TWI669399B - 體外擴增自然殺手細胞及自然殺手ｔ細胞之方法及其醫藥組成物 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於一種體外擴增自然殺手細胞及自然殺手T細胞之方法，該
方法係以0.5x106~5x106cells/mL之初始細胞密度進行培養，並於培養後特定時間點將細胞密度再次調整為0.5x106~5x106cells/mL，藉以維持較佳之細胞生長環境，進而提升細胞之擴增效率，據此，本發明之方法，相較於習知技術而言，得以於較短的時間獲得較多之細胞總數，且細胞存活率以及NK/NKT細胞比例皆較高，處於活化態而具備細胞毒殺性之NK/NKT細胞比例亦較高。
Description
本發明係關於一種體外擴增自然殺手細胞(NK細胞)及自然殺手T細胞(NKT細胞)之方法，尤其指一種可於體外擴增三至七千倍NK/NKT細胞之方法，且該方法所擴增之NK/NKT細胞，其細胞存活率高於85%，具活性之NK/NKT細胞達50%以上，對癌細胞之毒殺效果更達76%以上。
免疫治療(Immunotherapy)，泛指透過強化生物體自身免疫系統，或是外加式地賦予生物體免疫能力來預防及治療疾病的方式，其具備高度專一性、高效率以及持久性等特性；近十年來，由免疫治療之概念所衍生之免疫細胞治療(immune cell therapy)亦逐漸被廣為探討。
2011年，免疫細胞治療首先於國際期刊Nature中被提出具潛力之評論，其被視為可能治癒癌症之治療方法；免疫細胞療法著重於刺激免疫系統，而能破壞手術(如放射線治療或化學治療)後殘留的癌細胞，進而提高療效，並減少手術或化、放療的毒性作用，以提升病患的生活品質及預後；舉例而言，以免疫細胞療法治療癌症，係自患者之血液中分離出免疫細胞，經適當之體外培養、放大及活化後，再次輸回患者體內，以對體內特定組織之腫瘤產生專一性
之免疫反應，利用自身的免疫細胞回輸以進行治療亦可避免產生免疫排斥反應；所述之免疫細胞中，由於自然殺手細胞(Nature killer cells,NK cells)無須透過抗原呈現細胞呈現抗原即可直接對標的細胞進行毒殺，因此被預測其相較於T細胞而言具有更高的抗腫瘤效率。
自然殺手細胞在人體免疫系統中作為對抗外來物質之第一道防線，由於其細胞表面缺乏專一性之抗原受體(TCR)，故其所引發之免疫反應為非專一性之防禦，自然殺手細胞係位於周邊血液循環中，可攻擊受病毒感染之細胞，使人體免於病毒之感染，亦可對腫瘤細胞及骨髓移植產生排斥反應以攻擊此些外來細胞，當自然殺手細胞與此些異質細胞接觸後，即驅動其活化受體(activating receptor)，因而活化其自身，並促使自然殺手細胞釋出穿孔素(perforin)及顆粒酶(granzyme)等因子；穿孔素將在標的異質細胞膜形成孔洞，接著顆粒酶進入該標的異質細胞後，改變粒線體膜之通透性，並活化細胞凋亡(apoptosis)相關之蛋白質以啟動細胞凋亡(apoptosis)反應，進而使標的異質細胞中DNA片斷化並導致細胞分解；此外，自然殺手T細胞係一群同時表現T細胞表面抗原(如：CD3、TCRαβ)及自然殺手細胞表面抗原(如：CD56)之異質性免疫細胞，因此其可同時誘發如同T細胞之專一性免疫反應，以及如同NK細胞之非專一性免疫反應，亦被視為發展免疫細胞治療之一大重點。
然而，自然殺手細胞僅佔人體周邊血液中淋巴球的5~10%，且自然殺手T細胞更僅佔不到1%，因此，能夠於體外高效率擴增自然殺手細胞及自然殺手T細胞係一重大課題，至目前為止，研究者仍極力於提升自然殺手細胞及
自然殺手T細胞之體外擴增效率，其細胞存活率、細胞純度以及細胞毒殺能力，進而更提升其於醫藥及醫療上的應用性。
本發明於一方面，係提供一種體外擴增自然殺手細胞(NK細胞)及自然殺手T細胞(NKT細胞)之方法，該方法係以0.5x106~5x106cells/mL之一初始細胞密度進行培養，以提供細胞較佳之生長環境，並於細胞總數達到2.5x106~5x106cells/mL時，首次更新細胞培養液並重新調整細胞密度為0.5x106~5x106cells/mL，亦即當細胞處於穩定狀態後，再重新調整細胞密度，如此以提升細胞之生長效率。
本發明於另一方面，係提供一種體外擴增自然殺手細胞及自然殺手T細胞之方法，該方法係每隔2至3天更新該細胞培養液，並重新將細胞密度調整為0.5x106~5x106cells/mL，如此能持續提供細胞較佳之生長環境。
本發明於另一方面，係提供一種體外擴增自然殺手細胞及自然殺手T細胞之方法，該方法所使用之細胞培養液係包含人類重組介白素-2(rhIL-2)，用以活化NK/NKT細胞，進而促進NK細胞分泌穿孔素以結合標的細胞並造成細胞毒殺效應，同時有助於免疫細胞生長，以增加擴增後的NK/NKT細胞總數。
本發明於另一方面，係提供一種體外擴增自然殺手細胞及自然殺手T細胞之方法，該方法所使用之細胞培養液更包含Anti-CD3單株抗體，用
