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TWI675849B - 化合物或其美容學上可接受的鹽用於減少皺紋之用途 - Google Patents

化合物或其美容學上可接受的鹽用於減少皺紋之用途 Download PDF

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TWI675849B
TWI675849B TW106134242A TW106134242A TWI675849B TW I675849 B TWI675849 B TW I675849B TW 106134242 A TW106134242 A TW 106134242A TW 106134242 A TW106134242 A TW 106134242A TW I675849 B TWI675849 B TW I675849B
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Abstract

本發明提供一種脂肪酸綴合的三肽和包含其的化妝品組合物，本發明在防止皮膚老化、減少皺紋、增強皮膚彈性和滲透皮膚方面提供優異的效果。

Description

化合物或其美容學上可接受的鹽用於減少皺紋之用途 相關申請案之交互參照
本申請主張於2016年10月4日向韓國智財局提交的韓國專利申請第10-2016-0127375號的權益，其公開內容透過引用併入本文。
本發明涉及脂肪酸綴合的三肽(fatty acid-conjugated tripeptide)和包含其的具有優異的減少皮膚皺紋的效果之化妝品組合物。
皮膚是重要的器官，其起到可保護人體，起到屏障功能、以及排泄功能等多種作用。然而，由於諸如污染物、紫外線、壓力等的外部環境因素，皮膚細胞受損並且使細胞的更新不正確地進行。結果，表皮、真皮和皮下組織的厚度變薄，皮膚的彈性降低，繼而形成皺紋。紫外線會對皮膚誘發活性氧(active oxygen)，從而增加對皮膚細胞的損壞和色素沉著，繼而導致皮膚主要成分的直接功能的損失以及皮膚老化。活性氧是造成人體疾病和老化的原因，且可作為衡量抗氧化活性(antioxidative activity)和抗衰老作用(anti-aging action)的指標來評估。皮膚老化的特徵可包含彈性下降、皺紋、斑點(freckles)、雀斑(ephelides)及其類似物。原因之一是為彈性纖維(elastic fibers)之膠原蛋白和彈性蛋白由脂質 過氧化引起(lipid peroxidation-induced)的的斷鍊、其異常的交聯以及玻尿酸(hyaluronic acid)的斷鍊。脂質過氧化是由在此期間產生為活性含氧物(reactive oxygen species，ROS)之自由基的氧化壓力所引起的。據載，這種自由基生成的過程不僅在對皮膚有害的代謝活化之前的階段發生，而且還對皮膚細胞和組織造成損害。具體來說，對於皺紋，活性氧可誘導基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)的表達，並且使肌膚有彈性的膠原蛋白或彈性蛋白退化或受到破壞，從而導致皺紋。膠原蛋白為構成真皮層基質的主要成分，因此調節膠原蛋白的生物合成和降解成為皮膚老化過程的關鍵。已知已開發出像是抗壞血酸(ascorbic acid)(美國專利號4,983,382)、維生素A(retinoid)(美國專利號4,877,805)及其衍生物之化合物之促進膠原蛋白產生的物質，以及包含其的化妝品組合物。然而，抗壞血酸在空氣和濕氣中容易被氧化，因此具有穩定性的問題，且據報導，維生素A並不穩定，並且在應用於皮膚時會引起皮膚刺激問題。
作為一種對皮膚刺激性小且具有減少皮膚皺紋作用的化合物，肽係為蛋白質的主要成分，其具有減少皺紋且對皮膚無副作用的優點。除了肽之外，RGD(精胺酸-甘胺酸-天門冬胺酸)(Arg-Gly-Asp)序列從二十世紀八十年代後期就是已知的細胞識別序列(cell recognition sequence)，並且從二十世紀九十年代早期就已經使用合成的RGD肽(Biochem J.(1993)296,21-24)。此外，根據論文，已知包含RGD的肽對整合素(intergin)介導的細胞附著具有影響，並且上述功能影響細胞生長(Annu Rev Cell Dev Biol.(1996)12：697-715)。現在，RGD被用作為活化膠原蛋白和減少皮膚皺紋的成分，但是肽由於其親水性並且難以穿透皮膚屏障而在實際減少皺紋的效果上受到限制。
