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TWI681971B - 新穎抗人類Ｉｇβ抗體 - Google Patents

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TWI681971B
TWI681971B TW104125426A TW104125426A TWI681971B TW I681971 B TWI681971 B TW I681971B TW 104125426 A TW104125426 A TW 104125426A TW 104125426 A TW104125426 A TW 104125426A TW I681971 B TWI681971 B TW I681971B
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antibody
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山宿大介
関睦美
本田貴史
久保聡司
曽我真司
森中紹文
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日商安斯泰來製藥股份有限公司
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Abstract

本發明之課題係提供一種交聯BCR與FcγRIIb之具有較以往之抗體經增強之免疫抑制機能的抗人類Igβ抗體。

本發明之解決手段係一種抗人類Igβ抗體，其包含下述重鏈變異區以及下述輕鏈變異區，且包含下述重鏈恆定區：包含由序列編號2之胺基酸編號31至35之胺基酸序列而成之CDR1、由序列編號2之胺基酸編號50至65之胺基酸序列而成之CDR2、及由序列編號2之胺基酸編號98至108之胺基酸序列而成之CDR3的重鏈變異區；包含由序列編號4之胺基酸編號24至38之胺基酸序列而成之CDR1、由序列編號4之胺基酸編號54至60之胺基酸序列而成之CDR2、及由序列編號4之胺基酸編號93至101之胺基酸序列而成之CDR3的輕鏈變異區；具有S239D、H268D及L328W之胺基酸變異的人類Igγ1恆定區的重鏈恆定區。

Description

新穎抗人類Igβ抗體
本發明係關於一種抗人類Igβ抗體，其作為醫藥組成物的有效成分為有用。
B細胞受體(B cell receptor；BCR)是由Igα(CD79A)與Igβ(CD79B)之異二聚體組合的膜結合型免疫球蛋白分子(membrane immunoglobulin；mIg)所構成。抗原與mIg結合使受體凝集，且Igα/Igβ次單元傳遞訊號至B細胞內(Mol.Immunol.,Vol.41,p.599-613,2004)。
針對IgG抗體的Fc受體即Fcγ受體(FcγR)之蛋白質家族中，被報告有具有免疫活性功能之FcγRIa(CD64A)、FcγRIIa(CD32A)、及FcγRIIIa(CD16A)、以及具有免疫抑制的功能之FcγRIIb(CD32B)。報告有B細胞上的BCR與FcγRIIb若透過IgG免疫複合體交聯則使B細胞活性化被抑制，B細胞增殖或抗體產生被抑制(Nat.Rev.Immunol.,Vol.10,p.328- 343,2010、Nat.Rev.Immunol.,Vol.8,p.34-47,2008、Nat.Rev.Immunol.,Vol.2,p.580-592,2002)。
報告指出如此之透過FcγRIIb之B細胞活性化的控制，和風濕性關節炎或全身性紅斑狼瘡等自體免疫疾病有深刻的關係。
與風濕性關節炎之關連，報告有在FcγRIIb基因剔除小鼠中，體液性免疫沒有適當的受到控制(Nature,Vol.379,p.346-349,1996、J.Immunol.,Vol.163,p.618-622,1999)，且對膠原蛋白誘導關節炎之感受性增加(J.Exp.Med.,Vol.189,p.187-194,1999)。又，確認了風濕性關節炎病患之記憶型B細胞中之FcγRIIb的表現降低(J.Immunol.,Vol.190,p.6015-6022,2013)。
與全身性紅斑狼瘡之關連，報告有在FcγRIIb於B細胞特異性表現亢進之基因轉殖小鼠中，全身性紅斑狼瘡樣病理之發病顯著地被抑制(J.Exp.Med.,Vol.205,p.883-895,2008)。確認了FcγRIIb之基因剔除小鼠中，出現自體反應性之B細胞或漿細胞，全身性紅斑狼瘡樣病理自然發病(Immunity,Vol.13,p.277-285,2000、J.Exp.Med.,Vol.207,p.2767-2778,2010)。又，報告有全身性紅斑狼瘡病患之記憶型B細胞中之FcγRIIb的表現降低(J.Exp.Med.,Vol.203,p.2157-2164,2006、J.Immunol.,Vol.178,p.3272-3280,2007)、或FcγRIIb之細胞跨膜區域中之基因多型性與全身性紅斑狼瘡之發病頻率 之關連性(Arthritis Rheum.,Vol.46,p.1242-1254,2002)。
又，透過FcγRIIb之B細胞活性化的控制所生之抗體產生的抑制，對於自體抗體與病理狀態相關之自體免疫疾病的治療為有效。
特發性血小板減少性紫瘢病係起因於針對自體血小板之自體抗體而發生血小板破壞之自體免疫疾病(Autoimmun.Rev.,Vol.13,p.577-583,2014)。報告有經投予抗血小板抗體之動物引發了血小板減少(Br.J.Haematol.,Vol.167,p.110-120,2014)、使自體抗體減少對於特發性血小板減少性紫瘢病之治療為有效(Ther.Apher.Dial.Vol.16,p.311-320,2012、Lupus,Vol.22,p.664-674,2013)。
因此，若可以開發一種交聯BCR與FcγRIIb，且增強FcγRIIb之免疫抑制機能的單株抗體，則期待其對於風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡及特發性血小板減少性紫瘢病等之自體免疫疾病的預防及治療為有用的。
作為交聯BCR與FcγRIIb之抗體，報告有DART其係針對Igβ與FcγRIIb之雙重特異抗體(專利文獻1、非專利文獻1)、及anti-CD19 S267E/L328F其係具有結合於BCR複合體之一部分即CD19之變異區及針對FcγRIIb之親和性經增強之Fc區(專利文獻2、非專利文獻2及3)。其中，詳細研究anti-CD19 S267E/L328F，確認了其對於BCR經刺激之B細胞的活性化的抑制作用、 經移植人類末梢血單核細胞(PBMC)之小鼠中之人類血中抗體價濃度的降低作用(專利文獻2、非專利文獻2及3)。
〔先前技術文獻〕 〔專利文獻〕
[專利文獻1]國際公開第2012/018687號
[專利文獻2]國際公開第2008/150494號
〔非專利文獻〕
[非專利文獻1]「關節炎及風濕病(Arthritis & Rheumatism)」、(美國)、2010 ; 62(7) : 1933-1943
[非專利文獻2]「分子免疫學(Molecular Immunology)」、(美國)、2008 ; 45(15) : 3926-3933
[非專利文獻3]「免疫學雜誌(The Journal of Immunology)」、(美國)、2011 ; 186(7) : 4223-4233
本發明之課題係提供一種抗人類Igβ抗體，其係交聯BCR與FcγRIIb之具有較以往之抗體經增強之免疫抑制機能者。
本發明者們重複精心研究抗人類Igβ抗體之製作的結果，製作複數抗人類Igβ抗體(實施例1~3)，其係含有重鏈變異區以及輕鏈變異區，該重鏈變異區包含由序列編號2之胺基酸編號31至35之胺基酸序列而成之CDR1、由序列編號2之胺基酸編號50至65之胺基酸序列而成之CDR2、及由序列編號2之胺基酸編號98至108之胺基酸序列而成之CDR3，該輕鏈變異區包含由序列編號4之胺基酸編號24至38之胺基酸序列而成之CDR1、由序列編號4之胺基酸編號54至60之胺基酸序列而成之CDR2、及由序列編號4之胺基酸編號93至101之胺基酸序列而成之CDR3，且該抗體之重鏈恆定區為具有S239D、H268D及L328W之胺基酸變異的人類Igγ1恆定區，此等抗體結合於人類B細胞上之人類Igβ(實施例4及5)，阻礙抗IgM抗體誘發性之人類B細胞的活性化(實施例6)。此等結果提供前述抗人類Igβ抗體，而完成本發明。進而，發現上述抗體在人類PBMC移入NOG小鼠模式中，抑制血漿中人類抗體價(實施例7)、及在猴子TTx抗原致敏模式中，對於血漿中之總抗體價無影響而抑制抗原特異性抗體(實施例8)。
即，本發明作為醫學上或產業上有用之物質或方法係包含以下發明者。
(1)一種抗人類Igβ抗體，其包含下述重鏈變異區 以及下述輕鏈變異區，且含有下述重鏈恆定區：包含由序列編號2之胺基酸編號31至35之胺基酸序列而成之CDR1、由序列編號2之胺基酸編號50至65之胺基酸序列而成之CDR2、及由序列編號2之胺基酸編號98至108之胺基酸序列而成之CDR3的重鏈變異區；包含由序列編號4之胺基酸編號24至38之胺基酸序列而成之CDR1、由序列編號4之胺基酸編號54至60之胺基酸序列而成之CDR2、及由序列編號4之胺基酸編號93至101之胺基酸序列而成之CDR3的輕鏈變異區；具有S239D、H268D及L328W之胺基酸變異的人類Igγ1恆定區的重鏈恆定區。
(2)如(1)之抗人類Igβ抗體，其係人類化抗體。
(3)如(1)之抗人類Igβ抗體，其係選自以下1)~4)所成群：1)抗人類Igβ抗體，其包含由序列編號6之胺基酸編號1至119之胺基酸序列而成之重鏈變異區、及由序列編號8之胺基酸編號1至112之胺基酸序列而成之輕鏈變異區，且包含具有S239D、H268D及L328W之胺基酸變異的人類Igγ1恆定區的重鏈恆定區；2)抗人類Igβ抗體，其包含由序列編號2之胺基酸編號1至119之胺基酸序列而成之重鏈變異區、及由序列編號4之胺基酸編號1至112之胺基酸序列而成之輕鏈變異區，且包含且包含具有S239D、H268D及L328W之胺基酸變異的人類Igγ1恆定區之重鏈恆定區；3)抗人類Igβ抗體，其包含由序列編號10之胺基酸 編號1至119之胺基酸序列而成之重鏈變異區、及由序列編號12之胺基酸編號1至112之胺基酸序列而成之輕鏈變異區，且包含具有S239D、H268D及L328W之胺基酸變異的人類Igγ1恆定區之重鏈恆定區；以及4)抗人類Igβ抗體，其由上述1)~3)中任一項之抗人類Igβ抗體之轉譯後修飾所生。
(4)如(3)之抗人類Igβ抗體，其包含由序列編號6之胺基酸編號1至119之胺基酸序列而成之重鏈變異區、及由序列編號8之胺基酸編號1至112之胺基酸序列而成之輕鏈變異區，且包含具有S239D、H268D及L328W之胺基酸變異的人類Igγ1恆定區之重鏈恆定區。
(5)如(3)之抗人類Igβ抗體，其包含由序列編號2之胺基酸編號1至119之胺基酸序列而成之重鏈變異區、及由序列編號4之胺基酸編號1至112之胺基酸序列而成之輕鏈變異區，且包含具有S239D、H268D及L328W之胺基酸變異的人類Igγ1恆定區之重鏈恆定區。
