TWI654307B - 合成氣發酵法及培養基（一） - Google Patents
合成氣發酵法及培養基（一）Info
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Abstract
一種發酵合成氣之方法及一種發酵培養基提供高乙醇生產力同時去除先前視為必需的培養基成分。該方法可有效用以提供至少約為1克乙醇/(升．日．克細胞)的特定STY。於此面向中，發酵培養基具有少於約1.04pm硼，少於約0.16ppm錳，少於約0.26ppm鉬，或少於約0.16ppm銅。
Description
本案請求美國臨時專利申請案第61/650,098、61/650,093、61/650,077、61/650,084號申請日皆為2012年5月22日及美國臨時專利申請案第61/726,225號申請日2012年11月14日的權益，各案全文皆係爰引於此並融入本說明書的揭示。
提供用於合成氣發酵之方法及培養基。更明確言之，提供方法及培養基其可提供高水平乙醇生產力，即便於先前被視為必需或必要於某些濃度水平的成分其濃度被去除或減低時亦復如此。
發酵係在經界定的液體培養基內進行。此等培養基典型地將包括用於改良發酵效能上要緊的各種大量及微量營養素來源。用以連結較不常見酶基質諸如氣態酶基質的培養基要求經明確界定的培養基以最佳化效能。厭氧發酵也要求經明確界定的培養基。
厭氧微生物可經由氣態酶基質的發酵而從一氧化碳(CO)製造乙醇。使用得自梭菌屬(Clostridium)的厭氧微
生物發酵可製造乙醇及其它有用的產品。舉例言之，美國專利案第5,173,429號描述一種從合成氣製造乙醇及乙酸鹽的厭氧微生物俊達氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)ATCC No.49587。美國專利案第5,807,722號描述一種使用俊達氏梭菌ATCC No.55380將廢氣轉換成有機酸類及醇類之方法及裝置。美國專利案第6,136,277號描述一種使用俊達氏梭菌ATCC No.55988及55989將廢氣轉換成乙醇之方法及裝置。
美國專利案第7,285,402號描述已知用在氣態酶基質的厭氧發酵而製造乙醇的培養基。培養基內的各個成分及成分濃度係可有效用以提供高水平乙醇生產力。去除某些成分及減少其它成分要求的濃度水平，同時維持乙醇生產力可提供顯著節省成本，特別係在商業規模發酵時尤為如此。
一種發酵合成氣之方法及一種發酵培養基提供高乙醇生產力同時去除先前視為必需的培養基成分。去除某些培養基成分及減少其它培養基成分的濃度於商業規模提供顯著節省操作成本。
於一個面向中，一種發酵方法包含於一發酵培養基發酵合成氣。該方法可有效用以提供至少約為1克乙醇/(升．日．克細胞)的特定STY。於此面向中，發酵培養基具有少於約1.04pm硼，少於約0.16ppm錳，少於約0.26ppm鉬，或少於約0.16ppm銅。
於另一面向中，一種發酵培養基包括每克所製造的細胞至少約112毫克氮，每克所製造的細胞至少約10.5毫克磷，或每克所製造的細胞至少約26毫克鉀。於另一面向中，該發酵培養基具有少於約1.04pm硼，少於約0.16ppm錳，少於約0.26ppm鉬，或少於約0.16ppm銅。
於另一面向中，一種發酵法包括於發酵培養基發酵合成氣。該方法可有效用以提供至少約為1克乙醇/(升．日．克細胞)的特定STY。該發酵培養基具有約625：1或以上的NH4 +對比之重量比，或約2500：1或以上的NH4 +對Mn之重量比，或約2500：1或以上的NH4 +對Mo之重量比，或約4050：1或以上的NH4 +對銅之比；或該發酵培養基具有約30：1或以上的P對B之重量比，或約190：1或以上的P對Mn之重量比，或約120：1或以上的P對Mo之重量比，或約190：1或以上的Mn對Cu之重量比；或該發酵培養基具有約35：1或以上的K對B之重量比，或約245：1或以上的K對Mn之重量比，或約150：1或以上的K對Mo之重量比，或約245：1或以上的K對Cu之重量比。
後文說明並非解譯為限制性意義，反而僅用以描述實例面向之一般性原理。本發明之範圍須參考申請專利範圍決定。
提供一種方法及培養基組成物，其令人驚訝地且出乎意外地提供高濃度乙醇生產力，即便於一或多個成分之濃度去除或減少後亦復如此，該等成分與先前視為必需或要求於某個濃度水平。於本面向中，培養基具有一或多個營養素包括B、Mn、Mo及Cu減低的濃度水平。培養基中之營養素濃度如下：B：少於約1.04ppm B，於另一面向中，少於約1.0ppm B，於另一面向中，少於約0.75ppm B，於另一面向中，少於約0.5ppm B，及於另一面向中，少於約0.025ppm B；Mn：少於約0.16ppm Mn，於另一面向中，少於約0.15ppm Mn，於另一面向中，少於約0.10ppm Mn，於另一面向中，少於約0.05ppm Mn，及於另一面向中，少於約0.0025ppm Mn；Mo：少於約0.26ppm Mo，於另一面向中，少於約0.25ppm Mo，於另一面向中，少於約0.20ppm Mo，於另一面向中，少於約0.10ppm Mo，及於另一面向中，少於約0.001ppm Mo；或Cu：少於約0.16ppm Cu，於另一面向中，少於約0.15ppm Cu，於另一面向中，少於約0.10ppm Cu，於另一面向中，少於約0.05ppm Cu，及於另一面向中，少於約0.01ppm Cu。
於另一面向中，重量比可為如下：
NH4 +比B：約625：1或以上，於另一面向中，約650：1或以上，於另一面向中，約675：1或以上，於另一面向中，約
