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TWI656130B - Ｒｓｖ ｆ蛋白突變體 - Google Patents

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TWI656130B
TWI656130B TW105142706A TW105142706A TWI656130B TW I656130 B TWI656130 B TW I656130B TW 105142706 A TW105142706 A TW 105142706A TW 105142706 A TW105142706 A TW 105142706A TW I656130 B TWI656130 B TW I656130B
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Philip Ralph Dormitzer
亞歷賽 弗亞薛斯拉弗為奇 葛瑞班柯
Alexey Vyacheslavovich GRIBENKO
路克 大衛 韓德科
Luke David HANDKE
阿瓦里 克里續納 普瑞沙
Avvari Krishna PRASAD
夏楊 邱
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Xi SONG
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Kristin Rachael TOMPKINS
羅娜 戴爾 皮拉爾 奴那斯
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Abstract

本發明係關於RSV F蛋白突變體、編碼RSV F蛋白突變體之核酸或載體、包含RSV F蛋白突變體或核酸之組合物，及該等RSV F蛋白突變體、核酸或載體及組合物之用途。

Description

RSV F蛋白突變體
本發明概言之係關於疫苗且具體而言係關於抵抗呼吸道融合病毒之疫苗。
呼吸道融合病毒或RSV係感染肺及呼吸道之呼吸系統病毒。RSV係世界範圍內嬰兒嚴重病毒性下呼吸道疾病之主要病因且係老人呼吸疾病之重要病因。然而，尚未批准疫苗用於預防RSV感染。 RSV係副黏液病毒科(Paramyxoviridae )之成員。其基因體係由編碼11種蛋白質(包括9種結構蛋白(3種醣蛋白及6種內部蛋白)及兩種非結構蛋白)之單股負義RNA分子組成。結構蛋白包括3種跨膜表面醣蛋白：吸附蛋白G、融合蛋白F及小疏水SH蛋白。RSV有兩種亞型，A及B。其差異主要在於G醣蛋白，而F醣蛋白之序列在兩種亞型之間更保守。 成熟F醣蛋白具有三個一般結構域：胞外結構域(ED)、跨膜結構域(TM)及胞質尾區(CT)。CT含有單一棕櫚醯基化半胱胺酸殘基。 人類RSV之F醣蛋白首先自mRNA轉譯為單一574個胺基酸之多肽前體(稱為「F0」或「F0前體」)，其含有N-末端之信號肽序列(胺基酸1-25)。轉譯後，在內質網中藉由信號肽酶移除信號肽。F0前體之剩餘部分(即，殘基26-574)可藉由細胞蛋白酶(尤其弗林蛋白酶(furin))在兩個多鹼基位點(a.a. 109/110及136/137)進一步裂解，移除名為pep27 (胺基酸110-136)之27個胺基酸之間插序列且生成兩個名為F1 (C-末端部分；胺基酸137-574)及F2 (N-末端部分；胺基酸26-109)之連接片段。F1含有其N-末端之疏水融合肽及兩個七肽重複區(HRA及HRB)。HRA靠近該融合肽，且HRB靠近TM結構域。F1及F2片段經由兩個二硫鍵連接在一起。無信號肽序列之未裂解F0蛋白或F1-F2異二聚體可形成RSV F啟動子。3個該等啟動子裝配形成最終RSV F蛋白複合物，該複合物係3個啟動子之同三聚體。 亞型A及B之F蛋白之胺基酸序列約90%一致。A亞型之F0前體多肽之實例序列提供於SEQ ID NO: 1 (A2株；基因庫GI：138251；Swiss Prot P03420)中，且B亞型之F0前體多肽之實例序列提供於SEQ ID NO: 2 (18537株；基因庫GI：138250；Swiss Prot P13843)中。SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO:2二者皆係574個胺基酸之序列。SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO:2之信號肽序列亦已報導為胺基酸1-25 (基因庫及UniProt)。在兩個序列中，TM結構域係約胺基酸530至550，但替代地報導為525-548。胞質尾區始於胺基酸548或550且在胺基酸574結束，且棕櫚醯基化半胱胺酸殘基位於胺基酸550。 所探索用於RSV亞單位疫苗之一種一級抗原係F蛋白。RSV F蛋白三聚體介導病毒體膜與宿主細胞膜之間之融合且亦促進融合病毒之形成。在與宿主細胞膜融合之前的病毒體中，最大F分子群體形成棒糖形結構，且TM結構域錨定於病毒套膜中[Dormitzer, P.R.、Grandi, G.、Rappuoli, R.，Nature Reviews Microbiol, 10, 807, 2012.]。此構形稱為融合前構形。融合前RSV F由單株抗體(mAb) D25、AM22及MPE8識別，且寡聚狀態之間無差別。融合前F三聚體由mAb AM14特異性識別[Gilman MS、Moin SM、Mas V等人，Characterization of a prefusion-specific antibody that recognizes a quaternary, cleavage-dependent epitope on the RSV fusion glycoprotein. PLoS Pathogens,11(7), 2015]。在RSV進入細胞中期間，F蛋白自融合前狀態(其在本文中可稱為「F前」)經由中間延伸結構重排至融合後狀態(「F後」)。在此重排期間，融合前分子之C-末端捲曲螺旋解離為其三條組成股，然後其在球形頭周圍捲繞並接合另外三個螺旋而形成融合後六螺旋束。若融合前RSV F三聚體經受愈來愈嚴苛之化學或物理條件，例如升溫，則其經歷結構變化。首先，三聚體結構(至少在分子內局部地)損失，然後重排至融合後形式，然後結構域變性。 為防止病毒進入，在病毒套膜與細胞膜融合之前，F特異性中和抗體可能必須結合病毒體上F之融合前構形，或潛在地延伸中間體。因此，將F蛋白之融合前形式視為作為期望疫苗抗原之較佳構形[Ngwuta, J.O.、Chen, M.、Modjarrad, K.、Joyce, M.G.、Kanekiyo, M.、Kumar, A.、Yassine, H.M.、Moin, S.M.、Killikelly, A.M.、Chuang, G.Y.、Druz, A.、Georgiev, I.S.、Rundlet, E.J.、Sastry, M.、Stewart-Jones, G.B.、Yang, Y.、Zhang, B.、Nason, M.C.、Capella, C.、Peeples, M.、Ledgerwood, J. E.、Mclellan, J.S.、Kwong, P.D.、Graham, B.S.，Science Translat. Med., 14, 7, 309 (2015)]。在用諸如Triton X-100、Triton X-114、NP-40、Brij-35、Brij-58、Tween 20、Tween 80、辛基葡糖苷、辛基硫代葡糖苷、SDS、CHAPS、CHAPSO等表面活性劑提取，或表現為胞外結構域，經受物理或化學應力或儲存後，F醣蛋白易於轉化為融合後形式[McLellan JS、Chen M、Leung S等人，Structure of RSV fusion glycoprotein trimer bound to a pre-fusion-specific neutralizing antibody. Science 340, 1113–1117 (2013)；Chaiwatpongsakorn, S.、Epand, R.F.、Collins, P.L.、Epand R.M.、Peeples, M.E.、J Virol. 85(8):3968-77 (2011)；Yunus, A.S.、Jackson T.P.、Crisafi, K.、Burimski, I.、Kilgore, N.R.、Zoumplis, D.、Allaway, G.P.、Wild, C.T.、Salzwedel, K. Virology. 2010 Jan 20;396(2):226-37]。因此，將融合前F製備為疫苗抗原仍很困難。由於藉由干擾病毒進入實施之中和及保護性抗體功能，假定預期僅引發融合後特異性抗體之F抗原無法有效作為引發融合前特異性抗體之F抗原。因此，認為更可期望利用含有呈融合前形式(或潛在地延伸中間體形式)之F蛋白免疫原之F疫苗。迄今之努力仍未獲得已在臨床中顯示可引發足夠保護程度以支持發給RSV疫苗許可證之RSV疫苗。因此，業內需要衍生自RSV F蛋白之免疫原，其與相應天然RSV F蛋白相比具有改良之性質，例如融合前形式之增強之免疫原性或改良之穩定性，以及包含此一免疫原之組合物，例如疫苗。
在一些態樣中，本發明提供野生型RSV F蛋白之突變體，其中突變體顯示相對於相應野生型RSV F蛋白之胺基酸序列在胺基酸序列中引入突變且具有針對野生型RSV F蛋白或針對包含野生型F蛋白之病毒之免疫原性。突變體中之胺基酸突變包括相對於野生型RSV F蛋白之胺基酸取代、缺失或添加。 在一些實施例中，本揭示內容提供野生型RSV F蛋白之突變體，其中引入之胺基酸突變係野生型RSV F蛋白中之一對胺基酸殘基突變至一對半胱胺酸(「工程化二硫鍵突變」)。引入之半胱胺酸殘基對容許在半胱胺酸殘基之間形成穩定蛋白質構形或寡聚狀態、例如融合前構形之二硫鍵。該等突變之特定對之實例包括：55C及188C；155C及290C；103C及148C；及142C及371C，例如S55C及L188C；S155C及S290C；T103C及I148C；及L142C及N371C。 在其他實施例中，RSV F蛋白突變體包含係一或多個空腔填充突變之胺基酸突變。可以空腔填充之目標替代之胺基酸之實例包括小脂肪族(例如Gly、Ala及Val)或小極性胺基酸(例如Ser及Thr)及埋於融合前構形中，但暴露於融合後構形中之溶劑之胺基酸。替代胺基酸之實例包括大脂肪族胺基酸(Ile、Leu及Met)或大芳香族胺基酸(His、Phe、Tyr及Trp)。在一些具體實施例中，RSV F蛋白突變體包含選自由以下組成之群之空腔填充突變： (1) 位置55、62、155、190或290之S經I、Y、L、H或M取代； (2) 位置54、58、189、219或397之T經I、Y、L、H或M取代； (3) 位置151之G經A或H取代； (4) 位置147或298之A經I、L、H或M取代； (5) 位置164、187、192、207、220、296、300或495之V經I、Y、H取代；及 (6) 位置106之R經W取代。 在一些特定實施例中，RSV F蛋白突變體包含至少一個選自由以下組成之群之空腔填充突變：T54H、S190I及V296I。 在其他實施例中，本揭示內容提供RSV F蛋白突變體，其中突變體包含靜電突變，該等靜電突變減少蛋白質中在摺疊結構中彼此靠近之殘基之間之離子排斥或增加該等殘基之間之離子吸引。在若干實施例中，RSV F蛋白突變體包括靜電取代，其減小與來自RSV F三聚體之另一啟動子之Glu487及Asp489之酸性殘基之排斥性離子相互作用或增加吸引性離子相互作用。在一些具體實施例中，RSV F蛋白突變體包含選自由以下組成之群之靜電突變： (1) 位置82、92或487之E經D、F、Q、T、S、L或H取代； (2) 位置315、394或399之K經F、M、R、S、L、I、Q或T取代； (3) 位置392、486或489之D經H、S、N、T或P取代；及 (4) 位置106或339之R經F、Q、N或W取代。 在其他實施例中，本揭示內容提供RSV F蛋白突變體，其包含兩種或更多種選自工程化二硫鍵突變、空腔填充突變及靜電突變之不同類型之突變之組合。在一些特定實施例中，本發明提供野生型RSV F蛋白之突變體，其包含相對於相應野生型RSV F蛋白之突變組合，其中該突變組合選自由以下組成之群： (1) T103C、I148C、S190I及D486S之組合； (2) T54H、S55C、L188C及D486S之組合； (3) T54H、T103C、I148C、S190I、V296I及D486S之組合； (4) T54H、S55C、L142C、L188C、V296I及N371C之組合； (5) S55C、L188C及D486S之組合； (6) T54H、S55C、L188C及S190I之組合； (7) S55C、L188C、S190I及D486S之組合； (8) T54H、S55C、L188C、S190I及D486S之組合； (9) S155C、S190I、S290C及D486S之組合； (10) T54H、S55C、L142C、L188C、V296I、N371C、D486S、E487Q及D489S之組合；及 (11) T54H、S155C、S190I、S290C及V296I之組合。 在另一態樣中，本發明提供編碼本文所述RSV F蛋白突變體之核酸分子。在一些其他具體實施例中，本揭示內容提供編碼RSV F蛋白突變體之核酸分子，其中該核酸分子包含選自由以下組成之群之核苷酸序列： (1) SEQ ID NO: 8之核苷酸序列； (2) SEQ ID NO: 9之核苷酸序列； (3) SEQ ID NO: 10之核苷酸序列； (4) SEQ ID NO: 11之核苷酸序列； (5) SEQ ID NO: 12之核苷酸序列； (6) SEQ ID NO: 13之核苷酸序列； (7) SEQ ID NO: 14之核苷酸序列； (8) SEQ ID NO: 15之核苷酸序列； (9) SEQ ID NO: 16之核苷酸序列； (10) SEQ ID NO:17之核苷酸序列；及 (11) SEQ ID NO: 18之核苷酸序列。 在另一態樣中，本發明提供包含以下之組合物：(1) 本揭示內容中所述之RSV F蛋白突變體，或(2) 編碼此一RSV F蛋白突變體之核酸分子或載體。在一些特定實施例中，組合物係醫藥組合物，其包含本揭示內容提供之RSV F蛋白突變體及醫藥上可接受之載劑。在其他特定實施例中，醫藥組合物係疫苗。 本揭示內容亦係關於RSV F蛋白突變體、編碼例如RSV F蛋白突變體之核酸、或表現此一RSV F蛋白突變體之載體、或包含RSV F蛋白突變體或核酸之組合物之用途。在一些特定實施例中，本揭示內容提供預防個體之RSV感染之方法，其包含向該個體投與有效量之醫藥組合物(例如疫苗)，該醫藥組合物包含RSV F蛋白突變體、編碼RSV F蛋白突變體之核酸或表現RSV F蛋白突變體之載體。
相關申請案 本申請案主張對2015年12月23日申請之美國臨時申請案第62/387,270號及2016年11月11日申請之美國臨時申請案第62/421,184號之優先權。前述申請案各自之全部內容係以引用方式併入本文中。 本發明係關於RSV F蛋白突變體、包含RSV F蛋白突變體之免疫原性組合物、產生RSV F蛋白突變體之方法、包含RSV F蛋白突變體之組合物及編碼RSV F蛋白突變體之核酸。 A. 定義 術語「101F」係指US 2006/0159695 A1中所述之抗體，其具有包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列之重鏈可變結構域及包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列之輕鏈可變結構域。 除非上下文另有明確指示，否則如本文所用單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該」係指單數形式以及複數形式二者。舉例而言，術語「一種抗原」包括單一或複數種抗原且可視為等效於片語「至少一種抗原」。 術語「佐劑」係指能增強、加快或延長身體對疫苗中抗原(儘管其並非疫苗自身之靶抗原)之免疫反應之物質。佐劑可包括於疫苗組合物中，或可與疫苗分開投與。 術語「投與」係指藉由所選途徑將物質或組合物引入個體。投與可為局部或全身。舉例而言，若所選途徑係肌內，則組合物(例如包括所揭示免疫原之組合物)係藉由將組合物引入個體肌肉中來投與。 術語「AM14」係指WO 2008/147196 A2中所述之抗體，其具有包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列之重鏈可變結構域及包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之輕鏈可變結構域。 術語「AM22」係指WO 2011/043643 A1中所述之抗體，其具有包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之重鏈可變結構域及包含SEQ ID NO:27之胺基酸序列之輕鏈可變結構域。 術語「抗原」係指可由抗體識別之分子。抗原之實例包括含有抗原性決定子、例如由免疫細胞所識別之彼等之多肽、肽、脂質、多醣及核酸。 術語「保守取代」係指用化學相似胺基酸取代胺基酸。提供功能相似胺基酸之保守胺基酸取代為業內所熟知。以下6組各自含有彼此係保守取代之胺基酸： 1) 丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)； 2) 天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)； 3) 天冬醯胺(N)、麩醯胺酸(Q)； 4) 精胺酸(R)、離胺酸(K)； 5) 異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；及 6) 苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)。 術語「D25」係指WO 2008/147196 A2中所述之抗體，其具有包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列之重鏈可變結構域及包含SEQ ID NO:23之胺基酸序列之輕鏈可變結構域。 術語參照多核苷酸之「簡併變體」係指核苷酸序列與參照多核苷酸不同，但編碼與參照多核苷酸所編碼相同之多肽序列之多核苷酸。有20種天然胺基酸，其大多由一種以上密碼子所指定。例如，密碼子CGU、CGC、CGA、CGG、AGA及AGG皆編碼胺基酸精胺酸。因此，在蛋白質編碼序列內指定精胺酸之每一位置處，可在不改變所編碼蛋白質之情況下將密碼子改變為所述任一相應密碼子。由於遺傳密碼之簡併性，大量功能相同之核酸編碼任一給定多肽。 術語「DS-Cav1」係指RSV F蛋白之具有McLellan等人，Science, 342(6158), 592-598, 2013中所述胺基酸序列之形式。 術語「有效量」係指藥劑之足以生成期望反應之量。例如，此可係抑制病毒複製或可量測地改變病毒感染之外在症狀所需之量。 術語「表位」(或「抗原性決定子」或「抗原性位點」)係指抗體、B細胞受體或T細胞受體結合至其或對其反應之抗原區域。表位可自鄰接胺基酸或藉由蛋白質之二級、三級或四級摺疊相鄰之非鄰接胺基酸形成。自鄰接胺基酸形成之表位通常在暴露於變性溶劑後保留，而自更高級摺疊形成之表位通常在用變性溶劑處理後損失。 術語「F0多肽」 (F0)係指RSV F蛋白之前體多肽，其由信號多肽序列、F1多肽序列、pep27多肽序列及F2多肽序列組成。極少例外，已知RSV株之F0多肽由574個胺基酸組成。 術語「F1多肽」 (F1)係指成熟RSV F蛋白之多肽鏈。天然F1大致包括RSV F0前體之殘基137-574且由(自N-末端至C-末端)細胞外區域(約殘基137-524)、跨膜結構域(約殘基525-550)及細胞質結構域(約殘基551-574)組成。如本文所用，該術語涵蓋天然F1多肽及來自天然序列之包括修飾(例如，胺基酸取代、插入或缺失)之F1多肽二者，該等修飾例如經設計以穩定F突變體或增強F突變體之免疫原性之修飾。 術語「F2多肽」 (F2)係指成熟RSV F蛋白之多肽鏈。天然F2大致包括RSV F0前體之殘基26-109。如本文所用，該術語涵蓋天然F2多肽及來自天然序列之包括修飾(例如，胺基酸取代、插入或缺失)之F2多肽二者，該等修飾例如經設計以穩定F突變體或增強F突變體之免疫原性之修飾。在天然RSV F蛋白中，F2多肽藉由兩個二硫鍵連接至F1多肽以形成F2-F1異二聚體。術語「摺疊子」或「摺疊子結構域」係指能形成三聚體之胺基酸序列。該等摺疊子結構域之一個實例係衍生自噬菌體T4彈力素之肽序列，其具有GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO:40)之序列。術語「哺乳動物」係指哺乳動物綱(Mammalia class)之任何動物物種。哺乳動物之實例包括：人類；非人類靈長類動物，例如猴；實驗室動物，例如大鼠、小鼠、天竺鼠；家畜，例如貓、狗、兔、牛、綿羊、山羊、馬及豬；及捕獲之野生動物，例如獅、虎、象及諸如此類。 術語「醣蛋白」係指含有共價附接至多肽側鏈之寡醣鏈(聚醣)之蛋白質。碳水化合物以稱為醣基化之共轉譯或轉譯後修飾附接至蛋白質。術語「醣基化位點」係指多肽(例如蛋白質)表面上之胺基酸序列，其接納聚醣之附接。N-連接醣基化位點係NX(S/T)之三倍體序列，其中N係天冬醯胺，X係除脯胺酸以外之任何殘基，且(S/T)係絲胺酸或蘇胺酸殘基。聚醣係多醣或寡醣。聚醣亦可用於指醣偶聯物(例如醣蛋白、醣酯或蛋白多醣)之碳水化合物部分。 術語「宿主細胞」係指其中可增殖載體且可表現其DNA或RNA之細胞。該細胞可為原核或真核。 在兩種或更多種核酸或多肽序列之情況下，術語「一致性」或「一致性」百分比係指，在經比較且經比對用於最大對應性時，兩個或更多個序列或子序列相同或具有指定百分比之相同胺基酸殘基或核苷酸。用於比較之序列比對方法為業內所熟知。比對後，藉由計數兩個序列中存在一致核苷酸或胺基酸殘基之位置數來確定匹配數。序列一致性百分比係藉由以下方式來確定：將匹配數除以所鑑別序列中所述之序列長度，或除以聯接長度(例如來自所鑑別序列中所述序列之100個連續核苷酸或胺基酸殘基)，之後將所得值乘以100。舉例而言，在與具有1554個胺基酸之測試序列比對時具有1166個匹配之肽序列與測試序列75.0%一致(1166÷1554*100=75.0)。 用於比較之序列之最佳比對可藉由例如以下方法來實施：局部同源性算法，Smith及Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981；同源性比對算法，Needleman及Wunsch, Mol. Biol. 48:443, 1970；搜索類似性方法，Pearson及Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988；該等算法之電腦化實施(Wisconsin Genetics軟體包中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA，Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)；或人工比對及目視檢查(參見例如Sambrook等人(Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第4版，Cold Spring Harbor, New York, 2012)及Ausubel等人(In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York，增刊104, 2013))。 術語「免疫原性」係指物質在佐劑存在或不存在下，在動物中引起、引發、刺激或誘導針對特定抗原之免疫反應之能力。 術語「免疫反應」係指宿主哺乳動物中免疫系統細胞對刺激(例如免疫原)之任何可檢測反應，包括但不限於先天免疫反應(例如，類鐸(Toll)受體信號傳導級聯之活化)、細胞介導之免疫反應(例如，T細胞(例如抗原特異性T細胞)及免疫系統之非特異性細胞介導之反應)及體液性免疫反應(例如，B細胞介導之反應，例如生成抗體並分泌至血漿、淋巴及/或組織液中)。免疫反應之實例包括以下各項之改變(例如，增加)：類鐸受體活化、淋巴介質(例如，細胞介素(例如，Th1、Th2或Th17型細胞介素)或趨化介素)表現或分泌、巨噬細胞活化、樹突細胞活化、T細胞(例如，CD4+或CD8+ T細胞)活化、NK細胞活化、B細胞活化(例如，抗體生成及/或分泌)、免疫原(例如，抗原(例如，免疫原性多肽))結合至MHC分子、細胞毒性T淋巴球(「CTL」)反應之誘導、B細胞反應(例如，抗體產生)之誘導及免疫系統細胞(例如，T細胞及B細胞)之擴增(例如，細胞群生長)；以及抗原呈遞細胞之增加之抗原處理及呈遞。術語「免疫反應」亦涵蓋在活體外脊椎動物之免疫系統之一或多個組份對特定物質(例如抗原或免疫原)之任何可檢測反應。術語「免疫原」係指具有如下文所定義之免疫原性之化合物、組合物或物質。 