(6)如(3)之抗人類Igβ抗體，其包含由序列編號10之胺基酸編號1至119之胺基酸序列而成之重鏈變異區、及由序列編號12之胺基酸編號1至112之胺基酸序列而成之輕鏈變異區，且包含具有S239D、H268D及L328W之胺基酸變異的人類Igγ1恆定區之重鏈恆定區。
(7)一種抗人類Igβ抗體，其係由如(4)~(6)中任一項之抗人類Igβ抗體之轉譯後修飾所生。
(8)如(3)或(7)之抗人類Igβ抗體，其中轉譯 後修飾係重鏈變異區N末端之焦麩胺醯基化及/或重鏈C末端之離胺酸缺失。
(9)如(1)~(8)中任一項之抗人類Igβ抗體，其包含人類Igκ恆定區之輕鏈恆定區。
(10)如(1)之抗人類Igβ抗體，其包含由序列編號6所示胺基酸序列而成之重鏈、及由序列編號8所示胺基酸序列而成之輕鏈。
(11)如(1)之抗人類Igβ抗體，其包含由序列編號2所示胺基酸序列而成之重鏈、及由序列編號4所示胺基酸序列而成之輕鏈。
(12)如(1)之抗人類Igβ抗體，其包含由序列編號10所示胺基酸序列而成之重鏈、及由序列編號12所示胺基酸序列而成之輕鏈。
(13)一種抗人類Igβ抗體，其係由(10)~(12)中任一項之抗人類Igβ抗體之轉譯後修飾所生。
(14)如(13)之抗人類Igβ抗體，其中轉譯後修飾係重鏈變異區N末端之焦麩胺醯基化及/或重鏈C末端之離胺酸缺失。
(15)如(13)之抗人類Igβ抗體，其包含胺基酸編號1之麩醯胺經修飾成焦麩胺酸的由序列編號6之胺基酸編號1至448之胺基酸序列而成之重鏈、及由序列編號8所示胺基酸序列而成之輕鏈。
(16)如(13)之抗人類Igβ抗體，其包含由序列編號2之胺基酸編號1至448之胺基酸序列而成之重鏈、及 由序列編號4所示胺基酸序列而成之輕鏈。
(17)如(13)之抗人類Igβ抗體，其包含由序列編號10之胺基酸編號1至448之胺基酸序列而成之重鏈、及由序列編號12所示胺基酸序列而成之輕鏈。
(18)一種多核苷酸，其包含編碼如(1)~(6)中任一項之抗人類Igβ抗體之重鏈的鹼基序列。
(19)一種多核苷酸，其包含編碼如(1)~(6)中任一項之抗人類Igβ抗體之輕鏈的鹼基序列。
(20)一種表現載體，其包含如(18)及/或(19)之多核苷酸。
(21)一種宿主細胞，其係選自以下(a)~(d)所成群之經如(20)之表現載體所轉型者：(a)宿主細胞，其經含有包含編碼如(1)~(6)中任一項之抗人類Igβ抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸及包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型；(b)宿主細胞，其經含有包含編碼如(1)~(6)中任一項之抗人類Igβ抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體及含有包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型；(c)宿主細胞，其經含有包含編碼如(1)~(6)中任一項之抗人類Igβ抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型；及(d)宿主細胞，其經含有包含編碼如(1)~(6)中 任一項之抗人類Igβ抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型。
(22)一種宿主細胞，其係選自以下(a)~(d)所成群之經如(20)之表現載體所轉型者： (a)宿主細胞，其經含有包含編碼如(10)~(13)中任一項之抗人類Igβ抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸及包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型；(b)宿主細胞，其經含有包含編碼如(10)~(13)中任一項之抗人類Igβ抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體及含有包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型；(c)宿主細胞，其經含有包含編碼如(10)~(13)中任一項之抗人類Igβ抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型；及(d)宿主細胞，其經含有包含編碼如(10)~(13)中任一項之抗人類Igβ抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型。
(23)一種生產抗人類Igβ抗體之方法，其包含培養選自以下(a)~(c)所成群之宿主細胞，使抗人類Igβ抗體表現之步驟：(a)經含有包含編碼如(1)~(6)中任一項之抗人類Igβ抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸及包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型之宿主 細胞；(b)經含有包含編碼如(1)~(6)中任一項之抗人類Igβ抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體及含有包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型之宿主細胞；以及(c)經含有包含編碼如(1)~(6)中任一項之抗人類Igβ抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型之宿主細胞、及經含有包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型之宿主細胞。
(24)一種生產抗人類Igβ抗體之方法，其包含培養選自以下(a)~(c)所成群之宿主細胞，使抗人類Igβ抗體表現之步驟：(a)經含有包含編碼如(10)~(13)中任一項之抗人類Igβ抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸及包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型之宿主細胞；(b)經含有包含編碼如(10)~(13)中任一項之抗人類Igβ抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體及含有包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型之宿主細胞；以及(c)經含有包含編碼如(10)~(13)中任一項之抗人類Igβ抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型之宿主細胞、及經含有包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型之宿主細胞。
(25)一種抗人類Igβ抗體，其係以如(23)之方法所生產。
(26)一種抗人類Igβ抗體，其係以如(24)之方法所生產。
(27)一種醫藥組成物，其包含如(1)~(17)、(25)及(26)中任一項之抗人類Igβ抗體及藥學上容許之賦形劑。
(28)一種醫藥組成物，其包含如(10)之抗人類Igβ抗體、如(15)之抗人類Igβ抗體及藥學上容許之賦形劑。
(29)如(27)或(28)之醫藥組成物，其係自體免疫疾病之預防或治療用之醫藥組成物。
(30)如(29)之醫藥組成物，其中自體免疫疾病係全身性紅斑狼瘡、風濕性關節炎或特發性血小板減少性紫瘢病。
(31)一種預防或治療自體免疫疾病之方法，其包含投予如(1)~(17)、(25)及(26)中任一項之抗人類Igβ抗體之治療有效量的步驟。
(32)如(31)之方法，其中自體免疫疾病係全身性紅斑狼瘡、風濕性關節炎或特發性血小板減少性紫瘢病。
(33)如(1)~(17)、(25)及(26)中任一項之抗人類Igβ抗體，其係用以使用於自體免疫疾病之預防或治療。
(34)如(33)之抗人類Igβ抗體，其中自體免疫疾 病係全身性紅斑狼瘡、風濕性關節炎或特發性血小板減少性紫瘢病。
(35)一種如(1)~(17)、(25)及(26)中任一項之抗人類Igβ抗體所記載之抗人類Igβ抗體之使用於自體免疫疾病之預防或治療用醫藥組成物之製造中的用途。
(36)如(35)之用途，其中自體免疫疾病係全身性紅斑狼瘡、風濕性關節炎或特發性血小板減少性紫瘢病。
本發明之抗人類Igβ抗體係藉由阻礙B細胞之活性化具有優異免疫抑制作用者，可使用作為全身性紅斑狼瘡、風濕性關節炎或特發性血小板減少性紫瘢病等之自體免疫疾病的預防或治療劑。
[圖1]顯示人類B細胞中人類化抗Igβ抗體對於抗IgM抗體誘發細胞增殖之阻礙效果。縱軸表示B細胞之增殖率、橫軸表示添加的抗體濃度(μg/mL)。
[圖2]顯示人類化抗Igβ抗體對於因將人類PBMC移入NOG小鼠所引起之血漿中人類IgM抗體價的上升之阻礙作用。縱軸表示血漿中人類IgM抗體價(μg/mL)、橫軸表示將人類PBMC移入NOG小鼠後之時間(日)。
[圖3]顯示人類化抗Igβ抗體對於因將人類 PBMC移入NOG小鼠所引起之血漿中人類IgE抗體價的上升之阻礙作用。縱軸表示血漿中人類IgE抗體價(ng/mL)、橫軸表示將人類PBMC移入NOG小鼠後之時間(日)。
[圖4]顯示人類化抗Igβ抗體對於因以吸附破傷風類毒素對猴子進行免疫所引起之血漿中之抗吸附破傷風類毒素抗體價的上升之阻礙作用。縱軸表示血漿中抗吸附破傷風類毒素抗體價(U/mL)、橫軸表示以吸附破傷風類毒素對猴子進行免疫後之時間(日)。
[圖5]顯示經吸附破傷風類毒素進行免疫之猴子中人類化抗Igβ抗體之對於血漿中總IgM抗體價的作用。縱軸表示血漿中總IgM抗體價(U/mL)、橫軸表示以吸附破傷風類毒素對猴子進行免疫後之時間(日)。
[圖6]顯示經吸附破傷風類毒素進行免疫之猴子中人類化抗Igβ抗體之對於血漿中總IgA抗體價的作用。縱軸表示血漿中總IgA抗體價(U/mL)、橫軸表示以吸附破傷風類毒素對猴子進行免疫後之時間(日)。
[圖7]顯示經吸附破傷風類毒素進行免疫之猴子中人類化抗Igβ抗體之對於血漿中總IgG抗體價的作用。縱軸表示血漿中總IgG抗體價(U/mL)、橫軸表示以吸附破傷風類毒素對猴子進行免疫後之時間(日)。
以下詳述本發明。
抗體存在有IgG、IgM、IgA、IgD及IgE之5類(class)。抗體分子之基本構造各類共通，由分子量5萬~7萬之重鏈與2萬~3萬之輕鏈所構成。重鏈通常為包含約440個胺基酸之多肽鏈所構成，各類具有其特徵構造，對應於IgG、IgM、IgA、IgD、IgE各稱為Igγ、Igμ、Igα、Igδ、Igε。進而IgG存在有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4之亞類，分別對應之重鏈稱為Igγ1、Igγ2、Igγ3、Igγ4。輕鏈通常為包含約220個胺基酸之多肽鏈所構成，已知有L型及K型2種，分別稱為Igλ、Igκ。抗體分子之基本構造的肽構成係分別相同之2條重鏈及2條輕鏈透過雙硫鍵(S-S鍵)及非共價鍵所鍵結，分子量15萬~19萬。2種類的輕鏈與任一重鏈皆可配對。各個抗體分子通常由相同的輕鏈2條及相同的重鏈2條所組成。
