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TWI664424B - 應用於協助癌症診斷的跨染色及多生物標記方法 - Google Patents

應用於協助癌症診斷的跨染色及多生物標記方法 Download PDF

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TWI664424B
TWI664424B TW107118500A TW107118500A TWI664424B TW I664424 B TWI664424 B TW I664424B TW 107118500 A TW107118500 A TW 107118500A TW 107118500 A TW107118500 A TW 107118500A TW I664424 B TWI664424 B TW I664424B
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王靖維
Ching-Wei Wang
陳燕麟
Yen-Lin Chen
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國立臺灣科技大學
National Taiwan University Of Science And Technology
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Abstract

本發明提出一種跨染色及多生物標記方法。此方法的主要技術特徵在於，先將組織切片之影像分組為H&E染色組織影像與IHC染色組織影像，再接著將不同組別的IHC染色組織影像與H&E染色組織影像執行一跨染色影像註冊與融合處理，進以獲得複數幀跨染色組織影像。進一步地，便可以利用特別設計的生物標記之表現辨識流程，對所獲得的該複數幀跨染色組織影像執行一腫瘤辨識與定量分析，最終能夠自動地辨識該組織檢體所患有的癌症之癌細胞類型及其比率。可想而知，在搭配使用本發明的情況下，醫生不需要以人工辨識的方式辨別組織檢體中所患有的癌症之類型，是以能夠避免人工辨識造成任何可能的判斷錯誤。

Description

應用於協助癌症診斷的跨染色及多生物標記方法
本發明係關於癌症檢測與診斷的技術領域，尤指一種應用於協助症癌診斷的跨染色及多生物標記方法。
乳癌是由乳腺管細胞或腺泡細胞經不正常分裂所形成的惡性腫瘤。乳癌腫瘤除了會感染局部的乳房區域，也可能經由淋巴結轉移到其他器官組織。常見的乳癌可分為：乳管原位癌(Duodenal carcinoma in situ, DCIS)、乳腺管上皮不典型增生(Atypical ductal hyperplasia, ADH)、與乳腺癌(Basal-like Breast carcinoma, BC)。就乳癌的治療而言，必須先基於病理學從至少一組織切片的影像之中有效地辨識乳管原位癌(DCIS)、乳腺癌(BC)與/或乳腺管上皮不典型增生(ADH)，接著醫生才能夠擬定適合的乳癌治療方式。
圖1係顯示乳癌治療的流程圖。臨床上，醫生對於乳癌患者所提出的乳癌治療流程通常包括多個步驟。於步驟S1’中，根據患者的乳房的X光攝影或超音波檢查之影像，醫生必須根據其臨床經驗判讀患者的乳房是否有腫瘤或囊腫。若檢測結果顯示乳房狀況正常，則只需後續定期追蹤即可(步驟S2a’)。然而，若檢測結果顯示乳房具有腫瘤或囊腫，則醫生會接著替患者進行粗針穿刺(core needle biopsy) 以製作組織切片(步驟S2’)。於步驟S3’中，根據組織切片的染色影像分析之結果，醫生便可以判斷乳癌的種類是DCIS還是ADH。若乳癌的是ADH，則必須直接進行手術取出腫瘤(步驟S4’)。並且，於步驟S4’中，若取出的腫瘤很幸運地在透過病理分析之後判斷皆為ADH，則術後患者僅需進行定期追蹤即可(步驟S7’)。