術語「免疫原性組合物」係指包含免疫原之組合物。 術語「MPE8」係指Corti等人[Corti, D.、Bianchi, S.、Vanzetta, F.、Minola, A.、Perez, L.、Agatic, G.、Lanzavecchia, A. Cross-neutralization of four paramyxoviruses by a human monoclonal antibody. Nature, 501(7467), 439-443 (2013)]中所述抗體，其具有包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列之重鏈可變結構域及包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列之輕鏈可變結構域。術語野生型RSV F蛋白之「突變體」、RSV F蛋白之「突變體」、「RSV F蛋白突變體」或「經修飾RSV F蛋白」係指相對於野生型F蛋白顯示引入突變且具有針對野生型F蛋白之免疫原性之多肽。 術語「突變」係指與參照蛋白質或多肽之胺基酸序列相比，蛋白質或多肽之胺基酸序列中缺失、添加或取代胺基酸殘基。在通篇說明書及申請專利範圍中，在蛋白質序列中之一個特定位置取代胺基酸係使用記法「(野生型蛋白質中之胺基酸殘基)(胺基酸位置)(工程化蛋白質中之胺基酸殘基)」來提及。舉例而言，記法Y75A係指參照蛋白質之胺基酸序列第75位之酪胺酸(Y)殘基由丙胺酸(A)殘基取代(在參照蛋白質之突變體中)。在不同野生型序列之間相同位置之胺基酸殘基中存在變異之情形中，該記法中位置編號之前之胺基酸代碼可省略，例如「75A」。 術語「天然」或「野生型」蛋白質、序列或多肽係指未藉由選擇性突變經人工修飾之天然存在的蛋白質、序列或多肽。 術語「pep27多肽」或「pep27」係指在RSV F蛋白成熟期間自F0前體切除之27個胺基酸之多肽。pep27之序列側接兩個弗林蛋白酶裂解位點，該等裂解位點在F蛋白成熟期間藉由細胞蛋白酶裂解以生成F1及F2多肽。 術語「醫藥上可接受之載劑」係指在與活性成份組合時與活性成份相容且在投與個體、尤其哺乳動物時不引起毒性或其他不期望反應之材料或組合物。醫藥上可接受之載劑之實例包括溶劑、表面活性劑、懸浮劑、緩衝劑、潤滑劑、乳化劑、吸收劑、分散介質、包衣及穩定劑。 術語「融合前特異性抗體」係指特異性結合至呈融合前構形之RSV F醣蛋白，但不結合至呈融合後構形之RSV F蛋白之抗體。實例性融合前特異性抗體包括D25、AM22、5C4、MPE8及AM14抗體。 術語「融合前三聚體特異性抗體」係指特異性結合至呈融合前三聚體構形之RSV F醣蛋白，但不結合至呈融合後構形或呈亦非三聚體之融合前構形之RSV F蛋白之抗體。實例性融合前三聚體特異性抗體係AM14抗體。「融合前三聚體特異性抗體」係「融合前特異性抗體」之亞組。 術語「初免-加強疫苗接種」係指包括向個體投與第一免疫原性組合物(初免疫苗)，之後投與第二免疫原性組合物(加強疫苗)以誘導免疫反應之免疫治療方案。初免疫苗及加強疫苗通常含有相同免疫原且以相同或類似模式呈遞。然而，其亦可以不同模式呈遞，例如一者呈載體形式且另一者呈裸DNA質體形式。熟習此項技術者將瞭解投與初免疫苗及加強疫苗之間之適宜時間間隔。此外，初免疫苗、加強疫苗或初免疫苗及加強疫苗二者另外包括佐劑。 術語「融合前構形」係指RSV F蛋白或突變體採取之結構構形，其可由以下各項特異性結合：(i) 抗體D25，在RSV F蛋白或突變體呈單體或三聚體形式時，或(ii) 抗體AM14，在RSV F蛋白突變體呈三聚體形式時。融合前三聚體構形係融合前構形之亞組。 術語「融合後構形」係指RSV F蛋白採取之結構構形，其不由D25、AM22或AM14特異性結合。在病毒套膜與宿主細胞膜融合後，天然F蛋白採取融合後構形。在融合事件情況以外，例如在應力條件(例如熱及低滲透壓)下，在自膜提取時，在表現為胞外結構域時，或在儲存時，RSV F蛋白亦可採取融合後構形。 術語「可溶蛋白質」係指能溶解於水性液體中且保持溶解之蛋白質。蛋白質之溶解度可端視以下因素而變：蛋白質在水基液體中之濃度、液體之緩衝條件、液體中其他溶質之濃度(例如鹽及蛋白質濃度)及液體溫度。 在抗體結合至給定靶分子之情況下，術語「特異性結合」係指抗體以高於其與所測試其他物質結合之親和力與靶分子結合。舉例而言，特異性結合至呈融合前構形之RSV F蛋白之抗體係以高於其結合至呈融合後構形之RSV F蛋白之親和力結合呈融合前構形之RSV F蛋白之抗體。 術語「治療有效量」係指藥劑足以預防、治療(包括預防)病症、減少及/或改善病症之症狀及/或潛在病因之量。 術語「疫苗」係指包含能在個體中引發預防性或治療性免疫反應之免疫原之醫藥組合物。通常，疫苗引發針對病原體、例如病毒病原體之抗原之抗原特異性免疫反應。 術語「載體」係指能運輸或轉移外來核酸分子之核酸分子。該術語涵蓋表現載體及轉錄載體二者。術語「表現載體」係指能在靶細胞中表現插入物，且通常含有驅動插入物之表現之控制序列(例如增強子、啟動子及終止子序列)之載體。術語「轉錄載體」係指能被轉錄但不被轉譯之載體。轉錄載體用於擴增其插入物。外來核酸分子稱為「插入物」或「轉基因」。載體通常由插入物及用作載體主鏈之較大序列組成。基於載體之結構或來源，主要類型之載體包括質體載體、黏粒載體、噬菌體載體(例如λ噬菌體)、病毒載體(例如腺病毒(Ad)載體)及人工染色體。 B. RSV F蛋白突變體 在一些態樣中，本發明提供野生型RSV F蛋白之突變體，其中突變體顯示相對於相應野生型RSV F蛋白之胺基酸序列在胺基酸序列中引入突變且具有針對野生型RSV F蛋白或針對包含野生型F蛋白之病毒之免疫原性。在某些實施例中，RSV F突變體具有某些有益特徵，例如與相應野生型F蛋白相比增強之免疫原性性質或改良之呈突變體之融合前構形或突變體之融合前三聚體構形之穩定性。在其他實施例中，本揭示內容提供RSV F突變體，其顯示一或多個如本文所述引入突變且結合至選自抗體D25或抗體AM14之融合前特異性抗體。 RSV F蛋白突變體中所引入胺基酸突變包括胺基酸取代、缺失或添加。在一些實施例中，突變體胺基酸序列中之唯一突變係相對於野生型RSV F蛋白之胺基酸取代。 來自不同RSV亞型之眾多種天然RSV F蛋白之胺基酸序列以及編碼該等蛋白質之核酸序列為業內已知。舉例而言，若干種亞型A、B及牛RSV F0前體蛋白之序列闡述於SEQ ID NO:1、2、4、6及81-270中。 天然RSV F蛋白在RSV亞型之間展現顯著序列保守性。舉例而言，RSV亞型A及B共享90%序列一致性，且在F0前體分子範圍內RSV亞型A及B各自與牛RSV F蛋白共享81%序列一致性。在RSV亞型內，F0序列一致性甚至更高；例如在RSV A、B及牛亞型之每一者內，RSV F0前體蛋白具有約98%序列一致性。幾乎所有經鑑別RSV F0前體序列皆由574個胺基酸之長度組成，且長度通常由於C-末端胞質尾區之長度而有微小差異。不同天然RSV F蛋白之間之序列一致性為業內已知(例如，參見WO2014/160463)。為進一步闡釋F蛋白之序列保守程度，來自代表性RSV A株及RSV B株之F0前體多肽序列之間之非共有胺基酸殘基分別提供於表17及18中(其中非共有胺基酸係遵循來自RSV A株之所選F蛋白序列之比對用ClustalX (2版)鑑別)。 鑒於RSV F序列之實質性保守性，熟習此項技術者可容易地比較不同天然RSV F序列之間之胺基酸位置以鑑別不同RSV株及亞型之間之相應RSV F胺基酸位置。舉例而言，在幾乎所有經鑑別天然RSV F0前體蛋白之間，弗林蛋白酶裂解位點落在相同胺基酸位置中。因此，天然RSV F蛋白序列在株與亞型之間之保守性容許使用參照RSV F序列來比較RSV F蛋白中特定位置之胺基酸。出於本揭示內容之目的(除非上下文另有指示)，RSV F蛋白胺基酸位置係參照SEQ ID NO: 1中所述F0前體多肽之序列(RSV A2株之全長天然F前體多肽之胺基酸序列；對應於GenInfo標識符GI 138251及Swiss Prot標識符P03420)給出。然而，應注意到，且熟習此項技術者將理解，例如，若與SEQ ID NO:1相比添加或移除其他胺基酸殘基，則不同RSV F0序列可具有不同編號系統。因此，應理解，在藉由其編號提及特定胺基酸殘基時，該闡述不僅限於自給定胺基酸序列開始處計數時精確地位於該編號位置之胺基酸，而係欲指任何及所有RSV F序列中之等效/相應胺基酸殘基，即使該殘基並非位於相同精確編號位置，例如在RSV序列短於或長於SEQ ID NO:1，或與SEQ ID NO: 1相比具有插入或缺失之情況下。B-1. RSV F 蛋白突變體之結構 本揭示內容提供之RSV F蛋白突變體包含F1多肽及F2多肽。在若干實施例中，突變體進一步包含三聚化結構域。在一些實施例中，F1多肽或F2多肽包括至少一個如下文詳細闡述之引入修飾(例如，胺基酸取代)。在一些其他實施例中，F1多肽及F2多肽各自包括至少一個如下文詳細闡述之引入修飾(例如，胺基酸取代)。 B-1(a). RSV F 突變體之 F1 多肽及 F2 多肽 在一些實施例中，突變體呈RSV F蛋白之成熟形式，其包含兩個單獨多肽鏈，即F1多肽及F2多肽。在一些其他實施例中，F2多肽藉由一個或兩個二硫鍵連接至F1多肽以形成F2-F1多肽異二聚體。在其他實施例中，RSV F突變體呈單鏈蛋白質形式，其中F2多肽藉由肽鍵或肽連接體連接至F1多肽。可使用將兩條多肽鏈接合在一起之任何適宜肽連接體。該等連接體之實例包括G、GG、GGG、GS及SAIG連接體序列。連接體亦可係全長pep27序列或其片段。 突變體之F1多肽鏈可具有與相應野生型RSV F蛋白之全長F1多肽相同之長度；然而，其亦可具有缺失，例如自全長F1多肽之C-末端缺失1至最多60個胺基酸殘基。RSV F突變體之全長F1多肽對應於天然RSV F0前體之胺基酸位置137-574，且包括(自N-末端至C-末端)細胞外區域(殘基137-524)、跨膜結構域(殘基525-550)及細胞質結構域(殘基551-574)。應注意，天然F1多肽序列中胺基酸殘基514向前係本文所提供RSV F突變體之F1多肽之可選序列，且因此可在突變體之F1多肽中不存在。 在一些實施例中，RSV F突變體之F1多肽缺少整個細胞質結構域。在其他實施例中，F1多肽缺少細胞質結構域及一部分或全部跨膜結構域。在一些具體實施例中，突變體包含F1多肽，其中自位置510、511、512、513、514、515、520、525或530至574之胺基酸殘基不存在。通常，對於連接至三聚化結構域(例如摺疊子)之突變體，胺基酸514至754可不存在。因此，在一些具體實施例中，胺基酸殘基514至574在突變體之F1多肽中不存在。在其他具體實施例中，RSV F突變體之F1多肽包含天然F0多肽序列之胺基酸殘基137-513，例如SEQ ID No: 1、2、4、6及81-270中所述之任一F0前體序列，或由其組成。 另一方面，RSV F突變體之F1多肽可包括與三聚化結構域(例如摺疊子)之C-末端鏈接。本文所揭示RSV F突變體之多個序列包括蛋白酶裂解位點序列，例如凝血酶裂解位點(LVPRGS)；蛋白質標籤，例如6× His-標籤(HHHHHH)及鏈黴素標籤II (WSHPGFEK)；或連接體序列(例如GG及GS) (見圖1)，該等序列並非為RSV F蛋白之功能、例如誘導免疫反應所必需。熟習此項技術者將識別該等序列，且在適當時理解，該等序列不包括於所揭示之RSV F突變體中。 在本揭示內容提供之RSV F突變體中，F2多肽鏈可具有與相應野生型RSV F蛋白之全長F2多肽相同之長度；其亦可具有缺失，例如自F2多肽之N-末端或C-末端缺失1、2、3、4、5、6、7或8個胺基酸殘基。 呈F0形式(即，包含接合至具有或不具有部分或全長pep 27之F1多肽之F2多肽之單鏈多肽)或F1-F2異二聚體形式之突變體可形成啟動子。突變體亦可呈三聚體形式，其包含三個相同啟動子。此外，突變體可係醣基化蛋白質(即，醣蛋白)或非醣基化蛋白質。呈F0形式之突變體可包括或可缺少信號肽序列。 將一或多個突變引入其中之RSV F蛋白突變體之F1多肽及F2多肽可來自任何業內已知或將來發現之野生型RSV F蛋白，包括但不限於RSV亞型A及亞型B株(包括A2安大略(Ontario)及布宜諾斯艾利斯(Buenos Aires))或任何其他亞型之F蛋白胺基酸序列。在一些實施例中，RSV F突變體包含來自RSV A病毒之F1及/或F2多肽，例如來自SEQ ID NO: 1、2、4、6及81-270中任一者所述之將一或多個突變引入其中之RSV F0前體蛋白之F1及/或F2多肽。在一些其他實施例中， RSV F突變體包含來自RSV B病毒之F1及/或F2多肽，例如來自SEQ ID NO:2及211-263中任一者所述之將一或多個突變引入其中之RSV F0前體蛋白之F1及/或F2多肽。在其他實施例中，RSV F突變體包含來自RSV牛病毒之F1及/或F2多肽，例如來自SEQ ID NO:264-270中任一者所述之將一或多個突變引入其中之RSV F0前體蛋白之F1及/或F2多肽。 在一些實施例中，RSV F蛋白突變體包含F1-多肽、F2多肽及如下文所述之一或多個引入胺基酸突變，其中F1多肽包含350個連續胺基酸且與SEQ ID NO:1、4及81-210之任一序列之胺基酸137-513至少90、95、98或99%一致，其中F2多肽包含70個連續胺基酸且與SEQ ID NO:1、4及81-210之任一序列之胺基酸26-109至少90、95、98或99%一致且其中RSV F蛋白突變體作為單體或三聚體以融合前構形經穩定。在一些實施例中，F1多肽包含350個連續胺基酸且與SEQ ID NO:2、6及211-263之任一序列之胺基酸137-513至少90、95、98或99%一致，且F2多肽包含70個連續胺基酸且與SEQ ID NO:2、6及211-263之任一序列之胺基酸26-109至少90、95、98或99%一致，且在一些其他實施例中，RSV F蛋白突變體以融合前三聚體構形經穩定。 B-1(b) 三聚化結構域 在若干實施例中，本揭示內容提供至RSV F突變體連接至三聚化結構域。在一些實施例中，三聚化結構域促進形成3個F1/F2異二聚體之三聚體。 若干種促進形成可溶蛋白質之穩定三聚體之外源多聚化結構域為業內已知。該等可連接至本揭示內容所提供突變體之多聚化結構域之實例包括：(1) GCN4白胺酸拉鍊(Harbury等人1993 Science 262: 1401-1407)；(2) 來自肺表面活性劑蛋白之三聚化基序(Hoppe等人1994 FEB S Lett 344: 191-195)；(3) 膠原(McAlinden等人2003 Biol Chem 278:42200-42207)；及(4) 噬菌體T4彈力素摺疊子(Miroshnikov等人1998 Protein Eng 11:329-414)。在一些實施例中，摺疊子結構域在F1多肽C-末端連接至F突變體。在具體實施例中，摺疊子結構域係T4彈力素摺疊子結構域，例如胺基酸序列GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO: 40)。 通常，多聚化結構域定位於F1多肽C-末端。其可直接接合至F1多肽鏈。視情況，多聚化結構域經由連接體(例如胺基酸連接體，例如序列GG、GS或SAIG)連接至F1多肽。連接體亦可係較長連接體(例如，包括重複序列GG)。多種構形中性連接體為業內已知，其可用於本揭示內容所提供之突變體中。在一些實施例中，包含摺疊子結構域之F突變體包括用於自F1多肽移除摺疊子結構域之蛋白酶裂解位點，例如F1多肽與摺疊子結構域之間之凝血酶位點。B-2. RSV F 蛋白突變體中之引入突變 本揭示內容提供之RSV F突變體包含F1多肽及F2多肽，其中(1) F1多肽或(2) F2多肽或(3) F1多肽及F2多肽二者相對於相應天然F蛋白之胺基酸序列包括一或多個引入胺基酸突變。RSV F突變體中該等胺基酸突變之引入賦予突變體有益性質，例如增強之免疫原性，改良之穩定性，或突變體之某一期望物理形式或構形之形成或改良穩定性。該等引入胺基酸突變稱為「工程化二硫鍵突變」、「空腔填充突變」或「靜電突變」，且詳細闡述於下文中。包括任何其他突變之RSV F突變體亦涵蓋於本發明中，只要突變體之免疫原性性質不因該等其他突變受到顯著不良影響即可。 B-2(a) 工程化二硫鍵突變 在一些實施例中，本揭示內容所提供RSV F突變體包括一或多個工程化二硫鍵突變。術語「工程化二硫鍵突變」係指野生型RSV F蛋白中一對胺基酸殘基突變為一對半胱胺酸殘基。引入之半胱胺酸殘基對容許在引入半胱胺酸殘基之間形成二硫鍵，該二硫鍵用於穩定蛋白質構形或寡聚狀態，例如融合前構形。對於穩定突變體之融合前構形，突變為半胱胺酸之殘基對應在融合前構形中非常接近但在融合後構形中遠離。該等殘基可藉由業內已知之適宜方法來鑑別，例如目視檢查呈融合前構形之RSV F之晶體結構，或使用計算型蛋白質設計軟體之更定量之選擇(例如BioLuminateTM [BioLuminate, Schrodinger LLC, New York, 2015]、Discovery StudioTM [Discovery Studio Modeling Environment, Accelrys, San Diego, 2015 ]、MOETM [Molecular Operating Environment, Chemical Computing Group Inc., Montreal, 2015 ]及RosettaTM [Rosetta, University of Washington , Seattle, 2015])。較佳地，在融合前構形中殘基對(例如β碳)之間之距離小於8Å，但在融合後構形中大於20 Å。 在一些實施例中，RSV F蛋白突變體包含僅一個工程化二硫鍵突變(「單一工程化二硫鍵突變」)。在一些其他實施例中，RSV F蛋白突變體包含至少兩個工程化二硫鍵突變，其中工程化二硫鍵突變之每對半胱胺酸殘基在RSV F蛋白突變體呈融合前構形時適當定位(「雙重工程化二硫鍵突變」)。 在一些具體實施例中，本揭示內容提供包含至少一個工程化二硫鍵突變之RSV F突變體，其中突變體包含在表1及4-6中提供之任一實例性突變體中之相同引入突變。表1及4-6中提供之實例性RSV F突變體係基於具有位置102、379及447之3個天然取代之RSV A2株之相同天然F0序列(SEQ ID NO:3)。可將每一突變體中之相同引入突變引入任何其他RSV亞型或株之天然F0多肽序列中，以獲得不同RSV F突變體，例如SEQ ID NO: 1、2、4、6及81-270中之任一者所述之天然F0多肽序列。基於任何其他RSV亞型或株之天然F0多肽序列且包含任何工程化二硫鍵突變之RSV F突變體亦在本發明之範圍內。在一些特定實施例中，RSV F蛋白突變體包含至少一個選自由以下組成之群之工程化二硫鍵突變：55C及188C；155C及290C；103C及148C；及142C及371C，例如S55C及L188C、S155C及S290C、T103C及I148C或L142C及N371C。 在一些實施例中，本揭示內容提供RSV F蛋白突變體，其中胺基酸突變係RSV F蛋白之HRB區域(約胺基酸476 – 524)中之一對胺基酸殘基突變為一對半胱胺酸。引入之半胱胺酸殘基對容許自三聚體之兩個毗鄰F2-F1突變體啟動子在半胱胺酸殘基之間形成二硫鍵。連接三聚體中兩個啟動子之二硫鍵用於穩定呈三聚體狀態之突變體。該等突變之特定對之實例包括：508C及509C；515C及516C；522C及523C，例如K508C及S509C、N515C及V516C或T522C及T523C。在一些實施例中，RSV F突變體包含(1) HRB區域中之至少一對半胱胺酸突變及(2) 在HRB區域外之至少一個選自以下之引入突變：如上文所述工程化二硫鍵突變、如下文所述空腔填充突變、如下文所述靜電突變或該等突變中任一者之組合。 B-2(b) 空腔填充 突變 . 在其他實施例中，本揭示內容提供包含一或多個空腔填充突變之RSV F突變體。術語「空腔填充突變」係指野生型RSV F蛋白中之胺基酸殘基經預期填充成熟RSV F蛋白之內部空腔之胺基酸取代。在一種應用中，該等空腔填充突變有助於穩定RSV F蛋白突變體之融合前構形。RSV F蛋白之融合前構形中之空腔可藉由業內已知之方法來鑑別，例如目視檢查呈融合前構形之RSV F之晶體結構，或使用計算型蛋白質設計軟體(例如BioLuminateTM [BioLuminate, Schrodinger LLC, New York, 2015]、Discovery StudioTM [Discovery Studio Modeling Environment, Accelrys, San Diego, 2015]、MOETM [Molecular Operating Environment, Chemical Computing Group Inc., Montreal, 2015]及RosettaTM [Rosetta, University of Washington, Seattle, 2015])。欲替代用於空腔填充突變之胺基酸通常包括小脂肪族(例如Gly、Ala及Val)或小極性胺基酸(例如Ser及Thr)。其亦可包括埋於融合前構形中，但暴露於融合後構形中之溶劑之胺基酸。替代胺基酸可為大脂肪族胺基酸(Ile、Leu及Met)或大芳香族胺基酸(His、Phe、Tyr及Trp)。舉例而言，在若干實施例中，RSV F蛋白突變體包括T54H突變。 在一些具體實施例中，RSV F蛋白突變體包含一或多個選自由以下組成之群之空腔填充突變： 1) 位置55、62、155、190或290之S經I、Y、L、H或M取代； 2) 位置54、58、189、219或397之T經I、Y、L、H或M取代； 3) 位置151之G經A或H取代； 4) 位置147或298之A經I、L、H或M取代； 5) 位置164、187、192、207、220、296、300或495之V經I、Y、H取代；及 6) 位置106之R經W取代。 在一些具體實施例中，本揭示內容提供包含一或多個空腔填充突變之RSV F突變體，其中突變體包含表2、4及6中提供之任一突變體中之空腔填充突變。表2、4及6中提供之RSV F突變體係基於具有位置102、379及447之三個天然取代之RSV A2株之相同天然F0序列(SEQ ID NO:3)。可將每一突變體中之相同引入突變引入任何其他RSV亞型或株之天然F0多肽序列中以獲得不同RSV F突變體，例如SEQ ID NO:1、2、4、6及81-270之任一者中所述之天然F0多肽序列。基於任何其他RSV亞型或株之天然F0多肽序列且包含一或多個空腔填充突變中之任一者之RSV F突變體亦在本發明之範圍內。在一些特定實施例中，本揭示內容提供之RSV F蛋白突變體包含至少一個選自由以下組成之群之空腔填充突變：T54H、S190I及V296I。 B-2 (c) 靜電突變 . 在其他實施例中，本揭示內容提供包括一或多個靜電突變之RSV F蛋白突變體。術語「靜電突變」係指引入野生型RSV F蛋白中之胺基酸突變，該等突變減少蛋白質中在摺疊結構中彼此靠近之殘基之間之離子排斥或增加該等殘基之間之離子吸引。由於氫鍵係離子吸引之特殊情形，故靜電突變可增加該等接近殘基之間之氫鍵。在一實例中，可引入靜電突變以改良三聚體穩定性。在一些實施例中，在RSV F醣蛋白之融合前構形中但並非在其融合後構形中，引入靜電突變以減小在RSV F醣蛋白中非常接近之殘基之間之排斥性離子相互作用或增加吸引性離子相互作用(潛在地包括氫鍵)。舉例而言，在融合前構形中，來自RSV F醣蛋白三聚體之一個啟動子之Asp486之酸性側鏈位於三聚體界面處且結構上夾在來自另一啟動子之Glu487及Asp489之另外兩個酸性側鏈之間。另一方面，在融合後構形中，Asp486之酸性側鏈位於三聚體表面上且暴露於溶劑中。在若干實施例中，RSV F蛋白突變體包括靜電D486S取代，其減小與來自RSV F三聚體之另一啟動子之Glu487及Asp489之酸性殘基之排斥性離子相互作用或增加吸引性離子相互作用。通常，引入靜電突變將提高RSV F蛋白之融合前構形或融合前三聚體構形之熔融溫度(Tm)。 融合前或融合前三聚體構形中之不利靜電相互作用可藉由業內已知方法來鑑別，例如目視檢查呈融合前或融合前三聚體構形之RSV F之晶體結構，或使用計算型蛋白質設計軟體(例如BioLuminateTM [BioLuminate, Schrodinger LLC, New York, 2015]、Discovery StudioTM [Discovery Studio Modeling Environment, Accelrys, San Diego, 2015]、MOETM [Molecular Operating Environment, Chemical Computing Group Inc., Montreal, 2015.]及RosettaTM [Rosetta, University of Washington, Seattle, 2015.])。 在一些具體實施例中，RSV F蛋白突變體包含至少一個選自由以下組成之群之靜電突變： 1) 位置82、92或487之E經D、F、Q、T、S、L或H取代； 2) 位置315、394或399之K經F、M、R、S、L、I、Q或T取代； 3) 位置392、486或489之D經H、S、N、T或P取代；及 4) 位置106或339之R經F、Q、N或W取代。 