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TWI655209B - 結合人類計畫性死亡（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ）配位子１（ｐｄ－ｌ１）之抗體 - Google Patents

結合人類計畫性死亡（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ）配位子１（ｐｄ－ｌ１）之抗體 Download PDF

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TWI655209B
TWI655209B TW102146450A TW102146450A TWI655209B TW I655209 B TWI655209 B TW I655209B TW 102146450 A TW102146450 A TW 102146450A TW 102146450 A TW102146450 A TW 102146450A TW I655209 B TWI655209 B TW I655209B
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琳達 梁
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Abstract

本發明提供特異性結合人類PD-L1之經分離之抗體及該等抗體之抗原結合片段，以及包含該等抗PD-L1抗體或結合片段及一組用於偵測結合人類PD-L1之該等抗體或其抗原結合片段之複合物的試劑之套組。本發明之抗體及抗原結合片段適用於組織樣品中人類PD-L1表現之免疫組織化學偵測。亦提供編碼本發明之抗體及抗原結合片段之核酸分子以及用於其表現之表現載體及宿主細胞。

Description

結合人類計畫性死亡(PROGRAMMED DEATH)配位子1(PD-L1)之抗體
本發明係關於具有特異性序列之抗體，其結合人類計劃性死亡配位子1(PD-L1)且適用於藉由免疫組織化學(IHC)分析來偵測人類組織樣品中之PD-L1表現。本發明亦係關於採用該等抗人類-PD-L1抗體進行之特定IHC分析。
PD-L1為一種細胞表面醣蛋白，其為兩種用於計劃性死亡1(PD-1)之已知配位子中之一者，認為其在免疫調節及維持外周耐受性中起重要作用。已在許多免疫細胞之表面上觀察到PD-L1之表現，該等免疫細胞包括未處理淋巴細胞及活化B及T細胞、單核細胞及樹突狀細胞(同上)。此外、PD-L1 mRNA係由非淋巴組織(包括血管內皮細胞、上皮細胞、肌細胞)以及在扁桃體及胎盤組織中表現。參見例如Keir,M.E.等人,Annu Rev Immunol.26：677-704(2008)；Sharp A.H.等人,Nature Immunol.8：239-245(2007)；Okazaki T及Honjo T,Internat.immunol.19：813-824(2007)。
亦已在許多人類癌症中觀察到PD-L1表現，且表現PD-L1之腫瘤細胞與PD-1之相互作用可誘導腫瘤特異性T細胞之抑制或細胞凋亡。在例如卵巢癌、腎臟癌、結腸直腸癌、胰臟癌、肝癌及黑素瘤之大量 樣品中，在不考慮後續治療情況下，證實PD-L1表現與不良預後及總存活期短有關。已證實阻斷PD-L1與PD-1結合之抗PD-1單株抗體具有針對許多腫瘤類型之抗腫瘤活性，其中早期人類臨床資料表明具有表現PD-L1之腫瘤之患者更可能對抗PD-1療法起反應。參見例如Iwai等人,PNAS 99：12293-12297(2002)；Ohigashi等人,Clin Cancer Res 11：2947-2953(2005)；Ghebeh等人,Neoplasia 8：190-198(2006)；Hamanishi,J等人,PNAS 104：3360-3365(2007)；Yang等人,Invest Ophthalmol Vis Sci.49(6)：2518-2525(2008)；Gao等人,Clin Cancer Res 15：971-979(2009)；Brahmer J.R.等人,J Clin Oncol.28：3167-3175(2010)。
最近的報告描述15種抗人類PD-L1抗體之偵測福馬林固定之石蠟包埋(FFPE)型人類黑素瘤樣品中hPD-L1表現之效用的比較(Gadiot,J.,等人,Cancer 117(10)：2192-2201(2011))。此比較中所評定之效用準則為：(1)將石蠟包埋之組織染色之能力，(2)產生低本底染色及(3)藉由與PD-L1融合蛋白進行預培育來阻斷與PD-L1之結合。作者推斷Ab 4059號(一種兔抗人類多株抗體(獲自ProSci,Poway,CA USA))為15種測試抗體中唯一的可接受地符合所有此等準則之抗人類PD-L1抗體(同上2195，第二欄)。
本發明係關於一種抗人類PD-L1單株抗體，其在FFPE扁桃體組織中產生一種IHC染色圖案，本文之發明者認為該IHC染色圖案與藉由ProSci Ab 4059號產生之染色相比免疫相關性更高。如下文實例中所述，發明者發現此ProSci抗體(PRS4059，Sigma-Aldrich批號40590604)將扁桃體中之所有造血譜系以相等強度染色，而本發明之兩種抗體22C3及20C3選擇性染色扁桃體隱窩上皮細胞及濾泡性CD68+骨髓細胞(形態上與巨噬細胞一致)。此外，22C3及20C3展示此 等兩個個別細胞群體之間的一致強度差，其中隱窩上皮細胞中之染色強度顯著大於濾泡性巨噬細胞。所有三種抗體(PRS4059、22C3及20C3)均藉由與PD-L1抗原預培育而中和，從而指示反應性係由抗原結合域(CDR)介導。因此，本發明亦係關於本發明抗體在偵測人類細胞表面上之PD-L1表現，包括偵測FFPE組織切片中之PD-L1的IHC分析法中之用途。
在一個態樣中，本發明提供一種特異性結合人類PD-L1之經分離之抗體或其抗原結合片段。經分離之單株抗體或其抗原結合片段包含CDRL1、CDRL2及CDRL3之三個輕鏈CDR及CDRH1、CDRH2及CDRH3之三個重鏈CDR。
CDRL1係選自由以下組成之群：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：9之變異體及SEQ ID NO：21之變異體。CDRL2係選自由SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：2之變異體組成之群。CDRL3係選自由以下組成之群：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：10之變異體及SEQ ID NO：22之變異體。
CDRH1係選自由以下組成之群：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：14之變異體、SEQ ID NO：15之變異體、SEQ ID NO：26之變異體及SEQ ID NO：27之變異體。CDRH2係選自由以下組成之群：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：16之變異體及SEQ ID NO：28之變異體。CDRH3係選自由以下組成之群：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：17之變異體及SEQ ID NO：29之變異體。
在本發明之抗體及抗原結合片段中，除在參考序列中具有一或兩個保守胺基酸取代，且較佳在參考序列中具有僅一個保守胺基酸取代外，變異型CDR序列(輕鏈或重鏈)與參考序列一致。在較佳實施例 中，三個輕鏈CDR中之至多兩者為變異型序列，且三個重鏈CDR中之至多兩者為變異型序列。在更佳實施例中，六個CDR中之僅三者、兩者或一者為變異型序列。
在一個較佳實施例中，三個輕鏈CDR為SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3，且三個重鏈CDR為SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：7。
在另一個較佳實施例中，三個輕鏈CDR為SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：10且三個重鏈CDR為SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16及SEQ ID NO：17。
在又一個較佳實施例中，三個輕鏈CDR為SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：22且三個重鏈CDR為SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28及SEQ ID NO：29。
一些本發明之抗體及抗原結合片段包含輕鏈可變區及重鏈可變區。輕鏈可變區係選自由以下組成之群：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：13之變異體、SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：25之變異體，且重鏈可變區係選自由以下組成之群：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：20之變異體、SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：32之變異體。在該等實施例中，除在構架區(亦即CDR之外)具有多達五個保守胺基酸取代，且較佳在構架區具有小於四個、三個或兩個保守胺基酸取代外，變異型輕鏈可變區序列與參考序列一致。類似地，除在構架區(亦即CDR之外)具有多達17個保守胺基酸取代，且較佳在構架區具有小於十個、九個、八個、七個、六個或五個保守胺基酸取代外，變異型重鏈可變區序列與參考序列一致。
在本發明之一個較佳抗體或抗原結合片段中，輕鏈可變區為SEQ ID NO：13且重鏈可變區為SEQ ID NO：20。
本發明之另一個較佳抗體或抗原結合片段包含SEQ ID NO：25之 輕鏈可變區及SEQ ID NO：32之重鏈可變區。
在又一個實施例中，本發明之抗體或結合片段包含SEQ ID NO：25之輕鏈可變區及SEQ ID NO：32之重鏈可變區，其中SEQ ID NO：32中之X為pE。
在另一個實施例中，本發明之抗體或結合片段包含SEQ ID NO：25之輕鏈可變區及SEQ ID NO：32之重鏈可變區，其中SEQ ID NO：32中之X為Q。
在所有上述抗體實施例中，經分離之抗體可為任何類型之免疫球蛋白之全長抗體，包括IgM、IgG、IgD、IgA及IgE。抗體較佳為IgG抗體，諸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一個實施例中，抗體包含小鼠IgG1恆定區。
尤其較佳抗體為單株抗體20C3及22C3，其為分別由融合瘤MEB037.20C3及MEB037.22C3表現之IgG1抗體。
本發明亦提供一種經分離之單株抗體或其抗原結合片段，其特異性結合人類PD-LI且阻斷20C3或22C3或包含SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：32之參考抗體與人類PD-L1之結合。在一個較佳實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段阻斷20C3及22C3中之每一者或以下中之每一者與人類PD-L1之結合：(a)包含SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：20之參考抗體及(b)包含SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：32之參考抗體。
本發明亦提供一種抗體組合物，其在調配物中包含上述抗體或抗體片段中之任一者。一種適合調配物包含20mM乙酸鈉及9%蔗糖(pH 5.0)。在一個較佳實施例中，組合物包含抗體分子之混合物，其中混合物中之大多數(亦即大於60%、65%、70%、80%、85%、90%或95%中之任一者)抗體分子包含SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：32，其中SEQ ID NO：32中之X為pE，且混合物中之其餘抗體分子包含SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：32，其中SEQ ID NO：32中之X為Q。
