TWI669396B - 用於基因標定及性狀疊加之經工程處理的轉殖基因整合平台（ｅｔｉｐ） - Google Patents

Abstract

本文描述一種經工程處理的轉殖基因整合平台(ETIP)，其可被隨機地或於植物基因組中被標記之位置插入，用以促進快速篩選及偵測於該ETIP基因體位置被完整標記(包括5'及3'二端)之GOI。本說明書之要素為該ETIP中之該特異性雙鏈斷裂的引入。某些具體實施例描述使用鋅指核酸酶結合物之ETIP，但其可能利用其他標定技術，例如巨核酸酶(meganuclease)、CRISPRs、TALs或白胺酸鏈區。本文亦描述用於產生基因轉殖植物的組成物和方法，其中該供體或負載(payload)DNA表現一或多種之外源性核酸序列的產物(如蛋白質或RNA)，其具有穩定整合入植物細胞之ETIP。於具體實施例中，該ETIP促進測試發展階段中構思(ideation)的候選基因及植物表現載體。

Description

用於基因標定及性狀疊加之經工程處理的轉殖基因整合平台(ETIP) 交互參照相關申請案

本申請案主張2012年9月7日提申之美國臨時專利申請案No.61/697,882之優先權，且將該案之揭露內容整體納入作為參考。

發明領域

本說明書係與植物精確轉形、基因標定、標定(targeted)之基因體(genomic)整合及植物中之蛋白質表現的領域有關。於一較佳之具體實施例中，本說明書描述一經工程處理(Engineered)的轉殖基因整合平台(ETIP)，其可在植物基因組中被隨機地或於標定位置(location)插入。

發明背景

為了迎接食物生產需求增加的挑戰，改良農業的生產率(例如提高產量或工程化之害蟲抗性)的典型方法需依靠突變育種或藉轉形引入未知基因至作物物種之基因組中。此等方法本質上不具特異性且相對無效率。例如，傳統之植物轉形方法傳遞於隨機位置整合入基因組的外源性 DNA。因此，為了辨識及分離具有所欲屬性之基因轉殖植物株系，必須要對每一構建體(construct)產生數百個獨特隨機整合之品件，並隨後篩選所欲之個體。因此，傳統植物性狀工程為費力、費時且無法預測的工作(undertaking)。此外，此等整合之隨機特性，使其難以預測是否因意外之基因組斷裂而發生多效性。

現行之轉形方法的隨機特性需要產生數百個品件用來辨識及篩選基因轉殖品件候選者(轉形及品件篩選有速率限制，其與由功能基因體研究被辨識之基因候選者相關)。此外，依據基因組中整合的位置，由於該基因體位置效應，一基因表現卡匣會有不同程度的表現。此基因體位置效應使得用傳統轉形方法隨機插入至基因組之不同調控因子及轉殖基因設計之影響的比較會具有高度可變性。因此，具工程化基因或性狀之植物株系的產生、分離及特徵化，是低成功率之極費力及成本密集的方法。

精確的基因修飾(modification)克服了植物系統傳統實務之後勤(logistical)挑戰，且成為基礎植物研究者及農業生技學家的長期目標。但是，除了對稻米藉正-負藥物篩選之"基因標定"，或使用預先工程化之限制位，所有植物品種(包括模式及作物)之經標記之基因組的修飾直到最近才被證明難以實現。Teradaet al. (2002)Mat Biotechnol 20(10)：1030；Teradaet al. (2007)Plant Physiol 144(2)：846；D'Halluin etal. (2008)Plant Biotechnology J.6(1)：93。

近來有人描述用於剪切經標記之基因體 DNA的方法和組成物。該經標記之剪切品件可被使用，例如用以引導經標記之突變或經標記之細胞序列之缺失，或促進於一預先決定之染色體位點之經標記之重組。參見例如United States Patent Publications 2003/0232410,2005/0208489,2005/0026157,2005/0064474及2006/0188987，以及國際公開號WO 2007/014275，於所有目的下本說明書係以整體被併入作為參考。

美國專利公開號No.2008/0182332揭露對被標記之植物基因組修飾使用非典範(non-canonical)之鋅指核酸酶(ZFNs)。美國專利申請號No.12/284,888描述由ZFN-介導對植物EPSPS位點之標記整合。但是，仍有需要尋找辨識、篩選及快速發展穩定的在植物基因組中於精確位點的標記整合。

發明概要

本說明書之具體實施例係關於一種用於產生基因轉殖植物細胞的方法。於更一具體實施例中提供一植物細胞，其具有包含可標定(targetable)核酸分子之基因體DNA。該等具體實施例包含該可標定核酸分子，其包含：至少一具位特異性之核酸酶辨識位；一第一標記基因之第一片段；以及，一第二標記基因之第二片段。於另一具體實施例中，該植物細胞係經以一供體核酸分子及一具位特異性核酸酶核酸分子轉形。於下一個具體實施例中，該植物細胞之基因體DNA係在該至少一具位特異性核酸酶辨識 位剪切。一額外之具體實施例包含該供體核酸分子整合入該可標定核酸分子中，其中該可標定核酸分子中之整合包含至少一功能性標記基因，用以產生該基因轉殖植物細胞、包含該可標定核酸分子之該基因轉殖植物細胞以及包含至少一功能性標記基因之經整合供體核酸分子。

於又一具體實施例，本發明說明係關於西洋油菜染色體目標位，其係由以下組群篩選：SEQ ID NO：431之核苷酸1-579至SEQ ID NO：432之核苷酸166-732，SEQ ID NO：433之核苷酸1-550至SEQ ID NO：434之核苷酸190-653，SEQ ID NO：435之核苷酸1-298至SEQ ID NO：436之核苷酸51-644，SEQ ID NO：437之核苷酸1-536至SEQ ID NO：438之核苷酸146-545，SEQ ID NO：439之核苷酸1-431至SEQ ID NO：440之核苷酸167-685，SEQ ID NO：441之核苷酸1-599至SEQ ID NO：442之核苷酸116-521，SEQ ID NO：443之核苷酸1-298至SEQ ID NO：444之核苷酸193-775，及SEQ ID NO：445之核苷酸1-651至SEQ ID NO：446之核苷酸120-578。

於下一具體實施例，本說明書係關於一種用於產生基因轉殖植物細胞的方法。更一具體實施例包含該可標定核酸分子包括：至少一具位特異性核酸酶辨識位；一第一標記基因之第一片段；以及一第二非編碼多核苷酸序列之第二片段。於另一具體實施例中，該植物細胞係以一供體核酸分子及一具位特異性核酸酶核酸分子轉形。於下一具體實施例中，將該植物細胞之基因體DNA之該至少一具 位特異性核酸酶辨識位剪切。一額外之具體實施例包含該供體核酸分子整合入該可標定核酸分子，其中該可標定核酸分子之整合包括至少一功能性標記基因，用以產生該基因轉殖植物細胞，該基因轉殖植物細胞包括該可標定核酸分子，且經整合供體核酸分子包括至少一功能性標記基因。

藉由以下數個具體實施例之詳述及參考所附圖式，本發明上述及其他特色將更加顯著。

圖1A-1E：顯示FAD2基因序列之序列比對，使用AlignX®產生。

圖2：顯示FAD2基因序列之系統發生樹(phylogenetic tree)，其係以鄰接距離為基礎使用Jalview^TM v2.3產生。

圖3A-3M’：顯示FAD3基因序列之序列比對，使用AlignX®產生。

圖4：顯示FAD3基因序列之系統發生樹，其係以鄰接距離為基礎使用Jalview^TM v2.3產生。該標示之序列對應如下：本實施中FAD3A’/A”被稱為FAD3A’；本實施中Haplotype2被稱為FAD3C’；本實施中單倍體1被稱為FAD3C”；且本實施中Haplotype 3被稱為FAD3A”。

圖5：顯示pDAB104010之質體圖譜，且顯現一代表性之鋅指核酸酶(ZFN)表現卡匣。此構建體之規畫(lay-out)與其他ZFN表現卡匣相似，其中該鋅指域24828及 24829係以下述之可擇的鋅指域交換。

圖6：為例示之多線段圖，其顯示每10,000序列讀取(reads)於標的ZFN位具缺失之序列讀取數。圖之該X軸表示缺失的鹼基數，該Y軸表示序列讀取數，該Z軸表示如該圖右邊所述之顏色編碼樣品標識。所示之特定實施例係FAD2基因群之位點1(locus 1)，其包含4個基因群成員之3個標的ZFN位A、B及C以及被評定為控制樣品A及B之2個控制轉染。由頂至底所列之株系(圖標頂部A-control_FADA’至圖標底部C_sample_FAD2C)係被顯示於圖中，由最接近該標示之X軸(A_control_FADA’)至最遠離該標示之X軸(C_sample_FAD2C)。

圖7：(A)該圖呈現該FAD2基因群之ZFN目標位點4之資料。該位點包含2個ZFN位及2個必要的控制轉染。

圖7：(B)特定序列內容(SEQ ID NOs：471-480)圍繞著該ZFN標的位，辨識FAD2A及C，其含有三-核苷酸重覆C、T及G，造成定序FAD2A及C位點可觀察到單一鹼基缺失增加。

圖8：顯示pDAS000130之質體圖譜。

圖9：顯示pDAS000271之質體圖譜。

圖10：顯示pDAS000272之質體圖譜。

圖11：顯示pDAS000273之質體圖譜。

圖12：顯示pDAS000274之質體圖譜。

圖13：顯示pDAS000275之質體圖譜。

圖14：顯示pDAS000031之質體圖譜。

圖15：顯示pDAS000036之質體圖譜。

圖16：顯示pDAS000037之質體圖譜。

圖17：說明在該植物細胞基因體中於該ETIP位之一ETIP及負載(payload)核酸之配置，以及該標定負載(payload)之產物。

圖18：說明原生質體細胞之轉形之後藉FACS篩選宿主株之該ETIP之標定負載(payload)DNA，使用在3’及5’二端重新建構截頭式(truncated)可評價及可擇之標記。

圖19A-B：說明該ETIP油菜品件之同源重組修復，其肇因於該基因體位點之雙鏈DNA剪切，藉該鋅指核酸酶(pDAS000074或pDAS000075)及該Ds-red 供體(pDAS000068、pDAS000070或pDAS000072)接著整合到該油菜染色體之ETIP位點。該供體整合到該基因體位點導致完全功能性、高度表現之Ds-red 轉殖基因。

圖20：顯示該FACS分選油菜原生質體及油菜原生質體之經計算之轉染效率，其係經以pDAS000031(‘pDAS31’)轉染。此外，該FACS分選導致未被轉染之油菜原生質體被當作負控制。

圖21：顯示該FACS分選油菜原生質體及油菜原生質體品件之經計算之轉染效率，其係經以pDAS000064/pDAS000074(上圖)及pDAS000064/pDAS000075(下圖)轉染。

圖22：顯示該FACS分選油菜原生質體及油菜原生質體品件之經計算之轉染效率，其係經以 pDAS000068/pDAS000074(上圖)及pDAS000068/pDAS000075(下圖)轉染。

圖23：顯示該FACS分選油菜原生質體及油菜原生質體品件之經計算之轉染效率，其係經以pDAS000070/pDAS000074(上圖)及pDAS000070/pDAS000075(下圖)轉染。

圖24：顯示該FACS分選油菜原生質體及油菜原生質體品件之經計算之轉染效率，其係經以pDAS000072/pDAS000074(上圖)及pDAS000072/pDAS000075(下圖)轉染。

圖25：顯示pDAS000074之質體圖譜。

圖26：顯示pDAS000075之質體圖譜。

圖27：顯示pDAS000064之質體圖譜。

圖28：顯示pDAS000068之質體圖譜。

圖29：顯示pDAS000070之質體圖譜。

圖30：顯示pDAS000072之質體圖譜。

圖31：係一示意圖，顯示用於轉殖基因複製份數評估試驗之轉殖基因目標引子之結合位及探針。

圖32：顯示一Sequencher檔案，其顯示FAD2A ZFN DNA辨識域(bc12075_Fad2a-r272a2及bc12075_Fad2a-278a2)，以及ZFN特異引子之結合位(FAD2A.UnE.F1及FAD2A.UnE.R1)及內源性引子(FAD2A/2C.RB.UnE.F1及FAD2A/2C.RB.UnE.R1)。

圖33：顯示一示意圖，其顯示內源性及轉殖 基因目標引子之結合位，其被使用於藉完整HDR於FAD2A之偵測轉殖基因整合。

圖34：Is一示意圖，其顯示其中Kpn1限制性核酸內切酶位將出現在完整編輯之FAD2A位中，且其中FAD2a 5’、hph 及FAD2A 3’南方探針結合。

圖35：顯示複製份數評估qPCR之代表性資料輸出。左列表示由一已知之T₀ 基因轉殖植物獲得的資料，藉單一隨機轉殖基因插入且被用作為校準樣品，其中所有其他的樣品皆被‘標準化’。右列係一已知之有5個轉殖基因整合之T₀ 基因轉殖植物。二個植物之插入複製份數係使用南方分析來決定。其餘列提供對潛在基因轉殖植物之複製份數評估。該等列被由左至右標示為：1複製控制、310420、311819、311821、311822、311823、311824、311827、312524、312525、312526、312527、312529、312530、312532、313810、313811、313905、313941、313942、313944及5複製控制。該等列被使用來決定對各基因轉殖植物之評估複製份數。當使用軟體來評估複製份數，野生種植物、非轉形控制植物及只有質體之控制不會有複製份數，因為他們不具有對hph 及HMG I/Y 二標的之Cq。

圖36：顯示pDAB105855之質體圖譜，其含有標的DNA序列，其包括T-DNA邊緣之間的RB7 MAR序列/eZFN4結合位v1、OsUbi3啟動子/Phi YFP/ZmPer5 3'UTR v2/eZFN1結合位/ELP1 HR2 v2、ZmUbi1啟動子v8/Cry34Ab1 v2/StPinII 3' UTR v2、TaPer啟動子 v3/Cry35Ab1 v5/StPinII 3' UTR v2、SCBVv2/AAD-1v3/ZmLip3' UTR v1。

圖37：顯示pDAB105941之質體圖譜，其包括一ZFN1編碼序列係於玉米有內含子1之泛蛋白1啟動子(ZmUbi1啟動子v2)及ZmPer5 3'UTR v2之表現下。

圖38：顯示pDAB112366之質體圖譜，其含有稻米泛蛋白3(OsUbi3)啟動子之無啟動子內含子(rubi3內含子)，接著一殺草劑耐受性基因(草胺膦乙醯移轉酶(PAT)；及ZmLip 3'UTR。

圖39：提供一示意圖，對使用一經整合在該基因組中之ETIP位，用於標定一供體多核苷酸，其包括一基因表現卡匣。如圖中所示，若整合發生在該ETIP位點內，該供體可供轉殖基因表現。隨機整合該供體不會導致轉殖基因之表現，因為典型地沒有能驅使表現之啟動子元件。

本發明之實施態樣

本文所述係用於產生經工程處理的轉殖基因整合平台(ETIP)的方法和組成物，其包括一可標定核酸分子，該核酸分子係被穩定整合入植物細胞之基因組且供作為用於轉形之宿主之生殖質及供體核酸分子之整合。本說明書係關於植物中之植物精確轉形，基因標定，標定之基因體整合及蛋白質表現領域。於一較佳之具體實施例中，一ETIP可被隨機地或於植物基因組中被標記之位置插入，用以促進快速篩選及偵測於該ETIP基因體位置被標記(包 括5'及3'二端)之一或多個感興趣之基因(GOI)。於某些具體實施例中，特定之雙鏈斷裂可能被引入該ETIP中。於其他具體實施例中，一種用於篩選及增加(enrichment)標記分離出之細胞或原生質體的方法，之後使用所述之流式細胞儀及FACS來產生具生育力之植物。

特殊方法包含產生一在植物及其後代中具有穩定遺傳基因修飾之基因轉殖植物細胞，以及該基因轉殖植物之組成物。於特定之具體實施例中，描述一ETIP被使用在精確植物轉形系統，其中該包括一整合核酸之ETIP係被穩定整合入該宿主之生殖質。其他具體實施例係關於用於產生一基因轉殖植物細胞的方法，以使得該植物細胞基因體DNA包含至少一穩定整合之功能標記基因。於某些具體實施例中，該方法包括使用一含有一或多個標定位特異性核酸酶辨識位之可標定核酸分子，一第一標記基因之第一片段，以及一第二標記基因之第二片段。於另一具體實施例中，該供體核酸分子包括一感興趣之核苷酸序列以及在感興趣之核酸序列側翼的二個核酸序列。於另一具體實施例中該在感興趣之核酸序列側翼的二個核酸序列係第一及第二同源臂核酸序列。於其他具體實施例中該供體核酸分子被使用在轉形該植物細胞。該同源臂核酸序列可能與該ETIP區或該可標定核酸分子序列具同源性，可能與該可標定核酸分子之第一及第二標記基因的第一及第二片段具同源性。

本文亦描述用於產生基因轉殖植物之組成物 及方法，其中該供體核酸分子表現一或多個外源性核酸序列之產物(如蛋白質或RNA分子)，其被穩定整合入一植物細胞之ETIP或可標定核酸分子。於某些具體實施例中，一ETIP或該可標定核酸分子使用鋅指核酸酶結合位或一位特異性核酸酶，其包括一表現鋅指核酸酶活性之蛋白。於不同之具體實施例中一特異性核酸酶係由其他額外的標定技術如巨核酸酶(meganuclease)、TALs、RNA-引導CRISPR-Cas9 或白胺酸鏈區所組成。於特定具體實施例中，該ETIP係一可標定核酸分子，其促進候選基因之測試及該基因轉殖植物發育過程之早期發育階段的植物表現載體設計。於某些具體實施例中，一基因轉殖植物細胞包含一整合核酸分子，其具有含一或多個標定位特異性核酸酶辨識位之多核苷酸序列以及第一及第二標記基因之第一及第二片段。該標記基因片段可能無法編碼一功能標記基因表現產物。此外，該標記基因可能包括一內含子核酸序列作為一具體實施例。於其他具體實施例中，該標記基因可能包括一同源臂核酸序列。

於某些具體實施例中，該供體核酸分子之一或二或多個區缺少與植物基因體DNA(外源性)之序列同源性。於額外之具體實施例充該供體核酸分子可能包括同源臂核酸序列。該供體核酸分子之該同源臂核酸序列可能被整合入該可標定核酸分子之特異性核酸酶限制位之側翼區。於某些具體實施例中，該同源臂序列之長度可能為50bp至3kb。

於特定具體實施例中，該供體核酸分子可能包括 外源性核酸序列，其允許標定至該ETIP可標定核酸分子及於5’及3’端篩選精確地標定之品件。一外源性核酸序列之產物可包括例如一或多個基因或cDNA分子，或編碼或非編碼核苷酸序列之任何形態，以及一或多個調控基因之因子(如啟動子)。該供體核酸分子之設計允許編碼或非編碼DNA(包含但不限於可擇標記)之切除，接著選定整合供體DNA入該ETIP中。

於特定具體實施例中，該ETIP可標定核酸分子可能包含一第一標記基因之第一片段及一第二標記基因之第二片段，該供體核酸分子含有一對應於該第一標記基因之第二片段及該第二標記基因之第一片段。該第一標記基因之第一片段可能位於該可標定核酸分子的5'端，且該第二標記基因之第二片段係位於該可標定核酸分子之3'端，以使得該供體核酸分子(包括該第一標記基因之第二片段及該第二標記基因之第一片段)穩定整合到該植物細胞之基因組中產生一功能性第一標記基因及第二標記基因。於某些具體實施例中，此等標記基因可能被使用來篩選該ETIP之穩定的整合。於某些具體實施例中，適當之標記基因可能包含PMI,Xyl(A),YFP,DSR,GFP,GUS,NPTII,AAD-1,AAD-12,DGT-28,AHAS,PAT,DSM-2,HYG,BAR及螢光蛋白。於另一具體實施例中，該標記基因係一視覺上可選之標記基因，可藉由監測一細胞顏色上的變化來判斷其存在。於其他具體實施例中，該標記基因係一可擇之標記基因(如編碼一殺草劑或抗生物劑抗性之基因)，可使用一降低細 胞生長之殺草劑或抗生物劑來篩選其存在。於更一具體實施例中，該標記基因係一陽性選擇標記基因。

各種可擇標記(亦被稱為報導基因)可被併入所選擇之表現載體以允許鑑定及可擇之轉形植物(轉形物)。有許多方法可用來確認植物中可擇標記之表現，包含如DNA定序及PCR(聚合酶鏈鎖反應)、南方印漬術、RNA印漬術、免疫法，其係用於偵測一由該載體表現之蛋白(如導致草銨膦抗性的沉澱蛋白)或用於視覺觀察其他蛋白諸如編碼β-葡萄糖醛酸苷酶(GUS)之報導基因、螢光素酶、綠螢光蛋白(GFP)、黃螢光蛋白(YFP)、DsRed、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯轉移酶(CAT)、鹼性磷酸酶等(See Sambrook,et al. ,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Third Edition,Cold Spring Harbor Press,N.Y.,2001，其整體內容係被併入本文中作為參考)。

可擇之標記基因係被使用來篩選轉形細胞或組織。可擇之標記基因包含編碼抗生物劑抗性之基因，例如編碼新黴素磷酸酶II(NEO)及潮黴素磷酸轉移酶(HPT)以及賦予對殺草性化合物之抗性的基因。殺草劑抗性基因通常編碼一經修飾之對該殺草劑不敏感之標的蛋白或一在該殺草劑作用前分解或解毒植物中之該殺草劑之酵素。例如，藉由使用編碼突變標的酵素5-烯醇丙酮酸莽草酸(enolpyruvylshikimate)-3-磷酸合成酶(EPSPS)之基因來獲得對草甘膦之抗性。EPSPS之基因及突變體係已是眾所周知，且被進一步描述於下。藉由使用編碼pat 或DSM-2 之細菌的 基因、一腈酶(nitrilase )、一aad -1或一aad -12基因來獲得對草銨膦、溴苯腈及2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)之抗性，其解毒各殺草劑。

於一具體實施例中，殺草劑可抑制生長點或分生組織，包含咪唑啉或磺脲類，且已知對此等殺草劑之乙醯羥酸合成酶(AHAS)及乙醯乳酸合成酶(ALS)具抗性/耐受性的基因。草甘膦抗性基因包含突變之5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate合成酶(EPSPs)及dgt-28 基因(各藉產生重組核酸及/或各種活體內原生EPSPs基因之突變作用的形式)，aroA基因及草甘膦乙醯移轉酶(GAT)基因)。對其他膦化合物之抗性基因包含bar基因，其來自鏈黴菌物種，包含Streptomyces hygroscopicus 及Streptomyces viridichromogenes ，以及pyridinoxy或苯氧基丙酸及cyclohexones(ACCase抑制子編碼基因)。賦予對環己二酮及/或aryloxyphenoxypropanoic acid(包含Haloxyfop,Diclofop,Fenoxyprop,Fluazifop,Quizalofop)之抗性之例示性基因包含acetyl coenzyme A carboxylase(ACCase)基因--Acc1-S1,Acc1-S2及Acc1-S3。於一具體實施例中，殺草劑可抑制光合作用，包含三嗪(psbA及1s+基因)或苯甲腈(腈水解酶基因)。

一具體實施例中，可擇之標記基因包含但不限於編碼以下之基因：新黴素磷酸轉移酶II；氰化銨水合酶；天門冬胺酸激酶；二氫吡啶二羧酸(dihydrodipicolinate)合成酶；色氨酸脫羧酶；二氫吡啶二羧酸合成酶及脫敏(desensitized) 之天門冬胺酸激酶；bar基因；色氨酸脫羧酶；新黴素磷酸轉移酶(NEO)；潮黴素磷酸轉移酶(HPT或HYG)；二氫葉酸還原酶(DHFR)；phosphinothricin乙醯轉移酶；2,2-二氯丙酸脫鹵酶(dehalogenase)；acetohydroxyacid合成酶；5-enolpyruvyl-shikimate-phosphate合成酶(aroA)；鹵芳基腈水解酶(haloarylnitrilase)；乙醯-輔酶A脫羧酶；二氫喋呤(dihydropteroate)合成酶(sul I)；及32kD光合系統II多肽(psbA)。

具體實施例亦包含編碼對以下具抗性的基因：氯黴素；胺甲基葉酸(methotrexate)；潮黴素；觀黴素；溴苯腈；草甘膦；及草胺膦(phosphinothricin)。

以上所列可擇標記基因並非有意作為限制。任何報導或可擇標記基因可被包括在本發明中。

於一具體實施例中，該ETIP可標定多核苷酸分子係被整合到一基因體位點。於一實施例，該FAD2、FAD3及IPK1基因體位點可能被選為ETIP整合及後續之供體多核苷酸供體分子整合之標的。中斷該FAD2及FAD3內源性基因已被顯示不會對該植物細胞之農藝或品質特性有不利影響。因此，沒有與植物或植物產品表現(油菜、大豆、玉米等)相關之農藝或品質特性以及與特定油品質特性相關之附隨(bundling)性狀加速了基因移入，且當該FAD2及FAD3位被中斷時發現新的生殖質發育。於特定具體實施例中，該供體核苷酸序列分子可能被連接至一調控因子，例如一啟動子、內含子、5’UTR或3’UTR。

可能藉標定雙鏈剪切一特異性核酸酶來促使該供體核酸分子整合到一ETIP。該特異性核酸酶可能位於該ETIP可標定核酸分子內。此外，特異性核酸酶可能位包括一工程化降落場(ELP)之ETIP可標定核酸分子內(參見US Patent No.20110191899，併入本文作為參考)。此外，該特異性核酸酶可能位於選定之ETIP內之ELP內或接近ELP。剪切可能被標定至一ETIP，藉使用包括一融合蛋白，其包括DNA-結合域諸如一巨核酸酶(meganuclease)DNA-結合域、RNA-引導CRISPR-Cas9 DNA-結合域、 一白胺酸鏈區DNA-結合域、一TAL DNA-結合域、一鋅指蛋白(ZFP)、鋅指核酸酶或前述者之嵌合(chimeric)組合物，其被設計用以結合一選定ETIP內之經工程處理之序列。該剪切刺激了該ETIP中之負載(payload)或供體核酸外源性多核苷酸序列於或靠近該剪切位之整合。使用所揭露之方法整合供體核酸分子可藉同源依賴性及非依賴同源性機制二者進行，和藉篩選未知之可擇及/或可評價之標記來達到標定品件之選擇，該標記在標定品件中於該ETIP之3’及5’二區是有功能的。本說明書說明使用未知經工程處理之鋅指結合位及ZFNs以達成於該ETIP之選定之雙鏈斷裂。