在一些具體實施例中，本揭示內容提供包含一或多個靜電突變之RSV F突變體，其中突變體包含表3、5及6中提供之任一突變體中之靜電突變。表3、5及6中提供之RSV F突變體係基於具有位置102、379及447之三個天然取代之RSV A2株之相同天然F0序列(SEQ ID NO:3)。可將每一突變體中之相同引入突變引入任何其他RSV亞型或株之天然F0多肽序列中以獲得不同RSV F突變體，例如SEQ ID NO:1、2、4、6及81-270之任一者中所述之天然F0多肽序列。基於任何其他RSV亞型或株之天然F0多肽序列且包含一或多個靜電突變中之任一者之RSV F突變體亦在本發明之範圍內。在一些特定實施例中，RSV F蛋白突變體包含突變D486S。 B-2 (d) 工程化二硫鍵突變、空腔填充突變及靜電突變之組合 . 在另一態樣中，本揭示內容提供RSV F蛋白突變體，其包含兩種或更多種選自工程化二硫鍵突變、空腔填充突變及靜電突變之不同類型之突變之組合，每種突變如上文所述。 在一些實施例中，突變體包含至少一個工程化二硫鍵突變及至少一個空腔填充突變。在一些具體實施例中，RSV F突變體包括表4中所述突變之組合。 在一些其他實施例中，RSV F蛋白突變體包含至少一個工程化二硫鍵突變及至少一個靜電突變。在一些具體實施例中，RSV F突變體包括如表5中所述突變之組合。 在其他實施例中，RSV F蛋白突變體包含至少一個工程化二硫鍵突變、至少一個空腔填充突變及至少一個靜電突變。在一些具體實施例中，RSV F突變體包括如表6中所提供突變之組合。 在一些特定實施例中，本發明提供RSV F突變體，其包含選自由以下組成之群之突變之組合： (1) T103C、I148C、S190I及D486S之組合； (2) T54H、S55C、L188C及D486S之組合； (3) T54H、T103C、I148C、S190I、V296I及D486S之組合； (4) T54H、S55C、L142C、L188C、V296I及N371C之組合； (5) S55C、L188C及D486S之組合； (6) T54H、S55C、L188C及S190I之組合； (7) S55C、L188C、S190I及D486S之組合； (8) T54H、S55C、L188C、S190I及D486S之組合； (9) S155C、S190I、S290C及D486S之組合； (10) T54H、S55C、L142C、L188C、V296I、N371C、D486S、E487Q及D489S之組合；及 (11) T54H、S155C、S190I、S290C及V296I之組合。 在一些具體實施例中，本揭示內容提供包含引入突變之組合之RSV F突變體，其中突變體包含表4、5及6中提供之任一突變體中之突變之組合。表4、5及6中之RSV F突變體係基於具有位置102、379及447之三個天然取代之RSV A2株之相同天然F0序列(SEQ ID NO:3)。可將每一突變體中之相同引入突變引入任何其他RSV亞型或株之天然F0多肽序列中以獲得不同RSV F突變體，例如SEQ ID NO:1、2、4、6及81-270之任一者中所述之天然F0多肽序列。基於任何其他RSV亞型或株之天然F0多肽序列且包含任一突變組合之RSV F突變體亦在本發明之範圍內。 在一些其他特定實施例中，本發明提供RSV F突變體，其中突變體包含位置103 (103C)及位置148 (148C)之半胱胺酸(C)、位置190 (190I)之異白胺酸(I)及位置486 (486S)之絲胺酸(S)，且其中該突變體包含選自由以下組成之群之F1多肽及F2多肽： (1) 包含SEQ ID NO:41之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:42之胺基酸序列之F1多肽； (2) 包含與SEQ ID NO:41之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:42之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (3) 包含SEQ ID NO:43之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:44之胺基酸序列之F1多肽； (4) 包含與SEQ ID NO:43之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:44之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (5) 包含SEQ ID NO:45之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:46之胺基酸序列之F1多肽； (6) 包含與SEQ ID NO:45之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:46之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (7) 包含SEQ ID NO:47之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:48之胺基酸序列之F1多肽； (8) 包含與SEQ ID NO:47之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:48之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (9) 包含SEQ ID NO:49之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:50之胺基酸序列之F1多肽； (10) 包含與SEQ ID NO:49之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:50之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (11) 包含SEQ ID NO:279之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:280之胺基酸序列之F1多肽； (12) 包含與SEQ ID NO:279之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:280之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (13) 包含SEQ ID NO:281之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:282之胺基酸序列之F1多肽； (14) 包含與SEQ ID NO:281之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:282之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (15) 包含SEQ ID NO:283之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:284之胺基酸序列之F1多肽； (16) 包含與SEQ ID NO:283之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:284之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (17) 包含SEQ ID NO:285之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:286之胺基酸序列之F1多肽； (18) 包含與SEQ ID NO:285之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:286之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (19) 包含SEQ ID NO:287之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:288之胺基酸序列之F1多肽； (20) 包含與SEQ ID NO:287之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:288之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (21) 包含SEQ ID NO:289之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:290之胺基酸序列之F1多肽；及 (22) 包含與SEQ ID NO:289之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:290之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽。 在一些其他特定實施例中，本發明提供RSV F突變體，其中突變體包含位置54之組胺酸(H)、位置103及148之半胱胺酸(C)、位置190及296之異白胺酸(I)及位置486之絲胺酸(S)，且其中該突變體包含選自由以下組成之群之F1多肽及F2多肽： (1) 包含SEQ ID NO:51之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:52之胺基酸序列之F1多肽； (2) 包含與SEQ ID NO:51之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:52之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (3) 包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:54之胺基酸序列之F1多肽； (4) 包含與SEQ ID NO:53之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:54之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (5) 包含SEQ ID NO:55之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:56之胺基酸序列之F1多肽； (6) 包含與SEQ ID NO:55之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:56之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (7) 包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:58之胺基酸序列之F1多肽； (8) 包含與SEQ ID NO:57之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:58之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (9) 包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列之F1多肽； (10) 包含與SEQ ID NO:59之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:60之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (11) 包含SEQ ID NO:291之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:292之胺基酸序列之F1多肽； (12) 包含與SEQ ID NO:291之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:292之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (13) 包含SEQ ID NO:293之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:294之胺基酸序列之F1多肽； (14) 包含與SEQ ID NO:293之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:294之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (15) 包含SEQ ID NO:295之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:296之胺基酸序列之F1多肽； (16) 包含與SEQ ID NO:295之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:296之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (17) 包含SEQ ID NO:297之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:298之胺基酸序列之F1多肽； (18) 包含與SEQ ID NO:297之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:298之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (19) 包含SEQ ID NO:299之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:300之胺基酸序列之F1多肽； (20) 包含與SEQ ID NO:299之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:300之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (21) 包含SEQ ID NO:301之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:302之胺基酸序列之F1多肽；及 (22) 包含與SEQ ID NO:301之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:302之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽。 在一些其他特定實施例中，本發明提供RSV F突變體，其中突變體包含位置54之組胺酸(H)、位置55及188之半胱胺酸(C)及位置486之絲胺酸(S)，且其中該突變體包含選自由以下組成之群之F1多肽及F2多肽： (1) 包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:62之胺基酸序列之F1多肽； (2) 包含與SEQ ID NO:61之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:62之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (3) 包含SEQ ID NO:63之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:64之胺基酸序列之F1多肽； (4) 包含與SEQ ID NO:63之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:64之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (5) 包含SEQ ID NO:65之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:66之胺基酸序列之F1多肽； (6) 包含與SEQ ID NO:65之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:66之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (7) 包含SEQ ID NO:67之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:68之胺基酸序列之F1多肽； (8) 包含與SEQ ID NO:67之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:68之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (9) 包含SEQ ID NO:69之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:70之胺基酸序列之F1多肽； (10) 包含與SEQ ID NO:69之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:70之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (11) 包含SEQ ID NO:303之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:304之胺基酸序列之F1多肽； (12) 包含與SEQ ID NO:303之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:304之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (13) 包含SEQ ID NO:305之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:306之胺基酸序列之F1多肽； (14) 包含與SEQ ID NO:305之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:306之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (15) 包含SEQ ID NO:307之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:308之胺基酸序列之F1多肽； (16) 包含與SEQ ID NO:307之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:308之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (17) 包含SEQ ID NO:309之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:310之胺基酸序列之F1多肽； (18) 包含與SEQ ID NO:309之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:310之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (19) 包含SEQ ID NO:311之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:312之胺基酸序列之F1多肽； (20) 包含與SEQ ID NO:311之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:312之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (21) 包含SEQ ID NO:313之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:314之胺基酸序列之F1多肽；及 (22) 包含與SEQ ID NO:313之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:314之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽。 在一些其他特定實施例中，本發明提供RSV F突變體，其中突變體包含位置54之組胺酸(H)、位置55及188之半胱胺酸(C)、位置190之異白胺酸(I) (190I)及位置486之絲胺酸(S)，且其中該突變體包含選自由以下組成之群之F1多肽及F2多肽： (1) 包含SEQ ID NO:71之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:72之胺基酸序列之F1多肽； (2) 包含與SEQ ID NO:71之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:72之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (3) 包含SEQ ID NO:73之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:74之胺基酸序列之F1多肽； (4) 包含與SEQ ID NO:73之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:74之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (5) 包含SEQ ID NO:75之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:76之胺基酸序列之F1多肽； (6) 包含與SEQ ID NO:75之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:76之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (7) 包含SEQ ID NO:77之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:78之胺基酸序列之F1多肽； (8) 包含與SEQ ID NO:77之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:78之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (9) 包含SEQ ID NO:79之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:80之胺基酸序列之F1多肽； (10) 包含與SEQ ID NO:79之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:80之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (11) 包含SEQ ID NO:315之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:316之胺基酸序列之F1多肽； (12) 包含與SEQ ID NO:315之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:316之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (13) 包含SEQ ID NO:317之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:318之胺基酸序列之F1多肽； (14) 包含與SEQ ID NO:317之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:318之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (15) 包含SEQ ID NO:319之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:320之胺基酸序列之F1多肽； (16) 包含與SEQ ID NO:319之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:320之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (17) 包含SEQ ID NO:321之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:322之胺基酸序列之F1多肽； (18) 包含與SEQ ID NO:321之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:322之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (19) 包含SEQ ID NO:323之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:324之胺基酸序列之F1多肽； (20) 包含與SEQ ID NO:323之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:324之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (21) 包含SEQ ID NO:325之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:326之胺基酸序列之F1多肽；及 (22) 包含與SEQ ID NO:325之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:326之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽。 