在任一上述實施例中，抗原結合片段為Fab片段、Fab'片段、(Fab')2片段。
在任一上述實施例中，抗體或抗原結合片段可進一步包含可偵測標記。
本發明亦提供一種編碼任一個上文所揭示之抗體可變區之經分離之核酸。在一個較佳實施例中，核酸包含SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：34中之一者或兩者。在另一個較佳實施例中，核酸包含SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：36中之一者或兩者。在任一個此等實施例中，經分離之核酸較佳為表現載體。
本發明亦係關於一種宿主細胞，其包含編碼任一個上文所揭示之抗體可變區的表現載體。表現載體較佳包含SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：34或包含SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：36。
本發明亦提供一種分析自人類移出之人類組織樣品中PD-L1表現的方法。該分析方法包含在允許PD-L1結合試劑特異性結合人類PD-L1之條件下使組織樣品與PD-L1結合試劑接觸、移除未結合之PD-L1結合試劑及偵測結合之PD-L1結合劑存在或不存在。在一個較佳實施例中，該方法進一步包含對結合之結合試劑之量進行定量。結合試劑為上文所述之單株抗體或抗原結合片段中之任一者。結合試劑較佳為包含SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：20或包含SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：32之抗體。在一個較佳實施例中，結合試劑為一種抗體組合物，其包含有包含SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：32之抗體分子之混合物，其中大部分分子(亦即大於60%、65%、70%、80%、85%、90%或95%中之任一者)在SEQ ID NO：32中之位置X處具有pE，且其餘分子在SEQ ID NO：32中之位置X處具有Q。
在另一個態樣中，本發明提供一種分析人類組織樣品中之PD-L1表現的套組。該套組包含PD-L1結合劑及一組用於偵測包含結合於人 類PD-L1之結合劑之複合物的試劑。PD-L1結合劑為特異性結合人類PD-L1之任何上文所述之單株抗體或抗原結合片段。抗體或結合片段較佳包含SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：20，或包含SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：32。在一個較佳實施例中，結合試劑為一種抗體組合物，其包含有包含SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：32之抗體分子之混合物，其中大部分分子(亦即大於60%、65%、70%、80%、85%、90%或95%中之任一者)在SEQ ID NO：32中之位置X處具有pE，且其餘分子在SEQ ID NO：32中之位置X處具有Q。
圖1顯示由自融合瘤MEB037.20C3分離之總RNA製備之抗體可變輕鏈及重鏈cDNA之核苷酸序列及由其編碼之預測胺基酸序列(粗體)，括號指示前導肽之核苷酸及胺基酸序列且下劃線指示CDR序列。
圖2顯示由自融合瘤MEB037.22C3分離之總RNA製備之抗體可變輕鏈及重鏈cDNA之核苷酸序列及由其編碼之預測胺基酸序列(粗體)，其中括弧指示前導肽之核苷酸及胺基酸序列且下劃線指示CDR序列。
圖3顯示抗體20C3及22C3之輕鏈及重鏈之成熟可變區之對準胺基酸序列，其中粗體指示序列發生變化之位置，下劃線指示如由Kabat編號系統所定義之CDR序列，且括弧指示如由Chothia編號系統所定義之重鏈CDR1。
圖4顯示使用市售抗體PRS4059(圖4A)或本發明之22C3抗體(圖4B)由免疫組織化學分析法所產生之扁桃體切片之染色，其中圖4A及圖4B右側的切片顯示與PD-L1-IgG1融合蛋白(R&D Systems)預培育後之結果，該PD-L1-IgG1融合蛋白與抗人類PD-L1抗體競爭以結合人類PD-L1。
圖5顯示相鄰正常FFPE扁桃體組織切片之照片，其中人類PD-L1蛋白質及原位雜交(ISH)mRNA表現係分別使用抗體22C33(圖5A)及原位雜交(ISH)(圖5B)藉由IHC分析法進行分析，且由此展示兩個獨特細胞群體之間的鑑別染色：隱窩上皮細胞(圖5A，左側放大圖及圖5B，上圖)及濾泡性巨噬細胞(圖5A，右側放大圖及圖5B，下圖)。
圖6說明多種抗人類PD-L1抗體及同位素對照抗體與HT144細胞(由mRNA分析(qPCR)已知其對hPD-L1之表現為陰性)(圖6A)及LOX黑素瘤細胞(已知其大量表現hPD-L1 mRNA(qPCR))(圖6B)之結合的流動式細胞測量評定之結果。
圖7顯示經工程改造之CHO細胞株(圖7A)及人類細胞株(圖7B，上圖)之FFPE細胞集結粒上由抗體22C3產生之IHC染色，且展示染色強度與相同人類細胞株中所量測之hPD-L1 mRNA表現量顯著相關(圖7B，下圖)。
圖8說明抗體22C3及20C3對hPD-L1之選擇性結合及相對親和力，其中圖表顯示基於細胞之ELISA實驗之結果，其中將不表現hPD-L1(圖8A)、表現hPDL-1(圖8B及圖8C)或表現人類PD-L2(圖8D)之細胞與指定初級抗體一起以指定濃度培育，且接著如實例中所述藉由二級山羊抗人類IgG抗體偵測初級抗體之結合。
圖9A至圖9C顯示抗體結合競爭分析法之結果，其展示抗體22C3及20C3結合不一致但重疊之抗原決定基。
圖10說明來自指定腫瘤類型之FFPE樣品之22C3 ICH染色強度之半定量完形評分的結果，染色程度隨評分數值之增加而增加。
圖11說明IHC分析法中由抗體22C3偵測之人類PD-L1表現與黑素瘤患者對抗人類PD-1抗體(MK-3475)療法之反應相關，圖11A中顯示對於hPD-L1表現描述為陽性、陰性或意義不明確之22C3-IHC染色之代表性影像，且圖11B顯示具有陽性或陰性反應且藉由IHC分析法對 於hPD-L1表現評分為陽性或陰性(包括評分為意義不明確之患者)之患者數目。
縮寫. 在本發明之整個實施方式及實例中將使用以下縮寫：ADCC 抗體依賴性細胞毒素
CDC 補體依賴性細胞毒性
CDR 除非另外指出，否則為使用Kabat編號系統定義之免疫球蛋白可變區中之互補決定區
CHO 中國倉鼠卵巢
Clothia Al-Lazikani等人,JMB 273：927-948(1997)中所述之抗體編號系統
EC50 產生50%功效或結合之濃度
ELISA 酶聯結免疫吸附劑分析法
FFPE 福馬林固定石蠟包埋
FR 抗體構架區：除CDR區以外之免疫球蛋白可變區。
HRP 辣根過氧化酶
IFN 干擾素
IC50 產生50%抑制作用之濃度
IgG 免疫球蛋白G
Kabat 由Elvin A.Kabat((1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版公共健康服務部(Public Health Service),國立衛生研究院(National Institutes of Health),Bethesda,Md.)創造之免疫球蛋白 對準及編號系統
mAb或Mab或MAb 單株抗體
MES 2-(N-嗎啉基)乙烷磺酸
MOA 作用機制
NHS 正常人類血清
PCR 聚合酶鏈反應
pE 焦麩胺酸酯
PK 藥物動力學
SEB 葡萄球菌腸毒素B(Staphylococcus Enterotoxin B)
TT 破傷風類毒素
V區 IgG鏈之區段，其序列在不同抗體之間可不同。其延伸至輕鏈中之Kabat殘基109及重鏈中之Kabat殘基113。
VH 免疫球蛋白重鏈可變區
VK 免疫球蛋白κ輕鏈可變區
定義
為可更容易瞭解本發明，下文對某些技術及科學術語進行特定定義。除非在本文中之其他地方特定定義，否則本文中所用之所有其他技術及科學術語具有一般熟習本發明所屬技術者所通常瞭解之含義。
除非上下文另外明確規定，否則如本文(包括隨附申請專利範圍)所使用之詞語的單數形式，諸如「一」及「該」包括其相應的複數參考意義。
除非上下文或明確另外指示，否則「活化」在用於細胞或受體時係指用配位子活化或處理細胞或受體。「配位子」涵蓋天然及合成 配位子，例如細胞因子、細胞因子變異體、類似物、突變型蛋白及來源於抗體之結合化合物。「配位子」亦涵蓋小分子，例如細胞因子之肽模擬物及抗體之肽模擬物。「活化」可指如由內部機制以及外部或環境因素所調節之細胞活化。
分子之「活性」可描述或可指分子與配位子或受體之結合、催化活性；刺激基因表現或細胞信號傳導、分化或成熟之能力；抗原活性、其他分子之活性之調節及其類似物。分子之「活性」亦可指調節或維持細胞間相互作用(例如黏著性)之活性或維持細胞結構(例如細胞膜或細胞骨架)之活性。「活性」亦可意謂比活性(例如[催化活性]/[蛋白質之毫克數]或[免疫活性]/[蛋白質之毫克數])、生物代謝區中之濃度或其類似物。「活性」可指先天或適應性免疫系統之組分的調節。
「投藥」及「治療」在用於動物、人類、實驗個體、細胞、組織、器官或生物流體時係指外源性醫藥劑、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人類、個體、細胞、組織、器官或生物流體之接觸。細胞之治療涵蓋使試劑與細胞接觸以及使試劑與流體接觸，其中該流體與該細胞相接觸。「投藥」及「治療」亦意謂藉由試劑、診斷結合化合物或藉由一種細胞例如對另一種細胞進行之活體外及離體治療。術語「個體」包括任何生物體，較佳為動物，更佳為哺乳動物(例如大鼠、小鼠、犬、貓、兔子)且最佳為人類。
「治療(Treat/treating)」意謂將治療劑，諸如含有任一種本發明之抗體或抗原結合片段之組合物以內部或外部方式投與患有一或多種疾病症狀或懷疑患有疾病之個體或患者，該藥劑對其具有治療活性。通常，該藥劑係以誘導症狀消退或以任何臨床上可量測的程度抑制症狀進展而有效減輕所治療之個體或群體之一或多種疾病症狀之量投與。有效減輕任何特定疾病症狀之治療劑之量(亦稱為「治療有效量」)可根據諸如疾病病況、年齡及患者體重之因素以及藥物在個體 中引發所需反應之能力而變化。可藉由醫師或其他熟練保健提供者通常用於評定疾病症狀之嚴重程度或進展狀態之任何臨床量測來評定疾病症狀是否已減輕。儘管本發明之實施例(例如治療方法或製品)不能有效減輕每一個體中之目標疾病症狀，但如此項技術中已知之任何統計學測試所確定，其應減輕統計上顯著量之個體中之目標疾病症狀，該測試為諸如史都登氏t測試(Student's t-test)、chi2測試、根據曼恩(Mann)及惠特尼(Whitney)之U測試、克拉斯卡-瓦立斯測試(Kruskal-Wallis test)(H測試)、喬治-斯特拉測試(Jonckheere-Terpstra-test)及維克松測試(Wilcoxon-test)。
「治療」在用於人類、獸醫學或研究個體時係指治療性治療以及研究及診斷應用。「治療」在用於人類、獸醫學或研究個體、或細胞、組織或器官時涵蓋本發明之抗體或抗原結合片段與人類或動物個體、細胞、組織、生理區室或生理流體之接觸。
抗PD-L1抗體
抗體20C3為由融合瘤次純系MEB037.20C3.116產生之抗體。
抗體22C3為由融合瘤次純系MEB037.22C3.138產生之抗體且與小鼠IgG1之異型S414R對應。22C3之成熟重鏈之N末端殘基為麩醯胺酸或焦麩胺酸酯(pE)，其為當基因序列編碼成熟重鏈或輕鏈中之N末端麩醯胺酸時通常在單株抗體中觀察到之常見轉譯後修飾。
本發明之抗體及抗原結合片段結合在某些人類細胞之表面上表現之人類PD-L1之成熟形式(缺乏分泌前前導序列，亦稱為前導肽)。術語「PD-L1」及「成熟PD-L1」在本文中可互換使用，且除非另外指出或自上下文中顯而易見，否則應理解為意謂相同分子。成熟人類PD-L1分子由以下序列(SEQ ID NO：37)之胺基酸19-290組成：MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSL GNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET。
成熟人類PD-L1之細胞外域由以下序列(SEQ ID NO：38)組成：FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERT。