以促進NK/NKT細胞之活化，以提升NK/NKT細胞對癌細胞之細胞毒殺性，且不影響NK/NKT細胞之生長。
於是，本發明之一方面係關於一種體外擴增自然殺手細胞及自然殺手T細胞之方法，其係包含步驟：將一周邊血單核球細胞(peripheral mononuclear cells,PBMCs)懸浮於一細胞培養液中以獲得一細胞混合液；將該細胞混合液之細胞密度調整為0.5x106~5x106cells/mL，做為一初始細胞密度，並使用該細胞培養液將該細胞混合液培養於一細胞培養盤中；當該細胞培養盤中之總細胞數達2.5 x106~5x106cells/mL時更新該細胞培養液，並重新將細胞密度調整為0.5x106~5x106cells/mL；每隔2至3天更新該細胞培養液，並重新將細胞密度調整為0.5x106~5x106cells/mL，培養至少10至16天；以及清洗該細胞混合液並取得該細胞混合液中的一細胞群落，該細胞群落即一經擴增之該自然殺手細胞及自然殺手T細胞混合物。
於本發明之一些具體實施態樣，於懸浮該周邊血單核球細胞之步驟前，更包含收集該周邊血單核球細胞之步驟，其係包含：離心一周邊血液檢體，使該周邊血液檢體分層為一血漿層、一白細胞層(buffy coat)及一紅血球層；去除該血漿層並取得該白細胞層，將該白細胞層混合於Hanks平衡鹽溶液(HBSS)及一單核球細胞分離液中以獲得一白細胞混合液；離心以分層該白細胞混合液；以及去除上清液，並取得中間層白色液體，即獲得該周邊單核球細胞。
於本發明之其他具體實施態樣，所述之細胞培養液係包含：一幹細胞生長培養基(SCGM)；一人類介白素-2重組蛋白(rhIL-2)，其濃度範圍係
介於250至1,000IU/mL；一血清，其體積百分比係介於1~10%；以及一抗CD3單株抗體(anti-CD3 monoclonal antibody)，其濃度範圍係介於10至500ng/mL。
於本發明之其他具體實施態樣，於調整該初始細胞密度之步驟中，係將該細胞混合液之細胞密度調整為0.5x106~2.5 x106cells/mL。
於本發明之其他具體實施態樣，於更新該細胞培養液並重新調整細胞密度之步驟中，係將該細胞混合液之細胞密度調整為0.5 x 106~2.5 x 106cells/mL。
於本發明之其他具體實施態樣，於培養該細胞混合液之步驟中，係將該細胞混合液置於37℃及5%二氧化碳之環境中培養。
於本發明之其他具體實施態樣，於取得該細胞群落之步驟前，更包含：分析該自然殺手細胞及該自然殺手T細胞於該細胞混合液中的比例，且比例介於30至90%，該自然殺手細胞係細胞表面抗原為CD16+CD56+CD3-之細胞群落，且該自然殺手T細胞係細胞表面抗原為CD16+CD56+CD3+之細胞群落。
於本發明之其他具體實施態樣，於清洗該細胞混合液並取得該細胞群落之步驟之後，更包含以一保存液懸浮該細胞群落之步驟，該保存液係一磷酸緩衝溶液或一細胞外液(Plasma-Lyte A)。
於本發明之其他具體實施態樣，所述之經擴增之該自然殺手細胞及自然殺手T細胞混合物之細胞存活率係達到至少80%，且該自然殺手細胞及自然殺手T細胞混合物中具細胞毒殺性之該自然殺手細胞及自然殺手T細胞係達到至少50%。
本發明之另一方面係關於一種自然殺手細胞及自然殺手T細胞之醫藥組成物，其係包含以前述之方法製備所得之該經擴增之該自然殺手細胞及自然殺手T細胞混合物；以及醫藥上可接受之溶劑。
S10~S18‧‧‧步驟
S101~S104‧‧‧步驟
圖1係本發明之第一實施例之流程示意圖；圖2係本發明之第二實施例之流程示意圖；圖3A-3B係經擴增之自然殺手細胞(NK細胞)/自然殺手T細胞(NKT細胞)之比例分析；圖4A-4B係經擴增之自然殺手細胞(NK細胞)/自然殺手T細胞(NKT細胞)之比例分析；圖5係係經擴增之自然殺手細胞(NK細胞)/自然殺手T細胞(NKT細胞)之細胞毒殺能力分析。
有鑑於習知技術對於體外擴增自然殺手細胞(NK細胞)以及自然殺手T細胞(NKT細胞)仍存在諸多待改善之處，由於NK細胞僅佔人體免疫細胞約5~10%，NKT細胞更不及1%，為使其更符合醫藥之應用，需於較短之培養時程獲得較大量之細胞總數，並需能針對細胞群落中的NK/NKT細胞進行擴增，以提升NK/NKT細胞之比例，進而提高細胞純度，此外，亦須維持擴增所得之細胞存活率，並於細胞擴增的過程中，有效地刺激並活化NK/NKT細胞，以提升其免
疫毒殺之效能；據此，本發明提出一種體外擴增自然殺手細胞(NK cell)/自然殺手T細胞(NKT cell)之方法，以改善習知技術之不足；以下，將針對本發明之技術手段及特點進行說明。
定義
用於本說明書，術語”自然殺手細胞”(Nature killer cell,NK cell)意指一種隸屬於先天免疫系統(innate immune system)之毒殺性淋巴球(cytotoxic lymphocyte)，可被誘發以執行非專一性細胞毒殺效應。