本揭示內容提供之實例性RSV F突變體之F2多肽及F1多肽之胺基酸序列提供於表19-22中。 在若干實施例中，摺疊子結構域連接至上文所述之RSV F突變體，其中摺疊子結構域連接至F1多肽C-末端且包含SEQ ID NO:40之胺基酸序列。 本揭示內容提供之RSV F蛋白突變體可藉由業內已知之常規方法來製備，例如在重組宿主系統中使用適宜載體表現。適宜重組宿主細胞包括例如昆蟲細胞、哺乳動物細胞、禽類細胞、細菌及酵母細胞。適宜昆蟲細胞之實例包括例如Sf9細胞、Sf21細胞、Tn5細胞、Schneider S2細胞及High Five細胞(自親代粉紋夜蛾(Trichoplusia ni) BTI-TN-5B1-4細胞系衍生之無性系分離物(Invitrogen))。適宜哺乳動物細胞之實例包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人類胚腎細胞(HEK293或Expi 293細胞，通常藉由經剪切腺病毒5型DNA轉變)、NIH-3T3細胞、293-T細胞、Vero細胞及HeLa細胞。適宜禽類細胞包括例如雞胚胎幹細胞(例如，EBx.RTM.細胞)、雞胚胎纖維母細胞、雞胚胎生殖細胞、鵪鶉纖維母細胞(例如ELL-O)及鴨細胞。適宜昆蟲細胞表現系統、例如桿狀病毒載體系統為熟習此項技術者已知且闡述於例如Summers及Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987)中。桿狀病毒/昆蟲細胞表現系統之材料及方法尤其可以套組形式購自Invitrogen, San Diego Calif。禽類細胞表現系統亦為熟習此項技術者已知且闡述於例如美國專利第5,340,740號、第5,656,479號、第5,830,510號、第6,114,168號及第6,500,668號中。類似地，細菌及哺乳動物細胞表現系統亦為業內已知且闡述於例如Yeast Genetic Engineering (Barr等人編輯，1989) Butterworths, London中。 用於在昆蟲或哺乳動物細胞表現重組蛋白之多種適宜載體為業內熟知且習用。適宜載體可含有多種組份，包括但不限於以下中之一或多種：複製起點；可選標記物基因；一或多種表達控制元件，例如轉錄控制元件(例如，啟動子、增強子、終止子)及/或一或多種轉譯信號；及用於在所選宿主細胞(例如，哺乳動物來源或來自異源哺乳動物或非哺乳動物物種)中靶向分泌路徑之信號序列或前導序列。舉例而言，對於在昆蟲細胞中表現，使用適宜桿狀病毒表現載體、例如pFastBac (Invitrogen)來產生重組桿狀病毒顆粒。桿狀病毒顆粒經擴增且用於感染昆蟲細胞以表現重組蛋白。對於在哺乳動物細胞中表現，使用將在期望哺乳動物宿主細胞(例如，中國倉鼠卵巢細胞)中驅使構築體表現之載體。 RSV F蛋白突變體多肽可使用任何適宜方法純化。舉例而言，藉由免疫親和層析純化RSV F蛋白突變體多肽之方法為業內已知。Ruiz-Arguello等人，J. Gen. Virol., 85:3677-3687 (2004)。純化期望蛋白質之適宜方法為業內所熟知，包括沈澱及各種類型之層析，例如疏水相互作用層析、離子交換層析、親和層析、螯合層析及粒徑篩析層析。適宜純化方案可使用兩種或更多種該等或其他適宜方法產生。若期望，RSV F蛋白突變體多肽可包括有助於純化之「標籤」，例如表位標識或組胺酸(HIS)標籤。該等帶標籤多肽可便捷地純化，例如自條件化培養基藉由螯合層析或親和層析純化。 C. 編碼RSV F蛋白突變體之核酸 在另一態樣中，本發明提供編碼上文所述RSV F蛋白突變體之核酸分子。該等核酸分子包括DNA、cDNA及RNA序列。編碼RSV F突變體之僅F2多肽或僅F1多肽之核酸分子亦涵蓋於本發明中。可將核酸分子併入載體、例如表現載體中。 在一些實施例中，核酸分子編碼前體F0多肽，其在適當細胞中表現時經處理為所揭示RSV F突變體。在一些實施例中，核酸分子編碼前體F0多肽，其在適當細胞中表現時經處理為所揭示RSV F突變體，其中前體F0多肽自N-末端至C-末端包括信號肽、F2多肽、Pep27多肽及F1多肽。在一些實施例中，Pep27多肽包含如任一SEQ ID NO:1、2、4、6及81-270之位置110-136所述之胺基酸序列，其中該等胺基酸位置對應於SEQ ID NO:1之胺基酸序列。在一些實施例中，信號肽包含如任一SEQ ID NO:1、2、4、6及81-270之位置1-25所述之胺基酸序列，其中該等胺基酸位置對應於SEQ ID NO:1參照之胺基酸序列。 在一些實施例中，核酸分子編碼選自由以下組成之群之突變體： (1) 包含至少一個工程化二硫鍵突變之突變體； (2) 包含至少一個空腔填充突變之突變體； (3) 包含至少一個靜電突變之突變體； (4) 包含至少一個工程化二硫鍵突變及至少一個空腔填充突變之突變體； (5) 包含至少一個工程化二硫鍵突變及至少一個靜電突變之突變體； (6) 包含至少一個空腔填充突變及至少一個靜電突變之突變體；及 (7) 包含至少一個工程化二硫鍵突變、至少一個空腔填充突變及至少一個靜電突變之突變體。 在一些具體實施例中，本揭示內容提供核酸分子，其編碼選自由以下組成之群之突變體： (1) 包含取代103C、148C、190I及486S之組合之突變體； (2) 包含取代54H、55C、188C及486S之組合之突變體； (3) 包含取代54H、103C、148C、190I、296I及486S之組合之突變體； (4) 包含取代54H、55C、142C、188C、296I及371C之組合之突變體； (5) 包含胺基酸取代55C、188C及486S之組合之突變體； (6) 包含胺基酸取代54H、55C、188C及190I之組合之突變體； (7) 包含胺基酸取代55C、188C、190I及486S之組合之突變體； (8) 包含胺基酸取代54H、55C、188C、190I及486S之組合之突變體； (9) 包含胺基酸取代155C、190I、290C及486S之組合之突變體； (10) 包含胺基酸取代54H、55C、142C、188C、296I、371C、486S、487Q及489S之組合之突變體；及 (11) 包含胺基酸取代54H、155C、190I、290C及296I之組合之突變體。 在一些特定實施例中，核酸分子編碼RSV F突變體，其中該突變體包含位置103 (103C)及位置148 (148C)之半胱胺酸(C)、位置190 (190I)之異白胺酸(I)及位置486 (486S)之絲胺酸(S)，且其中該突變體包含選自由以下組成之群之F1多肽及F2多肽： (1) 包含SEQ ID NO:41之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:42之胺基酸序列之F1多肽； (2) 包含與SEQ ID NO:41之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:42之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (3) 包含SEQ ID NO:43之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:44之胺基酸序列之F1多肽； (4) 包含與SEQ ID NO:43之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:44之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (5) 包含SEQ ID NO:45之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:46之胺基酸序列之F1多肽； (6) 包含與SEQ ID NO:45之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:46之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (7) 包含SEQ ID NO:47之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:48之胺基酸序列之F1多肽； (8) 包含與SEQ ID NO:47之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:48之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (9) 包含SEQ ID NO:49之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:50之胺基酸序列之F1多肽； (10) 包含與SEQ ID NO:49之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:50之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (11) 包含SEQ ID NO:279之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:280之胺基酸序列之F1多肽； (12) 包含與SEQ ID NO:279之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:280之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (13) 包含SEQ ID NO:281之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:282之胺基酸序列之F1多肽； (14) 包含與SEQ ID NO:281之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:282之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (15) 包含SEQ ID NO:283之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:284之胺基酸序列之F1多肽； (16) 包含與SEQ ID NO:283之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:284之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (17) 包含SEQ ID NO:285之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:286之胺基酸序列之F1多肽； (18) 包含與SEQ ID NO:285之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:286之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (19) 包含SEQ ID NO:287之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:288之胺基酸序列之F1多肽； (20) 包含與SEQ ID NO:287之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:288之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (21) 包含SEQ ID NO:289之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:290之胺基酸序列之F1多肽；及 (22) 包含與SEQ ID NO:289之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:290之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽。 在一些其他特定實施例中，核酸分子編碼RSV F突變體，其中該突變體包含位置54之組胺酸(H)、位置103及148之半胱胺酸(C)、位置190及296之異白胺酸(I)及位置486之絲胺酸(S)，且其中該突變體包含選自由以下組成之群之F1多肽及F2多肽： (1) 包含SEQ ID NO:51之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:52之胺基酸序列之F1多肽； (2) 包含與SEQ ID NO:51之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:52之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (3) 包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:54之胺基酸序列之F1多肽； (4) 包含與SEQ ID NO:53之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:54之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (5) 包含SEQ ID NO:55之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:56之胺基酸序列之F1多肽； (6) 包含與SEQ ID NO:55之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:56之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (7) 包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:58之胺基酸序列之F1多肽； (8) 包含與SEQ ID NO:57之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:58之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (9) 包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列之F1多肽； (10) 包含與SEQ ID NO:59之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:60之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (11) 包含SEQ ID NO:291之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:292之胺基酸序列之F1多肽； (12) 包含與SEQ ID NO:291之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:292之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (13) 包含SEQ ID NO:293之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:294之胺基酸序列之F1多肽； (14) 包含與SEQ ID NO:293之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:294之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (15) 包含SEQ ID NO:295之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:296之胺基酸序列之F1多肽； (16) 包含與SEQ ID NO:295之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:296之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (17) 包含SEQ ID NO:297之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:298之胺基酸序列之F1多肽； (18) 包含與SEQ ID NO:297之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:298之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (19) 包含SEQ ID NO:299之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:300之胺基酸序列之F1多肽； (20) 包含與SEQ ID NO:299之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:300之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (21) 包含SEQ ID NO:301之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:302之胺基酸序列之F1多肽；及 (22) 包含與SEQ ID NO:301之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:302之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽。 在一些其他特定實施例中，核酸分子編碼RSV F突變體，其中該突變體包含位置54之組胺酸(H)、位置55及188之半胱胺酸(C)及位置486之絲胺酸(S)，且其中該突變體包含選自由以下組成之群之F1多肽及F2多肽： (1) 包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:62之胺基酸序列之F1多肽； (2) 包含與SEQ ID NO:61之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:62之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (3) 包含SEQ ID NO:63之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:64之胺基酸序列之F1多肽； (4) 包含與SEQ ID NO:63之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:64之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (5) 包含SEQ ID NO:65之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:66之胺基酸序列之F1多肽； (6) 包含與SEQ ID NO:65之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:66之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (7) 包含SEQ ID NO:67之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:68之胺基酸序列之F1多肽； (8) 包含與SEQ ID NO:67之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:68之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (9) 包含SEQ ID NO:69之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:70之胺基酸序列之F1多肽； (10) 包含與SEQ ID NO:69之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:70之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (11) 包含SEQ ID NO:303之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:304之胺基酸序列之F1多肽； (12) 包含與SEQ ID NO:303之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:304之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (13) 包含SEQ ID NO:305之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:306之胺基酸序列之F1多肽； (14) 包含與SEQ ID NO:305之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:306之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (15) 包含SEQ ID NO:307之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:308之胺基酸序列之F1多肽； (16) 包含與SEQ ID NO:307之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:308之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (17) 包含SEQ ID NO:309之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:310之胺基酸序列之F1多肽； (18) 包含與SEQ ID NO:309之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:310之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (19) 包含SEQ ID NO:311之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:312之胺基酸序列之F1多肽； (20) 包含與SEQ ID NO:311之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:312之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (21) 包含SEQ ID NO:313之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:314之胺基酸序列之F1多肽；及 (22) 包含與SEQ ID NO:313之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:314之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽。 