TWI672375B - 細胞培養載體模組、生物反應器及細胞回收方法 - Google Patents
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Abstract
一種細胞培養載體模組、生物反應器及細胞回收方法。細胞培養載體模組包括至少一細胞培養載體，細胞培養載體可在二維結構與三維結構之間轉變。細胞培養載體在鬆開的狀態為二維結構，且在壓縮的狀態為三維結構。
Description
本發明是有關於一種細胞培養載體模組、生物反應器及細胞回收方法，且特別是有關於一種具有可在二維結構與三維結構之間轉換的細胞培養載體模組、包括上述細胞培養載體模組的生物反應器以及使用上述細胞培養載體模組的細胞回收方法。
目前細胞量產所使用之載體支架可分為兩類，分別為天然材料（例如膠原蛋白（collagen）、幾丁聚醣（chitosan）或明膠（gelatin）等），或是合成材料（聚已內酯（PCL）、聚苯乙烯（PS）、聚丙烯（PP）或聚乳酸-聚甘醇酸共聚物（PLGA）等）。天然材料多為動物來源材料，雖然動物來源材料具有低細胞毒性且生物相容性高，但動物來源材料可能會帶有無法檢測出的動物性污染原，因此目前趨勢傾向減少使用甚至不使用動物來源材料以降低汙染風險。
另外，目前市面上之細胞載體除了以海藻酸鹽（Alginate）為基材的相關產品外，其他的合成材料皆相當難以降解（degradation），所以難以順利回收細胞。由於海藻酸鹽為基材的相關產品在進行細胞培養時需使用高濃度鈣離子，可能會傷害細胞或使某些細胞趨向分化（例如間質幹細胞），而且海藻酸鹽降解時亦需要使用鈣離子螯合劑（chelator），使用不當很容易傷害細胞。此外，收集細胞的載體支架關鍵技術仍待突破，故目前細胞量產技術一直停留在傳統二維平盤培養方法，無法順利放大製程。
因此，如何找出適合細胞快速大量生長又不帶有動物性污染源之載體材料，以及如何提高細胞回收率及細胞品質，是目前研究人員急欲解決的問題。
本發明提出一種細胞培養載體模組，其可有效地提高細胞回收率。
本發明提供一種細胞培養載體模組，其包括至少一細胞培養載體，細胞培養載體可在二維結構與三維結構之間轉變。細胞培養載體在鬆開的狀態為二維結構，且在壓縮的狀態為三維結構。
依照本發明實施例所述的細胞培養載體模組，其中二維結構例如是平行線陣列或交錯線陣列。
依照本發明實施例所述的細胞培養載體模組，其中三維結構例如是螺旋狀或線團狀。
依照本發明實施例所述的細胞培養載體模組，其中細胞培養載體的材料包括細胞可貼附材料或經處理後具有細胞可貼附性的材料。
依照本發明實施例所述的細胞培養載體模組，其中處理方式例如是表面改質、表面塗覆或表面微結構化。
依照本發明實施例所述的細胞培養載體模組，更包括外套管以及至少一固定構件，固定構件配置於細胞培養載體的至少一端，例如是將兩個固定構件分別配置於細胞培養載體的兩端，其中細胞培養載體位於外套管內且固定於固定構件上。
依照本發明實施例所述的細胞培養載體模組，其中藉由將固定構件推進所述外套管內而擠壓細胞培養載體，使細胞培養載體從二維結構轉變成三維結構，並藉由將固定構件從外套管內退出，使細胞培養載體從三維結構轉變成二維結構。
依照本發明實施例所述的細胞培養載體模組，其中外套管的內側管壁可具有螺紋，藉由使固定構件沿著螺紋旋入外套管內，而將細胞培養載體從二維結構轉變成三維結構，並藉由使固定構件沿著螺紋從外套管內旋出，而將細胞培養載體從三維結構轉變成二維結構。
依照本發明實施例所述的細胞培養載體模組，更包括驅動件以及螺桿。驅動件配置於所述外套管的一端，螺桿連接於所述驅動件，且穿過固定構件，藉由驅動件驅動螺桿，使固定構件推進外套管內，而將細胞培養載體從二維結構轉變成三維結構，並藉由驅動件驅動螺桿，使固定構件從外套管內退出，而將細胞培養載體從三維結構轉變成二維結構。
本發明提供一種生物反應器。生物反應器包括上述細胞培養載體模組。
本發明提供一種細胞回收方法，其包括以下步驟：提供細胞培養載體模組，細胞培養載體模組包括至少一細胞培養載體，細胞培養載體可在二維結構與三維結構之間轉變，細胞培養載體在鬆開的狀態為二維結構，在壓縮的狀態為三維結構，且在細胞培養載體為三維結構狀態下進行細胞培養，在細胞培養載體為二維結構狀態下進行細胞回收。
依照本發明實施例所述的細胞回收方法，其中將二維結構的細胞培養載體轉變為三維結構的細胞培養載體的方法例如是扭轉或擠壓二維結構的細胞培養載體。
依照本發明實施例所述的細胞回收方法，其中在細胞培養載體為二維結構的狀態下進行細胞回收的步驟包括下列步驟。將二維結構狀態的細胞培養載體浸漬在含有細胞脫附酵素的試劑中，使細胞從細胞培養載體脫附。取出含有細胞的懸浮液。