於不同之具體實施例中，未知之經工程處理之DNA-結合域(如ZFPs、巨核酸酶(meganuclease)、白胺酸鏈區、TALs、RNA-引導CRISPR-Cas9 )結合至一ETIP之一或多個目標位，其不會存在於天然植物細胞之基因體中。該DNA-結合域可包含例如任何經工程處理之鋅指DNA結合 域，其包括該辨識螺旋，例如在U.S.Application No：12/931,096被描述者。在某些具體實施例中，本文所述之任何DNA結合域可能進一步包括一功能域，例如一剪切域或剪切半域(half-domain)。於另一具體實施例中，該剪切半域可由一第IIS型限制性核酸內切酶如Fokl 或Stsl 。該剪切域之進一步具體實施例可包括一返(homing)核酸內切酶，舉例來說，如一具有經修飾之DNA-結合域的返(homing)核酸內切酶。

本說明書之具體實施例包含使用鋅指DNA結合蛋白。一鋅指DNA結合蛋白“ZFP”(或結合域)係具有一較大蛋白之一蛋白或一域，其藉一或多個鋅指結合一序列-特異性方式之DNA，其為結合域內之胺基酸序列區，該結合域之結構係藉一鋅離子之配位來穩定。術語鋅指DNA結合蛋白常被簡寫為鋅指蛋白或ZFP。鋅指結合域可能"經工程處理"用以結合一預定之核苷酸序列。非限制性實施例之用於工程處理鋅指蛋白之方法係係設計及篩選。一經設計之鋅指蛋白係一不存在自然中之蛋白，其設計/組成結果主要來自理論標準。用於設計之理論標準包含實施取代規則及電腦演算法以供處理ZFP設計及結合位於資料庫儲存資訊中之資訊。參見例如U.S.Patents 6,140,081；6,453,242；6,534,261；及6,785,613；see,also WO 98153058；WO 98153059；WO 98153060；WO 021016536及WO 031016496；及U.S.Patents 6,746,838；6,866,997；及7,030,215。

於本說明書之特定具體實施例中，一鋅指核酸酶 (ZFN)可被使用。一ZFN可為任何可依本說明書被傳遞至植物細胞之鋅指核酸酶。例如，ZFN可能包括融合蛋白，其包括一剪切域(或一剪切半域)及一鋅指結合域、編碼此等蛋白之多核苷酸及多肽及編碼多肽之多核苷酸的組合。一鋅指結合域可能包括一或多個鋅指(如2、3、4、5、6、7、8、9或更多鋅指)，且可能為經工程處理以結合任何感興趣之區。因此，藉辨識希望剪切或重組之標的感興趣區，可能會依本文所述方法建構一或多個融合蛋白，其包括一剪切域(或剪切半域)及一經工程處理以辨識感興趣區之一標的序列之鋅指域。該融合蛋白(或該等蛋白)於細胞中之存在將導致該融合蛋白結合到其(其等)結合位及在感興趣區中或鄰近處剪切。此外，若一外源性多核苷酸對該感興趣區之同源性亦在一細胞中存在，該細胞之同源重組在該雙鏈斷裂核苷酸序列及該外源性多核苷酸之間的發生率高。於本說明書之目的，"同源重組"係指發生之該交換的特殊形式，例如，藉同源重組修復機制修補細胞之雙鏈斷裂。此方法需要核苷酸序列同源性，使用"供體"分子以模板修補一"標的"分子(即遭遇該雙鏈斷裂者)，以及各種已知為"非交叉(non-crossover)基因轉換"或"短序列(tract)基因轉換"，因為其造成基因資訊由該供體轉移至該標的。在不希望受任何特定原理約束下，該轉移可包括失配校正異源雙鏈(heteroduplex)DNA，其於該斷裂之標的及該供體之間形成，及/或"合成-依賴性鏈合"，其中該供體係被使用來重新合成將成為該標的之一部分的基因資訊，及/或相關製程。該特 殊性之同源重組通常導致該標的分子之序列改變，以致使該供體多核苷酸之部分或所有序列被併入該標的多核苷酸。

本說明書之方法中，本文描述之一或多個標定之特異性核酸酶製造了該標的序列(e.g., 細胞染色質)於一預定位之雙鏈斷裂，以及一具有該斷裂區之核苷酸序列之同源性的“供體”多核苷酸可被導入該細胞中。該雙鏈斷裂的存在被顯示促進整合該供體序列。該供體序列可被物理地整合或替代性地該供體多核苷酸被使用作為模板用於藉同源重組修補該斷裂，導致導入部分或全部之該該供體之核苷酸序列至該細胞染色質。因此，一細胞染色質之第一序列可被改變且於某些具體實施例中可被轉換成一存在於供體多核苷酸之序列。因此，所用之術語“取代(replace)”或“替代(replacement)”可被理解為表示以其他取代一核苷酸序列(即，替代一訊息意義(sense)之序列)，且不必然需要以其他來物理或化學替代一多核苷酸。

於某些具體實施例中，位特異性整合可藉使用能辨識及結合特定核苷酸序列之因子來達成，例如在宿主生物體之基因組。例如，許多蛋白包括能辨識及以位特異性方式結合DNA之多肽域。一被DNA-結合多肽辨識之DNA序列會被指為一“標的”序列。能辨識及以位特異性方式結合DNA之多肽域通常會正確折疊且獨立地作用以位特異性方式結合DNA，即便是表現在其域原本就被隔離(isolated)之蛋白以外之一多肽中。相似地，用於以DNA-結 合多肽辨識及結合之標的序列通常能被該多肽辨識及結合，即便是存在於大的DNA結構(例如一染色體)，特別是當該標的序列所位之位係已知可被可溶性細胞蛋白接近的(例如基因)。

當DNA-結合多肽被自然存在之典型結合至分離(discrete)之核苷酸序列或模體(motif)(例如共通辨識序列)的蛋白辨認，該技術領域中存在且已知用於修飾許多DNA-結合多肽以辨識不同之核苷酸序列或模體的方法。DNA-結合多肽包含例如但不限於：鋅指DNA-結合域；白胺酸鏈區；UPA DNA-結合域；GAL4；TAL；LexA；RNA-引導CRISPR-Cas9 ；一Tet抑制子；LacR；及一類固醇激素受體。

於某些實施例，一DNA-結合多肽係一鋅指。個別之鋅指模體可被設計用於特定地標定及結合至任何大範圍之DNA位。典範之Cys₂ His₂ (以及非典範之Cys₃ His)鋅指多肽結合DNA，藉插入一α-螺旋至該標的DNA雙股螺旋之主溝槽(major groove)。以鋅指辨識DNA係模組化；各指接觸該標的之首三個連續鹼基對，該多肽之少數關鍵殘基進行辨識。藉一標定核酸內切酶中包含多個鋅指DNA-結合域，該標定核酸內切酶之DNA-結合特異性被進一步增加(於是任何藉此所賦予之基因調控功效之特異性亦被增加)。See ,e.g. ,Urnovet al. (2005)Nature 435：646-51。因此一或多個鋅指DNA-結合多肽可被工程處理及使用，以使得一被導入一宿主細胞之標定核酸內切酶與一該宿主細胞基因 組中特殊之DNA序列互相作用。

較佳的，該鋅指蛋白係非自然存在，其係經工程處理以結合一選擇之標的位。參見例如Beerli et al.(2002)Nature Biotechnol.20：135-141；Pabo et al.(2001)Ann.Rev.Biochem.70：313-340；Isalan et al.(2001)Nature Biotechnol.19：656-660；Segal et al.(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12：632-637；Choo et al.(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10：411-416；U.S.Patent Nos.6,453,242；6,534,261；6,599,692；6,503,717；6,689,558；7,030,215；6,794,136；7,067,317；7,262,054；7,070,934；7,361,635；7,253,273；and U.S.Patent Publication Nos.2005/0064474；2007/0218528；2005/0267061，其等整體被併入本文作為參考。

經工程處理之鋅指結合域可具有相較於自然存在之鋅指蛋白為未知之結合特異性。工程方法包含但不限於理論設計及各種選擇型。理論設計包含如使用包括三聯體(或四聯體)核苷酸序列及個別之鋅指胺基酸序列的資料庫，其中各三聯體或四聯體核苷酸序列係與鋅指之一或多個胺基酸序列相關，其結合至該特定之三聯體或四聯體序列。See,for example,co-owned U.S.Patents 6,453,242 and 6,534,261，其等整體被併入本文作為參考。

例示性選擇方法包含噬菌體展示技術及雙雜合系統，揭露在US Patents 5,789,538；5,925,523；6,007,988；6,013,453；6,410,248；6,140,466；6,200,759；及6,242,568；以及WO 98/37186；WO 98/53057；WO 00/27878； WO 01/88197及GB 2,338,237。此外，鋅指結合域之結合特異性之提升被描述在例如共有之WO 02/077227。

此外，如此等或其他文獻所揭露，可使用任何適當之連接子序列將鋅指域及/或多指(multi-fingered)鋅指蛋白連接在一起，包含如5或多個胺基酸長度之連接子。See,also,U.S.Patent Nos.6,479,626；6,903,185；及7,153,949例示之6或多個胺基酸長度之連接子序列。本文所述之該蛋白可能包含在蛋白之個別鋅指之間任何適當連接子之組合。

選擇目標位；用於設計及建構融合蛋白(及編碼相同之多核苷酸)之ZFPs及方法係為該領域之技術人員已知且被詳細描述在U.S.Patent Nos.6,140,0815；789,538；6,453,242；6,534,261；5,925,523；6,007,988；6,013,453；6,200,759；WO 95/19431；WO 96/06166；WO 98/53057；WO 98/54311；WO 00/27878；WO 01/60970；WO 01/88197；WO 02/099084；WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536及WO 03/016496。

此外，如此等及其他文獻所揭露，可使用任何適當之連接子序列將鋅指域及/或多指鋅指蛋白連接在一起，包含如5或多個胺基酸長度之連接子。參見如U.S.Patent Nos.6,479,626；6,903,185；及7,153,949例示之6或多個胺基酸長度之連接子序列。本文所述之該蛋白可能包含在蛋白之個別鋅指之間任何適當連接子之組合。

於某些實施例中，一DNA-結合多肽係一 GAL4之DNA-結合域。GAL4係啤酒酵母菌之模組化轉活化子，但其亦操控許多其他生物之轉活化子。參見例如Sadowskiet al. (1988)Nature 335：563-4。於此調控系統，編碼該啤酒酵母菌之半乳糖代謝途徑之酵素的基因表現係藉可用之碳源嚴格調控。Johnston(1987)Microbiol.Rev.51：458-76。藉該正調控蛋白之交互作用、GAL4及一GAL4特異性結合之17bp對稱DNA序列(UAS)之間的交互作用進行此等代謝酵素之轉錄控制。

原生之GAL4包括881胺基酸殘基，分子量99kDa。GAL4包括功能自主域，其結合之活性導致GAL4活體內之活性。Ma and Ptashne(1987)Cell 48：847-53)；Brent and Ptashne(1985)Cell 43(3 Pt 2)：729-36。GAL4之N端65胺基酸包括該GAL4 DNA-結合域。Keeganet al. (1986)Science 231：699-704；Johnston(1987)Nature 328：353-5。序列-特異性結合需要存在於DNA結合域之配位有6個Cys殘基之二價陽離子存在。藉直接接觸該DNA螺旋之主溝槽於17bp UAS之各端使該含有配位陽離子之域與保留之CCG三聯體交互作用或辨識該三聯體。Marmorsteinet al. (1992)Nature 356：408-14。該DNA-結合功能of the蛋白定位鄰近啟動子之C-端轉錄活化域，以使得該活化域可直接轉錄。

可能被使用於某些具體實施例之額外DNA-結合多肽包含例如但不限於：一結合序列，來自AVRBS3-誘導基因；一致之結合序列，來自經工程處理之AVRBS3-誘導基因或合成結合序列(如UPA DNA-結合域)；TAL；LexA(參 見如Brent & Ptashne(1985),supra )；LacR(see ,e.g. ,Labowet al. (1990)Mol.Cell.Biol.10：3343-56；Baimet al. (1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(12)：5072-6)；一類固醇激素受體(Elllistonet al. (1990)J.Biol.Chem.265：11517-121)；該Tet抑制子(U.S.Patent 6,271,341)及結合至存在之tet 操作子序列的一突變之Tet抑制，但不意謂沒有四環素(Tc)；NF-κB之DNA-結合域；及被描述在Wanget al. (1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(17)：8180-4之調控系統之組件，其使用GAL4、激素及VP16之融合。

於某些具體實施例中，被使用在本文所述之方法及組成物中之該一或多個核酸酶之DNA-結合域包括一自然存在或經工程處理(非自然存在)之TAL效應DNA結合域。參見如U.S.Patent Publication No.20110301073，其等整體被併入本文作為參考。已知植物病菌黃單胞菌屬(Xanthomonas)會造成重要作物植物之多種疾病。黃單胞菌屬之致病性係取決於保留之第III型分泌(T3S)系統，其注入多於25種不同效應蛋白至該植物細胞中。這些被注入的蛋白為轉錄類活化子(TAL)效應因子，其模擬植物轉錄活化子及操縱植物轉錄組(參見Kay et al(2007)Science 318：648-651)。此等蛋白包含一DNA結合域及一轉錄活化域。最特徵化之TAL-效應因子之一者為來自Xanthomonas campestgris pv.Vesicatoria)之AvrBs3(see Bonas et al(1989)Mol Gen Genet 218：127-136及WO2010079430)。TAL-效應因子包含一銜接重覆之集中域，各重覆包含約34個對此等 蛋白之DNA結合特異性很關鍵之胺基酸。此外，他們含有一核定位序列及一酸性轉錄化合域(評論請參Schornack S,et al(2006)J Plant Physiol 163(3)：256-272)。此外，在該植物病原菌Ralstonia solanacearum之二基因中，特定之brg11及hpx17被發現其與R.solanacearum biovar 1品系GMI1000及biovar 4品系RS1000之AvrBs3群黃單胞菌屬同源(參見Heuer et al(2007)Appl and Envir Micro 73(13)：4379-4384)。此等基因彼此間有98.9%核苷酸序列一致性，但不同在該hpx17重複域中有一1,575bp之缺失。但是，二種基因產物皆與黃單胞菌屬之AvrBs3群蛋白具有少於40%序列一致性。參見如U.S.Patent Nos.,8,420,782及8,440,431及U.S.Patent Publication No.20110301073。

於其他具體實施例中，該核酸酶包括一CRISPR/Cas系統。該編碼RNA系統構件之CRISPR(規律成簇間隔短回文重覆序列)位點及該編碼蛋白之cas(CRISPR-相關)位點(Jansenet al. ,2002.Mol.Microbiol. 43：1565-1575；Makarovaet al. ,2002.Nucleic acids Res. 30：482-496；Makarovaet al. ,2006.Biol.Direct 1：7；Haftet al. ,2005.PLoS Comput.Biol. 1：e60)組成該CRISPR/Cas核酸系統之基因序列。微生物宿主CRISPRx位點包含一CRISPR-相關(Cas)基因以及能設計CRISPR-導引之核酸剪切之特異性的非編碼RNA因子之組合。

該第II型CRISPR係最充分表徵的系統之一，及在4個連續步驟中完成標定之DNA雙鏈斷裂。第一，二個非編 碼RNA(該前體-crRNA系列及tracrRNA)係由CRISPR位點轉錄。第二，tracrRNA與前體-crRNA重覆區雜交且導致前體-crRNA加工成為含有個別間隔之(spacer)序列之成熟crRNAs。第三，該成熟crRNA：tracrRNA複合體使Cas9導向該標的DNA，藉由Wastson-Crick鹼基配對該crRNA之間隔及該標的DNA之在前間(protospacer)鄰近模體(PAM)旁邊的前間，此係一額外之標的辨識要求。最後，Cas9中介(mediates)剪切標的DNA以製造該前間中之雙鏈斷裂。該CRISPR/Cas系統活性包括3步驟：(i)將外來(alien)DNA序列插入至該CRISPR系列中以避免未來的攻擊(attacks)，稱為‘改編(adaptation)’的製程，(ii)表現該相關蛋白，及表現及加工該系列，然後是(iii)具該外來核酸之RNA-導引之干擾(interference)。因此，於該細菌細胞中，數種被稱為‘Cas’蛋白者係與該CRISPR/Cas細統之自然功能相涉，並擔任具功能之角色例如插入外來DNA等。

於某些具體實施例，Cas蛋白可能為一自然存在之Cas蛋白之"功能性衍生物"。一原生之序列多肽的"功能性衍生物"係一與一原生序列多肽同樣具有定性之生物學特性的化合物。"功能性衍生物"包含但不限於一原生序列之片段及一原生序列多肽之衍生物及其片段，前提是他們與對應之原生序列多肽具有相同之生物活性。本文預期之生物活性係該功能性衍生物水解DNA物質成為片段之能力。術語"衍生物"包括多肽之胺基酸序列變體、共價修飾及其之融合。適當之Cas多肽衍生物或其片段包含但不限於Cas 蛋白之突變、融合、共價修飾或其片段。Cas蛋白，其包含Cas蛋白或其片段，以及Cas蛋白衍生物及其片段，可由一細胞或化學合成或藉該二製程之組合來獲得。該細胞可為一會自然產生Cas蛋白之細胞，或一會自然產生Cas蛋白之細胞及經遺傳工程處理以產生高表現程度之內源性Cas蛋白或以產生自外源性導入核酸之Cas蛋白，其中該核酸編碼相同或不同之內源性Cas。於某些情況，該細胞不自然產生Cas蛋白，且經遺傳工程處理以產生Cas蛋白。

於一特定具體實施例，其中至少二雙鏈斷裂係被製造，修補該雙鏈斷裂可能包括去除該介於雙鏈斷裂之物質，及重接該核苷酸序列之末端以割除該雙鏈斷裂之間的序列。於具體實施例中，該經割除之序列可能(非限制)包括編碼所有或一部分之核苷酸序列的序列，該核苷酸序列編碼一高度、更高度、極高度或最高度表現之蛋白。於更一具體實施例中該經割除之序列可能(非限制)包括調控序列，其影響高度、更高度、極高度或最高度表現蛋白之表現。於該具體實施例中，該高度、更高度、極高度或最高度表現蛋白之表現係相對於剪切前之表現程度降低。

於另外之具體實施例中，其中至少二雙鏈斷裂係被製造，修補該雙鏈斷裂可能包括去除該介於雙鏈斷裂之物質，以供體序列取代之，以置換該介於雙鏈斷裂之間帶有該供體序列的序列。於其他具體實施例中，該經去除之序列可能(非限制)包括編碼所有或一部分之核苷酸序列的序列，該核苷酸序列編碼高度、更高度、極高度或最高度 表現之蛋白。於更一具體實施例中該經去除之序列可能(非限制)包括調控序列，其影響高度、更高度、極高度或最高度表現蛋白之表現。於該具體實施例中，該高度、更高度、極高度或最高度表現蛋白之表現係相對於剪切前之表現程度降低。

於具體實施例中，其中一雙鏈斷裂係被製造，修補該雙鏈斷裂可能包括將供體序列插入或至跨過(across)該雙鏈斷裂。於某些具體實施例中，該供體序列可能被插入至高度、更高度、極高度或最高度表現之蛋白的編碼序列。於具體實施例中，該插入序列可能中斷高度、更高度、極高度或最高度表現蛋白之編碼序列之轉錄，經由(以非限制例之方式)同讀碼框(in-frame)終止密碼子之存在。於更一具體實施例中，該供體可能(非限制)中斷調控序列之功能，該調控序列影響高度、更高度、極高度或最高度表現蛋白之表現。於具體實施例中，該高度、更高度、極高度或最高度表現蛋白之表現係相對於剪切前之表現程度降低。

於又一具體實施例，該供體序列可能編碼一感興趣之蛋白。於更一具體實施例中，該來自該供體序列之感興趣之蛋白的表現可能被控制、被調控或操作性連接至存在於該供體序列之調控序列及/或存在於該供體序列所插入之該序列之調控序列。於額外之具體實施例中，編碼感興趣之蛋白之核酸序列可能被提供給與該供體序列隔開或結合之細胞。於某些具體實施例中，該供體序列可能被包含於與編碼感興趣之蛋白的序列相同之核酸分子。

於其他具體實施例，該編碼高度、更高度、極高度或最高度表現蛋白之核苷酸序列，可能位於(非限制例方式)基因體、質體、黏質體(cosmid)、人工染色體、游離基因組、或其他細胞之核苷酸結構中。

於某一面向，本文描述雙鏈之供體多核苷酸，用於在活體內剪切該供體之後整合一選擇之內源性位點，使用至少一核酸酶。該供體核苷酸包含一被整合到該內源性位點之外源性序列(轉殖基因)，並包含至少一核酸酶標的位。該供體核苷酸可包含轉殖基因序列側翼之同源區(如同源臂)。存在於該供體序列之染色體同源性可在該核酸酶結合位中。於某些具體實施例中，其中該核酸酶被使用來剪切該供體，該核酸酶與使用來剪切該染色體之核酸酶並不相同，且可能該染色體與該供體序列之間不具同源性。於其他具體實施例中，該供體分子係被整合到內源性位點，經由非依賴同源性機制(如NHEJ)。於其他具體實施例，該雙鏈供體包括至少1kb長之轉殖基因，且該轉殖基因之核酸酶目標位3’及/或5’可供活體內剪切。該供體分子可能例如是一質體。於某些具體實施例，該供體在核酸酶-介導該內源性位點剪切之後被整合。於任何核酸酶-介導之該供體分子之整合，該使用來剪切該供體之核酸酶之一或多者可與使用來剪切該內源性位點之核酸酶之一或多者相同。可擇地，使用來剪切該供體之核酸酶之一或多者可與使用來剪切該內源性位點之核酸酶之一或多者不同。

於某些具體實施例，該供體分子係被包含在一質 體上。該供體可能在核酸酶-介導剪切之後被整合，其中以至少二核酸酶剪切位而使該供體位在該質體之側翼。於某些具體實施例，該供體質體中之該核酸酶剪切位序列係與該含有將標定之ETIP之染色體位點中之該核酸酶剪切位序列相同。於其他具體實施例，位在含供體之質體上該供體側翼之核酸酶剪切位係與該染色體之ETIP之剪切位不同。於額外之具體實施例，含供體之質體中在該供體側翼之核酸酶剪切位可能不相同，也可能與與該染色體之核酸酶剪切位相異。於更一具體實施例，該供體可能被包含在一質體上，側翼有至少二個核酸酶剪切位，且可能被整合一缺失至該染色體之ETIP，以二核酸酶之作用來製造。於該具體實施例，質體上該供體側翼之核酸酶剪切位及該染色體之ETIP之核酸酶剪切位可能相同或不同。於其他具體實施例，該供體係一僅含有單一核酸酶剪切位之質體，且該染色體之ETIP之核酸酶剪切位可能相同或不同。

該供體分子之感興趣序列可能包括一或多個編碼功能性多肽之序列(如cDNA)，有或沒有啟動子。於某些具體實施例，該核酸序列包括一序列，其編碼抗體、抗原、酵素、生長因子、受體(細胞表面或核)、激素、淋巴素、細胞素、報導子、任何以上之功能性片段其以上之組合。於具體實施例，其中該功能性多肽編碼序列沒有啟動子，接著以轉錄確認該整合序列之表現，以感興趣之區中之內源性啟動子或其他控制因子驅動。於其他具體實施例，串接之卡匣可以此方法整合到該選定位，該第一組件包含上述 之無啟動子序列之卡匣，接著是一轉錄終止子序列，及一編碼自主表現卡匣之第二序列。額外之序列(編碼或非編碼序列)可被包含在該同源臂間之該供體分子。於額外之實施例，該供體核酸包括編碼功能性RNAs(例如miRNAs或shRNAs)之序列。

所述之標定剪切之方法及組成物可被使用來誘導基因體序列之突變體。標定剪切也可被使用來製造基因剃除(knock-out)或基因弱化(knock-down)(如功能性基因體或標的驗證)及用來促進標定之插入序列至基因組中(即序列敲入(knock-in))。插入可藉由取代染色體序列(經以非限制例之方式)同源重組或藉標定整合，其中新序列(即，一序列不存在於感興趣之區)被插入在一預定之目標位。於某些實施例，該新序列之側翼是與染色體感興趣之區具序列同源性者。相同方法可被使用來取代具突變序列之野生型序列或用來將一對偶基因變換成不同對偶基因。

所述之標定重組產生感興趣之蛋白的方法可被使用來取代任何具非相同序列之基因體序列。例如，一突變基因體序列可被其野生型對應體代取，藉此提供用來處理植物疾病之方法；提供植物對病原體之抗性；增加作用收穫等。以類似方法，一基因之對偶基因可被一不同之對偶基因取代，使用本文所述標定重組之方法。

於許多此種情況下，感興趣之區包括一突變，且該供體多核苷酸包括對應之野生型序列。相似地，若希望的話，一野生型基因體序列可被一突變序列取代。例如， 過度表現一致癌基因可被反轉，藉突變該基因或以支持(support)一較低、非致病性程度表現之序列來取代其控制序列。確實任何取決於特定基因體序列之病理(以任何方式)可被矯正或緩解，使用本文所述之方法。

標定之剪切、插入、切除及/或重組可被使用來改變非編碼序列(如調控序列諸如啟動子、加強子、起始子、終止子、剪接位(splice site))用以改變基因產物表現程度。該方法可被使用例如在治療目的、功能性基因體及/或標的驗證研究。

標定修飾染色質結構可被使用來促進將融合蛋白結合至細胞染色質。於額外之實施例，介於鋅指結合域及重組酶(recombinase)(或其功能性片段)之間的一或多個融合可在本文所述之鋅指-剪切域融合以外或代替其被使用，用來促進標定之重組。參見例如共有之US patent No.6,534,261 and Akopian et al.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：8688-8691。於額外之實施例，所述方法及組成物被用來提供ZFP結合域與其活性之需要二聚(同質二聚體或異質二聚體)之轉錄活化或抑制域之融合。於此情況，一融合多肽包括一功能域單體之鋅指結合域(如二聚轉錄活洞或表現域)。結合該二種融合多肽以正確地定位目標位允許二聚作用，以重建一功能性轉錄活化或抑制域。

此外，如上述，本文所列之方法或組成物可被使用來標定整合外源性序列至細胞之基因組之感興趣之區，例如其中剪切藉同源依賴性機制增進插入(如插入供體序 列，其包括外源性序列連同一或多個相同或同源但不相同之序列，具預定之基因體序列(即目標位)。