鏈內S-S鍵有重鏈四個(μ、ε鏈有五個)、輕鏈有二個，每胺基酸100~110殘基形成一個環，此立體結構在各環間相類似，稱為結構單位或域(domain)。位於重鏈、輕鏈的胺基末端(N末端)之域，即使在同種動物之同一類(亞類)的樣本中，其胺基酸序列皆不固定，稱為變異區，各域分別稱為重鏈變異區及輕鏈變異區。相較於變異區，羧基末端(C末端)側之胺基酸序列在每各類或亞類中幾乎固定稱為恆定區。
抗體之抗原結合部位由重鏈變異區及輕鏈變異區所構成，結合之特異性係依據此部位之胺基酸序列。另一方面，生物學活性如與補體或各種細胞之結合係反映 各類Ig之恆定區構造的差異。輕鏈及重鏈之變異區的可變性，已知幾乎限於兩鏈皆存在的3個小的高度變異區，此等區稱為互補性決定區(CDR；自N末端側分別為CDR1、CDR2、CDR3)。變異區之剩餘部分稱為框架區(FR)，相對的較固定。
<本發明之抗人類Igβ抗體>
本發明之抗人類Igβ抗體包含具有以下特徵之抗人類Igβ抗體。
一種抗人類Igβ抗體，其含有包含由序列編號2之胺基酸編號31至35之胺基酸序列而成之CDR1、由序列編號2之胺基酸編號50至65之胺基酸序列而成之CDR2、及由序列編號2之胺基酸編號98至108之胺基酸序列而成之CDR3的重鏈變異區，以及包含由序列編號4之胺基酸編號24至38之胺基酸序列而成之CDR1、由序列編號4之胺基酸編號54至60之胺基酸序列而成之CDR2、及由序列編號4之胺基酸編號93至101之胺基酸序列而成之CDR3的輕鏈變異區，且含有具有S239D、H268D及L328W之胺基酸變異的人類Igγ1恆定區之重鏈恆定區。
在一個實施形態中，本發明之抗人類Igβ抗體係人類化抗體。本說明書中所謂「人類化抗體」，意指含有來自小鼠抗體之CDR及來自人類抗體之其他抗體部分的形態之抗體。人類化抗體之製作方法為該領域所周知，例如可參照美國專利5225539號、美國6180370號等 來製作。
在一個實施形態中，本發明之抗人類Igβ抗體為以下1)~3)中任一項之抗人類Igβ抗體：1)包含由序列編號2之胺基酸編號1至119之胺基酸序列而成之重鏈變異區、及由序列編號4之胺基酸編號1至112之胺基酸序列而成之輕鏈變異區，且包含具有S239D、H268D及L328W之胺基酸變異的人類Igγ1恆定區之重鏈恆定區的抗人類Igβ抗體；2)包含由序列編號6之胺基酸編號1至119之胺基酸序列而成之重鏈變異區、及由序列編號8之胺基酸編號1至112之胺基酸序列而成之輕鏈變異區，且包含具有S239D、H268D及L328W之胺基酸變異的人類Igγ1恆定區之重鏈恆定區的抗人類Igβ抗體；以及3)包含由序列編號10之胺基酸編號1至119之胺基酸序列而成之重鏈變異區、及由序列編號12之胺基酸編號1至112之胺基酸序列而成之輕鏈變異區，且包含具有S239D、H268D及L328W之胺基酸變異的人類Igγ1恆定區之重鏈恆定區的抗人類Igβ抗體。
本說明書中所使用之抗體的恆定區中關於胺基酸變異導入之殘基編號，係依循EU索引(Kabat等，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.,United States Public Health Service,National Institute of Health,Bethesda)。所謂S239D係指人類Igγ1恆定區中依循Kabat等之EU索引之 胺基酸第239位的絲胺酸之經天冬胺酸的取代。所謂H268D，係指人類Igγ1恆定區中依循Kabat等之EU索引之胺基酸第268位的組胺酸之經天冬胺酸的取代。所謂L328W，係指人類Igγ1恆定區中依循Kabat等之EU索引之胺基酸第328位的白胺酸之經色胺酸的取代。作為具有S239D、H268D及L328W之胺基酸變異的人類Igγ1恆定區，例如可舉例由序列編號2之胺基酸編號120至449之胺基酸序列而成之人類Igγ1恆定區。
作為本發明之抗人類Igβ抗體之輕鏈恆定區，雖可選擇Igλ或Igκ之任一恆定區，但以人類Igκ恆定區較佳。作為人類Igκ恆定區，例如可舉例由序列編號4之胺基酸編號113至218之胺基酸序列而成之人類Igκ恆定區。
在一個實施形態中，本發明之抗人類Igβ抗體為選自以下i)~iii)中任一項之抗人類Igβ抗體：i)包含由序列編號2所示胺基酸序列而成之重鏈、及由序列編號4所示胺基酸序列而成之輕鏈的抗人類Igβ抗體；ii)包含由序列編號6所示胺基酸序列而成之重鏈、及由序列編號8所示胺基酸序列而成之輕鏈的抗人類Igβ抗體；以及iii)包含由序列編號10所示胺基酸序列而成之重鏈、及由序列編號12所示胺基酸序列而成之輕鏈的抗人類Igβ抗體。
當抗體在細胞內表現時，已知抗體在轉譯後會受到修飾。作為轉譯後修飾之例，可舉例重鏈C末端之離胺酸之經羧肽酶的切斷、重鏈及輕鏈N末端之麩醯胺或麩胺酸之經焦麩胺醯基化之成為焦麩胺酸的修飾、糖基化、氧化、脫醯胺化、糖化等，已知在各種抗體中發生如此之轉譯後修飾(Journal of Pharmaceutical Sciences,Vol.97,p.2426-2447,2008)。
本發明之抗人類Igβ抗體中亦包含受到轉譯後修飾之抗人類Igβ抗體。作為受到轉譯後修飾之本發明之抗人類Igβ抗體之例，可舉例受到重鏈變異區N末端之焦麩胺醯基化及/或重鏈C末端之離胺酸缺失之抗人類Igβ抗體。在當領域中已知如此之經N末端之焦麩胺醯基化或C末端離胺酸缺失的轉譯後修飾對於抗體活性並無影響(Analytical Biochemistry,Vol.348,p.24-39,2006)。
例如，本發明之抗人類Igβ抗體中亦包含以下1)~3)之抗人類Igβ抗體：
1)包含由胺基酸編號1之麩胺酸經修飾成焦麩胺酸及/或欠缺胺基酸編號449之離胺酸之序列編號2之胺基酸序列而成之重鏈、以及由序列編號4所示胺基酸序列而成之輕鏈的抗人類Igβ抗體。
2)包含由胺基酸編號1之麩胺酸經修飾成焦麩胺酸及/或欠缺胺基酸編號449之離胺酸之序列編號6之胺基酸序列而成之重鏈、以及由序列編號8所示胺基酸序列而成之輕鏈的抗人類Igβ抗體。
3)包含由胺基酸編號1之麩胺酸經修飾成焦麩胺酸及/或欠缺胺基酸編號449之離胺酸之序列編號10之胺基酸序列而成之重鏈、以及由序列編號12所示胺基酸序列而成之輕鏈的抗人類Igβ抗體。
在一個實施形態中，本發明之抗人類Igβ抗體係選自以下i)~iii)中任一項之抗人類Igβ抗體：
i)包含由序列編號2之胺基酸編號1至448之胺基酸序列而成之重鏈、及由序列編號4所示胺基酸序列而成之輕鏈的抗人類Igβ抗體。
ii)包含胺基酸編號1之麩醯胺經修飾成焦麩胺酸之由序列編號6之胺基酸編號1至448之胺基酸序列而成之重鏈、及由序列編號8所示胺基酸序列而成之輕鏈的抗人類Igβ抗體；以及
iii)包含由序列編號10之胺基酸編號1至448之胺基酸序列而成之重鏈、及由序列編號12所示胺基酸序列而成之輕鏈的抗人類Igβ抗體。
該發明所屬技術領域具有通常知識者基於本發明，可製作抗體與其他肽或蛋白質之融合體，或製作與修飾劑結合之修飾體，此等形態之抗體亦包含於本發明之抗體。用於融合之其他肽或蛋白質，只要是不使抗體之結合活性降低者即無特別限定，例如可舉例人類血清白蛋白、各種標記肽、人工螺旋模體(motif)肽、麥芽糖結合蛋白質、麩胱甘肽S轉移酶、各種毒素、其他可促進多量體化之肽或蛋白質等。用於修飾之修飾劑，只要是不使 抗體之結合活性降低者即無特別限定，例如可舉例聚乙二醇、糖鏈、磷脂、脂質體、低分子化合物等。
本說明書中所謂「抗人類Igβ抗體」，意指結合於人類Igβ之抗體。是否結合於人類Igβ，可使用周知之結合活性測定方法來確認。作為測定結合活性之方法，例如可舉例Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay(ELISA)等之方法。使用ELISA時，例如，將人類Igβ-Flag蛋白質(例如，序列編號13之鹼基序列所編碼)固相化於ELISA盤，對此添加被驗抗體使其反應後，使其與以辣根過氧化酶(HRP)等酵素標記之抗IgG抗體等之二次抗體反應。反應後，洗淨後，透過使用檢測其活性之試藥(例如，HRP標記時為BM-Chemiluminescence ELISA Substrate(POD)(Roche Diagnostics公司))等的活性測定，藉由鑑定二次抗體之結合，可確認被驗抗體是否結合於人類Igβ。作為具體之評估方法，可使用如後記實施例4所記載之方法。
本發明之抗人類Igβ抗體中，亦包含結合於人類Igβ之抗體在與人類Igβ之結合之外，亦結合於來自其他動物之Igβ(例如，猴子Igβ)的抗體。
作為評估本發明之抗人類Igβ抗體之活性的方法，可評估對於人類B細胞之結合活性，或阻礙因BCR刺激之人類B細胞之活性化的活性。作為如此活性之評估方法，可使用如後記實施例5及6所記載之方法。較佳為本發明之抗人類Igβ抗體結合於人類Igβ，具有阻 礙因BCR刺激之人類B細胞之活性化的活性。
本發明之抗人類Igβ抗體基於本說明書所揭示之本發明之抗體之重鏈及輕鏈的序列情報，使用該領域所周知的方法，該發明所屬技術領域具有通常知識者可輕易製作。本發明之抗人類Igβ抗體雖無特別限定，但例如可依循後述之<本發明之生產抗人類Igβ抗體之方法及由該方法所生產之抗人類Igβ抗體>所記載之方法來製造。
本發明之抗人類Igβ抗體應需要進一步純化後，依循常規方法而製劑化，可用於全身性紅斑狼瘡、風濕性關節炎、特發性血小板減少性紫瘢病、重症肌無力症、格雷氏病、視神經脊髓炎、自體免疫性溶血性貧血、天疱瘡、抗磷脂抗體症候群、ANCA相關血管炎、Sjogren氏症候群、橋本病、慢性發炎去髓鞘型多發性神經病變及慢性疲勞症候群等之自體免疫疾病的預防或治療。
<本發明之多核苷酸>
本發明之多核苷酸包含：包含編碼本發明之抗人類Igβ抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸、及包含編碼本發明之抗人類Igβ抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸。
在一個實施形態中，包含編碼本發明之抗人類Igβ抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸為：包含編碼由序列編號2所示胺基酸序列而成之重鏈的鹼基序列之多核苷酸、包含編碼由序列編號6所示胺基酸序列而成之重鏈的鹼基序列之多核苷酸、或包含編碼由序列編號10所示 胺基酸序列而成之重鏈的鹼基序列之多核苷酸。
作為包含編碼由序列編號2所示胺基酸序列而成之重鏈的鹼基序列之多核苷酸，例如可舉例包含序列編號1或15所示鹼基序列之多核苷酸。作為包含編碼由序列編號6所示胺基酸序列而成之重鏈的鹼基序列之多核苷酸，例如可舉例包含序列編號5所示鹼基序列之苷酸。作為包含編碼由序列編號10所示胺基酸序列而成之重鏈的鹼基序列之多核苷酸，例如可舉例包含序列編號9所示鹼基序列之多核苷酸。