為了克服現有技術的上述問題，本發明致力於解決親水性三肽RGD(精胺酸-甘胺酸-天門冬胺酸)穿透皮膚屏障的困難，其係藉由將各種疏水性脂肪酸與RGD綴合來製備具有親水-親脂結構的多種衍生物，因此透過鑑定衍生物對於減少皮膚皺紋具有高效力代表本發明已完成。
因此，本發明要達成的目的是提供下述化學式I的脂肪酸綴合的三肽或其美容學上可接受的鹽。
此外，本發明要達成的另一個目的是提供一種化妝品組合物，其包含下述化學式I的脂肪酸綴合的三肽或其美容學上可接受的鹽作為活性成分，以及其用於減少皺紋之用途。
本發明涉及脂肪酸綴合的三肽和包含其的具有優異的減少皮膚皺紋作用之化妝品組合物。
在下文中，將更詳細地描述本發明。
本發明提供為脂肪酸綴合的RGD的脂肪酸綴合的三肽或其美容學上可接受的鹽，更優選棕櫚醯-RGD(palmitoyl-RGD)或其美容學上可接受的鹽。
上述RGD是與已知具有膠原蛋白合成效果的精胺酸、甘胺酸和天門冬胺酸的三個氨基酸連接的三肽，因此被用作化妝品成分。
上述脂肪酸綴合的RGD係由如化學式I之通式表示：[化學式I]
Figure TWI675849B_D0001
其中n是11至16的整數。
而且，上述棕櫚醯-RGD是由下述化學式II，或Palm-Arg-Gly-Asp表示的化合物，其中化學式I中的n是15。
Figure TWI675849B_D0002
而且，本發明提供了上述化學式I的脂肪酸綴合的三肽(RGD)或包含其的化妝品組合物。
上述化妝品組合物在防止皮膚老化、減少皺紋、增強皮膚彈性和滲透皮膚方面提供了極好的效果，並在長期儲存的穩定性以及皮膚安全性上具有良好效果。
用上述化學式I的化合物處理的細胞的原膠原蛋白(procollagen)合成量可比用相同濃度的下述化學式III化合物處理的細胞多至少20%。
[化學式Ⅲ]
Figure TWI675849B_D0003
相對於化妝品組合物的總重量，本發明的化妝品組合物可包含0.0001~2wt%，優選地為0.01~0.05wt%的化學式I的化合物作為活性成分。
以及，本發明提供用於減少皺紋的化妝品組合物，其包含上述化學式I的脂肪酸綴合的三肽(RGD)或其美容學上可接受的鹽。
相對於化妝品組合物的總重量，本發明的化妝品組合物可包含0.0001~2wt%，優選地為0.01~0.05wt%的化學式I的化合物作為活性成分。
根據本發明的化妝品組合物的配方無特別限制，並且本發明的化妝品組合物可根據待製備的配方包含本領域已知的常規化妝品組合物組合。本發明的化妝品組合物可製成像是洗劑(lotion)、乳液(emulsion)、營養霜(nourishing cream)、面膜(pack)、美容液(beauty liquid)、精油(essence)等配方，也可以根據待製備的配方，透過選擇油、乳化劑(emulsifier)、乳化穩定劑(emulsion stabilizer)、保濕劑(humectant)、增稠劑(thickener)、防腐劑(preservative)、香料(fragrance)等來組合。
本發明提供了上述化學式I的化合物的製備方法，其包含以下步驟：(a)藉由使用具有受保護之N-末端，C-末端或其反應性殘基(reactive residue)之精胺酸衍生物、甘胺酸衍生物和天門冬胺酸衍生物在液相中合成三肽(精胺酸-甘胺酸-天門冬胺酸)衍生物； (b)藉由使上述三肽(精胺酸-甘胺酸-天門冬胺酸)衍生物與脂肪酸鹽反應，使精胺酸的N末端與脂肪酸綴合；以及(c)從上述脂肪酸綴合的三肽(精胺酸-甘胺酸-天門冬胺酸)衍生物除去三肽部分的保護基。
在下文中，將參照下面的反應式I詳細描述根據本發明的上述化學式II的棕櫚醯-RGD的製備方法。以下反應式I中所示的方法僅僅是可能的製備方法的代表，並且如果需要，可以適當地修改在以下反應式I中顯示的單元操作的順序、試劑、反應條件等。此外，可以使用藉由為一般肽合成方法的固相合成(solid synthesis)法所製備的RGD。