該供體序列於外源性序列側翼區包含充足同源性，以支持同源重組修復(HDR)基因體序列之雙鏈斷裂，藉此在基因體目標位插入該外源性序列。因此，該供體核酸可以為之足以支持整合該外源性序列之任何大小，藉依賴同源性之修復機制(如同源重組)。不希望被任何特定原理拘束，外源性序列側翼之該同源區被認為提供破裂之染色體末端雙鏈斷裂位之基因資訊重新合成的模板。於某些具體實施例，二個相同序列或二個同源但不相同之序列(或其一)係存在於外源性序列側翼。外源性序列(或外源性核酸或外源性多核苷酸)含有感興趣之區不會出現之核苷酸序列。

已知一帶有受誘導啟動子及其對應之辨識序列控制之ZFN基因之構建體可被穩定整合到阿拉伯芥，且被顯示導入標定之產生自辨識位非同源端接合的突變體。例如，International Patent Publication No.WO/2008/021207描述藉ZFN-導引之同源重組精確插入轉殖基因之方法。相反地，其中該ZFN蛋白可在該標的生物體之外表現及純化，然後遞送到目標植物中，藉非同源端接合(NHEJ)誘導手術(surgically)特定突變/基因剃除。因此，本說明書可產生一非轉殖基因之遺傳修飾植物，其將繞過基因轉殖作物之限制，且標定基因之編輯將可能不需要轉殖基因方法。

標定之基因添加(addition)係典型地藉轉染可擇之標記基因來進行，該可擇之標記基因側翼是大量與該標 的位同源之DNA。可能由停滯(stalled)DNA複製叉在該標的位形成自發性雙鏈斷裂(DSBs)。當以該姊妹染色體作為模板之同源重組修復(HDR)無誤地正常修復，HDR可改用該同源性供體DNA以治癒斷裂。當一額外之DNA序列被插入在該供體質體之二同源區之間，該細胞DNA修補工具(machinery)無意地複製此基因資訊至該染色體中。因為此基於同源(homology-based)之標定依賴於非常少之於供體同源區內之DSBs的抓取，需要於實用之頻率對該標的位點之廣泛同源性來獲得標定之整合。

於另一具體實施例，相似的基因添加(addition)能力可藉NHEJ提供給缺乏有效基於同源(homology-based)DNA修補的細胞型。此種方法可能證明初級、非分裂細胞之基因添加(addition)特定實用性，其優先使用該NHEJ DNA修補途徑。藉NHEJ之基因添加(addition)也可對未被定序之基因組(如不具有需要辛勞初級選殖及定序之基因組序列的供體建構體)有用。可以理解的是，非特異性DNA可在NHEJ-導引之修復位被抓取。於一特定具體實施例，由ZFN剪切製造之該存在於單鏈懸垂部分(overhang)的資訊可被使用來執行標定之DNA整合，使用該NHEJ DNA修補工具(machinery)。

於其他具體實施例，可藉NHEJ及同源重組修復之二種有效基於同源(homology-based)DNA修補提供基因添加(addition)能力。於該具體實施例，一供體序列之一端藉NHEJ被整合在一染色體之標的中，該供體序列之另一端 藉同源重組修復被整合一染色體之標的中。

某些具體實施例包含用於產生一供體或負載(payload)DNA之方法，該方法表現一外源性核酸序列之一或多個產物(即，一蛋白或一RNA分子)，該產物被穩定整合到一植物細胞細胞之ETIP(圖17)。

本說明書之另一具體實施例包含整合標記基因及隨後表現該被併入該ETIP可標定核酸分子之標記蛋白。於某些具體實施例，用於篩選ETIP位點中之標定供體DNA的方法使用細胞分選及篩選被併入該ETIP之5’及3’之標記基因之表現(圖18)。該ETIP於或接近該FAD2、FAD3或IPK2位點之整合，或植物基因組中隨機位置之ETIP整合，似乎不會損害該宿主植物再生、開花、產生種子的能力，且使其能夠隨後篩選、再生及遺傳傳遞該供體多核苷酸分子所傳遞之外源性核酸序列產物，其跨代(over generations)標定該ETIP。

此外，該ETIP可被使用來降低需要以傳統品件基因移入實驗產生之基因轉殖品件數，因為該基因候選及植物表現載體設計係被整合在相同之內源性植物基因組位置中。該ETIP技術可配置在所有植物物種中，包含作物及模式物種，其包括：玉米、大豆、稻米、油菜、小麥、大麥、向日葵、番茄、阿拉伯芥、棉花、馬鈴薯、高粱、牧草、芸苔屬物種(包含但不限於B.napus、B.rapa、B.oleracea、B.nigra、B.juncea、B.carrinata)、甘蔗甜菜、短柄草(Brachypodium)及紫花苜蓿(alfalfa))。

一特定之具體實施例包含使用本文所述方法所產生之基因轉殖植物或基因轉殖植物細胞。具體地，於一具體實施例，一基因轉殖植物細胞包含一具有含有至少一可標定核酸分子之核苷酸序列(其可為基因體)的核酸分子，其中該可標定核酸分子包括至少一標記基因之特異性核酸酶辨識位及一片段，其中該片段不會編碼一功能性標記基因表現產物。該可標定核酸分子之特定具體實施例可能包含一第一標記基因之第一片段及一第二標記基因之第二片段。該可標定核酸分子之其他具體實施例可能包含一或多個基因表現卡匣。於更一具體實施例，該第一及第二片段可在該特異性核酸酶辨識位之側翼。

於某些具體實施例，該供體核苷酸序列可被操作上連接至一調控因子，例如啟動子、5’UTR、3’UTR、內含子或MAR。於其他具體實施例，該核苷酸序列可能包括二標記基因之片段。

該ETIP系統代表使能夠快速篩選標定之整合供體序列至植物基因組之平台技術。於某些具體實施例，該ETIP技術可被使用在植物細胞培養物以及藻類、苔蘚、真菌系統和哺乳動物細胞培養物，例如NK-1、CHO等。該ETIP系統形成用於發展不同作物物種之精確植物轉型系統之基礎，使能夠在整個性狀發育過程中進行高通量(through put)基因及建構體測試。

包括在此引用之出版物、專利和專利申請案的所有文獻中與本說明書明確細節不牴觸之範圍係被併入做為 參考，且若各文獻曾單獨且具體指明藉由引用而併入且在本文中被整體列出亦以相同範圍併入。本文所討論過的該等文獻僅是在提供於本發明提申日前之揭露。本文中之任何內容皆不應被理解為因該等先前發明而承認本發明人非為較早之揭露。

實施例

以下之實施例係被提供來說明某些特色及/或面向。此等實施例不應被解釋為將本說明書限制在所述之特定的特色或面向。

實施例1：鑑定來自細菌人工染色體庫之旁系同源(PARALOGOUS)FAD2及FAD3目標序列

建構BAC

一細菌人工染色體(BAC)庫係來自商業供應商(Amplicon Express,Pullman,WA)。該BAC庫係由110,592個BAC選殖株組成，其包含分離自Brassica napus L.var.DH10275之高分子量基因體DNA(gDNA)片段。該gDNA係經以BamHI 或HinDIII 限制酶酶切。分離之約135Kbp之gDNA片段被連接到pCC1BAC載體(Epicentre,Madison,WI)中，轉形到Escherichia coli str.DH10B(Invitrogen)中。該BAC庫係由偶數個BAC選殖株構成，其係使用二個不同限制酶建構。因此，該Hind III 建構之BAC庫係由144個單獨之384孔盤所組成。同樣地，該BamHI 建構之BAC庫係由144個單獨之384孔盤所組成。總共110,592個BAC選殖株係被分離且排列在288個單獨之384孔盤。288個單獨之 384孔盤之每一者係由供應商提供作為供快速PCR篩選之單一DNA萃取物。該獲得之BAC庫涵蓋大約15Gbp之gDNA，其對應於12-倍於Brassica napus L.var.DH10275基因組的基因組覆蓋(估計該Brassica napus L.基因組ca.1.132Gbp，如Johnstonet al. (2005)Annals of Botany 95：229-235所述)。

序列分析分離自該BAC庫之FAD2的編碼序列

該構建之BAC庫被使用來分離FAD2基因編碼序列。進行定序實驗以辨識來自Brassica napus L.var.DH10275之4個FAD2基因旁系同源之特定基因序列。

該FAD2基因序列以模式物種阿拉伯芥被初步辨識。該基因序列在Genbank被列為位點標籤：At3g12120。先前已描述介於該模式植物物種阿拉伯芥及二倍體Brassica rapa ，四倍體之Brassica napus 的祖先之一之間的比較性基因體關聯性(Schranzet al. (2006)Trends in Plant Science 11(11)：535-542)。與該FAD2基因有特殊關係，該比較性分析預測該基因之3-4複製份數將存在該二倍體Brassica 基因體中。額外之遺傳圖譜研究係由Scheffleret al. (1997)Theoretical and Applied Genetics 94；583-591進行。此等遺傳圖譜研究之結果指出FAD2基因之4複製份數存在於Brassica napus 。

定序分析該BAC庫(其係建構自B.napus L.var.DH12075)導致分離出4個BAC序列(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4)，來自決定為以下 基因之編碼序列：FAD2A(SEQ ID NO：5)，FAD2-1(SEQ ID NO：6)，FAD2-2(SEQ ID NO：7)，及FAD2-3(SEQ ID NO：8)。該FAD2A、FAD2-1、FAD2-2及FAD2-3基因序列被辨識及遺傳作圖。對該4個FAD2基因進行序列分析，使用序列比對程式及一使用辨識百分比之鄰接樹。該序列比對係藉AlignX^® 程式進行，來自Vector NTI Advance 11.0 computer程式(Life Technologies,Carlsbad,CA)且如圖1所示。AlignX^® 使用經修飾之Clustal W演算法以產生多種蛋白或核酸序列之序列比對，用於近似度比較及功能註解。該鄰接樹係以Jalview v2.3®軟體製得，如顯示在圖2(Waterhouseet al. (2009)Bioinformatics 25(9)1189-1191)。如圖2所示，該分離序列之分析指出，該FAD2A及FAD2-3序列分享高度序列相似性，同樣地FAD2-1及FAD2-2分享高度序列相似性。該4個序列可被歸類為二分支，其中FAD2A及FAD2-3包括第一分支，FAD2-1及FAD2-2包括第二分支。

其次，該新分離自Brassica napus 之FAD2序列被用於BLAST基因體庫，其分離自Brassica rapa 基因體BAC庫及Brassica oleracea 基因體槍序列讀取(reads)。Brassica rapa 及Brassica oleracea 二者皆為雙二倍體物種Brassica napus 之二倍體祖先(AC基因體，n=19)。Brassica napus 係衍生自最近的雜交品件，其介於Brassica rapa (A亞-基因組，n=10)及Brassica oleracea (C亞-基因組，n=9)。該二倍體祖先序列與使用BLASTn分析分離自Brassica napus 之4個不同之FAD2編碼序列比較。此序列分析辨識 特定、被註解之來自Brassica rapa 及Brassica oleracea 之基因序列，其與新發現之Brassica napus FAD2序列有最高序列相似度。表1列出新辨識的FAD2編碼序列及對應之祖先參考序列登錄號和來源生物。

該FAD2基因以各亞-基因組有二個複製份數存在於Brassica napus 基因組中。各基因之一複製份數係位在該A亞-基因組，同樣地各基因之一複製份數係位在該C亞-基因組。新的命名習慣指出各基因係位在哪一個亞-基因組。該4個分離自Brassica napus BAC基因體DNA庫及祖先序列資料之FAD編碼序列之間的高度序列相似度建議FAD2-3重複了來自C亞-基因組之FAD2序列，而可被重標示為FAD2C；FAD2-1重覆了來自A亞-基因組之FAD2序列，因此可被重標示為FAD2A’；最後，FAD2-2係由來自C亞-基因之FAD2序列複製之第二複製，可被重標示為FAD2C’。

序列分析分離自該BAC庫之FAD3編碼序列

該構建之BAC庫被使用來分離FAD3基因編碼序列。進行定序實驗以辨識來自Brassica napus L.var.DH10275之5個FAD3基因旁系同源之特定基因序列。

該FAD3基因序列以模式物種阿拉伯芥被初步辨識。該基因序列在Genbank被列為位點標籤：At2g29980。先前已描述介於該模式植物物種阿拉伯芥及二倍體Brassica rapa ，四倍體之Brassica napus 的祖先之一之間的比較性基因體關聯性(Schranzet al. (2006)Trends in Plant Science 11(11)：535-542)。與該FAD基因有特殊關係，該比較性分析預測該基因之3-4複製份數將存在該二倍體Brassica 基因體中。額外之遺傳圖譜研究係由Scheffler et al.(1997)Theoretical and Applied Genetics 94；583-591進行。此等遺傳圖譜研究之結果指出FAD3基因之6複製份數存在於Brassica napus 。

先前集中在來自Brassica napus 之FAD3基因在定序上的努力辨識及遺傳作圖出A及C基因組之特定複製份數(Huet al., (2006)Theoretical and Applied Genetics,113(3)：497-507)。來自種子特異性cDNA庫之EST序列之集合已於先前被建構及定序，來自植物株系DH12075，藉Andrew Sharpe of Agriculture及Agri-food Canada,107 Science Place,Saskatoon,Saskatchewan。因為無法取得來自雙單倍體油菜植物DH12075全長基因序列之ESTs集合，此外亦無法取得該序列品質及稱為核苷酸之正確可信度的指示。於是，不同之FAD基因序列讀取之間的序列變異無法被明確地歸因為各種旁系同源FAD3基因群之不同之基因複製份數或是無法取得該基因體序列。然而，當一結合序列分局與ESTs以及二個FAD3A及FAD3C全長基因序列一起 被進行(如Huet al. ,(2006)所述)，能辨識與該基因皆可配對之ESTs以及額外之3個單倍體。其結果為，總共6個特別的FAD3單倍體被辨識。在組合所有可取得之各種FAD3單倍體之資料後，確定外顯子1中有高度外顯子序列歧異度。該外顯子1中之FAD3序列之歧異度被確定為可被使用來設計基因/對偶基因特定PCR引子之機會。此外，外顯子被確定為與單倍體之間有最小歧異(如外顯子5、6、7及8具有在FAD3A及FAD3D之間不同的1-3bp)，或沒有序列差異(如外顯子2及3)。

序列分析該建構自B.napus L.var.DH12075之BAC庫導致分離出6個BAC序列(SEQ ID NO：9,SEQ ID NO：10,SEQ ID NO：11,SEQ ID NO：12,SEQ ID NO：13，及SEQ ID NO：14)，來自決定為以下基因之編碼序列：FAD3A(SEQ ID NO：15),FAD3A’(SEQ ID NO：16),FAD3A”(SEQ ID NO：17),FAD3C(SEQ ID NO：18),FAD3C”(SEQ ID NO：19),and FAD3C’(SEQ ID NO：20)。該FAD3A,FAD3A’,FAD3A”,FAD3C,FAD3C”，及FAD3C’基因序列係被確定及遺傳作圖。

該6個FAD3基因之序列分析係使用序列比對程式來進行，以及使用相似度之百分比來做鄰接樹。該序列比對藉AlignX^® 程式被製得，其來自Vector NTI Advance 11.0電腦軟體(Life Technologies,Carlsbad,CA)且顯示在圖3。AlignX^® 使用一經修飾之uses Clustal W演算法以產生蛋白或核酸序列之多種序列比對，供用於相似度比較及 功能註解。該鄰接樹係以Jalview v2.3®軟體製得且顯示在圖4。(Waterhouseet al. (2009)Bioinformatics 25(9)1189-1191)。該被確定為含有FAD3基因之重疊群(contig)係被使用在對阿拉伯芥基因資料庫使用BLASTn請求。該含有FAD3基因之6個重疊群之每一者之區藉與阿拉伯芥FAD3基因比較而被確定(Genbank Accession No：At2g29980)。然後該FAD3重疊群被導向，以使得所有FAD3基因之方向為5’至3’。FAD3重疊群被修剪以在可能之處含有多達2個上游(5’)及1個下游(3’)之阿拉伯芥基因。一經導向，該FAD3基因之該完整的編碼區域被由各重疊群萃取並被使用來產生鄰接樹以顯示不同之FAD3基因群成員之間的關係。該6個FAD3群成員係被排列成為3對FAD3基因(圖4)。

以PCR為基礎之篩選

PCR引子群係被設計來篩選前述之BAC庫。該等引子係被設計作為通用引子(會擴增所有基因群之成員)或作為基因特定引子(擴增標定之對偶基因)。該等PCR引子係被設計成為20bp長(+/- 1bp)且含有50%(+/- 8%)之G/C含量。表2及表3列出設計及合成之引子。該BAC庫之選殖株係被集中，藉聚合酶鏈鎖反應(PCR)篩選。

具不同條件之兩組(set)被使用來聚合酶鏈鎖反應。第一系列之PCR反應包含：1X PCR緩衝液(含dNTPs)；1.5mM MgCl₂ ；200μM之0.25 U Immolase® DNA聚合酶(Bioline,London,UK)；250nM之各引子；及，約5-10ng模板DNA。第二系列之PCR反應被建力用於擴增基因體DNA並包含：5-10ng基因體DNA，1X PCR緩衝液，2mM dNTPs，0.4μM前置及反置引子，及0.25 U Immolase® DNA聚合酶(Bioline,London,UK)。擴增係被集中為總量13μL及，使用MJ PTC200® thermocycler(BioRad,Hercules,CA)或ABI 9700 Gene Amp System®(Life Technologies,Carlsbad,CA)來擴增。以PCR為基礎篩選特定盤係使用四維篩選方法來進行，其係基於Bryanet al (Scottish Crops Research Institute annual report：2001-2002)所述之篩選系統以上述之PCR條件進行。在以PCR為基礎篩選被集中之BAC庫之後，使用直接Sanger定序方法來定序被擴增之PCR產物。依據BigDye® v3.1 protocol(Applied Biosystems)以乙醇、醋酸鈉及EDTA來純化該被擴增之產物，在ABI3730xl®自動化毛細電泳平台上進行電泳。

在以以PCR為基礎篩選及構形Sanger定序之後，盤之集合被確定包含有各種不同FAD2及FAD3基因群成員。總共有4個特別的FAD2及FAD3旁系同源基因序列被確定(表4及表5)。於每一FAD2及FAD3旁系同源基因序列中總共有2盤被選擇進行盤篩選以辨識盤中含FAD2及FAD3基因之特定孔及選殖株(表4及表5)。確定該二盤之特定孔，且選定各FAD2及FAD3基因群成員之個別選殖株。

各經辨識之FAD基因群成員之單一選殖株係藉定序進一步分析。分離DNA以得到BAC選殖株並被製備以依製造商指示使用Large construct kit®(Qiagen,Valencia,CA)進行定序。依製造商指示使用GS-FLX Titanium Technology®(Roche,Indianapolis,IN)萃取出來的BAC DNA係被製備用於定序。使用物理分段之GS-FLX TI Pico-titer plate®來進行定序反應，利用成對集中之BACs以得到最佳資料。BACs係成對結合，其中FAD2基因係與FAD3 基因配對。所有產生之序列資料係被Newbler v2.0.01.14®(454 Life Sciences,Branford,CT)集合。該集合之重疊群係使用Sequencher v3.7®(GeneCodes,Ann Arbor,MI)經人工評估對應之FAD基因之存在。

在所有4個FAD2及6個FAD3基因之全長基因體序列被確定及完全特徵化之後，鋅指核酸酶係經設計以結合至各特定基因群成員之序列。

實施例2：設計對FAD2基因具特異性之鋅指結合域

依前所述設計一鋅指蛋白導向能針對編碼各種FAD2基因位點之功能性序列的DNA序列。參見如Urnovet al. (2005)Nature 435：646-651。例示性目標序列及辨識螺旋係被顯示在表6和表7(辨識螺旋區設計)及表8和表9(目標位)。於表8和表9中，被ZFP辨識螺旋接觸之該標的位中之核苷酸係以上標字母顯示；未接觸之核苷酸以下標顯示。鋅指核酸酶(ZFN)目標位係被設計以結合FAD2A之5個目標位以及FAD3之7個目標位。該FAD2及FAD3鋅指設計係被併入鋅指表現載體，其編碼具至少一指(該指帶有CCHC結構)的蛋白。參見U.S.Patent Publication No.2008/0182332。特別的是，各蛋白之末指具有針對辨識螺旋之CCHC架構。該非典範之鋅指-編碼序列係被稠合(fused)至第IIS型限制酶FokI之核酸酶域(Wahet al. ,(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：10564-10569之胺基酸序列384-579)，藉一4胺基酸ZC連接子及一源自玉米之opaque-2 核定位訊息以形成FAD2A鋅指核酸酶(ZFNs)。該融合蛋白之表現係以相對強 之組成型啟動子來驅動，例如源自木薯葉脈嵌紋病毒(CsVMV)啟動子且側翼是農桿腫瘤菌(Agrobacterium tumefaciens )ORF23 3’非轉譯區(AtuORF23 3’UTR v1)之啟動子。編碼來自Thosea asigna virus之核苷酸序列的自水解2A(Szymczaket al., 2004)係被加入到該被選殖入構建體中之二個鋅指核酸酶融合蛋白之間。例示之載體係如下所述。

最佳鋅指視使用先前所示用以辨識活性核酸酶之出芽酵母系統時不同之剪切活性而定。參見如U.S.Patent Publication No.20090111119；Doyonet al. (2008)Nat Biotechnol. 26：702-708；Geurtset al. (2009)Science 325：433。各功能域之鋅指係被選擇供活體內使用。在設計、產生及測試會結合至潛在FAD基因體多核苷酸目標位之眾多ZFNs之中，某ZFN被確定具有高度之活體內活性，且被選擇用於進一步之實驗。此等ZFN係被特徵化為能夠有效地結合及剪切植物中特定FAD2基因體多核苷酸目標位。

實施例3：鋅指核酸酶剪切FAD2基因之評價

建構體之集合

如實施例2所述使用酵母測試來識別之含有範例鋅指核酸酶之ZFN表現構建體的質體載體，係使用技術領 域中已普遍知悉之技能和技術來設計及完成。各個鋅指編碼序列被連接至位於該鋅指核酸酶上游之編碼opaque-2核定位信號的序列(Maddaloniet al. (1989)Nuc.Acids Res. 17(18)：7532)。

其次，該opaque-2核定位信號：：鋅指核酸酶融合序列與互補之opaque-2核定位信號：：鋅指核酸酶融合序列配對。據此，每一個由單一開啟讀碼框(open reading frame)所組成之構建體包含了二個以來自序列刺蛾(Thosea asigna )病毒之2A序列(Mattionet al. (1996)J.Virol. 70：8124-8127)分開的opaque-2核定位信號：：鋅指核酸酶融合序列。融合蛋白之表現係以相對強之組成型啟動子來驅動，例如來自木薯葉脈嵌紋病毒(CsVMV)啟動子及兩側為農桿腫瘤菌(Agrobacterium tumefaciens )ORF23 3'非轉譯區(AtuORF23 3'UTR)之啟動子。

使用In-FUSION^TM Advantage Technology(Clontech,Mountain View,CA)來組合該載體。核酸限制內切酶係由New England BioLabs(NEB；Ipswich,MA)獲得，T4 DNA連接酶(Invitrogen)係被用於DNA連接。使用NucleoSpin® Plasmid Kit(Macherey-Nagel Inc.,Bethlehem,PA)或Plasmid Midi Kit(Qiagen)依供應者之指示來進行質體之製備。使用QIAquick Gel Extraction Kit^TM (Qiagen)在瓊脂糖Tris-乙酸膠體電泳之後分離DNA片段。以限制酶切少量DNA來初步篩選所有被集合之質體的選殖株。選定選殖株之質體DNA係透過商用定序廠商(Eurofins MWG Operon, Huntsville,AL)來定序。使用Sequencher^TM 軟體(Gene Codes Corp.,Ann Arbor,MI)來集合及分析序列資料。在送入B.napus 原生質體之前，使用Pure Yield Plasmid Maxiprep System®(Promega Corporation,Madison,WI)或Plasmid Maxi Kit®(Qiagen,Valencia,CA)依供應商之指示由E.coli 培養來製備質體DNA。

經由限制酶酶切及DNA定序來確認所得之以下11種質體構建體：pDAB104008(含有ZFN24845及ZFN24844構建體)，pDAB104009(含有ZFN24820及ZFN24821構建體)，pDAB104010(含有ZFN24828及ZFN24829構建體)(圖5)，pDAB104003(含有ZFN24810及ZFN24811構建體)，pDAB104011(含有ZFN24832及ZFN24833構建體)，pDAB104002(含有ZFN24794及ZFN24795構建體)，pDAB104006(含有ZFN24796及ZFN24797構建體)，pDAB104004(含有ZFN24814及ZFN24815構建體)，pDAB104001(含有ZFN24800及ZFN24801構建體)，pDAB104005(含有ZFN24818及ZFN24819構建體)及pDAB104007(含有ZFN24836及ZFN24837構建體)。表10列出不同構建體及特定FAD序列，其中各ZFN係被設計用來剪切及結合。

經由限制酶酶切及DNA定序來確認所得之以下質體構建體：pDAB107824(ZFNs 28025-2A-28026)，pDAB107815(ZFNs 27961-2A-27962)，pDAB107816(ZFNs 27969-2A-27970)，pDAB107817(ZFNs 27973-2A-27974)， pDAB107825(ZFNs 28035-2A-28036)，pDAB107826(ZFNs 28039-2A-28040)，pDAB107818(ZFNs 27987-2A-27988)，pDAB107827(ZFNs 28051-2A-28052)，pDAB107821(ZFNs 28004-2A-28005)，pDAB107819(ZFNs 27989-2A-27990)，pDAB107828(ZFNs 28053-2A-28054)，pDAB107829(ZFNs 28055-2A-28056)，pDAB107820(ZFNs 27991-2A-27992)，pDAB107822(ZFNs 28021-2A-28022)及pDAB107823(ZFNs 28023-2A-28024)。

製備用於轉染之DNA

藉由在100%(v/v)乙醇中沉澱及沖洗來消毒上述 載體之質體DNA，在一層流櫥中乾燥。在30μL之二次消毒蒸餾水中懸浮該DNA沉澱物，使最終濃度為0.7μg/μl，以供用於轉染入以下所述之原生質體細胞中。質體DNA之製備係在獲得供暫時轉染之超螺旋(supercoiled)質體DNA及穩定轉染之線性化(linearized)質體DNA。暫時轉染原生質體細胞不需要添加運送DNA(例如魚精子DNA)至轉形質體。於暫時實驗中，約每10⁶ 原生質需使用30μg質體DNA轉形。