在一個實施形態中，包含編碼本發明之抗人類Igβ抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸為：包含編碼由序列編號4所示胺基酸序列而成之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸、包含編碼由序列編號8所示胺基酸序列而成之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸、或包含編碼由序列編號12所示胺基酸序列而成之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸。
作為由包含編碼由序列編號4所示胺基酸序列而成之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸，例如可舉例包含序列編號3所示鹼基序列之多核苷酸。作為包含編碼由序列編號8所示胺基酸序列而成之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸，例如可舉例包含序列編號7所示鹼基序列之多核苷酸。作為包含編碼由序列編號12所示胺基酸序列而成之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸，例如可舉例包含序列編號11所示鹼基序列之多核苷酸。
本發明之多核苷酸基於其鹼基序列，使用該 領域所周知的方法，該發明所屬技術領域具有通常知識者可輕易製作。例如，本發明之多核苷酸可利用該領域所周知的基因合成方法來合成。作為如此之基因合成方法，可使用WO90/07861所記載之抗體基因之合成方法等之該發明所屬技術領域具有通常知識者所周知的各種方法。
<本發明之表現載體>
本發明之表現載體包含：含有包含編碼本發明之抗人類Igβ抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體、含有包含編碼本發明之抗人類Igβ抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體、及含有包含編碼本發明之抗人類Igβ抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸及包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體。
作為用於表現本發明之多核苷酸的表現載體，只要是在真核細胞(例如，動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母)及/或原核細胞(例如，大腸菌)之各種宿主細胞中表現包含編碼本發明之抗人類Igβ抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸及/或包含編碼本發明之抗人類Igβ抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸，而由此等可產生所編碼之多肽者，即無特別限制。作為如此之表現載體，例如可舉例質體載體、病毒載體(例如，腺病毒、反轉錄病毒)等，較佳可使用pEE6.4或pEE12.4(Lonza Biologics公司)。
本發明之表現載體可包含可作用地連接到本 發明多核苷酸之啟動子。作為在動物細胞中用以使本發明之多核苷酸表現的啟動子，例如可舉例CMV、RSV、SV40等之病毒由來啟動子、啟動子、EF(elongation factor)1α啟動子、熱休克啟動子等。作為在細菌(例如，大腸桿菌屬菌)中用以使本發明多核苷酸表現之啟動子，例如可舉例trp啟動子、lac啟動子、λPL啟動子、tac啟動子等。作為在酵母中用以使本發明多核苷酸表現之啟動子，例如可舉例GAL1啟動子、GAL10啟動子、PH05啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子等。
作為宿主細胞使用動物細胞、昆蟲細胞或酵母時，本發明之表現載體可包含起始密碼子及終止密碼子。此時，亦可包含強化子序列、編碼本發明之抗體或其重鏈或輕鏈之基因的5’側及3’側之非轉譯區、分泌信號序列、剪接接合部、多腺苷酸化部位、或可複製單位等。作為宿主細胞使用時，本發明之表現載體可包含起始密碼子、終止密碼子、終止子區、及可複製單位。本發明之表現載體應目的需要亦可包含通常使之選擇標記(例如，四環素耐性基因、安比西林耐性基因、康黴素耐性基因、新黴素耐性基因、二氫葉酸還原酶基因)。
<本發明之經轉型之宿主細胞>
本發明之經轉型之宿主細胞中，包含選自以下(a)~(d)所成群之經本發明之表現載體所轉型之宿主細胞。
(a)經含有包含編碼本發明之抗人類Igβ抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸及包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型的宿主細胞；(b)經含有包含編碼本發明之抗人類Igβ抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體及含有包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型的宿主細胞；(c)經含有包含編碼本發明之抗人類Igβ抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型之宿主細胞；及(d)經含有包含編碼本發明之抗人類Igβ抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型的宿主細胞。
作為較佳的本發明之經轉型之宿主細胞，可舉例經含有包含編碼本發明之抗人類Igβ抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸及包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型的宿主細胞、以及、經含有包含編碼本發明之抗人類Igβ抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體及含有包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型的宿主細胞。
作為轉型之宿主細胞，只要適合使用之表現載體，經該表現載體所轉型，可表現抗體者，則無特別限定。作為轉型之宿主細胞，例如可舉例本發明之技術領域中通常使用之天然細胞或人工建立之細胞等各種細胞(例如，動物細胞(例如，CHOK1SV細胞)、昆蟲細胞(例 如，Sf9)、細菌(大腸桿菌屬菌等)、酵母(酵母菌屬、畢赤酵母菌屬等)等)，較佳可使用CHOK1SV細胞、CHO-DG44細胞、293細胞、NS0細胞等之培養細胞。
轉型宿主細胞之方法雖無特別限定，但例如可使用磷酸鈣法、電穿孔法等。
<本發明之生產抗人類Igβ抗體之方法及藉由該方法所生產之抗人類Igβ抗體>
本發明之生產抗人類Igβ抗體之方法中包含具有下述步驟之生產抗人類Igβ抗體之方法：培養選自以下(a)~(c)所成群之宿主細胞，使抗人類Igβ抗體表現之步驟。
(a)經含有包含編碼本發明之抗人類Igβ抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸及包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型的宿主細胞；(b)經含有包含編碼本發明之抗人類Igβ抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體及含有包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型的宿主細胞；以及(c)經含有包含編碼本發明之抗人類Igβ抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型的宿主細胞、及、經含有包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型的宿主細胞。
本發明之生產抗人類Igβ抗體之方法，只要是包含培養本發明之經轉型之宿主細胞，使抗人類Igβ抗體表現之步驟，則無特別限定。作為該方法中所使用之較佳宿主細胞，可舉例前述較佳的本發明之經轉型之宿主細胞。
經轉型之宿主細胞的培養可藉由周知方法進行。培養條件，例如溫度、培養基之pH及培養時間可適宜地選擇。宿主細胞為動物細胞時，作為培養基，例如可使用含有約5~20%之胎牛血清的MEM培養基(Science,Vol.130,p.432-437,1959)、DMEM培養基(Virology,Vol.8,p.396,1959)、RPMI1640培養基(J.Am.Med.Assoc.,Vol.199,p.519,1967)、199培養基(Exp.Biol.Med.,Vol.73,p.1-8,1950)等。培養基之pH以約6~8較佳，培養依需要可一邊通氣或攪拌，一邊以通常約30~40℃進行約15~72小時。宿主細胞為昆蟲細胞時，作為培養基，例如可使用含有胎牛血清之Grace’s培養基(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.82,p.8404,1985)等。培養基之pH以約5~8較佳，培養培養依需要可一邊通氣或攪拌，一邊以通常約20~40℃進行約15~100小時。宿主細胞為大腸菌或酵母時，作為培養基，例如含有營養源之液體培養基為適合。營養培養基以含有經轉型之宿主細胞的生育所必要之碳源、無機氮源、或有機氮源較佳。作為碳源，例如可舉例葡萄糖、葡聚醣、可溶性澱粉、蔗糖等，作為無機氮源或有機氮源，例如可舉例銨鹽類、硝酸鹽 類、胺基酸、玉米浸液、蛋白腖、酪蛋白、肉萃取物、大豆粕、馬鈴薯萃取液等。依照期望亦可含有其他營養素(例如無機鹽(例如，氯化鈣、磷酸二氫鈉、氯化鎂)、維生素類)、抗生素(例如，四環素、新黴素、安比西林、康黴素)等。培養基之pH以約5~8較佳。宿主細胞為大腸菌時，作為較佳的培養基，例如可使用LB培養基、M9培養基(Mol.Clo.,Cold Spring Harbor Laboratory,Vol.3,A2.2)等。培養依需要可一邊通氣或攪拌，一邊以通常約14~43℃進行約3~24小時。宿主細胞為酵母時，作為培養基，例如可使用Burkholder最小培養基(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.77,p.4505,1980)等。培養依需要可一邊通氣或攪拌，一邊以通常約20~35℃進行約14~144小時。藉由如上述之培養，可表現本發明之抗人類Igβ抗體。
本發明之生產抗人類Igβ抗體之方法在培養本發明之經轉型之宿主細胞，使抗人類Igβ抗體表現之步驟之外，可進一步由該經轉型之宿主細胞回收抗人類Igβ抗體，較佳為單離或純化之步驟。作為單離或純化方法，例如可舉例：鹽析、溶劑沈澱法等之利用溶解度的方法，透析、超過濾、凝膠過濾等之利用分子量差的方法，離子交換色層分析法、羥基磷灰石色層分析法等之利用荷電的方法，親合性色層分析法等之利用特異親和性的方法，逆相高速液體色層分析法等之利用疏水性差的方法，等電點電泳等之等利用電點差的方法等。較佳為培養上清液中所 蓄積之抗體可藉由各種色層分析法，例如使用蛋白質A管柱或蛋白質G管柱之管柱色層分析法來純化。