如本文所用，抗人類PD-L1抗體或抗hPD-L1抗體係指特異性結合人類PD-L1之抗體。「特異性結合人類PD-L1」之抗體或「特異性結合包含人類PD-L1之胺基酸序列之多肽」之抗體為呈現相比於其他抗原優先結合人類PD-L1之抗體，但此特異性不需要絕對結合特異性。若在抗hPD-L1抗體之結合可例如在不產生不當結果(諸如IHC診斷分析法中之假陽性)之情況下決定樣品中是否存在人類PD-L1，則認為抗hPD-L1抗體對人類PD-L1具有「特異性」。本發明之抗hPD-L1抗體所需之特異性的程度可視抗體之預定用途而定，且至少藉由其用於預定目的之適合性來定義。本發明之抗體或其結合片段以某一親和力結合人類PD-L1，該親和力比對任何非PD-L1蛋白質之親和力大至少兩倍、較佳大至少十倍、更佳大至少20倍且最佳大至少100倍。如本文所用，若抗體結合包含既定序列之多肽，但不結合缺乏該序列之蛋白質，則認為抗體特異性結合包含該序列之多肽，例如成熟人類PD-L1(在此情況下為SEQ ID NO：37之胺基酸19-290)。舉例而言，特異性結合包含SEQ ID NO：37之19-290之多肽的抗體可結合SEQ ID NO：37之 19-290之FLAG®標記形式，但不結合其他FLAG®標記之蛋白質。
如本文所用，術語「抗體」係指呈現所需生物活性之任何形式之抗體。因此，其係以最廣泛含義使用且特定涵蓋(但不限於)單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、人類化完全人類抗體、嵌合抗體及駱駝單域抗體。「親本抗體」為藉由在抗體進行修飾以用於預定用途(諸如用作人類治療抗體而進行抗體之人類化)之前使免疫系統暴露於抗原所獲得之抗體。
如本文所用，除非另外指出，否則「抗體片段」或「抗原結合片段」係指抗體之抗原結合片段，亦即保留特異性結合由全長抗體結合之抗原之能力的抗體片段，例如保留一或多個CDR區之片段。抗體結合片段之實例包括(但不限於)Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子，例如sc-Fv；奈米抗體及由抗體片段形成之多特異性抗體。
「Fab片段」包含一個輕鏈、及一個重鏈之CH1及可變區。Fab分子之重鏈不能與另一個重鏈分子形成雙硫鍵。「Fab片段」可為抗體之番木瓜蛋白酶裂解之產物。
「Fc」區含有兩個包含抗體之CH1及CH2域之重鏈片段。該兩個重鏈片段由兩個或兩個以上雙硫鍵及CH3域之疏水性相互作用保持在一起。
「Fab'片段」含有一個輕鏈、及一個重鏈之含有VH域及CH1域以及CH1與CH2域之間的區域之部分或片段，以便可在兩個Fab'片段之兩個重鏈之間形成鏈間雙硫鍵以形成F(ab')2分子。
「F(ab')2片段」含有兩個輕鏈及含有CH1與CH2域之間的恆定區之一部分的兩個重鏈，以便在兩個重鏈之間形成鏈間雙硫鍵。因此，F(ab')2片段由藉由兩個重鏈之間的雙硫鍵保持在一起的兩個Fab'片段構成。「F(ab')2片段」可為抗體之胃蛋白酶裂解之產物。
「Fv區」包含來自重鏈與輕鏈之可變區，但缺乏恆定區。
術語「單鏈Fv」或「scFv」抗體係指包含抗體之VH及VL域之抗體片段，其中此等結構域存在於單個多肽鏈中。一般而言，Fv多肽進一步包含介於VH與VL域之間的多肽連接子，其使得scFv能夠形成用於抗原結合之所需結構。對於scFv之評述，參見Pluckthun(1994)THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES,第113卷,Rosenburg及Moore編,Springer-Verlag,New York,第269-315頁。亦參見國際專利申請公開案第WO 88/01649號及美國專利第4,946,778號及第5,260,203號。
「域抗體」為僅含有重鏈可變區或輕鏈可變區之免疫功能性免疫球蛋白片段。在一些情況下，兩個或兩個以上VH區與肽連接子共價接合以產生二價域抗體。二價域抗體之兩個VH區可靶向相同或不同抗原。
「二價抗體」包含兩個抗原結合位點。在一些情況下，該兩個結合位點具有相同抗原特異性。然而，二價抗體可為雙特異性(參見下文)。
在某些實施例中，單株抗體在本文中亦包括駱駝單域抗體。參見例如Muyldermans等人,(2001)Trends Biochem.Sci.26：230；Reichmann等人,(1999)J.Immunol.Methods 231：25；WO 94/04678；WO 94/25591；美國專利第6,005,079號。在一個實施例中，本發明提供一種單域抗體，其包含兩個具有修飾之VH域以便形成單域抗體。
如本文所用，術語「雙功能抗體」係指具有兩個抗原結合位點之小抗體片段，該等片段在同一多肽鏈(VH-VL或VL-VH)中包含連接至輕鏈可變域(VL)之重鏈可變域(VH)。藉由使用過短而無法使同一鏈上兩個域之間配對的連接子，該等域被迫與另一鏈之互補域配對且產生兩個抗原結合位點。雙功能抗體更充分地描述於例如EP 404,097； WO 93/11161；及Holliger等人,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448中。對於經工程改造之抗體變異體之評估，一般參見Holliger及Hudson(2005)Nat.Biotechnol.23：1126-1136。
通常，本發明之抗體或抗原結合片段在其人類PD-L1結合活性以莫耳濃度計進行表現時保留其人類PD-L1結合活性之至少10%(當與親本抗體比較時)。本發明之抗體或抗原結合片段較佳保留親本抗體之人類PD-L1結合親和力之至少20%、50%、70%、80%、90%、95%、或100%或100%以上。本發明之抗體或抗原結合片段亦意欲可包括不實質上改變其生物活性之保守或非保守胺基酸取代(稱為抗體之「保守變異體」或「功能保守變異體」)。
「經分離之抗體」係指純化狀態且在該上下文中意謂分子實質上不含其他生物分子，諸如核酸、蛋白質、脂質、碳水化合物或其他物質(諸如細胞碎片及生長培養基)。一般而言，術語「分離」不意欲指完全不存在該物質或不存在水、緩衝液或鹽，除非其以實質上干擾如本文所述之結合化合物之實驗或治療性用途之量存在。
如本文所用，術語「單株抗體」係指實質上均質之抗體群體，亦即除以較小量存在之可能天然存在之突變外，包含該群體之抗體分子之胺基酸序列一致。相反，習知(多株)抗體製劑通常包括大量的在可變域中，尤其在CDR中具有不同胺基酸序列之不同抗體，其通常對不同抗原決定基具有特異性。修飾語「單株」指示如自實質上均質之抗體群體獲得之抗體特徵，且不應理解為需要藉由任何特定方法產生該抗體。舉例而言，根據本發明使用之單株抗體可藉由Kohler等人,(1975)Nature 256：495首先描述之融合瘤方法製得，或可藉由重組DNA方法(參見例如美國專利第4,816,567號)製得。「單株抗體」亦可使用例如Clackson等人,(1991)Nature 352：624-628及Marks等人,(1991)J.Mol.Biol.222：581-597中所述之技術自噬菌體抗體文庫分 離。亦參見Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116：731。
一般而言，基本抗體結構單元包含四聚體。各四聚體包括兩個一致的多肽鏈對，各對具有一個「輕」鏈(約25kDa)及一個「重」鏈(約50-70kDa)。各鏈之胺基末端部分包括主要負責抗原識別之約100個至110個或110個以上胺基酸之可變區。重鏈之羧基末端部分可定義主要負責效應功能之恆定區。通常將人類輕鏈分類為κ及λ輕鏈。此外通常將人類重鏈分類為μ、δ、γ、α或ε，且將抗體之同型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。在輕鏈及重鏈內，可變區及恆定區由約12個或12個以上胺基酸之「J」區接合，其中重鏈亦包括約10個以上胺基酸之「D」區。通常參見Fundamental Immunology，第7章(Paul,W.編,第2版,Raven Press,N.Y.(1989))。
各輕鏈/重鏈對之可變區形成抗體結合位點。因此，一般而言，完整抗體具有兩個結合位點。除非在雙功能性或雙特異性抗體中，否則兩個結合位點一般相同。
通常，重鏈與輕鏈之可變域包含位於相對保守之構架區(FR)內的三個高變區，亦稱為互補決定區(CDR)。CDR通常藉由構架區對準，從而使得能夠結合特異性抗原決定基。一般而言，自N末端到C末端，輕鏈與重鏈可變域均包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。一般根據Sequences of Proteins of Immunological Interest,Kabat等人；國立衛生研究院，Bethesda,Md.；第5版；NIH出版號91-3242(1991)；Kabat(1978)Adv.Prot.Chem.32：1-75；Kabat等人,(1977)J.Biol.Chem.252：6609-6616；Chothia等人,(1987)J Mol.Biol.196：901-917或Chothia等人,(1989)Nature 342：878-883之定義將胺基酸歸類至各結構域。
如本文所用，術語「高變區」係指負責抗原結合之抗體之胺基酸殘基。高變區包含來自「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基 (亦即輕鏈可變域中之CDRL1、CDRL2及CDRL3以及重鏈可變域中之CDRH1、CDRH2及CDRH3)。參見Kabat等人,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,公共健康服務部,國立衛生研究院,Bethesda,Md.(藉由序列定義抗體之CDR區)；亦參見Chothia及Lesk,(1987)J.Mol.Biol.196：901-917(藉由結構定義抗體之CDR區)。如本文所用，術語「構架」或「FR」殘基係指除本文定義為CDR殘基之高變區殘基外之可變域殘基。
「同源性」係指在最佳對準時兩個聚核苷酸序列之間或兩個多肽序列之間的序列相似性。當兩個比較序列中之位置由相同鹼或胺基酸單體次單元佔據時，例如若兩個DNA分子中之每一者中之位置由腺嘌呤佔據，則該等分子在該位置同源。同源性百分比為兩個序列共享之同源位置數目除以總比較位置數×100。舉例而言，若在序列最佳對準時兩個序列中10個位置中之8個匹配或同源，則兩個序列80%同源。一般而言，在序列對準時進行比較以得到最大同源性百分比。舉例而言，可藉由BLAST演算法進行比較，其中選擇演算法之參數以得到在各別參考序列之整個長度上之各別序列之間的最大匹配。
「經分離之核酸分子」意謂未與所有或一部分聚核苷酸締合之基因組之DNA或RNA、mRNA、cDNA或其合成來源或一些組合，其中經分離之聚核苷酸在自然界中可見或連接至在自然界中未連接之聚核苷酸。就本發明而言，應瞭解，「包含特定核苷酸序列之核酸分子」不涵蓋完整染色體。「包含」指定核酸序列之經分離之核酸分子除指定序列之外亦可包括多達10種或甚至多達20種或20種以上其他蛋白質或其部分或片段之編碼序列，或可包括控制所述核酸序列之編碼區之表現的可操作地連接之調節序列，及/或可包括載體序列。
片語「控制序列」係指在特定宿主生物體中表現可操作地連接之編碼序列所需之DNA序列。適用於原核生物之控制序列例如包括啟 動子、視情況選用之操縱子序列(operator sequence)及核糖體結合位點。已知真核細胞使用啟動子、聚腺苷酸化信號及強化子。
當核酸與另一核酸序列之間存在功能關係時，其為「可操作地連接」。舉例而言，若前序列或分泌性前導序列之DNA表現為參與多肽分泌之前體蛋白，則其與該多肽之DNA可操作地連接；若啟動子或強化子影響編碼序列之轉錄，則其與該序列可操作地連接；或若核糖體結合位點經定位以便有助於轉譯，則其與編碼序列可操作地連接。一般而言，「可操作地連接」意謂所連接之DNA序列相鄰且在分泌性前導序列之情況下，相鄰且在閱讀相(reading phase)中。然而，強化子不必為相鄰的。連接係藉由在適宜限制性位點處連接來實現。若該等位點不存在，則根據慣例使用合成寡核苷酸接附子或連接子。
如本文所用，表述「細胞」、「細胞株」及「細胞培養物」可互換使用且所有該等名稱均包括子代。因此，詞語「轉型物」及「轉型之細胞」包括原代目標細胞及由其衍生之培養物(不考慮轉移次數)。亦應瞭解，由於有意或無意的突變，並非所有子代均具有精確一致的DNA含量。包括在最初轉型細胞中所篩選之具有相同功能或生物活性之突變型子代。當意欲使用不同名稱時，應將其與上下文區分。