用於本說明書，術語”自然殺手細胞”(Nature killer T cell,NKT cell)意指一種同時表達αβT細胞受體(TCR)以及與自然殺手細胞相關分子標記之免疫細胞，其同時具備專一性之細胞免疫毒殺性以及非專一性之細胞免疫毒殺性。
用於本說明書，術語”單核球細胞”(peripheral mononuclear cells,PBMCs)意指一種具單一細胞核且細胞核形態為圓形之細胞，其包含T細胞、B細胞及NK細胞等淋巴細胞(lymphocyte)、單核細胞(monocyte)及樹突細胞(dendritic cell)，位於周邊血中的單核球細胞又可稱周邊血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。
材料與方法
試劑製備
細胞培養基(medium)
本發明之一實施例係使用CloneticsTM CellGro® SCGM BulletKitTM(CC-3205)做為基礎培養基，其容量500毫升(mL)之包裝中係包含基
底細胞基礎培養基(Stromal Cell Basal Medium)、0.5mL之人類纖維母細胞生長因子(h-FGF-B)、0.5mL之胰島素(Insulin)、0.5mL之胎牛血清(FBS)及0.5mL之慶大黴素/兩性黴素(Gentamicin sulfate/Amphotericin；GA-1000)。
人類重組介白素-2(recombinant human interleukin-2,rhIL-2)
於無菌作業環境下，取無菌針筒取1毫升(mL)無菌水，注入含有1.1毫克(mg)rhIL-2粉末(Proleukin®)之容器中，均勻溶解後獲得濃度為1.1毫克/毫升(mg/mL)之rhIL-2原液，接著以無菌針筒將rhIL-2原液取出，並放置於50mL離心管中，再加入43mL之細胞培養基以將rhIL-2溶液之濃度調整為500單位/微升(U/μl)，以獲得rhIL-2稀釋溶液；將rhIL-2稀釋溶液分裝至微量無菌離心管中，保存於-20℃冰箱備用。
抗-分化簇3之單株抗體(Anti-cluster of differentiation-3 monoclonal antibody,Anti-CD3 mAb)
於無菌作業環境下，將Anti-CD3單株抗體原液(濃度為1mg之Anti-CD3單株抗體溶於1mL溶劑中)自原始包裝(Takara)中取出，接著將Anti-CD3單株抗體原液混合至4mL之細胞培養基中，以將Anti-CD3單株抗體溶液之濃度稀釋為20μg/mL；將Anti-CD3單株抗體溶液稀釋溶液分裝至微量無菌離心管中，保存於-20℃冰箱備用。
擴增自然殺手細胞(NK cell)/自然殺手T細胞(NKT cell)之細胞培養液
取前述之rhIL-2稀釋溶液、Anti-CD3單株抗體稀釋溶液及血清加入細胞培養基中，均勻混合以配置成用以擴增自然殺手細胞/自然殺手T細胞之細
胞培養液，所述之細胞培養液包含終濃度為250~1,000IU/mL之rhIL-2、終濃度為10~500ng/mL之Anti-CD3單株抗體以及終濃度為1~10%之血清。
周邊血檢體
由醫院醫師門診採集受試者之周邊血檢體並保存於無菌採血管中，依據規範將檢體運輸至人體細胞組織優良操作(Good Tissue Practice,GTP)核心實驗室，以進行後續處理。
細胞(cell)
製備周邊血單核球細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)
將周邊血從採血管轉移到50mL離心管中進行梯度離心，其係設定離心機(AUBOCA,4000/4200)之離心力為600xg，並關閉離心機之煞車功能，於室溫下離心10分鐘以將周邊血檢體分為三層，由上而下分別為血漿(Plasma)、白細胞層(Buffy coat)與紅血球(Erythrocytes)；接著將血漿層去除並轉移白細胞層至新的無菌離心管中，再使用Hanks平衡鹽溶液(HBSS)緩慢地將白細胞混合以獲得白細胞稀釋溶液；另一方面，取1~3mL之單核球細胞分離液(Ficoll-Paque Plus)置於單核球分離離心管中，於室溫下以600xg離心力離心30秒後備用；接著，取前述之白細胞稀釋溶液加入含有單核球細胞分離液之單核球分離離心管中，於室溫下以600xg離心力離心10分鐘以分層，接續移除上清液，轉移白色中間層(即周邊血單核球細胞)至新的無菌離心管中，加入HBSS均勻混合以清洗細胞，於室溫下離心10分鐘後去除上清液，接著再次以HBSS重新懸浮細胞，於室溫下離心10分鐘，分別收集上清液及周邊血單核球細胞以備用。
細胞測試
細胞表面抗原分析