本發明之抗人類Igβ抗體中亦包含以本發明之生產抗人類Igβ抗體之方法所生產之抗人類Igβ抗體。
<本發明之醫藥組成物>
本發明之醫藥組成物中包含：含有本發明之抗人類Igβ抗體及藥學上容許之賦形劑之醫藥組成物。本發明之醫藥組成物使用該領域中通常使用之賦形劑，即藥劑用賦形劑或藥劑用載體等，可藉由通常使用之方法來調製。作為此等醫藥組成物之劑型的例，例如可藉由注射劑、點滴用劑等之非經口劑，靜脈內投予、皮下投予等來投予。至於製劑化，在藥學上容許之範圍，可使用與此等劑型相對應之賦形劑、載體、添加劑等。
本發明之醫藥組成物可包含複數種之本發明之抗人類Igβ抗體。例如，含有未受到轉譯後修飾之抗體及藉由轉譯後修飾所生之抗體的醫藥組成物亦包含於本發明中。
在一個實施形態中，本發明之醫藥組成物含有選自以下(1)~(3)所成群之抗人類Igβ抗體、及該抗人類Igβ抗體之藉由轉譯後修飾所生之抗人類Igβ抗體。
(1)包含由序列編號6之胺基酸編號1至119之胺基酸序列而成之重鏈變異區、及由序列編號8之胺基酸編 號1至112之胺基酸序列而成之輕鏈變異區，且包含具有S239D、H268D及L328W之胺基酸變異的人類Igγ1恆定區之重鏈恆定區的抗人類Igβ抗體；(2)包含由序列編號2之胺基酸編號1至119之胺基酸序列而成之重鏈變異區、及由序列編號4之胺基酸編號1至112之胺基酸序列而成之輕鏈變異區，且包含具有S239D、H268D及L328W之胺基酸變異的人類Igγ1恆定區之重鏈恆定區的抗人類Igβ抗體；以及(3)包含由序列編號10之胺基酸編號1至119之胺基酸序列而成之重鏈變異區、及由序列編號12之胺基酸編號1至112之胺基酸序列而成之輕鏈變異區，且包含具有S239D、H268D及L328W之胺基酸變異的人類Igγ1恆定區之重鏈恆定區的抗人類Igβ抗體。
本發明之醫藥組成物中亦包含重鏈C末端離胺酸缺失之抗體、受到N末端轉譯後修飾之抗體、重鏈C末端離胺酸缺失且受到N末端轉譯後修飾之抗體、及/或具有重鏈C末端離胺酸且未受到N末端轉譯後修飾之抗體的醫藥組成物。
在一個實施形態中，含有抗人類Igβ抗體之本發明之醫藥組成物中，亦包含含有以下(1)~(4)之中2種以上之抗人類Igβ抗體的醫藥組成物。
(1)包含由序列編號2之胺基酸編號1至448之胺基酸序列而成之重鏈、及由序列編號4所示胺基酸序列而成之輕鏈的抗人類Igβ抗體。
(2)包含胺基酸編號1之麩胺酸經修飾成焦麩胺酸之由序列編號2之胺基酸序列而成之重鏈、及由序列編號4所示胺基酸序列而成之輕鏈的抗人類Igβ抗體。
(3)包含胺基酸編號1之麩胺酸經修飾成焦麩胺酸之由序列編號2之胺基酸編號1至448之胺基酸序列而成之重鏈、及由序列編號4所示胺基酸序列而成之輕鏈的抗人類Igβ抗體。
(4)包含由序列編號2所示胺基酸序列而成之重鏈、及由序列編號4所示胺基酸序列而成之輕鏈的抗人類Igβ抗體。
在一個實施形態中，含有抗人類Igβ抗體之本發明之醫藥組成物中，亦包含含有以下(1)~(4)之中2種以上之抗人類Igβ抗體的醫藥組成物。
(1)包含由序列編號6之胺基酸編號1至448之胺基酸序列而成之重鏈、及由序列編號8所示胺基酸序列而成之輕鏈的抗人類Igβ抗體。
(2)包含胺基酸編號1之麩醯胺經修飾成焦麩胺酸之由序列編號6之胺基酸序列而成之重鏈、及由序列編號8所示胺基酸序列而成之輕鏈的抗人類Igβ抗體。
(3)包含胺基酸編號1之麩醯胺經修飾成焦麩胺酸之由序列編號6之胺基酸編號1至448之胺基酸序列而成之重鏈、及由序列編號8所示胺基酸序列而成之輕鏈的抗人類Igβ抗體。
(4)包含由序列編號6所示胺基酸序列而成之重 鏈、及由序列編號8所示胺基酸序列而成之輕鏈的抗人類Igβ抗體。
在一個實施形態中，含有抗人類Igβ抗體之本發明之醫藥組成物中，亦包含含有以下(1)~(4)之中2種以上之抗人類Igβ抗體的醫藥組成物。
(1)包含由序列編號10之胺基酸編號1至448之胺基酸序列而成之重鏈、及由序列編號12所示胺基酸序列而成之輕鏈的抗人類Igβ抗體。
(2)包含胺基酸編號1之麩胺酸經修飾成焦麩胺酸之由序列編號10之胺基酸序列而成之重鏈、及由序列編號12所示胺基酸序列而成之輕鏈的抗人類Igβ抗體。
(3)包含胺基酸編號1之麩胺酸經修飾成焦麩胺酸之由序列編號10之胺基酸編號1至448之胺基酸序列而成之重鏈、及由序列編號12所示胺基酸序列而成之輕鏈的抗人類Igβ抗體。
(4)包含由序列編號10所示胺基酸序列而成之重鏈、及由序列編號12所示胺基酸序列而成之輕鏈的抗人類Igβ抗體。
進而在一個實施形態中，本發明之醫藥組成物為以下所記載之醫藥組成物：
含有包含由序列編號6所示胺基酸序列而成之重鏈及由序列編號8所示胺基酸序列而成之輕鏈的抗人類Igβ抗體、包含胺基酸編號1之麩醯胺經修飾成焦麩胺酸之由序列編號6之胺基酸編號1至448之胺基酸序列而成之重鏈 及由序列編號8所示胺基酸序列而成之輕鏈的抗人類Igβ抗體、以及藥學上容許之賦形劑之醫藥組成物。
製劑化中本發明之抗人類Igβ抗體之添加量雖依病患之症狀程度或年齡、使用之製劑的劑型、或是抗體之結合力價等有所不同，但例如可使用0.001mg/kg~100mg/kg左右。
本發明之醫藥組成物可使用作為全身性紅斑狼瘡、風濕性關節炎、特發性血小板減少性紫瘢病、重症肌無力症、格雷氏病、視神經脊髓炎、自體免疫性溶血性貧血、天疱瘡、抗磷脂抗體症候群、ANCA相關血管炎、Sjogren氏症候群、橋本病、慢性發炎去髓鞘型多發性神經病變及慢性疲勞症候群等之自體免疫疾病的治療劑。
本發明中包含：包含本發明之抗人類Igβ抗體之全身性紅斑狼瘡、風濕性關節炎或突發性血小板減少性紫瘢病之預防或治療用醫藥組成物。又，本發明中包含：包含投予本發明之抗人類Igβ抗體之治療有效量的步驟之治療或預防全身性紅斑狼瘡、風濕性關節炎或突發性血小板減少性紫瘢病的方法。又，本發明中包含：用以使用於全身性紅斑狼瘡、風濕性關節炎或突發性血小板減少性紫瘢病之預防或治療的本發明之抗人類Igβ抗體。又，本發明中包含：全身性紅斑狼瘡、風濕性關節炎或突發性血小板減少性紫瘢病之預防或治療用醫藥組成物之製造中，本發明之抗人類Igβ抗體的使用。
雖此處提供為了可進一步地理解本發明而參 照之特定的實施例，但此等係作為例示之目的，並未限定本發明。
〔實施例〕
關於使用市售之套組或試藥等的部分，若無特別說明則依照附加的實驗室指南進行實驗。
(實施例1：人類及猴子Igβ-Flag蛋白質之取得)
取得使Flag標誌結合於人類Igβ的蛋白質(人類Igβ-Flag蛋白質)及使Flag標誌結合於猴子Igβ的蛋白質(猴子Igβ-Flag蛋白質)。將人類Igβ-Flag基因(序列編號13)重組於GS載體pEE6.4(Lonza Biologics公司)。將猴子Igβ-Flag基因(序列編號14)重組於GS載體pEE6.4(Lonza Biologics公司)。將製作之各載體使用FreeStyle MAX Reagent(Life Technologies公司)基因導入FreeStyle 293細胞(Life Technologies公司)。將各細胞以使用FreeStyle 293 Expression medium(Life Technologies公司)之無血清培養系培養1週後，分別取得含有人類Igβ-Flag蛋白質或猴子Igβ-Flag蛋白質之培養上清液。由取得之培養上清液使用抗FLAG M2抗體親合性凝膠(SIGMA-ALDRICH公司)純化蛋白質，使用於以下實驗。
(實施例2：抗人類Igβ抗體之取得)
為了取得抗人類Igβ抗體，於C3H/HeJJmsSlc-lpr/lpr小鼠(日本SLC)，與引起免疫反應之佐劑一起，以實施例1所取得之人類Igβ-Flag蛋白質及猴子Igβ-Flag蛋白質進行免疫。小鼠進行數次免疫，進行最終免疫。依尋常法，摘出經免疫之小鼠的脾臟或淋巴結收集淋巴球，藉由將此與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0(ATCC CRL-1581)進行細胞融合來製作融合瘤。製作融合瘤之極限稀釋樣本，進行單株化。關於各株，進行擴大培養後變更培養基成無血清培養基之Hybridoma SFM(Life Technologies公司)，培養3~5日。由所得之培養上清液使用抗體純化套組Protein G Purification kit(Proteus公司)純化抗體。
關於由各株所得之抗體，評估對於人類及猴子Igβ-Flag蛋白質之結合活性、以及對於人類及猴子B細胞之結合活性。其結果發現，命名為CL6_40之抗體結合於人類及猴子Igβ-Flag蛋白質兩者，具有對於人類及猴子B細胞兩者之高結合活性。關於CL6_40，由融合瘤選殖編碼抗體之重鏈及輕鏈的基因，進行序列測定。
(實施例3：人類化抗體之製作)
將CL6_40之輕鏈及重鏈的CDR移植至其他人類抗體，製作複數之人類化抗體的重鏈及輕鏈之基因。使用GS載體(Lonza Biologics公司)，構築包含各人類化抗體之重鏈及輕鏈兩基因的表現載體。具體而言，分別於各人類化抗體之重鏈變異區基因之5’側連接編碼信號序列 (N.Whittle等，Protein Eng.,Vol.1,p.499-505,1987)的基因，及於3’側連接具有S239D、H268D及L328W之胺基酸變異的人類Igγ1之恆定區基因(由序列編號1之鹼基編號358至1350之鹼基序列而成)，將此重鏈基因插入GS載體pEE6.4。又，分別於此等各人類化抗體之輕鏈變異區基因之5’側連接編碼信號序列(N.Whittle等，如前)之基因，及於3’側連接人類κ鏈之恆定區基因(由序列編號3之鹼基編號337至657之鹼基序列而成))，將此輕鏈基因插入GS載體pEE12.4。
分別將所製作之人類化抗體CL6_40m12_DDW之重鏈的鹼基序列表示於序列編號1及序列編號15，由其所編碼之胺基酸序列表示於序列編號2，該抗體之輕鏈的鹼基序列表示於序列編號3，由其所編碼之胺基酸序列表示於序列編號4。序列編號2所示重鏈之變異區係由序列編號2之胺基酸編號1至119之胺基酸序列而成，重鏈之CDR1、CDR2、CDR3係分別由序列編號2之胺基酸編號31至35、50至65、98至108之胺基酸序列而成。序列編號4所示輕鏈之變異區係由序列編號4之胺基酸編號1至112之胺基酸序列而成，輕鏈之CDR1、CDR2、CDR3係分別由序列編號4之胺基酸編號24至38、54至60、93至101之胺基酸序列而成。
分別將所製作之人類化抗體CL6_40m14_DDW之重鏈的鹼基序列表示於序列編號5，由其所編碼之胺基酸序列表示於序列編號6，該抗體之輕 鏈的鹼基序列表示於序列編號7，由其所編碼之胺基酸序列表示於序列編號8。序列編號6所示重之變異區係由序列編號6之胺基酸編號1至119之胺基酸序列而成，重鏈之CDR1、CDR2、CDR3係分別由序列編號6之胺基酸編號31至35、50至65、98至108之胺基酸序列而成。序列編號8所示輕鏈之變異區係由序列編號8之胺基酸編號1至112之胺基酸序列而成，輕鏈之CDR1、CDR2、CDR3係分別由序列編號8之胺基酸編號24至38、54至60、93至101之胺基酸序列而成。