向中，約800：1或以上；或NH4 +比Mn：約4050：1或以上，於另一面向中，約4100：1或以上，於另一面向中，約4200：1或以上，於另一面向中，約4300：1或以上，於另一面向中，約4400：1或以上，及於另一面向中，約4500：1或以上；或NH4 +比Mo：約2500：1或以上，於另一面向中，約2600：1或以上，於另一面向中，約2700：1或以上，於另一面向中，約2800：1或以上，於另一面向中，約2900：1或以上，及於另一面向中，約3000：1或以上；或NH4 +比Cu：約4050：1或以上，於另一面向中，約4100：1或以上，於另一面向中，約4200：1或以上，於另一面向中，約4300：1或以上，於另一面向中，約4400：1或以上，及於另一面向中，約4500：1或以上；或P比B：約30：1或以上，於另一面向中，約35：1或以上，於另一面向中，約40：1或以上，於另一面向中，約45：1或以上，於另一面向中，約50：1或以上，及於另一面向中，約100：1或以上；或P比Mn：約190：1或以上，於另一面向中，約200：1或以上，於另一面向中，約225：1或以上，於另一面向中，約250：1或以上，於另一面向中，約275：1或以上，及於另一面向中，約300：1或以上；或P比Mo：約120：1或以上，於另一面向中，約130：1或以上，於另一面向中，約140：1或以上，於另一面向中，約150：1或以上，於另一面向中，約175：1或以上，及於另一面向中，
約200：1或以上；或P比Cu：約190：1或以上，於另一面向中，約200：1或以上，於另一面向中，約225：1或以上，於另一面向中，約250：1或以上，於另一面向中，約275：1或以上，及於另一面向中，約300：1或以上；或K比B：約35：1或以上，於另一面向中，約40：1或以上，於另一面向中，約45：1或以上，於另一面向中，約50：1或以上，於另一面向中，約75：1或以上，及於另一面向中，約100：1或以上；或K比Mn：約245：1或以上，於另一面向中，約250：1或以上，於另一面向中，約260：1或以上，於另一面向中，約270：1或以上，於另一面向中，約280：1或以上，及於另一面向中，約300：1或以上；或K比Mo：約150：1或以上，於另一面向中，約250：1或以上，於另一面向中，約260：1或以上，於另一面向中，約270：1或以上，於另一面向中，約280：1或以上，及於另一面向中，約300：1或以上；或K比Cu：約245：1或以上，於另一面向中，約250：1或以上，於另一面向中，約260：1或以上，於另一面向中，約270：1或以上，於另一面向中，約2801或以上，及於另一面向中，約300：1或以上。
除非另行定義，否則於本案全文說明書中使用於本文揭示之下列術語定義如後及包括如下定義之單數型或
複數型：
術語「約」修飾任何數量係指於實際狀況下例如於實驗室中、於試驗工廠中、或生產設施中所遭遇的數量變化。例如，於混合物中採用之各成分或測量值的數量或數量由「約」修飾時包括典型採用於測量製造廠或實驗室中之實驗條件的變化程度及審慎程度。例如，產品的成分數量當藉「約」修飾時包括於工廠或實驗室之多個實驗中各批次間的變化及分析方法所特有的變化。無論是否藉「約」修飾，該數量包括該等量之相當量。此處所述任何藉「約」修飾之數量，當未被「約」修飾時也可採用於本文揭示。
「合成氣」或「合成氣體」一詞表示給予含有不等量之一氧化碳及氫氣之氣體混合物的合成氣體名稱。製造方法之實例包括天然氣或烴類之水蒸氣重整以製造氫氣、煤炭的氣化及某些類型的廢物至能源氣化設施。該名稱係來自於其可用作為產生合成天然氣(SNG)的中間產物及用於製造氨及甲醇。合成氣為可燃性，常用作為燃料來源或用作為其它化學品製造上的中間產物。
「發酵」、「發酵法」或「發酵反應」等詞意圖涵蓋該方法之生長階段及產物生物合成階段。於一個面向中，發酵係指一氧化碳轉換成醇類。
「細胞密度」一詞係指每單位體積發酵醪的微生物細胞重量，例如克/升。於本面向中，該方法及培養基可有效提供至少約為1.0克/升之細胞密度。細胞密度可為約1
至約25克/升，於另一面向中，約1至約20克/升，於另一面向中，約1至約10克/升，於另一面向中，約2至約8克/升，於另一面向中，約3至約6克/升，及於另一面向中，約4至約5克/升。
「細胞回收」一詞係指微生物細胞從發酵醪中分離及回送部分或全部此等分離的微生物細胞返回發酵器。一般而言，使用過濾裝置來達成分離。
此處所述方法及培養基可有效用以提供高度生產力。於本面向中，該方法可有效用於提供至少約為1的特定STY(空間時間產率)表示為克乙醇/(升．日．克細胞)，於另一面向中，約1至約10，於另一面向中，約2至約8，於另一面向中，約3至約7，及於另一面向中，約4至約6。
於相關面向中，生產力可表示為STY(以克乙醇/(升．日)表示的空間時間產率)。於本面向中，該方法可有效提供至少約10克乙醇/(升．日)之STY(空間時間產率)。可能的STY值包括約10克乙醇/(升．日)至約160克乙醇/(升．日)，於另一面向中，約10克乙醇/(升．日)至約160克乙醇/(升．日)，於另一面向中，約10克乙醇/(升．日)至約120克乙醇/(升．日)，於另一面向中，約10克乙醇/(升．日)至約80克乙醇/(升．日)，於另一面向中，約20克乙醇/(升．日)，至約140克乙醇/(升．日)，於另一面向中，約20克乙醇/(升．日)至約100克乙醇/(升．日)，於另一面向中，約40克乙醇/(升．日)，至約140克乙醇/(升．日)，及於另一面向中，約40克乙醇/(升．日)至約
100克乙醇/(升．日)。
於一個面向中，該方法及培養基可有效用以提供至少約5%至約99%之一氧化碳轉換率，於另一面向中，約10%至約90%，於另一面向中，約20%至約80%，於另一面向中，約30%至約70%，及於另一面向中，約40%至約90%。