Figure TWI675849B_D0004
按照上述方法製備的本發明的棕櫚醯-RGD不僅穩定，而且在防止皮膚老化、減少皺紋、增強皮膚彈性和滲透皮膚方面具有優異的效果。
本發明的優點
根據本發明的脂肪酸綴合的三肽化合物在防止皮膚老化、減少皺紋、增強皮膚彈性和滲透皮膚方面提供了優異的效果。
第1圖係繪示說明脂肪酸綴合的RGD的細胞毒性實驗結果的圖。
第2圖係繪示說明脂肪酸綴合的RGD的原膠原蛋白合成效果比較的圖。
第3圖係繪示說明脂肪酸綴合的RGD的經皮吸收效果比較的圖。
第4圖至第6圖係繪示說明包含棕櫚醯-RGD的組合物減少眼眶周圍(periorbital)皺紋效果的圖。
第7圖係繪示說明包含棕櫚醯-RGD的組合物增強皮膚彈性效果的圖。
第8圖係繪示說明包含棕櫚醯-RGD的組合物改善皮膚真皮密度效果的圖。
本發明提供脂肪酸綴合的三肽和包含其的用於減少皮膚皺紋之化妝品組合物。
在本發明的一個具體實施例中，脂肪酸綴合的三肽可為棕櫚醯-RGD。
下文中，本發明將透過實施例進一步詳細描述。然而，此些實施例的記述僅作為本發明說明性之敘述，而不被解釋為對本發明範圍之限制。
製備實施例1：製備棕櫚醯-RGD
製備實施例1-1：合成Boc-Gly-Asp(OBn)2
將N-(叔丁氧基羰基)甘胺酸(N-(tert-butoxycarbonyl)glycine(N-Boc-Gly-OH),20g,114.17mmol)和L-天門冬胺酸二芐酯(L-aspartic acid dibenzyl ester,55.43g,114.17mmol)溶於四氫呋喃(tetrahydrofuran(THF),600mL)，在這之後，將其溫度降低到0℃，接著將1-羥基苯並三唑水合物(1-hydroxybenzotriazolehydrate(HOBt),18.51g,137.00mmol)和1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidehydrochloride(EDC．HCl),27.00g,137.00mmol)加入所得溶液中，再將三乙胺(triethylamine(TEA),55.69mL,399.59mmol)緩慢加入於其中。然後，將所得混合物在0℃下攪拌30分鐘，然後將所得溶液從冷卻浴中移出，並在室溫下攪拌整夜(over night)。將反應溶液濃縮，然後向所得濃縮物中加入水(320mL)和乙酸乙酯(ethyl acetate,400mL)以萃取兩次(400mL×2)，有機層用NaCl(aq)(300mL)潤洗，並以硫酸鈉(Na2SO4)乾燥，接著在壓力下過濾及濃縮。將濃縮物減壓乾燥，得到(S)-二芐基-2-(2-((叔丁氧基羰基)胺基)乙醯胺基)琥珀酸酯((S)-dibenzyl2-(2-((tert-butoxycarbonyl)amino)acetamido)succinate(Boc-Gly-Asp(OBn)2),64.53g,120%)的黃色油狀物，使得在沒有其純化過程的情況下進行下列反應。
製備實施例1-2：合成Gly-Asp(OBn)2HCl
(S)-二芐基-2-(2-((叔丁氧基羰基)胺基)乙醯胺基)琥珀酸酯(53.71g,114.15mmol)溶於乙酸乙酯(500mL)，之後向其中加入4M鹽酸(HCl)1,4-二[口咢]烷(1,4-dioxane)(113mL,114.15mmol)溶液，使得到的混合物在室溫下攪拌6小時。於減壓下過濾並乾燥生成的固體，由此得到(S)-二芐基2-(2-胺基乙醯胺基) 琥珀酸鹽酸鹽((S)-dibenzyl2-(2-aminoacetamido)succinate hydrochloride(Gly-Asp(OBn)2HCl),39.47g,85%)的白色固體。
製備實施例1-3：合成Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBn)2