分別將所製作之人類化抗體CL6_40m16_DDW之重鏈的鹼基序列表示於序列編號9，由其所編碼之胺基酸序列表示於序列編號10，該抗體之輕鏈的鹼基序列表示於序列編號11，由其所編碼之胺基酸序列表示於序列編號12。序列編號10所示重鏈之變異區係由序列編號10之胺基酸編號1至119之胺基酸序列而成，重鏈之CDR1、CDR2、CDR3係分別由序列編號10之胺基酸編號31至35、50至65、98至108之胺基酸序列而成。序列編號12所示輕鏈之變異區係由序列編號12之胺基酸編號1至112之胺基酸序列而成，輕鏈之CDR1、CDR2、CDR3係分別由序列編號12之胺基酸編號24至38、54至60、93至101之胺基酸序列而成。
序列編號6及10所示各重鏈之CDR1、CDR2、CDR3與序列編號2所示重鏈之CDR1、CDR2、CDR3相同，序列編號8及12所示各輕鏈之CDR1、 CDR2、CDR3與序列編號4所示輕鏈之CDR1、CDR2、CDR3相同。
為了製作各人類化抗體，將分別插入各抗體之重鏈及輕鏈之基因的前述GS載體以NotI及PvuI進行限制酶切斷，使用Ligation-Convenience Kit(NIPPONGENE公司)進行接合，構築經插入重鏈及輕鏈兩基因的Double-Gene載體。對經以Expi293 Expression medium(Life Technologies公司)培養至約300萬個/mL的Expi293細胞(Life Technologies公司)，將Double-Gene載體使用ExpiFectamine293(Life Technologies公司)進行轉染，培養5日。由其培養上清液使用蛋白質G(GE Healthcare Japan公司)，得到各人類化抗體之純化抗體。關於恆常表現，藉由將前述Double-Gene載體轉染至CHO-K1SV細胞(Lonza Biologics公司)使抗體表現。由其培養上清液使用MabSelect SuRe(GE Healthcare Japan公司)，得到各人類化抗體之純化抗體。分析經純化之各人類化抗體之胺基酸修飾的結果，純化抗體之大部分中分別發生：CL6_40m12_DDW中為重鏈C末端之離胺酸的缺失，CL6_40m14_DDW中為重鏈N末端之焦麩醯胺變換及重鏈C末端之離胺酸缺失，CL6_40m16_DDW中為重鏈C末端之離胺酸缺失。
(實施例4：對於抗原之ELISA分析)
為了測定人類化抗體之抗原結合活性，使用抗原ELISA。將實施例1所取得之人類Igβ-Flag蛋白質以Tris緩衝生理食鹽水(TBS；Wako Pure Chemical Industries公司)調製成為5000ng/mL之濃度，並以每1孔15μL添加至Nunc MaxiSorp白色384盤(Maxisorp 384 plate；Nunc公司)於室溫1小時使其固相化。以TBS-T(含有0.05% Tween-20之TBS；Wako Pure Chemical Industries公司)洗淨2次後，添加封鎖劑(Blocking One；nacalai tesque公司)120μL，於室溫靜置1小時後，除去該溶液。使用封鎖劑與TBS等量加入之稀釋溶液，製作實施例3所取得之各人類化抗體之稀釋系列(終濃度為0.46ng/mL~1μg/mL之8階段)，添加15μL。於室溫靜置1小時後，以TBS-T洗淨液洗淨3次，添加以稀釋溶液稀釋成3000倍之辣根過氧化酶標記兔子抗人類Ig抗體(DAKO公司)20μL。於室溫靜置1小時後，以TBS-T洗淨液洗淨3次。加入化學發光檢測試藥之BM-Chemiluminescence ELISA Substrate(POD)(Roche Diagnostics公司)30μL，以EnVision計數器(PerkinElmer公司)測定化學發光量。以相同方法，亦實施使用實施例1所取得之猴子Igβ-Flag蛋白質之抗原ELISA分析。算出被驗抗體之各濃度中結合活性，將未添加被驗抗體之孔的測定值作為0%，被驗抗體之最大活性之收斂值設定為100%。解析所算出之結合活性，藉由擬合曲線算出被驗抗體之EC50值。
其結果，CL6_40m12_DDW之對於人類及猴子Igβ-Flag蛋白質之EC50值，分別為128ng/mL及183ng/mL。CL6_40m14_DDW之對於人類及猴子Igβ-Flag蛋白質之EC50值，分別為100ng/mL及106ng/mL。CL6_40m16_DDW之對於人類及猴子Igβ-Flag蛋白質之EC50值，分別為132ng/mL及118ng/mL。可確認各人類化抗體對於人類及猴子Igβ-Flag蛋白質兩者皆具有高結合活性。
(實施例5：對於人類及猴子PBMC之FACS解析)
為了評估對於人類及猴子B細胞之人類化抗體的結合活性，使用人類及猴子PBMC，以該等PBMC中所含之B細胞作為對象，以B細胞標記之CD20為指標進行Fluorescence Activated Cell Sorting(FACS)。猴子PBMC係藉由將猴子血液以等量之PBS(Life Technologies公司)稀釋後，疊加至等量之Ficoll(GE Healthcare Japan公司)上，以室溫、1500rpm、30分鐘離心處理所調製。將人類PBMC(AllCells公司)或猴子PBMC以96孔盤(Greiner公司)中每1孔20萬個懸浮於30μL之Stain Buffer(Becton,Dickinson公司)進行播種。使用Stain Buffer，製作實施例3所取得之各人類化抗體的稀釋系列(終濃度為0.03μg/mL~30μg/mL之4階段)，添加30μL。於冰上靜置30分鐘後，以Stain Buffe洗淨3次，添加以Stain Buffer稀釋200倍之藻紅素標記 山羊抗人類IgG Fcγ片段(JACKSON公司)與稀釋8倍之異藻藍素標記小鼠抗CD20抗體(Becton,Dickinson公司)的溶液40μL。於冰上靜置30分鐘後，以Stain Buffer洗淨2次後，以FACSArray(Becton,Dickinson公司)測定螢光強度，算出平均螢光強度(mean fluorescence intensity；MFI)。解析係使用FlowJo(TOMY DIGITAL BIOLOGY公司)。
其結果，可確認各人類化抗體對於人類及猴子B細胞兩者皆具有高結合活性。
(實施例6：人類B細胞中之抗IgM抗體誘發細胞增殖活性評估)
為了評估對於因BCR刺激之人類B細胞的活性化之人類化抗體的阻礙效果，評估了人類B細胞中之抗IgM抗體誘發細胞增殖活性。抗IgM抗體藉由使BCR凝集而導致B細胞之活性化。結合於BCR及FcγRIIb雙方的抗體，將FcγRIIb動員至BCR，據此可阻礙B細胞之增殖。本實施例中，作為比較抗體，使用anti-CD19 S267E/L328F(專利文獻2)。作為對照抗體，使用針對生物體內不存在之抗原即KLH(keyhole limpet hemocyanin)的人類IgG1抗體(anti-KLH Ab)(國際公開第2013/094723號)。將人類B細胞(AllCells公司)以每1孔約3萬個，且以60μL之RPMI培養基(SIGMA-ALDRICH公司)播種至96孔盤(Iwaki公司)。使用 RPMI培養基，製作實施例3所取得之各人類化抗體、anti-CD19 S267E/L328F、或anti-KLH Ab之稀釋系列(終濃度為0.3μg/mL~30μg/mL之3階段)，添加20μL。添加20μL之以RPMI培養基調製成終濃度為5μg/mL之抗IgM抗體(JACKSON公司)，以CO2培養箱培養4日。之後，使用CellTiter-Glo(Promega公司)，進行細胞增殖解析。又，本實施例中，作為陰性對照調製被驗抗體未添加/抗IgM抗體未添加組、作為陽性對照調製被驗抗體未添加/抗IgM抗體添加組進行試驗。各被驗抗體中，以二重複進行試驗。
人類B細胞之增殖率的結果表示於圖1。被驗抗體未添加/抗IgM抗體未添加組作為陰性對照(增殖率0%)、被驗抗體未添加/抗IgM抗體添加組作為陽性對照(增殖率100%)，算出被驗抗體投予組之增殖率。該增殖率之值越小意指被驗抗體之對於BCR之抑制活性越強。
如圖1所示，相對於anti-CD19 S267E/L328F之30μg/mL之增殖率為52.3%，CL6_40m12_DDW、CL6_40m14_DDW及CL6_40m16_DDW之30μ.g/mL之增殖率分別為2.8%、20.2%及23.2%。因此，明白前述人類化抗體與anti-CD19 S267E/L328F相比，對於人類B細胞中之抗IgM抗體誘發細胞增殖皆具有強阻礙活性。
(實施例7：人類PBMC移人NOG小鼠模式之藥效評 估)
以確認對於人類化抗體之in vivo抗體產生之有效性為目的，評估治療投予針對藉由將人類PBMC移入NOG小鼠所引起之人類抗體價上升的各種抗體之作用。模式中，因辨認異物(小鼠)而強烈活性化之人類B細胞，被認為於小鼠體內分化成漿(母)細胞，認為對於針對人類B系列細胞之活性化的被驗藥之藥理作用係適合的模式。
人類PBMC(AllCells公司)以PBS(Wako Pure Chemical Industries公司)懸浮成1000萬個/mL，尾靜脈內投予0.25mL(250萬個)至11週齡之雄性NOG小鼠(invivoscience公司)。於Day34(PBMC移入後34日)實施體重測定及採血。以ELISA(Bethyl Laboratories公司)測定血漿中人類IgM及IgE抗體價。基於血漿中人類IgM、IgE抗體價及體重之數據實施分組。
本實施例中，作為比較抗體，使用anti-CD19 S267E/L328F。作為對照抗體，使用anti-KLH Ab。於Day35及42以10mg/10mL/kg皮下投予被驗抗體至小鼠。於Day42及Day49實施採血，以ELISA(Bethyl Laboratories公司)測定血漿中人類IgM及IgE抗體價。實驗以4-5隻/組實施。實驗結果以平均值±標準誤差表示。anti-KLH Ab組與各種被驗抗體組之顯著差異檢測使用非配對Student’s t-test，p值未達0.05時被認為是統計上顯著的。以上之檢測使用GraphPad Prism(版本 5.04)來進行。
被驗抗體對於血漿中人類IgM抗體價的作用表示於圖2。與anti-KLH Ab相比，CL6_40m12_DDW及CL6_40m14_DDW使血漿中人類IgM抗體價顯著地降低。CL6_40m12_DDW及CL6_40m14_DDW對於血漿中人類IgM抗體價的降低作用之展現非常早，於投予開始後1週(Day42)可觀察到。另一方面，anti-CD19 S267E/L328F僅於投予開始後2週(Day49)顯示對血漿中人類IgM抗體價之顯著降低作用。
接著，被驗抗體對於血漿中人類IgE抗體價的作用表示於圖3。與anti-KLH Ab相比，CL6_40m12_DDW及CL6_40m14_DDW使血漿中人類IgE抗體價急速且顯著地降低。另一方面，anti-CD19 S267E/L328F未使漿中人類IgE抗體價降低。
如圖2及圖3所示，明白前述CL6_40m12_DDW及CL6_40m14_DDW與anti-CD19 S267E/L328F相比，對於人類抗體價之上升皆具有強阻礙活性。
(實施例8：猴子TTx抗原致敏模式中之藥效評估)