於一個面向中，該培養基包括氮源中之至少一者或多者、磷源中之至少一者或多者及鉀源中之至少一者或多者。培養基可包括三種中之任一者、三種中之任一項組合，及於一個重要面向中包括全部三者。氮源可包括選自於由氯化銨、磷酸銨、硫酸銨、硝酸銨、及其混合物所組成之該組群中之一氮源。磷源可包括選自於由磷酸、磷酸銨、磷酸鉀、及其混合物所組成之該組群中之一磷源。鉀源可包括選自於由氯化鉀、磷酸鉀、硝酸鉀、硫酸鉀、及其混合物所組成之該組群中之一鉀源。
於一個面向中，培養基包括鐵、鎢、鎳、鈷、鎂、硫及噻胺中之一或多者。培養基可包括此等成分中之任一者、任一種組合，及於一個重要面向中包括此等成分之全部組合。鐵源可包括選自於由氯化亞鐵、硫酸亞鐵、及其混合物所組成之該組群中之一鐵源。鎢源可包括選自於由鎢酸鈉、鎢酸鈣、鎢酸鉀、及其混合物所組成之該組群中之一鎢源。鎳源可包括選自於由氯化鎳、硫酸鎳、硝酸鎳、及其混合物所組成之該組群中之一鎳源。鈷源可包括選自於由氯化鈷、氟化鈷、溴化鈷、碘化鈷、及其混合物所組成之該組群中之一鈷源。鎂源可包括選自於由氯化鎂、硫
酸鎂、磷酸鎂及其混和物所組成之該組群中之一鎂源。硫源可包括半胱胺酸、硫化鈉、及其混合物。
各種成分之濃度如下：
方法操作維持pH於約.2至約4.8之範圍。培養基包括少於約0.01克/升酵母萃取物及少於約0.01克/升碳水化合物。
合成氣可從任何已知來源提供。於一個面向中，合成氣可源自於含碳材料的氣化。氣化涉及於氧氣限制供應情況下的生質部分燃燒。所得氣體主要包括一氧化碳(CO)及氫氣(H2)。於本面向中，合成氣將含有至少約10莫耳% CO，於一個面向中，至少約20莫耳%，於一個面向中，約10至約100莫耳%，於另一個面向中，約20至約100莫耳% CO，於另一個面向中，約30至約90莫耳% CO，於另一個
面向中，約40至約80莫耳% CO，及於另一個面向中，約50至約70莫耳% CO。合成氣將具有至少約0.75之CO/CO2比，於另一個面向中，至少約1.0，及於另一面向中，至少約1.5。適當氣化方法及裝置之若干實施例係提供於美國專利申請案13/427,144、13/427,193及13/427,247，各案皆係於2012年3月22日提出申請，各案皆係爰引於此並融入本說明書的揭示。
於另一面向中，用於繁殖乙酸生成菌的合成氣可為實質上CO。用於此處，「實質上CO」表示至少約50莫耳% CO，於另一面向中，至少約60莫耳% CO，於另一面向中，至少約70莫耳% CO，於另一面向中，至少約80莫耳% CO，及於另一面向中，至少約90莫耳% CO。
依據一個面向，發酵法始於培養基添加至反應器容器內。培養基經滅菌以去除非期望的微生物，反應器內接種期望的微生物。於一個面向中，使用的微生物包括乙酸生成菌。有用的乙酸生成菌包括梭菌(Clostridium)屬，諸如俊達氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)菌株包括述於WO 2000/68407、EP 117309、美國專利案5,173,429、5,593,886及6,368,819、WO 1998/00558及WO 2002/08438者；自產乙醇梭桿菌(Clostridium autoethanogenum)(德國，DSMZ之DSM 10061及DSM 19630)菌株包括WO 2007/117157及WO 2009/151342所述；及拉格拉式梭菌(Clostridium ragsdalei)(P11，ATCC BAA-622)菌株及巴奇嗜鹼
(Alkalibaculum bacchi)(CP11，ATCC BAA-1772)菌株包括分別述於美國專利案第7,704,723號及「得自生質產生的合成氣體之生物燃料及生物製品」，Hasan Atiyeh，於阿拉巴馬州EPSCoR年度州會議，2010年4月29日提出者；及羧基梭菌(Clostridium carboxidivorans)(ATCC PTA-7827)菌株述於美國專利申請案第2007/0276447號。其它適當微生物包括莫雷拉氏菌(Moorella)屬，包括莫雷拉氏菌種HUC22-1，及羧基嗜熱菌(Carboxydothermus)屬。此等參考文獻各自係爰引於此並融入本說明書的揭示。可使用二或多種微生物之混合培養。
有用的細菌之若干實例包括凱伍產醋菌(Acetogenium kivui)、潮濕厭氧醋菌(Acetoanaerobium noterae)、伍氏醋酸桿菌(Acetobacterium woodii)、巴奇嗜鹼菌(Alkalibaculum bacchi)CP11(ATCC BAA-1772)、產生性布洛堤菌(Blautia producta)、嗜甲基丁酸桿菌(Butyribacterium methylotrophicum)、地下嗜熱厭氧菌(Caldanaerobacter subterraneous)、太平洋地下嗜熱厭氧菌(Caldanaerobacter subterraneous pacificus)、產氫羧基嗜熱菌(Carboxydothermus hydrogenoformans)、醋酸梭菌(Clostridium aceticum)、丙酮丁醇梭桿菌P262(Clostridium acetobutylicum P262(德國DSMZ之DSM 19630)、自產乙醇梭桿菌(Clostridium autoethanogenum)(德國DSMZ之DSM 19630)、自產乙醇梭桿菌(德國DSMZ之DSM 10061)、自產乙醇梭桿菌(德國DSMZ之DSM 23693)、自產乙醇梭桿菌(德