轉染

西洋油菜L.var.DH10275之轉染係依Spangenberget al. ,(1986)Plant Physiology 66：1-8所述方式來完成，該媒介物之配方係被描述在Spangenberg G.及Protrykus I.(1995)之煙草原生質體中以聚乙二醇致使之直接基因轉移。在Gene Transfer to Plant (Protrykus I.及Spangenberg G.Eds.)Springer-Verlag,Berlin中。在70%乙醇中消毒西洋油菜種子表面。該種子被浸泡在12mL之70%乙醇溶液中，以和緩晃動方式混合該混合物10分鐘。藉傾析該溶液來去除該70%乙醇溶液，換成含有1% w/v次氯酸鈣及0.1% v/v Tween-20之種子消毒溶液。該種子被浸泡在該種子消毒溶液中，以和緩晃動方式混合該混合物25分鐘。傾析該種子消毒溶液，以50mL經消毒的水清洗該經消毒之種子三次。最後，將該種子移到放在培養皿中之經消毒80mm Whatman®過濾紙盤(Fisher-Scientific,St.Louis,MO)，稍微使該種子被水浸透。以Parafilm®(Fisher-Scientific,St. Louis,MO)密封該培養皿，使該盤保持在25℃之完全黑暗中一至二天。觀察到種子萌芽的跡象後，將該芽苗移到含固化之GEM介質的培養皿，以促使進一步種子發芽。使該芽苗保持在25℃之GEM介質四至五天。

一數量之液體PS培養基(約10mL)被傾析至一經消毒之培養皿中。使用經消毒之鉗和手術刀去除在增長和發育之4葉期的四到五日齡幼苗的地上部分並丟棄。決定用長20-40mm之胚軸段來產生最高量之小型、富有胞質之原生質體。該胚軸段係在無菌條件下切下並轉移到液體PS培養基。該切下之胚軸段被聚集在一起，橫向切成5-10mm段。其次，將該胚軸段移到新鮮的PS培養基中並保持在室溫一小時。該胞質分離(plasmolyzed)之胚軸被移到含有限制酶溶液之培養皿。小心地將所有胚軸段浸泡在該溶液中。以Parafilm®密封該等培養皿，保持在20-22℃中以和緩晃動隔夜(16至18小時)。

由胚軸段釋出原生質體細胞。輕輕地攪拌隔夜之胚軸酶切物(酶切s)來釋出限制酶溶液中的原生質體。稍微傾斜該培養皿，協助移置該由限制酶溶液及植物碎片之酶切懸浮物。使用10mL吸量管將酶切懸浮物移到經消毒之原生質體過濾(100micron篩之濾器)單元以進一步分開植物碎片及原生質體。輕輕敲打該過濾單元以釋出篩網留滯之剩餘液體。輕輕混合該原生質體懸浮物(約8至9mL)並分配至14mL經消毒之塑膠圓底離心管中。覆蓋1.5mL之W5溶液至各懸浮物之上。以一角度小心地注入該W5溶液於該原 生質體懸浮物之上，以逐滴加入達到最小攪拌之方式來注入。將該W5溶液加入至該原生質體懸浮物中會產生富有原生質體的界面。使用吸量管來收集此界面。其次，將收集到之原生質體移到新的14mL離心管中，輕輕地混合。使用血球計來決定所獲得之原生質體的產量，用來決定每一毫升中原生質體的數量。重覆該方法，其中葉組織被酶切來產生葉肉原生質體。

其次，添加W5溶液達10mL之量，在去除該W5溶液前以70g沉澱該原生質體。以和緩的搖動再次懸浮其餘之原生質體懸浮物。每一含有該原生質體懸浮物之管添加5mL之W5溶液，保持在室溫下一至四小時。以70g沉澱該原生質體懸浮物，然後去除所有W5溶液。其次，300μL轉形緩衝液被添加至每一含有分離之原生質體的經沉澱之原生質體懸浮物。10μg質體DNA被加入至每一管之原生質體懸浮物。該質體DNA係由上述之鋅指核酸酶構建體所組成(如pDAB104010)。其次，300μL之預熱PEG 4000溶液被加入至該原生質體懸浮物，輕輕敲打該管。將該原生質體懸浮物及轉形混合物保持在室溫15分鐘，不攪拌。加入另外10mL之W5溶液至各管中，依序等分為1mL、1mL、1mL、2mL、2mL及3mL，在W5溶劑添加之間將管上下顛倒。以70g離心旋轉沉澱該原生質體。去除所有W5溶液，留下純的原生質體懸浮物。

其次，添加0.5mL之K3培養基至沉澱之原生質體細胞，再懸浮該細胞。該再懸浮之原生質體細胞被置於1：1 濃度之5mL之K3及0.6mL之Sea Plaque^TM 瓊脂糖(Cambrex,East Rutherford,NJ)培養皿中央。以單一和緩的旋轉動作搖晃該培養皿，將其保持在室溫20-30分鐘。以PARAFILM®密封該培養皿，在完全黑暗中培養該原生質體24小時。在保持黑暗中之後，在微光中培養該培養皿6天(5μMol m^-2 s^-1 之Osram L36 W/21 Lumilux白管)。於該培養步驟之後，使用經消毒之刮刀將該含有原生質體之瓊脂糖切成四分圓。切開之四分圓被置於含有20mL之A培養基的250mL塑膠培養瓶中，在旋轉搖盪器上保持80rpm及1.25cm throw於24℃連續微光中14天，然後分析決定各鋅指核酸酶構建體活性程度。

由油菜原生質體分離遺傳DNA

以個別之1.5或2.0mL微量離心管提供轉染之原生質體。將在緩衝溶液中之該細胞沉澱在管的基底。DNA萃取係藉由在液態氮中快速冷凍細胞進行，接著在a Labconco Freezone 4.5®(Labconco,Kansas City,MO)中於-40℃及約133 x 10^-3 mBar壓力下冷凍乾燥該細胞48小時。使用DNeasy®(QIAGEN,Carlsbad,CA)植物套組依製造者指示將該凍乾細胞進行DNA萃取，除非不能使組織瓦解，該原生質體細胞被直接加入至該細胞分解緩衝液。

在油菜原生質體中測試FAD2A及FAD3之ZFNs之遺傳DNA序列剪切

針對FAD2A及FAD3基因位之ZFN目標位之設計被聚集，因此多對ZFN被設計重疊該目標位。聚集ZFN目標 位使得PCR引子將可被設計為能於100bp窗內擴增所有FAD2A及FAD3基因群成員周圍基因序列，封圍所有重疊之ZFN目標位。據此，該Illumina短讀取序列技術可被使用來評估轉染之原生質體之目標ZFN位的完整性。此外，該設計之PCR引子需要包括將序列讀取歸因(attribute)於FAD2A及FAD3群之特定基因成員的特定核苷酸基。因此，所有PCR引子必須結合離任何ZFN目標切位5-10個核苷酸，當已知非同源性末端接合(NHEJ)活性會造成小型缺失，其會造成引發位被去除、抑制擴增，且因此扭曲NHEJ活性之評估。

引子被設計用來結合至所有FAD2A及FAD3基因群之ZFN目標位(表11)，並經由PCR擴增產物之Sanger定序來實證檢驗所有基因群成員之擴增。於數種例子中，引子無法與所有基因群成員區別(表12及表13)，但是在所有例子中FAD2A及FAD3之目標基因序列是能區別的。以下之PCR引子設計定制DNA條碼序列被嵌入至被使用來區別不同AFN目標位之PCR引子，且識別轉染之特定序列片段及ZFN(表11、12及13)。

以下以ZFN轉染之油菜原生質體之DNA萃取，PCR擴增目標ZFN位點係被進行用來產生正確形式之必要之位點特定DNA分子，藉由合成技術用於Illumina定序。各檢驗係被最佳化來用於25ng起始DNA(約12,500細胞當量之西洋油菜基因組)。進行多反應，每一樣品提供需要的覆蓋範圍來評估適當量之NHEJ效率及特異性，約16個PCR反應相當於200,000複製之西洋油菜基因組取向個別之原生質體。對所有樣品進行了PCR擴增主混合(master-mixes)以相同檢驗測試，一個進行三次的反應係使用了定量PCR方法檢測，其係被使用來判斷在目標組織上進行的最佳周期數，以確保PCR擴增不會受限於試劑且維持在以指數級擴增的階段。該具有必要之負控制反應之試驗係在96井形式下進行，使用MX3000P thermocycler®(Stratagene,LaJolla, CA)。由該定量PCR平台收集之輸出資料，相對增加之螢光逐周期地被繪製，決定將提供足夠擴增之每一試驗之周期數，但不會讓反應受限於試劑，試圖減少過多周期(over cycling)及一般轉譯體或分子的擴增。未使用之主混合，其留在冰上直到定量PCR分析得到結果且決定周期數，接著被分配到所需數量之反應管中(每一ZFN試驗約16)且進行PCR反應。之後擴增，匯集單一ZFN位點之樣品在一起，以MinElute PCR purification kit®(Qiagen)依製造者指示清洗每一ZFN之200μL匯集之產物。為了使用Illumina短片段技術來定序該樣品，需要藉由擴增連接額外對配之末端引子至所產生之片段上。藉由PCR擴增技術達成此目地，使用將被加入到該第一輪擴增之部分互補至該序列且包含該所需之對配末端序列之引子。再次使用經過先前所述之定量PCR周期分析之樣品來決定進行之最佳PCR周期數，其加入配對末端序列而不會過度擴增樣品之一般片段。之後PCR擴增，使用MinElute column®(Qiagen)依製造者指示來清洗產生之產物，再次溶解於2.5%瓊脂糖膠體中。使用Syber® Safe(Life Technologies,Carlsbad,CA)使呈正確大小之帶狀的可見之DNA片段被膠體萃取，以去除任何殘餘之PCR所產生的引子-雙聚體或其他偽片段，使用MinElute gel extraction kit®(Qiagen)依製造者指示由該膠體切塊萃取DNA。膠體萃取完成之後，使用AMPure magnetic beads®(Beckman-Coulter,Brea,CA)以DNA對珠粒(bead)為1：1.7之比例進行額外之DNA清洗步驟。使用用於Illumina定序之定 量PCR庫量化套組(KAPA)來評估DNA之濃度，以1/40,000及1/80,000稀釋度並進行該反應三次。基於該定量PCR之結果，該DNA被稀釋至標準濃度2nM，所有序列庫與DNA定序組合。使用cBot cluster generation kit®(Illumina,San Diego,CA)來製備用於定序之樣品，該樣品在Illumina GA2x®上以100bp配對-末端定序片段依製造者指示被定序。

用於偵測於目標鋅指位之非同源性末端連接資料分析方法

定序反應完成及使用Illumina生物資訊管道鹼基識別(base calling)來進行初級資料取得之後，進行全分析來識別在各例中目標ZFN位缺失的鹼基。一定制(custom)之PERL script被設計用來萃取及排序來自在計算上接在輸入序列表之後的DNA序列碼(barcode)。該序列碼(barcode)必須與該參考序列相配至被接受的Phred得分大於30，以減少錯認序列片段。在將序列片段依所使用之不同碼群來分級之後，所有序列都經過品質過濾。品質過濾為第二定制開發之PERL script。若為多於3個鹼基為”N”或是Phred得分之中位數小於20或是有3個連續鹼基之Phred得分小於20或該序列片段小於40bp長的序列片段會被排除。使用NextGENe®(SoftGenetics,State College,PA)組件合併剩餘序列，可得到配對序列片段之二者。接著將該剩餘之合併序列片段減少為獨特序列片段的集合，使用具有被識別為重複序列的計數之被記錄在剩餘序列辨識器之末端的第三 定制PERL script。使用製造有間隔之FASTA比對檔案之NextGENe®軟體來使該獨特序列片段及FAD2及FAD3參考序列比對。

使用有間隔之FASTA檔案，使用第四定制PERL script將有間隔之鹼基位數轉變為輸入參考值。這使得在組合資料中之鹼基被識別，該鹼基區別不同基因群成員(不同基因群成員之間的同源或旁系同源序列變異)。一旦鹼基數變化，各獨特序列片段可能產生單倍型記錄(reports)，並指定該片段至特定基因群成員。一旦以基因分群該片段，圍繞在該ZFN目標位之10bp窗(window)被識別並被評估。記錄每一基因具缺失之序列數以及缺少的鹼基數。

接著以具序列數之多線段圖之圖像來顯示資料，於目標ZFN位每10,000序列片段缺失1至10鹼基(圖6)。分析係被用於所有ZFN轉染以及控制轉染。於一些情況下，天然DNA序列中之重複造成目標ZFN位定序錯誤的增加，例如在所有樣品中被報導而常被視為單鹼基缺失之普及性的增加，包括以ZFN或控制轉者(圖7)。

由此等結果，藉由NHEJ更高活性判斷來確定FAD2目標位之最高量ZFN活性在位點E。該編碼在質體pDAB104010(即ZFN24828及24829)上之ZFNs被選擇用於苗標定工程轉殖基因嵌入平台(ETIP)，其特徵在於特顯著之遺傳DNA剪切活性及最小非目標活性。

實施例4：工程轉殖基因嵌入平台(ETIP)油菜植物株之DNA構建體

以下所述之該質體載體構建體係使用一般該技術領域所知悉之方法及技術來建構。該領域熟悉此藝者能輕易知悉本段中所述之特定試劑及技術之實施，且可輕易以其他試劑及技術替換來達成希望健構出質體載體構建體的目的。由New England BioLabs(NEB；Ipswich,MA)獲得核酸限制內切酶。以T4連接酶(Invitrogen,Carlsbad,CA)來完成連接。使用Gateway® LR Clonase®限制酶混合(Invitrogen)來進行閘道反應(Gateway reactions)，用於將一進入載體組合入一終點載體。在使用In-融合^TM 優選技術(Clontech,Mountain View,CA)來進行In-融合^TM 反應用於將一進入載體組合入一單一終點載體，使用NucleoSpin®質體套組(Macherey-Nagel Inc.,Bethlehem,PA)或質體Midi套組®(Qiagen)依提供者指示來進行質體之製備。使用QIAquick Gel Extraction Kit^TM (Qiagen)分離DNA片段，在瓊脂糖Tris-乙酸膠體電泳之後。藉由限制酶切miniprepDNA來初步篩選所有組合質體之群落體。以商業定序提供者(Eurofins MWG Operon,Huntsville,AL)來定序選定之選殖株的質體DNA。使用Sequencher^TM 軟體(Gene Codes Corp.,Ann Arbor,MI)來收集並分析序列資料。

用於在油菜FAD2A位點精確嵌入ETIP之直接遞送載體

標準選殖方法被使用在建構含ETIP載體pDAS000130(圖8，T-鏈插入SEQ ID NO：141)，用於特定嵌入至B.napus 之FAD2A基因中。此構建體被設計用來與鋅 指核酸酶構建體pDAB1004010一起遞送至油菜原生質體中。該鋅指核酸酶構建體會切斷FAD2A位點，然後pDAS000130構建體將經由同源重組修復機制(homology directed repair mechanism)嵌入在油菜基因組中，且可藉去除該同源性側翼區來修飾以供用於NHEJ導引之整合。該ETIP包含四個表現卡匣(二個不完全)，其被另外之ZFN辨識序列及含有另一ZFN辨識序列之工程降落坪(ELP)分開。該另外ZFN辨識序列是獨特的且被設計用來標定具ETIP及ELP轉形基因插入之多核苷酸序列的導入。同樣地，該ZFN辨識序列可被使用來切除多核苷酸序列。該第一基因表現卡匣係不完整之dsRED表現卡匣且包含來自阿拉伯芥聚泛蛋白10(AtUbi啟動子)基因(Callis,et al., (1990)J.Biol.Chem. ,265：12486-12493)之啟動子、5' 非轉譯區及內含子，接著是用於在雙子葉植物表現之210bp之來自礁珊瑚(Discosoma sp.)(Clontech,Mountain View,CA)密碼子-最佳化之dsRed基因(ds RED(最佳雙子葉)外顯子1)，接著是來自阿拉伯芥硫基還原酶類基因的內含子(來自At之硫基還原酶之內含子1：登錄號：NC_00374)及包括玉米Vp1(Viviparous-1)基因之轉錄終止子及聚腺苷酸位的3' 非轉譯區(Zmlip terminator：Paeket al., (1998)Molecules and Cells,8(3)：336-342)。該第二表現卡匣包含19S啟動子，其包含花椰菜嵌紋病毒之5' UTR(CaMV 19S：Cook and Penon(1990)Plant Molecular Biology 14(3)：391-405)，接著是用於在雙子葉植物表現之密碼子-最佳化之E.coli 之hph 基因(hph(HygR)：Kasteret al., (1983)nucleic acids Research 11(19)：6895-6911)及包括農桿腫瘤菌(A.tumefaciens )pTi15955之開啟讀碼框1之轉錄終止子及聚腺苷酸位的3' UTR(At-ORF1 terminator：Barkeret al. ,(1983)Plant Molecular Biology 2(6)：335-50)。該第三表現卡匣係不完整之PAT表現卡匣且包含阿拉伯芥4-香豆基(coumaryl)-CoA合成酶之第一內含子(內含子#2 4-香豆基-CoA合成酶v：登錄號：At3g21320/NC003074)，接著是最後256bp分離自產綠色鏈霉菌(Streptomyces viridochromogenes )之合成植物-最佳化草丁膦(phosphinothricin)乙醯轉移酶基因，其編碼對麩胺合成酶抑制劑具抗性的蛋白，包括草丁膦(phophinothricin)、草銨膦(glufosinate)及雙丙氨磷(bialaphos)(PAT(v6)3' end：Wohllebenet al., (1988)Gene 70(1)：25-37)。此卡匣之終止為包括農桿腫瘤菌(A.tumefaciens )pTi15955之開啟讀碼框23之轉錄終止子及聚腺苷酸位的3' UTR(AtuORF23 terminator：Barkeret al., (1983)Plant Molecular Biology 2(6)：335-50)。該第四表現卡匣係ipt 基因卡匣且包含來自阿拉伯芥DNA結合蛋白MYB32基因(U26933)之588bp之截斷的啟動子及5' UTR(AtMYB32(T)promoter：Liet al. ,(1999)Plant Physiology 121：313)，接著是農桿腫瘤菌(A.tumefaciens )之異戊基轉移酶(ipt )基因及包含花椰菜嵌紋病毒之包括轉錄終止子及聚腺苷酸位的35s終止子(CaMV 35S terminator：Chenaultet al. ,(1993)Plant Physiology 101(4)： 1395-1396)。為了遞送至FAD2A，ETIP序列之每一端由該雙鏈斷裂位置之每一側接有1kb之FAD2A基因序列，由pDAB104010中編碼之ZFN至B.napus 之FAD2A基因的遞送所引發。

該ETIP序列係藉由商業基因合成供應商來合成(GeneArt,Life Technologies)。使用Qiagen DNeasy plant mini kit®(Qiagen,Hilden)依製造者所提供之指示由B.napus DH12075葉組織純化之遺傳DNA擴增FAD2A基因組序列之1kb片段。使用T4連接酶(NEB,Ipswich,MA)將該1kb之FAD2A序列連接至ETIP載體中。所有組合質體之群落係藉由miniprep DNA限制酶切來初步篩選。核酸限制內切酶係由New England BioLabs(NEB,Ipswich,MA)及Promega(Promega Corporation,WI)獲得。使用QIAprepSpin Miniprep Kit®(Qiagen)或Pure Yield Plasmid Maxiprep system®(Promega Corporation,WI)依提供者之指示來進行質體製備。選定之選殖株的質體DNA被定序，使用ABI Sanger定序及Big Dye terminator v3.1 cycle sequencing protocol®(Applied Biosystems,Life Technologies)。使用Sequencher^TM 軟體(Gene Codes Corp.,Ann Arbor,MI)來組合及分析序列資料。

用於在油菜FAD3位點精密嵌入ETIP的直接遞送載體

標準選殖方法被使用在建構含ETIP載體pDAS000271(圖9，T-鏈插入SEQ ID NO：142)、pDAS000272 (圖10，T-鏈插入SEQ ID NO：143)、pDAS000273(圖11，T-鏈插入SEQ ID NO：144)、pDAS000274(圖12，T-鏈插入SEQ ID NO：145)及pDAS000275(圖13，T-鏈插入SEQ ID NO：146)，用於特定嵌入至B.napus 之FAD3A或FAD3C基因位點中。此構建體被設計用來與鋅指核酸酶構建體pDAB107828或pDAB107829一起遞送至油菜原生質體中。特定鋅指核酸酶構建體會切斷FAD3A位點，然後pDAS000273或pDAS275構建體將嵌入在該油菜基因組中，經由同源重組修復機制(homology directed repair mechanism)。同樣地，特定鋅指核酸酶構建體會切斷FAD3C位點，然後pDAS000271、pDAS000272或pDAS000274構建體將嵌入在該油菜基因組中，經由同源重組修復機制(homology directed repair mechanism)。該ETIP包含四個表現卡匣(二個不完全)，其被另外之ZFN辨識序列及含有另一ZFN辨識序列之工程降落坪(ELP)分開。該另外ZFN辨識序列是獨特的且被設計用來標定具ETIP及ELP轉形基因插入之多核苷酸序列的導入。同樣地，該ZFN辨識序列可被使用來切除多核苷酸序列。該第一基因表現卡匣係不完整之dsRED表現卡匣且包含來自阿拉伯芥聚泛蛋白10(AtUbi啟動子)基因(Callis,et al., (1990)J.Biol.Chem. ,265：12486-12493)之啟動子、5' 非轉譯區及內含子，接著是用於在雙子葉植物表現之210bp之來自礁珊瑚(Discosoma sp.)(Clontech,Mountain View,CA)密碼子-最佳化之dsRed基因(ds RED(最佳雙子葉)之外顯子1)，接著是來自阿拉伯芥硫基還原酶類基因的內含子(來自 At之硫基還原酶之內含子1：登錄號：NC_00374)及包括玉米Vp1(Viviparous-1)基因之轉錄終止子及聚腺苷酸位的3' 非轉譯區(Zmlip terminator：Paeket al., (1998)Molecules and Cells,8(3)：336-342)。該第二表現卡匣包含19S啟動子，其包含花椰菜嵌紋病毒之5' UTR(CaMV 19S：Cook and Penon(1990)Plant Molecular Biology 14(3)：391-405)，接著是用於在雙子葉植物表現之密碼子-最佳化之E.coli 之hph 基因(hph(HygR)：Kasteret al., (1983)nucleic acids Research 11(19)：6895-6911)及包括農桿腫瘤菌(A.tumefaciens )pTi15955之開啟讀碼框1之轉錄終止子及聚腺苷酸位的3' UTR(At-ORF1 terminator：Barkeret al. ,(1983)Plant Molecular Biology 2(6)：335-50)。該第三表現卡匣係不完整之PAT表現卡匣且包含阿拉伯芥4-香豆基(coumaryl)-CoA合成酶之第一內含子(內含子#2 4-香豆基-CoA合成酶v：登錄號：At3g21320/NC003074)，接著是最後256bp分離自產綠色鏈霉菌(Streptomyces viridochromogenes )之合成植物-最佳化草丁膦(phosphinothricin)乙醯轉移酶基因，其編碼對麩胺合成酶抑制劑具抗性的蛋白，包括草丁膦(phophinothricin)、草銨膦(glufosinate)及雙丙氨磷(bialaphos)(PAT(v6)3' end：Wohllebenet al., (1988)Gene 70(1)：25-37)。此卡匣之終止為包括農桿腫瘤菌(A.tumefaciens )pTi15955之開啟讀碼框23之轉錄終止子及聚腺苷酸位的3' UTR(AtuORF23終止子：Barkeret al., (1983)Plant Molecular Biology 2(6)： 335-50)。該第四表現卡匣係ipt 基因卡匣且包含阿拉伯芥DNA結合蛋白MYB32基因(U26933)之588bp之截斷的啟動子及5' UTR(AtMYB32(T)promoter：Liet al. ,(1999)Plant Physiology 121：313)，接著是A.tumefaciens 之異戊基轉移酶(ipt )基因及包含花椰菜嵌紋病毒之轉錄終止子及聚腺苷酸位的35s終止子(CaMV 35S terminator：Chenaultet al. ,(1993)Plant Physiology 101(4)：1395-1396)。為了遞送至FAD3A或FAD3C，ETIP序列之每一端由該雙鏈斷裂位置之每一側接有1kb之FAD3A或FAD3C基因序列，由B.napus 之FAD3A或FAD3C基因中編碼之ZFN的遞送所引發。

該ETIP序列係藉由商業基因合成供應商來合成(GeneArt,Life Technologies)。使用Qiagen DNeasy plant mini kit®(Qiagen,Hilden)依製造者所提供之指示由B.napus DH12075葉組織純化之遺傳DNA擴增FAD3A或FAD3C基因組序列之1kb片段。使用T4連接酶(NEB,Ipswich,MA)將該1kb之FAD3A或FAD3C序列連接至ETIP載體中。所有組合質體之群落係藉由miniprep DNA限制酶切來初步篩選。核酸限制內切酶係由New England BioLabs(NEB,Ipswich,MA)及Promega(Promega Corporation,WI)獲得。使用QIAprepSpin Miniprep Kit®(Qiagen)或Pure Yield Plasmid Maxiprep system®(Promega Corporation,WI)依供應者之指示來進行質體製備。選定之選殖株的質體DNA被定序，使用ABI Sanger Sequencing and Big Dye Terminator v3.1 cycle sequencing protocol®(Applied Biosystems,Life Technologies)。使用Sequencher^TM 軟體(Gene Codes Corp.,Ann Arbor,MI)來組合及分析序列資料。

控制載體

使用控制載體來發展螢光激活細胞分選(FACS)之細胞分選方法。使用標準選殖方法建構包含二基因表現卡匣之控制載體pDAS000031(圖14：T-鏈插入SEQ ID NO：147)。該第一基因表現卡匣包含花椰菜嵌紋病毒19s啟動子(CaMV 19S promoter；Shillito,et al., (1985)Bio/Technology 3；1099-1103)：：潮黴素抗性基因(hph(HygR)；US Patent No.4,727,028)：：及該農桿腫瘤菌(Agrobacterium tumefaciens )開啟讀碼框1之3' 非轉譯區(AtORF1 terminator；Huanget al. ,(1990)J.Bacteriol. 1990172 ：1814-1822)。該第二基因表現卡匣包含以反方向(trans orientation)(如頭對頭之方向)在同一個讀框融合之阿拉伯芥泛蛋白10啟動子(AtUbi10 promoter；Callis,et al., (1990)J.Biol.Chem. ,265：12486-12493)：：dsRED(dsRED(D)；US Patent No.6,852,849)及阿拉伯芥之內含子(內含子#1；GenBank：AB025639.1)：：農桿腫瘤菌(Agrobacterium tumefaciens )開啟讀碼框23之3' 非轉譯區(AtORF23 terminator；US Patent No.5,428,147)。使用In-融合^TM Advantage Technology(Clontech,Mountain View,CA)組合該質體載體。