相反地，若取出的腫瘤不幸地在透過病理分析之後判斷其部分已經是DCIS，則患者必須進一步地接受核磁共振(MRI)以確認是否為多發性腫瘤(步驟S5’)。若為多發性腫瘤，則患者必須接受全部乳房切除手術(步驟S6’)。較幸運地，若為非多發性腫瘤，則患者只切除部分乳房。最終，於步驟(S7’)的術後持續治療過程中，乳房已經完全切除的患者可以考慮接受乳房重建手術。必須加以強調的是，對於部分乳房切除的患者而言，其仍舊必須持續地接受放射治療或者賀爾蒙治療。
由圖1可知，若醫生透過組織切片的染色影像的判讀診斷患者的乳癌類型是ADH，則在經由手術摘除腫瘤之後，患者只需要接著進行術後的定期追蹤即可。但是，若組織切片的染色影像指出患者的乳癌類型是DCIS，醫生則必須根據DCIS的病灶多寡判斷是否為多發性腫瘤。簡單地說，「組織切片之病理分析的正確性」會嚴重地影響後續的步驟S4’至步驟S7’的治療方案的選擇。有鑑於此，影像對準(alignment)或註冊(registration)技術被廣泛地應用於組織切片的染色影像之判讀。例如，美國專利號US9,818,190揭示一種完整載片圖像配准與交叉圖像注釋系統(Whole slide image registration and cross-image annotation system)，可應用於多張組織切片的染色影像特徵比對。其中一張定義為來源影像且一張定義為目標影像，兩張影像內容可在同一座標系統下進行影像特徵分析。
例如，根據美國專利號US9,818,190之揭示內容，經H&E染色的組織切片影像可以被定義為來源影像，且經IHC染色的組織切片影像可以被定義為目標影像。接著，使用者只要在H&E染色的組織切片影像之中選擇或標記一特徵區域，則系統會在IHC染色的組織切片影像之上自動地選擇或標記同一塊特徵區域。簡單地說，透過所述完整載片圖像配准和交叉圖像注釋系統的輔助，醫生能夠快速且準確地自組織切片的染色影像的判讀診斷患者的乳癌類型。
可惜的是，所述完整載片圖像配准和交叉圖像注釋系統無法根據IHC染色的組織切片影像與/或H&E染色的組織切片影像的顏色而自行判讀患者的乳癌類型、腫瘤大小與病灶多寡。嚴格地說，該圖像配准系統僅協助醫生儲存多張影像、進行任兩張影像之對準、以及標註特徵影像，並無法協助醫生進行精準的癌症類型診斷。 有鑑於此，本案之發明人係極力加以研究創作，而終於研發完成本發明之一種應用於協助癌症診斷的跨染色及多生物標記方法。
本發明之主要目的在於提供一種應用於協助癌症診斷的跨染色及多生物標記方法。此方法的主要技術特徵在於，先將組織切片之影像分組為H&E染色組織影像與IHC染色組織影像，再接著將不同組別的IHC染色組織影像與H&E染色組織影像執行一跨染色影像註冊與融合處理，進以獲得複數幀跨染色組織影像。進一步地，便可以利用特別設計的生物標記之表現辨識流程，對所獲得的該複數幀跨染色組織影像執行一腫瘤辨識與定量分析，最終能夠自動地辨識該組織檢體所患有的癌症之癌細胞類型及其比率。可想而知，在搭配使用本發明的情況下，醫生不需要以人工辨識的方式辨別組織檢體中所患有的癌症之類型，是以能夠避免人工辨識造成任何可能的判斷錯誤。
為了達成上述本發明之主要目的，本案發明人係提供所述應用於協助癌症診斷的跨染色及多生物標記方法的一實施例，係包括以下步驟： (1)取得一組織檢體，並將其製作成複數張組織切片； (2)將該複數張組織切片分成複數個染色組織切片群組，且該複數個染色組織切片群組至少包括：一蘇木素-伊紅染色(H&E stain)群組與至少二免疫組織染色(Immunohistochemistry stain, IHC stain)群組； (3)對該蘇木素-伊紅染色群組內的組織切片進行一蘇木素-伊紅染色處理以獲得複數張H&E染色組織切片，並對該免疫組織染色群組內的組織切片進行一免疫組織染色處理以獲得複數張IHC染色組織切片； (4)將該複數張H&E染色組織切片與該複數張IHC染色組織切片轉換成複數幀H&E染色組織影像與複數幀IHC染色組織影像； (5)對該些H&E染色組織影像與該些IHC染色組織影像進行一跨染色影像註冊與融合； (6)重複該步驟(5)，直至所有的IHC染色組織影像與所有的H&E染色組織影像皆完成所述跨染色影像註冊與融合，進而獲得複數幀跨染色組織影像；以及 (7)對所獲得的該複數幀跨染色組織影像執行一腫瘤辨識與定量分析，進而自動地辨識該組織檢體所患有的癌症之癌細胞類型及其比率。