國DSMZ之DSM 24138)、羧基梭菌P7(Clostridium carboxidivorans P3)(ATCC PTA-7827)、克氏梭菌(Clostridium coskatii)(ATCC PTA-10522)、德可氏梭菌(Clostridium drakei)、俊達氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)PETC(ATCC 49587)、俊達氏梭菌ERI2(ATCC55380)、俊達氏梭菌C-01(ATCC55988)、俊達氏梭菌O-52(ATCC55889)、大梭菌(Clostridium magnum)、巴斯德氏梭菌(Clostridium pasteurianum)(德國DSMZ之DSM 525)、拉格拉氏梭菌(Clostridium ragsdali)P11(ATCC BAA-622)、糞味梭菌(Clostridium scatologenes)、熱醋梭菌(Clostridium thermoaceticum)、雅爾氏梭菌(Clostridium ultunense)、庫茲氏脫硫菌(Desulfotomaculum kuznetsovii)、黏液真桿菌(Eubacterium limosum)、硫還原地桿菌(Geobacter sulfurreducens)、乙酸甲烷八疊球菌(Methanosarcina acetivorans)、巴氏甲烷八疊球菌(Methanosarcina barkeri)、熱醋莫雷拉氏菌(Morrella thermoacetica)、自嗜熱莫雷拉氏菌(Morrella thermoautotrophica)、芬尼產醋桿菌(Oxobacter pfennigii)、產生消化鏈球菌(Peptostreptococcus productus)、產生瘤胃球菌(Ruminococcus productus)、凱伍熱厭氧菌(Thermoanaerobacter kivui)、及其混合物。
當接種時，初步進給氣體供應速率建立可有效供應微生物的初始族群。分析流出物氣體決定流出物氣體之含量。氣體分析結果用來控制進給氣體速率。當達到期望的程度時，液相及細胞物質從反應器中撤出及補充培養
基。於此一面向中，生物反應器操作來維持至少約2克/升之細胞密度，及於另一面向中，約2至約50克/升，於多個其它面向中，約5至約40克/升，約5至約30克/升，約5至約20克/升，約5至約15克/升，約10至約40克/升，約10至約30克/升，約10至約20克/升，及約10至約15克/升。細胞密度可經由循環過濾器控制。生物反應器操作之進一步說明陳述於美國臨時專利申請案第61/571,564號申請日2011年6月30日；美國臨時專利申請案第61/571,565號申請日2011年6月30日；及美國臨時專利申請案第61/573,845號申請日2011年9月13日，各案皆係爰引於此並融入本說明書的揭示。
於生物反應器(紐布朗威(New Brunswick)百歐佛(BioFlo)I或IIc)進行實驗，操作為直通式CSTR，無通透物掃除。生物反應器操作條件如下：
培養型別為俊達氏梭菌C01。
培養溫度維持於38-39℃。
攪動在類比讀出值為850rpm。
未經喚醒的培養體積為約1600-1650毫升。
培養pH設定點為4.5。使用7.7% NaHCO3溶液進行pH控制。
進給氣體為15% H2、45% N2、30% CO及10% CO2之合成摻合物以282毫升/分鐘速率進給至培養。
培養基係以約0.88毫升/分鐘，或約1300毫升/日進給入
反應器。
液體及細胞保留時間為約29-31小時。
所使用之起始培養基說明如下。
生物反應器操作直到培養獲得高生產力穩態為止。高生產力穩態係定義為約2.5-3克/升細胞密度，乙醇濃度大於20克/升，CO吸收量大於3.0毫莫耳/分鐘，及氫氣吸收量大於0.5毫莫耳/分鐘。於獲得高生產力穩態之方法中，CaCl2．2H2O濃度減至零及銨濃度降至546ppm。
一旦培養係在高生產力穩態，B、Mn及Cu源從培養基之製備中去除。恰在去除該等成分前，培養條件/參數如下：
細胞密度-2.9克/升
CO轉換率-86%
H2轉換率-32%
CO吸收-3.0毫莫耳/分鐘
H2吸收-0.54毫莫耳/分鐘
乙醇-21.8克/升
總乙醯基-2.7克/升
丁醇-0.35克/升
然後針對任何不良效應監視氣體吸收，包括H2及CO、產物濃度及細胞密度之培養參數。若於若干(>3)細胞停留時間後去除B、Cu及Mn不影響該等參數，則可視為對該培養為不需要。
於約5.7細胞停留時間(170小時)後，培養醪中之硼、銅及錳濃度已經降至起始濃度之約0.41%(從1.05ppm B、0.149ppm銅及1.67ppm錳降至0.0043ppm B、0.0006ppm銅、及0.0068ppm錳)。培養醪中估計剩餘成分濃度係使用起始鈣濃度、MFR、LRT及該等成分通過培養基或波尖而添加入生物反應器之洗出計算決定。對培養效能並無不良影響。
未添加硼、銅及錳170小時後，培養參數/條件如下：
細胞密度-2.9克/升
CO轉換率-86%
H2轉換率-36%
CO吸收-3.0毫莫耳/分鐘
H2吸收-0.61毫莫耳/分鐘
乙醇-21.0克/升
總乙醯基-2.9克/升
丁醇-0.32克/升
於生物反應器(紐布朗威百歐佛I或IIc)進行實驗，操作為直通式CSTR，無細胞循環回路操作。生物反應器操作條件如下：
培養型別為俊達氏梭菌C01。
培養溫度維持於37-39℃。
攪動在類比讀出值為850rpm(以轉速計校準曲線為基準，實際攪動為931rpm)。
未經喚醒的培養體積為約1600-1650毫升。
已喚醒培養體積為約1950毫升。
培養pH設定點為4.5。使用7.7% NaHCO3溶液進行pH控制。
進給氣體為15% H2、45% N2、30% CO及10% CO2之合成摻合物以286毫升/分鐘速率進給至培養。