在一些其他特定實施例中，核酸分子編碼RSV F突變體，其中該突變體包含位置54之組胺酸(H)、位置55及188之半胱胺酸(C)、位置190之異白胺酸(I) (190I)及位置486之絲胺酸(S)，且其中該突變體包含選自由以下組成之群之F1多肽及F2多肽： (1) 包含SEQ ID NO:71之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:72之胺基酸序列之F1多肽； (2) 包含與SEQ ID NO:71之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:72之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (3) 包含SEQ ID NO:73之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:74之胺基酸序列之F1多肽； (4) 包含與SEQ ID NO:73之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:74之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (5) 包含SEQ ID NO:75之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:76之胺基酸序列之F1多肽； (6) 包含與SEQ ID NO:75之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:76之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (7) 包含SEQ ID NO:77之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:78之胺基酸序列之F1多肽； (8) 包含與SEQ ID NO:77之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:78之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (9) 包含SEQ ID NO:79之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:80之胺基酸序列之F1多肽； (10) 包含與SEQ ID NO:79之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:80之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (11) 包含SEQ ID NO:315之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:316之胺基酸序列之F1多肽； (12) 包含與SEQ ID NO:315之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:316之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (13) 包含SEQ ID NO:317之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:318之胺基酸序列之F1多肽； (14) 包含與SEQ ID NO:317之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:318之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (15) 包含SEQ ID NO:319之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:320之胺基酸序列之F1多肽； (16) 包含與SEQ ID NO:319之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:320之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (17) 包含SEQ ID NO:321之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:322之胺基酸序列之F1多肽； (18) 包含與SEQ ID NO:321之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:322之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (19) 包含SEQ ID NO:323之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:324之胺基酸序列之F1多肽； (20) 包含與SEQ ID NO:323之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:324之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (21) 包含SEQ ID NO:325之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:326之胺基酸序列之F1多肽；及 (22) 包含與SEQ ID NO:325之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:326之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽。 在一些具體實施例中，本揭示內容提供核酸分子，其編碼選自由以下組成之群之突變體： (1) 包含SEQ ID NO:19之胺基酸26-513之突變體； (2) 包含SEQ ID NO:20之胺基酸26-513之突變體；及 (3) 包含SEQ ID NO:21之胺基酸26-513之突變體。 在一些其他具體實施例中，本揭示內容提供編碼RSV F蛋白突變體之核酸分子或其簡併變體，其中該核酸分子包含選自由以下組成之群之核苷酸序列： (1) 包含SEQ ID NO:8之核苷酸76-1539之核苷酸序列； (2) 包含SEQ ID NO:9之核苷酸76-1539之核苷酸序列； (3) 包含SEQ ID NO:10之核苷酸76-1539之核苷酸序列； (4) 包含SEQ ID NO:11之核苷酸76-1539之核苷酸序列； (5) 包含SEQ ID NO:12之核苷酸76-1539之核苷酸序列； (6) 包含SEQ ID NO:13之核苷酸76-1539之核苷酸序列； (7) 包含SEQ ID NO:14之核苷酸76-1539之核苷酸序列； (8) 包含SEQ ID NO:15之核苷酸76-1539之核苷酸序列； (9) 包含SEQ ID NO:16之核苷酸76-1539之核苷酸序列； (10) 包含SEQ ID NO:17之核苷酸76-1539之核苷酸序列；及 (11) 包含SEQ ID NO:18之核苷酸76-1539之核苷酸序列。 D. 包含RSV F蛋白突變體之組合物；包含編碼RSV F蛋白突變體之核酸之組合物 在另一態樣中，本發明提供包含以下之組合物：(1) 本揭示內容中所述之RSV F蛋白突變體，或(2) 編碼此一RSV F蛋白突變體之核酸分子或載體。 在一些實施例中，組合物係能引發個體針對RSV之F蛋白之免疫反應之免疫原性組合物。在一些特定實施例中，免疫原性組合物係醫藥組合物，其包含本揭示內容提供之RSV F蛋白突變體及醫藥上可接受之載劑。 在其他實施例中，醫藥組合物係疫苗。疫苗中之免疫原性組份可為(1) 本揭示內容中所述之RSV F蛋白突變體，(2) 編碼例如RSV F蛋白突變體之核酸，或(3) 用於表現此一RSV F蛋白突變體之載體。 在一些特定實施例中，疫苗包含RSV F突變體，其中該突變體包含位置103 (103C)及位置148 (148C)之半胱胺酸(C)、位置190 (190I)之異白胺酸(I)及位置486 (486S)之絲胺酸(S)，且其中該突變體包含選自由以下組成之群之F1多肽及F2多肽： (1) 包含SEQ ID NO:41之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:42之胺基酸序列之F1多肽； (2) 包含與SEQ ID NO:41之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:42之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (3) 包含SEQ ID NO:43之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:44之胺基酸序列之F1多肽； (4) 包含與SEQ ID NO:43之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:44之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (5) 包含SEQ ID NO:45之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:46之胺基酸序列之F1多肽； (6) 包含與SEQ ID NO:45之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:46之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (7) 包含SEQ ID NO:47之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:48之胺基酸序列之F1多肽； (8) 包含與SEQ ID NO:47之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:48之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (9) 包含SEQ ID NO:49之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:50之胺基酸序列之F1多肽； (10) 包含與SEQ ID NO:49之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:50之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (11) 包含SEQ ID NO:279之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:280之胺基酸序列之F1多肽； (12) 包含與SEQ ID NO:279之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:280之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (13) 包含SEQ ID NO:281之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:282之胺基酸序列之F1多肽； (14) 包含與SEQ ID NO:281之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:282之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (15) 包含SEQ ID NO:283之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:284之胺基酸序列之F1多肽； (16) 包含與SEQ ID NO:283之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:284之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (17) 包含SEQ ID NO:285之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:286之胺基酸序列之F1多肽； (18) 包含與SEQ ID NO:285之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:286之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (19) 包含SEQ ID NO:287之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:288之胺基酸序列之F1多肽； (20) 包含與SEQ ID NO:287之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:288之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (21) 包含SEQ ID NO:289之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:290之胺基酸序列之F1多肽；及 (22) 包含與SEQ ID NO:289之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:290之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽。 在一些其他特定實施例中，疫苗包含RSV F突變體，其中該突變體包含位置54之組胺酸(H)、位置103及148之半胱胺酸(C)、位置190及296之異白胺酸(I)及位置486之絲胺酸(S)，且其中該突變體包含選自由以下組成之群之F1多肽及F2多肽： (1) 包含SEQ ID NO:51之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:52之胺基酸序列之F1多肽； (2) 包含與SEQ ID NO:51之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:52之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (3) 包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:54之胺基酸序列之F1多肽； (4) 包含與SEQ ID NO:53之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:54之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (5) 包含SEQ ID NO:55之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:56之胺基酸序列之F1多肽； (6) 包含與SEQ ID NO:55之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:56之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (7) 包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:58之胺基酸序列之F1多肽； (8) 包含與SEQ ID NO:57之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:58之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (9) 包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列之F1多肽； (10) 包含與SEQ ID NO:59之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:60之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (11) 包含SEQ ID NO:291之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:292之胺基酸序列之F1多肽； (12) 包含與SEQ ID NO:291之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:292之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (13) 包含SEQ ID NO:293之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:294之胺基酸序列之F1多肽； (14) 包含與SEQ ID NO:293之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:294之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (15) 包含SEQ ID NO:295之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:296之胺基酸序列之F1多肽； (16) 包含與SEQ ID NO:295之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:296之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (17) 包含SEQ ID NO:297之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:298之胺基酸序列之F1多肽； (18) 包含與SEQ ID NO:297之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:298之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (19) 包含SEQ ID NO:299之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:300之胺基酸序列之F1多肽； (20) 包含與SEQ ID NO:299之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:300之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (21) 包含SEQ ID NO:301之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:302之胺基酸序列之F1多肽；及 (22) 包含與SEQ ID NO:301之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:302之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽。 在一些其他特定實施例中，疫苗包含RSV F突變體，其中該突變體包含位置54之組胺酸(H)、位置55及188之半胱胺酸(C)及位置486之絲胺酸(S)，且其中該突變體包含選自由以下組成之群之F1多肽及F2多肽： (1) 包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:62之胺基酸序列之F1多肽； (2) 包含與SEQ ID NO:61之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:62之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (3) 包含SEQ ID NO:63之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:64之胺基酸序列之F1多肽； (4) 包含與SEQ ID NO:63之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:64之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (5) 包含SEQ ID NO:65之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:66之胺基酸序列之F1多肽； (6) 包含與SEQ ID NO:65之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:66之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (7) 包含SEQ ID NO:67之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:68之胺基酸序列之F1多肽； (8) 包含與SEQ ID NO:67之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:68之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (9) 包含SEQ ID NO:69之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:70之胺基酸序列之F1多肽； (10) 包含與SEQ ID NO:69之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:70之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (11) 包含SEQ ID NO:303之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:304之胺基酸序列之F1多肽； (12) 包含與SEQ ID NO:303之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:304之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (13) 包含SEQ ID NO:305之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:306之胺基酸序列之F1多肽； (14) 包含與SEQ ID NO:305之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:306之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (15) 包含SEQ ID NO:307之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:308之胺基酸序列之F1多肽； (16) 包含與SEQ ID NO:307之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:308之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (17) 包含SEQ ID NO:309之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:310之胺基酸序列之F1多肽； (18) 包含與SEQ ID NO:309之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:310之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (19) 包含SEQ ID NO:311之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:312之胺基酸序列之F1多肽； (20) 包含與SEQ ID NO:311之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:312之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (21) 包含SEQ ID NO:313之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:314之胺基酸序列之F1多肽；及 (22) 包含與SEQ ID NO:313之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:314之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽。 