(S)-二芐基2-(2-胺基乙醯胺基)琥珀酸鹽酸鹽(39.47g,97.01mmol)和2-((叔丁氧基羰基)胺基)-5-(3-硝基胍基)戊酸(2-((tert-butoxycarbonyl)amino)-5-(3-nitroguanidino)pentanoicacid(N-Boc-Arg(NO2)-OH),30.98g,97.01mmol)溶解於四氫呋喃(600mL)後，降溫至0℃，接著將1-羥基苯並三唑(15.73g,116.41mmol)和1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸(22.31g,116.41mmol)加入到所得溶液中，並向其中緩慢加入三乙胺(47.33mL,339.54mmol)。然後，將所得混合物在0℃下攪拌30分鐘，然後將所得溶液從冷卻浴中移出，並在室溫下攪拌整夜。將反應物溶液濃縮，然後向所得濃縮物中加入水(320mL)和乙酸乙酯(400mL)以萃取兩次(400mL×2)，且有機層用NaCl(aq)(300mL)潤洗，並用硫酸鈉乾燥，並在壓力下過濾及濃縮。將濃縮物減壓乾燥，得到(S)-二芐基2-(2-((S)-2((叔丁氧基羰基)胺基)-5-(3-硝基胍基)戊醯胺基)乙醯胺基)琥珀酸酯((S)-dibenzyl 2-(2-((S)-2((tert-butoxycarbonyl)amino)-5-(3-nitroguanidino)pentanamido)acetamido)succinate(Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBn)2),65.16g,102%)的黃色油狀物，使得不進行其純化過程而進行下列反應。
製備實施例1-4：合成Arg(NO2)-Gly-Asp(OBn)2HCl鹽
將(S)-二芐基2-(2-((S)-2((叔丁氧基羰基)胺基)-5-(3-硝基胍基)戊醯胺基)乙醯胺基)琥珀酸酯(65.16g,97.00mmol)溶於乙酸乙酯(500mL)中，然後向其中加入4M鹽酸(HCl)1,4-二[口咢]烷(94.58mL,378.30mmol)溶液，並將得到的混合物在室溫下攪拌6小時。在減壓下過濾並乾燥取得的固體，由此獲得白色固體的(S)-二芐基-2-(2-((S)-2-胺基)-5-(3-硝基胍基)戊醯胺基)乙醯胺基)琥珀酸鹽 酸鹽((S)-dibenzyl 2-(2-((S)-2-amino)-5-(3-nitroguanidino)pentanamido)acetamido)succinate hydrochloride(Arg(NO2)-Gly-Asp(OBn)2 HCl鹽)，59.08g,100%)。
製備實施例1-5：合成Palm-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBn)2
將(S)-二芐基-2-(2-((S)-2-胺基)-5-(3-硝基胍基)戊醯胺基)乙醯胺基)琥珀酸鹽酸鹽(59.06g,97.04mmol)溶於二氯甲烷(dichloromethane(CH2Cl2),800mL)中，然後使其溫度降溫至0℃，向得到的溶液中加入棕櫚醯氯(palmitoyl chloride,30.76mL,101.85mmol)，接著緩慢加入三乙胺(27.04mL,194.01mmol)。然後，將所得混合物在0℃下攪拌30分鐘，然後將所得溶液從冷卻浴中移出，並在室溫下攪拌整夜。完成反應後，將得到的溶液在壓力下濃縮，之後，自其部分去除二氯甲烷並加入水，接著過濾。所得固體在減壓下乾燥，得到(S)-二芐基2-(2-((S)-5-(3-硝基胍基)-2-棕櫚醯胺基戊醯胺基)乙醯胺基)琥珀酸酯((S)-dibenzyl 2-(2-((S)-5-(3-nitroguanidino)-2-palmitamidopentanamido)acetamido)succinate(Palm-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBn)2),73.01g,93%)。
製備實施例1-6：合成Palm-RGD-HCl鹽