於油菜中隨機嵌入ETIP之二元載體的建構

建構二個二元載體用來在西洋油菜之基因組中 隨機嵌入ETIP T-鏈序列。使用標準選殖方法建構含ETIP之載體pDAS000036(圖15，T-鏈插入SEQ ID NO：148)及pDAS000037(圖16，T-鏈插入SEQ ID NO：149)。該ETIP載體包含四個表現卡匣(二個不完整之表現卡匣)，其被ZFN辨識序列及含更多ZFN辨識序列之工程降落坪(ELP)分開。該第一基因表現卡匣係不完整之dsRED表現卡匣且包含來自阿拉伯芥聚泛蛋白10(AtUbi10啟動子)基因(Norriset al. ,(1993)植物Molecular Biology,21(5)：895-906)之啟動子、5' 非轉譯區及內含子，接著是用於在雙子葉植物表現之210bp之來自礁珊瑚(Discosoma sp.)(Clontech,Mountain View,CA)密碼子-最佳化之dsRed基因，接著是阿拉伯芥硫基還原酶類基因內含子(登錄號：NC_00374)及包括玉米Vp1(Viviparous-1)基因之轉錄終止子及聚腺苷酸位之3' 非轉譯區(UTR)(Zmlip terminator：Paeket al., (1998)Molecules and Cells,8(3)：336-342)。該第二表現卡匣包含19S啟動子，其包含花椰菜嵌紋病毒之5' UTR(CaMV 19S：Cook and Penon(1990)Plant Molecular Biology 14(3)：391-405)，接著是用於在雙子葉植物表現之密碼子-最佳化之E.coli 之hph 基因(hph(D)：Kasteret al (1983)核酸s Research,11(19)：6895-6911)及包括農桿腫瘤菌(A.tumefaciens )pTi15955之開啟讀碼框1(ORF1)之轉錄終止子及聚腺苷酸位的3' UTR(At-ORF1 terminator：Barkeret al. ,(1983)Plant Molecular Biology 2(6)：335-50)。該第三表現卡匣係不完整之PAT表現卡匣且包含阿拉伯芥4-香豆基 (coumaryl)-CoA合成酶之第一內含子(登錄號：At3g21320(NC003074))，接著是最後256bp分離自產綠色鏈霉菌(Streptomyces viridochromogenes )之合成植物-最佳化草丁膦(phosphinothricin)乙醯轉移酶基因，其編碼對麩胺合成酶抑制劑具抗性的蛋白，包括草丁膦(phophinothricin)、草銨膦(glufosinate)及雙丙氨磷(bialaphos)(PATv6(外顯子2)；Wohllebenet al., (1988)Gene,70(1)：25-37)。此卡匣之終止為包括農桿腫瘤菌(A.tumefaciens )pTi15955之開啟讀碼框23(ORF23)之轉錄終止子及聚腺苷酸位的3' UTR(AtuORF23 terminator：Barkeret al., (1983)Plant Molecular Biology 2(6)：335-50)。該第四表現卡匣係ipt 基因卡匣且包含阿拉伯芥DNA結合蛋白MYB32基因(U26933)之588bp之截斷的啟動子及5' UTR(AtMYB32(T)promoter：Liet al. ,(1999)Plant Physiology 121：313)，接著是農桿腫瘤菌(A.tumefaciens )之異戊基轉移酶(ipt )基因及包含花椰菜嵌紋病毒之轉錄終止子及聚腺苷酸位的35s終止子(CaMV 35S terminator：Chenaultet al. ,(1993)Plant Physiology 101(4)：1395-1396)。

該表現卡匣及ELP係藉由商業基因合成供應商(GeneArt,Life Technologies)利用Multi-Gateway位來合成。進入選殖株(entry clones)係使用BP clonase II enzyme mix^TM (Invitrogen,Life Technologies)及pDONR221 vector suite^TM (Invitrogen,Life Technologies)由各表現卡匣及ELP建構而成。該進入選殖株接著與Gateway-enabled二元載體一起被 使用在一Multi-Gateway反應中，使用LR Clonase II Plus Enzyme mix^TM (Invitrogen,Life Technologies)。所有組合質體之群落係藉由miniprep DNA限制酶切來初步篩選。核酸限制內切酶係由New England BioLabs(NEB,Ipswich,MA)及Promega(Promega Corporation,WI)獲得。使用QIAprepSpin Miniprep Kit^TM (Qiagen,Hilden)或Pure Yield Plasmid Maxiprep System^TM (Promega Corporation,WI)依提供者之指示來進行質體製備。選定之植株的質體DNA被定序，使用ABI Sanger Sequencing and Big Dye terminator® v3.1 cycle sequencing protocol^TM (Applied Biosystems,Life Technologies)。使用Sequencher^TM 軟體(Gene Codes Corp.,Ann Arbor,MI)來組合及分析序列資料。

實施例5：ETIP油菜植物株之產生

西洋油菜之轉形

ETIP構建體(pDAS000036、pDAS000037)、DS-Red控制構建體(pDAS000031)以及FAD2A、FAD3A和FAD3C位特異性構建體(pDAS000130及pDAS000271-pDAS000275)以及伴隨之鋅指核酸酶(pDAB104010、pDAB10728及pDAB10729)係如實施例4所述。該二元載體被轉形至農桿腫瘤菌(Agrobacterium tumefaciens )品系GV3101：PM90中。西洋油菜原生質體細胞之轉形係使用部分改變之實施例3所述之轉染實驗方法。

該實驗方法之改變包含使用海藻酸鈉代替Sea Plaque^TM 瓊脂。鋅指核酸酶構建體及ETIP構建體被一起遞送進入西洋油菜原生質體細胞之轉染實驗係以包含5：1莫耳比質體DNA之DNA濃度完成。其他ETIP及控制質體構建體以30μg濃度之質體DNA來轉形。據此，pDAS000130係由濃度為27.8μg之質體DNA組成，且pDAB104010係由濃度為2.2μg之質體DNA組成。其他ETIP及控制質體構建體以30μg之質體DNA轉形。

實驗方法的額外改變包括在含1.5mg/mL潮黴素之培養基由轉殖原生質體細胞繁殖全植物。繁殖全植物需要每二周更換A培養基並監測該原生質體而來之群落的生長。該原生質體而來之群落長至大約2-3mm大小時，將該群落移到含有固化MS型態培養基之12孔井Costar®盤(Fisher Scientific,St.Louis,MO)單獨之孔井中。使該盤保持在連續微光中於24℃一至二周，直到該癒傷組織增長至8-10mm大小。於原生質體細胞達到1-2cm大小之後，將該原生質體細胞移到含有MS型態培養基之單獨之250mL培養瓶中。使該管保持在24℃光照16小時(20μMol m^-2 s^-1 of Osram L36 W/21 Lumilux white tubes)及8h黑暗環境。一至二周內可見多個芽體(shoots)。當其達到3-4cm長度之後，將該芽體移到含有MS型態培養基250mL培養瓶中。使該250mL培養瓶保持在24℃光照16h(20μMol m^-2 s^-1 之Osram L36 W/21 Lumilux white tubes)及8h黑暗環境。使該芽體(shoot)在該培養瓶中維持，直到其發展成植物小苗時移到溫室中成長至成熟。

實施例6；在油菜中嵌入含T-DNAs之ETIPs之分子驗證

分子確認油菜中ETIP之隨機整合

使用DNeasy 96植物DNA extraction kit^TM 或DNeasy Plant Mini Kit^TM (Qiagen)由所有推定基因轉殖植物之葉組織萃取遺傳DNA。使用以下引子進行PCR來分析各植物之遺傳DNA：被設計用以擴增pTiC58前置(SEQ ID NO：150 CGAGAACTTGGCAATTCC)及pTiC58反置(SEQ ID NO：151 TGGCGATTCTGAGATTCC)之vir C之引子，被設計用以擴增B.napus 肌動蛋白之引子，來測試A.tumfaciens 之持續性；肌動蛋白前置(SEQ ID NO：152 GACTCATCGTACTCTCCCTTCG)及肌動蛋白反置(SEQ ID NO：153 GACTCATCGTACTCTCCCTTCG)，來檢查基因組DNA之品質。引子被設計用來擴增hph 基因；HPH前置(SEQ ID NO：154 TGTTGGTGGAAGAGGATACG)及HPH反置(SEQ ID NO：155 ATCAGCAGCAGCGATAGC)，其係由ETIP編碼。未由vir C引子得到產物卻由肌動蛋白及hph 之引子擴增出正確大小產物的植物被歸類為基因轉殖植物。

完成第二篩選，其中各基因轉殖植物之gDNA係藉由PCR分析，其係使用五組引子，該引子係設計用來擴增T-DNA區以外的二元載體[(1F SEQ ID NO：156 ATGTCCACTGGGTTCGTGCC；1R SEQ ID NO：157 GAAGGGAACTTATCCGGTCC)(2F SEQ ID NO：158 TGCGCTGCCATTCTCCAAAT；2R SE ID NO：159 ACCGAGCTCGAATTCAATTC)(3F SEQ ID NO：160 CCTGCATTCGGTTAAACACC；3R SEQ ID NO：161 CCATCTGGCTTCTGCCTTGC)(4F SEQ ID NO：162 ATTCCGATCCCCAGGGCAGT；4R SEQ ID NO：163 GCCAACGTTGCAGCCTTGCT)(5F SEQ ID NO：164 GCCCTGGGATGTTGTTAAGT；5R SEQ ID NO：165 GTAACTTAGGACTTGTGCGA)]。以引子組3及4擴增出正確及預期大小之PCR產物的植物被認為具有架構(backbone)嵌入。

使用改變之CTAB方法(Maguireet al,. (1994)Plant Molecular Biology Reporter,12(2)：106-109)由20g葉組織純化沒有架構嵌入之植物的DNA。以數種限制酶酶切分離之，藉由在瓊脂糖膠上電泳分出10μg之gDNA，使用標準南方墨點法將其移至一膜上。依製造商指示使用DIG Easy Hyb System^TM (Roche,South San Francisco,CA)探測該膜。使用以下引子由EITP構建體擴增各表現卡匣、ELP及內源控制基因、肌動蛋白的探針：IPT-F SEQ ID NO：166 TCTCTACCTTGATGATCGG；IPT-R SEQ ID NO：167 AACATCTGCTTAACTCTGGC；dsRED-F SEQ ID NO：168 ATGGCTTCATCTGAGAACG；dsRED-R SEQ ID NO：169 TTCCGTATTGGAATTGAGG；PAT-F SEQ ID NO：170 TTGCTTAAGTCTATGGAGGCG；PAT-R SEQ ID NO：171 TGGGTAACTGGCCTAACTGG；ELP-F SEQ ID NO：172 ATGATATGTAGACATAGTGGG；ELP-R SEQ ID NO：173 AGGGTGTAAGGTACTAGCC；Hph-F SEQ ID NO：174 TGTTGGTGGAAGAGGATACG；Hph-R SEQ ID NO：175 ATCAGCAGCAGCGATAGC；肌動蛋白-F SEQ ID NO：176 GTGGAGAAGAACTACGAGCTACCC；肌動蛋白-R SEQ ID NO：177 GACTCATCGTACTCTCCCTTCG。

由所有含有僅有ETIP單份(single copy)之植物擴增及定序ETIP序列。藉直接定序PCR產物來分析各T-DNA插入之序列，使用ABI3730xI^TM (Applied Biosystems,Life Teachnologies)。由基因組DNA擴增該T-DNA插入，使用Phusion Hot Start II聚合酶^TM (Finnzymes,Thermo Fisher Scientific)。以多引子對擴增大約2Kbp長之重疊序列來完成T-DNA擴增反應。以多引子定序各PCR產物以確定完全涵蓋。以蝦鹼性磷酸酶及核酸外切酶I(Applied Biosystems,Life Technologies)處理該PCR反應，以使多餘的引子在定序PCR反應前失活。辨識每個複製ETIP株之T-DNA插入側翼的序列，藉由以八種核酸限制內切酶酶切純化之遺傳DNA，之後連接對核酸限制內切酶所產生之突出部分具專一性之雙鏈連接子。在此連接步驟之後，PCR係以生物素化(biotinylated)之引子對ETIP之3’或5’端以及以一引子對各連接子來進行。該PCR產物在Ampure Solid Phase Reversible Immobilization(SPRI)beads^TM (Agencourt Bioscience Corporation,Beckman Coulter Company)上被捕抓及清潔。進行巢式PCR，所有產物使用ABI Sanger Sequencing and Big Dye Terminator v3.1 cycle^TM 定序方法 (Applied Biosystems,Life Technologies)來定序。使用Sequencher^TM 軟體(Gene Codes Corp.,Ann Arbor,MI)來收集並分析序列資料。

南方墨點法分析

在進行南方探測之前，選擇特定限制酶來酶切gDNA樣品。藉由以EcoR I及Swa I酶切該遺傳DNA來分析假定的基因轉殖植物。其次，以包括PATv6、IPT或ELP基因組成之多核苷酸片段來探測經酶切之gDNA及未切之gDNA樣品，因為此等多核苷酸探針片段能夠區分在EcoR I酶切中以及Swa I酶切的多個插入。接著以所有6個探針進一步分析被辨識之單份(single copy)基因轉殖植物株，以辨識該插入之載體之所有必要組成的存在。

因此，67個以ETIP-pDAS000036轉殖的獨立品件被取樣及測試轉殖基因(hph )的存在及載體架構的存在。在測試之67個植物中，發現有47個具有轉殖基因嵌入(integrated)基因組內。該47基因轉殖植物中發現17個植物含有載體架構(表14)。其餘30個不含載體架構顯著部分(沒有Ori或SpecR)的植物經南方分析取樣。作為一般規則，以IPT探針初步篩選該植物，以包括dsRED、PAT、ELP及hph 基因組成之探針進一步測試被識別為假定單份(single copy)株之植物株，為了確認整個卡匣存在。

同樣地，以ETIP-pDAS000037轉殖且在土中存活之52個獨立品件被取樣及測試轉殖基因(hph )的存在及載體架構的存在。該測試之52個植物中，發現48個具有轉殖 基因整合在基因組內。在該48個基因轉殖植物中，發現23個植物含有載體架構，而3個植物未經測試(表14)。其餘22個不含載體架構顯著部分(沒有Ori或SpecR)的植物經南方分析取樣。以IPT探針初步篩選此等基因轉殖植物，以dsRED、PAT、ELP、hph 及肌動蛋白探針進一步測試被識別為假定單份複製(single copy)株之植物株，為了確認結果。一旦獲得識別之5個獨立單份(single copy)株，終止其餘植物中的的南方分析。總共有11個ETIP-pDAS000037株經南方分析。

以pDAS000036及pDAS000037轉殖之ETIP轉殖基因油菜的結果

該經pDAS000036及pDAS000037轉形所產生之轉殖基因西洋油菜品件導致單份複製、全長T-鏈插入的產生。每一植物之三或四個品件被完全特徵化並假定地圖譜 化到該西洋油菜基因組之特定染色體中。雖然少數單一鹼基對重組在該T-鏈嵌入時發生，選定之品件包含能夠驅動轉殖基因大量表現的全長表現卡匣。選定之T₀ 品件被培育到T₁ 生長階段。使用上述之PCR檢驗再次篩選該T₁ ，來判斷整合入T-鏈的接合子。經篩選之品件被分類為同型、異型或不表現型。

由所有含有嵌入ETIP序列僅有單份複製的轉殖基因品件擴增並定序該ETIP序列。以直接定序PCR產物來分析每個T-DNA插入之序列。由基因組DNA擴增該T-DNA插入，使用Phusion Hot Start II聚合酶^TM (Finnzymes,Thermo Fisher Scientific)。其次，以多引子對來擴增該T-DNA，以擴增大約2Kb長之重疊序列。以多引子定序每一PCR產物以確保完全涵蓋。以蝦鹼性磷酸酶及核酸外切酶I(Applied Biosystems,Life Technologies)來處理該PCR反應以使得定序PCR反應之前多餘的引子失活。

辨識每個單份複製ETIP株之T-DNA插入側翼的序列，藉由以八種核酸限制內切酶酶切純化之遺傳DNA，之後連接對核酸限制內切酶所產生之突出部分具專一性之雙鏈連接子。在此步驟之後，以生物素化(biotinylated)引子對ETIP之3’或5’端以及以一引子對各連接子來進行PCR反應。該PCR產物在Ampure Solid Phase Reversible Immobilization^TM (SPRI)beads(Agencourt Bioscience Corporation,Beckman Coulter Company)上被捕抓及清潔。進行巢式PCR，所有產物使用ABI Sanger Sequencing and Big Dye Terminator v3.1 cycle^TM 定序方法(Applied Biosystems,Life Technologies)來定序。使用Sequencher^TM 軟體(Gene Codes Corp.,Ann Arbor,MI)來收集並分析序列資料。八個ETIP株被辨識並被選定用於側翼序列分析(表15)。側翼序列之左及右(亦被稱為邊緣或接合序列)係SEQ ID NO：431-SEQ ID NO：446，畫底線之序列係指質體載體，無底線之序列係基因組側翼序列。

pDAS000036品件詳細內容：em02-5788-1-1左緣側翼(SEQ ID NO：431)

em02-5788-1-1左緣側翼(SEQ ID NO：432)

pDAS000036品件詳細內容：ad58-5784-2-1左緣側翼(SEQ ID NO：433)

ad58-5784-2-1右緣側翼(SEQ ID NO：434)

pDAS000036品件詳細內容：ad58-5898-10-1左緣側翼(SEQ ID NO：435)

ad58-5898-10-1右緣側翼(SEQ ID NO：436)

pDAS000037品件詳細內容：lf31-6139-2-3左緣側翼(SEQ ID NO：437)

lf31-6139-2-3右緣側翼(SEQ ID NO：438)

pDAS000037品件詳細內容：bm56-6315-1-1左緣側翼(SEQ ID NO：439)

bm56-6315-1-1右緣側翼(SEQ ID NO：440)

pDAS000037品件詳細內容：ad58-6372-1-1左緣側翼(SEQ ID NO：441)

ad58-6372-1-1右緣側翼(SEQ ID NO：442)

pDAS000037品件詳細內容：ad58-6620-4-1左緣側翼(SEQ ID NO：443)

ad58-6620-4-1右緣側翼(SEQ ID NO：444)

pDAS000037品件詳細內容：ad58-6620-17-1左緣側翼(SEQ ID NO：445)

ad58-6620-17-1右緣側翼(SEQ ID NO：446)

ETIP圖譜

對於每一含有ETIP之單份(single copy)插入的轉殖基因品件，接著以人工進行該側翼序列組合，並使用區域BLAST分析。此方法識別出共八個具單份(single copy) 嵌入之植物(表16及表17)。由NCBI GSS資料庫下載甘藍(Brassica oleracea )霰彈槍定序之595,478基因組匯集，形成核苷酸BLAST資料庫。然後BLASTn該側翼ETIP序列及比對該資料庫，人工檢驗所有配對。甘藍資料庫中最顯著配對至該側翼ETIP序列之序列被拿來與線上蕪菁基因組序列(http：//brassicadb.org/brad/blastPage.php)進行比對，其中檢索出該基因組中具有最顯著配對序列的位置。例如僅5' 或3' 側翼序列提供與甘藍基因組序列顯著配對者，假定不對齊或不配對之序列具有資料庫中被辨識之缺漏序列或在嵌入ETIP時所產生之顯著基因組重組。對於由分析該側翼ETIP序列所產生之顯著BLASTn配對的樣品，對於該八個單份(single copy)ETIP植物之每一者，最顯著之甘藍GSS配對序列以及蕪菁基因組之最顯著配對序列在Sequencher^TM v5.0軟體(Gene Codes Corp.,Ann Arbor,MI)中以人工比對。比較三個序列，與該側翼ETIP比較之雙子葉植物Brassica 種之最相似序列於該ETIP位在之基因組中被標出。對於多數顯著不同之樣品確實存在於該二種雙子葉植物Brassica 基因組序列，該西洋油菜之側翼ETIP序列顯示與一或其他雙子葉植物序列之顯著關聯。然而有雙子葉植物之間差異不足的例子，可能指定連鎖群(linkage group)但無法指定次-基因組(sub-genome)。接著預測該特定基因組於蕪菁基因組序列之位置。例如在ETIP被辨識為嵌入在甘藍(B.oleracea )C基因組中者，於Parkinet al. (Genetics 2005,171：765-781)所述之該雙子葉植物Brassica基因組之間之比較 性基因同性線(synteny)被使用來推斷西洋油菜C次-基因組中之基因組位置。除了識別之序列與阿拉伯芥基因組編碼序列(由http：//arabidopsis.org/index.jsp下載之TAIR 9 CDS)進行BLASTn，識別如Schranzet al. (Trend in Plant Science 2006,11,11：535-542)所述在阿拉伯芥甘藍(Brassica )基因同性線(synteny)之後的任何斷裂基因序列之相似性以及確認基因組位置。

經由先前所述方法使用同型合子品件來產生原生質體。該原生質體隨後與一被設計來標定鋅指結合位之鋅指核酸酶共-轉殖，該鋅指結合位係被嵌入ETIP序列及一與ETIP特定區具同源性之供體質體內。該鋅指核酸酶切斷該ETIP位點且該供體質體經由同源修復被嵌入西洋油菜細胞之基因組內。作為嵌入供體質體之結果，該部分DS-red 轉殖基因被修復為全長之DS-red 轉殖基因。現在可完整運作之DS-red 轉殖基因的表現被使用來以FACS方法分選原生質體細胞。使用實施例7所述之FACS方法分選假定之基因轉殖植物，再生該分離之原生質體成為成熟植物。使用分子確認方法確認在該ETIP標定植物中嵌入供體質體。據此，該ETIP位點成為一對於基因標定嵌入供體多核苷酸序列位點之特異性位點。

該基因組標定位置提供不會改變植物一般表型之基因組位置。得到的品件，其中轉殖基因被標定在一ETIP內，當該ETIP品件與控制植物比較，其不具有農業上有意義之差異。此外，該嵌入在EITP位點內之轉殖基因的蛋白表現程度係大量表現，且一致和穩定的跨多個基因組的位置。該揭示之基因序列SEQ ID NO：431至SEQ ID NO：446提供brassica基因組中的基因組位置，其標定包括一轉殖基因之基因表現卡匣之嵌入。

以ZFN之同源重組DS-ReD來標定ETIP株

藉分子特徵獲得且確認一含有pDAS000036之T-鏈插入的油菜株，其含有一全長的、單份(single copy)之T-鏈。此油菜品件被標誌為pDAS000036-88且被使用來藉先前所述之方法產生原生質體。該原生質體被分離且~50,000油菜原生質體隨後以一鋅指核酸酶(pDAS000074(圖25)或pDAS000075(圖26))共-轉形，其被設計以標定該被整合到ETIP序列中之鋅指結合位以及一與該ETIP有同源性之供體質體pDAS000064、pDAS000068、pDAS000070或 pDAS000072(分別為圖27，圖28，圖29及圖30)。圖19及圖20提供該導致藉鋅指核酸酶同源重組之Ds-red 轉殖基因之位點特異性嵌入之同源直接修復之說明。該鋅指核酸酶被設計用以於被界定之鋅指結合序列切斷該ETIP位點，藉此產生該基因組內之雙股斷裂。其次，該供體質體藉同源直接修復被嵌入在該西洋油菜原生質體細胞之基因組中。該供體質體之內含子-1及內含子-2區域與對應之該ETIP位點之內含子-1及內含子-2區域具有同源性。供體質體嵌入之結果，該部分DS-red 轉殖基因被修復成全長、高表現性之之DS-red 轉殖基因。使用該全面運作之DS-red 轉殖基因的表現以上述之FACS方法分選原生質體細胞。因此，該ETIP位點被當作用於標定供體多核苷酸序列嵌入之基因的位點特異性之位點。最後，該分離之原生質體可被分選及再生為成熟植物。使用分子確認方法確認該供體質體之嵌入係在該ETIP-標定植物中。

該供體質體DNA及ZFN質體DNA於各種濃度下被混合，且被使用來轉染該含有品件pDAS000036-88之油菜原生質體細胞，使用前述之FACS轉染分選該基因轉殖原生質體細胞using the FACS轉染。表18描述各種轉染實驗及使用來轉染該含有品件pDAS000036-88之油菜原生質體之DNA濃度。藉前述方法分離及製備用來轉染之該ZFN及供體質體DNA。

在轉染試驗完成後，該原生質體被保持在室溫48小時且使用上述FACS實驗方法進行分選。各試驗被獨立地分選，且鋅指之轉殖基因滲入係藉辨識表現DS-red 轉殖基因之各個品件來確認。圖21-24顯示FACS分選的結果。如所指之圖說明的結果，含有完整全嵌入之DS-red 轉殖基因的多個品件被產生。該多個Ds-Red 品件係鋅指核酸酶之供體DNA構建體嵌入在該ETIP基因組位點中之結果。此位點 特異性嵌入導致高度表現、完整複製之Ds-Red 轉殖基因。該Ds-Red 轉殖基因表現之頻率的範圍為總油菜原生質體細胞(~50,000)之約0.03-0.07%。但是，在該ETIP基因組位點中之鋅指核酸酶之供體DNA構建體嵌入的轉染效率頻率更高且範圍為約0.07-0.64%。

圖21顯示該供體質體及ZFN質體被共-轉形之轉染的結果。在上方之圖，其中供體(pDAS000064)及該鋅指核酸酶(pDAS000074)在26μg對4μg之質體DNA之比例下被共-轉形，導致在ETIP基因組位點中之鋅指核酸酶之供體DNA構建體之嵌入，重組頻率為該~50,000個油菜原生質體細胞之約0.03%。實際上，該重組頻率高更多。在轉染實驗中提供之該~50,000個的油菜原生質體細胞中，只有此等油菜原生質體細胞之約10-30%實際被轉形。因此，實際之在ETIP基因組位點中之鋅指核酸酶致供體DNA構建體嵌入的轉染效率範圍約為0.22-0.07%。同樣在下方之圖，其中供體(pDAS000064)及該鋅指核酸酶(pDAS000075)係於26μg對4μg之質體DNA之比例下被共-轉形，導致在ETIP基因組位點中之鋅指核酸酶致供體DNA構建體嵌入，重組頻率為該~50,000個油菜原生質體細胞之約0.03%。實際上，該重組頻率高更多。在轉染實驗中提供之該~50,000個的油菜原生質體細胞中，只有此等細胞之約10-30%實際被轉染。因此，實際之在ETIP基因組位點中之鋅指核酸酶致供體DNA構建體嵌入的轉染效率範圍約為0.26-0.08%。該鋅指致同源直接修復之結果顯著地大於陰性控制實驗，其中 ~50,000個原生質體之中只有1個被辨識具有紅色螢光，因此獲得圖20所示之0.00%重組頻率。