取1x106cells於15mL離心管中，以離心力500g離心5分鐘後去除上清液，再以4mL杜比可磷酸緩衝溶液(Dulbeccos Phosphate Buffered Saline，DPBS)重新懸浮細胞，並重複此步驟兩次，接著加入5μl之細胞螢光標記試劑，於4℃中避光反應15分鐘，接著，加入4mL DPBS清洗細胞，以離心力500g離心5分鐘後去除上清液，最後加入0.5mL DPBS重新懸浮細胞，接續以流式細胞儀(SONY；SH800Z)分析並定量細胞表面之螢光標記；前述之細胞螢光標記試劑包含與T細胞相關之螢光標記Anti-CD3 mAb(Invitrogen；Cat# 11-0038-42)，以及與NK細胞相關之螢光標記Anti-CD16 mAb(Invitrogen；Cat# 17-0168-42)、Anti-CD56 mAb(Invitrogen；Cat#12-0567-41)及Anti-CD314(NKG2D)mAb(BD；Cat# 562365)。
細胞計數
自細胞培養盤中取得欲分析細胞存活率之細胞樣本，以微量吸管將細胞樣本均勻懸浮以獲得細胞懸浮液，接著取20μl之細胞懸浮液與20μl之0.4%台盼蘭染劑(Trypan blue；Gibco；Cat# 15250-061)均勻混合以獲得細胞混合液，再以微量吸管取10~20μl之細胞混合液注入蓋玻片與細胞計數盤(Marienfeld；Cat# AP-0650030)之間的凹槽，接著將細胞計數盤置於顯微鏡下觀察，待細胞靜止後即開始計數細胞。
細胞計數盤之四個角落分別包括一4*4之區域，計數範圍則包括所述之四個區域；計數四個區域中之亮細胞，獲得活細胞之數量，再計數四個
區域中之暗色細胞及深藍色細胞，獲得死細胞之數量，再以此些數值計算細胞密度、細胞總數及細胞存活率等參數值；其中，細胞密度(cells/ml)=(四區域活細胞數/4)x(稀釋倍數2)x 104/mL；細胞總數(cells)=細胞密度(cells/ml)x細胞培養液體積(mL)；細胞存活率%=活細胞數(cells)/(活細胞數+死細胞數)(cells)x%。
細胞毒殺性測試
實驗係以擴增後之NK/NKT細胞做為效應細胞(effector cells)，並以K562細胞株做為毒殺標的細胞(target cells)，將效應細胞及標的細胞以1：1混合後培養，反應4小時後，再以染劑7-AAD進行細胞染色，由於7-AAD無法通透正常細胞之細胞膜，僅能通透處於細胞凋亡過程或者已死亡之細胞，因此可藉由偵測細胞中7-AAD之訊號以做為細胞凋亡之依據。
接著，請參閱圖1，其係本發明之第一實施例之流程示意圖；如圖所示，本實施例所述之體外擴增自然殺手細胞(NK cells)及自然殺手T細胞(NKT cells)之方法，係包含步驟如下：步驟S10：將一周邊血單核球細胞(peripheral mononuclear cells,PBMCs)懸浮於一細胞培養液中以獲得一細胞混合液；步驟S12：將該細胞混合液之細胞密度調整為0.5x106~5x106cells/mL，做為一初始細胞密度，並使用該細胞培養液將該細胞混合液培養於一細胞培養盤中；步驟S14：當該細胞培養盤中之總細胞數達2.5 x106~5x106cells/mL時更新該細胞培養液，並重新將細胞密度調整為0.5x106~5x106cells/mL；
步驟S16：每隔2至3天更新該細胞培養液，並重新將細胞密度調整為0.5x106~5x106cells/mL，培養至少10至16天；以及步驟S18：清洗該細胞混合液並取得該細胞混合液中的一細胞群落，該細胞群落即一經擴增之該自然殺手細胞及自然殺手T細胞混合物。
其中，於步驟S10之前，更包含如圖2所示之第二實施例之流程示意圖；如圖所示，本實施例之收集該周邊血單核球細胞係包含步驟如下：步驟S101：離心一周邊血液檢體，使該周邊血液檢體分層為一血漿層、一白細胞層(buffy coat)及一紅血球層；步驟S102：去除該血漿層並取得該白細胞層，將該白細胞層混合於Hanks平衡鹽溶液(HBSS)及一單核球細胞分離液中以獲得一白細胞混合液；步驟S103：離心以分層該白細胞混合液；以及步驟S104：去除上清液，並取得中間層白色液體，即獲得該周邊單核球細胞。
本實施例係如材料與方法中所述製備周邊血單核球細胞之流程；其中，於步驟S11獲得分層之周邊血檢體，接著於步驟S12中，係以10mL無菌吸管搭配輔助器去除血漿，在吸除的過程中，當液面接近距離該白細胞層0.4~0.5公分時即停止，以避免消耗白細胞，亦避免破壞周邊血分層之介面，接著將白細胞以HBSS混合並稀釋，以適於後續分離單核球之用；而於步驟S14中，於吸除上清液之過程中，當液面接近距離中間層白色液體0.5~1公分時即停止，同樣係為避免消耗白細胞，以及避免破壞分層之介面；透過本實施例之方法，即可獲得周邊血單核球細胞，即為第一實施例中用以擴增NK/NKT細胞之初始細胞來源。