在一些其他特定實施例中，疫苗包含RSV F突變體，其中該突變體包含位置54之組胺酸(H)、位置55及188之半胱胺酸(C)、位置190之異白胺酸(I) (190I)及位置486之絲胺酸(S)，且其中該突變體包含選自由以下組成之群之F1多肽及F2多肽： (1) 包含SEQ ID NO:71之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:72之胺基酸序列之F1多肽； (2) 包含與SEQ ID NO:71之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:72之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (3) 包含SEQ ID NO:73之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:74之胺基酸序列之F1多肽； (4) 包含與SEQ ID NO:73之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:74之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (5) 包含SEQ ID NO:75之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:76之胺基酸序列之F1多肽； (6) 包含與SEQ ID NO:75之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:76之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (7) 包含SEQ ID NO:77之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:78之胺基酸序列之F1多肽； (8) 包含與SEQ ID NO:77之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:78之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (9) 包含SEQ ID NO:79之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:80之胺基酸序列之F1多肽； (10) 包含與SEQ ID NO:79之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:80之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (11) 包含SEQ ID NO:315之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:316之胺基酸序列之F1多肽； (12) 包含與SEQ ID NO:315之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:316之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (13) 包含SEQ ID NO:317之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:318之胺基酸序列之F1多肽； (14) 包含與SEQ ID NO:317之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:318之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (15) 包含SEQ ID NO:319之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:320之胺基酸序列之F1多肽； (16) 包含與SEQ ID NO:319之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:320之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (17) 包含SEQ ID NO:321之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:322之胺基酸序列之F1多肽； (18) 包含與SEQ ID NO:321之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:322之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (19) 包含SEQ ID NO:323之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:324之胺基酸序列之F1多肽； (20) 包含與SEQ ID NO:323之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:324之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽； (21) 包含SEQ ID NO:325之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO:326之胺基酸序列之F1多肽；及 (22) 包含與SEQ ID NO:325之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO:326之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽。 在一些實施例中，組合物、例如醫藥組合物或疫苗包含兩種或更多種不同RSV F突變體。該兩種或更多種不同RSV F突變體可包含相同引入胺基酸突變，但包含來自不同RSV株或亞型之F1多肽及F2多肽。該兩種或更多種不同RSV F突變體可包含不同引入胺基酸突變。 在一些實施例中，組合物包含兩種包含相同引入胺基酸突變之不同突變體，其中一種突變體包含來自RSV亞型A之F1多肽及F2多肽且其中另一種突變體包含來自RSV亞型B之F1多肽及F2多肽。在一些具體實施例中，兩種不同突變體包含選自由以下組成之群之相同胺基酸取代組合： (1) 胺基酸取代103C、148C、190I及486S之組合； (2) 胺基酸取代54H、55C、188C及486S之組合； (3) 胺基酸取代54H、103C、148C、190I、296I及486S之組合； (4) 胺基酸取代54H、55C、142C、188C、296I及371C之組合； (5) 胺基酸取代55C、188C及486S之組合； (6) 胺基酸取代54H、55C、188C及190I 之組合； (7) 胺基酸取代55C、188C、190I及486S之組合； (8) 胺基酸取代54H、55C、188C、190I及486S之組合； (9) 胺基酸取代155C、190I、290C及486S之組合； (10) 胺基酸取代54H、55C、142C、188C、296I、371C、486S、487Q及489S之組合；及 (11) 胺基酸取代54H、155C、190I、290C及296I之組合。 除了免疫原性組份以外，疫苗可進一步包含免疫調節劑，例如佐劑。適宜佐劑之實例包括鋁鹽，例如氫氧化鋁及/或磷酸鋁；油乳液組合物(或水包油組合物)，包括角鯊烯-水乳液，例如MF59 (例如，參見WO 90/14837)；皂素調配物，例如QS21及免疫刺激複合物(ISCOMS) (例如，參見美國專利第5,057,540號；WO 90/03184、WO 96/11711、WO 2004/004762、WO 2005/002620)；細菌或微生物衍生物，其實例係單磷醯脂質A (MPL)、3-O-去醯化MPL (3dMPL)、含CpG-基序之寡核苷酸、ADP-核糖基化細菌毒素或其突變體，例如大腸桿菌(E. coli )熱不穩定腸毒素LT、霍亂毒素CT及諸如此類。亦可能藉由(例如)使用編碼C4結合蛋白(C4 bp)之寡聚結構域與目標抗原之融合物之異源核酸來使用編碼載體之佐劑(例如Solabomi等人，2008, Infect Immun 76：3817-23)。在某些實施例中，本發明組合物包含鋁作為佐劑，例如呈氫氧化鋁、磷酸鋁、磷酸鋁鉀或其組合之形式，濃度為每劑量0.05 mg-5 mg (例如0.075 mg-1.0 mg)鋁含量。 E. RSV F蛋白突變體、核酸分子及組合物之用途 本揭示內容亦係關於RSV F蛋白突變體、編碼RSV F蛋白突變體之核酸、或用於表現RSV F蛋白突變體之載體、或包含RSV F蛋白突變體或核酸之組合物之用途。 在若干實施例中，本揭示內容提供引發個體針對RSV之免疫反應之方法，其包含向該個體投與有效量之RSV F蛋白突變體、編碼RSV F蛋白突變體之核酸分子或包含RSV F蛋白突變體或核酸分子之組合物。 在一些特定實施例中，本揭示內容提供預防個體之RSV感染之方法，其包含向該個體投與有效量之醫藥組合物(例如疫苗)，該醫藥組合物包含RSV F蛋白突變體、編碼RSV F蛋白突變體之核酸或表現RSV F蛋白突變體之載體。在一些實施例中，個體為人類。在一些特定實施例中，人類係兒童，例如嬰兒。在一些其他特定實施例中，人類係女性，尤其懷孕女性。 組合物可在投與或不投與佐劑之情況下投與個體。投與個體之有效量係足以引發個體針對RSV抗原、例如RSV F蛋白之免疫反應之量。可經選擇用於治療之個體包括由於暴露於或可能暴露於RSV而具有發生RSV感染之風險之彼等。由於幾乎所有人類截至2歲時皆經RSV感染，故包括全部出生世代作為免疫相關群體。此可藉由例如以下方式來實施：在自出生至6個月齡中之任一時間、自6個月齡至5歲中之任一時間、在懷孕女性(或育齡女性)中(以藉由抗體之被動轉移保護其嬰兒)、新生嬰兒或彼等仍在子宮內之嬰兒之家庭成員中及大於50歲之個體中開始免疫方案。具有最大RSV感染風險且具有嚴重症狀(例如需要住院)之個體包括患有早產、支氣管肺發育不良及先天心臟病之兒童。 本揭示內容所提供組合物、例如醫藥組合物之投與可使用標準投與途徑來實施。非限制性實施例包括非經腸投與，例如真皮內、肌內、皮下、透皮、黏膜或經口投與。 在一次投與期間提供至個體之組合物之總劑量可變，如熟練開業醫師已知。 亦可能提供一或多種疫苗組合物之一或多次加強投與。若實施加強疫苗接種，則此一加強疫苗接種通常將在首次向個體投與組合物(其在該等情形中稱作「初免疫苗接種」)後1週與10年之間、較佳2週與6個月之間之時刻投與同一個體。在替代加強方案中，亦可能在初免疫苗接種後向個體投與不同載體，例如一或多種腺病毒，或其他載體，例如經修飾安卡拉(Ankara)牛痘病毒(MVA)或DNA或蛋白質。例如，可能向個體投與本發明重組病毒載體作為初免，且用包含RSV F蛋白之組合物進行加強。 在某些實施例中，投與包含初免投與及至少一次加強投與。在某些其他實施例中，投與係每年提供。在其他實施例中，投與係每年與流行性感冒疫苗一起提供。 本揭示內容所提供疫苗可與一或多種其他疫苗一起使用。舉例而言，在成人中，其可與流行性感冒疫苗、Prevnar、破傷風疫苗、白喉疫苗及百日咳疫苗一起使用。對於兒科用途，本揭示內容所提供疫苗可與經指示用於兒科患者之任何其他疫苗一起使用。 表17. 來自所選RSV A株之F蛋白序列之間之非共有胺基酸殘基. 表18. 來自所選RSV B株之F蛋白序列之間之非共有胺基酸殘基. 表19. 包含引入突變T103C、I148C、S190I及D486S之突變體pXCS847之變體 表20. 包含引入突變T54H、T103C、I148C、S190I、V296I、D486S之突變體pXCS851之變體 表21. 包含引入突變T54H、S55C、L188C、D486S之突變體pXCS852之變體 表22. 包含引入突變T54H、S55C、L188C、S190I、D486S之突變體pXCS855之變體 表23. 序列索引 F. 實例 藉由以下說明性實例進一步闡述本發明。該等實例不以任何方式限制本發明。其僅用於闡明本發明。實例 1 ： RSV F 蛋白突變體之設計及製備 1A ：具有摺疊子結構域之 RSV F 突變體 本實例闡釋各種RSV F蛋白突變體之設計及製備，該等突變體包括彈力素摺疊子三聚化結構域及引入胺基酸突變，例如工程化二硫鍵突變、空腔填充突變、靜電突變或其組合。實例性RSV F突變體(其各自藉由唯一標識符標識，例如pXCS501、pXCS601等)提供於表1-6中。該等突變體各自基於SEQ ID NO:3中所述之胺基酸序列來設計及製備，該序列亦闡述於圖1中。SEQ ID NO:3之序列之胺基酸殘基1-513與如SEQ ID NO:1中所述之天然RSV A2之F0前體多肽之胺基酸殘基1-513一致，但在SEQ ID NO:3之序列中有三個天然取代P102A、I379V及M447V。因此，除了如針對表1-6中列示之每一突變體所述之引入胺基酸突變以外，該等實例性F突變體之胺基酸序列一致。該等RSV F蛋白突變體各自包含兩個單獨多肽鏈。一個多肽鏈、即F2多肽包含SEQ ID NO:3之胺基酸26-109，如所述之引入突變除外。另一多肽鏈包含經由SAIG連接體(殘基514-517)連接至摺疊子三聚化結構域(殘基518-544)之F1多肽(殘基137-513)。SEQ ID NO:3之信號肽(殘基1-25)及pep27 (殘基110-136)係在表現過程期間自F0前體裂解。勇於表現及純化該等實例性RSV F突變體之方法闡述於實例2及3中。1B ：無摺疊子結構域之 RSV F 突變體 RSV F突變體pXCS899無摺疊子結構域，其係以上文實例1A中所述之相同方法製備，但SEQ ID NO:3之F0前體序列之胺基酸514-544缺失。pXCS899之前體多肽之胺基酸序列闡述於SEQ ID NO:271中。 表1. 包含工程化二硫鍵突變之實例性RSV F蛋白突變體 表2. 包含空腔填充突變之實例性RSV F蛋白突變體 表3. 包含靜電突變之實例性RSV F蛋白突變體 表4. 包含工程化二硫鍵突變及空腔填充突變之實例性RSV F蛋白突變體 表5. 包含工程化二硫鍵突變及靜電突變之實例性RSV F蛋白突變體。 表6. 包含工程化二硫鍵突變、空腔填充突變及靜電突變之組合之實例性RSV F蛋白突變體。 實例 2. RSV F 突變體表現載體構築 使用標準分子生物學技術使編碼具有天然取代P102A、I379V及M447V之SEQ ID NO:1中所述天然RSV A2 F0多肽之核酸分子突變，以編碼具有期望引入胺基酸突變之RSV F突變體之前體多肽。該前體多肽之結構及組份闡述於圖1及SEQ ID NO:3中。該前體多肽包含信號肽(殘基1-25)、F2多肽(殘基26-109)、pep27多肽(殘基110-136)、F1多肽(殘基137-513)、T4彈力素摺疊子(殘基518-544)、凝血酶識別序列(547-552)、純化標籤(HIS-標籤(殘基553-558))、鏈黴素標籤II (殘基561-568)及連接體序列(殘基514-517、545、546、559及560)。 藉由DNA2.0 (Menlo Park, CA)使SEQ ID NO:3之蛋白質序列進行哺乳動物密碼子最佳化及合成。將所合成基因產物引入市售表現載體pcDNA3.1/Zeo(+) (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)中，其已經修飾以編碼康黴素抗性而非胺苄青黴素抗性且編碼CAG啟動子[Niwa, H.、Yamamura, K.及Miyazaki, J., Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene, 108(2), 193-199, 1991]代替CMV啟動子。用QuikChange引子設計算法(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)設計誘變性寡核苷酸，且所有寡核苷酸皆購自Integrated DNA Technologies (Coralville, IA)。用QuikChange Lightning多點誘變套組(Agilent Technologies)併入核苷酸取代、插入及缺失。在用Dpn I消化初始質體模板後，藉由聚合酶鏈式反應(PCR)以高保真度Q5 DNA聚合酶(New England Biolabs, Ipswich, MA)或PrimeSTAR HS (Premix) DNA聚合酶(Takara/Clontech, Mountain View, CA)再次擴增經誘變F等位基因，且用NEBuilder HiFi DNA裝配套組(New England Biolabs)或用Gibson裝配混合母液(New England Biolabs)將所得產物插入哺乳動物表現載體中。藉由DNA測序確認既定序列之存在。用QIAprep Spin MiniPrep套組(Qiagen, Valencia, CA)或用EndoFree Plasmid Mega套組(Qiagen)純化用於轉染至Expi293細胞中之質體DNA。對於所有商業套組或試劑，根據製造商方案執行程序。實例 3. RSV F 蛋白突變體之表現及純化 藉由用如實例2所述裝配且製備之DNA構築體瞬時轉染Expi293F細胞(ThermoFisher, Waltham, MA)產生用於RSV F蛋白突變體評估之蛋白質。瞬時轉染係根據製造商方案來實施。 使用切向流過濾將澄清細胞培養物濃縮5-10倍，之後在Ni-IMAC管柱上緩衝液交換為適用於捕獲之緩衝液。將含有可溶F蛋白之條件化細胞培養基加載至Ni-IMAC管柱上。使用濃度遞增之咪唑溶析產物。彙集含有產物之部分且隨後加載於Strep-Tactin管柱(IBA Life Sciences, Goettingen, Germany)上。使用濃度遞增之去硫生物素自Strep-Tactin管柱溶析產物。彙集含有產物之部分並透析至最終儲存緩衝液中。粗培養上清液及經純化蛋白用於本文所述之活體外及活體內分析中。實例 4 ： RSV F 蛋白突變體之穩定性 藉由應力測試及儲存穩定性實驗評估所設計RSV F蛋白突變體之穩定性。在熱應力測試期間，將所設計突變體之粗培養上清液在50℃或60℃下培育1小時並在ELISA分析中用融合前特異性單株抗體D25及融合前三聚體特異性抗體AM14探測。受應力樣品對未受應力樣品之抗體反應性之比率定義為應力抗性參數。預期更穩定之突變體具有較高應力抗性。在儲存穩定性分析期間，比較在4℃下儲存1週後粗培養上清液中之融合前抗體反應性與新鮮培養上清液之反應性。活性比率定義為突變體之儲存穩定性。 結果呈現於表7A-7C及8A-8C中。應力抗性計算為應力後保留之融合前特異性mAb反應性分率(「NR」 – 未檢測到反應性，「ND」 – 未測定)。將自個別工程化二硫鍵突變體、空腔填充突變體及靜電突變體鑑別之最強穩定性胺基酸取代(融合前穩定性由熱應力後保留之D25反應性界定)組合為組合突變體。該等組合突變體亦經受熱應力且用兩種單株抗體– D25 (融合前特異性)及AM14 (融合前三聚體特異性)探測。由AM14抗體識別之融合前三聚體特異性四元表位對熱應力較D25表位顯著更敏感(表8B)。任何組合突變體在60℃應力後未保留顯著AM14反應性，但大多數突變體在60℃熱應力後保留D25反應性。此觀察提供重要證據AM14抗體係融合前結構損失、且尤其融合前三聚體狀態之顯著更精確之指示物。 表7A. 含有工程化二硫鍵之突變體之熱及儲存穩定性 表7B. 含有空腔填充突變之突變體之熱及儲存穩定性 表7C. 含有靜電突變之突變體之熱及儲存穩定性 表8A. 含有雙重組合突變之突變體之熱及儲存穩定性 表8B. 含有三重組合突變之突變體之熱及儲存穩定性 應力抗性計算為應力後保留之融合前特異性mAb (D25)及融合前三聚體特異性mAb (AM14)反應性之分率。「NR」 – 未檢測到反應性，「ND」 – 未測定。 表8C：無摺疊子三聚化結構域之突變體(pXCS899)之熱穩定性 實例 5 ：用一組單株抗體評估之 RSV F 蛋白突變體之構形完整性 . 該研究之目的係鑑別維持RSV-F融合前構形(包括融合前三聚體構形及締合)之結構完整性之RSV F蛋白突變體。體針對一組參照mAb測試每一突變，該等參照mAb包括兩個位點ø-及融合前特異性mAb (AM22及D25)、一個結合靠近位點II之表位且亦係融合前特異性之mAb (MPE8)，一個結合融合前及融合後F二者之位點II特異性mAb (帕利珠單抗(palivizumab)，Synagis® )、一個融合前三聚體特異性mAb (AM14)及一個結合融合前及融合後F二者之位點IV特異性抗體(101F)。預期維持融合前構形之RSV F蛋白突變體結合所測試之所有參照抗體。 使用量測即時生物分子相互作用動力學之OCTETHTX (ForteBio, Pall Corporation, Port Washington, NY)儀器來評估每一突變體之抗體反應性。以1000 rpm攪動在30℃溫度下在96孔黑色板(Greiner Bio-One, Monroe, NC)中以200 µL/孔之最終體積進行實驗。在開始結合量測之前使抗HIS生物感測器尖端在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)、2%牛血清白蛋白(BSA)、0.05% Tween 20 (PBT)中平衡10 min。帶HIS-標籤之突變體蛋白由抗HIS生物感測器捕獲5 min。在PBT中經3 min建立基線，之後以20 nM抗體在PBT中經10 min進行締合步驟。使所有抗體在用於建立基線之相同孔中解離20 min。基於締合及解離步驟之曲線擬合，且假定1:1可逆結合相互作用，使用OCTET數據分析軟體(8.2版，Pall Corp.)進行動力學分析。每一突變體對各種參照單株抗體之結合反應(nm移動)呈現於表9A及9B中。反應值＜ 0.10視為陰性且係此分析之檢測極限(LOD)。值≥ 0.10視為陽性且指示抗體結合至個別突變體。在突變體與每一抗體之間觀察到不同程度之結合。然而，大部分組合突變體由101F及Synagis結合，而諸如pXCS735及pXCS776等突變體例如顯示與至少一種融合前特異性mAb之結合之損失。結合之損失指示缺少完整融合前構形。 表9A. 融合前特異性抗體之OCTET結果 注意：LoD = 檢測極限，ND = 未測定 表9B. 抗體101F及Synagis之OCTET結果 實例 6. 所選融合前 RSV F 突變體之分子量及粒徑分佈分析 . 藉由SDS-PAGE之後藉由西方墨點法以RSV F特異性單株抗體L4分析經穩定融合前F突變體[Walsh EE、Cote PT、Fernie BF等人，Analysis of the Respiratory Syncytial Virus Fusion Protein Using Monoclonal and Polyclonal Antibodies. J. Gen. Virol. 76：505-513, 1986.]。圖2A顯示代表性突變體pXCS847、pXCS851及pXCS852及DS-Cav1之SDS-PAGE泳動率譜。在所有情形中，如針對單體RSV F突變體所預期之視分子量介於55與60 kDa之間之主帶在非還原條件下存在。在DS-Cav1與突變體pXCS847、pXCS851、pXCS852之間觀察到之泳動率之微小變化可係由於個別二硫鍵之性質及對呈未摺疊狀態之蛋白質之總體緊致性的所得效應及對SDS之可及性所致。 圖2B闡述在溶液中在天然條件下突變體pXCS847、pXCS851、pXCS852及DS-Cav1之分子量及粒徑分佈。使用分析型超離心機自沉降速率分析估計分子量及粒徑分佈。使經純化蛋白質以35,000 rpm在20℃下離心，且在280 nm下監測樣品細胞之間之UV吸光度。將數據擬合至連續c(s)分佈，假定細胞中之所有沉降物質具有相同摩擦比率。所有蛋白質皆以約7.6 S之沉降係數及約180 kDa之視分子量沉降，指示經純化蛋白質在溶液中係三聚體。