培養基係以約0.83至約0.86毫升/分鐘，或約1220毫升/日進給入反應器。
液體及細胞保留時間為約31-33小時。
所使用之起始培養基說明如下。
生物反應器操作直到培養獲得高生產力穩態為止。高生產力穩態係定義為約2.5-3克/升細胞密度，乙醇濃度大於20克/升，CO吸收量大於3.0毫莫耳/分鐘，及氫氣吸
收量大於0.5毫莫耳/分鐘。
然後針對任何不良效應監視氣體吸收包括H2及CO、產物濃度及細胞密度等培養參數。若成分濃度的減低於數次(大於3)細胞停留時間後不影響該等參數，則濃度可更進一步減低。若在一個成分濃度減低後，發現培養參數的降低，則可將濃度增回先前顯示為足夠的程度。若回收培養，則濃度將再度降低，偶爾降至重複該效應之前的某個程度，偶爾降至有效至造成問題間之某個濃度。
實驗開始前，鈷濃度係於正常培養基濃度或0.991ppm。培養參數穩定於約3克/升細胞密度；22-26克/升乙醇；2.7-3.7克/升乙醯基；3.1毫莫耳/分鐘CO吸收；及0.5-0.7毫莫耳/分鐘H2吸收。於t=0小時開始，從培養基去除鈷。當鈷從發酵器洗出時，CO只從3.1略微降至2.9mmol/min。全部其它參數皆維持或多或少恆定直到t=121小時。於該時間後H2及CO吸收分別降至0.16及2.6mmol/min。於該時間總乙醯基快速降至0.77克/升指示鈷濃度已經降至或低於極限濃度。鈷洗出計算顯示至鈷濃度低而影響培養參數時，反應器內之鈷濃度已經降至0.0222ppm，或原先濃度的2.24%。只添加鈷至反應器，提升濃度至正常濃度的23.3%或0.231ppm。即刻觀察到效果，CO吸收、H2吸收及酸濃度升高。此時不再添加鈷至培養基而讓反應器內之鈷再度被洗滌降回極限濃度。如前述可知，培養參數持續顯示並無窘迫現象直到鈷被洗滌至低於0.0220ppm。於t=210小時時，H2吸收及CO吸收以及酸濃度全部皆
再度下降，顯示鈷限制的影響。此時將鈷加回反應器及培養基，培養基為20%(0.198ppm)及反應器為21.2%(0.21ppm)。如前文說明，效果為氣體吸收及酸濃度二者即刻升高。
於兩個不同時間，鈷從反應器洗出直到培養顯示窘迫徵象，結果約0.022ppm之鈷濃度為該培養的極限。然後將鈷濃度設定於0.023ppm，良好進行培養而無不良影響。幾乎鈷濃度，用來更明確找出營養素添加相對於培養效能之相關性的參數計算值如下：每毫莫耳氣體吸收所添加之鈷之毫克量為0.005(mg/mmol)。每克細胞製造量添加的鈷之微克量為約9(μg/g)。
從鈷極限的回復快速且無持續性不良影響。若在參數降至二次問題點，亦即氣體毒性或無酸存在之前增加鈷，則對培養不會造成永久性傷害。
降低鈷濃度確實造成細胞濃度的降低。鈷極限與丁醇產量之間並無明顯交互關係。CO及H2轉化率/吸收二者受到鈷極限影響，但直到培養中的鈷濃度降至約0.022ppm或以下之前極少影響或未見影響。氣體轉換率不會逐漸下降。但一旦鈷濃度降至超過極限點時，CO及H2轉換率極微快速降低。一旦CO及H2轉換率開始下降，培養已經超過臨界鈷濃度，及須快速添加鈷來回復培養。鈷極限的早期指標為產物比從酸移至乙醇。酸濃度開始降低，乙醇濃度開始升高，即便於觀察得氣體轉換率降低之前亦復如此。
於生物反應器(紐布朗威百歐佛I或IIc)進行實
驗，操作為直通式CSTR，無滲透物掃除。生物反應器操作條件如下：
培養型別為俊達氏梭菌C01。
培養溫度維持於37-39℃。
攪動在類比讀出值為700rpm。
未經喚醒的培養體積為約1500-1650毫升。
已喚醒培養體積為約1900毫升。
培養pH設定點為4.5。使用7.7% NaHCO3溶液進行pH控制。
進給氣體為15% H2、45% N2、30% CO及10% CO2之合成摻合物以290毫升/分鐘速率進給至培養。
培養基係以約0.86至約0.88毫升/分鐘，或約1250毫升/日進給入反應器。
液體及細胞保留時間為約27-31小時。
所使用之起始培養基說明如下。
生物反應器操作直到培養獲得高生產力穩態為止。高生產力穩態係定義為約2.5-3克/升細胞密度，乙醇濃度大於20克/升，CO吸收量大於3.0毫莫耳/分鐘，及氫氣吸收量大於0.5毫莫耳/分鐘。
然後針對任何不良效應監視氣體吸收包括H2及CO、產物濃度及細胞密度等培養參數。若成分濃度的減低於數次(大於3)細胞停留時間後不影響該等參數，則濃度可更進一步減低。若在一個成分濃度減低後，發現培養參數的降低，則可將濃度增回先前顯示為足夠的程度。若回收培養，則濃度將再度降低，偶爾降至重複該效應之前的某個程度，偶爾降至有效至造成問題間之某個濃度。
於本實驗開始時，反應器內之Ni濃度降至原先Ni濃度之56%，或0.11ppm。反應器內之鎳濃度係以培養基
中使用的鎳濃度「洗出」為基準計算，鎳添加至培養基及/或反應器，液體流經系統來計算隨著時間的經過反應器內之Ni濃度。隨著Ni持續從反應器洗出，培養參數不變。細胞密度維持於2.8克/升；CO吸收為約3.2mmol/min；H2吸收為約0.7mmol/min；乙醇濃度為24克/升；及總乙醯基濃度為約2.5克/升。但至約t=107小時時，細胞形態開始惡化。長形細胞的百分比從約5%升高至5-10%，長形細胞的長度增加。長形細胞現在顯示略微翹曲。平均細胞的總長度也增加，但只有輕度翹曲或無翹曲。約略於細胞型態下降時反應器內之鎳濃度降至0.0996ppm。
至t=約160小時時，反應器內鎳濃度洗出至50%，0.0988ppm。如前述，培養參數並無太多改變。但當於t=250小時觀察時，細胞型態惡化。長形細胞之百分比增加至10-20%，連同該等細胞之彎曲或翹曲程度增加。其餘培養之長度為平均長度或略長，偶爾有輕度彎曲。並無嚴重彎曲而類似螺旋管彈簧的細胞，但有若干顆粒狀細胞及中空本體細胞。再度培養參數或鎳濃度未見變化。