為了能夠更清楚地描述本發明所提出之一種應用於協助癌症診斷的跨染色及多生物標記方法，以下將配合圖式，詳盡說明本發明之較佳實施例。
請參閱圖2A與圖2B，係顯示本發明之一種跨染色及多生物標記方法的流程圖。本發明之跨染色及多生物標記方法主要是應用於協助癌症類型之辨識與診斷。請同時參閱圖3A與圖3B，係顯示本發明之跨染色及多生物標記方法的示意性製程圖。根據圖2A，本發明之方法於流程上係首先執行步驟S1，用以取得一組織檢體，並將其製作成複數張組織切片。由圖3A可知，在取得所述組織檢體之後，必須先將該組織檢體製作成一蠟塊；接著，對該蠟塊執行一切片處理(Sectioning process)之後，便可以獲得複數張組織切片。值得注意的是，對這些組織切片進行染色處理之前，必須先對每一張組織切片執行一固定處理(Fixation process)。
接著，步驟S2之中，係將該複數張組織切片分成複數個染色組織切片群組，且該複數個染色組織切片群組至少包括：一蘇木素-伊紅染色(H&E stain)群組與至少二免疫組織染色(Immunohistochemistry stain, IHC stain)群組。就乳癌類型的檢測而言，醫師會依據參考至少一種蛋白質圖譜以選擇含有對應的至少一種蛋白質的組織切片；其中，所述蛋白質包括但不限於：E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、腫瘤蛋白p63、平滑肌肌動蛋白(Smooth muscle actin, SMA)、高分子量細胞角蛋白(High molecular weight cytokeratin, HMCK)、細胞角蛋白CK14、細胞角蛋白CK7、細胞角蛋白CK5/6、與細胞角蛋白CK8/18。簡單地說，根據醫師想要觀測的蛋白質生物標記反應，免疫組織染色群組的數量必定在兩組以上。
繼續地，於步驟S3之中，係對該蘇木素-伊紅染色群組內的組織切片進行一蘇木素-伊紅染色處理以獲得複數張H&E染色組織切片，並對該免疫組織染色群組內的組織切片進行一免疫組織染色處理以獲得複數張IHC染色組織切片。例如，圖3A即顯示一組蘇木素-伊紅染色群組以及兩組免疫組織染色群組。特別地，其中一組免疫組織染色群組的IHC染色組織切片為CK18染色組織切片，另一組免疫組織染色群組的IHC染色組織切片則為HMCK染色組織切片。繼續地，參考圖2A與圖3B，本發明之方法係繼續執行步驟S4，用以將該複數張H&E染色組織切片與該複數張IHC染色組織切片轉換成複數幀H&E染色組織影像與複數幀IHC染色組織影像。
繼續地參閱圖2B與圖3B。於步驟S5之中，係對該些H&E染色組織影像與該些IHC染色組織影像進行一跨染色影像註冊與融合。圖4係顯示影像註冊與融合的執行過程圖。參考圖3B與圖4，一幀H&E染色組織影像、一幀CK18染色組織影像與一幀HMCK染色組織影像被取出。其中，該CK18染色組織影像係與H&E染色組織影像被進行影像註冊與融合，且該HMCK染色組織影像係與H&E染色組織影像也被進行影像註冊與融合。於此，必須特別強調的是，基於一來源影像(Source image)對一目標影像(Target image)進行影像對準(alignment)或註冊(registration)的類似技術已經被廣泛地應用於組織切片的染色影像之判讀。類似的技術包括Least squares、UnwarpJ、bUnwarpJ、Elastic、CwR、CLAHE+bunwarpJ、TrakEM2等方法。然而，於本發明之方法的步驟S5非常要求來源影像與目標影像之影像對準的精準度，因此建議使用文獻一所提出的影像註冊技術。於此，文獻一指的是: Wang et.al, “Robust image registration of biological microscopic images”, Nature-Scientific Reports 4: 6050 (SCI, JCR 2015 (7/63) in MULTIDISCIPLINARY SCIENCES, IF=5.228)。