自其胺基酸組成計算之RSV F三聚體之預期分子量為171 kDa。實例 7. 用於表徵所設計 RSV F 蛋白突變體之二級及三級結構完整性之圓二色譜學 . 在配備有Peltier型6位溫度控制池架之Jasco J-810自動化記錄分光偏振計上記錄遠-及近UV CD光譜二者。在0.10-0.12 mg/ml蛋白質濃度在1× PBS (pH 7.4)中，在1 mm矩形石英池中，在200與260 nm之間以100 nm/min每0.1 nm記錄遠UV CD光譜，帶寬為3 nm。每一樣品收集5個光譜且取平均值。在0.4-0.5 mg/ml蛋白質濃度在1× PBS (pH 7.4)中，在1 cm矩形石英池中，在250與320 nm之間以100 nm/min每0.1 nm記錄近UV CD光譜，帶寬為3 nm。每一樣品亦收集5個光譜並取平均值。針對緩衝液基線貢獻校正數據並使用已確立關聯正規化至平均殘基橢圓率(遠UV CD)或莫耳橢圓率(近UV CD)。 結果顯示於圖3A及3B中。遠-及近UV CD數據二者顯示所有蛋白質皆保留明確界定之二級及三級結構。此外，遠-及近UV CD光譜明顯相似性指示突變體之總體二級及三級結構相似，且蛋白質之結構完整性保存。實例 8. 所設計 RSV F 蛋白突變體之結構穩定性 使用差示掃描量熱法(DSC)表徵經純化RSV F蛋白突變體之結構穩定性。DSC實驗係在VP-DSC微熱量計(MicroCal, Northampton, MA)上進行。以分光光度法測定蛋白質濃度並針對光散射貢獻校正。自10℃至80℃以90℃/hr掃描1× PBS (pH 7.4)中0.2-0.5 mg/mL (1.0-2.4微莫耳三聚體濃度)之蛋白質樣品，反應時間為8秒且掃描前平衡時間為5分鐘。視溫度記錄圖中觀察到之轉變，使用DSC製造商提供之Origin 7.0軟體將熱容量譜擬合至2態或3態解摺疊模型中。給出第一可觀察轉變之熔融溫度作為每一突變體之熔融溫度。 DSC數據顯示，所設計之幾乎所有突變體皆較DS-Cav1更穩定(表10)。所有突變體(pXCS738除外)之熔融溫度(定義為每一實驗中第一可觀察DSC峰之DSC最大值，表10)皆較DS-Cav1高多至18℃。DSC數據顯示，實例1中所述之計算型蛋白質設計成功產生顯著更穩定之RSV F突變體，其亦保留融合前構形(Octet數據，實例5)。 表10. RSV F蛋白突變體之熔融溫度. 熔融溫度係自DSC實驗計算(如實例8中所述)。 實例 9. 融合前三聚體構形損失之機制 . 為表徵導致融合前構形損失之特定結構路徑，使經純化DS-Cav1經受熱應力測試。將經純化醣蛋白(0.5 mg/ml，於1× PBS中，pH 7.4)在50℃及60℃下培育30、60及120分鐘。如實例4中所述經由ELISA實驗評估融合前特異性mAb D25及融合前三聚體特異性mAb AM14與該受應力蛋白質之結合。分別如實例7及8中所述經由CD及DSC表徵蛋白質之結構完整性。結果顯示於圖4-6中。 受應力樣品之相對AM14及D25反應性顯示於圖4中。在50℃下培育長達2小時後，DS-Cav1之D25及AM14反應性二者保持基本不變。與之相比，對兩種融合前特異性抗體之反應性在60℃處理期間逐漸損失。此外，AM14反應性較D25反應性損失更快，指示四元融合前AM14表位早於D25表位破裂。該結果突出顯示AM14抗體作為用於檢測融合前三聚體構形損失之探針之優點。 未受應力之DS-Cav1之DSC評價(圖5)顯示，蛋白質在50℃與60℃之間經歷可逆構形轉變。此轉變不對應於不可逆之融合前構形損失。此外，此轉變並非源自蛋白質之全面解摺疊，此乃因DS-Cav1保留所界定之遠-及近UV CD光譜(圖6A及6B)，指示蛋白質在該等條件下保持摺疊。所觀察到之DSC轉變之最有可能的解釋係蛋白質之四級結構之可逆損失，即融合前三聚體之至少局部解離。朝向融合前構形損失之初始步驟需要此解離，此乃因AM14及D25反應性在該轉變發生之前皆非略微損失(圖4，ELISA數據)。該等數據強調三聚體完整性對融合前構形穩定性之重要性。三聚體完整性僅可藉由針對四元表位特異性抗體AM14、而非位點Ø特異性抗體D25之反應性確認。 該等數據表明，融合前構形經由以下路徑發生損失：天然三聚體(N3 )可逆地解離為天然單體(3N)，其緩慢且不可逆地損失融合前構形(3U)且最終聚集，形成高分子質量物質(Un )。三聚體繼而解離，意指DS-Cav1將顯示針對熱應力之蛋白質濃度依賴性抗性：總蛋白質濃度之降低將促進三聚體解離，其繼而將加快融合前構形損失。與之相比，經穩定融合前F突變體(例如851)應顯示其應力抗性之極小至無濃度依賴性，前提係使其足夠穩定。圖7A及7B提供其他實驗證據支持此假說。將蛋白質樣品連續稀釋且經受50℃應力1小時。在ELISA分析中評價與對照(未受應力)樣品相關之應力後保留之AM14及D25反應性。DS-Cav1之應力抗性顯示對蛋白質濃度之顯著依賴性，如藉由AM14 (圖7A)或D25 (圖7B)抗體反應性所測定。與之相比，經穩定突變體pXCS851及pXCS898之應力抗性在相同蛋白之濃度範圍內保持基本不變。實例 10 ：呈融合前構形之經穩定 RSV F 蛋白突變體在小鼠中引發中和抗體反應 . 用0.025 μg或0.25 μg具有或無0.1 mg/劑量磷酸鋁作為佐劑之DS-Cav1、野生型F、F突變體pXCS852、pXCS855、pXCS830、pXCS853、pXCS780、pXCS898、pXCS851、pXCS874、pXCS881、pXCS738或pXCS847對雌性Balb/c小鼠進行免疫。免疫係在第0週及第3週肌內給予(表11)。在如所述具有微小修改之RSV子家族A中和分析中評估劑量前(第0週)及劑量2後(PD2，第5週)血清[Eyles JE、Johnson JE、Megati S等人，Nonreplicating vaccines can protect african green monkeys from the Memphis 37 strain of respiratory syncytial virus. J Inf Dis. 208(2):319-29, 2013.]。簡言之，中和抗體效價測定為導致感染單位減少50%之血清稀釋因子。結果報告為來自每組10隻小鼠之幾何平均效價。向無可檢測病毒中和之血清分配20之效價。50%幾何平均值效價之倍數增加報告為每組內劑量2後(PD2)效價對免疫前效價之比率。表 11. 比較融合前F突變體之鼠類免疫原性研究之免疫時間表. 在小鼠中兩次免疫後，所測試之所有突變體皆引發中和抗體反應(表12)。總之，對於突變體852、830、851及847，抗體效價在兩個抗原劑量下始終較高，表明該等突變體係經穩定RSV融合前F醣蛋白之免疫原性更強之形式(表12及13，圖8)。 表12. 在用融合前F突變體免疫後Balb/c小鼠之50%中和抗體效價之幾何平均值. 表13. 在用融合前F突變體免疫後Balb/c小鼠之50%中和抗體效價之倍數增加. 比較PD2 50%中和抗體效價與其相應突變體之活體外表徵數據，顯示PD2中和抗體效價與AM14熱應力抗性之間之關聯(圖9)。此結果表明，對於融合前三聚體狀態為特異性之AM14結合與突變體之免疫原性相關聯。實例 11. 在 HRB 區域包含引入半胱胺酸突變之 RSV F 突變體 11A. 在 HRB 區域包含引入突變之 RSV F 突變體之製備 在HRB區域(F0多肽之約胺基酸476 – 524)中包含引入半胱胺酸突變之代表性RSV F突變體提供於表14中，其中記錄每個突變體中此區域中之特定突變。除了HRB區域中之突變外，該等突變體亦各自包括引入突變S55C、L188C、T54H及D486S。該等突變體係藉由類似於實例1-3中所述之彼等之方法製備。簡言之，製備每一突變體之由545個胺基酸組成之前體多肽，其包含：(1) SEQ ID NO:1之序列之胺基酸1-529，但在殘基104與144之間缺失41個胺基酸；(2) 在HRB區域外部之引入突變(S55C、L188C、T54H及D486S)，(3) 凝血酶蛋白酶識別序列；(4) 摺疊子結構域；(5) HIS-標籤；(6) 鏈黴素標籤II；(7) 連接體序列；及(8) 如所記錄之引入半胱胺酸突變。在表現過程期間自前體裂解包含胺基酸1-25之信號肽。摺疊子結構域亦自突變體裂解，其係在表現過程後藉由用500 ug/ml牛α-凝血酶(HTI)在室溫下消化過夜來獲得。 表14：在HRB區域中包含工程化二硫鍵突變之實例性RSV F蛋白突變體 11B. 在 HRB 區域中包含引入半胱胺酸突變之 RSV F 突變體之穩定性 根據實例8及實例4中所述之方法評價表14中提供之RSV F突變體之穩定性。結果分別呈現於表15及16中。 表15：RSV F蛋白突變體之熔融溫度 表16：包含工程化二硫鍵突變之突變體之熱穩定性 應力抗性計算為應力後保留之融合前特異性mAb反應性分率。將已自其裂解摺疊子之純化pXCS1106蛋白以12 µg/mL之濃度稀釋至條件化培養基中。 原始序列列表SEQ ID NO:1. 天然 RSV A2 之全長 F0 之胺基酸序列 ( 基因庫 GI ： 138251 ； Swiss Prot P03420) MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPPTNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEINLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGMDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSNSEQ ID NO:2. 天然 RSV B 之全長 F0 之胺基酸序列 (18537 株；基因庫 GI ： 138250 ； Swiss Prot P13843) MELLIHRSSAIFLTLAVNALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSNIKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTINTTKNLNVSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNRLLPIVNQQSCRISNIETVIEFQQMNSRLLEITREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLHNVNTGKSTTNIMITTIIIVIIVVLLSLIAIGLLLYCKAKNTPVTLSKDQLSGINNIAFSKSEQ ID NO:3. 具有摺疊子之 RSV A2 F 胞外結構 域 MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARR ELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRR FLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGLVPRGSHHHHHHGSWSHPQFEKSEQ ID NO:4 ： RSV RSVA/ 智人 /USA/LA2_21/2013 F ( 安大略 ) 天然胺基酸序列 ( 基因庫 GI ： AHX57185) ： MELPILKTNAITTILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPAANSRARRELPRFMNYTLNNTKNTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNIDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLALIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSNSEQ ID NO:5 ：具有摺疊子之 RSV RSVA/ 智人 /USA/LA2_21/2013 F 胞外結構 域 ： MELPILKTNAITTILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPAANSRARRELPRFMNYTLNNTKNTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNIDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGLVPRGSHHHHHHGSWSHPQFEKSEQ ID NO:6 ： RSV RSVB/ 智人 /PER/FPP00592/2011 F ( 布宜諾斯艾利斯 ) 天然胺基酸序列 ( 基因庫 GI ： AHV80758) ： MELLIHRSSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSNIKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTINTTKNLNVSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQSCRISNIETVIEFQQKNSRLLEITREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLHNVNTGKSTTNIMITAIIIVIIVVLLSLIAIGLLLYCKAKNTPVTLSKDQLSGINNIAFSKSEQ ID NO:7 ：具有摺疊子之 RSV RSVB/ 智人 /PER/FPP00592/2011 F 胞外結構 域： MELLIHRSSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSNIKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTINTTKNLNVSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQSCRISNIETVIEFQQKNSRLLEITREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGLVPRGSHHHHHHGSWSHPQFEKSEQ ID NO:8 ：編碼 pXCS738 之前體 多肽之核苷酸序列： atggaacttctgatcctgaaagccaacgcgattaccactatcctgactgccgtcaccttctgcttcgcatcgggacagaacattaccgaggagttctaccagtccacctgttcggcggtgtccaagggttacctctcggccctgagaactggctggtaccactgtgtgattactatcgagctgagcaacatcaaggagaacaagtgcaatggaacggacgcgaaggtcaagctgattaagcaggaactcgataagtacaagaacgccgtgaccgagctccagctgctgatgcaatcgacccctgccactaacaacagagctcgccgggaactgccgcgcttcatgaattacaccctcaacaacgcgaagaaaaccaacgtgaccctgtccaagaagcgcaagcggaggttcctgggattcctgtgtggcgtgggctccgcaatcgcatccggagtggccgtgtccaaagtgctgcatctggagggggaagtgaacaagatcaagtccgccctcctgtcaactaataaggcggtggtgtccctgagcaacggagtcagcgtgtgtacatccaaggtcctggacctcaagaactacatcgacaagcagctgttgcccatcgtcaacaagcagtcatgctcgattagcaatatcgaaaccgtgattgagttccagcagaagaacaacagactgctcgaaattacccgggagttttccgtgaacgccggagtgaccactcctgtgtccacctacatgcttacgaactccgaactgctcagcctcatcaacgatatgccgatcactaacgaccagaagaagttgatgagcaacaatgtgcagatcgtgcgccaacagtcctactcaatcatgtcaattatcaaggaggaaatcctcgcctatgtggtgcaattgcctctgtacggagtcatcgacacaccctgctggaagctgcacactagcccactctgtacgaccaacaccaaggaaggttccaacatctgcctgactaggaccgatcggggctggtattgcgataatgctgggtccgtgagcttcttcccgcaagccgagacttgcaaagtgcagtcaaaccgcgtgttctgtgacaccatgtgtagcctgaccctgccatccgaagtcaacctctgcaacgtggacatctttaacccgaaatacgactgcaagattatgacctccaagaccgacgtcagcagctctgtcatcactagcctgggagctattgtgtcctgctacggaaagaccaaatgcactgcctcgaacaagaacagaggcatcatcaagaccttcagcaacggctgtgactacgtgtccaacaagggagtggacaccgtgtccgtcgggaacaccctgtactacgtgaacaagcaggaggggaagtcgctctacgtcaagggggaaccgattatcaatttctacgaccccctggtgttcccttccgacgagttcgatgcctccatatcccaagtcaacgagaagatcaaccagtctcttgccttcatccggaagtcggacgaactgctgtccgccatcggtggctatattccggaagcccccagggatggacaggcctacgtgcggaaggatggagaatgggtgcttttgtccaccttcctgggcggtctggtgccccgcggctcacaccatcatcaccaccacggttcgtggtcccaccctcaatttgagaagtga [相關組份(bp座標)：信號序列：1-75；pep27：328-408；F1：409-1539；F2：76-327；摺疊子：1552-1632；凝血酶識別序列：1639-1656；His-標籤：1657-1674；鏈黴素標籤II：1681-1704；連接體序列：1540-1551、1633-1638、1675-1680；P102A (天然取代)：304-306；I379V (天然取代)：1135-1137；M447V (天然取代)：1339-1341；T54H：160-162；S55C：163-165；L142C：424-426；L188C：562-564；V296I：886-888；N371C：1111-1113]SEQ ID NO:9 ：編碼 pXCS780 之前體 多肽之核苷酸序列： 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atggaacttctgatcctgaaagccaacgcgattaccactatcctgactgccgtcaccttctgcttcgcatcgggacagaacattaccgaggagttctaccagtccacctgttcggcggtgtccaagggttacctctcggccctgagaactggctggtaccactgtgtgattactatcgagctgagcaacatcaaggagaacaagtgcaatggaacggacgcgaaggtcaagctgattaagcaggaactcgataagtacaagaacgccgtgaccgagctccagctgctgatgcaatcgacccctgccactaacaacagagctcgccgggaactgccgcgcttcatgaattacaccctcaacaacgcgaagaaaaccaacgtgaccctgtccaagaagcgcaagcggaggttcctgggattcctgttgggcgtgggctccgcaatcgcatccggagtggccgtgtccaaagtgctgcatctggagggggaagtgaacaagatcaagtccgccctcctgtcaactaataaggcggtggtgtccctgagcaacggagtcagcgtgtgtacaatcaaggtcctggacctcaagaactacatcgacaagcagctgttgcccatcgtcaacaagcagtcatgctcgattagcaatatcgaaaccgtgattgagttccagcagaagaacaacagactgctcgaaattacccgggagttttccgtgaacgccggagtgaccactcctgtgtccacctacatgcttacgaactccgaactgctcagcctcatcaacgatatgccgatcactaacgaccagaagaagttgatgagcaacaatgtgcagatcgtgcgccaacagtcctactcaatcatgtcaattatcaaggaggaagtgctcgcctatgtggtgcaattgcctctgtacggagtcatcgacacaccctgctggaagctgcacactagcccactctgtacgaccaacaccaaggaaggttccaacatctgcctgactaggaccgatcggggctggtattgcgataatgctgggtccgtgagcttcttcccgcaagccgagacttgcaaagtgcagtcaaaccgcgtgttctgtgacaccatgaacagcctgaccctgccatccgaagtcaacctctgcaacgtggacatctttaacccgaaatacgactgcaagattatgacctccaagaccgacgtcagcagctctgtcatcactagcctgggagctattgtgtcctgctacggaaagaccaaatgcactgcctcgaacaagaacagaggcatcatcaagaccttcagcaacggctgtgactacgtgtccaacaagggagtggacaccgtgtccgtcgggaacaccctgtactacgtgaacaagcaggaggggaagtcgctctacgtcaagggggaaccgattatcaatttctacgaccccctggtgttcccttccgacgagttcgatgcctccatatcccaagtcaacgagaagatcaaccagtctcttgccttcatccggaagtcggacgaactgctgtccgccatcggtggctatattccggaagcccccagggatggacaggcctacgtgcggaaggatggagaatgggtgcttttgtccaccttcctgggcggtctggtgccccgcggctcacaccatcatcaccaccacggttcgtggtcccaccctcaatttgagaagtga 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[相關組份(bp座標)：信號序列：1-75；pep27：328-408；F1：409-1539；F2：76-327；摺疊子：1552-1632；凝血酶識別序列：1639-1656；His-標籤：1657-1674；鏈黴素標籤II：1681-1704；連接體序列：1540-1551、1633-1638、1675-1680；P102A (天然取代)：304-306；I379V (天然取代)：1135-1137；M447V (天然取代)：1339-1341；T54H：160-162；T103C：307-309；I148C：442-444；S190I：568-570；V296I：886-888；D486S：1456-1458]SEQ ID NO:13 ：編碼 pXCS852 之前體 多肽之核苷酸序列： 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[相關組份(bp座標)：信號序列：1-75；pep27：328-408；F1：409-1539 (僅包括天然RSV F序列)；F2：76-327；摺疊子：1552-1632；凝血酶識別序列：1639-1656；His-標籤：1657-1674；鏈黴素標籤II：1681-1704；連接體序列：1540-1551、1633-1638、1675-1680；P102A (天然取代)：304-306；I379V (天然取代)：1135-1137；M447V (天然取代)：1339-1341；T54H：160-162；S55C：163-165；L188C：562-564；D486S：1456-1458]SEQ ID NO:14 ：編碼 pXCS853 之前體 多肽之核苷酸序列： 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[相關組份(bp座標)：信號序列：1-75；pep27：328-408；F1：409-1539；F2：76-327；摺疊子：1552-1632；凝血酶識別序列：1639-1656；His-標籤：1657-1674；鏈黴素標籤II：1681-1704；連接體序列：1540-1551、1633-1638、1675-1680；P102A (天然取代)：304-306；I379V (天然取代)：1135-1137；M447V (天然取代)：1339-1341；S55C：163-165；L188C：562-564；S190I：568-570；D486S：1456-1458]SEQ ID NO:15 ：編碼 pXCS855 之前體 多肽之核苷酸序列 ： 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MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYHCVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVCTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSSEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLH CC NAGKS CC NIMITTLVPRGSGGSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGHHHHHHGSWSHPQFEKSEQ ID NO:278. pXCS1112 之前體 多肽之胺基酸序列 MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYHCVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVCTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSSEFDASISQVNEKINQSLAFIR CC DELLH CC NAGKS CC NIMITTLVPRGSGGSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGHHHHHHGSWSHPQFEK
圖1繪示用於構築實例中所述之一些RSV F蛋白突變體之前體多肽模板(SEQ ID NO:3)之胺基酸序列。前體多肽包括信號序列(殘基1-25)、F2多肽(殘基26-109)、pep27序列(殘基110-136)、F1多肽(殘基137-513)、T4彈力素(fibritin)源三聚化結構域(摺疊子(foldon)；殘基518-544)、凝血酶識別序列(殘基547-552)、組胺酸標籤(殘基553-558)、鏈黴素標籤(Streptag) II (561-568)及連接體序列(殘基514-517、545-546及559-560)。其亦包括相對於SEQ ID NO:1中所述之天然RSV F序列之3個天然取代(P102A、I379V及M447V)。弗林蛋白酶裂解位點稱為RARR及KKRKRR。 圖2A繪示所選融合前F突變體(pXCS847、pXCS851及pXCS852)在非還原條件下之十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及西方墨點分析。 圖2B顯示使用分析型超離心機自沉降速率實驗計算之所選突變體(pXCS847、pXCS851及pXCS852)之沉降係數分佈。 圖3A及3B繪示具有特定位點突變之實例性經修飾RSV F蛋白之圓二色譜學(CD)光譜。所設計突變體之遠紫外線(UV) CD光譜確認二級結構完整性，且近UV CD光譜確認三級結構完整性。 圖4繪示在兩個溫度(50℃及60℃)下使用兩種不同單株抗體(mAb) D25及AM14對純化DS-Cav1之時間依賴性應力測試。 圖5繪示使用純化DS-Cav1之差示掃描量熱法(DSC)實驗(實例8)。該等實驗係如針對所設計融合前F突變體所述來實施。實線—樣品之初始DSC掃描，虛線—初始掃描中所用同一樣品之重複掃描。DSC峰主要在重複掃描期間回收，指示藉由DSC檢測之構形轉變可逆。 圖6A繪示在60℃下受應力之DS-Cav1之遠UV CD光譜(實例8)。如上文針對所設計融合前RSV F突變體所述記錄CD光譜(實例6)。DS-Cav1在60℃下培育長達2小時後保持所界定遠UV CD光譜，指示在此期間未發生球蛋白解摺疊。 圖6B繪示在60℃下受應力之DS-Cav1之近UV CD光譜(實例8)。如上文針對所設計融合前RSV F突變體所述記錄CD光譜(實例6)。 圖7A繪示熱應力抗性之蛋白質濃度依賴性，如藉由融合前F三聚體特異性AM14表位之保存所測定(實例8)。 圖7B繪示熱應力抗性之蛋白質濃度依賴性，如藉由融合前F特異性D25表位之保存所測定(實例8)。蛋白質樣品經連續稀釋且經受50℃應力1小時。在ELISA分析中評價，相對於對照(未受應力)樣品，應力後保留之D25反應性。 圖8顯示來自經以下免疫之小鼠之中和抗體反應：DS-Cav1；野生型F；或突變體pXCS852、pXCS855、pXCS830、pXCS853、pXCS780、pXCS898、pXCS851、pXCS874、pXCS881、pXCS738或pXCS847；使用或不使用磷酸鋁作為佐劑。結果報告為每組10隻小鼠之50%幾何平均效價(GMT)。各散佈圖反映個別小鼠之反應，每組總計10隻動物。各組內之線條指示50%中和抗體效價之幾何平均值。「野生型F」係指野生型F胞外結構域重組構築體。 圖9A及9B闡述工程化融合前F蛋白突變體引發之中和抗體效價與該等突變體之穩定性之間之關聯。Y軸—藉由用0.25 µg無佐劑抗原或0.025 µg抗原及0.1 mg/ml AlPO4佐劑免疫小鼠引發之中和抗體效價。(數據顯示於表12中。) X軸—工程化突變體之穩定性，如藉由熱應力後之殘留AM14反應性所界定。(數據顯示於表8B中。)

Claims (42)

  1. 一種野生型RSV F蛋白之突變體，該突變體包含F1多肽及F2多肽，且該突變體相對於該野生型RSV F蛋白之胺基酸序列包含至少一個經導入的胺基酸突變，其中該經導入的胺基酸突變包含一對半胱胺酸取代，其位於位置103(103C)及位置148(148C)。
  2. 如請求項1之突變體，其中該經導入的胺基酸突變進一步包含至少一個空腔填充突變及至少一個靜電突變。
  3. 如請求項1之突變體，其中該F1多肽連接至三聚化結構域。
  4. 如請求項3之突變體，其與該相應野生型RSV F蛋白相比具有提高之穩定性，其中該穩定性係藉由該突變體與抗體AM14結合來量測。
  5. 如請求項1至4中任一項之突變體，其中該野生型RSV係亞型A、亞型B、A2株、安大略(Ontario)株或布宜諾斯艾利斯(Buenos Aires)株。
  6. 如請求項1至4中任一項之突變體，其中：(1)該F2多肽包含位置26-109之RSV F胺基酸；且(2)該F1多肽包含位置137-513之RSV F胺基酸。
  7. 如請求項2之突變體，其中該空腔填充突變選自由以下組成之群：(1)位置55、62、155、190或290之胺基酸經I、Y、L、H或M取代；(2)位置54、58、189、219或397之胺基酸經I、Y、L、H或M取代；(3)位置151之胺基酸經A或H取代；(4)位置147或298之胺基酸經I、L、H或M取代；(5)位置164、187、192、207、220、296、300或495之胺基酸經I、Y或H取代；及(6)位置106之胺基酸經W取代。
  8. 如請求項2之突變體，其中該靜電突變選自由以下組成之群：(1)位置82、92或487之胺基酸經D、F、Q、T、S、L或H取代；(2)位置315、394或399之胺基酸經F、M、R、S、L、I、Q或T取代；(3)位置392、486或489之胺基酸經H、S、N、T或P取代；及(4)位置106或339之胺基酸經F、Q、N或W取代。
  9. 如請求項2之突變體，其中：(i)該空腔填充突變選自由以下組成之群：(1)位置190之胺基酸經I、Y或M取代；(2)位置54之胺基酸經I或H取代；及(3)位置296之胺基酸經I取代；且(ii)該靜電突變選自由以下組成之群：(1)位置487之胺基酸經D、Q或H取代；(2)位置489之胺基酸經H、S或N取代；及(3)位置486之胺基酸經H、S或T取代。
  10. 如請求項9之突變體，其中該經導入的胺基酸突變係選自由以下組成之群之突變之組合：(1)103C、148C、190I及486S之組合；(2)54H、55C、188C及486S之組合；(3)54H、103C、148C、190I、296I及486S之組合；(4)54H、55C、142C、188C、296I及371C之組合；(5)55C、188C及486S之組合；(6)54H、55C、188C及190I之組合；(7)55C、188C、190I及486S之組合；及(8)54H、55C、188C、190I及486S之組合。
  11. 如請求項1之突變體，其中該經導入的胺基酸突變進一步包含在位置190之異白胺酸(I)取代(190I)及在位置486之絲胺酸(S)取代(486S)，且其中該突變體包含選自由以下組成之群之F1多肽及F2多肽：(1)包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之F1多肽；(2)包含與SEQ ID NO：41之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO：42之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽；(3)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列之F1多肽；(4)包含與SEQ ID NO：43之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO：44之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽；(5)包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列之F1多肽；(6)包含與SEQ ID NO：45之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO：46之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽；(7)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列之F1多肽；(8)包含與SEQ ID NO：47之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO：48之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽；(9)包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列之F1多肽；(10)包含與SEQ ID NO：49之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO：50之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽；(11)包含SEQ ID NO：279之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO：280之胺基酸序列之F1多肽；(12)包含與SEQ ID NO：279之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO：280之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽；(13)包含SEQ ID NO：281之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO：282之胺基酸序列之F1多肽；(14)包含與SEQ ID NO：281之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO：282之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽；(15)包含SEQ ID NO：283之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO：284之胺基酸序列之F1多肽；(16)包含與SEQ ID NO：283之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO：284之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽；(17)包含SEQ ID NO：285之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO：286之胺基酸序列之F1多肽；(18)包含與SEQ ID NO：285之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO：286之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽；(19)包含SEQ ID NO：287之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO：288之胺基酸序列之F1多肽；(20)包含與SEQ ID NO：287之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO：288之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽；(21)包含SEQ ID NO：289之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO：290之胺基酸序列之F1多肽；及(22)包含與SEQ ID NO：289之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO：290之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽。
  12. 如請求項1之突變體，其中該經導入的胺基酸突變進一步包含位置54之組胺酸(H)取代(54H)、位置190及296之異白胺酸(I)取代(190I；296I)及位置486之絲胺酸(S)取代(486S)，且其中該突變體包含選自由以下組成之群之F1多肽及F2多肽：(1)包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列之F1多肽；(2)包含與SEQ ID NO：51之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO：52之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽；(3)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列之F1多肽；(4)包含與SEQ ID NO：53之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO：54之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽；(5)包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列之F1多肽；(6)包含與SEQ ID NO：55之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO：56之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽；(7)包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列之F1多肽；(8)包含與SEQ ID NO：57之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO：58之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽；(9)包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列之F1多肽；(10)包含與SEQ ID NO：59之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO：60之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽；(11)包含SEQ ID NO：291之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO：292之胺基酸序列之F1多肽；(12)包含與SEQ ID NO：291之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO：292之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽；(13)包含SEQ ID NO：293之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO：294之胺基酸序列之F1多肽；(14)包含與SEQ ID NO：293之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO：294之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽；(15)包含SEQ ID NO：295之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO：296之胺基酸序列之F1多肽；(16)包含與SEQ ID NO：295之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO：296之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽；(17)包含SEQ ID NO：297之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO：298之胺基酸序列之F1多肽；(18)包含與SEQ ID NO：297之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO：298之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽；(19)包含SEQ ID NO：299之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO：300之胺基酸序列之F1多肽；(20)包含與SEQ ID NO：299之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO：300之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽；(21)包含SEQ ID NO：301之胺基酸序列之F2多肽及包含SEQ ID NO：302之胺基酸序列之F1多肽；及(22)包含與SEQ ID NO：301之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F2多肽及包含與SEQ ID NO：302之胺基酸序列至少97%、98%或99%一致之胺基酸序列之F1多肽。
  13. 如請求項10之突變體，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列之胺基酸26-109及137-513：(1)SEQ ID NO：19之胺基酸序列；(2)SEQ ID NO：20之胺基酸序列；及(3)SEQ ID NO：21之胺基酸序列。
  14. 如請求項9之突變體，其中該經導入的胺基酸突變進一步包含HRB區域中之至少一對半胱胺酸突變。
  15. 如請求項14之突變體，其中至少一對半胱胺酸突變選自由以下組成之群：(1)508C及509C；(2)515C及516C；及(3)522C及523C。
  16. 一種醫藥組合物，其包含(i)如請求項1至15中任一項之RSV F蛋白突變體及(ii)醫藥上可接受之載劑。
  17. 如請求項16之醫藥組合物，其中該F1多肽及F2多肽為來自RSV亞型B之F蛋白。
  18. 如請求項16之醫藥組合物，其中該F1多肽及F2多肽為來自RSV亞型A之F蛋白。
  19. 如請求項18之醫藥組合物，其進一步包含如請求項1至15中任一項之第二突變體，其中該第二突變體之F1多肽及F2多肽為來自RSV亞型B之F蛋白。
  20. 如請求項16之醫藥組合物，其係疫苗。
  21. 一種如請求項1至15之突變體之用途，其用於製造減少RSV感染之藥劑。
  22. 如請求項16之醫藥組合物，其進一步包含佐劑。
  23. 如請求項22之醫藥組合物，其中該佐劑包含鋁鹽。
  24. 如請求項22之醫藥組合物，其中該佐劑包含：含CpG-基序之寡核苷酸。
  25. 如請求項16之醫藥組合物，其中該突變體之F1多肽連接至三聚化結構域。
  26. 如請求項25之醫藥組合物，其中該三聚化結構域係噬菌體T4摺疊子結構域。
  27. 如請求項19之醫藥組合物，其中來自RSV亞型A之F蛋白之突變體之F2多肽及F1多肽，分別包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列及SEQ ID NO：46之胺基酸序列，且其中來自RSV亞型B之F蛋白之第二突變體之F2多肽及F1多肽，分別包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列及SEQ ID NO：50之胺基酸序列。
  28. 如請求項27之醫藥組合物，其進一步包含佐劑。
  29. 如請求項28之醫藥組合物，其中該佐劑包含鋁鹽。
  30. 如請求項28之醫藥組合物，其中該佐劑包含：含CpG-基序之寡核苷酸。
  31. 如請求項27之醫藥組合物，其中該來自RSV亞型A之F蛋白之突變體之F1多肽，及該來自RSV亞型B之F蛋白之第二突變體之F1多肽，連接至三聚化結構域。
  32. 如請求項31之醫藥組合物，其中該三聚化結構域係噬菌體T4彈力素摺疊子結構域。
  33. 如請求項1之突變體，其中該經導入的胺基酸突變進一步包含空腔填充突變。
  34. 如請求項33之突變體，其中空腔填充突變選自由以下組成之群：(1)位置62、155、190或290之胺基酸經I、Y、L、H或M取代；(2)位置54、58、189、219或397之胺基酸經I、Y、L、H或M取代；(3)位置151之胺基酸經A或H取代；(4)位置147或298之胺基酸經I、L、H或M取代；及(5)位置164、187、192、207、220、296、300或495之胺基酸經I、Y或H取代。
  35. 如請求項34之突變體，其中該空腔填充突變選自由以下組成之群：(1)位置190之胺基酸經I、Y或M取代；(2)位置54之胺基酸經I或H取代；及(3)位置296之胺基酸經I取代。
  36. 如請求項1之突變體，其中該經導入的胺基酸突變進一步包含靜電突變。
  37. 如請求項36之突變體，其中該靜電突變選自由以下組成之群：(1)位置82、92或487之胺基酸經D、F、Q、T、S、L或H取代；(2)位置315、394或399之胺基酸經F、M、R、S、L、I、Q或T取代；(3)位置392、486或489之胺基酸經H、S、N、T或P取代；及(4)位置106或339之胺基酸經F、Q、N或W取代。
  38. 如請求項37之突變體，其中該靜電突變選自由以下組成之群：(1)位置487之胺基酸經D、Q或H取代；(2)位置489之胺基酸經H、S或N取代；及(3)位置486之胺基酸經H、S或T取代。
  39. 一種醫藥組合物，其包含：(1)如請求項33或請求項36之突變體；及(2)醫藥上可接受之載劑。
  40. 如請求項39之醫藥組合物，其進一步包含佐劑。
  41. 如請求項39之醫藥組合物，其中該突變體之F1多肽之C端連接至三聚化結構域。
  42. 一種如請求項33或36之突變體之用途，其用於製造減少RSV感染之藥劑。
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