將(S)-二芐基2-(2-((S)-5-(3-硝基胍基)-2-棕櫚醯胺基戊醯胺基)乙醯胺基)琥珀酸酯(70.00g,86.42mmol)和四氫呋喃(1.5L)加在一起，然後向其中加入3M鹽酸(288.07mL,864.21mmol)。然後，在氬氣(Ar)下，將10%鈀碳(palladium carbon(Pd/C),8.64g)加入到所得混合物中。在氫氣(H2)下，將溶液在室溫中攪拌3小時。將藉由矽藻土的手段從反應混合物中過濾的溶液減壓，從而使其溶劑部分地自其除去。向剩餘的溶液中緩慢加入氫氧化鈉(NaOH)(aq)，然後將在pH 2或更高的pH下生成的固體用水洗滌、過濾並乾燥。固體在異丙醇(isopropyl alcohol(IPA))中回流，接著在高溫態(hot state)下過濾並再次乾燥。當將5M氫氧化鈉和6M鹽酸加入到所得固體中時，固體隨著溶液變熱而融化，使固 體隨著溶液冷卻而產生。之後，將固體過濾並在真空烘箱中乾燥，由此獲得(S)-二芐基2-(2-((S)-5-胍基)-2-棕櫚醯胺基戊醯胺基)乙醯胺基)琥珀酸鹽酸鹽((S)-dibenzyl2-(2-((S)-5-guanidino)-2-palmitamidopentanamido)acetamido)succinate hydrochloride)，即棕櫚醯-RGD-HCl鹽(palmitoyl-RGD-HCl salt,33.82g,63%)。
實驗例1：細胞毒性實驗
為了鑑定脂肪酸綴合的RGD的細胞毒性，藉由以下方法之手段，在分別具有不同長度的脂肪酸之作為四種材料的月桂醯-RGD(Lauroyl-Arg-Gly-Asp)、肉荳蔻醯-RGD(Myristoyl-Arg-Gly-Asp)、棕櫚醯-RGD(Palmitoyl-Arg-Gly-Asp)和硬脂醯-RGD(Stearoyl-Arg-Gly-Asp)上進行細胞毒性實驗。
將新生成的人真皮纖維細胞(human dermal fbbroblast neonatal,HDFn細胞，Cascade Co.)接種到24-微孔板(5×104個細胞/孔)中，於37℃及5%CO2條件下培養24小時。然後，除去培養基，用磷酸緩衝生理鹽水(PBS)清洗微孔板，向其中添加其中添加有1%青黴素/鏈黴素(penicillins/streptomycin(P/S))的Dulbecco's Modified Eagle's培養基(DMEM)的培養基從而培養24小時。除去培養基，用PBS清洗微孔板，然後根據最終處理濃度，向其中加入900μL培養基以及各100μL月桂醯-RGD、肉荳蔻醯-RGD、棕櫚醯-RGD和硬脂醯-RGD，培養48小時。然後，除去培養基，用PBS洗滌微孔板，然後向其中加入100μLMTT(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide))和900μL培養基，培養4小時。除去培養液，並向其中分別添加300μL二甲基亞碸(dimethyl sulfoxide(DMSO))溶液，之後將所得混合物振盪10分鐘，並利用微量盤檢測儀(microplate reader)之裝置測量在570nm的光密度，以鑑定細胞活性。
結果顯示在下表1和第1圖中。
如以上表1所示，證實月桂醯-RGD和肉荳蔻醯-RGD在濃度為10.0ug/mL或以下時不表現細胞毒性，棕櫚醯-RGD在濃度為4.0ug/mL或以下時不表現細胞毒性。另一方面，證實硬脂醯-RGD在濃度為2.0u g/mL或以上時表現出高細胞毒性。
實驗例2：原膠原蛋白合成效果的分析
分析月桂醯-RGD、肉荳蔻醯-RGD、棕櫚醯-RGD和硬脂醯-RGD作為脂肪酸綴合的三肽的原膠原蛋白合成效果，以找到合適長度的脂肪酸。並透過使用未與脂肪酸綴合的RGD和乙醯-RGD作為控制組進行比較實驗。
透過使用其中添加有10%胎牛血清的Dulbecco's Modified Eagle's培養基(DMEM)的培養基，將新生成的人真皮纖維細胞接種到24孔微量培養板(5×104個細胞/孔)中，由此在37℃和5%CO2的條件下培養24小時。然後，將培養基 換成無血清的DMEM培養基，培養24小時，然後處理適量的各測試化合物。培養48小時後，收集細胞培養液，然後使用Takara公司(Takara Shuzo Co.,Ltd.Japan)的膠原蛋白測定試劑盒測定原膠原蛋白量。首先，將收集的細胞培養液注入96孔微量培養板中，初級膠原蛋白抗體均勻地塗佈至其，使抗原抗體反應可在37℃下發生3小時。從孔中取出細胞培養液並用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌四次。向每個孔中注入染色物質(color causing material)，然後在室溫下進行反應15分鐘，並加入1N硫酸溶液於其中以停止反應。用分光光度計之裝置在450nm波長測量光密度(optical density)。使用標準溶液繪製標準曲線，將透過上述方法之手段獲得的光密度歸屬於(assigned to)標準曲線，從而計算向其添加了各測試化合物的細胞培養液所產生的原膠原蛋白量。