圖4顯示CK18染色組織影像基於H&E染色組織影像進行影像註冊，且HMCK染色組織影像係基於H&E染色組織影像進行影像註冊。但是，為了令影像辨識系統可以更容易地進行腫瘤辨識與定量分析，最佳的是HMCK染色組織影像也必須基於CK18染色組織影像進行影像註冊。簡單地說，基於包含第一生物標記的IHC染色組織影像對包含第二生物標記的IHC染色組織影像執行一影像註冊。完成來源影像與目標影像的影像對準或註冊之後，如圖4所示，CK18染色組織影像與H&E染色組織影像可以透過影像融合技術而被組合成一幀跨染色組織影像；同樣地，HMCK染色組織影像與H&E染色組織影像也是透過影像融合技術而被組合成一幀跨染色組織影像。完成步驟S5之後，本發明之方法係接著執行步驟S6，進而重複該步驟S5，直至所有的IHC染色組織影像皆與一幀H&E染色組織影像完成所述跨染色影像註冊與融合，進而獲得複數幀跨染色組織影像。
如圖2B與圖3B所示，最終，本發明之方法係執行步驟S7，對所獲得的該複數幀跨染色組織影像執行一腫瘤辨識與定量分析，進而自動地辨識該組織檢體所患有的癌症之癌細胞類型及其比率。以乳癌為例，癌症的類型可以利用生物標記的方式來提高辨識準確率。舉例而言，可以同時透過辨識四種生物標記的免疫化學反應而自動地辨識該組織檢體所患有的癌症之癌細胞類型及其比率。圖5A至圖5E係顯示步驟S7的詳細步驟流程圖。並且，由圖5A至圖5E可以得知，在示範性的方法流程中係使用E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、腫瘤蛋白p63、細胞角蛋白CK14、與細胞角蛋白CK5/6這四種生物標記。
在正常乳腺組織中，E-cadherin在肌上皮中呈顆粒狀膜陽性，在DCIS細胞上則呈線狀膜陽性。根據這個基礎特徵，步驟S71被設計用以判斷是否該註冊影像之中的E-鈣粘蛋白(E-cadherin)呈陽性反應，若是，則方法流程便接著執行步驟S72。值得注意的是，若步驟S71的判斷結果為“否”，則表示製作E-cadherin的IHC染色組織切片的過程可能有問題，導致對E-cadherin的免疫染色的結果無法呈陽性。故此，方法流程便無法繼續執行下去，必須在此結束步驟執行。
另一方面，腫瘤蛋白p63被認為是一個抑癌基因，在乳腺癌的發生、發展過程中起著重要的作用，因此其免疫檢測之結果為乳腺癌早期診斷的重要依據。因此，於步驟S72中，係判斷是否該跨染色組織影像之中的腫瘤蛋白p63呈陽性反應，若是，則接著執行步驟S73。步驟S73用以判斷該跨染色組織影像之中的細胞角蛋白CK14是否呈陽性反應，其意義在於檢測檢體組織是否有乳腺管之細胞增生現象發生。因此，若步驟S73的判斷結果為“是”，則必須接著執行步驟S74以判斷該跨染色組織影像之中的細胞角蛋白CK5/6是否呈陽性反應。必須特別說明的是，與普通乳腺管增生(usual ductal hyperplasia, UDH)相比，不典型乳腺管增生(atypical ductal hyperplasia, ADH)之中細胞角蛋白CK5/6表現明顯减少。值得一提的是，在DCIS中，細胞角蛋白CK5/6的陽性基因表現基本上消失。可想而知，若步驟S74的判斷結果為“否”，則判定該組織檢體含有類型為乳腺管上皮不典型增生(ADH)之乳癌(步驟S75b)。相反地，若步驟S74的判斷結果為“是”，則判定該組織檢體為正常 (步驟S75a)。簡單地說，組織檢體被檢測出的乳腺管增生為普通型，係屬正常。