依照本發明實施例所述的細胞回收方法，其中細胞脫附酵素例如是胰蛋白酶（trypsin）、Tryp LE（商品名）、Accutase（商品名）、Accumax（商品名）或膠原蛋白酶（collagenase）。
依照本發明實施例所述的細胞回收方法，更包括在三維結構的狀態下或從三維結構轉變至二維結構的過程中，於細胞培養載體上加入細胞脫附酵素。
依照本發明實施例所述的細胞回收方法，更包括在三維結構的狀態下或從三維結構轉變至二維結構的過程中進行細胞回收。
依照本發明實施例所述的細胞回收方法，其中細胞培養載體模組更包括外套管以及至少一固定構件。固定構件配置於外套管的至少一端，例如是將兩個固定構件分別配置於細胞培養載體的兩端。細胞培養載體位於外套管內且固定於固定構件上。
依照本發明實施例所述的細胞回收方法，其中藉由將固定構件推進所述外套管內而擠壓細胞培養載體，使細胞培養載體從二維結構轉變成三維結構，並藉由將固定構件從外套管內退出，使細胞培養載體從三維結構轉變成二維結構。
依照本發明實施例所述的細胞回收方法，其中外套管的內側管壁具有螺紋。藉由使固定構件沿著螺紋旋入外套管內，而將細胞培養載體從二維結構轉變成三維結構，藉由使固定構件沿著螺紋從外套管內旋出，而將細胞培養載體從三維結構轉變成二維結構。
依照本發明實施例所述的細胞回收方法，其中細胞培養載體更包括驅動件以及螺桿。驅動件配置於所述外套管的一端，螺桿連接於驅動件，且穿過固定構件，藉由驅動件驅動所述螺桿，將固定構件推進外套管內，而使細胞培養載體從二維結構轉變成三維結構。並藉由驅動件驅動所述螺桿，將固定構件從外套管內退出，而使細胞培養載體從三維結構轉變成二維結構。
依照本發明實施例所述的細胞回收方法，其中細胞培養載體的材料包括細胞可貼附材料或經處理後具有細胞可貼附性的材料。
依照本發明實施例所述的細胞回收方法，其中處理方式例如是表面改質、表面塗覆或表面微結構化。
基於上述，本發明之細胞培養載體模組，其具有可在二維結構與三維結構之間轉換的細胞培養載體，因此當細胞培養載體在三維結構下進行細胞培養時，三維結構的細胞培養載體可提供更多的表面積與空間以供細胞生長，進而提高所培養的細胞數量。此外，當細胞培養載體在二維結構狀態下進行細胞回收時，其鬆開的結構可使細胞培養載體與細胞脫附酵素充分地反應，有助於進行生長於細胞培養載體內層的細胞脫附，進而提高細胞的回收率。
為讓本發明的上述特徵和優點能更明顯易懂，下文特舉實施例，並配合所附圖式作詳細說明如下。
圖1為依據本發明一實施例之細胞培養模組所繪示的示意圖。圖2為依據本發明一實施例之螺旋狀的細胞培養載體模組所繪示的示意圖。圖3為依據本發明一實施例之線團狀的細胞培養載體模組所繪示的示意圖。
請參照圖1至圖3，細胞培養載體模組包括可在二維結構與三維結構之間轉變的細胞培養載體100。細胞培養載體100在鬆開的狀態為所述二維結構（請參照圖1），且在壓縮的狀態為所述三維結構（請參照圖2與圖3）。在圖1的實施例中，二維結構是以平行線陣列為例進行說明，但本發明並不以此為限。三維結構例如是螺旋狀（圖2）或線團狀（圖3）。
舉例來說，細胞培養載體100包括多條細胞培養線材102。如圖1所示，多條細胞培養線材102可彼此平行排列成平行線陣列的二維結構。細胞培養載體100的材料例如是聚酯（Polyester；PET）、尼龍（Nylon）、聚乙烯（Polyethylene；PE）、聚丙烯（Polypropylene；PP）、聚氯乙烯（polyvinyl chloride；PVC）、聚苯乙烯（polystyrene；PS）、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物（Ethylene Vinyl Acetate；EVA）或聚氨酯（polyurethane；PU）等。但本發明不限於此，凡是具有可抽絲特性之材料（例如，條狀薄片或線狀片材)皆可作為本發明之細胞培養載體的材料。
細胞培養載體100可為細胞可貼附材料或經處理後具有細胞可貼附性的材料。上述處理的方法包括表面改質、表面塗覆或表面微結構化等。表面改質例如是對細胞可貼附材料或細胞不可貼附材料的表面進行電漿處理(plasma modification)，使其表面具有細胞可貼附特性，以利於細胞貼附。表面塗覆(coating)為在細胞可貼附材料或細胞不可貼附材料的表面上塗覆例如是膠原蛋白(collagen)、幾丁聚醣(chitosan)、明膠(gelatin)或海藻酸鹽(Alginate)等，但不限於此，以利於細胞貼附。表面微結構化(micro-structured)例如是在細胞可貼附材料或細胞不可貼附材料的表面上進行雷射切割以形成微孔道，以利於細胞貼附。但本發明的處理方式並不限於此，凡是可提高細胞貼附性的處理方式皆可應用在本發明中。