圖22顯示該供體質體及ZFN質體被共-轉形之轉染的結果。在上方之圖，其中供體(pDAS000068)及該鋅指核酸酶(pDAS000074)於28μg對2μg之質體DNA之比例下被共-轉形，導致在ETIP基因組位點中之鋅指核酸酶致供體DNA構建體嵌入，重組頻率為該~50,000個油菜原生質體細胞之約0.03%。實際上，該重組頻率高更多。在轉染實驗中提供之該~50,000個的油菜原生質體細胞中，只有此等油菜原生質體細胞之約10-30%實際被轉形。因此，實際之在ETIP基因組位點中之鋅指核酸酶致供體DNA構建體嵌入的轉染效率範圍約為0.22-0.07%。同樣在下方之圖，其中供體(pDAS000068)及該鋅指核酸酶(pDAS000075)係於28μg對2μg之質體DNA之比例下被共-轉形，導致在ETIP基因組位點中之鋅指核酸酶致供體DNA構建體嵌入，重組頻率為該~50,000個油菜原生質體細胞之約0.04%。實際上，該重組頻率高更多。在轉染實驗中提供之該~50,000個的油菜原生質體細胞中，只有此等細胞之約10-30%實際被轉染。因此，實際之在ETIP基因組位點中之鋅指核酸酶致供體DNA構建體嵌入的轉染效率範圍約為0.38-0.12%。該鋅指致同源直接修復之結果顯著地大於陰性控制實驗，其中~50,000個原生質體之中只有1個被辨識具有紅色螢光，因此獲得圖20所示之0.00%重組頻率。

圖23顯示該供體質體及ZFN質體被共-轉形之轉 染的結果。在上方之圖，其中供體(pDAS000070)及該鋅指核酸酶(pDAS000074)於28μg對2μg之質體DNA之比例下被共-轉形，導致在ETIP基因組位點中之鋅指核酸酶致供體DNA構建體嵌入，重組頻率為該~50,000個油菜原生質體細胞之約0.07%。實際上，該重組頻率高更多。在轉染實驗中提供之該~50,000個的油菜原生質體細胞中，只有此等油菜原生質體細胞之約10-30%實際被轉形。因此，實際之在ETIP基因組位點中之鋅指核酸酶致供體DNA構建體嵌入的轉染效率範圍約為0.64-0.21%。同樣在下方之圖，其中供體(pDAS000070)及該鋅指核酸酶(pDAS000075)係於28μg對2μg之質體DNA之比例下被共-轉形，導致在ETIP基因組位點中之鋅指核酸酶致供體DNA構建體嵌入，重組頻率為該~50,000個油菜原生質體細胞之約0.04%。實際上，該重組頻率高更多。在轉染實驗中提供之該~50,000個的油菜原生質體細胞中，只有此等細胞之約10-30%實際被轉染。因此，實際之在ETIP基因組位點中之鋅指核酸酶致供體DNA構建體嵌入的轉染效率範圍約為0.34-0.11%。該鋅指致同源直接修復之結果顯著地大於陰性控制實驗，其中~50,000個原生質體之中只有1個被辨識具有紅色螢光，因此獲得圖20所示之0.00%重組頻率。

圖24顯示該供體質體及ZFN質體被共-轉形之轉染結果。在上方之圖，其中供體(pDAS000072)及該鋅指核酸酶(pDAS000074)於28μg對2μg之質體DNA之比例下被共-轉形，導致在ETIP基因組位點中之鋅指核酸酶致供體 DNA構建體嵌入，重組頻率為該~50,000個油菜原生質體細胞之約0.07%。實際上，該重組頻率高更多。在轉染實驗中提供之該~50,000個的油菜原生質體細胞中，只有此等油菜原生質體細胞之約10-30%實際被轉形。因此，實際之在ETIP基因組位點中之鋅指核酸酶致供體DNA構建體嵌入的轉染效率範圍約為0.62-0.2%。同樣在下方之圖，其中供體(pDAS000072)及該鋅指核酸酶(pDAS000075)係於28μg對2μg之質體DNA之比例下被共-轉形，導致在ETIP基因組位點中之鋅指核酸酶致供體DNA構建體嵌入，重組頻率為該~50,000個油菜原生質體細胞之約0.05%。實際上，該重組頻率高更多。在轉染實驗中提供之該~50,000個的油菜原生質體細胞中，只有此等細胞之約10-30%實際被轉染。因此，實際之在ETIP基因組位點中之鋅指核酸酶致供體DNA構建體嵌入的轉染效率範圍約為0.44-0.14%。該鋅指致同源直接修復之結果顯著地大於陰性控制實驗，其中~50,000個原生質體之中只有1個被辨識具有紅色螢光，因此獲得圖20所示之0.00%重組頻率。

選定之外植體被移動且以含有phosphothrinocin之再生介質培養。培養期之後，存活之外植體被移到伸長培養基(elongation medium)及誘根培養基(root induction medium)中培養及植物發育。包括發育之根(root)及芽體(shoot)結構之全株植物被移到土壤中，且在溫室中進一步繁殖。該組織培養方法使用前述之培養基及培養條件。由組織培養方法產生之植物的結果顯示在下表19。

油菜中FAD2A嵌入之分子確認

由所有假定之基因轉殖植物的葉組織萃取遺傳DNA，依製造商指示使用DNeasy Plant Mini Kit^TM (Qiagen)，例外是在80μl之AE緩衝液中洗提組織。在研磨成粉末之前，在液態氮中快速冷凍30毫克再生植物之年輕的葉組織。

使用三獨立的檢驗表現FAD2A位點的分子特徵。使用以下控制來設計即最佳化檢驗：特徵化之轉殖基因品件，其包括單一隨機嵌入之轉殖基因，特徵化之轉殖基因品件，具五個隨機嵌入轉殖基因，天然油菜c.v.DH12075植物及非模板控制反應。三個以下之分子分析的結果被一起考量用以提供經由HDR在FAD2A嵌入ETIP的證據。

藉由即時定量聚合酶鏈鎖反應識別轉殖基因之嵌入

使用對hph 具特異性之引子(亦稱為hpt )標定基因(SEQ ID NO：447，hpt F791 5' CTTACATGCTTAGGATCGGACTTG 3' ；SEQ ID NO：448，hpt R909 5' AGTTCCAGCACCAGATCTAACG 3' ；SEQ ID NO：449，hpt Taqman 872 5' CCCTGAGCCCAAGCAGCATCATCG 3' FAM)(圖31)及編碼高遷移率族蛋白I/Y(HMG I/Y) 的參考基因(SEQ ID NO：450，F 5' CGGAGAGGGCGTGGAAGG 3' ；SEQ ID NO：451，R 5' TTCGATTTGCTACAGCGTCAAC 3' ；SEQ ID NO：452，探針5' AGGCACCATCGCAGGCTTCGCT 3' HEX)來分析每一植物之四個複製。使用以下條件來擴增反應：95℃ 10分鐘，接著40個周期95℃ 30秒，60℃ 1分鐘，每一個鏈合 步驟結束時獲得擴增資料。使用△Cq方法計算複製數，其中△Cq=Cq(目標基因)-Cq(參考基因)。Livak,K.J.and T.D.Schmittgen,Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))Method. Methods,2001.25(4)：p.402-8。hph 及HMG I/Y 擴增的植物以及具0.5或更多複製數被認為是轉殖基因，當具有0.5及1.2之植物被評分為假定之單份(single copy)。在BioRad CFX96 Touch^TM Real-Time PCR Detection System利用FastStart Universal Probe Master(ROX)進行擴增(Roche,Basel,Switzerland)。

偵測斷裂之FAD2A之ZFN位

在優勢檢驗之斷裂位點測試中，分析每一植物存在有或沒有內源性目標的擴增。該檢驗為SYBR® Green I qPCR檢驗，且單對分別(singleplex)(但各反應同時在同一個PCR盤上進行)標定一內源性位點(FAD2A/2C.RB.UnE.F1,SEQ ID NO：453,5' CTTCCACTCCTTCCTCCTCGT*C 3' 及FAD2A/2C.RB.UnE.R1,5' SEQ ID NO：454,GCGTCCCAAAGGGTTGTTGA*G 3' )及ZFN位點(ZFN pDAB104010結合及切斷該基因組的位點)(FAD2A.UnE.F1,SEQ ID NO：455,5' TCTCTACTGGGCCTGCCAGGG*C 3' 及FAD2A.UnE.R1,SEQ ID NO：456,5' CCCCGAGACGTTGAAGGCTAAGTACAA*A 3' )(圖32)。二引子對皆使用以下條件擴增：98℃ 30秒，接著35個周期(98℃ 10秒，65℃ 20秒，72℃ 90秒)，然後接著95℃ 10秒，然後由50℃到95℃以每0.05秒增加 0.5℃之熔化分析及對每一增加進行讀盤。反應條件被列在表20。

擴增內源性目標但未擴增ZFN目標之植物被評分為具有斷裂位點測試，且其備認為具有斷裂之ZFN位。此檢驗被認為是正面的，當FAD2A位點上之對偶之ZFN結合位皆被打斷。

經由同源直接修復對於在FAD2A嵌入之轉殖基因進行PCR偵測

利用端點以被設計用來擴增以下之目標轉殖基因的PCR引子來分析每一假定轉形植物：hph(hph _ExoDigPC_F1,SEQ ID NO：457,5' TTGCGCTGACGGATTCTACAAGGA 3' 及hph _ExoDigPC_R1,SEQ ID NO：458,5' TCCATCAGTCCAAACAGCAGCAGA 3' )，FAD2A內源位點(FAD2A.Out.F1,SEQ ID NO：459,5' CATAGCAGTCTCACGTCCTGGT*C 3' 及FAD2A.Out.Rvs3, SEQ ID NO：460,5' GGAAGCTAAGCCATTACACTGTTCA*G 3' )，經由HDR插入在FAD2A位點之任何轉殖基因的跨越5’端的區域，FAD2A位點中轉殖基因之上游(FAD2A.Out.F1,SEQ ID NO：461,5' CATAGCAGTCTCACGTCCTGGT*C 3' 及QA520,SEQ ID NO：462,5' CCTGATCCGTTGACCT GCAG 3' )以及經由HDR插入在FAD2 A位點之任何轉殖基因的跨越3’端的區域，FAD2 A位點中轉殖基因之下游(QA558,SEQ ID NO：463,5' GTGTGAGGTGGCTAGGCATC 3' 及FAD2A.Out.Rvs3,SEQ ID NO：464,5' GGAAGCTAAGCCATTACACTGTTCA*G 3' )(圖33)。使用以下條件來擴增所有引子對：98℃ 30秒，之後進行35個周期(98℃ 10秒，65℃ 20秒，72℃ 90秒)。反應試劑條件係如表21 所述。

5' 轉殖基因-基因組側翼標的之擴增及/或3' 轉殖基因-基因組側翼標的之擴增指示了假定的插入品件。應注 意的是，由於pDAS000130卡匣中大約1,000bp之FAD2A同源臂(homology arms)(包括與ZFN切斷位緊臨之上游或下游之FAD2A區100%序列相似度之多核苷酸序列)，該PCR反應會有因脫離標的之ETIP嵌入品件而發生之PCR嵌合現象所致之假陽性PCR產物之擴增。確認轉殖基因嵌入而有hph 標的擴增出現。擴增FAD2A標的說明了FAD2A位點是完整的或只含有部分插入。由於ETIP的大小(11,462bp之ETIP卡匣或13,472bp之包含FAD2A同源性臂(homologous arm)及ETIP卡匣)，預期當完整ETIP嵌入至FAD2A位點中，該FAD2A引子將不會擴增產物。

FAD2A編排之南方偵測

擴增5' 基因組-轉殖基因側翼標的產物及/或擴增3'轉殖基因-基因組側翼標的之植物，或者是未擴增ZFN位點標的之植物，或是該二種植物，接受南方分析以偵測於FAD2A位點之轉殖基因的嵌入。由5g葉組織純化遺傳DNA，使用改變之CTAB方法(Maguire,T.L.,G.G.Collins,and M.SedgleyA modified CTAB DNA extraction procedure for plant belonging to the family proteaceae 。Plant Molecular Biology Reporter,1994.12(2)：p.106-109)。其次，以Kpn1 -HF(New England BioLabs)酶切12μg遺傳DNA，在使用標準南方墨點法將酶切片段移到膜上之前，於0.8%瓊脂糖膠上以電泳分離該等酶切片段。FAD2A 5' 目標區(F,SEQ ID NO：465,5' AGAGAGGAGACAGAGAGAGAGT 3' 及R,SEQ ID NO：466,5' AGACAGCATCAAGATTTCACACA 3' )、FAD2A 3' 目標區 (F,SEQ ID NO：467,5' CAACGGCGAGCGTAATCTTAG 3' 及R,SEQ ID NO：468,5' GTTCCCTGGAATTGCTGATAGG 3' )及hph (F,SEQ ID NO：469,5' TGTTGGTGGAAGAGGATACG 3' 及R,SEQ ID NO：470,5' ATCAGCAGCAGCGATAGC 3' )之引子，在DIG Easy Hyb System®(Roche,South San Francisco,CA)依製造商指示被使用來產生用以偵測在FAD2A位點之中是否有ETIP存在的探針(圖34)。雜交反應係在42℃下對FAD2A 5' 區、在45℃下對FAD2A 3' 區進行，以及在42℃下用於偵測hph 。

膜結合遺傳DNA係以特定順序被探測；第一，探測FAD2A 5' 序列，接著探測FAD2A 3' 序列，最後探測hph 序列(圖34)。其理由如下。第一探針(FAD2A 5')為診斷探針，若ETIP有經由完整HDR嵌入至FAD2A中，膜上會發現5,321bp片段。在電穿孔時造成的帶大小可輕易地區別，將座落(sit)在接近DIG標定Roche DNA分子量標記III®(Roche,Indianapolis,IN)之5,148bp片段。膜之第二探針具有該FAD2A 3' 探針，且一經編輯之植物將具有22,433bp片段，其中一未經編輯之植物將會具有16,468bp片段。該以FAD2A 3' 探針辨識之相同的22,433bp片段亦應被hph 探針連接且以hph 探針辨識。此等片段在膠(gel)上難以區分，因為他們非常大且難以決定出現在大於或小於該DIG標定Roche DNA分子量標記III®中最大之21,226bp片段的片段之間有任何差異。據此，此等探針提供強化辨識ETIP 經由同源直接修復(HDR)嵌入至FAD2A中的證據，藉由使用該FAD2A 5' 探針來觀察5kb片段。限制酶KpnI是唯一適合用於此試驗之限制核酸內切酶，因為KpnI 切位出現在單一位點中之該ETIP卡匣切位之單一位點，且出現在FAD2A ZFN位點之二個區位(site)中。一區位(site)係位在上游，該第二區位(site)位在FAD2A同源臂之下游。此外，KpnI 不對甲基化敏感，且可作為具增加之保真度(fidelity)之重組限制酶(New England Biolabs)。

分子及南方分析的結果

在轉染、培養及選擇之後，該基因轉殖植物被移置土壤。由此方法，139個植物存活且有組織樣品用以gDNA萃取及分析。所有139個植物皆被分析複製數估計。於此等139個植物中，56個為ETIP陽性，且該56個陽性植物中之11個具有潛在的單份(single copy)嵌入(圖35)(表22)。該ETIP嵌入為陽性之56個植物中，該FAD2A 5' -基因組-轉殖基因側翼序列之擴增出現在7個植物中。該FAD2A 3' -轉殖基因-基因組側翼序列之擴增並未出現在該ETIP嵌入為陽性之56個植物之任何一者中。此外，轉殖基因嵌入為陽性之該56個植物中，11個植物之中斷位點qPCR測試為陽性。對FAD2A 5' 基因組-轉殖基因側翼序列之擴增為陽性及/或中斷位點qPCR測試為陽性之14個植物以上述3種探針進行南方分析。經南方分析之該14個植物全部顯示出在FAD2A位點中部分嵌入，但是當以FAD2A 5' 探針、FAD2A 3' 及hph 探針偵測，此等植物沒有任何一者顯示出藉HDR於該FAD2A位點之完 整全長嵌入該ETIP之證據。當以FAD2A 3’探針偵測，沒有條帶i)大於WT及ii)等於對該等樣品觀察之條帶(表22 )。

以pDAS000130及pDAB104010轉殖之油菜的ETIP基因轉殖結果。

藉pDAS000130及pDAB104010轉形製造之基因轉殖西洋油菜品件造成單份(single copy)之嵌入、在該FAD2A位點中pDAS000130之ETIP多核苷酸序列之全長T-鏈之插入。3至4個品件完全被特徵化及確認含有嵌入之ETIP。該確認係使用一入-出(in-out)PCR擴增方法來完成，且進一步藉南方點墨法驗證。該被選擇之T₀ 品件被培養至T₁ 成長階段。再篩選該T₁ 植物以決定該嵌入之T-鏈之合子型。經篩選之品件被分類為同型、異型或不表現型。

藉先前所述之方法使用該同型合子品件來產生原生質體。該原生質體隨後以鋅指核酸酶共-轉殖，該鋅指 核酸酶係被設計來標定被嵌入在該ETIP序列之鋅指結合位及與該ETIP特定區域有同源性之供體質體，其中該供體藉HDR機制被嵌入在該ETIP中。同樣地，該原生質體隨後以鋅指核酸酶共-轉殖，該鋅指核酸酶係被設計來標定被嵌入在該ETIP序列之鋅指結合位及與該ETIP特定區域沒有同源性之供體質體，其中該供體藉非同源性末端連結機制被嵌入在該ETIP中。該鋅指核酸酶切斷該ETIP位點，且該供體質體藉同源性直接修復或非同源性末端連結被嵌入在該西洋油菜細胞之基因組中。該供體質體之嵌入的結果，該部分DS-red 轉殖基因被修復成全長之DS-red 轉殖基因。使用該正全面運作之DS-red 轉殖基因的表現以FACS方法分選原生質體細胞。使用實施例7中所述之該FACS方法來分選潛在之基因轉殖植物，該分離出之原生質體被再生為成熟的植物。使用分子確認方法確認該供體質體之嵌入係在ETIP-標定植物中。因此，該ETIP位點被當作用於標定供體多核苷酸序列嵌入之基因的位點特異性之位點。

以鋅指核酸酶及pDAS000271-PDAS000275之ETIP構建體轉殖之油菜之基因轉殖結果

藉轉形ETIP及鋅指核酸酶製造之該基因轉殖西洋油菜品件造成嵌入單份(single copy)，在該FAD3A位點中插入pDAS000273及pDAS275之ETIP多核苷酸序列之全長T-鏈，及在FAD3C位點中插入pDAS000271、pDAS000272或pDAS000274之ETIP多核苷酸序列之全長T-鏈。3至4個品件完全被特徵化及確認含有嵌入之ETIP。該確認係使用一 入-出(in-out)PCR擴增方法來完成，且進一步藉南方點墨法驗證。該被選擇之T₀ 品件被培養至T₁ 成長階段。再篩選該T₁ 植物以決定該嵌入之T-鏈之合子型。經篩選之品件被分類為同型、異型或不表現型。

藉先前所述之方法使用該同型合子品件來產生原生質體。該原生質體隨後以鋅指核酸酶共-轉殖，該鋅指核酸酶係被設計來標定被嵌入在該ETIP序列之鋅指結合位及與該ETIP特定區域有同源性之供體質體。該鋅指核酸酶切斷該ETIP位點，且該供體質體藉由同源直接修復被嵌入在該西洋油菜細胞的基因組中。該供體質體之嵌入的結果，該部分DS-red 轉殖基因被修復成全長之DS-red 轉殖基因。使用該正全面運作之DS-red 轉殖基因的表現以FACS方法分選原生質體細胞。使用實施例7中所述之該FACS方法來分選潛在之基因轉殖植物，該分離出之原生質體被再生為成熟的植物。使用分子確認方法確認該供體質體之嵌入係在ETIP-標定植物中。因此，該ETIP位點被當作用於標定供體多核苷酸序列嵌入之基因的位點特異性之位點。

實施例7：以FACS分選原生質體細胞

使用BD Biosciences Influx-Cell sorter^TM (San Jose,CA)藉由FACS細胞分選方法來分選以DS-Red控制構建體，pDAS000031，轉染之西洋油菜之原生質體。如實施例3所述方法分離且轉染該原生質體細胞。以pDAS000031轉染該等細胞後，使用FACS分選儀以表23所述之條件來分選該等細胞。

該表現DS-red 轉殖基因之原生質體被分選及分離。使用分選儀計數該FACS分離之原生質體。約1x10⁵ 至1.8x10⁵ 細胞於FACS分離後之第一天被置於一24井微孔板之井中。該細胞被移到珠培養5至20天。於相似條件進行測試，其中於FACS分離後之第二天約1x10⁴ 細胞被置於一2或4井微孔板之井中。測試之各種條件導致回收的細胞存活率為分離之原生質體細胞全體之95-98%。該FACS分選之原生質體細胞被移到珠培養3-20天。使用上述之實驗方法，將該FACS分選之原生質體細胞在含有1.5mg/mL潮黴素之介質上再生成植物。該潛在之基因轉殖植物藉分子確認實驗方法被確認含有一完整之pDAS000031之T-鏈插入。

以ZFN之同源重組DS-ReD來標定ETIP株

藉分子特徵獲得且確認一含有pDAS000036之T-鏈插入的油菜株，其含有一全長的、單份(single copy)之T-鏈。此油菜品件被標誌為pDAS000036-88且被使用來藉先前所述之方法產生原生質體。該原生質體被分離且~50,000油菜原生質體隨後以一鋅指核酸酶(pDAS000074(圖25)或pDAS000075(圖26))共-轉形，其被設計以標定該被整合到ETIP序列中之鋅指結合位以及一與該ETIP有同源性之供體質體pDAS000064、pDAS000068、pDAS000070或pDAS000072(分別為圖27，圖28，圖29及圖30)。圖19及圖20提供該導致藉鋅指核酸酶同源重組之Ds-red 轉殖基因之位點特異性嵌入之同源直接修復之說明。該鋅指核酸酶被設計用以於被界定之鋅指結合序列切斷該ETIP位點，藉此產生該基因組內之雙股斷裂。其次，該供體質體藉同源直接修復被嵌入在該西洋油菜原生質體細胞之基因組中。該供體質體之內含子-1及內含子-2區域與對應之該ETIP位點之內含子-1及內含子-2區域具有同源性。供體質體嵌入之結果，該部分DS-red 轉殖基因被修復成全長、高表現性之之DS-red 轉殖基因。使用該全面運作之DS-red 轉殖基因的表現以上述之FACS方法分選原生質體細胞。因此，該ETIP位點被當作用於標定供體多核苷酸序列嵌入之基因的位點特異性之位點。最後，該分離之原生質體可被分選及再生為成熟植物。使用分子確認方法確認該供體質體之嵌入係在該ETIP-標定植物中。

該供體質體DNA及ZFN質體DNA於各種濃度下 被混合，且被使用來轉染該含有品件pDAS000036-88之油菜原生質體細胞，使用前述之FACS轉染分選該基因轉殖原生質體細胞using the FACS轉染。表24描述各種轉染實驗及使用來轉染該含有品件pDAS000036-88之油菜原生質體之DNA濃度。藉前述方法分離及製備用來轉染之該ZFN及供體質體DNA。

在轉染試驗完成後，該原生質體被保持在室溫48小時且使用上述FACS實驗方法進行分選。各試驗被獨立地分選，且鋅指之轉殖基因滲入係藉辨識表現DS-red 轉殖基因之各個品件來確認。圖21-24顯示FACS分選的結果。如所指之圖說明的結果，含有完整全嵌入之DS-red 轉殖基因的多個品件被產生。該多個Ds-Red 品件係鋅指核酸酶之供體DNA構建體嵌入在該ETIP基因組位點中之結果。此位點特異性嵌入導致高度表現、完整複製之Ds-Red 轉殖基因。該Ds-Red 轉殖基因表現之頻率的範圍為總油菜原生質體細胞(~50,000)之約0.03-0.07%。但是，在該ETIP基因組位點中之鋅指核酸酶之供體DNA構建體嵌入的轉染效率頻率更高且範圍為約0.07-0.64%。

圖21顯示該供體質體及ZFN質體被共-轉形之轉染的結果。在上方之圖，其中供體(pDAS000064)及該鋅指核酸酶(pDAS000074)在26μg對4μg之質體DNA之比例下被共-轉形，導致在ETIP基因組位點中之鋅指核酸酶之供體DNA構建體之嵌入，重組頻率為該~50,000個油菜原生質體細胞之約0.03%。實際上，該重組頻率高更多。在轉染實驗中提供之該~50,000個的油菜原生質體細胞中，只有此等油菜原生質體細胞之約10-30%實際被轉形。因此，實際之在ETIP基因組位點中之鋅指核酸酶致供體DNA構建體嵌入的轉染效率範圍約為0.22-0.07%。同樣在下方之圖，其中供體(pDAS000064)及該鋅指核酸酶(pDAS000075)係於26μg對4μg之質體DNA之比例下被共-轉形，導致在ETIP基因 組位點中之鋅指核酸酶致供體DNA構建體嵌入，重組頻率為該~50,000個油菜原生質體細胞之約0.03%。實際上，該重組頻率高更多。在轉染實驗中提供之該~50,000個的油菜原生質體細胞中，只有此等細胞之約10-30%實際被轉染。因此，實際之在ETIP基因組位點中之鋅指核酸酶致供體DNA構建體嵌入的轉染效率範圍約為0.26-0.08%。該鋅指致同源直接修復之結果顯著地大於陰性控制實驗，其中~50,000個原生質體之中只有1個被辨識具有紅色螢光，因此獲得圖20所示之0.00%重組頻率。