接著，於步驟S10中，係將步驟S11~S14所獲得之周邊血單核球細胞懸浮於該細胞培養液中，該細胞培養液需於細胞生長過程中提供充足之養分，並且於擴增細胞的同時提供適當之因子刺激並活化NK/NKT細胞，基於上述之目的，本實施例之該細胞培養液係選用一幹細胞生長培養基(SCGM)作為基礎培養基，另添加濃度範圍介於150~1,500IU/mL之一人類介白素-2重組蛋白(rhIL-2)，以及濃度範圍介於10至800ng/mL之一抗CD3單株抗體(anti-CD3 monoclonal antibody,anti-CD3 mAb)作為活化NK/NKT細胞之刺激因子，同時於本實施例中，rhIL-2亦可促進NK/NKT細胞之生長，以增加NK/NKT細胞之細胞總數，此外，本實施例亦加入體積百分比介於1~10%之一血清；上述之添加物，於一較佳實施例中，其所添加之最終濃度為250~1,000IU/mL之rhIL-2、50~500ng/mL之anti-CD3 mAb以及1~5%之血清，該血清可為周邊血檢體之提供者之自體血清，或可為其他動物源之血清。
接續於步驟S12中，係將步驟S11獲得之該細胞混合液之細胞密度調整為0.5x106~5x106cells/mL，並以此初始細胞密度放置於載有該細胞培養液之該細胞培養盤中，再將該細胞培養盤放置於細胞培養箱中，以37℃及5%二氧化碳之環境開始單核球細胞之培養，並將此步驟定義為培養第0天，此初始細胞密度能提供細胞與細胞之間適當之接觸以及良好的生長空間，以促進細胞趨向穩定的狀態，以利後續生長分裂；於一較佳實施例中，係以0.5 x 106~2.5 x 106cells/mL之細胞數作為初始細胞密度，並將細胞置於細頸培養盤中(flask)進行培養。
接續於步驟S14中，當該細胞培養盤中的總細胞數成長至約2.5x106~5x106cells/mL，即更新細胞培養盤中的該細胞培養液，並將細胞密度再次調整為0.5x106~5x106cells/mL，以維持細胞培養盤中良好的生長環境以及充足之生長養分；於一較佳實施例中，係於總細胞數成長至2.5x106~3.5x106cells/mL，或培養至第5天，此時，細胞已處於穩定之狀態，並具有較佳之細胞生長分裂之效能，即再次將細胞密度調整為0.5 x 106~5 x 106cells/mL，持續擴增NK/NKT細胞。
接續，在步驟S14之後，每隔2至3天更新該細胞培養液，並重新將細胞密度調整為0.5x106~5x106cells/mL，以持續維持細胞培養盤中良好的生長環境以及充足之生長養分，並持續培養至第10天~第16天；於一較佳實施例，在擴增NK/NKT細胞之流程中，係於培養後第5天、第7天、第9天、第12天、第14天及第16天重新調整細胞密度，且係將細胞密度調整為0.5x106~5x106cells/mL。
接續，在步驟S16之前，係先取得該細胞培養盤中部分細胞均勻混合液作為測試樣本，以進行細胞計數及細胞特性分析；所述之細胞特性分析係如材料與方法所述，透過分析細胞表面抗原CD16、CD56及CD3來定義所擴增之細胞群落中所包含的NK/NKT細胞，以分析NK細胞及NKT細胞所佔之比例，其中NK細胞係細胞表面抗原CD16+CD56+CD3-之細胞群落，而NKT細胞則係細胞表面抗原CD16+CD56+CD3+之細胞群落，透過本實施例之流程所擴增之細胞群落，其NK/NKT細胞所佔之比例最高可達到90%。
最後，於步驟S18中，係於清洗該細胞群落後，獲得該經擴增之該自然殺手細胞及自然殺手T細胞混合物，其係以生理等級無菌磷酸緩衝溶液懸
浮該細胞群落，離心10分鐘以移除上清液，重複此步驟至少三次，以確保去除該細胞培養液及其所包含之添加物質。
經前述步驟所獲得之該擴增之該自然殺手細胞及自然殺手T細胞混合物可混合於適當之溶劑中保存，或進一步製備為醫藥組成物，所述之溶劑可為一磷酸緩衝溶液或一細胞外液(Plasma-Lyte A)
本發明之其他特色及優點將於下列實施範例中被進一步舉例與說明，而該實施範例僅作為輔助說明，並非用於限制本發明之範圍。
實施例
實施例1、初始細胞數之優化
本實施例目的係建立本發明之體外擴增自然殺手細胞(NK cell)/自然殺手T細胞(NKT cell)之方法所使用之較佳初始細胞密度，其係如前述方法取得周邊血單核球細胞，以該周邊血檢體來源者之自體血清(包含250IU/ml之rhIL-2及50ng/ml之Anti-CD3單株抗體)進行培養，再透過前述之細胞計數方法進行細胞密度評估；如表一所示，其係分別以初始細胞密度1.00 x106、2.00x106、3.00 x106及5.00 x106cells/ml進行培養，並於培養後第5、7、9、12、14、16、18及20天自培養盤取出細胞進行計數，並將細胞密度重新調整為1.00 x106cells/ml，由結果可以得知，以此些初始細胞密度進行體外擴增NK/NKT細胞時，皆能將細胞存活率維持在90%以上，其中，以1.00 x106cells/ml之初始細胞密度進行培養時，其細胞擴增效率最好，擴增後所能獲得之細胞數亦為最多；據此，