如本文所用，「聚合酶鏈反應」或「PCR」係指其中將特異性核酸序列、RNA及/或DNA擴增之程序或技術，如例如美國專利第4,683,195號中所述。一般而言，使用來自相關區域之末端或其以外的序列資訊設計寡核苷酸引子。此等引子與待擴增模板之相反股之序列一致或類似。兩個引子之5'末端核苷酸可與擴增物質之末端一致。可使用PCR擴增特異性RNA序列、來自總基因組DNA之特異性DNA序列及自總細胞RNA轉錄之cDNA、噬菌體或質體序列等。一般而言參見Mullis等人,(1987)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51：263；Erlich編,(1989)PCR TECHNOLOGY(Stockton Press,N.Y.)。如本文 所用，認為PCR為用於擴增核酸測試樣品之核酸聚合酶反應法之一個實例，但非僅有實例，其包含使用已知核酸作為引子且使用核酸聚合酶擴增或產生核酸之特異性斷片。
如本文所用，「生殖系序列」係指非重組免疫球蛋白DNA序列之序列。可使用任何適合來源之非重排免疫球蛋白序列。可例如自美國國立衛生研究院之國立關節炎及肌肉骨胳及皮膚疾病研究所(National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases)之網站上之JOINSOLVER®生殖系資料庫獲得人類生殖系序列。可例如如Giudicelli等人,(2005)Nucleic Acids Res.33：D256-D261中所述獲得小鼠生殖系序列。
例示性抗PD-L1抗體之物理及功能特性
本發明提供經分離之抗PD-L1抗體及抗體或其抗原結合片段在偵測細胞表面上之PD-L1表現中之使用方法。本發明之抗PD-L1抗體之實例包括(但不限於)：抗體20C3及22C3(參見圖1及圖2)。20C3及22C3抗體結合非一致但相鄰之抗原決定基(參見實例2及圖9)，從而指示可混合此等兩種抗體之CDR以衍生在此等抗原決定基中之一者或兩者處特異性結合PD-L1之其他抗體。因此，結合人類PD-L1之經分離之抗體或其抗原結合片段可包含表1至表3中所示之輕鏈互補決定區中之三者及重鏈CDR中之三者。
「經保守修飾之變異體」或「保守取代」係指用具有類似特徵(例如電荷、側鏈尺寸、疏水性/親水性、主鏈構形及剛性等)之其他胺基酸取代蛋白質中之胺基酸，以便通常可在不改變蛋白質之生物活性下進行改變。熟習此項技術者認為多肽之非必要區域中之單次胺基酸取代一般不會實質上改變生物活性(參見例如Watson等人,(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224頁(第4版))。另外，在結構上或功能上類似的胺基酸之取代不太可能破壞生物活性。例示性保守取代闡述於表4中。
本發明亦涵蓋本發明抗體之功能保守變異體。如本文所用，「功能保守變異體」係指其中一或多個胺基酸殘基在不改變所要特性(如抗原親和力及/或特異性)下發生改變之抗體或片段。該等變異體包括(但不限於)將胺基酸用具有類似特性之胺基酸替換，諸如表4中之保守胺基酸取代。
在另一個實施例中，本發明包括如下抗體或其抗原結合片段：特異性結合PD-L1，且具有VL域及VH域，且與表1或表2之輕鏈及重鏈CDR共享100%序列同源性且與表1或表2之輕鏈及重鏈成熟可變區共享至少90%、92%、94%、96%、98%或99%序列同源性。
核酸
本發明亦提供編碼本文所揭示之抗PD-L1抗體及抗原結合片段之免疫球蛋白鏈之核酸。舉例而言，本發明包括編碼表1、表2及表3中所述之胺基酸的核酸以及與其雜交之核酸。
一般而言，核酸在低、中或高嚴格性條件下雜交且編碼維持特異性結合PD-L1之能力的抗體。當第一核酸分子之單股形式可在適當溫度條件及溶液離子強度下黏接至第二核酸分子時，該第一核酸分子可與第二核酸分子「雜交」(參見Sambrook等人,上述)。溫度及離子強度條件確定雜交之「嚴格性」。典型低嚴格性雜交條件包括55℃、 5X SSC、0.1% SDS且無甲醯胺；或30%甲醯胺、5X SSC、0.5% SDS、在42℃下。典型中嚴格性雜交條件為40%甲醯胺、5X或6X SSC及0.1% SDS、在42℃下。高嚴格性雜交條件為50%甲醯胺、5X或6X SSC、在42℃下或視情況在較高溫度(例如57℃、59℃、60℃、62℃、63℃、65℃或68℃)下。一般而言，SSC為0.15M NaCl及0.015M檸檬酸鈉。雜交需要兩個核酸含有補充序列，但視雜交之嚴格性而定，可能存在鹼之間的錯配。核酸雜交之適當嚴格性視核酸之長度及互補程度、此項技術中熟知之變數而定。兩個核苷酸序列之間的相似或同源程度愈大，則核酸可雜交之嚴格性愈高。對於長度大於100個核苷酸之雜交物而言，已推導出計算熔融溫度之方程(參見Sambrook等人,上述,9.50-9.51)。對於與較短核酸(例如寡核苷酸)之雜交而言，錯配之位置更為重要，且寡核苷酸之長度決定其特異性(參見Sambrook等人,上述,11.7-11.8)。
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在另一個實施例中，本發明提供編碼本文所述之經分離之抗PD-L1抗體或抗原結合片段之多肽鏈中之至少一者的經分離之核酸，例如DNA。在一些實施例中，經分離之核酸編碼單核酸分子上之輕鏈與重鏈，且在其他實施例中，在各別核酸分子上編碼輕鏈及重鏈。在另一個實施例中，核酸進一步編碼信號序列。
本發明亦提供包含本發明之經分離之核酸的表現載體，其中該核酸可操作地連接至在用載體轉染宿主細胞時由宿主細胞所識別之控制序列。亦提供包含本發明之表現載體的宿主細胞及產生本文所揭示之抗體或其抗原結合片段的方法，該等方法包含在培養基中培養具有編碼抗體或抗原結合片段之表現載體之宿主細胞，及自宿主細胞或培養基分離抗原或其抗原結合片段。
抗原決定基結合
本發明進一步提供藉由分別與20C3或22C3結合於相同抗原決定基來阻斷抗體20C3或22C3與人類PD-L1結合之抗體或其抗原結合片段。該等抗體及結合片段可如下鑑別：使用此項技術中已知之任何交 叉阻斷或競爭分析，包括實例2中所述之八隅體競爭分析，隨後鑑別交叉阻斷抗體所結合之人類PD-L1上之抗原決定基。若目標與第一抗體預先結合至飽和使實現目標之半最大結合所需之第二抗體濃度增至2、3、4、5、10、20、50、100、200倍或200倍以上，則認為第一抗體交叉阻斷第二抗體之結合。可使用此項技術中熟知之技術鑑別用於交叉阻斷抗體之結合抗原決定基。
一種該抗原決定基定位技術為與蛋白水解及質譜分析偶合之氫/氘交換(HDX-MS)。此方法依賴於當以多種時間間隔單獨在重水(D2O)中或在抗體存在下培育時，由抗原進行之氘併入程度之準確量測及比較。氘與暴露區域中之蛋白質之醯胺主鏈上之氫發生交換，而結合於抗體之抗原區域將受到保護且在藉由蛋白水解片段之液相層析聯合質譜分析(LC-MS/MS)進行分析之後顯示較小或無交換。
基於實例3中所述之HDX-MS抗原決定基定位，抗體22C3之成熟人類PD-L1上之建議抗原決定基包含細胞外域(SEQ ID NO：38)中之兩個不連續胺基酸區段中之殘基：156至178及196至206。其他抗原決定基殘基可能存在於細胞外域(SEQ ID NO：38)中之以下區段中：3至9；10至13；88至93及135至147。
因此，在一個實施例中，藉由與22C3結合於相同抗原決定基來阻斷抗體22C3與人類PD-L1結合之抗體可結合SEQ ID NO：38之第一胺基酸區段156至178之中之殘基及SEQ ID NO：38之第二胺基酸區段196至206中之殘基，且在一些實施例中亦結合SEQ ID NO：38之以下區段中任何一者、兩者或三者或所有四者中之殘基：胺基酸3至9；胺基酸10至13；胺基酸88至93及胺基酸135至147。
製造抗體及其抗原結合片段之方法
產生親本(例如嚙齒動物)單株抗X抗體之融合瘤細胞可藉由此項技術中通常已知之方法產生。此等方法包括(但不限於)最初由Kohler 等人,(1975)(Nature 256：495-497)開發之融合瘤技術以及三體雜交瘤技術(Hering等人,(1988)Biomed.Biochim.Acta.47：211-216及Hagiwara等人,(1993)Hum.Antibod.Hybridomas 4：15)、人類B細胞融合瘤技術(Kozbor等人,(1983)Immunology Today 4：72及Cote等人,(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 80：2026-2030)、EBV融合瘤技術(Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,第77-96頁,1985)，及使用細胞波(Cyto Pulse)大室剔除融合電穿孔儀之基於電場之電融合(Cyto Pulse Sciences,Inc.,Glen Burnie,MD)。較佳地，分離小鼠脾細胞且以PEG或基於標準方案藉由與小鼠骨髓瘤細胞株電融合來融合。
接著可針對產生抗原特異性抗體來篩選所得融合瘤。舉例而言，可以50% PEG將來自免疫之小鼠之脾淋巴細胞之單細胞懸浮液與六分之一數目之P3X63-Ag8.653非分泌小鼠骨髓瘤細胞(ATCC，CRL 1580)融合。細胞可以約2×105個細胞/毫升接種於平底微量滴定板中，隨後在含有以下物質之選擇性培養基中培育兩週：20%胎兒純系血清、18%「653」條件培養基、5%奧利金(origen)(IGEN)、4mM L-麩胺醯胺、1mM L-麩胺醯胺、1mM丙酮酸鈉、5mM HEPES、0.055mM 2-巰基乙醇、50個單位/毫升青黴素(penicillin)、50mg/ml鏈黴素(streptomycin)、50mg/ml健大黴素(gentamycin)及1X HAT(Sigma；在融合後24小時添加HAT)。在兩週之後，可在用HT替換HAT之培養基中培養細胞。接著可藉由ELISA針對抗X單株IgG抗體篩選個別孔。一旦出現廣泛融合瘤生長，則通常可在10-14天後觀察培養基。將分泌抗體之融合瘤再塗於板中，再篩選，且若對於人類IgG(抗X單株抗體)而言仍為陽性，則可藉由限制稀釋法次選殖至少兩次。
接著可活體外培養穩定之次純系以在組織培養基中產生少量抗體以供表徵。舉例而言，可使用以下程序自小鼠融合瘤細胞株 MEB037.22C3.138產生約1公克22C3抗體且進行純化。將冷凍MEB037.22C3.138細胞解凍且使用含有2mM額外L-麩醯胺酸且含有或不含0.18%普洛尼克F-68(Pluronic F-68)之無融合瘤血清之培養基將其接附至震盪燒瓶中。普洛尼克F-68之存在可改良震盪燒瓶培養物之存活力。一旦細胞完全接附至震盪燒瓶中，則在添加10% CHO CD高效進料B(Invitrogen，目錄號A10240-01)之情況下在WAVE生物反應器(GE Healthcare Life Sciences)中在無血清培養基中進行20公升產量培養。對於細胞擴增而言，在小WAVE袋中起始1公升培養，且接著在WAVE生物反應器中將1L WAVE培養擴增成20L培養。可以0.5×106個活細胞/毫升之細胞密度起始20公升培養，在第1天饋入10% CHO CD高效進料B，且每天用1N Na2CO3進行pH值調節。四天之後收集細胞。可每天收集小樣品進行NOVA分析。
可藉由以下方法自融合瘤培養物純化本發明之抗hPD-L1抗體。藉由使用1.2微米玻璃纖維及0.2微米乙酸纖維素過濾器深度過濾使融合瘤培養物澄清。向澄清的收集物中添加等體積之2X ProSepA緩衝液(100mM硼酸、5M NaCl，pH 8.5)且將稀釋之收集物裝載於170mL床體積蛋白質-A管柱上。管柱用5管柱體積(CV)1X ProSepA緩衝液(50mM硼酸、2.5M NaCl，pH 8.5)洗滌，接著用2CV 1X PBS洗滌，且將抗hPD-L1抗體用5CV溶離緩衝液(0.1M甘胺酸，pH 3.0)溶離。合併含有IgG之溶離份且藉由添加1/10體積之1.0M Tris(pH值緩衝液)來中和pH值。接著使用10kDa拋棄式TFF卡匣無菌過濾經中和之抗體組合物。可藉由針對10公升調配緩衝液(20mM乙酸鈉、9%蔗糖，pH 5.0)進行透濾且使用20次體積變化來調配抗體以進行儲存。使用此方案，可製備濃度為約5.0mg/ml之抗體22C3，且藉由SDS-PAGE、SEC HPLC及C8 RP-HPLC量測純度為至少98%，且內毒素含量小於0.1EU/ml且小於0.02EU/mg。
亦可以重組方式產生本文所揭示之抗PD-L1抗體(例如根據上文所討論在大腸桿菌(E.coli)/T7表現系統中)。在此實施例中，編碼本發明之抗體分子(例如VH或VL)之核酸可插入基於pET之質體中且表現於大腸桿菌/T7系統中。此項技術中已知若干種用於產生重組型抗體之方法。以重組方式產生抗體之方法的一個實例揭示於美國專利第4,816,567號中。可藉由任何已知的用於將聚核苷酸引入宿主細胞中之方法進行轉型。將異源聚核苷酸引入哺乳動物細胞中之方法在此項技術中熟知且包括聚葡萄糖介導之轉染、磷酸鈣沈澱、聚凝胺介導之轉染、原生質體融合、電致孔、聚核苷酸於脂質體中之囊封、基因槍注射(biolistic injection)及將DNA直接微注射至核中。另外，核酸分子可藉由病毒載體引入哺乳動物細胞中。細胞轉型之方法在此項技術中已熟知。參見例如美國專利第4,399,216號；第4,912,040號；第4,740,461號及第4,959,455號。