在本實施例中，將細胞培養載體100由二維結構轉變為三維結構的方法例如是藉由擠壓或扭轉二維結構狀態之細胞培養載體100，以使二維結構狀態的細胞培養載體100經壓縮而轉變為三維結構狀態，如螺旋狀(圖2)或線團狀(圖3)的三維結構。舉例來說，可用手直接扭轉或壓縮二維結構的細胞培養載體100，但本發明不限於此。在另一實施例中，亦可使用輔助工具來扭轉或壓縮二維結構的細胞培養載體100。
將細胞培養載體100由三維結構轉變為二維結構的方法例如是藉由鬆開或拉直三維結構狀態之細胞培養載體100，以使三
維結構狀態的細胞培養載體100轉變為二維結構狀態。舉例來說，可用手直接鬆開或拉直三維結構的細胞培養載體100，但本發明不限於此。在另一實施例中，亦可使用輔助工具(請參照圖5a至圖7b)來鬆開或拉直三維結構的細胞培養載體100。
在上述實施例中，由於細胞培養載體模組具有可在二維結構與三維結構之間轉換的細胞培養載體100，因此當細胞培養載體100在三維結構下進行細胞培養時，三維結構的細胞培養載體100可提供更多的表面積與空間以供細胞生長，進而提高所培養的細胞數量。此外，當細胞培養載體100在二維結構狀態下進行細胞回收時，其鬆開的結構可使細胞培養載體100與細胞脫附酵素充分地反應，有助於進行生長於細胞培養載體100內層的細胞脫附，進而提高細胞的回收率。
圖4為依據本發明另一實施例之細胞培養載體模組所繪示的示意圖。
請參照圖4，細胞培養載體200亦可在二維結構與三維結構之間轉變。細胞培養載體200在鬆開的狀態為所述二維結構(請參照圖4)，且在壓縮的狀態為所述三維結構(請參照圖2與圖3)。請同時參照圖1與圖4，圖4的細胞培養載體200與圖1的細胞培養載體100的差別在於：細胞培養載體200的二維結構為交錯線陣列，意即，細胞培養線材102可彼此交錯排列成交錯線陣列的二維結構。此外，在細胞培養載體200與細胞培養載體100中相同的構件以相同的符號表示並省略其說明。
圖5a為依據本發明第一實施例之細胞培養載體模組所繪示的示意圖。圖5b為圖5a之細胞培養載體模組中細胞培養載體經壓縮後所繪示的示意圖。
請同時參考圖5a與圖5b，細胞培養載體模組10包括細胞培養載體302、外套管304以及二個固定構件306a、306b。細胞培養載體302例如是上述實施例中的細胞培養載體100、200中至少一者。細胞培養載體302可包括多條細胞培養線材302a。
固定構件306a、306b分別配置於細胞培養載體302的兩端。細胞培養載體302位於外套管304內且固定於固定構件306a、306b上。外套管304的材料及固定構件306a、306b的材料例如是聚酯(Polyester；PET)、尼龍(Nylon)、聚乙烯(Polyethylene；PE)、聚丙烯(Polypropylene；PP)、聚氯乙烯(polyvinyl chloride；PVC)、聚苯乙烯(polystyrene；PS)、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物(Ethylene Vinyl Acetate；EVA)、聚氨酯(polyurethane；PU)、聚碳酸酯(polycarbonate；PC)或玻璃等，但本發明不限於此。
在本實施例中，可藉由將固定構件306a推進外套管內304而擠壓細胞培養載體302，使細胞培養載體302從所述二維結構轉變成所述三維結構(如圖5b所示)；同理，可藉由將固定構件306a從外套管304內退出，使細胞培養載體302從所述三維結構轉變成所述二維結構(如圖5a所示)。
圖6a為依據本發明第二實施例之細胞培養載體模組所繪示的示意圖。圖6b為圖6a之細胞培養載體模組中細胞培養載體
經壓縮後所繪示的示意圖。
圖6a及圖6b的細胞培養模組20與圖5a及圖5b的細胞培養模組10大致相似。在圖6a及圖6b中，與圖5a及圖5b相同的元件以相同的標號表示，於此不另行對其進行說明。請同時參照圖6a及圖6b，圖6a及圖6b之細胞培養模組20與圖5a及圖5b之細胞培養模組10的主要差異在於：在本實施例中，外套管304的內側管壁具有螺紋305。
在本實施例中，可藉由將固定構件306a沿著螺紋305旋入外套管304內，以使細胞培養載體302經扭轉而壓縮成螺旋狀，進而將細胞培養載體302從二維結構轉變為三維結構(如圖6b所示)；同理，可藉由將固定構件306a沿著螺紋305從外套管304內旋出，以使細胞培養載體302鬆開，進而使細胞培養載體302從三維結構轉變為二維結構(如圖6a所示)。
圖7a為依據本發明第三實施例之細胞培養載體模組所繪示的示意圖。圖7b為圖7a之細胞培養載體模組中細胞培養載體經壓縮後所繪示的示意圖。