藉由以吸附破傷風類毒素(TTx)抗原使猴子致敏1次產生TTx抗原特異性IgG。本模式中，血漿中之TTx抗原特異性IgG之外，亦可評估血漿中之總抗體價。因此，本模式對於自體免疫疾病之治療除了有效性之外，安全性 之評估亦為可能。
使用雄性食蟹猴(生產地：中國、3歲以上)，於唑拉西泮(Zolazepam)鹽酸鹽2-5mg/kg(0.05mL/kg；USP公司)及替來他明(Tiletamine)鹽酸鹽2.5-5mg/kg(0.25mL/kg；USP公司)之混合麻醉下以TTx致敏(致敏日作為Day0)。TTx之致敏藉由將破傷風類毒素(TTx、10Lf/mL、電化生研公司)以0.6mL/猴子注入大腿部肌肉內，以0.6mL/猴子注入背部皮內(12處各50μL)來進行。作為處理組，使用Vehicle組(溶劑(20mM檸檬酸鈉緩衝液/120mM NaCl(pH6.0)；KOHJIN BIO公司)、1mL/kg、n=3)及抗體投予組(10mg/1mL/kg、人類化抗體CL6_40m14_DDW(以溶劑稀釋)、n=3)。投予之時間點為TTx致敏14日後，清醒下由靜脈以1mL/kg之投予容量進行。
上述食蟹猴中CL6_40m14_DDW投予4小時後、72小時後、168小時後及336小時後隨時間進行採血，離心後，回收血漿。血漿中藥物濃度使用GyrolabTM xP workstation(Gyros AB公司)進行測定。方法及圓盤使用200-3W-001-A及Bioaffy 200 compact discs(Gyros AB公司)。又，於固相化抗原及檢出抗體使用biotin標誌化之Recombinant Human CD79B(Novoprotein公司)及alexa標誌化之Goat Anti-Human IgG(Southern Biotechnology Associates公司)。如表1所示，CL6_40m14_DDW之血漿中藥物濃度在本模式之評估期間 中，維持著。
表1：猴子中之人類化抗Igβ抗體的血漿中藥物濃度推移
Figure 104125426-A0202-12-0047-1
上述食蟹猴於Day13(經吸附破傷風類毒素免疫13日後)、Day14、Day17、Day21及Day28隨時間進行採血，離心後，回收血漿。為了測定所回收之血漿中的抗吸附破傷風類毒素抗體價(anti-TTx IgG)，使用抗原ELISA。將吸附破傷風類毒素(電化生研公司)，以磷酸緩衝生理食鹽水(PBS；Wako Pure Chemical Industries公司)稀釋20倍，於Nunc MaxiSorp 96盤(Maxisorp 96 plate；Nunc公司)每1孔添加100μL，於4℃一晚進行固相化。以PBS-T(含有0.05% Tween-20之PBS；Thermo Scientific公司)洗淨4次後，添加封鎖劑(Blocker Casein in PBS；Life Technologies公司)200μL，於室溫靜置2小時後，除去溶液。接著，將回收之血漿及校正曲線用樣本分別添加100μL。校正曲線樣本係使用將經吸附破傷風類毒素免疫之食蟹猴於21日後及23日後所採取的 血漿混合者作為100U/mL，用封鎖劑做為稀釋溶液調製之稀釋系列(0.488mU/mL~500mU/mL)。於室溫靜置2小時後，以PBS-T洗淨液洗淨4次，添加以封鎖劑稀釋成3000倍之辣根過氧化酶標記山羊抗猴子IgG抗體(Nordic公司)100μL。於室溫靜置1小時後，以PBS-T洗淨液洗淨4次。之後，使用TMB Microwell Peroxidase Substrate System(KPL公司)進行測定。吸光度以SpectraMax(分子裝置公司)測定。
被驗抗體對於血漿中抗吸附破傷風類毒素抗體價的作用如圖4所示。CL6_40m14_DDW與Vehicle組相比，使血漿中抗吸附破傷風類毒素抗體價(anti-TTx IgG)降低。
上述由食蟹猴回收之Day14、Day17、Day21及Day28之血漿中的總抗體價(IgM、IgA、IgG)使用以下之方法進行測定。將兔子抗猴子IgM多株抗體(COVANCE公司)、山羊抗人類IgA多株抗體(Bethyl Laboratories公司)、山羊抗人類IgG多株抗體(Bethyl Laboratories公司)，以磷酸緩衝生理食鹽水(PBS；Wako Pure Chemical Industries公司)分別稀釋100倍、500倍、1000倍，於Nunc MaxiSorp96盤(Maxisorp 96 plate；Nunc公司)添加100μL於4℃一晚進行固相化。以PBS-T(含有0.05% Tween-20之PBS；Thermo Scientific公司)洗淨4次後，添加封鎖劑(Blocker Casein in PBS；Life Technologies公司)200μL，於室溫 靜置1小時後，以PBS-T洗淨液洗淨4次。用封鎖劑作為稀釋溶液，製作校正曲線用樣本及所採取之猴子血漿的稀釋系列，添加100μL。於校正曲線用樣本，稀釋由正常食蟹猴所調製之血漿來使用。於室溫靜置2小時，以PBS-T洗淨液洗淨4次後，將辣根過氧化酶標記抗猴子IgM抗體(KPL公司)、辣根過氧化酶標記抗人類IgA抗體(Bethyl Laboratories公司)、辣根過氧化酶標記抗猴子IgG抗體(KPL公司)以封鎖劑分別稀釋成1000倍、5000倍、3000倍，添加100μL。於室溫靜置2小後，以PBS-T洗淨液洗淨4次。之後，使用TMB Microwell Peroxidase Substrate System(KPL公司)進行測定。吸光度以SpectraMax(分子裝置公司)測定。
被驗抗體血漿中之總抗體價(IgM、IgA、IgG)的作用分別表示於圖5、6及7。CL6_40m14_DDW與Vehicle組相比，對於血漿中之總抗體價(IgM、IgA、IgG)沒有影響。
由此等結果明白，CL6_40m14_DDW對於血漿中之總抗體價沒有影響，抑制抗原特異性抗體。對於自體免疫疾病之治療，除有效性之外，於安全性亦具有優異之輪廓。
〔產業上之可利用性〕
本發明之抗人類Igβ抗體對於自體免疫疾病之預防或治療為有用。又，本發明之生產多核苷酸、表現 載體、經轉型之宿主細胞及抗體的方法對於產生前述抗人類Igβ抗體為有用。
〔序列表自由文本〕
於以下之序列表之數字標題<223>記載有「Artificial Sequence」之說明。具體而言，序列表之序列編號1及3所示鹼基序列分別為CL6_40m12_DDW之重鏈及輕鏈之鹼基序列，序列表之序列編號2及4所示胺基酸序列分別為由序列編號1及3所編碼之重鏈及輕鏈之胺基酸序列。序列表之序列編號5及7所示鹼基序列分別為CL6_40m14_DDW之重鏈及輕鏈之鹼基序列，序列表之序列編號6及8所示胺基酸序列分別為由序列編號5及7所編碼之重鏈及輕鏈之胺基酸序列。序列表之序列編號9及11所示鹼基序列分別為CL6_40m16_DDW之重鏈及輕鏈之鹼基序列，序列表之序列編號10及12所示胺基酸序列分別為由序列編號9及11所編碼之重鏈及輕鏈之胺基酸序列。序列表之序列編號13所示鹼基序列為人類Igβ-Flag基因之鹼基序列，序列表之序列編號14所示鹼基序列為猴子Igβ-Flag基因之鹼基序列。序列表之序列編號15所示鹼基序列為CL6_40m12_DDW之重鏈之鹼基序列。
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<210> 1
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 抗人類Ig-β抗體的重鏈
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<213> 人工序列
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<223> 抗人類Ig-β抗體的輕鏈
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<212> DNA
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<223> 抗人類Ig-β抗體的重鏈
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<221> CDS
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Figure 104125426-A0305-02-0070-18
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<223> 抗人類Ig-β抗體的輕鏈
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<212> PRT
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<223> 合成構築
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<223> 人類Igβ-Flag融合基因
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<223> 抗人類Ig-β抗體的重鏈
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Figure 104125426-A0305-02-0080-26

Claims (23)

  1. 一種抗人類Igβ抗體，其包含下述重鏈變異區以及下述輕鏈變異區，且包含下述重鏈恆定區：包含由序列編號2之胺基酸編號31至35之胺基酸序列而成之CDR1、由序列編號2之胺基酸編號50至65之胺基酸序列而成之CDR2、及由序列編號2之胺基酸編號98至108之胺基酸序列而成之CDR3的重鏈變異區；包含由序列編號4之胺基酸編號24至38之胺基酸序列而成之CDR1、由序列編號4之胺基酸編號54至60之胺基酸序列而成之CDR2、及由序列編號4之胺基酸編號93至101之胺基酸序列而成之CDR3的輕鏈變異區；具有S239D、H268D及L328W之胺基酸變異的人類Igγ1恆定區的重鏈恆定區。
  2. 如請求項1之抗人類Igβ抗體，其係選自以下(1)~(4)所成群：(1)抗人類Igβ抗體，其包含由序列編號6之胺基酸編號1至119之胺基酸序列而成之重鏈變異區、及由序列編號8之胺基酸編號1至112之胺基酸序列而成之輕鏈變異區，且包含具有S239D、H268D及L328W之胺基酸變異的人類Igγ1恆定區之重鏈恆定區；(2)抗人類Igβ抗體，其包含由序列編號2之胺基酸編號1至119之胺基酸序列而成之重鏈變異區、及由序列編號4之胺基酸編號1至112之胺基酸序列而成之輕鏈變異區，且包含具有S239D、H268D及L328W之胺基酸變異的人類Igγ1恆定區之重鏈恆定區； (3)抗人類Igβ抗體，其包含由序列編號10之胺基酸編號1至119之胺基酸序列而成之重鏈變異區、及由序列編號12之胺基酸編號1至112之胺基酸序列而成之輕鏈變異區，且包含具有S239D、H268D及L328W之胺基酸變異的人類Igγ1恆定區之重鏈恆定區；以及(4)抗人類Igβ抗體，其由上述(1)~(3)中任一項之抗人類Igβ抗體之轉譯後修飾所生，前述轉譯後修飾係重鏈變異區N末端之焦麩胺醯基化及/或重鏈C末端之離胺酸缺失。