結果顯示在下表2和第2圖中。
如上述表2所示，證實在相同濃度下脂肪酸綴合的RGD的原膠原蛋白合成效果比RGD或乙醯-RGD更優異，特別是在相同濃度下，棕櫚醯-RGD的效果最優異。
如在上述實驗例1至2中證實的那樣，其證實了在脂肪酸綴合的RGD中，棕櫚醯-RGD是在呈現有效效果的濃度中表現無細胞毒性，但是高的膠原蛋白合成效率的物質。因此，下文中在以下的實驗例中對棕櫚醯-RGD進行實驗。
實驗例3：經皮吸收(滲入皮膚細胞)實驗
通過使用棕櫚醯-RGD(由上化學式II表示的物質)進行經皮吸收實驗，並且還透過未與脂肪酸綴合的RGD作為控制組進行比較實驗(參考：Lehman PA，Slattery JT，Franz TJ。類維生素A的經皮吸收：載體、光照和劑量的影響(Percutaneous absorption of retinoids：Influence of vehicle,light exposure,and dose)，J.Invest Dermatol.,91；56-61,1988)。
具體而言，在Franz擴散槽(Franz diffusion cell)測量滲透性。以未與脂肪酸綴合的RGD作為控制組。使用儲存在-20℃的入類皮膚以鑑別皮膚滲透性。為了在測試之前鑑別皮膚的結構完整性，通過經皮水分散失(transepidermal water loss(TEWL))證實皮膚(700μm厚，在-20℃保存)沒有損傷。
將10%RGD和棕櫚醯-RGD溶解在二丙烯甘醇/辛基十二烷醇(dipropylene glycol/octyldodecanol,1：1)的溶劑中，然後將1mL所得溶液裝載到提供有樣品的腔室上，使其貼劑應用於人體皮膚。然後，24小時後，通過樣品端口取出500μL下層溶液，並通過HPLC的手段定量分析。每個樣品進行5次皮膚滲透實驗。
結果顯示在下表3和第3圖中。
如上表3所示，即使在施用於皮膚後24小時，可檢測量的RGD也是極微量的。這意味著上述RGD具有包含為鹼性氨基酸的R(精胺酸)以及為酸性氨基酸的D(天門冬胺酸)的親水性，使得上述RGD不能滲透含有大量疏水脂質的皮膚角質層，而不能直接傳遞到皮膚細胞。此外，硬脂醯-RGD具有優異的皮膚滲透性，但在如表1所示之具有有效效果的濃度時具有細胞毒性，使得硬脂醯-RGD不適合作為化妝品。然而，棕櫚醯-RGD在有效濃度下不具有細胞毒性。由於RGD與為疏水性脂肪酸的棕櫚醯基(palmitoyl)綴合，其皮膚滲透性提高了15倍以上，且原膠原蛋白合成效果也得到改善。
實驗例4：皮膚安全性測試
為了測定棕櫚醯-RGD的皮膚安全性，將棕櫚醯-RGD成分以各濃度溶解於丙二醇中，確認其皮膚刺激性。
具體而言，將5×20cm的含有一定量(20μL)棕櫚醯-RGD丙二醇溶液的貼劑施用於30名20至50歲成年人的背部區域24小時。然後，將貼劑取下，以便在1小時和24小時後用肉眼檢查皮膚狀況的變化，其結果在表4中示出。此時，根據下面的皮膚狀況評估標準對皮膚狀況的變化程度進行分類及評估。
<皮膚狀況的評估標準>
研究人員根據以下標準進行視覺評估。
0：沒有變化1：非常微小的變化
2：輕微變化3：略劇烈變化
4：劇烈變化5：非常劇烈變化
如上表4所示，證實棕櫚醯-RGD的含量達到0.05wt%時不具皮膚刺激性。
實驗例5：濕度和熱的穩定性測試
化妝品組合物中使用的活性成分對濕度和熱的穩定性是組合物在儲存期間的重要因素。因此，為了證實棕櫚醯-RGD作為化妝品組合物中使用的活性成分的適合性，評估其對濕度和熱的穩定性。
具體而言，各樣品以密封狀態在4℃、30℃、45℃，相對濕度75%的惡劣條件下保存12週後，用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography(HPLC))測定對於初始活性成分值的樣品的殘留率(%)。其結果列於下表5中。
如以上表5所示，其證實棕櫚醯-RGD對水分和熱優異的穩定性。