重複說明的是，步驟S73用以判斷該跨染色組織影像之中的細胞角蛋白CK14是否呈陽性反應；因此，若步驟S73的判斷結果為“否”，則本發明之方法流程會接著執行步驟S76，用以判斷該跨染色組織影像之中的細胞角蛋白CK5/6是否呈陽性反應。若步驟S76的判斷結果為“是”，則判定該組織檢體含有類型為乳腺管上皮不典型增生(ADH)之乳癌(步驟S75b)。相反地，若步驟S76的判斷結果為“否”，則判定該組織檢體含有乳管原位癌(DCIS)(步驟S77)，原因在於在低級別的DCIS中，細胞角蛋白CK5/6的陽性基因表現基本上消失。
繼續地參閱圖5A至圖5E的流程圖。若步驟S72的判斷結果為“否”，則方法流程接著執行步驟S78，用以判斷該跨染色組織影像之中的細胞角蛋白CK14是否呈陽性反應。若步驟S78的判斷結果為“是”，則方法流程接著執行步驟S79，判斷該跨染色組織影像之中的細胞角蛋白CK5/6是否呈陽性反應。接著，根據步驟S79的判斷結果，步驟S7Aa與步驟S7Ab會分別判定該組織檢體含有第一型式或第二型式的腫瘤。簡單地說，在E-鈣粘蛋白表現為陽性(+)、腫瘤蛋白p63表現為陰性(-)且細胞角蛋白CK14表現為陽性(+)的情況下，若細胞角蛋白CK5/6表現為陰性(-)則判定該組織檢體含有第一型式的腫瘤(Exceptional case 1)。相反地，若細胞角蛋白CK5/6表現為陽性(+)則判定該組織檢體含有第二型式的腫瘤(Exceptional case 2)。
另一方面，若步驟S78的判斷結果為“是”(圖5A)，則方法流程接著執行步驟S79(圖5D)，用以判斷該跨染色組織影像之中的細胞角蛋白CK5/6是否呈陽性反應，若否，則判定該組織檢體含有第一型式的腫瘤(步驟S7Aa)。相反地，若步驟S7B的判斷結果為“否”， 則判定該組織檢體含有乳腺癌(BC)(步驟S7C)。基於圖5A至圖5E的流程圖，吾人可將乳癌類型的分類方式整理於下表(1)之中。 表(1)
乳癌類型 分類方式
正常 (未罹患乳癌) E-鈣粘蛋白呈陽性(+) 腫瘤蛋白p63呈陽性(+) 細胞角蛋白CK14呈陽性(+) 細胞角蛋白CK5/6呈陽性(+)
乳腺管上皮不典型增生(1) (ADH) E-鈣粘蛋白呈陽性(+) 腫瘤蛋白p63呈陽性(+) 細胞角蛋白CK14呈陽性(+) 細胞角蛋白CK5/6呈陰性(-)
乳腺管上皮不典型增生(2) (ADH) E-鈣粘蛋白呈陽性(+) 腫瘤蛋白p63呈陽性(+) 細胞角蛋白CK14呈陰性(-) 細胞角蛋白CK5/6呈陽性(+)
乳管原位癌 (DCIS) E-鈣粘蛋白呈陽性(+) 腫瘤蛋白p63呈陽性(+) 細胞角蛋白CK14呈陰性(-) 細胞角蛋白CK5/6呈陰性(-)
含有第一型式的腫瘤(1) E-鈣粘蛋白呈陽性(+) 腫瘤蛋白p63呈陰性(-) 細胞角蛋白CK14呈陽性(+) 細胞角蛋白CK5/6呈陰性(-)
含有第一型式的腫瘤(2) E-鈣粘蛋白呈陽性(+) 腫瘤蛋白p63呈陰性(-) 細胞角蛋白CK14呈陰性(-) 細胞角蛋白CK5/6呈陽性(+)
含有第二型式的腫瘤 E-鈣粘蛋白呈陽性(+) 腫瘤蛋白p63呈陰性(-) 細胞角蛋白CK14呈陽性(+) 細胞角蛋白CK5/6呈陽性(+)
乳腺癌 (BC) E-鈣粘蛋白呈陽性(+) 腫瘤蛋白p63呈陰性(-) 細胞角蛋白CK14呈陰性(-) 細胞角蛋白CK5/6呈陰性(-)
參考表(1)之後可以發現，步驟S7的14個細部執行步驟是可能被調整或變化的。簡單地說，雖然本發明透過圖5A至圖5E示範了使用藉由辨識E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、腫瘤蛋白p63、細胞角蛋白CK14、與細胞角蛋白CK5/6這四種生物標記來辨識該組織檢體所患有的癌症之癌細胞類型及其比率，但並非以此限制步驟S7的細部執行步驟之組成。舉例而言，細胞角蛋白CK14、CK8、CK18皆可以用來表達乳腺中間細胞的增生，因此以CK8或CK18取代CK14作為生物標記是可能的。另一方面，平滑肌肌動蛋白(SMA)與細胞角蛋白CK5/6同樣皆可以用來表達肌上皮前體細胞的增生，因此以SMA取代CK5/6作為生物標記也是可能的。