請同時參考圖7a與圖7b，本實施例的細胞培養載體模組30包括細胞培養載體402、外套管404、二個固定構件406a、406b、驅動件408與螺桿410。細胞培養載體402例如是上述實施例中的細胞培養載體100、200中至少一者。細胞培養載體402可包括多條細胞培養線材402a。
固定構件406a與406b分別配置於細胞培養載體402的
兩端。細胞培養載體402線性排列於外套管404內且固定於固定構件406a與406b上。外套管404的材料及固定構件406a、406b的材料例如是聚酯(Polyester；PET)、尼龍(Nylon)、聚乙烯(Polyethylene；PE)、聚丙烯(Polypropylene；PP)、聚氯乙烯(polyvinyl chloride；PVC)、聚苯乙烯(polystyrene；PS)、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物(Ethylene Vinyl Acetate；EVA)、聚氨酯(polyurethane；PU)、聚碳酸酯(polycarbonate；PC)或玻璃等，但本發明不限於此。
驅動件408配置於外套管404靠近固定構件406a的一端。螺桿410連接於驅動件408，且穿過固定構件406a。因此，可藉由驅動件408驅動螺桿410，而將固定構件406a推進外套管404內，使細胞培養載體402從二維結構轉變成三維結構(如圖7b所示)；同理，可藉由驅動件408驅動螺桿410，而將固定構件406a從外套管404內退出，使細胞培養載體402從三維結構轉變成二維結構(如圖7a所示)。
圖8為依照本發明之一實施例的一種細胞回收的流程步驟圖。
請參考圖8，並提供執行細胞回收步驟之詳細敘述如下：
首先，執行步驟S100：提供細胞培養載體模組。細胞培養載體模組可使用圖1至圖7b中的細胞培養載體模組中的至少一者。上述細胞培養載體模組包括可在二維結構與三維結構之間轉變的細胞培養載體。細胞培養載體在鬆開的狀態為所述二維結
構，而在壓縮的狀態為所述三維結構。
其次，執行步驟S110：在細胞培養載體為三維結構狀態下進行細胞培養。步驟S110可進一步包括子步驟S112、S114、S116、S118；其中，子步驟S112為將二維結構狀態的細胞培養載體轉變為三維結構狀態，而關於將二維結構狀態的細胞培養載體轉變為三維結構狀態的方式已於上述實施例中進行詳盡地描述，故於此不再贅述。
接著，執行子步驟S114：將細胞接種至三維結構的細胞培養載體上。培養的細胞例如是幹細胞或分化的細胞，但本發明不限於此；具體來說，培養的細胞例如是非洲綠猴腎(VERO,an African green monkey kidney cell line)細胞、脂肪幹細胞(ADSC,Human Adipose-Derived Stem Cell)、間質幹細胞(MSC,Mesenchymal Stem Cell)、馬丁達比犬腎細胞(MDCK,Madin-Darby Canine Kidney)或人類胚胎腎臟細胞(HEK293,Human Embryonic Kidney 293)等，但不限於此。在本實施例中，先將培養基加入細胞培養載體中，以使整個三維結構的細胞培養載體充滿了培養基，再將細胞接種至細胞培養載體中。在另一實施例中，亦可直接將含有細胞的細胞培養基均勻加入三維結構的細胞培養載體中，以使整個三維結構的細胞培養載體充滿了細胞培養基。培養基為一般常用於細胞培養的標準生長培養基；例如是具有胎牛血清(FBS)的培養基或無血清培養基，但本發明不限於此。此外，應理解的是，因應不同的細胞特性，其細胞培養基操作濃度的需
求亦不相同，因此可視細胞特性來調整操作濃度，且視情況需要，可於培養基中添加生長因子或抗生素等等，此為本領域通常知識者所熟知。
再接著，執行子步驟S116：使細胞貼附於細胞培養載體上。在本實施例中，將細胞培養模組在特定生長條件(例如特定的溫度、濕度或二氧化碳濃度)下置於培養箱中，以使細胞貼附於細胞培養載體上。
再接著，執行子步驟S118：進行細胞培養。細胞培養的方式例如是將細胞培養載體置於培養箱中進行靜態培養或動態培養。動態培養可藉由擾動細胞培養載體周圍的培養基來進行，擾動培養基的方式例如是將具有細胞培養載體模組的培養瓶置放於磁力轉盤上，藉由磁力轉盤帶動磁石的旋轉來擾動培養基。在一實施例中，細胞培養後之細胞生長數量可增加至100倍以上。在另一實施例中，細胞培養後之細胞生長數量更可增加至高達2000倍以上。