反應器內之鎳濃度直到t=1885小時維持於50%，或0.0988ppm。以約0.87ml/min之培養基流速，鎳進給速率為0.12毫克/日。培養參數相當恆定於約2.8g/L細胞密度，約3.2mmol/min CO吸收，約0.7mmol/min H2吸收，約25g/L乙醇，約2.5g/L總乙醯基，及約0.3g/L丁醇。於50%鎳進給速率，鎳係以約34微克/克製造細胞，約0.022微克/毫莫耳氣體吸收添加。一旦鎳濃度為0.0988ppm時，細胞
型態不會繼續惡化。維持約10%長形細胞有輕微翹曲，約5%極長細胞有中等翹曲，及其餘細胞的長度為平均長度或略長偶爾翹曲。
於t=445小時，培養基之鎳濃度降至原先濃度之25%或0.049ppm。幾乎即刻觀察得培養參數緩慢但穩定的改變。CO吸收維持恆定於約3.2mmol/min，但在鎳減低之約120小時以內，H2吸收從0.7-0.8mmol/min開始降至0.6-0.7mmol/min。在鎳改變之約160小時以內乙醇濃度開始從約24g/L降至約21g/L，及總乙醯基濃度也開始從約2.5g/L降至約2.0g/L。一旦培養基內之鎳濃度降低，丁醇濃度開始緩慢但穩定地升高。鎳降低後約635小時，濃度從約0.21g/L升高至約0.34g/L。細胞型態相對不變。降低的鎳進給速率現在變成0.062毫克/日。於該進給速率，鎳係以約18微克/克製造的細胞，約0.011微克/毫莫耳氣體吸收添加。
為了加快低鎳濃度對培養的影響，於t=638小時，培養基的鎳濃度降至原先濃度的10%或0.0198ppm。如前述觀察得培養參數有相同趨勢但速率較快。H2吸收及酸濃度持續降低。細胞密度及CO吸收不變，但丁醇濃度持續升高。細胞密度仍然不變，維持於約2.8g/L。氫吸收為約0.5-0.6mmol/min。一氧化碳吸收仍然為3.2mmol/min。產物濃度為約21g/L乙醇，約1.5g/L總乙醯基及約0.65g/L丁醇。歷經額外86小時，鎳濃度維持於10%以決定對參數及細胞型態的較長期影響。培養參數不再進一步降低。培養型態確實略微惡化，顯示長形細胞數目的增加，以及細胞
總長度的增加。約10-15%細胞被歸類為長形具有翹曲。其餘細胞為短至略長，大部分細胞具有平均長度且無翹曲。培養基內含10%或0.01975ppm鎳，鎳進給速率為0.025毫克/日。如此提供約7微克添加鎳/克製造的細胞，或約0.0048微克添加的鎳/毫莫耳氣體攝取。於t=2270小時，鎳濃度回升至50%或0.0988ppm。氫吸收增加至約0.7mmol/min。CO吸收維持於約3.2mmol/min。乙醇升高至約24g/L。酸增加至約2.5g/L。丁醇降至約0.24g/L，及細胞密度維持不變於約2.9g/L。細胞型態也改良，顯示細胞長度整體縮短及長形細胞數目總體減低。約5-10%細胞被歸類為長形略有翹曲。其餘細胞的長度為短至略長，大部分具有平均長度且只偶爾略有翹曲。
反應器內之鎳濃度降至0.0988ppm，或50%不會造成培養參數可見的改變。但細胞型態確實惡化，顯示培養總長度增加，高達20%細胞被視為長形且有輕度至中度翹曲。於50%鎳濃度，細胞型態不會持續惡化，顯示於該種條件下培養確實維持於穩定。
當培養基之鎳濃度降至正常濃度之25%或0.049ppm時，乙醇及總乙醯基濃度及H2攝取全部開始降低。同時，乙醇濃度開始緩慢增高。全部指示培養受到鎳限制，但細胞型態維持相對不變。
基於反應器內計算的鎳濃度作為培養參數及細胞型態開始走下坡，當鎳洗出低牴50%或0.099ppm時，型態開始惡化。隨著鎳濃度的進一步降至36%或0.072ppm，
丁醇濃度惡化。於29%鎳或0.057ppm，H2吸收開始下降。然後最後於25%鎳或0.050ppm，乙醇濃度及酸濃度開始降低。於50%鎳，只有培養型態受影響。一旦鎳濃度進一步降低，培養的吸收及生產力下降。如此表示培養基中50%鎳濃度或0.12毫克/日進給速率極為接近鎳的極限。基於培養參數及0.12毫克/日鎳進給速率，鎳係以約34微克/克製造的細胞，約0.022微克/毫莫耳氣體吸收添加。
鎳極限的徵象為H2吸收減低，酸濃度減低，及丁醇升高接著為乙醇濃度減低。未見細胞密度改變。最終細胞型態受影響，顯示長形細胞的總數增加及該等長形細胞的總長度增加。一般而言，隨著細胞長度的增加，細胞變成更彎曲或更翹曲。
於生物反應器(紐布朗威百歐佛I或IIc)進行實驗，操作為直通式CSTR，無滲透物掃除。生物反應器操作條件如下：
培養型別為俊達氏梭菌C01。
培養溫度維持於38-39℃。
攪動在類比讀出值為700rpm。
未經喚醒的培養體積為約1550-1700毫升。
已喚醒培養體積為約1900毫升。
培養pH設定點為4.5。使用7.7% NaHCO3溶液進行pH控制。
進給氣體為15% H2、45% N2、30% CO及10% CO2之合
成摻合物以290毫升/分鐘速率進給至培養。
培養基係以約0.86至約0.88毫升/分鐘，或約1250毫升/日進給入反應器。
液體及細胞保留時間為約28-31小時。
所使用之起始培養基說明如下。
生物反應器操作直到培養獲得高生產力穩態為止。高生產力穩態係定義為約2.5-3克/升細胞密度，乙醇濃度大於20克/升，CO吸收量大於3.0毫莫耳/分鐘，及氫氣吸收量大於0.5毫莫耳/分鐘。
然後針對任何不良效應監視氣體吸收包括H2及CO、產物濃度及細胞密度等培養參數。若成分濃度的減低於數次(大於3)細胞停留時間後不影響該等參數，則濃度可更進一步減低。若在一個成分濃度減低後，發現培養參數的降低，則可將濃度增回先前顯示為足夠的程度。若回收培養，則濃度將再度降低，偶爾降至重複該效應之前的某個程度，偶爾降至有效至造成問題間之某個濃度。