本發明之一較佳實施例中，可選用1.00 x106、2.00x106、3.00 x106及5.00 x106cells/ml之初始細胞密度進行培養。
實施例2、細胞培養天數之優化
承上，為了達到較佳之細胞生長效率，本實施例接續探討所需之細胞培養天數，以及重新調整細胞密度之時間間隔；於本實施例中，係取得前述之周邊血單核球細胞，以一較佳實施例1.00 x106cells/mL為初始細胞密度，使用該周邊血檢體來源者之自體血清(包含250IU/ml之rhIL-2及50ng/ml之Anti-CD3單株抗體)進行培養，於表二中各組別所標示之培養時間進行細胞計數，並於細胞計數後將培養盤中的細胞密度重新調整為1.00 x106cells/mL繼續培養。
如表二所示，其係分為三個測試組別，其中，第一組在細胞放置於培養盤後第5天進行第一次細胞密度調整，接著每隔2天重新調整細胞密度為1.00 x106cells/mL，接著在第9天時連續培養3天，再於培養第12天起每隔2天重
新調整細胞密度為1.00 x106cells/mL，由結果可以得知，與第二組及第三組相比，第一組之細胞總數在培養第12天後，其細胞總數仍持續穩定地上升，於第20天時所達到之細胞總數較其他組別多了2~20倍，且細胞存活率亦維持在95%以上；據此，於本發明之一較佳實施例中，係如表二第一組所述之細胞密度調整間隔作為擴增NK/NKT細胞之培養條件，以達到較佳之細胞生長效率。
實施例3、細胞培養液中人類重組介白素-2(rhIL-2)濃度之優化
由於細胞擴增培養時，細胞培養液中的添加物之使用量亦影響細胞生長效率，因此本實施例接續探討，在實施例1及2所建立之初使細胞密度及調整細胞密度時間間隔之培養條件下，可進一步提升細胞生長效率之rhIL-2濃度；其係取得前述之周邊血單核球細胞，以一較佳實施例1.00 x106cells/mL為初始細胞密度，使用該周邊血檢體來源者之自體血清(包含rhIL-2及50ng/ml之Anti-CD3單株抗體)進行培養，試驗組別分別為包含250、500、750或1,000IU/ml之rhIL-2。
如表三所示，使用500IU/ml rhIL-2進行培養之組別，其細胞擴增趨勢最為穩定，且於培養第20天時所能獲得之細胞總數較其他組別多1~3倍；據此，本發明之一較佳實施例係可以250至1,000IU/ml之rhIL-2進行培養，此外，由本實施例之結果亦可得知，本發明所用以擴增細胞之細胞培養液，可進一步幫助免疫細胞生長，亦即，本發明之一實施例中所選用之rhIL-2濃度得以提高擴增後之細胞群中NK/NKT細胞總數。
實施例4、細胞培養液中抗-分化簇-3(Anti CD-3)之單株抗體濃度及添加次數之優化
體外擴增之免疫細胞係應用於人體中以提升免疫力，進而對腫瘤細胞進行毒殺作用，為了能提高體外擴增之免疫細胞進入人體後所產生的免疫毒殺效能，除了需增殖大量的細胞外，所獲得之細胞亦需具備細胞毒殺性，於此，本實施例進一步探討用以於體外活化NK/NKT細胞之Anti CD-3單株抗體，其於擴增培養細胞的過程中較佳之用量；其係取得前述之周邊單核球細胞，以
一較佳實施例1.00 x106cells/mL為初始細胞密度，使用該周邊血檢體來源者之自體血清(包含500IU/ml之rhIL-2及Anti-CD3單株抗體)進行培養，試驗組別分別為包含50、100、250或500ng/ml之Anti-CD3單株抗體。
如表四所示，使用50ng/ml及500ng/ml之Anti-CD3單株抗體進行培養之組別，相較於其他組別而言，於培養第20天時可達到較高的細胞總數，而為了能降低製備成本，並減少所製備之細胞群中外來物質之殘留，進而降低因外來物質所誘發之免疫反應，以減少施用於人體時產生副作用之風險，於本發明之較佳一實施例中，係選用50至500ng/ml之Anti-CD3單株抗體進行培養，此外，又如表五所示，於細胞培養液中添加50ng/ml之Anti-CD3單株抗體之條件，係於細胞培養後分別於第0、5及7天各添加一次，相較於其他組別更能穩定地擴增細胞，除了維持實施例3能達到之擴增後細胞總數，同時提升擴增後之細胞群中具有毒殺活性之NK/NKT細胞的比例。
實施例5、擴增所得之自然殺手細胞(NK cell)及自然殺手T細胞(NKT cell)比例
經上述實施例之數據說明，本發明之體外擴增自然殺手細胞及自然殺手T細胞之方法，在取得周邊單核球細胞並於培養18天內，細胞擴增量可達3,000至7,000倍，且細胞存活率高於85%；接著，本實施例進一步確立本發明之方法確實能針對初始細胞(即周邊單核球細胞)中的NK/NKT細胞進行擴增。
於本實施例中，係先經前述之實施例獲得經擴增之細胞群落，再利用流式細胞儀(Flow cytometry)分析所擴增之細胞群落中有效細胞(即NK/NKT細胞)之佔比；其係分別依據NK細胞及NKT細胞之細胞專一性標記(cell marker)，透過流式細胞儀定量經擴增之細胞群落中NK/NKT細胞之比例，該NK細胞專一性標記分別為CD56及NK細胞活化受體CD16與NKG2D，此外，亦以