在此要說明的是，由於不同的細胞具有不同的特性，因此可依據不同細胞種類來調整細胞培養條件。舉例來說，在培養哺乳動物細胞時，可在37℃與5%CO2條件下進行細胞培養，並將培養基的pH值維持在其生理範圍內，例如對大多數動物細胞而言，培養液合適pH值為7.2~7.4。
相較於二維結構的細胞培養載體而言，在本實施例中，由於是在三維結構的細胞培養載體上接種細胞並進行細胞培養，
三維結構的細胞培養載體除了可提供更多的表面積與空間以供細胞生長，進而提高所培養的細胞數量。除此之外，在本實施例中，細胞培養載體是在壓縮的狀態下進行細胞接種及後續的細胞培養，因此也可減少培養基的使用量，進而減少成本。
再者，執行步驟S120：在細胞培養載體為二維結構狀態下進行細胞回收。步驟S120可進一步包括以下子步驟S122、S124、S126。
首先，執行子步驟S122：將三維結構狀態的細胞培養載體轉變為二維結構狀態。將三維結構狀態的細胞培養載體轉變為二維結構狀態的方式已於上述實施例中進行詳盡地描述，故於此不再贅述。
接著，執行子步驟S124：將二維結構的細胞培養載體浸漬在含有細胞脫附酵素的試劑中，使細胞從細胞培養載體上脫附。在一實施例中，含有細胞脫附酵素的試劑可在二維結構狀態下進行滴加，而使得二維結構的細胞培養載體浸漬在含有細胞脫附酵素的試劑中。在另一實施例中，亦可在三維結構的狀態下或從三維結構轉變至二維結構的過程中，在細胞培養載體上滴加含有細胞脫附酵素的試劑，此時細胞培養載體可在三維結構的狀態下就已浸漬在含有細胞脫附酵素的試劑中。細胞脫附酵素例如是胰蛋白酶、Tryp LE、Accutase、Accumax或膠原蛋白，但本發明不限於此，亦可以使用其他可使細胞脫附的酵素或試劑。
再接著，進行子步驟S126：取出含有細胞的懸浮液，而
完成細胞回收。
在上述實施例中，是以在細胞培養載體為二維結構狀態下進行細胞回收為例來進行說明。在另一實施例中，在三維結構的狀態下或從三維結構轉變至二維結構的過程中，於細胞培養載體上滴加含有細胞脫附酵素的試劑的情況下，除了可在細胞培養載體為二維結構狀態下進行細胞回收之外，更可在所述三維結構的狀態下或從所述三維結構轉變至所述二維結構的過程中進行細胞回收。
在本實施中，由於是在細胞培養載體為二維結構的狀態下進行細胞回收，其鬆開的結構可充分的使細胞培養載體與含有細胞脫附酵素的試劑反應，且其鬆開的結構也有利於生長於細胞培養載體內層之細胞脫附，進而有效提高細胞回收率。
在一實施例中，可將圖1至圖7b中的細胞培養載體模組中的至少一者應用在生物反應器中，以提高生物反應器的細胞數量與細胞回收率。
圖9為依據本發明一實施例之生物反應器所繪示的示意圖。
請參考圖9，本實施例的生物反應器50包括細胞培養載體模組500以及培養基槽510。細胞培養載體模組500包括細胞培養載體502、外套管504以及二個固定構件506a、506b。固定構件506a、506b分別配置於細胞培養載體502的兩端。細胞培養載體502位於外套管504內且固定於固定構件506a、506b上。
培養基槽510包括培養基輸入管線512以及培養基輸出管線514。培養基槽510經由培養基輸入管線512以及培養基輸出管線514分別連接至外套管504的兩端。培養基輸入管線512可藉由幫浦513將培養基槽510中的培養基注入外套管504中，而培養基輸出管線514可將外套管504中的培養基輸出至培養基槽510中。培養基輸入管線512具有細胞注入孔511。可將含有細胞的細胞培養基由細胞注入孔511注入培養基輸入管線512中，並經由培養基輸入管線512進入外套管504中。
在本實施例中，培養基槽510可更包括至少一探測器516以及加熱器518。探測器516配置在培養基槽510上。探測器516具有探針516a，探針516a的一端延伸入培養基槽510內的培養基中。探測器516藉由探針516a來檢測培養基。探測器516例如是pH酸鹼度計、溫度計或溶氧度計。
加熱器518配置在培養基槽510外。可藉由加熱器518來加熱培養基槽510內培養基的溫度，以使培養基維持在適當的溫度。
此外，生物反應器50可更包括系統控制主機520，連接於幫浦513、探測器516以及加熱器518，用以控制培養基之輸入與輸出、探測器516以及加熱器518。
以下將描述使用上述生物反應器進行細胞回收的流程步驟。
首先，將含有細胞的細胞培養基由細胞注入孔511注入
培養基輸入管線512中。所注入的細胞培養基經由培養基輸入管線512進入外套管504內且接種至三維結構狀態的細胞培養載體502上。在本實施例中，所注入至外套管內的細胞培養基的體積約為剛好覆蓋整個細胞培養載體502的體積。使細胞貼附於細胞培養載體上(約4-6小時，可依細胞種類不同而調整)。