圖22顯示該供體質體及ZFN質體被共-轉形之轉染的結果。在上方之圖，其中供體(pDAS000068)及該鋅指核酸酶(pDAS000074)於28μg對2μg之質體DNA之比例下被共-轉形，導致在ETIP基因組位點中之鋅指核酸酶致供體DNA構建體嵌入，重組頻率為該~50,000個油菜原生質體細胞之約0.03%。實際上，該重組頻率高更多。在轉染實驗中提供之該~50,000個的油菜原生質體細胞中，只有此等油菜原生質體細胞之約10-30%實際被轉形。因此，實際之在ETIP基因組位點中之鋅指核酸酶致供體DNA構建體嵌入的轉染效率範圍約為0.22-0.07%。同樣在下方之圖，其中供體(pDAS000068)及該鋅指核酸酶(pDAS000075)係於28μg對2μg之質體DNA之比例下被共-轉形，導致在ETIP基因組位點中之鋅指核酸酶致供體DNA構建體嵌入，重組頻率為該~50,000個油菜原生質體細胞之約0.04%。實際上，該重組頻率高更多。在轉染實驗中提供之該~50,000個的油菜原 生質體細胞中，只有此等細胞之約10-30%實際被轉染。因此，實際之在ETIP基因組位點中之鋅指核酸酶致供體DNA構建體嵌入的轉染效率範圍約為0.38-0.12%。該鋅指致同源直接修復之結果顯著地大於陰性控制實驗，其中~50,000個原生質體之中只有1個被辨識具有紅色螢光，因此獲得圖20所示之0.00%重組頻率。

圖23顯示該供體質體及ZFN質體被共-轉形之轉染的結果。在上方之圖，其中供體(pDAS000070)及該鋅指核酸酶(pDAS000074)於28μg對2μg之質體DNA之比例下被共-轉形，導致在ETIP基因組位點中之鋅指核酸酶致供體DNA構建體嵌入，重組頻率為該~50,000個油菜原生質體細胞之約0.07%。實際上，該重組頻率高更多。在轉染實驗中提供之該~50,000個的油菜原生質體細胞中，只有此等油菜原生質體細胞之約10-30%實際被轉形。因此，實際之在ETIP基因組位點中之鋅指核酸酶致供體DNA構建體嵌入的轉染效率範圍約為0.64-0.21%。同樣在下方之圖，其中供體(pDAS000070)及該鋅指核酸酶(pDAS000075)係於28μg對2μg之質體DNA之比例下被共-轉形，導致在ETIP基因組位點中之鋅指核酸酶致供體DNA構建體嵌入，重組頻率為該~50,000個油菜原生質體細胞之約0.04%。實際上，該重組頻率高更多。在轉染實驗中提供之該~50,000個的油菜原生質體細胞中，只有此等細胞之約10-30%實際被轉染。因此，實際之在ETIP基因組位點中之鋅指核酸酶致供體DNA構建體嵌入的轉染效率範圍約為0.34-0.11%。該鋅指 致同源直接修復之結果顯著地大於陰性控制實驗，其中~50,000個原生質體之中只有1個被辨識具有紅色螢光，因此獲得圖20所示之0.00%重組頻率。

圖24顯示該供體質體及ZFN質體被共-轉形之轉染結果。在上方之圖，其中供體(pDAS000072)及該鋅指核酸酶(pDAS000074)於28μg對2μg之質體DNA之比例下被共-轉形，導致在ETIP基因組位點中之鋅指核酸酶致供體DNA構建體嵌入，重組頻率為該~50,000個油菜原生質體細胞之約0.07%。實際上，該重組頻率高更多。在轉染實驗中提供之該~50,000個的油菜原生質體細胞中，只有此等油菜原生質體細胞之約10-30%實際被轉形。因此，實際之在ETIP基因組位點中之鋅指核酸酶致供體DNA構建體嵌入的轉染效率範圍約為0.62-0.2%。同樣在下方之圖，其中供體(pDAS000072)及該鋅指核酸酶(pDAS000075)係於28μg對2μg之質體DNA之比例下被共-轉形，導致在ETIP基因組位點中之鋅指核酸酶致供體DNA構建體嵌入，重組頻率為該~50,000個油菜原生質體細胞之約0.05%。實際上，該重組頻率高更多。在轉染實驗中提供之該~50,000個的油菜原生質體細胞中，只有此等細胞之約10-30%實際被轉染。因此，實際之在ETIP基因組位點中之鋅指核酸酶致供體DNA構建體嵌入的轉染效率範圍約為0.44-0.14%。該鋅指致同源直接修復之結果顯著地大於陰性控制實驗，其中~50,000個原生質體之中只有1個被辨識具有紅色螢光，因此獲得圖20所示之0.00%重組頻率。

該FACS分選方法可直接實施用來篩選任何螢光轉殖基因序列，且被使用來分離利用螢光轉殖基因藉同源重組修復基因組位點中ETIP區特定位以螢光轉殖基因標定之原生質體之一部分。

實施例8：額外之ETIP設計

建構植物轉形載體

藉標準分子選殖方法建構Gateway®(INVITROGEN)入們(entry)及目的(destination)載體，其被用來製造最後表現載體。入門載體(pDAB105852)包括一RB7 MAR序列(Hall et al.,1991)及eZFN4結合位v1(U.S.Patent Publication No.20110191899，其整體被併入本文作參考)。另一入門載體(pDAB105853)包括表現卡匣，其包括稻米泛蛋白3(OsUbi3)啟動子(Sivamani,E.,Qu,R.,(2006)Plant Molecular Biology 60；225-239)，黃螢光蛋白(Phi YFP)標記基因編碼區(Shagin,D.A.,(2004)Mol Biol Evol. 21；841-50)(Evrogen,Moscow Russia)含ST-LS1(Vancanneyt,G.,(1990)Mol Gen Genet. 220；245-50)內含子，其後為一包括有來自玉米過氧化酶5基因(ZmPer5 3'UTR v2；U.S.Patent No.6,699,984)、éZFN1結合位及經工程處理之降落坪(ELP1 HR2 v2)之3’非轉譯區(UTR)之片段(U.S.Patent Publication No.20110191899)。另一入門載體(pDAB105850)包括一Cry34Ab1蛋白編碼區(U.S.Patent No.8,273,535)，其在具內含子1之玉米泛蛋白1啟動子之複製之表現控制下(ZmUbi1 promoter v8)(Christensen,A.H.,Quail,P.H.,(1996) Transgenic Research 5；213-218；Christensen,A.H.,(1992)Plant Molecular Biology 18；675-689)，以及一包括來自馬鈴薯之StPinII 3'UTR的片段(An,G.,(1989)Plant Cell.1；115-22)。一額外之入門載體(pDAB105851)包括小麥過氧化酶(TaPer)啟甕子(Hertig,C.,(1991)Plant Mol Biol. 16；171-4)及Cry35Ab1(U.S.Patent Publication No.20110191899)蛋白編碼區，其後為包括來自馬鈴薯之StPinII 3'UTR之片段。

藉由使用標準選殖方法及採用典型目的二元載體(pDAB109805)及上述目的載體之Gateway®重組反應，來建構用於農桿菌介導玉米胚轉形之轉形/表現載體。二元目的載體pDAB109805包括一殺草劑耐受性基因(aryloxyalknoate dioxygenase(AAD-1)；(U.S.Patent No.7,838,733)，其係在甘蔗桿狀病毒(SCBV)啟動子的表現控制下；基本上如U.S.Patent No.6,093,569所述。一包括來自玉米脂酶基因3'UTR之片段(ZmLip 3'UTR,U.S.Patent No.7,179,902)係被使用來終止AAD-1 mRNA之轉錄。AAD-1的表現賦予對殺草化合物(例如氟吡禾靈(haloxyfop)和喹禾靈(quizalofop))之耐受性。該Gateway®重組反應係被使用將入門載體pDAB105852、pDAB105853、pDAB105850和pDAB105851與目的載體pDAB109805再結合(recombine)，以獲得被使用作為標的載體之表現載體pDAB105855(圖36)。該ETIP質體pDAB105855包含標的DNA序列，其包括RB7 MAR序列/eZFN4結合位v1、OsUbi3啟動子/Phi YFP/ ZmPer5 3'UTR v2/eZFN1結合位/ELP1 HR2 v2、ZmUbi1啟動子v8/Cry34Ab1 v2/StPinII 3' UTR v2、TaPer啟動子v3/Cry35Ab1 v5/StPinII 3' UTR v2、SCBVv2/AAD-1v3/ZmLip 3' UTR介於T-DNA邊緣之間。該pDAB105855質體係一ETIP質體，且被使用來整合在玉米基因體。

該鋅指核酸酶(ZFN1)載體(pDAB105941；圖37)包括一ZFN1編碼序列，在帶有內含子之玉米泛蛋白1啟動子(ZmUbi1 promoter v2)及ZmPer5 3'UTR v2之表現下。該供體載體(pDAB112366；Figure 38)包含稻米泛蛋白3(OsUbi3)啟動子之無啟動子內含子(rubi3內含子)，其後為一殺草劑耐受性基因(phosphinothricin acetyl transferase(PAT)；Wehrmannet al. (1996)Nature Biotechnology 14：1274-1278)，及ZmLip 3'UTR。此不具啟動子之供體配置不會產生供殺草劑選擇之PAT基因訊息。該供體載體中之ZmLip 3'UTR in donor vector之後為eZFN4及eZFN8結合位，及ELP1 HR2 v2(如U.S.Patent Publication No.20110191899所述)。該供體(pDAB112366)中之5’rubi3內含子及3’ELP1 HR2 v2序列係被用來基因標定標的(pDAB105855)之5’及3’同源性，以精確地以供體之PAT序列取代標的之Phi YFP序列，造成以稻米泛蛋白3(OsUbi3)啟動子驅動之功能性PAT製造基因標定之陽性選擇。

建構一陽性PAT控制載體(pDAB112364)包括驅動殺草劑耐受性基因(phosphinothricin acetyl transferase(PAT)之稻米泛蛋白3(OsUbi3)啟動子而其後為ZmLip 3'UTR，且在之後的實驗中使用。

轉形農桿腫瘤菌(Agrobacterium tumefaciens )

將二元表現載體轉形入農桿腫瘤菌(Agrobacterium tumefaciens) 品系DAt13192三元(ternary)(International Pat.Pub.No.WO 2012016222)。分離菌落，分離並藉限制酶酶切確認二元載體。

農桿菌介導之轉形

農桿菌介導之轉形係被使用來穩定整合上述轉殖基因到植物基因體中，因此產生產生AAD-1之基因轉殖玉米細胞、組織及植物。本領域已知採用超級二元(superbinary)或二元轉形載體之玉米轉形方法，例如在International PCT Publication No.WO2010/120452所描述者。篩選轉形組織，藉其在含haloxyfop或雙丙氨磷(Bialaphos)之培養基中生長的能力。

農桿菌培養之開始

農桿腫瘤菌(Agrobacterium tumefaciens) 主系DAt13192(WO 2012/016222A2)提供方案(project)載體之甘油原種(stock)。由甘油原種在AB基本培養基上以畫線培養農桿菌，含適當抗生素，在黒暗中保持在20℃下3天。以畫線培養在YEP培養基上，使用抗生素，在黑暗中保持在20℃下1天。

實驗第一天，製備對於實驗之建構數適當量之接種培養基之混合物及acetosyringone(Frameet al. (2011)Methods in Molecular Biology 710：327-341)，以定量吸管轉 入經消毒之可拋棄式250mL培養瓶(flask)。接種培養基包含：2.2gm/L MS鹽；1X ISU改良MS維生素(Frameet al. ,ibid. )68.4gm/L蔗糖；36gm/L葡萄糖；115mg/L L-脯氨酸；及100mg/L myo-inositol；於pH 5.4。)將Acetosyringone加入到含接種培養基之培養瓶中，達到最終濃度200μM，由1M原液，100%二甲基亞碸。

對各建構體，1或2個滿是來自YEP盤之農桿菌之接種環在經消毒之可拋棄式50mL離心管中之15mL接種培養基/acetosyringone混合物中懸浮，在分光光度計中測量液體於550nm(OD₅₅₀ )之光學密度。將該懸浮物稀釋到OD₅₅₀ 為0.3至0.4，使用額外之接種培養基/acetosyringone混合物。該管之農桿菌懸浮液被水平放置在一平台搖晃器，設定在約75rpm，在使用前於室溫下搖晃1至4小時。

穗之消毒和胚之分離

在溫室產生玉米品種B104之穗，授粉後10至12天收穫。收穫之穗被去殼及藉浸在20%商用漂白水中表面消毒(Ultra Clorox® Germicidal Bleach,6.15%次氯酸鈉；加二滴TWEEN 20)20分鐘，然後在層流罩中以無菌去離子水清洗三次。未成熟合子型胚(1.8 to 2.2mm長)在無菌條件下自各穗切除，分散到一或多個加有2μL之10% BREAK-THRU® S233表面活性劑(Evonik Industries；Essen,Germany)之含2.0mL農桿菌懸浮液的微量離心管中。

農桿菌共培養

分離之後，將胚置於晃動平台5分鐘。將管的內容物倒入共培養基質之盤中，其包含：4.33gm/L MS鹽；1X ISU改良MS維生素；30gm/L蔗糖；700mg/L L-脯氨酸；3.3mg/L溶於KOH中之麥草畏(Dicamba)(3,6-二氯-o-大茴香酸或3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸)；100mg/L myo-肌醇；100mg/L酪蛋白酶水解產物；15mg/L AgNO₃ ；200μM溶於DMSO之乙醯丁香酮(acetosyringone)；及3gm/L洋菜(SIGMA-ALDRICH，經測試之植物細胞培養)；於pH 5.8。。以無菌之可拋棄式移液管除去該農桿菌懸浮液，將含有胚之共培養盤置於層流罩之後段，蓋子半開30分鐘，此後用無菌鑷子在顯微鏡的輔助下將胚定向成胚盤(scutellum)朝上。將該等盤放重層流罩之後段，蓋子半開15分鐘。關閉該盤，以3M^TM Micropore^TM 醫療膠帶密封，放置在約60μEm^-2 sec^-1 光強度之持續光線的25℃恆溫箱中。

癒傷組織的選擇和再生基因轉殖品件

在該共培養期間之後，將胚移到休眠培養基(Resting Medium)，其包括：4.33gm/L MS鹽；1X ISU改良MS維生素；30gm/L蔗糖；700mg/L L-脯氨酸；3.3mg/L溶於KOH中之麥草畏(Dicamba)；100mg/L myo-肌醇；100mg/L酪蛋白酶水解產物；15mg/L AgNO₃ ；0.5gm/L MES(2-(N-嗎啉基)乙磺酸單水合物；PhytoTechnologies Labr.；Lenexa,KS)；250mg/L西弗士林(cefotaxime)；及7.0gm/L洋菜；於pH 5.8。。不超過36胚胎被轉移到各盤。以Micropore^TM 膠帶纏繞，保溫在27℃，在約50μmol m-2 s-1 光強度之持續光線下7至10天。有癒合組織之胚(<18/盤)被移到選擇培養基I上，其包括休眠培養基(如上)但只有6.5gm/L洋菜，以及適當之100nM R-吡酸(0.0362mg/L；供選擇含AAD-1基因之轉形體)或5.0mg/L雙丙氨磷(Bialaphos)(供選擇含PAT基因之轉形體)。提供Herbiace®之雙丙氨磷。以Micropore^TM 膠帶纏繞，保溫在27℃，在約50μEm^-2 sec^-1 光強度之持續光線下7天。有癒合組織之胚(<12/盤)被移到選擇培養基II上，其包括休眠培養基(如上)但只有6.5gm/L洋菜，以及適當之50nM R-吡酸(0.0181mg/L)或5.0mg/L雙丙氨磷。纏繞該盤，保溫在27℃，在約50μEm^-2 sec^-1 光強度之持續光線下14天。

在此階段，具抗性之癒傷組織(<9/盤)被移到Pre-再生培養基中。Pre-再生培養基含有4.33gm/L MS鹽；salts；1X ISU改良MS維生素；45gm/L蔗糖；350mg/L L-脯氨酸；100mg/L myo-肌醇；50mg/L酪蛋白酶水解產物；1.0mg/L AgNO₃ ；0.5gm/L MES；0.5mg/L萘乙酸(naphthaleneacetic acid)in NaOH；2.5mg/L離層酸in ethanol；1mg/L 6-芐氨基嘌呤；250mg/L西弗士林(cefotaxime)；5.5gm/L洋菜；及如適當的話50nM R-吡酸或3.0mg/L雙丙氨磷(Bialaphos)，於pH 5.8。纏繞該盤，保溫在27℃，在約50μEm^-2 sec^-1 光強度之持續光線下7天。再生癒傷組織(<6/盤)被移到Phytatrays^TM (sigma-aldrich)再生培養基中，保溫在28℃，每一天16小時光/8小時暗，約150μmol m-2 s-1光強度14天或直到芽(shoot)生長。再生培養基包含4.33gm/L MS鹽； 1X ISU改良MS維生素；60gm/L蔗糖；0.50gm/L MES；125mg/L西弗士林(cefotaxime)；5.5gm/L洋菜；及50nM R-吡酸或3.0mg/L雙丙氨磷(Bialaphos)，如適當的話；於pH 5.8。具初根(root)之小芽(shoot)被分離及移到不具選擇性之伸展培養基(Elongation Medium)(即不具R-吡酸或雙丙氨磷(Bialaphos)之再生培養基)供進一步生長。約6cm或更高之具根之植體(Rooted苗)被移植到土壤中，移到生長箱供強化。

將T₀ 植物移到溫室中並於其中成長，以供分析和產生種子。

將藉含有適當之Haloxyfop或雙丙氨磷(Bialaphos)之培養基中生長的能力來選擇出的轉形植物組織由Phytatrays^TM 移植到填有生長培養基(ProMix BX；Premier Tech Horticulture)之小罐(T.O.Plastics,3.5”SVD)，以humidomes(Arco Plastics Ltd.)覆蓋，然後在生長室中強化(28℃日/24℃夜，16-小時光週期，50-70% RH，200μEm^-2 sec^-1 光強度)。當植物達到V3-V4階段，將他們移植到Sunshine Custom Blend 160土壤混合物，在溫室中生長到開花(曝光類型：Photo或Assimilation；高光限：1200 PAR；16-小時日長：27℃日/24℃夜)。將潛在之基因轉殖苗用於分析轉殖因基複製份數，藉即時聚合酶鏈式反應分析，使用設計用來偵測該轉殖基因之相關複製份數的因子，且用於提升之單一複製份數品件被移植到5加侖罐。定期觀察追蹤任何不正常的表現型。

於溫室中產生用於粒子轟擊之T1S1半合子未成熟胚

二個以目標序列基因轉殖之植物係經自體授粉以獲得T1種子。該T1種子被種植且使用qPCR方法來分析植物之該目標轉殖基因之合子型式(zygosity)。使轉殖基因同型合子之該植物進一步產生花粉。該同型合子目標植物之花粉被使用來回交(backcross)B104玉米植物，以獲得T1S1半合子未成熟胚。以供體及ZFN1 DNA粒子轟擊該未成熟胚，以測試基因標定。

藉微粒子轟擊標定玉米未成熟胚

在微粒子轟擊之三天前，由表面無菌之穗分離1.5-2.2mm之胚，將其置放(胚盤向上)在N6基礎培養基及維生素(Phytotechnology Laboratories,Shawnee Mission,KS)，含2.0mg/L 2,4-D,2.8g/L脯氨酸，30g/L蔗糖，100mg/L酪蛋白酶水解產物，100mg/L myo-肌醇及4.25mg/L以2.5g/L Gelzan固化之硝酸銀(Phytotechnology Laboratories,Shawnee Mission,KS)。微粒子轟擊之四小時前，~35-40個胚被置放(胚盤向上)在100 x 15mm培養皿之中央，其含有相同之培養基，另含36.4g/L山梨糖醇及36.4g/L甘露醇。

製備金之微粒(0.6微米，BioRad,Hercules,CA,)供用於DNA沉澱，稱取15mg裝入無菌矽化之1.7mL微量離心管(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,T3406)，緩慢加入500μL冰冷之100%乙醇。在一FS-14超音波震盪水浴(Fisher Scientific,Nazareth,PA)中超音波震盪15秒後，使該金在使用MiniSpin(Eppendorf,Hauppauge,NY)以3,000rpme離心60秒之前，在室溫下靜置30分鐘。去除上清液之後，加入1mL冰冷無菌水，上下移液(pipetting)混合，在以3,000離心60秒之前靜置3-5分鐘。在以500μL冰冷無菌水懸浮該金之前，再重複該洗淨步驟一次。該洗淨之金被分裝到各1.7mL無菌矽化之微量離心管(每管50μL)，小心地以定量吸管使各管之金充分上下移液。該洗淨之金(每50μL~1.5mg)被儲存在-20℃中直到需要被使用。

供DNA沉澱，在50μL水中有~1.5mg金之管被解凍供10個將被轟擊之目標，並在超音波水浴中超音波震盪15秒，然後置於冰上。質體DNA(0.6μg ZFN+4.4μg供體)被預混合在0.6mL微量離心管(Fisher Scientific,Nazareth,PA)中，被加入到該金之懸浮，輕輕上下移液數次以充分混合。50微升(50μL)冰冷的2.5M氯化鈣被加入並輕輕上下移液數次混合。然後加入20微升(20μL)冷的0.1M精三胺，並輕輕上下移液數次混合。然後將該管加蓋，置於一Vortex Genie 2(Scientific Instruments Inc.,Bohemia,NY)以混合(設定在‘shake 2’)10分鐘，之後使混合物靜置3-5分鐘。在以5,000rpm離心15秒後，小心地移除上清液，加入250μL冰冷的100%乙醇，將管加蓋，用手大力混合以使片狀沉澱物離開原位。在以5,000rpm第二次離心15秒後，加入120μL冰冷的100%乙醇，將管加蓋，用手大力混合以使片狀沉澱物離開原位。

供微粒子轟擊，無菌之巨載體(macrocarriers)(BioRad,Hercules,CA)被裝入不銹鋼容器(BioRad,Hercules,CA)並被高壓滅菌。10微升(10μL)金/DNA懸浮被平均地分佈在該巨載體之中央，上下移液數次混合以確保充分混合，然後置於一片無菌之125mm Whatman #4濾紙(GE Healthcare,Buckinghamshire,UK)，在140 x 25mm玻璃皿之8-mesh Drierite床(W.A Hammond Drierite Co.,Xenia,OH)。完整乾燥該金/DNA 10分鐘。以浸在二甲基甲醇數分鐘來消毒備裂盤(Rupture discs)(650psi,BioRad,Hercules,CA)，然後裝入微粒子轟擊裝置之護帽(retaining cap)(PDS-1000,BioRad,Hercules,CA)。一高壓滅菌停止屏(autoclaved stopping screen)(BioRad,Hercules,CA)及一裝入之巨載體被置於發射總成，該蓋(lid)被旋上(screwed on)，滑進在噴嘴下之發射室(bombardment chamber)。含屏蓋(screen-covered)、葉標(leaf target)之培養皿被揭開，置於噴嘴下6cm之發射室。抽成真空(-0.9bar)然後擊發裝置。

隔天(轟擊後16-20小時)，被轟擊的胚被移(胚盤向上)到N6基礎培養基及維生素(Phytotechnology Laboratories,Shawnee Mission,KS)，含2.0mg/L 2,4-D,2.8g/L脯氨酸，30g/L蔗糖，100mg/L酪蛋白酶水解產物，100mg/L myo-肌醇。

使用陽性PAT控制載體((pDAB112364))供用於粒子轟擊之PAT的最佳化

PAT控制載體(pDAB112364)係被使用來標準化 用於粒子轟擊玉米胚之組織陪養條件。為了潛在背景選擇，使用或不使用ZFN1載體(pDAB105941)來測試該供體載體。如表25所示，使用PAT控制載體(pDAB112364)之轉形率為9%。此資料顯示稻米之泛蛋白3(OsUbi3)啟動子驅動PAT基因的強大表現，使用粒子轟擊玉米B104未成熟胚以獲得植物轉形之選擇。在PAT選擇培養基上獲得極少數(1-2)之植物經轟擊之未成熟胚，使用有或沒有ZFN1載體之(pDAB105941)供體載體(pDAB112366)。此等結果確認不具上游啟動子之含rubi3內含子的供體載體(pDAB112366)沒有提供PAT基因之轉形選擇。

為基因標定而使用供體及ZFN1之轉殖基因標定pDAB105855對未成熟胚粒子轟擊

標定pDAB105855之未成熟玉米胚半合子係被處理以供粒子轟擊，使用ZFN1及供體DNA預混合(premix)(pDAB105941/112366)以獲得基因標定，使用陽性PAT選擇。表17顯示目標品件及被使用在各品件之胚數。各目標品件成功再生在PAT選擇培養基之植物數亦顯示在表26。總共有68個植物由13,563個涵蓋所有品件之經處理之未成熟胚被再生。由PAT選擇培養基獲得之少量植物說明大多數之非標 定隨機PAT供體插入被淘汰。

PCR分析標定ETIP之基因

進行QPCR以偵測共68個植物中之67個植物之YFP及PAT編碼序列，該68個植物係在PAT選擇培養基中被再生。在表27中概述此結果。如表27所指，50個植物使用qPCR分析後被發現係PAT陽性，而有24個植物對YFP編碼序列為陰性。該資料建議有17個由PAT選擇之植物為逃脫者(escapes)，且至少在24個植物中ZFN1表現中斷了目標位之YFP。

對24個YFP陰性品件進行進一步之診斷In/Out PCR，以測量標定5’In/Out PCR之基因，使用鏈合至OsUbi3啟動子之目標DNA-特異性5’寡核苷酸(oligo)及鏈合至PAT編碼序列之供體DNA-特異性3’寡核苷酸(oligo)以獲得預期之1838bp PCR產物。該預期之PCR產物將支持精確基因標定5’之目標位。該PCR結果確認了該預期之1838bp產物在21個品件中被擴增。

進行相似之3’In/Out PCR。該方法使用鏈合至ZmUbi1啟動子序列之供體DNA-特異性5’寡核苷酸(oligo)及鏈合至PAT編碼序列之供體DNA-特異性3’寡核苷酸(oligo)以獲得預期之2184bp PCR產物。該預期之PCR產物將支持精確基因標定3’之目標位。該PCR結果確認了該預期之2184bp產物在16個品件中被擴增。