配方例1。製備包含棕櫚醯-RGD的溶解配方(solubilization formulation)
為了證實包含棕櫚醯-RGD作為活性成分的化妝品組合物的穩定性，如下表6所示地製備其溶解配方。
<製備方法>
(1)分別將各水相和乙醇相均勻混合並溶解。
(2)將乙醇相加入到水相中且混合並溶解所得溶液。
(3)將添加物I的棕櫚醯-RGD溶解，並將其加到所得的混合物中，並將添加物II混合於其中以完成溶解配方。
配方例2。製備包含棕櫚醯-RGD的精油配方
為了證實包含棕櫚醯-RGD作為活性成分的化妝品組合物的穩定性，如下表7所示地製備精油配方。
<製備方法>
(1)加熱水相和油相，並分別均勻混合並溶解各水相和油相。
(2)於75℃將油相加入水相中以混合並乳化在一起。
(3)在45℃加入添加物相I的棕櫚醯-RGD於所得混合物中，並混合在一起，且將添加物相II混合在一起。
配方例3。製備包含棕櫚醯-RGD的乳霜配方
為了證實包含新的棕櫚醯-RGD作為活性成分的化妝品組合物的穩定性，如下表8所示地製備乳霜配方。
<製備方法>
(1)加熱水相和油相，並分別均勻混合並溶解各水相和油相。
(2)於75℃將油相加入水相中以混合並乳化在一起。
(3)在45℃加入添加物相I的棕櫚醯-RGD於所得混合物中，並混合在一起，且將添加物相II混合在一起。
實驗例6：鑑定包含棕櫚醯-RGD的化妝品組合物的成分穩定性
為了鑑定配方中棕櫚醯-RGD的穩定性，將上述配方例1至3的溶解配方、精油配方和乳霜配方在4℃、30℃、45℃和日照條件下儲存12週，之後 以與上述實驗例5相同的高效液相色譜(HPLC)，觀察包含棕櫚醯-RGD的化妝品中隨時間推移的含量變化，且其結果列於下表9中。
如上表9所示，其證實在高溫和日照條件下溶解配方、精油配方和乳霜配方都具有於配方中優異的成分穩定性。
實驗例7：鑑定包含棕櫚醯-RGD的化妝品組合物的配方穩定性
為了鑑定包含棕櫚醯-RGD的化妝品組合物本身的配方穩定性，將上述配方例1至3的溶解配方、精油配方和乳霜配方在4℃、30℃(室溫，RT)、45℃且日照之條件儲存12週，然後通過目視和感官評估觀察顏色、氣味和配方的變化，其結果示於下表10至12中。此時，根據以下評估標準對顏色、氣味和配方的變化進行分類和評估。
<評估標準>
沒有變化：- 非常些微的變化：+ 輕微的變化：++
可觀察到的變化：+3 顯著變化：+4 明顯變化：+5
如上表10~12所示，其證實在高溫和日光條件下，溶解配方、精油配方和乳霜配方都具有優異的穩定性。
實驗例8：鑑定包含棕櫚醯-RGD的化妝品組合物的皮膚刺激性
為了鑑定包含棕櫚醯-RGD的化妝品組合物的皮膚刺激性，評估上述配方例3的乳霜配方的皮膚刺激性。
具體而言，將濃度依賴性方式(a concentration-dependent manner)之含有於上述配方例3中製備的包含棕櫚醯-RGD的一定量(60uL)之乳霜配方的5×20cm貼劑應用於50名成人的每個背部區域每次24小時，共計9次。在總共9次之貼劑重複應用的過程中，在移除貼劑後每30分鐘觀察一次皮膚反應，之後再次貼上貼劑，從而鑑定致敏誘導(sensitization induction)。休息2週後，再用一次貼劑，並在移除貼劑後30分鐘和24小時和48小時中鑑定致敏誘導的程度。致敏誘導的結果表示在表13和致敏誘導測試的結果表明在表14中。當時，根據國際接觸性皮炎研究組織(International Contact Dermatitis Research Group(ICDRG))的標準判定皮膚反應判斷。
<皮膚狀況的評估標準>
0：負面反應(無刺激性)
1：疑似反應-只有微弱的紅斑
2：弱陽性反應-紅斑、浸潤(infiltration)、可能的丘疹
3：強烈的陽性反應-紅斑、浸潤、丘疹、水泡
4：極度強烈的反應-嚴重的紅斑和浸潤和聚集水泡
如上表13~14所示，證實包含棕櫚醯-RGD的乳霜配方的具有低皮膚刺激性。
實驗例9：包含棕櫚醯-RGD的化妝品組合物在減少皮膚皺紋的臨床效果
測定上述包含棕櫚醯-RGD的化妝品組合物減少皮膚皺紋的效果。