接著，將培養基槽510內的培養基經由培養基輸入管線512注入外套管504中，且同時將外套管504中的培養基經由培養基輸出管線514輸出至培養基槽510中，以進行培養基灌流及循環。
為了使培養基槽510中的培養基混合均勻，可藉由擾動培養基槽510中的培養基，或者是藉由震盪培養基槽510而使培養基槽510內的培養基混合。擾動培養基的方式例如是將培養基槽510置放於磁力轉盤上，藉由磁力轉盤帶動磁石的旋轉來擾動培養基。震盪培養基槽510的方式例如是將培養基槽510置放於震盪器上，藉由震盪器來搖晃震盪培養基槽510，以使培養基槽510中的培養基混合。
然後，在培養基持續循環下進行細胞培養。在此期間中，系統控制主機520控制培養基之輸入與輸出、探測器516以及加熱器518。舉例來說，可藉由控制探測器516來監控培養基和細胞生長代謝狀況。
細胞培養之後，將外套管504內所有的培養基經由培養基輸出管線514輸出至培養基槽510中。使用磷酸緩衝鹽溶液
(phosphate buffer saline，PBS)反覆沖洗細胞培養載體502上殘留的培養基，然後移除磷酸緩衝鹽溶液。
接著，在三維結構狀態的細胞培養載體502上滴加含有細胞脫附酵素的試劑(例如是胰蛋白酶、Tryp LE、Accutase、Accumax或膠原蛋白酶)，使細胞從細胞培養載體502上脫附。將三維結構狀態的細胞培養載體502轉變為二維結構狀態，用以將生長於細胞培養載體502內層之細胞脫附。將三維結構狀態的細胞培養載體轉變為二維結構狀態的方式已於上述實施例中進行詳盡地描述，故於此不再贅述。在其他實施例中，亦可在細胞培養載體502為二維結構狀態時滴加含有細胞脫附酵素的試劑，或者在細胞培養載體502從三維結構狀態轉變成二維結構狀態的過程中滴加含有細胞脫附酵素的試劑。
之後，取出含有細胞的懸浮液，並進行離心等後續處理步驟而完成細胞回收。
以下，列舉本發明的實例以更具體對本發明進行說明。然而，在不脫離本發明的精神，可適當地對以下的實例中所示的材料、使用方法等進行變更。因此，本發明的範圍不應以以下所示的實例來限定解釋。
[動態培養實驗]
實例1
在實例1中，使用圖1的細胞培養載體模組且依照圖8所示的細胞培養步驟來進行細胞動態培養實驗。採用非洲綠猴腎
細胞(VERO)作為待培養的細胞。細胞培養的步驟如下：將具有VERO細胞之M199培養基(含有10%FBS)接種於三維結構的細胞培養載體，其中在M199培養基中的VERO細胞密度為2×104/cm2；將上述接種細胞後的細胞培養載體在37℃與5%CO2條件下進行動態培養21天；在此期間，每2-3天更換新的培養基，並於不同時間點測量細胞生長情況。
實例2
在實例2中，使用圖1的細胞培養載體模組且依照圖8所示的細胞培養步驟來進行細胞動態培養實驗。採用脂肪幹細胞(ADSC)作為待培養的細胞。細胞培養的步驟如下：將含有ADSC的無血清培養基分別接種於三維結構的細胞培養載體，其中在無血清培養基中的ADSC的細胞密度為1.5×103/cm2；將上述接種細胞後的細胞培養載體在37℃與5%CO2條件下進行動態培養21天；在此期間，每2-3天更換新的培養基，並於不同時間點測量細胞生長情況。
圖10為在本發明之細胞培養載體上培養非洲綠猴腎(VERO)細胞21天後的生長曲線圖。圖11為在本發明之細胞培養載體上培養脂肪幹細胞(ADSC)21天後的生長曲線圖。如圖10與圖11所示，實例1的VERO細胞與實例2的ADSC的細胞數皆隨著培養的天數增加而上升，其中，實例1的VERO細胞於培養21天之後，其細胞生長數量增加800倍以上；實例2的ADSC於培養21天之後，其細胞生長數量增加2000倍以上。由上述結
果可知，本發明之細胞培養載體不具有毒性，可使細胞順利貼附並生長，具有良好的生物相容性。
[細胞回收率檢測]
實例3
在實例3中，依照圖8所示的細胞回收步驟來對實例2的ADSC進行細胞回收，並對所回收的細胞進行細胞回收率測試。使用ADSC作為待培養的細胞。進行細胞回收的步驟如下：將ADSC分別培養於3個三維結構的細胞培養載體中(細胞培養載體A、細胞培養載體B及細胞培養載體C)並進行細胞培養10天後，將各個細胞培養載體分別浸泡在膠原蛋白酶中，接著再鬆開各個細胞培養載體以使結構由三維結構轉變為二維結構，持續使各個二維結構狀態的細胞培養載體浸泡於膠原蛋白酶中以促進細胞脫附，接著計算細胞懸浮液中細胞數目與載體上殘留之細胞數(各個細胞培養載體回收之結果詳列於下表1中)。
如表1所示，細胞培養載體上取下之細胞仍保有大於80%之高存活率。並且，利用本發明之細胞培養載體進行細胞培養的回收率大於80%。由上述結果可知，由於上述實施例是在細胞培養載體為二維結構的狀態下進行細胞回收，其鬆開的結構可充分的使細胞培養載體與膠原蛋白酶反應，且鬆開的二維結構也有利於生長於細胞培養載體內層之細胞脫附，因此在細胞培養載體為三維結構狀態下無法進行脫附的細胞可在二維結構狀態下進行脫附，進而提升細胞回收率。