於磷測試期間，於t=0小時從培養基去除鎢。於磷測試期間，儘管將磷添加回反應器，培養也不會如預期般的回復，培養基沈澱。當進行一系列試圖改良培養皆失敗時，藉添加8毫升0.2g/l Na2WO4．2H2O溶液至1.6升培養而於t=812小時時，將鎢以50%濃度或正常濃度，或0.56ppm添加回反應器作為最後手段。鎢洗出計算顯示反應器內的鎢濃度已經被洗出至小於0.0001ppm。當添加鎢時，培養幾乎即刻反應。H2吸收開始增加。伴隨H2轉換率的改良，進給氣體流速於t=885小時時回升至約290ml/min的原先設定值。CO吸收及H2吸收分別係回升至3.2及約0.75mmol/min。伴隨氣體吸收的增高，細胞密度增加至約2.7g/L，乙醇濃度升高至約22g/L。總乙醯基濃度及丁醇濃度分別維持於約略相同，於約3.5及約0.45g/L。培養的另一項
改變為細胞型態改良。藉由添加鎢，總細胞長度顯著下降，細胞較少彎曲及翹曲。
並未回添加鎢至培養基以便將反應器內之濃度回洗意圖嘗試及決定培養所要求的鎢濃度。當鎢被洗出時，於約t=904小時，當鎢被洗出時，H2吸收開始有降低趨勢。未添加鎢至反應器或培養基。約t=981小時，丁醇濃度開始緩慢升高。然後約略t=1030小時，乙醇濃度開始降低。仍然不添加鎢。至t=1100小時，H2吸收為約0.2mmol/min；乙醇為約17g/L及丁醇為約0.74g/L。CO吸收不受影響，細胞密度約略相等。
至t=約1100小時，鎢以50%正常濃度或0.56ppm添加至反應器。如前文可知，培養幾乎即刻開始改良。H2吸收開始增加；乙醇濃度升高；酸濃度降低；細胞密度略微增加；及乙醇濃度開始減低。至報告週期結束時，細胞密度為約3.3克/升；CO及H2吸收分別為約3.2及約0.75mmol/min；乙醇為22克/升；酸為約2.5克/升；及丁醇為0.52克/升。至報告週期結束時，反應器內之鎢濃度已經被洗出至低抵0.045ppm，或原先濃度之4.0%。
鎢極限為原先添加濃度的2.7%或0.030ppm。隨著H2吸收的減低，當鎢已經被洗出反應器低抵0.030ppm時，培養首次出現窘迫現象。於該濃度時，鎢係以10微克/克製造的細胞，0.0068微克/毫莫耳氣體吸收添加。
含有培養基，該培養基不含任何B、Cu、Mn或
Mo(標示為培養基A)或已知培養基(標示為402培養基)含B、Cu、Mn及Mo的紐布朗威百歐佛夕里(Cellii)Gen 115反應器接種0.39克/升活潑生長的俊達氏梭菌CO-1菌株。
於接種後，反應器的攪動速率設定為800rpm。以約1小時間隔取自反應器的氣體樣本及液體樣本分析各種氣體成分的消耗量或生產量、培養醪乙酸濃度、培養醪乙醇濃度、及培養之光密度。也每日測量合成氣中各種氣體的組成，至反應器之合成流係藉質量流量控制器調節流至反應器的合成氣而即時測量。實際氣體流量係藉校準質量流量控制器獲得的方程式，使用該方程式計算。進行計算來決定維持從流入反應器之進氣流中H2之H2吸收恆定百分比而進行計算決定氣體流入反應器之需要流量，或換言之，於本特定實驗中，氣體流入反應器內之流速係維持使得培養的H2吸收係占流入反應器的總氣體分子的4.5%。然後反應器係以如上計算的氣體流速供應氣體(維持從入口吸收H2之百分比占總氣體分子的4.5%)。
針對全部三個實驗，細胞循環系統附接至反應器，隨後接種，培養基循環通過系統歷經整個實驗週期。針對培養基A的第一實驗，於接種後2.75小時(CO轉換率已經達80%或以上之後)，以1.0ml/min啟動培養基流至反應器，滲透物係以1.0ml/min由反應器內排出。接種後6.83小時，流至反應器的培養基增至2.0ml/min，滲透物以2.0ml/min從反應器內流出。
針對使用402培養基的第二實驗，於接種後1.9小
時(CO氣體轉換率已經達80%或以上之後)，以2.0ml/min開始培養基流至反應器，及滲透物以2.0ml/min從反應器內排出。
針對使用培養基A之第三實驗，於接種後2.0小時(CO氣體轉換率已經達80%或以上)，於2.0ml/min開始培養基流至反應器，以2.0ml/min從反應器內排出滲透物。針對全部三次實驗，施加細胞循環系統以去除反應器內乙醇的快速積聚。
培養基A及402培養基針對使用俊達氏梭菌的氫氣吸收提供相等效能。
於生物反應器(紐布朗威百歐佛I或IIc)進行實驗，操作為直通式CSTR，無滲透物掃除。生物反應器操作條件如下：
培養型別為俊達氏梭菌C01。
培養溫度維持於38-39℃。
攪動在類比讀出值為850rpm。
未經喚醒的培養體積為約1600-1650毫升。
已喚醒培養體積為約1900毫升。
培養pH設定點為4.5。使用7.7% NaHCO3溶液進行pH控制。
進給氣體為15% H2、45% N2、30% CO及10% CO2之合成摻合物以282毫升/分鐘速率進給至培養。
培養基係以約0.88毫升/分鐘，或約1300毫升/日進給入反應器。
液體及細胞保留時間為約29-31小時。
所使用之起始培養基說明如下。
生物反應器操作直到培養獲得高生產力穩態為止。高生產力穩態係定義為約2.5-3克/升細胞密度，乙醇濃度大於20克/升，CO吸收量大於3.0毫莫耳/分鐘，及氫氣吸收量大於0.5毫莫耳/分鐘。
然後針對任何不良效應監視氣體吸收包括H2及
CO、產物濃度及細胞密度等培養參數。若成分濃度的減低於數次(大於3)細胞停留時間後不影響該等參數，則濃度可更進一步減低。若在一個成分濃度減低後，發現培養參數的降低，則可將濃度增回先前顯示為足夠的程度。若回收培養，則濃度將再度降低，偶爾降至重複該效應之前的某個程度，偶爾降至有效至造成問題間之某個濃度。
鉬需求測試係始於t=0小時藉從培養基之製備中去除Na2MoO4．2H2O。恰在去除該等成分之前，培養條件/參數如下：
細胞密度-3.2克/升
CO轉換率-86%
H2轉換率-36%
CO吸收-3.0毫莫耳/分鐘
H2吸收-0.56毫莫耳/分鐘
乙醇-21.8克/升