抗PD-L1抗體亦可藉由美國專利第6,331,415號中所述之任一方法合成。
可用作表現本文所揭示之抗體或片段之宿主的哺乳動物細胞株在此項技術中已熟知且包括可獲自美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)(ATCC)之許多永生化細胞株。此等細胞株尤其包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NSO、SP2細胞、海拉細胞(HeLa cell)、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴子腎臟細胞(COS)、人類肝細胞癌細胞(例如Hep G2)、A549細胞、3T3細胞、HEK-293細胞及許多其他細胞株。哺乳動物宿主細胞包括人類、小鼠、大鼠、犬、猴子、豬、山羊、牛、馬及倉鼠細胞。尤其較佳之細胞株係經由測定具有高表現量之細胞株來選擇。其他可使用之細胞株為昆蟲細胞株，諸如Sf9細胞、兩棲動物細胞、細菌細胞、植物細胞及真菌細胞。當將編碼重鏈或其抗原結合部分或片段、輕鏈及/或其抗原結合片段之重組表現載體引入哺乳 動物宿主細胞中時，藉由將宿主細胞培養足以使得在宿主細胞中表現抗體或更佳使抗體分泌至生長宿主細胞之培養基中之時間來產生抗體。
可使用標準蛋白質純化方法自培養基回收抗體。此外，可使用多種已知技術來增強本發明之抗體(或來自其之其他部分)自生產細胞株(production cell lines)之表現。舉例而言，麩醯胺酸合成酶基因表現系統(GS系統)為一種在特定條件下增強表現之常見方法。GS系統係完全或部分結合歐洲專利第0 216 846號、第0 256 055號及第0 323 997號及歐洲專利申請案第89303964.4號進行討論。
多株抗體為在一或多種其他非一致抗體中或在其存在下產生之抗體。一般而言，多株抗體係由不同B-淋巴細胞之集合產生，例如用相關免疫原處理之動物之B-淋巴細胞，由此產生全部針對該免疫原之不同抗體之群體。通常，多株抗體係直接獲自免疫動物，例如脾臟、血清或腹水液。
本發明進一步包括本文所揭示之抗PD-L1抗體之抗體片段。抗體片段包括F(ab)2片段，其可由IgG之例如胃蛋白酶酶促裂解產生。Fab片段可藉由例如用二硫蘇糖醇或巰基乙胺還原F(ab)2來產生。Fab片段為藉由雙硫橋附接至VH-CH1鏈之VL-CL鏈。F(ab)2片段為兩個Fab片段，該兩個Fab片段又由兩個雙硫橋附接。F(ab)2分子之Fab部分包括Fc區中之其間安置有雙硫橋的部分。FV片段為VL或VH區。
可視免疫球蛋白之重鏈之恆定域之胺基酸序列而將其歸為不同類別。存在至少五個主要免疫球蛋白類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且若干此等類別可進一步分成子類(同型)，例如IgG-1、IgG-2、IgG-3及IgG-4；IgA-1及IgA-2。本發明包含任一此等抗體類別或子類中之抗體及抗原結合片段。
在一個實施例中，抗體或抗原結合片段包含重鏈恆定區，例如 人類恆定區，諸如γ1、γ2、γ3或γ4人類重鏈恆定區或其變異體。在另一個實施例中，抗體或抗原結合片段包含輕鏈恆定區，例如人類輕鏈恆定區，諸如λ或κ人類輕鏈區或其變異體。舉例而言(但不侷限於)，人類重鏈恆定區可為γ1且人類輕鏈恆定區可為κ。在替代實施例中，抗體之Fc區為具有Ser228Pro突變之γ4(Schuurman,J等人,Mol.Immunol.38：1-8,2001)。
在一些實施例中，可將不同恆定域附接至來源於本文提供之CDR的人類化VL及VH區。舉例而言，若本發明之抗體(或片段)之特定預定用途需要效應功能有改變，則可使用除人類IgG1外之重鏈恆定域，或可利用雜交IgG1/IgG4。
抗體工程改造
在特定實施例中，需要如下文所述將含有暴露之側鏈的某些胺基酸變為另一胺基酸殘基以提供更大的最終抗體之化學穩定性。天冬醯胺之去醯胺可在N-G或D-G序列上發生且引起產生異天冬胺酸殘基，該異天冬胺酸殘將扭接引入多肽鏈中且降低其穩定性(異天冬胺酸作用)。在某些實施例中，本發明之抗體不含有天冬醯胺異構化位點。
舉例而言，天冬醯胺(Asn)殘基可變成Gln或Ala以降低在任何Asn-Gly序列處，尤其在CDR內形成異天冬胺酸的可能。類似問題可能存在於Asp-Gly序列處。Reissner及Aswad(2003)Cell.Mol.Life Sci.60：1281。異天冬胺酸形成可削弱或完全消除抗體與其目標抗原之結合。參見Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116：731-734。在一個實施例中，使天冬醯胺變為麩醯胺酸(Gln)。亦可能需要改變與天冬醯胺(Asn)或麩醯胺酸(Gln)殘基相鄰之胺基酸以降低去醯胺之可能性，此舉在小胺基酸與天冬醯胺或麩醯胺酸相鄰時以更大機率發生。參見Bischoff及Kolbe(1994)J.Chromatog.662：261。另外，CDR中之 任何甲硫胺酸殘基(通常為暴露於溶劑之Met)可變為Lys、Leu、Ala或Phe以降低甲硫胺酸硫氧化之可能性，由此可降低抗原結合親和力且亦有助於最終抗體製劑中的分子異質性。同上。在一個實施例中，將甲硫胺酸變為丙胺酸(Ala)。另外，為防止可能易裂之Asn-Pro肽鍵或使其減至最少，可能需要使CDR中所見之任何Asn-Pro組合變為Gln-Pro、Ala-Pro或Asn-Ala。隨後篩選具有該等取代之抗體以確保取代不會使針對人類PD-L1之抗體之親和力或特異性、或其他所要生物活性降低至不可接受的程度。
抗體結合物
本文所揭示之抗PD-L1抗體分子亦可與諸如放射性核素或其他可偵測標記之化學部分結合。放射性核素包括99Tc、90Y、111In、32P、14C、125I、3H、131I、11C、15O、13N、18F、35S、51Cr、57To、226Ra、60Co、59Fe、57Se、152Eu、67CU、217Ci、211At、212Pb、47Sc、109Pd、234Th及40K、157Gd、55Mn、52Tr及56Fe。螢光或化學發光標記包括螢光團，諸如稀土螯合劑、螢光素及其衍生物、若丹明(rhodamine)及其衍生物、異硫氰酸酯、藻青蛋白、別藻藍蛋白、鄰苯二甲醛、胺螢、152Eu、丹醯、傘酮、螢光素、魯米那標記(luminal label)、異魯米那標記、芳族吖啶酯標記(aromatic acridinium ester label)、咪唑標記、 吖啶鹽標記、草酸酯標記、水母發光蛋白標記、2,3-二氫酞嗪二酮、生物素/抗生物素蛋白、自旋標記及穩定自由基。
可採用此項技術中已知之任何使抗體分子與多種部分結合之方法，包括以下文獻中所述之方法：Hunter等人,(1962)Nature 144：945；David等人,(1974)Biochemistry 13：1014；Pain等人,(1981)J.Immunol.Meth.40：219；及Nygren,J.,(1982)Histochem.and Cytochem.30：407。結合抗體之方法在此項技術中習知且極為熟知。
實驗及診斷用途
本文所揭示之抗PD-L1抗體及抗體片段可用於特異性偵測在細胞表面上表現之人類PD-L1。細胞可存在於獲自人類個體之組織或血清樣品中，且使用此項技術中已知之多種活體外分析方法中之任一者進行PD-L1表現之偵測。
舉例而言，特定實施例包括ELISA分析(酶聯結免疫吸附劑分析法)，其通常包含以下步驟：(a)用抗PD-L1抗體或其抗原結合片段塗佈受質(例如微量滴定板孔(例如塑料板)之表面)；(b)將待測試是否存在人類PD-L1之樣品塗覆於受質；(c)洗滌板，由此移除樣品中未結合之物質；(d)塗覆亦對人類PD-L1具有特異性之經可偵測標記之抗體(例如與酶連接之抗體)；(e)洗滌受質，由此移除未結合之經標記之抗體；(f)若經標記之抗體與酶連接，則塗覆可由酶轉化成螢光信號之化學製品；及(g)偵測經標記之抗體之存在。
在另一個實施例中，經標記之抗體係用可與ABTS(例如2,2'-次偶氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))或3,3',5,5'-四甲基聯苯胺反應產生 可偵測之變色之過氧化酶標記。或者，經標記之抗體係用可在閃爍體存在下藉由閃爍計數器偵測之可偵測放射性同位素(例如3H)標記。
本發明之抗PD-L1抗體及其抗原結合片段可用於西方墨點法(Western blot)或免疫蛋白質墨點程序。該程序形成本發明之一部分且包括例如：(1)使待測試是否存在人類PD-L1之膜或其他固體受質與本發明之抗體或其抗原結合片段接觸。該膜可呈基於硝化纖維或乙烯(例如聚偏二氟乙烯(PVDF))之膜的形式，其中在非變性PAGE(聚丙烯醯胺凝膠電泳)凝膠或SDS-PAGE(十二院基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳)凝膠中測試是否存在X的蛋白質可轉移至該膜(例如在凝膠中電泳分離之後)。在膜與抗PD-L1抗體或片段接觸之前，視情況例如用脫脂乳粉或其類似物阻斷該膜以便結合膜上之非特異性蛋白質結合位點(2)洗滌膜一或多次以移除未結合之抗PD-L1抗體或片段及其他未結合之物質；及(3)偵測結合之抗PD-L1抗體或片段。
結合之抗體或片段可如下進行偵測：將結合之抗體或片段與經可偵測標記之二級抗體(抗免疫球蛋白抗體)一起培育，且接著偵測是否存在二級抗體。
本文所揭示之抗PD-L1抗體及其抗原結合片段亦可用於免疫組織化學(IHC)分析法中，該等分析法可使用此項技術中已知之多種IHC形式進行且組成本發明之實施例。典型IHC分析使用約3-4毫米且較佳4微米、安裝於顯微鏡載片上且乾燥之FFPE組織切片且包含例如(1)使組織切片經受脫蠟及水合，使再水合之組織切片與本發明之抗PD-L1抗體或其抗原結合片段接觸；及(2)在組織中一或多個細胞之表面上偵測抗PD-L1抗體或其抗原結合片段。若抗體或片段本身經可偵測標記，則其可直接偵測。或者，抗體或片段可由已偵測到的經可偵測標 記之二級抗體結合。
較佳IHC分析法採用市售Dako EnVisionTM FLEX偵測系統，其意欲與Dako Autostainer儀器(Dako,Agilent Technologies Company,Glostrup,Denmark)一起使用。當將此系統與22C3抗體或包含22C3抗體之重鏈及輕鏈可變區之抗體一起使用時，可如下文所述進行IHC分析。將安裝於載片上之四微米厚之FFPE組織切片風乾隔夜，在60℃下烘烤45分鐘，脫蠟且再水合。在脫蠟之後，使FFPE載片經歷藉由在97℃下使用EnVisionTM FLEX高pH值目標檢索溶液且隨後在室溫下20分鐘而進行之熱致抗原決定基檢索。接著洗滌載片，用2μg/mL之22C3染色60分鐘，且接著如下使用Dako EnVisionTM FLEX試劑進行偵測：EnVisionTM FLEX+MS連接劑(15分鐘)、EnVisionTM FLEX/HRP(20分鐘)、EnVisionTM FLEX DAB(10分鐘)及DAB增強劑(7分鐘)，其中插有洗滌步驟。
本文所揭示之某些抗PD-L1抗體及其抗原結合片段亦可用於活體內腫瘤成像。該方法可包括將經放射性標記之抗PD-L1抗體或其抗原結合片段注射至待測試是否存在與PD-L1表現相關之腫瘤之人類患者體內，隨後對患者之身體進行核成像以偵測是否存在經標記之抗體或片段，例如在結合於腫瘤之包含高濃度之抗體或片段之基因座處。
成像技術包括SPECT成像(單光子發射電腦斷層攝影法)或PET成像(正電子發射斷層攝影法)。標記包括例如碘-123(123I)及鍀-99m(99mTc)(例如與SPECT成像結合使用)、或11C、13N、15O或18F(例如與PET成像結合使用)、或銦-111(參見例如Gordon等人,(2005)International Rev.Neurobiol.67：385-440)。
偵測套組及治療套組
為方便起見，本文所揭示之抗體或特異性結合劑可提供於套組，亦即預定量之試劑與用於進行診斷或偵測分析之說明書的封裝組 合中。當抗體經酶標記時，該套組將包括酶所需之受質及輔因子(例如提供可偵測發色團或螢光團之受質前驅體)。此外，可包括其他添加劑，諸如穩定劑、緩衝液(例如阻斷緩衝液或溶解緩衝液)及其類似物。多種試劑之相對量可廣泛變化以提供可實質上使分析法之敏感性最佳化之溶液中之試劑濃度。特定言之，試劑可以乾粉形式(通常經凍乾)提供，其包括一經溶解即提供具有合適濃度之試劑溶液的賦形劑。