CD3作為T細胞專一性標記以分析NKT細胞；試驗係以材料與方法所述之細胞表面抗原分析流程進行細胞群分析。
請見圖3A及圖3B，圖3A係細胞表面顆粒性及細胞顆粒大小之分析結果，如結果所示，本實施例所分析之細胞樣本，大多集中在同一群落，顯示其細胞型態一致，且細胞樣本並未明顯區分為多個群落，顯示其細胞存活率之一致性；圖3B則係NK/NKT細胞於細胞群落中佔比之分析結果，如圖所示，左上角之細胞群係如圖3A所搜集之細胞群落中，不表現CD3但表現CD56之細胞群(CD3- CD56+)，其即為NK細胞，其佔總細胞之比例為5.64%，此外，右上角為表現CD3亦表現CD56之細胞群(CD3+ CD56+)，其即為NKT細胞，且其細胞比例為55.82%，由此可知，經本發明之方法所擴增之細胞群落中，NK/NKT細胞之比例達62.5%(NK細胞5.64+NKT細胞55.82)。
請接續參閱4A及4B，圖4A右上角係顯示細胞群落中同時表現CD16及CD56之細胞，其比例為總細胞之23.03%，接續自圖4A選取CD16+CD56+之細胞群後，分析CD16+CD56+之細胞群中，表現NKG2D及CD3之細胞分佈狀態，結果如圖4B所示，左上角係CD16+CD56+NKG2D+CD3-之細胞群，其即為NK細胞，右上角則係CD16+CD56+NKG2D+CD3+之細胞群，其即為NKT細胞，依據流式細胞儀之定量結果可以得知，同時表現NK細胞專一性標記CD16、CD56及NKG2D之NK/NKT細胞比例達16.9%(23.03%*(15.37+58.3)%=16.9%)。
實施例6、擴增所得之自然殺手細胞(NK cell)及自然殺手T細胞的細胞毒殺能力
最後，為能確立本發明之體外擴增NK/NKT細胞之方法，其所製備之NK/NKT細胞得以符合製備為醫藥組成物之需求，本實施例利用材料與方法中所述的細胞毒殺性測試，進一步分析經擴增所得之NK/NKT細胞對於癌細胞之毒殺效果；請見圖5A及5B，圖5A係顯示細胞樣本呈現一致的細胞型態及細胞存活率，圖5B則可清楚獲知，與擴增所得之NK/NKT細胞共同培養之K562細胞，其細胞狀態處於早期凋亡或凋亡過程之比例約為76.30%，亦即擴增所得之NK/NKT細胞對於癌細胞之毒殺效果可達76.30%。
綜合上述實施例之說明，本發明所揭示之體外擴增自然殺手細胞及自然殺手T細胞之方法，係經測試證實，其步驟中所使用之初始細胞密度，以及於特定的時間點更新細胞培養盤中的細胞密度，確實能夠給予細胞較佳之生長環境，進而提升細胞之擴增效率，此外，該方法之細胞培養液所包含之添加物rhIL-2及anti-CD3單株抗體，除可更提升細胞生長效率外，亦能活化所擴增之NK/NKT細胞，如此，透過本發明之方法所獲得之細胞，相較於習知技術，不僅可獲得較高的細胞總數，同時能維持較佳的細胞存活率，以及較高的NK/NKT細胞比例，更甚者，經擴增後之NK/NKT細胞亦具有較佳之細胞毒殺性，亦即，本發明之方法確實可針對細胞群落中的NK/NKT細胞進行有效地擴增及活化，進而可進一步應用於醫藥組成物之製備。
雖然前述說明書已舉出並詳述多種不同的實施範例，使得本發明所屬領域具通常知識者可以很容易地了解本發明的本質及特徵。然而應了解，在不脫離其發明精神和範圍的情況下，本發明亦可以從前述的描述再經過某些變化和修改，而使其更適用於各種用途和條
件。因此，本說明書及其所述之申請專利範圍應為示範用途，而非以任何方式限制本發明之範圍。
Claims (8)
- 一種體外擴增自然殺手細胞(NK cells)及自然殺手T細胞(NKT cells)之方法，其係包含步驟：將一周邊血單核球細胞(peripheral mononuclear cells,PBMCs)懸浮於一細胞培養液中以獲得一細胞混合液；將該細胞混合液之細胞密度調整為0.5x106~5x106cells/mL，做為一初始細胞密度，並使用該細胞培養液將該細胞混合液培養於一細胞培養盤中；當該細胞培養盤中之總細胞數達2.5x106~5x106cells/mL時更新該細胞培養液，並重新將細胞密度調整為0.5x106~5x106cells/mL；每隔2至3天更新該細胞培養液，並重新將細胞密度調整為0.5x106~5x106cells/mL，培養至少10至16天；以及清洗該細胞混合液並取得該細胞混合液中的一細胞群落，該細胞群落即一經擴增之該自然殺手細胞及自然殺手T細胞混合物；其中該細胞培養液係包含：一幹細胞生長培養基(SCGM)；一人類介白素-2重組蛋白(rhIL-2)，其濃度範圍係介於250至1000IU/mL；一血清，其體積百分比係介於1~10%；以及一抗CD3單株抗體(anti-CD3 monoclonal antibody)，其濃度範圍係介於10至500ng/mL；其中該自然殺手細胞係細胞表面抗原為CD16+CD56+CD3-之細胞群落，且該自然殺手T細胞係細胞表面抗原為CD16+CD56+CD3+之細胞群落。