同時，透過上述說明吾人亦可進一步地得知，將本發明之跨染色及多生物標記方法應用於辨識乳癌以外的其他癌症也是可能的，包括：卵巢癌、胰臟癌、肝癌、肺癌、大腸直腸癌、胃癌、或食道癌。就前述所列最常發生的癌症而言，組織切片的病理分析配合特定蛋白或細胞(亦即生物標記)免疫組織染色處理經常被用來協助醫生確診癌症的類型。可預見的，在使用本發明的情況下，醫生可以很容易地就對包含上述任一種癌症的組織檢體做出以下項目: (1)腫瘤的診斷和鑒別； (2)對癌症的腫瘤細胞進行病理分型； (3)明確腫瘤的正確組織學分類； (4)確認病灶多寡；以及 (5)為醫生的癌症治療方案提供有力的支持。
如此，上述係已完整且清楚地說明本發明之一種應用於協助癌症診斷的跨染色及多生物標記方法；並且，經由上述可知本發明係具有下列之優點：
(1)習知的載片圖像配准與交叉圖像注釋系統只可以協助醫生儲存多張組織切片之影像、進行任兩張影像之對準、以及標註影像內的特徵區域，並無法協助醫生進行精準的癌症類型診斷。有鑑於此，本發明提出一種跨染色及多生物標記方法。此方法的主要技術特徵在於，先將組織切片之影像分組為H&E染色組織影像與IHC染色組織影像，再接著將不同組別的IHC染色組織影像與H&E染色組織影像執行一跨染色影像註冊與融合處理，進以獲得複數幀跨染色組織影像。進一步地，便可以利用特別設計的生物標記之表現辨識流程，對所獲得的該複數幀跨染色組織影像執行一腫瘤辨識與定量分析，最終能夠自動地辨識該組織檢體所患有的癌症之癌細胞類型及其比率。可想而知，在搭配使用本發明的情況下，醫生不需要以人工辨識的方式辨別組織檢體中所患有的癌症之類型，是以能夠避免人工辨識造成任何可能的判斷錯誤。
(2)並且，本發明之跨染色及多生物標記方法可與市售任何一種圖像配准與交叉圖像注釋系統進行結合以應用於協助癌症診斷，例如: 徕卡的Leica Biosystems或Polaris所提出的Vectra全自動定量病理成像系統。
必須加以強調的是，上述之詳細說明係針對本發明可行實施例之具體說明，惟該實施例並非用以限制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更，均應包含於本案之專利範圍中。
＜本發明＞
S1-S4‧‧‧步驟
S5-S7‧‧‧步驟
S71-S73、S78‧‧‧步驟
S74、S75a、S75b‧‧‧步驟
S76-S77‧‧‧步驟
S79、S7Aa、S7Ab‧‧‧步驟
S7B-S7C‧‧‧步驟
＜習知＞
S1’‧‧‧步驟
S2a’‧‧‧步驟
S2’-S7’‧‧‧步驟
圖1係顯示乳癌治療的流程圖； 圖2A與圖2B係顯示本發明之一種跨染色及多生物標記方法的流程圖； 圖3A與圖3B係顯示本發明之跨染色及多生物標記方法的示意性製程圖；以及 圖4係顯示影像註冊與融合的執行過程圖； 圖5A至圖5E係顯示步驟S7的詳細步驟流程圖。

Claims (7)

  1. 一種跨染色及多生物標記方法，其係應用於一圖像配准與交叉圖像注釋系統之中，用以協助癌症類型之辨識與診斷，並包括以下步驟：(1)取得一組織檢體，並將其製作成複數張組織切片；(2)將該複數張組織切片分成複數個染色組織切片群組，且該複數個染色組織切片群組至少包括：一蘇木素-伊紅染色(H&E stain)群組與至少二免疫組織染色(Immunohistochemistry stain,IHC stain)群組；(3)對該蘇木素-伊紅染色群組內的組織切片進行一蘇木素-伊紅染色處理以獲得複數張H&E染色組織切片，並對該免疫組織染色群組內的組織切片進行一免疫組織染色處理以獲得複數張IHC染色組織切片；(4)將該複數張H&E染色組織切片與該複數張IHC染色組織切片轉換成複數幀H&E染色組織影像與複數幀IHC染色組織影像；(5)對該些H&E染色組織影像與該些IHC染色組織影像進行一跨染色影像註冊與融合；(6)重複該步驟(5)，直至所有的IHC染色組織影像與所有的H&E染色組織影像皆完成所述跨染色影像註冊與融合，進而獲得複數幀跨染色組織影像；以及(7)對所獲得的該複數幀跨染色組織影像執行一腫瘤辨識與定量分析，進而自動地辨識該組織檢體所患有的癌症之癌細胞類型及其比率。