表28概述了目標位點之5’及3’之In/Out PCR資料。該資料顯示15個品件導致預期之PCR產物，其指示佔總PAT陽性再生植物約30%基因標定率。

南方分析基因標定

使用南方墨點分析使目標品件特徵化，顯示event#12中目標轉基因的截斷。以南方墨點法來分析總共12個品件。該資料確認在5個植物中確定預期之帶型(3個為event#12及2個為其他品件)。此等結果指出ETIP曾被整合到基因體之構建體隨後可以供體序列再標定，並且該ETIP可作為標定平台。圖39提供了一個使用被整合在基因體中之ETIP位示意圖，其標定含基因表現卡匣之供體多核苷酸。如該示意圖所示，如果整合發生在ETIP位點內，該供體可以表現轉殖基因。隨機整合供體多核苷酸不會導致轉殖基因之表現，因為沒有能驅動表現之啟動子元件，當該供體多核苷酸隨機地整合到基因組中。標定ETIP位內之供體導致可被偵測或選擇之功能性標記基因。

雖然本文描述某些例示性之具體實施例，習於此藝者將能認識並理解到，可對該等例示性之具體實施例在不背離以下請求項之範圍內進行增加、減少及修飾。此外，一具體實施例之特徵可與另一具體實施例之特徵組合。

<110> 陶氏農業科學公司

<120> 用於基因標定及性狀疊加之經工程處理的轉殖基因整合平台(ETIP)

<130> 2971-11112.1US(72289-US-NP)

<160> 480

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 47493

<212> DNA

<213> 西洋油菜(Brassica napus)

<400> 1

<210> 2

<211> 40174

<212> DNA

<213> 西洋油菜(Brassica napus)

<400> 2

<210> 3

<211> 28527

<212> DNA

<213> 西洋油菜(Brassica napus)

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<212> DNA

<213> 西洋油菜(Brassica napus)

<400> 4

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<212> DNA

<213> 西洋油菜(Brassica napus)

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<212> DNA

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<213> 西洋油菜(Brassica napus)

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<212> DNA

<213> 西洋油菜(Brassica napus)

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<212> DNA

<213> 西洋油菜(Brassica napus)

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<212> DNA

<213> 西洋油菜(Brassica napus)

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<212> DNA

<213> 西洋油菜(Brassica napus)

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<212> DNA

<213> 西洋油菜(Brassica napus)

<220>

<221> misc_feature

<222> (27461)..(27461)

<223> n is a,c,g,or t

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<222> (27463)..(27463)

<223> n is a,c,g,or t

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<222> (27470)..(27470)

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<400> 12

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<212> DNA

<213> 西洋油菜(Brassica napus)

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<212> DNA

<213> 西洋油菜(Brassica napus)

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<212> DNA

<213> 西洋油菜(Brassica napus)

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 西洋油菜(Brassica napus)

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 西洋油菜(Brassica napus)

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> D_uni_F3_F1引子序列

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<213> 人工序列

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<223> D_spec_F3_F2引子序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> D_spec_F3_F3引子序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> D_uni_F3_R1引子序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> D_spec_F3_R2引子序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> D_spec_F3_R3引子序列

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<213> 人工序列

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<223> D_UnivF2_F1引子序列

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> D_UnivF2_R1引子序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> D_UnivF2_R2引子序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> D_SpecificF2_F3引子序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> D_SpecificF2_R3引子序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> D_UnivF2_F4引子序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 28035 ZFP目標位

<400> 56

<210> 57

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 28036 ZFP目標位

<400> 57

<210> 58

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 28039 ZFP目標位

<400> 58

<210> 59

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 28040 ZFP目標位

<400> 59

<210> 60

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 28051 ZFP目標位

<400> 60

<210> 61

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 28052 ZFP目標位

<400> 61

<210> 62

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 28053 ZFP目標位

<400> 62

<210> 63

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 28054 ZFP目標位

<400> 63

<210> 64

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 28055 ZFP目標位

<400> 64

<210> 65

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 28056 ZFP目標位

<400> 65

<210> 66

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 24800 ZFP目標位

<400> 66

<210> 67

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 24801 ZFP目標位

<400> 67

<210> 68

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 24794 ZFP目標位

<400> 68

<210> 69

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 24795 ZFP目標位

<400> 69

<210> 70

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 24810 ZFP目標位

<400> 70

<210> 71

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 24811 ZFP目標位

<400> 71

<210> 72

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 24814 ZFP目標位

<400> 72

<210> 73

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 24815 ZFP目標位

<400> 73

<210> 74

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 24818 ZFP目標位

<400> 74

<210> 75

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 24819 ZFP目標位

<400> 75

<210> 76

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 24796 ZFP目標位

<400> 76

<210> 77

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 24797 ZFP目標位

<400> 77

<210> 78

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 24836 ZFP目標位

<400> 78

<210> 79

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 24837 ZFP目標位

<400> 79

<210> 80

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 24844 ZFP目標位

<400> 80

<210> 81

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 24845 ZFP目標位

<400> 81

<210> 82

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 24820 ZFP目標位

<400> 82

<210> 83

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 24821 ZFP目標位

<400> 83

<210> 84

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 24828 ZFP目標位

<400> 84

<210> 85

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 24829 ZFP目標位

<400> 85

<210> 86

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 24832 ZFP目標位

<400> 86

<210> 87

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 24833 ZFP目標位

<400> 87

<210> 88

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD2_ZFN_Locus1_F PCR引子

<400> 88

<210> 89

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD2_ZFN_Locus1_F2A PCR引子

<400> 89

<210> 90

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD2_ZFN_Locus1_F2B PCR引子

<400> 90

<210> 91

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD2_ZFN_Locus1_F2C PCR引子

<400> 91

<210> 92

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD2_ZFN_Locus2_F1D PCR引子

<400> 92

<210> 93

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD2_ZFN_Locus2_F1E PCR引子

<400> 93

<210> 94

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD2_ZFN_Locus3_F2F PCR引子

<400> 94

<210> 95

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD2_ZFN_Locus3_F2G PCR引子

<400> 95

<210> 96

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD2_ZFN_Locus3_F2H PCR引子

<400> 96

<210> 97

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD2_ZFN_Locus4_F1J PCR引子

<400> 97

<210> 98

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD2_ZFN_Locus4_F1K PCR引子

<400> 98

<210> 99

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD2_ZFN_Locus5_F1L PCR引子

<400> 99

<210> 100

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD2_ZFN_Locus1_R1A PCR引子

<400> 100

<210> 101

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD2_ZFN_Locus1_R1B PCR引子

<400> 101

<210> 102

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD2_ZFN_Locus1_R1C PCR引子

<400> 102

<210> 103

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD2_ZFN_Locus2_R1D PCR引子

<400> 103

<210> 104

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD2_ZFN_Locus2_R1E PCR引子

<400> 104

<210> 105

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD2_ZFN_Locus3_R1F PCR引子

<400> 105

<210> 106

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD2_ZFN_Locus3_R1G PCR引子

<400> 106

<210> 107

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD2_ZFN_Locus3_R1H PCR引子

<400> 107

<210> 108

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD2_ZFN_Locus4_R1J PCR引子

<400> 108

<210> 109

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD2_ZFN_Locus4_R1K PCR引子

<400> 109

<210> 110

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD2_ZFN_Locus5_R1L PCR引子

<400> 110

<210> 111

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD3_ZFN_Locus1A_F3 PCR引子

<400> 111

<210> 112

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD3_ZFN_Locus1B_F3 PCR引子

<400> 112

<210> 113

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD3_ZFN_Locus2C_F1 PCR引子

<400> 113

<210> 114

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD3_ZFN_Locus3D_F1 PCR引子

<400> 114

<210> 115

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD3_ZFN_Locus3E_F1 PCR引子

<400> 115

<210> 116

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD3_ZFN_Locus3F_F1 PCR引子

<400> 116

<210> 117

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD3_ZFN_Locus4G_F1 PCR引子

<400> 117

<210> 118

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD3_ZFN_Locus4H_F1 PCR引子

<400> 118

<210> 119

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD3_ZFN_Locus5J_F1 PCR引子

<400> 119

<210> 120

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD3_ZFN_Locus6K_F1 PCR引子

<400> 120

<210> 121

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD3_ZFN_Locus6L_F1 PCR引子

<400> 121

<210> 122

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD3_ZFN_Locus6M_F1 PCR引子

<400> 122

<210> 123

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD3_ZFN_Locus6N_F1 PCR引子

<400> 123

<210> 124

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD3_ZFN_Locus7P_F3 PCR引子

<400> 124

<210> 125

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD3_ZFN_Locus7Q_F3 PCR引子

<400> 125

<210> 126

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD3_ZFN_Locus1A_R1 PCR引子

<400> 126

<210> 127

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD3_ZFN_Locus1B_R1 PCR引子

<400> 127

<210> 128

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD3_ZFN_Locus2C_R1 PCR引子

<400> 128

<210> 129

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD3_ZFN_Locus3D_R1 PCR引子

<400> 129

<210> 130

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD3_ZFN_Locus3E_R1 PCR引子

<400> 130

<210> 131

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD3_ZFN_Locus3F_R1 PCR引子

<400> 131

<210> 132

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD3_ZFN_Locus4G_R_uni PCR引子

<400> 132

<210> 133

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD3_ZFN_Locus4H_R_uni PCR引子

<400> 133

<210> 134

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD3_ZFN_Locus5J_R2 PCR引子

<400> 134

<210> 135

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD3_ZFN_Locus6K_R1 PCR引子

<400> 135

<210> 136

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD3_ZFN_Locus6L_R1 PCR引子

<400> 136

<210> 137

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD3_ZFN_Locus6M_R1 PCR引子

<400> 137

<210> 138

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD3_ZFN_Locus6N_R1 PCR引子

<400> 138

<210> 139

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD3_ZFN_Locus7P_R1 PCR引子

<400> 139

<210> 140

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAD3_ZFN_Locus7Q_R1 PCR引子

<400> 140

<210> 141

<211> 13472

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pDAS000130之T鏈插入區

<400> 141

<210> 142

<211> 13462

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pDAS000271之T鏈插入區

<400> 142

<210> 143

<211> 13462

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pDAS000272之T鏈插入區

<400> 143

<210> 144

<211> 13462

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pDAS000273之T鏈插入區

<400> 144

<210> 145

<211> 13462

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pDAS000274之T鏈插入區

<400> 145

<210> 146

<211> 13462

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pDAS000275之T鏈插入區

<400> 146

<210> 147

<211> 5521

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pDAS000031之T鏈插入區

<400> 147

<210> 148

<211> 11708

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pDAS000036之T鏈插入區

<400> 148

<210> 149

<211> 11707

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pDAS000037之T鏈插入區

<400> 149

<210> 150

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pTiC58前置PCR引子

<400> 150

<210> 151

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pTiC58反置PCR引子

<400> 151

<210> 152

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 肌動蛋白 前置PCR引子

<400> 152

<210> 153

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 肌動蛋白 反置PCR引子

<400> 153

<210> 154

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HPH前置PCR引子

<400> 154

<210> 155

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HPH反置PCR引子

<400> 155

<210> 156

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1F PCR引子

<400> 156

<210> 157

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1R PCR引子

<400> 157

<210> 158

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2F PCR引子

<400> 158

<210> 159

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2R PCR引子

<400> 159

<210> 160

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 3F PCR引子

<400> 160

<210> 161

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 3R PCR引子

<400> 161

<210> 162

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 4F PCR引子

<400> 162

<210> 163

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 4R PCR引子

<400> 163

<210> 164

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 5F PCR引子

<400> 164

<210> 165

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 5R PCR引子

<400> 165

<210> 166

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IPT-F PCR引子

<400> 166

<210> 167

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IPT-R PCR引子

<400> 167

<210> 168

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dsRED-F PCR引子

<400> 168

<210> 169

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dsRED-R PCR引子

<400> 169

<210> 170

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PAT-F PCR引子

<400> 170

<210> 171

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PAT-R PCR引子

<400> 171

<210> 172

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ELP-F PCR引子

<400> 172

<210> 173

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ELP-R PCR引子

<400> 173

<210> 174

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Hph-F PCR引子

<400> 174

<210> 175

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Hph-R PCR引子

<400> 175

<210> 176

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 肌動蛋白-F PCR引子

<400> 176

<210> 177

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 肌動蛋白-R PCR引子

<400> 177

<210> 178

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27961指1

<400> 178

<210> 179

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27961指2

<400> 179

<210> 180

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27961指3

<400> 180

<210> 181

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27961指4

<400> 181

<210> 182

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27961指5

<400> 182

<210> 183

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27961指6

<400> 183

<210> 184

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27962指1

<400> 184

<210> 185

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27962指2

<400> 185

<210> 186

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27962指3

<400> 186

<210> 187

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27962指4

<400> 187

<210> 188

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27962指5

<400> 188

<210> 189

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27973指1

<400> 189

<210> 190

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27973指2

<400> 190

<210> 191

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27973指3

<400> 191

<210> 192

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27973指4

<400> 192

<210> 193

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27973指5

<400> 193

<210> 194

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27973指6

<400> 194

<210> 195

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27974指1

<400> 195

<210> 196

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27974指2

<400> 196

<210> 197

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27974指3

<400> 197

<210> 198

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27974指4

<400> 198

<210> 199

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27974指5

<400> 199

<210> 200

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27974指6

<400> 200

<210> 201

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27987指1

<400> 201

<210> 202

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27987指2

<400> 202

<210> 203

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27987指3

<400> 203

<210> 204

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27987指4

<400> 204

<210> 205

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27987指5

<400> 205

<210> 206

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27990指1

<400> 206

<210> 207

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27990指2

<400> 207

<210> 208

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27990指3

<400> 208

<210> 209

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27990指4

<400> 209

<210> 210

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27990指5

<400> 210

<210> 211

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27990指6

<400> 211

<210> 212

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27991指1

<400> 212

<210> 213

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27991指2

<400> 213

<210> 214

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27991指3

<400> 214

<210> 215

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27991指4

<400> 215

<210> 216

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27991指5

<400> 216

<210> 217

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27992指1

<400> 217

<210> 218

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27992指2

<400> 218

<210> 219

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27992指3

<400> 219

<210> 220

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27992指4

<400> 220

<210> 221

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27992指5

<400> 221

<210> 222

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28004指1

<400> 222

<210> 223

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28004指2

<400> 223

<210> 224

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28004指3

<400> 224

<210> 225

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28004指4

<400> 225

<210> 226

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28004指5

<400> 226

<210> 227

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28004指6

<400> 227

<210> 228

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28005指1

<400> 228

<210> 229

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28005指2

<400> 229

<210> 230

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28005指3

<400> 230

<210> 231

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28005指4

<400> 231

<210> 232

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28005指5

<400> 232

<210> 233

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28021指1

<400> 233

<210> 234

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28021指2

<400> 234

<210> 235

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28021指3

<400> 235

<210> 236

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28021指4

<400> 236

<210> 237

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28021指5

<400> 237

<210> 238

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28022指1

<400> 238

<210> 239

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28022指2

<400> 239

<210> 240

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28022指3

<400> 240

<210> 241

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28022指4

<400> 241

<210> 242

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28022指5

<400> 242

<210> 243

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28023指1

<400> 243

<210> 244

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28023指2

<400> 244

<210> 245

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28023指3

<400> 245

<210> 246

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28023指4

<400> 246

<210> 247

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28023指5

<400> 247

<210> 248

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28024指1

<400> 248

<210> 249

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28024指2

<400> 249

<210> 250

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28024指3

<400> 250

<210> 251

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28024指4

<400> 251

<210> 252

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28024指5

<400> 252

<210> 253

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28025指1

<400> 253

<210> 254

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28025指2

<400> 254

<210> 255

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28025指3

<400> 255

<210> 256

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28025指4

<400> 256

<210> 257

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28025指5

<400> 257

<210> 258

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28025指6

<400> 258

<210> 259

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28026指1

<400> 259

<210> 260

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28026指2

<400> 260

<210> 261

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28026指3

<400> 261

<210> 262

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28026指4

<400> 262

<210> 263

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28026指5

<400> 263

<210> 264

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28035指1

<400> 264

<210> 265

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28035指2

<400> 265

<210> 266

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28035指3

<400> 266

<210> 267

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28035指4

<400> 267

<210> 268

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28035指5

<400> 268

<210> 269

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28035指6

<400> 269

<210> 270

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28036指1

<400> 270

<210> 271

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28036指2

<400> 271

<210> 272

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28036指3

<400> 272

<210> 273

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28036指4

<400> 273

<210> 274

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28036指5

<400> 274

<210> 275

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28036指6

<400> 275

<210> 276

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28039指1

<400> 276

<210> 277

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28039指2

<400> 277

<210> 278

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

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<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

<220>

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<220>

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<213> 人工序列

<220>

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24796指3

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24797指1

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24797指2

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24797指3

<400> 374

<210> 375

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24797指4

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24797指5

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<211> 7

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<213> 人工序列

<220>

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<213> 人工序列

<220>

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<213> 人工序列

<220>

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24837指3

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<213> 人工序列

<220>

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<220>

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<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24845指1

<400> 393

<210> 394

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24845指2

<400> 394

<210> 395

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24845指3

<400> 395

<210> 396

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24845指4

<400> 396

<210> 397

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24845指5

<400> 397

<210> 398

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24820指1

<400> 398

<210> 399

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24820指2

<400> 399

<210> 400

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24820指3

<400> 400

<210> 401

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24820指4

<400> 401

<210> 402

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24820指5

<400> 402

<210> 403

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24821指1

<400> 403

<210> 404

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24821指2

<400> 404

<210> 405

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24821指3

<400> 405

<210> 406

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24821指4

<400> 406

<210> 407

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24821指5

<400> 407

<210> 408

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24828指1

<400> 408

<210> 409

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24828指2

<400> 409

<210> 410

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24828指3

<400> 410

<210> 411

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24828指4

<400> 411

<210> 412

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24828指5

<400> 412

<210> 413

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24829指1

<400> 413

<210> 414

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24829指2

<400> 414

<210> 415

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24829指3

<400> 415

<210> 416

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24829指4

<400> 416

<210> 417

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24829指5

<400> 417

<210> 418

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24829指6

<400> 418

<210> 419

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24832指1

<400> 419

<210> 420

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24832指2

<400> 420

<210> 421

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24832指3

<400> 421

<210> 422

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24832指4

<400> 422

<210> 423

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24832指5

<400> 423

<210> 424

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24832指6

<400> 424

<210> 425

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24833指1

<400> 425

<210> 426

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24833指2

<400> 426

<210> 427

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24833指3

<400> 427

<210> 428

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24833指4

<400> 428

<210> 429

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24833指5

<400> 429

<210> 430

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24833指6

<400> 430

<210> 431

<211> 694

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 品件細節：em02-5788-1-1左邊緣側翼

<400> 431

<210> 432

<211> 732

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> em02-5788-1-1左邊緣側翼

<400> 432

<210> 433

<211> 643

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 品件細節：ad58-5784-2-1左邊緣側翼

<400> 433

<210> 434

<211> 653

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ad58-5784-2-1右邊緣側翼

<400> 434

<210> 435

<211> 450

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 品件細節：ad58-5898-10-1左邊緣側翼

<400> 435

<210> 436

<211> 644

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ad58-5898-10-1右邊緣側翼

<400> 436

<210> 437

<211> 674

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> lf31-6139-2-3左邊緣側翼

<400> 437

<210> 438

<211> 544

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> [00213]lf31-6139-2-3右邊緣側翼

<400> 438

<210> 439

<211> 569

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> bm56-6315-1-1左邊緣側翼

<400> 439

<210> 440

<211> 685

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> bm56-6315-1-1右邊緣側翼

<400> 440

<210> 441

<211> 734

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ad58-6372-1-1左邊緣側翼

<400> 441

<210> 442

<211> 521

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ad58-6372-1-1右邊緣側翼

<400> 442

<210> 443

<211> 450

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ad58-6620-4-1左邊緣側翼

<400> 443

<210> 444

<211> 775

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ad58-6620-4-1右邊緣側翼

<400> 444

<210> 445

<211> 808

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ad58-6620-17-1左邊緣側翼

<400> 445

<210> 446

<211> 578

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ad58-6620-17-1右邊緣側翼

<400> 446

<210> 447

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子序列

<400> 447

<210> 448

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 448

<210> 449

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 449

<210> 450

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 450

<210> 451

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 451

<210> 452

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 452

<210> 453

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 453

<210> 454

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 454

<210> 455

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 455

<210> 456

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 456

<210> 457

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 457

<210> 458

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 458

<210> 459

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 459

<210> 460

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 460

<210> 461

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 461

<210> 462

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 462

<210> 463

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 463

<210> 464

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 464

<210> 465

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 465

<210> 466

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 466

<210> 467

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 467

<210> 468

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 468

<210> 469

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 469

<210> 470

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 470

<210> 471

<211> 118

<212> DNA

<213> 西洋油菜(Brassica napus)

<400> 471

<210> 472

<211> 118

<212> DNA

<213> 西洋油菜(Brassica napus)

<400> 472

<210> 473

<211> 118

<212> DNA

<213> 西洋油菜(Brassica napus)

<400> 473

<210> 474

<211> 118

<212> DNA

<213> 西洋油菜(Brassica napus)

<400> 474

<210> 475

<211> 20

<212> DNA

<213> 西洋油菜(Brassica napus)

<400> 475

<210> 476

<211> 28

<212> DNA

<213> 西洋油菜(Brassica napus)

<400> 476

<210> 477

<211> 28

<212> DNA

<213> 西洋油菜(Brassica napus)

<400> 477

<210> 478

<211> 28

<212> DNA

<213> 西洋油菜(Brassica napus)

<400> 478

<210> 479

<211> 28

<212> DNA

<213> 西洋油菜(Brassica napus)

<400> 479

<210> 480

<211> 20

<212> DNA

<213> 西洋油菜(Brassica napus)

<400> 480

Claims (17)

1. 一種用於產生一基因轉殖植物細胞的方法，該方法包括：以一供體核酸分子及編碼一具位特異性核酸酶的一核酸分子來轉形一植物細胞，其中該植物細胞包含被整合至該植物細胞之基因體DNA中之一位點(locus)的多核苷酸，該多核苷酸在5’至3’的方向包含：一第一啟動子，一第一功能性標記基因之一第一非功能性片段，該具位特異性核酸酶之至少一辨識位，以及一第二功能性標記基因之一第二非功能性片段，其中該第一啟動子是可操作地連接至該第一功能性標記基因之該第一非功能性片段，其中該供體核酸分子包含一供體多核苷酸，其在5’至3’的方向包含該第一功能性標記基因之一第二片段、一感興趣之核苷酸序列、一第二啟動子以及該第二功能性標記基因之一第一片段，其中該第二啟動子是可操作地連接至該第二功能性標記基因之該第一片段，從而表現該具位特異性核酸酶以將一雙股斷裂引入至該植物細胞之該基因體DNA的該具位特異性核酸酶之該辨識位，使得雙股斷裂之修復造成該供體多核苷酸被整合至該位點中，俾生成該基因轉殖植物細胞，其中該基因轉殖植物細胞於該位點在5’至3’的方向包含：該第一啟動子，該第一功能性標記基因，該感興趣之核苷酸序列，該第二啟動子，以及該第二功能性標記基因，其中該第一啟動子是可操作地連接至該第一功能性標記基因，且其中該第二啟動子是可操作地連接至該第二功能性標記基因。
2. 如請求項1之方法，其中整合於該植物細胞之該基因體DNA中之該位點的該多核苷酸在5’至3’的方向包含：該第一標示基因之該第一片段，一第一同源臂核苷酸序列，該具位特異性核酸酶之該辨識位，一第二同源臂核苷酸序列，及該第二標記基因之該第二片段，其中該供體多核苷酸在5’至3’的方向包含：該第一同源臂核苷酸序列，該第一標記基因之該第二片段，該感興趣之核苷酸序列，該第二標記基因之該第一片段，及該第二同源臂核苷酸序列，使得該供體多核苷酸藉由同源依賴性雙股斷裂修復機制整合至該位點。
3. 如請求項2之方法，其中該第一或第二同源臂核苷酸序列係一內含子。
4. 如請求項2之方法，其中該第一及第二同源臂核苷酸序列共享(share)小於50%序列一致性。
5. 如請求項2之方法，其中該第一及第二同源臂核苷酸序列長度為自50bp至3kbp。
6. 如請求項1之方法，其中該植物細胞係被包含在一植物組織或一整株植物中。
7. 如請求項1之方法，其中該感興趣之核苷酸序列包括一基因表現卡匣。
8. 如請求項7之方法，其中該基因表現卡匣包括至少一轉殖基因。
9. 如請求項8之方法，其中該轉殖基因係選自於由以下所組成之組群：昆蟲抗性轉殖基因、殺草劑耐受性轉殖基因、氮利用效率轉殖基因、水利用效率轉殖基因、營養品質轉殖基因、編碼一DNA結合蛋白的轉殖基因、及編碼一可擇標記的轉殖基因。
10. 如請求項1之方法，其中該具位特異性核酸酶係一融合蛋白，該融合蛋白包括一DNA-結合域(domain)及一剪切(cleavage)域或一剪切半域(half-domain)。
11. 如請求項10之方法，其中該DNA-結合域係選於由以下所組成之組群：一巨核酸酶DNA-結合域、一RNA-引導性CRISPR-Cas9 DNA-結合域、一白胺酸鏈區DNA-結合域、一類轉錄活化體(TAL)DNA-結合域、一重組酶(recombinase)之一DNA-結合域、一鋅指蛋白DNA-結合域、及其等之嵌合(chimeric)組合物；以及其中該剪切域或剪切半域係選自於由以下所組成之組群：一第IIS型位特異性限制核酸酶之剪切半域、一FokI位特異性核酸酶之剪切半域、一StsI位特異核酸酶之剪切半域、及一位特異性返(homing)核酸酶。
12. 如請求項10之方法，其中該DNA-結合域係一鋅指DNA-結合域。
13. 如請求項12之方法，其中該剪切域或剪切半域係選自於由以下所組成之組群：一第IIS型位特異性限制核酸酶之剪切半域、一FokI位特異性核酸酶之剪切半域、及一StsI位特異核酸酶之剪切半域。
14. 如請求項1之方法，其進一步包含篩選該基因轉殖植物細胞中之該第一功能性標記基因之表現或篩選該基因轉殖植物細胞中之該第二功能性標記基因之表現。
15. 如請求項1之方法，其進一步包含篩選該第一功能性標記基因及該第二功能性標記基因之表現。
16. 如請求項1之方法，其中該第一功能性標記基因或第二功能性標記基因係選自於由以下所組成之群組：PMI、YFP、Xyl(A)、RFP、DSR、GFP、GUS、NPTII、AAD-1、AAD-12、AHAS、PAT、HPH、及BAR。
17. 如請求項1之方法，其進一步包含使用流式細胞儀來分離該基因轉殖植物細胞。