  3. 如請求項2之抗人類Igβ抗體，其係選自以下(1)~(4)所成群：(1)抗人類Igβ抗體，其包含由序列編號6所示胺基酸序列而成之重鏈、及由序列編號8所示胺基酸序列而成之輕鏈；(2)抗人類Igβ抗體，其包含由序列編號2所示胺基酸序列而成之重鏈、及由序列編號4所示胺基酸序列而成之輕鏈；(3)抗人類Igβ抗體，其包含由序列編號10所示胺基酸序列而成之重鏈、及由序列編號12所示胺基酸序列而成之輕鏈；以及(4)抗人類Igβ抗體，其係由上述(1)~(3)中任一項之抗人類Igβ抗體之轉譯後修飾所生，前述轉譯後修飾係重鏈變異區N末端之焦麩胺醯基化及/或重鏈C末端之離胺酸缺失。
  4. 如請求項3之抗人類Igβ抗體，其係選自以下(1)~(6)所成群：(1)抗人類Igβ抗體，其包含由序列編號6所示胺基酸序列而成之重鏈、及由序列編號8所示胺基酸序列而成之輕鏈；(2)抗人類Igβ抗體，其包含胺基酸編號1之麩醯胺經修飾成焦麩胺酸之由序列編號6之胺基酸編號1至448之胺基酸序列而成之重鏈、及由序列編號8所示胺基酸序列而成之輕鏈；(3)抗人類Igβ抗體，其包含由序列編號2所示胺基酸序列而成之重鏈、及由序列編號4所示胺基酸序列而成之輕鏈；(4)抗人類Igβ抗體，其包含由序列編號2之胺基酸編號1至448之胺基酸序列而成之重鏈、及由序列編號4所示胺基酸序列而成之輕鏈；(5)抗人類Igβ抗體，其包含由序列編號10所示胺基酸序列而成之重鏈、及由序列編號12所示胺基酸序列而成之輕鏈；以及(6)抗人類Igβ抗體，其包含由序列編號10之胺基酸編號1至448之胺基酸序列而成之重鏈、及由序列編號12所示胺基酸序列而成之輕鏈。
  5. 如請求項4之抗人類Igβ抗體，其包含由序列編號6所示胺基酸序列而成之重鏈、及由序列編號8所示胺基酸序列而成之輕鏈。
  6. 如請求項4之抗人類Igβ抗體，其包含胺基酸編號1之麩醯胺經修飾成焦麩胺酸之由序列編號6之胺基酸編號1至448之胺基酸序列而成之重鏈、及由序列編號8所示胺基酸序列而成之輕鏈。
  7. 一種多核苷酸，其係選自下述(1)~(2)所成群：(1)多核苷酸，其包含編碼如請求項2之(1)~(3)中任一項之抗人類Igβ抗體之重鏈的鹼基序列；及(2)多核苷酸，其包含編碼如請求項2之(1)~(3)中任一項之抗人類Igβ抗體之輕鏈的鹼基序列。
  8. 一種多核苷酸，其係選自下述(1)~(2)所成群：(1)多核苷酸，其包含編碼如請求項5之抗人類Igβ抗體之重鏈的鹼基序列；及(2)多核苷酸，其包含編碼如請求項5之抗人類Igβ抗體之輕鏈的鹼基序列。
  9. 一種表現載體，其包含下述(1)及/或(2)：(1)多核苷酸，其包含編碼如請求項2之(1)~(3)中任一項之抗人類Igβ抗體之重鏈的鹼基序列，及/或(2)多核苷酸，其包含編碼如請求項2之(1)~(3)中任一項之抗人類Igβ抗體之輕鏈的鹼基序列。
  10. 一種表現載體，其包含下述(1)及/或(2)：(1)多核苷酸，其包含編碼如請求項5之抗人類Igβ 抗體之重鏈的鹼基序列，及/或(2)多核苷酸，其包含編碼如請求項5之抗人類Igβ抗體之輕鏈的鹼基序列。
  11. 一種宿主細胞，其係選自以下(a)~(d)所成群：(a)宿主細胞，其經含有包含編碼如請求項2之(1)~(3)中任一項之抗人類Igβ抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸及包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型；(b)宿主細胞，其經含有包含編碼如請求項2之(1)~(3)中任一項之抗人類Igβ抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體及含有包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型；(c)宿主細胞，其經含有包含編碼如請求項2之(1)~(3)中任一項之抗人類Igβ抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型；及(d)宿主細胞，其經含有包含編碼如請求項2之(1)~(3)中任一項之抗人類Igβ抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型。
  12. 一種宿主細胞，其係選自以下(a)~(d)所成群：(a)宿主細胞，其經含有包含編碼如請求項5之抗人類Igβ抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸及包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型； (b)宿主細胞，其經含有包含編碼如請求項5之抗人類Igβ抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體及含有包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型；(c)宿主細胞，其經含有包含編碼如請求項5之抗人類Igβ抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型；及(d)宿主細胞，其經含有包含編碼如請求項5之抗人類Igβ抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型。
  13. 一種生產抗人類Igβ抗體之方法，其包含培養選自以下(a)~(c)所成群之宿主細胞，使抗人類Igβ抗體表現之步驟：(a)經含有包含編碼如請求項2之(1)~(3)中任一項之抗人類Igβ抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸及包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型之宿主細胞；(b)經含有包含編碼如請求項2之(1)~(3)中任一項之抗人類Igβ抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體及含有包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型之宿主細胞；以及(c)經含有包含編碼如請求項2之(1)~(3)中任一項之抗人類Igβ抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型之宿主細胞、及經含有包含編碼該抗體之輕 鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型之宿主細胞。
  14. 一種生產抗人類Igβ抗體之方法，其包含培養選自以下(a)~(c)所成群之宿主細胞，使抗人類Igβ抗體表現之步驟：(a)經含有包含編碼如請求項5之抗人類Igβ抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸及包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型之宿主細胞；(b)經含有包含編碼如請求項5之抗人類Igβ抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體及含有包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型之宿主細胞；以及(c)經含有包含編碼如請求項5之抗人類Igβ抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型之宿主細胞、及經含有包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體所轉型之宿主細胞。
  15. 一種醫藥組成物，其包含選自由以下之(a)~(c)所成群中之至少一個的抗人類Igβ抗體及藥學上容許之賦形劑：(a)包含由序列編號6所示胺基酸序列而成之重鏈及由序列編號8所示胺基酸序列而成之輕鏈的抗人類Igβ抗體，以及/或，包含胺基酸編號1之麩醯胺經修飾成焦麩胺酸之由序列編號6之胺基酸編號1至448之胺基酸序列而成之重鏈及由序列編號8所示胺基酸序列而成之輕鏈的抗人類Igβ抗體； (b)包含由序列編號2所示胺基酸序列而成之重鏈及由序列編號4所示胺基酸序列而成之輕鏈的抗人類Igβ抗體，以及/或，包含由序列編號2之胺基酸編號1至448之胺基酸序列而成之重鏈及由序列編號4所示胺基酸序列而成之輕鏈的抗人類Igβ抗體；以及(c)包含由序列編號10所示胺基酸序列而成之重鏈及由序列編號12所示胺基酸序列而成之輕鏈的抗人類Igβ抗體，以及/或，包含由序列編號10之胺基酸編號1至448之胺基酸序列而成之重鏈及由序列編號12所示胺基酸序列而成之輕鏈的抗人類Igβ抗體。
  16. 一種醫藥組成物，其包含抗人類Igβ抗體、及藥學上容許之賦形劑，前述抗人類Igβ抗體係(1)包含由序列編號6所示胺基酸序列而成之重鏈及由序列編號8所示胺基酸序列而成之輕鏈的抗人類Igβ抗體，以及/或，(2)包含胺基酸編號1之麩醯胺經修飾成焦麩胺酸之由序列編號6之胺基酸編號1至448之胺基酸序列而成之重鏈及由序列編號8所示胺基酸序列而成之輕鏈的抗人類Igβ抗體。
  17. 如請求項16之醫藥組成物，其係自體免疫疾病之預防或治療用之醫藥組成物。
  18. 如請求項17之醫藥組成物，其中自體免疫疾病係全身性紅斑狼瘡、風濕性關節炎或特發性血小板減少性紫瘢病。
  19. 一種抗人類Igβ抗體，其係用以使用於自體免疫疾 病之預防或治療，其係(1)包含由序列編號6所示胺基酸序列而成之重鏈及由序列編號8所示胺基酸序列而成之輕鏈的抗人類Igβ抗體，以及/或，(2)包含胺基酸編號1之麩醯胺經修飾成焦麩胺酸之由序列編號6之胺基酸編號1至448之胺基酸序列而成之重鏈及由序列編號8所示胺基酸序列而成之輕鏈的抗人類Igβ抗體。
  20. 如請求項19之抗人類Igβ抗體，其中自體免疫疾病係全身性紅斑狼瘡、風濕性關節炎或特發性血小板減少性紫瘢病。
  21. 一種抗人類Igβ抗體之使用於自體免疫疾病之預防或治療用醫藥組成物之製造中的用途，前述抗人類Igβ抗體係(1)包含由序列編號6所示胺基酸序列而成之重鏈及由序列編號8所示胺基酸序列而成之輕鏈的抗人類Igβ抗體，以及/或，(2)包含胺基酸編號1之麩醯胺經修飾成焦麩胺酸之由序列編號6之胺基酸編號1至448之胺基酸序列而成之重鏈及由序列編號8所示胺基酸序列而成之輕鏈的抗人類Igβ抗體。
  22. 如請求項21之用途，其中自體免疫疾病係全身性紅斑狼瘡、風濕性關節炎或特發性血小板減少性紫瘢病。
  23. 如請求項2之抗人類Igβ抗體，其係抗體與其他胜肽或蛋白質的融合體，或是與修飾劑結合的修飾體。
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