亦提供診斷或偵測試劑及包含一或多種該等試劑之套組，其係用於多種偵測分析法(包括例如免疫分析法，諸如ELISA(夾心型或競爭性形式))。在使用套組時可將套組之組分預先附接至固體載體或可塗覆於固體載體之表面。在一些實施例中，在使用之前，信號產生構件可與本發明之抗體預先締合或可能需要與一或多種組分(例如緩衝液、抗體-酶結合物、酶受質或其類似物)組合。套組亦可包括其他試劑，例如用於使與固相表面之非特異性結合減少之阻斷試劑、洗滌試劑、酶受質及其類似物。固相表面可呈管、珠粒、微量滴定盤、微球體或其他適用於固定蛋白質、肽或多肽之物質的形式。在特定態樣中，催化化學發光或顯色產物形成或化學發光或顯色受質之減少之酶為信號產生構件之組分。該等酶在此項技術中熟知。套組可包含本文所述之捕捉劑及偵測試劑中之任一者。套組視情況亦可包含用於實施本發明方法之說明書。
亦可製備本文所揭示之偵測套組，其包含本文所揭示之抗體或抗原結合片段中之至少一者及使用組合物作為偵測試劑的說明書。用於該等套組之容器通常可包含至少一個小瓶、試管、燒瓶、瓶子、注射器或其他適合容器，可將一或多種偵測組合物置於該等容器中且較佳進行適當等分。本文所揭示之套組通常亦包括用於含有嚴禁商業銷售之小瓶之構件，諸如其中夾持有所要小瓶之注射或吹製塑料容器。 當套組內包括放射性標記、顯色、螢光或其他類型之可偵測標記或偵測構件時，標記劑可與偵測組合物本身提供於同一容器中，或可另外置於可置放該第二組合物且進行適當等分之第二不同容器構件中。或者，可在單個容器構件中製備偵測試劑，且在大多數情況下，套組通常亦包括用於含有嚴禁商業銷售之小瓶及/或宜封裝及運輸的構件。
亦提供用於進行本文所述之偵測或監測方法之器件或裝置。該裝置可包括可投入樣品之腔室或管、視情況包括閥門或泵以引導樣品流穿過器件之流體處理系統、視情況選用之用於自血液分離血漿或血清之過濾器、用於添加捕捉劑或偵測試劑之混合室及視情況選用之用於偵測與捕捉劑免疫複合物結合之可偵測標記之量的偵測器件。樣品流動可為被動的(例如藉由一旦施用樣品即不需要進一步操作裝置之毛細管力、流體靜力或其他力)或主動的(例如藉由施加經由機械泵、電滲泵、離心力或氣壓增加而產生之力)或藉由主動與被動力之組合實現。
其他實施例亦提供一種處理器、電腦可讀記憶體及儲存於電腦可讀記憶體上且適合於在處理器上執行以實施任一種本文所述之方法之常式。適合計算系統、環境及/或組態之實例包括個人電腦、伺服器電腦、手提式或膝上型器件、多處理器系統、基於微處理器之系統、機頂盒、可計劃性消費電子設備、網路PC、小型電腦、主機電腦、包括以上系統或器件中之任一者的分散式計算環境(distributed computing environments)或此項技術中已知之任何其他系統。
通用方法
分子生物學中之標準方法描述於Sambrook,Fritsch及Maniatis(1982及1989第2版,2001第3版)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Sambrook及Russell(2001)Molecular Cloning,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Wu(1993)Recombinant DNA,第217卷,Academic Press,San Diego,CA)中。標準方法亦發表於Ausbel等人,(2001)Current Protocols in Molecular Biology,第1-4卷,John Wiley and Sons,Inc.New York,NY中，該文獻描述細菌細胞及DNA突變誘發中之選殖(第1卷)、哺乳動物細胞及酵母中之選殖(第2卷)、糖結合物及蛋白質表現(第3卷)及生物資訊(第4卷)。
描述蛋白質純化方法，其包括免疫沈澱、層析、電泳、離心及結晶(Coligan等人,(2000)Current Protocols in Protein Science,第1卷,John Wiley and Sons,Inc.,New York)。描述化學分析、化學修飾、轉譯後修飾、融合蛋白之產生、蛋白質之糖基化(參見例如Coligan等人,(2000)Current Protocols in Protein Science,第2卷,John Wiley and Sons,Inc.,New York；Ausubel等人,(2001)Current Protocols in Molecular Biology,第3卷,John Wiley and Sons,Inc.,NY,NY,第16.0.5-16.22.17頁；Sigma-Aldrich,Co.(2001)Products for Life Science Research,St.Louis,MO；第45-89頁；Amersham Pharmacia Biotech(2001)BioDirectory,Piscataway,N.J.,第384-391頁)。描述多株及單株抗體之產生、純化及斷裂(Coligan等人,(2001)Current Protcols in Immunology,第1卷,John Wiley and Sons,Inc.,New York；Harlow及Lane(1999)Using Antibodies,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Harlow及Lane,同上)。可獲得用於表徵配位子/受體相互作用之標準技術(參見例如Coligan等人,(2001)Current Protocols in Immunology,第4卷,John Wiley,Inc.,New York)。
可製備單株、多株及人類化抗體(參見例如Sheperd及Dean(編)(2000)Monoclonal Antibodies,Oxford Univ.Press,New York,NY； Kontermann及Dubel(編)(2001)Antibody Engineering,Springer-Verlag,New York；Harlow及Lane(1988)Antibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,第139-243頁；Carpenter等人,(2000)J.Immunol.165：6205；He等人,(1998)J.Immunol.160：1029；Tang等人,(1999)J.Biol.Chem.274：27371-27378；Baca等人,(1997)J.Biol.Chem.272：10678-10684；Chothia等人,(1989)Nature 342：877-883；Foote及Winter(1992)J.Mol.Biol.224：487-499；美國專利第6,329,511號)。
人類化之替代方法為使用呈現於噬菌體上之人類抗體文庫或轉殖基因小鼠中之人類抗體文庫(Vaughan等人,(1996)Nature Biotechnol.14：309-314；Barbas(1995)Nature Medicine 1：837-839；Mendez等人,(1997)Nature Genetics 15：146-156；Hoogenboom及Chames(2000)Immunol.Today 21：371-377；Barbas等人,(2001)Phage Display：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York；Kay等人,(1996)Phage Display of Peptides and Proteins：A Laboratory Manual,Academic Press,San Diego,CA；de Bruin等人,(1999)Nature Biotechnol.17：397-399)。
抗原純化並非為產生抗體所必需。動物可用帶有相關抗原之細胞進行免疫。接著可自免疫動物分離脾細胞，且可使脾細胞與骨髓瘤細胞株融合以產生融合瘤(參見例如Meyaard等人,(1997)Immunity 7：283-290；Wright等人,(2000)Immunity 13：233-242；Preston等人,同上；Kaithamana等人,(1999)J.Immunol.163：5157-5164)。
抗體可與例如小藥物分子、酶、脂質體、聚乙二醇(PEG)結合。抗體適用於治療、診斷、套組或其他目的，且包括與例如染料、放射性同位素、酶或金屬(例如膠態金)偶合之抗體(參見例如Le Doussal等人,(1991)J.Immunol.146：169-175；Gibellini等人,(1998)J.Immunol. 160：3891-3898；Hsing及Bishop(1999)J.Immunol.162：2804-2811；Everts等人,(2002)J.Immunol.168：883-889)。
可獲得用於流動式細胞測量術之方法，其包括螢光活化細胞分選(FACS)(參見例如Owens等人,(1994)Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice,John Wiley and Sons,Hoboken,NJ；Givan(2001)Flow Cytometry,第2版；Wiley-Liss,Hoboken,NJ；Shapiro(2003)Practical Flow Cytometry,John Wiley and Sons,Hoboken,NJ)。可獲得適用於修飾核酸之螢光試劑，包括用作例如診斷試劑之核酸引子及探針、多肽及抗體(Molecular Probes(2003)Catalogue,Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR；Sigma-Aldrich(2003)Catalogue,St.Louis,MO)。
描述免疫系統組織學之標準方法(參見例如Muller-Harmelink(編)(1986)Human Thymus：Histopathology and Pathology,Springer Verlag,New York,NY；Hiatt等人,(2000)Color Atlas of Histology,Lippincott,Williams,and Wilkins,Phila,PA；Louis等人,(2002)Basic Histology：Text and Atlas,McGraw-Hill,New York,NY)。
可獲得用於測定例如抗原片段、前導序列、蛋白質摺疊、功能域、糖基化位點及序列對準之軟體封裝及資料庫(參見例如GenBank,Vector NTI® Suite(Informax,Inc,Bethesda,MD)；GCG Wisconsin Package(Accelrys,Inc.,San Diego,CA)；DeCypher®(TimeLogic Corp.,Crystal Bay,Nevada)；Menne等人,(2000)Bioinformatics 16：741-742；Menne等人,(2000)Bioinformatics Applications Note 16：741-742；Wren等人,(2002)Comput.Methods Programs Biomed.68：177-181；von Heijne(1983)Eur.J.Biochem.133：17-21；von Heijne(1986)Nucleic Acids Res.14：4683-4690)。
實例 實例1. 抗PD-L1融合瘤之產生及篩選
將Balb/C小鼠用含人類PD-L1-Fc融合蛋白(R&D Systems®目錄號156-B7-100)之佐劑進行免疫。此融合蛋白含有與人類IgG1片段(Pro100-Lys 300)融合之PD-L1之細胞外域(Phe19-Thr239)。在進行12次免疫之後，收集兩隻對人類PD-L1具有高效價之小鼠的淋巴結，且進行電融合以產生兩批融合瘤，給予其實驗室名稱MEB033及MEB037。
篩選MEB033及MEB037融合瘤批料之上清液以鑑別產生針對人類PD-L1之抗體的融合瘤。篩選採用針對與人類hPD-L1-Fc蛋白質之結合的基於蛋白質之ELISA；及針對與人類PD-L1-CHO人類PD-L1-CHO穩定轉型物及親本CHO細胞(作為陰性對照)之結合的基於細胞之ELISA。來自88個MEB037純系及23個MEB033融合瘤純系之上清液測試為對抗PD-L1抗體之存在呈陽性(資料未圖示)，且測試其樣品對來自正常人類扁桃體之FFPE組織切片的IHC反應性(資料未圖示)。