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之跨染色及多生物標記方法，其中，根據所述癌症，於執行所述免疫組織染色處理之前必須先參考至少一種蛋白質圖譜以選擇含有對應的至少一種蛋白質的組織切片。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之跨染色及多生物標記方法，其中，該蛋白質係包括：E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、腫瘤蛋白p63、平滑肌肌動蛋白(SMA)、細胞角蛋白HMCK、細胞角蛋白CK14、細胞角蛋白CK7、細胞角蛋白CK5/6、與細胞角蛋白CK8/18。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之跨染色及多生物標記方法，其中，該步驟(1)係包括以下詳細步驟：(11)取得該組織檢體，並將該組織檢體製作成一蠟塊；(12)對該蠟塊執行一切片處理(Sectioning process)，以獲得該複數張組織切片；以及(13)對每一張組織切片執行一固定處理(Fixation process)。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之跨染色及多生物標記方法，其中，所述跨染色影像註冊與融合包括以下處理步驟：(51)取得一幀H&E染色組織影像或包含一第一生物標記的一幀IHC染色組織影像；(52)取得包含一第二生物標記的另一幀IHC染色組織影像；(52)基於該H&E染色組織影像或包含該第一生物標記的該IHC染色組織影像而對包含該第二生物標記的該IHC染色組織影像執行一影像註冊；以及(53)將該H&E染色組織影像與完成所述影像註冊的該IHC染色組織影像進行一影像融合。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之跨染色及多生物標記方法，其中，所述癌症為乳癌，且該步驟(7)係包括以下詳細步驟：(71)判斷該跨染色組織影像之中的E-鈣粘蛋白是否呈陽性反應，若是，則執行步驟(72)；若否，則步驟結束。(72)判斷該跨染色組織影像之中的腫瘤蛋白p63是否呈陽性反應，若是，則執行步驟(73)；若否，則執行步驟(78)；(73)判斷該染色組織影像之中的細胞角蛋白CK14是否呈陽性反應，若是，則執行步驟(74)；若否，則執行步驟(76)；(74)判斷該染色組織影像之中的細胞角蛋白CK5/6是否呈陽性反應，若是，則執行步驟(75a)；若否，則執行步驟(75b)；(75a)判定該組織檢體為正常；(75b)判定該組織檢體含有類型為乳腺管上皮不典型增生之乳癌；(76)判斷該染色組織影像之中的細胞角蛋白CK5/6是否呈陽性反應，若是，則重複執行該步驟(75b)；若否，則執行步驟(77)；(77)判定該組織檢體含有乳管原位癌；(78)判斷該染色組織影像之中的細胞角蛋白CK14是否呈陽性反應，若是，則執行步驟(79)；若否，則執行步驟(7B)；(79)判斷該染色組織影像之中的細胞角蛋白CK5/6是否呈陽性反應，若否，則執行步驟(7Aa)；若是，則執行步驟(7Ab)；(7Aa)判定該組織檢體含有一第一型式的腫瘤；(7Ab)判定該組織檢體含有一第二型式的腫瘤；(7B)判斷該染色組織影像之中的細胞角蛋白CK5/6是否呈陽性，若是，則重複執行該步驟(7Aa)；若否，則執行步驟(7C)；以及(7C)判定該組織檢體含有乳腺癌。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之跨染色及多生物標記方法，其中，所述癌症為乳癌。
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