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中於懸浮該周邊血單核球細胞之步驟前，更包含收集該周邊血單核球細胞之步驟，其係包含： 離心一周邊血液檢體，使該周邊血液檢體分層為一血漿層、一白細胞層(buffy coat)及一紅血球層；去除該血漿層並取得該白細胞層，將該白細胞層混合於Hanks平衡鹽溶液(HBSS)及一單核球細胞分離液中以獲得一白細胞混合液；離心以分層該白細胞混合液；以及去除上清液，並取得中間層白色液體，即獲得該周邊單核球細胞。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中於調整該初始細胞密度之步驟中，係將該細胞混合液之細胞密度調整為0.5 x106~2.5 x106cells/mL。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中於更新該細胞培養液並重新調整細胞密度之步驟中，係將該細胞混合液之細胞密度調整為0.5x106~2.5x106cells/mL。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中於培養該細胞混合液之步驟中，係將該細胞混合液置於37℃及5%二氧化碳之環境中培養。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中於清洗該細胞混合液並取得該細胞群落之步驟之後，更包含以一保存液懸浮該細胞群落之步驟，該保存液係一磷酸緩衝溶液或一細胞外液(Plasma-Lyte A)。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該經擴增之該自然殺手細胞及自然殺手T細胞混合物之細胞存活率係達到至少60%，且該經擴增之該自然殺手細胞及自然殺手T細胞混合物中具細胞毒殺性之該自然殺手細胞及自然殺手T細胞係達到至少50%。
- 一種自然殺手細胞及自然殺手T細胞之醫藥組成物，其係包含以申請專利範圍第1項所述之方法製備所得之該經擴增之該自然殺手細胞及自然殺手T細胞混合物；以及一醫藥上可接受之溶劑。
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| Title |
|---|
| Bakkenist et al.,〝Radiation therapy induces the DNA damage response in peripheral blood〞Oncotarget, August 2013, Vol.4 No8. pp1143-1148 |
| Fuss et al.,〝Isolation of Whole Mononuclear Cells from Peripheral Blood and Cord Blood〞 Current Protocols in Immunology 7.1.1-7.1.8 April 2009. |
| Masuyama et al.,〝Ex vivo expansion of natural killer cells from human peripheral blood mononuclear cells co-stimulated with anti-CD3 and anti-CD52 monoclonal antibodies〞Cytotherapy,2016; Vol 18 pp80-90. |
| Masuyama et al.,〝Ex vivo expansion of natural killer cells from human peripheral blood mononuclear cells co-stimulated with anti-CD3 and anti-CD52 monoclonal antibodies〞Cytotherapy,2016; Vol 18 pp80-90. Fuss et al.,〝Isolation of Whole Mononuclear Cells from Peripheral Blood and Cord Blood〞 Current Protocols in Immunology 7.1.1-7.1.8 April 2009. Bakkenist et al.,〝Radiation therapy induces the DNA damage response in peripheral blood〞Oncotarget, August 2013, Vol.4 No8. pp1143-1148 * |
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