在該88個純系中，基於與由下表中所列舉之市售抗PD-L1抗體獲得之染色圖案相比較，僅11個來自MEB037批料之純系產生具有可保證進一步評估之充分強度及表觀特異性之染色圖案：
當發明者將由實驗抗體獲得之多種染色圖案與由此等市售抗人類PD-L1抗體獲得之圖案進行比較時，其觀察到染色圖案之間的顯著差異，包括染色之位置及染色細胞之類型。為試圖解釋此等差異，發明者進行許多其他實驗且發現此等市售抗體均不提供用於FFPE切片 中PD-L1表現之IHC所需之屬性的組合：(1)敏感性，亦即偵測陽性對照組織(例如人類扁桃體)中正常生理表現以及腫瘤組織(例如人類黑素瘤樣品)中表現之能力；(2)特異性，亦即染色圖案需要與PD-L1之已知解剖/細胞分佈相關且需為可中和的；及(3)穩固，亦即在用於分析「重複」組織切片時染色圖案幾乎無變化。
舉例而言，發明者發現Sigma/ProSco PRS4059抗體在扁桃體溶胞物上顯示多條色帶(可證實其均不表示PD-L1)，未能對藉由流動式細胞測量術證實為PD-L1陽性的LOX黑素瘤細胞株進行染色，且未能藉由IHC將陽性與陰性細胞株區分開。
一些此等資料顯示於圖4中，其中與PRS4059抗體(其由Gadiot等人(同上)鑑別為15種抗人類PD-L1抗體中唯一的適用於偵測FFPE組織切片中之PD-L1表現之候選物)相比，扁桃體切片之免疫組織化學染色將22C3及20C3鑑別為FFPE組織上之兩種具有罕見且有用免疫組織化學特性的抗體。在發明者所進行之實驗中，Prosci抗體(PRS4059，批號40590604，主要以0.4mg/ml使用，隨後使用兔聚合物偵測系統(DAKO Envision))以相等強度染色扁桃體中之所有造血譜系(圖4A)，而22C3抗體選擇性染色扁桃體隱窩上皮細胞及濾泡性CD68+骨髓細胞(形態上與巨噬細胞一致)(圖4B)。由抗體20C3觀察到實質上相同的染色圖案(資料未圖示)。此外，22C3及20C3展示此等兩個離散細胞群體之間的一致染色強度差，其中隱窩上皮細胞大於濾泡性巨噬細胞。所有三種抗體均可藉由與PD-L1抗原一起預培育來中和，從而指示反應性係藉由抗原結合域(CDR)介導。
實例2. 20C3及22C3抗PD-L1抗體之品質評定
此實例描述經實施以評定20C3及22C3抗體在用於FFPE組織切片之IHC分析法中之效用的其他實驗。
一個實驗評定此等兩種抗體在正常人類FFPE扁桃體切片之IHC分 析法中偵測多種人類PD-L1(hPD-L1)蛋白質表現之能力，且22C3之代表性影像顯示於圖5A中。用22C3進行免疫組織化學染色可強烈標記扁桃體隱窩上皮細胞，以及展示CD68+濾泡性骨髓群體之弱至中度染色(假定的巨噬細胞)。兩種抗體(20C3資料未圖示)均以明確界定之膜/細胞表面圖案形式標記此等兩種細胞類型中之細胞。在相鄰FFPE扁桃體組織切片上藉由獨立方法(用於hPD-L1 mRNA之原位雜交[ISH])證實扁桃體中hPD-L1表現之適當性(亦即IHC染色僅限於兩種細胞群體(隱窩上皮細胞及濾泡性巨噬細胞))。另外，如由IHC所評定之hPD-L1蛋白質之差異表現(隱窩上皮細胞>>濾泡性巨噬細胞)與由ISH所觀察到之hPD-L1 mRNA之相對豐度一致。
另一實驗評定20C3及22C3對hPD-L1表現細胞之結合特異性。將藉由mRNA分析(qPCR)已知對hPD-L1表現呈陰性的HT144細胞及已知大量表現hPD-L1 mRNA(qPCR)之LOX黑素瘤細胞用1微克/毫升之經純化之小鼠IgG染色，該經純化之小鼠IgG係來自以上實例1中所述實驗中所產生之七種融合瘤。亦使用相同濃度之無關同型對照小鼠抗體。使用螢光標記之抗小鼠二級抗體偵測初級小鼠抗體。在染色且重複洗滌之後，藉由流動式細胞測量術分析細胞，計算群體之中值螢光強度(>10,000個收集之事件)。結果顯示於圖6中。
將20C3及22C3以及其他hPD-L1抗體用作流動式細胞測量試劑以偵測細胞表面hPD-L1。20C3與22C3直方曲線(圖6A)與同型對照抗體曲線相比之顯著右移反映hPD-L1陽性LOX黑素瘤細胞株上hPD-L1之選擇性偵測。與此等直方圖及來自此分析之其他結果相關之中值螢光強度顯示於圖6B中。20C3及22C3結合之選擇性係藉由在陰性細胞株HT144上缺乏重要結合(亦即與同型相比22C3及20C3之MFI)進一步證實。相反，圖6B中之資料顯示與hPD-L1陽性LOX黑素瘤細胞株上之同型相比，20C3與22C3之MFI增加至少10倍。因此，藉由流動式細胞 測量評定，20C3與22C3(除純系5F9、7C8、13D2及31D3之外)展示與hPD-L1表現細胞之選擇性結合。
另一實驗評估22C3抗體偵測經工程改造及人類細胞株上hPD-L1表現之能力。將對hPD-L1呈陰性的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株用編碼人類PD-L1之表現載體轉染以產生經工程改造之陽性對照細胞株。如圖7B中所示，親本CHO細胞株(陰性對照)及經轉染之CHO細胞株(陽性對照)之福馬林固定石蠟包埋(FFPE)細胞集結粒之22C3免疫組織化學染色展示適當陽性及陰性染色。
將其他FFPE人類細胞株集結粒(A375、HS578T及LOX黑素瘤)用22C3染色且展示多種染色圖案及強度(如圖7B中所示)。22C3染色在Lox黑素瘤細胞上強烈且均勻，但在A375及HS578T細胞集結粒中僅顯示罕見的單陽性細胞。由20C3抗體觀察到類似染色(資料未圖示)。如以泛素mRNA作為基準使用qPCR所評定，在IHC分析中藉由22C3在此等3種細胞株中偵測到之hPD-L1表現量與此等細胞株中之PD-L1 mRNA含量充分相關。
在基於細胞之ELISA實驗中評估22C3對hPD-L1表現細胞之選擇性結合及相對親和力。將若干細胞株(hPDL1-CHOK1細胞、親本CHOK1細胞、hPDL2-CHOK1細胞及LOX細胞)塗於經膠原蛋白塗佈之96孔板之個別孔上且生長至匯合。移除培養基且用含有遞增濃度(介於1.4ng/ml與3,000ng/ml之間)之初級抗體之新鮮CHOK1培養基(含有10% BCS之DMEM/F12)替換。使用以下初級抗體：兩種不同生產批量之抗體20C3及22C3中之每一者，其中小鼠IgG1同型、抗PD-L1抗體(Biolegend)及抗PD-L2抗體充當對照。初級抗體在37℃下培育1小時，用PBS/0.01% Tween 20洗滌3次，且添加用CHOK1培養基以1：2000稀釋之二級抗體(山羊抗人類IgG、Fc特異性HRP(Southern Biotech，目錄號1030-05)結合物)。二級抗體在37℃下培育1小時且如上洗滌5次。 使用TMB進行ELISA，用0.1N磷酸中止，且讀取450nm下之吸光度(減去650nm下之本底)。圖8中所示之結果展示22C3及20C3與表現hPD-L1之細胞之選擇性結合，對於經hPD-L1 CHOK1工程改造之細胞及LOX細胞，22C3結合親和力之親和性均大於20C3。
進行類似ELISA實驗以評定20C3或22C3抗體中之任一者是否結合小鼠PD-L1。未觀察到任一種抗體與小鼠PD-L1之顯著結合(資料未圖示)。
進行實例1中所述實驗中所鑑別之不同抗hPD-L1抗體對之間的抗體結合競爭分析法(「交叉阻斷」)。該等分析法採用ForteBio® Octet®平台，其係基於生物薄膜干涉術。簡言之，此技術將初始抗體(mAb1)與生物感測器尖端表面之結合以歸因於結合抗體使生物感測器尖端之光學厚度(Y軸)隨著時間推移(X軸)而增加的波長位移(Δλ)進行量測。尖端由結合hPD-L1-Fc之抗huIgG感測器組成。抗PD-L1抗體結合時光學厚度之變化以由第一垂直紅色點線開始之向上傾斜之曲線反映(參見圖9A、圖9B及圖9C中之圖表)，其表示將飽和濃度之mAb1(10微克/毫升)添加至溶液中。在達到平衡(約1000秒)之後，將第二抗體注入分析溶液中(在圖9A、圖9B及圖9C中由第二垂直紅色點線指示)。由曲線之額外偏移所示之第二mAb2之結合表明兩種抗體結合於不相重疊的抗原決定基，而曲線幾乎無偏移表明兩種抗體結合於重疊或一致的抗原決定基。
總而言之，結果展示22C3結合與除5H9外之所有其他抗hPDL-1純系(作為mAb2進行測試)之額外結合進行競爭(圖9A)。類似地，20C3亦未能與5H9結合競爭，但顯示與22C3以及4B7之中等程度之額外結合(圖9B)。當一起考量時，此等資料指示20C3及22C3結合重疊的抗原決定基。
22C3抗體偵測不同腫瘤類型中多種hPD-L1表現之能力係藉由在 由以下腫瘤製備之FFPE切片上進行IHC分析來評定：膀胱、食道、頭頸、腎臟、HCC、乳房、肺、卵巢及胃腫瘤。使用染色程度之半定量「完形」解釋進行22C3與此等腫瘤組織切片反應性之初篩選。如圖10所描繪，22C3能夠偵測自基本上無染色(分數=0)至顯著強烈表現(分數=4)之多種PD-L1表現，從而展示22C3之IHC分析引導可對禁止免疫抑制PD-1/PD-L1相互作用起反應之未來腫瘤類型之效用。
在研究中評定22C3抗體將患者分級之效用，該等患者很可能對阻斷PD-1與PD-L1之相互作用的療法起反應，該等研究利用獲自18個參加第1階段(P001)MK-3475(一種由Merck and Co.,Inc研發之抗PD1治療抗體)試驗的黑素瘤患者之存檔樣品之22C3免疫組織化學評定。兩位病理學家獨立地評價該等情況且歸為「陽性」、「陰性」或「意義不明確」，且描繪此等三個種類之代表性影像顯示於圖11A中。病理學家之間關於此樣品集(n=18)的一致性為100%。
臨床反應係使用免疫相關反應準則(irRC)評定且與IHC結果相關。對於此分析而言，將「意義不明確的」情況視為陰性，從而使得分析敏感性為72%且特異性為86%。圖11B中所示之結果表明FFPE組織之22C3免疫組織化學染色具有作為患者選擇生物標記之效用。
基於上文所述實驗之結果，本文之發明者確定由88個實驗融合瘤中之兩者(MEB037.20C3.138及MEB037.20C3.116)所產生之抗體具有考慮發展成為候選FFPE反應性IHC診斷試劑所要的敏感性、特異性及穩固性之組合。
實例3. 人類PD-L1上抗原決定基針對22C3抗PD-L1抗體之定位
使用抗體22C3及PD-L1-His蛋白質(其含有與十一聚體組胺酸標記融合之成熟人類PD-L1之細胞外域(SEQ ID NO：38))進行HDX-MS抗原決定基定位。人類PD-L1之細胞外域(SEQ ID NO：38)上之區段156至178及196至206在結合於抗體22C3時顯示強保護作用(平均氘化程度差 >10%)。另外，區段3至9、10至13、88至93及135至147顯示微小但重要之保護(平均氘化程度差為5%至10%)。
本文所引用之所有參考文獻均以引用的方式併入，其引用的程度如同特定且個別地將各個別公開案、資料庫條目(例如Genbank序列或GeneID條目)、專利申請案或專利以引用的方式併入一般。按照37 C.F.R.§1.57(b)(1)，對於此關於參考文獻以引用的方式併入之陳述，申請人意指每一個別公開案、資料庫條目(例如Genbank序列或GeneID條目)、專利申請案或專利，每一文獻遵照37 C.F.R.§1.57(b)(2)進行明確標識，即使該引用並不緊鄰以引用方式併入之專用陳述。說明書中包含關於以引用的方式併入之專用陳述(若存在)並不以任何方式削弱此關於以引用的方式併入之通用陳述。本文中參考文獻之引用不意欲承認參考文獻為相關先前技術，亦不構成對此等公開案或文檔之內容或日期的任何承認。
本發明並不限於本文所述之特定實施例的範疇。實際上，熟習此項技術者將自先前描述及隨附圖示知曉除本文所述之內容外之本發明的多種修改。該等修改意欲屬於隨附申請專利範圍之範疇內。
認為以上書面說明書足以使熟習此項技術者能夠實踐本發明。熟習此項技術者將自以上描述知曉除本文所示及所述之內容外之本發明的多種修改且此等修改屬於隨附申請專利範圍之範疇內。
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<213> 人工序列
<220>
<223> 共同序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> 位置4之Xaa可為Ile或Met
<400> 5
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共同序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> 位置7之Xaa可為Asp或Gly
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> 位置9之Xaa可為His或Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> 位置12之Xaa可為Ser或Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> 位置13之Xaa可為Glu或Gln