[細胞特性測試]
為了測試利用本發明細胞培養載體所培養之細胞的特性，使用如同下述流式細胞儀之操作步驟對上述實例3所回收的ADSC進行細胞表面標記分析。
流式細胞儀分析的操作步驟如下：
1.將細胞離心後移去上清液並加入適量體積MACS分離緩衝液(MACS Separation Buffer)(或2%FBS)去回溶(resuspend)細胞，使細胞濃度約為1×106/ml至2×106/ml。
2.取100μl平分到每一試管中，細胞數目為1×105/管至1×106/管。
3.依抗體的種類加入適量的抗體在2℃至8℃避光反應30分鐘。
4.加入1ml的杜氏磷酸鹽緩衝液(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline，DPBS)後，以1500rpm離心5分鐘後，移去上清液。
5.加入300μl的DPBS回溶細胞後，使用流式細胞儀(型號：BD FACScan)進行分析。
一般來說，脂肪幹細胞的特性為：需高度表現標記蛋白CD73、CD90及CD105，且需低度表現或不表現血球細胞之標記
蛋白CD34及CD45。
結果如表2所示，由細胞培養載體A、B及C所回收之ADSC細胞，皆會高度表現CD73、CD90及CD105，且低度表現或不表現CD34及CD45。此結果證實了利用本發明之細胞培養載體所培養及回收的ADSC仍能維持其幹細胞的特性。
綜上所述，由於上述實施例的細胞培養載體模組具有可在二維結構與三維結構之間轉換的細胞培養載體，因此不僅提高了所培養的細胞數量與細胞回收率，且能維持細胞培養的品質，使細胞於增長的同時仍維持其既有的特性，例如上述回收之ADSC仍維持其幹細胞的特性。
雖然本發明已以實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作些許的更動與潤飾，故本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。
10、20、30、500‧‧‧細胞培養載體模組
50‧‧‧生物反應器
100、200、302、402、502‧‧‧細胞培養載體
102、302a、402a‧‧‧細胞培養線材
304、404、504‧‧‧外套管
305‧‧‧螺紋
306a、306b、406a、406b、506a、506b‧‧‧固定構件
408‧‧‧驅動件
410‧‧‧螺桿
510‧‧‧培養基槽
511‧‧‧細胞注入孔
512‧‧‧培養基輸入管線
513‧‧‧幫浦
514‧‧‧培養基輸出管線
516‧‧‧探測器
516a‧‧‧探針
518‧‧‧加熱器
520‧‧‧系統控制主機
S100、S110、S120‧‧‧步驟
S112、S114、S116、S118、S122、S124、S126‧‧‧子步驟
圖1為依據本發明一實施例之細胞培養載體模組所繪示的示意圖。 圖2為依據本發明一實施例之螺旋狀的細胞培養載體模組所繪示的示意圖。 圖3為依據本發明一實施例之線團狀的細胞培養載體模組所繪示的示意圖。 圖4為依據本發明另一實施例之細胞培養載體模組所繪示的示意圖。 圖5a為依據本發明第一實施例之細胞培養載體模組所繪示的示意圖。 圖5b為圖5a之細胞培養載體模組中細胞培養載體經壓縮後所繪示的示意圖。 圖6a為依據本發明第二實施例之細胞培養載體模組所繪示的示意圖。 圖6b為圖6a之細胞培養載體模組中細胞培養載體經壓縮後所繪示的示意圖。 圖7a為依據本發明第三實施例之細胞培養載體模組所繪示的示意圖。 圖7b為圖7a之細胞培養載體模組中細胞培養載體經壓縮後所繪示的示意圖。 圖8為依照本發明之一實施例的一種細胞回收的流程步驟圖。 圖9為依據本發明一實施例之生物反應器所繪示的示意圖。 圖10為在本發明之細胞培養載體上培養非洲綠猴腎（VERO）細胞21天後的生長曲線圖。 圖11為在本發明之細胞培養載體上培養脂肪幹細胞（ADSC）21天後的生長曲線圖。
Claims (18)
- 一種細胞培養載體模組，所述細胞培養載體模組包括：至少一細胞培養載體，所述細胞培養載體在鬆開的狀態為二維結構，在壓縮的狀態為三維結構，且相較鬆開的狀態的所述二維結構的所述細胞培養載體，壓縮狀態的所述三維結構的所述細胞培養載體供細胞生長的表面積與空間較大，其中所述二維結構包括平行線陣列或交錯線陣列，且所述三維結構包括螺旋狀或線團狀；外套管；以及至少一固定構件，所述固定構件配置於所述細胞培養載體的至少一端，所述細胞培養載體位於所述外套管內且固定於所述固定構件上，且藉由移動所述固定構件使所述細胞培養載體在所述二維結構與所述三維結構之間轉變。