具體而言，為了評估包含棕櫚醯-RGD的化妝品組合物的有效性，對23名30至60歲的女性進行臨床測試。使用包含0.04wt%的棕櫚醯-RGD的化妝品組合物作為測試組產品。使用包含蒸餾水代替用於測試組產品中之棕櫚醯-RGD的安慰劑乳霜作為控制組產品。將上述測試和控制組產品隨機地分別施用到對象面部的左及右區域，並以每天兩次的間隔再次施用，並觀察12週的變化。
實驗例9-1：眼眶周圍皺紋減少的鑑定測試
為了鑑定通過使用測試組產品和控制組產品的手段之眼眶周圍皺紋減少，以如下方式獲得數值：在使用之前和使用後的4週、8週和12週，將光穿透到對於產品施用的區域製造的半透明皮膚皺紋複製品(translucent skin wrinkle replica)中，並用VisiometerSV600(Courage-Khazaka electronic GmbH，Germany)分析其結果。在這些分析值中，R2和R3值作為眼眶周圍皺紋的關鍵參數評估。R2對應於對於其中褶皺輪廓等分為五分之區段之五個峰值和五個谷值 之間的最大差值。R3是通過沿著X軸將皺紋輪廓等分成五個區段並且用每個區段測量的最大值和最小值之間的差值來計算算術平均值。
上述R2和R3值的結果在第4圖和第5圖的圖表中表示。
結果，與使用前相比，使用後4週、8週和12週的R2值皆顯著降低(p<0.05)。即使與控制組產品相比時，測試組產品的R2值在使用後8週和12週時顯示出顯著差異(p<0.05)。此外，與使用前相比，測試組產品組的R3值在使用後的4週、8週和12週皆顯著降低(p<0.05)。即使與控制組產品比較時，測試組產品組的R3值在使用後的8週和12週時也顯示出顯著差異(p<0.05)。
實驗例9-2：使用Primos的眼眶周圍皺紋測量測試
為了鑑定透過使用產品的手段，眼眶周圍皺紋測量值的變化，在使用前和在使用後的4週、8週和12週時使用為一種3D皮膚攝影裝置之Primos premium(GFMesstechnik GmbH，Germany)分析眼眶周圍皺紋的Ra值。Ra代表皺紋輪廓的平均粗糙度。值越小，表示眼眶周圍皺紋就越少。測量的Ra值的結果在第6圖的圖表中表示。
結果，與使用前相比，測試組產品組的Ra值在使用後12週內均顯著降低(p<0.05)。即使與控制組產品比較，使用後4週和12週的Ra值也有顯著差異(p<0.05)。
因此，通過上述實驗例9-1和9-2的結果證實，包含棕櫚醯-RGD的化妝品組合物在減少眼眶周圍皺紋上具有效果。
實驗例9-3：皮膚彈性測量測試
為了鑑定通過使用包含棕櫚醯-RGD的產品之手段，皮膚彈性測量值的變化，在使用前和使用後的4週、8週和12週時測量皮膚彈性。使用CutometerCM580(CK Electronics，Koln，Germany)分別在雙眼周圍的每個相同區域測量一次皮膚彈性。在結果值中，將R2(從皮膚變形恢復)值用作為評估皮膚彈 性程度的數據。R2值是指整體的彈性。值越接近1，皮膚越有彈性。測量的R2值的結果在第7圖的圖表中表示。
結果，與使用前相比，測試組產品組的皮膚彈性測量值在使用後的4週、8週和12週中顯著增加(p<0.05)。即使與控制組產品比較，在使用後4週、8週、12週的皮膚彈性測定值皆顯示顯著差異(p<0.05)。因此，證實包含棕櫚醯-RGD的化妝品組合物在增強皮膚彈性上具有效果。
實驗例9-4：皮膚真皮密度測量測試
為了測量皮膚真皮密度，在使用之前和在使用後的4週、8週和12週期間，透過皮膚掃描儀高分辨率超音波(Skin Scanner High Resolution Ultrasound(taberna pro medicum，Germany))的手段拍攝雙眼周圍的區域，並使用測量的圖像來分析使用產品前後皮膚的真皮密度。皮膚真皮密度的測量單位為%，表明測量值越高，真皮密度越提升。測量結果如第8圖所示。
結果，與使用前相比，測試組產品組的真皮密度測量值在使用後的8週和12週皆顯著增加(p<0.05)。即使與控制組產品比較，使用後8週和12週的真皮密度測量值也皆顯示出顯著的差異(p<0.05)。因此，證實包含棕櫚醯-RGD的化妝品組合物在改善皮膚真皮密度上具有效果。

Claims (1)

  1. 一種以下化學式I的化合物或其美容學上可接受的鹽用於減少皺紋之用途：其中，n是15，其中，以一化妝品組合物的總重量為基準，該化合物的含量為0.04wt%。
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