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> 位置16之Xaa可為Ile或Met
<400> 6
<210> 7
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共同序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> 位置5之Xaa可為Ile或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> 位置13之Xaa可為Phe或Tyr
<400> 7
<210> 8
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共同序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> 位置3之Xaa可為His或Gln
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> 位置4之Xaa可為Leu或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> 位置13之Xaa可為Glu或Lys
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (34)..(34)
<223> 位置34之Xaa可為Ile或Met
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (37)..(37)
<223> 位置37之Xaa可為Ile或Leu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (56)..(56)
<223> 位置56之Xaa可為Asp或Gly
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (58)..(58)
<223> 位置58之Xaa可為或His或Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (61)..(61)
<223> 位置61之Xaa可為Asn或Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (62)..(62)
<223> 位置62之Xaa可為Glu或Gln
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (65)..(65)
<223> 位置65之Xaa可為Ile或Met
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (74)..(74)
<223> 位置74之Xaa可為Lys或Arg
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (75)..(75)
<223> 位置75之Xaa可為Ala或Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (77)..(77)
<223> 位置77之Xaa可為Ser或Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (82)..(82)
<223> 位置82之Xaa可為His或Cln
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (84)..(84)
<223> 位置84之Xaa可為IIe或Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (103)..(103)
<223> 位置103之Xaa可為Ile或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (111)..(111)
<223> 位置111之Xaa可為Phe或Tyr
<400> 8
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 9
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 10
<210> 11
<211> 20
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 11
<210> 12
<211> 132
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 12
<210> 13
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 13
<210> 14
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 14
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 15
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 16
<210> 17
<211> 13
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 17
<210> 18
<211> 19
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 18
<210> 19
<211> 141
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 19
<210> 20
<211> 122
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 20
<210> 21
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 21
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 22
<210> 23
<211> 20
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 23
<210> 24
<211> 132
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 24
<210> 25
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 25
<210> 26
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 26
<210> 27
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 27
<210> 28
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 28
<210> 29
<211> 13
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 29
<210> 30
<211> 19
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 30
<210> 31
<211> 141
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 31
<210> 32
<211> 122
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 位置1之Xaa可為Gln或焦麩胺酸酯
<400> 32
<210> 33
<211> 396
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 33
<210> 34
<211> 423
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 34
<210> 35
<211> 396
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 35
<210> 36
<211> 423
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 36

Claims (10)

  1. 一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其特異性結合人類PD-L1且包含CDRL1、CDRL2及CDRL3之三個輕鏈CDR及CDRH1、CDRH2及CDRH3之三個重鏈CDR，其中：(a)CDRL1係SEQ ID NO：9，CDRL2係SEQ ID NO：2，CDRL3係SEQ ID NO：10，CDRH1係SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15，CDRH2係SEQ ID NO：16，及CDRH3係SEQ ID NO：17；或(b)CDRL1係SEQ ID NO：21，CDRL2係SEQ ID NO：2，CDRL3係SEQ ID NO：22，CDRH1係SEQ ID NO：26，CDRH2係SEQ ID NO：28，及CDRH3係SEQ ID NO：29。
  2. 如請求項1之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該三個輕鏈CDR為SEQ ID NO：9；SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：10且該三個重鏈CDR為SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16及SEQ ID NO：17。
  3. 如請求項1之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該三個輕鏈CDR為SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：22且該三個重鏈CDR為SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28及SEQ ID NO：29。
  4. 如請求項1之經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中：(a)該輕鏈可變區係SEQ ID NO：13且該重鏈可變區係SEQ ID NO：20；或(b)該輕鏈可變區係SEQ ID NO：25且該重鏈可變區係SEQ ID NO：32。
  5. 如請求項1之經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中：(a)該輕鏈可變區為SEQ ID NO：13且該重鏈可變區為SEQ ID NO：20；(b)該輕鏈可變區為SEQ ID NO：25且該重鏈可變區為SEQ ID NO：32，其中SEQ ID NO：32中之X為Q；或(c)該輕鏈可變區為SEQ ID NO：25且該重鏈可變區為SEQ ID NO：32，其中SEQ ID NO：32中之X為焦麩胺酸酯(pE)。
  6. 如請求項5之經分離之抗體或其抗原結合片段，其係IgG1抗體。
  7. 一種經分離之抗體，其包含SEQ ID NO：25之輕鏈可變區、SEQ ID NO：32之重鏈可變區及小鼠IgG1恆定區。
  8. 一種經分離之核酸，其編碼抗體輕鏈可變區及抗體重鏈可變區中之一者或兩者，其中該抗體輕鏈可變區為SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：25且該抗體重鏈可變區為SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：32，其中SEQ ID NO：32中之X為Q。
  9. 如請求項8之經分離之核酸，其為表現載體。
  10. 一種宿主細胞，其包含如請求項9之經分離之核酸。
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