- 如申請專利範圍第1項所述之細胞培養載體模組，其中所述細胞培養載體的材料包括細胞可貼附材料或經處理後具有細胞可貼附性的材料。
- 如申請專利範圍第2項所述之細胞培養載體模組，其中所述處理方式包括表面改質、表面塗覆或表面微結構化。
- 如申請專利範圍第1項所述之細胞培養載體模組，其中藉由將所述固定構件推進所述外套管內而擠壓所述細胞培養載體，使所述細胞培養載體從所述二維結構轉變成所述三維結構，且 藉由將所述固定構件從所述外套管內退出，使所述細胞培養載體從所述三維結構轉變成所述二維結構。
- 如申請專利範圍第1項所述之細胞培養載體模組，其中所述外套管的內側管壁具有螺紋，藉由使所述固定構件沿著所述螺紋旋入所述外套管內，而將所述細胞培養載體從所述二維結構轉變成所述三維結構，且藉由使所述固定構件沿著所述螺紋從所述外套管內旋出，而將所述細胞培養載體從所述三維結構轉變成所述二維結構。
- 如申請專利範圍第1項所述之細胞培養載體模組，更包括：驅動件，配置於所述外套管的一端；以及螺桿，連接於所述驅動件，且穿過該所述固定構件，藉由所述驅動件驅動所述螺桿，而將所述固定構件推進所述外套管內，使所述細胞培養載體從所述二維結構轉變成所述三維結構，且藉由所述驅動件驅動所述螺桿，而將所述固定構件從所述外套管內退出，使所述細胞培養載體從所述三維結構轉變成所述二維結構。
- 一種生物反應器，其包括如申請專利範圍第1項至第6項中任一項所述之細胞培養載體模組。
- 一種細胞回收方法，包括以下步驟： 提供細胞培養載體模組，所述細胞培養載體模組包括至少一細胞培養載體、外套管以及至少一固定構件，其中所述細胞培養載體在鬆開的狀態為二維結構，且在壓縮的狀態為三維結構，其中所述二維結構包括平行線陣列或交錯線陣列，所述三維結構包括螺旋狀或線團狀，其中所述固定構件配置於所述細胞培養載體的至少一端，所述細胞培養載體位於所述外套管內且固定於所述固定構件上，且藉由移動所述固定構件使所述細胞培養載體在所述二維結構與所述三維結構之間轉變；在所述細胞培養載體為所述三維結構狀態下進行細胞培養；以及在所述細胞培養載體為所述二維結構狀態下進行細胞回收，且從所述三維結構轉變至所述二維結構的過程中進行所述細胞回收。
- 如申請專利範圍第8項所述之細胞回收方法，其中將所述二維結構的所述細胞培養載體轉變為所述三維結構的所述細胞培養載體的方法包括扭轉或擠壓所述二維結構的所述細胞培養載體。
- 如申請專利範圍第8項所述之細胞回收方法，其中在所述細胞培養載體為所述二維結構的狀態下進行所述細胞回收的步驟包括： 將所述二維結構的所述細胞培養載體浸漬在含有細胞脫附酵素的試劑中，使細胞從所述細胞培養載體脫附；以及取出含有所述細胞的懸浮液。
- 如申請專利範圍第10項所述之細胞回收方法，其中所述細胞脫附酵素包括胰蛋白酶、Tryp LE、Accutase、Accumax或膠原蛋白酶。
- 如申請專利範圍第8項所述之細胞回收方法，更包括在所述三維結構的狀態下或從所述三維結構轉變至所述二維結構的過程中，於所述細胞培養載體上加入含有細胞脫附酵素的試劑。
- 如申請專利範圍第8項所述之細胞回收方法，更包括在所述三維結構的狀態下進行所述細胞回收。
- 如申請專利範圍第8項所述之細胞回收方法，其中藉由將所述固定構件推進所述外套管內而擠壓所述細胞培養載體，使所述細胞培養載體從所述二維結構轉變成所述三維結構，且藉由將所述固定構件從所述外套管內退出，使所述細胞培養載體從所述三維結構轉變成所述二維結構。
- 如申請專利範圍第8項所述之細胞回收方法，其中所述外套管的內側管壁具有螺紋，藉由使所述固定構件沿著所述螺紋旋入所述外套管內，而將所述細胞培養載體從所述二維結構轉變成所述三維結構， 藉由使所述固定構件沿著所述螺紋從所述外套管內旋出，而將所述細胞培養載體從所述三維結構轉變成所述二維結構。
- 如申請專利範圍第8項所述之細胞回收方法，其中所述細胞培養載體模組更包括：驅動件，配置於所述外套管的一端；以及螺桿，連接於所述驅動件連接，且穿過該所述固定構件，藉由所述驅動件驅動所述螺桿，使所述固定構件推進所述外套管內，而將所述細胞培養載體從所述二維結構轉變成所述三維結構，藉由所述驅動件驅動所述螺桿，使所述固定構件從所述外套管內退出，而將所述細胞培養載體從所述三維結構轉變成所述二維結構。
- 如申請專利範圍第8項所述之細胞回收方法，其中細胞培養載體的材料包括細胞可貼附材料、或經處理後具有細胞可貼附性的材料。
- 如申請專利範圍第17項所述之細胞回收方法，其中所述處理方式包括表面改質、表面塗覆或表面微結構化。
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