總乙醯基-2.3克/升
丁醇-0.32克/升
於約9.7倍細胞停留時間(292小時)後，培養醪中之鉬濃度已經降至0.238ppm Mo之起始鉬濃度之低於0.0001%。培養醪中剩餘成分濃度之估值係藉使用起始鈣濃度、通過培養基或生物反應器內波尖的Mo之MFR、LRT及任何添加藉洗出計算決定。對培養效能並無不良影響。經292小時未添加鉬之後，培養參數/條件如下：
細胞密度-2.9克/升
CO轉換率-86%
H2轉換率-36%
CO吸收-3.0毫莫耳/分鐘
H2吸收-0.61毫莫耳/分鐘
乙醇-21.0克/升
總乙醯基-2.9克/升
丁醇-0.32克/升
於生物反應器(紐布朗威百歐佛I或IIc)進行實驗，操作為直通式CSTR，不具有細胞循環回路。生物反應器操作條件如下：
培養型別為俊達氏梭菌C01。
培養溫度維持於37-39℃。
攪動在類比讀出值為880-890rpm。
未經喚醒的培養體積為約1275毫升。
已喚醒培養體積為約1900毫升。
培養pH設定點為4.2。使用7.7% NaHCO3溶液進行pH控制。
進給氣體為15% H2、45% N2、30% CO及10% CO2之合成摻合物以232毫升/分鐘速率進給至培養。
培養基係以約0.70毫升/分鐘，或約1008毫升/日進給入反應器。
液體及細胞保留時間為約29-31小時。
所使用之起始培養基說明如下。
生物反應器操作直到培養獲得高生產力穩態為止。高生產力穩態係定義為約2.5-3克/升細胞密度，乙醇濃度大於20克/升，CO吸收量大於3.0毫莫耳/分鐘，及氫氣吸收量大於0.5毫莫耳/分鐘。
然後針對任何不良效應監視氣體吸收包括H2及CO、產物濃度及細胞密度等培養參數。若成分濃度的減低於數次(大於3)細胞停留時間後不影響該等參數，則濃度可更進一步減低。若在一個成分濃度減低後，發現培養參數的降低，則可將濃度增回先前顯示為足夠的程度。若回收培養，則濃度將再度降低，偶爾降至重複該效應之前的某個程度，偶爾降至有效至造成問題間之某個濃度。
於實驗開始時，鎂濃度係於正常乙醇培養基濃度或59.77ppm。培養參數穩定於約3.1g/L細胞密度；20.5g/L乙醇；3.0g/L乙醯基；2.4mmol/min CO吸收；及0.42mmml/min H2吸收。始於t=0小時，培養基內之鎂濃度降至14.97ppm。當鎂從發酵器洗出時，監視全部參數對培養效能的潛在影響。於約300小時或約10倍細胞停留時間後，未觀察得對培養效能有任何不利影響。在鎂降低後幾乎即刻出現乙醯基濃度的下降，但此點係由於培養基的進料問題。一旦問題經過校正，乙醯基濃度回升至類似於鎂濃度於59.77ppm時觀察得的濃度。獲得結論含14.97ppm鎂之培養基進料能夠於約30小時細胞停留時間維持培養於約3克/升細胞密度。
Mg於59.77ppm
細胞密度-3.1克/升
CO轉換率-84%
H2轉換率-32%
CO吸收-2.4毫莫耳/分鐘
H2吸收-0.42毫莫耳/分鐘
乙醇-20.5克/升
總乙醯基-2.4克/升
Mg於14.94ppm
細胞密度-3.0克/升
CO轉換率-84%
H2轉換率-34%
CO吸收-2.4毫莫耳/分鐘
H2吸收-0.45毫莫耳/分鐘
乙醇-21.0克/升
總乙醯基-2.7克/升
始於t=403小時，培養基內之鎂濃度進一步降至7.47ppm。當鎂從發酵器中洗出時，監視全部參數對培養效能的潛在影響。只有20小時後，氫轉換率及氫吸收開始減低。培養中計算的鎂濃度為約11ppm。隨著CO轉換率/吸收的下降，乙醯基濃度的升高，乙醇濃度的減低及細胞密度的穩定降低，培養效能持續下降，儘管於培養及培養基二者持續添加鎂亦復如此。最終喪失掉培養。獲得結論含7.47ppm Mg的培養基進料不足以維持於30小時細胞停留時間的3g/l培養。
於生物反應器(紐布朗威百歐佛I或IIc)進行實驗，操作為直通式CSTR，不具有細胞循環回路。生物反應器操作條件如下：
培養型別為俊達氏梭菌C01。
培養溫度維持於38-39℃。
攪動在類比讀出值為950-1000rpm。
已喚醒培養體積為約1550毫升。
培養pH設定點為4.2。使用7.5% NaHCO3溶液進行pH控制。
進給氣體為15% H2、45% N2、30% CO及10% CO2之合成摻合物以279毫升/分鐘速率進給至培養。
培養基係以約0.80-0.85毫升/分鐘，或約1220毫升/日進給入反應器。
液體及細胞保留時間為約28-30小時。
所使用之起始培養基說明如下。
生物反應器操作直到培養獲得高生產力穩態為止。高生產力穩態係定義為約2.5-3克/升細胞密度，乙醇濃度大於20克/升，CO吸收量大於3.0毫莫耳/分鐘，及氫氣吸收量大於0.5毫莫耳/分鐘。
然後針對任何不良效應監視氣體吸收包括H2及CO、產物濃度及細胞密度等培養參數。若成分濃度的減低於數次(大於3)細胞停留時間後不影響該等參數，則濃度可更進一步減低。若在一個成分濃度減低後，發現培養參數的降低，則可將濃度增回先前顯示為足夠的程度。若回收培養，則濃度將再度降低，偶爾降至重複該效應之前的某個程度，偶爾降至有效至造成問題間之某個濃度。
於實驗開始時，鉀濃度係於正常乙醇培養基濃度或78.7ppm。培養參數穩定於約3g/L細胞密度；約22g/L乙醇；約2.6g/L乙醯基；0.5g/L丁醇；3.1mmol/min CO吸收；及0.5-0.6mmol/min H2吸收。培養基內之鉀降至39.3ppm，始於t=0小時。鉀從發酵器內洗出後，監視培養參數的變化。約30小時後，H2吸收開始降低，接著為CO吸收降
低。氫吸收降至0.078mmol/min及CO吸收降至低值2.8mmol/min。鉀減低後約40小時，乙酸濃度也降至0.78g/L的低值，接著為乙醇濃度降至19.2g/L。丁醇濃度升高至0.67g/L。細胞密度也受影響，如所知，細胞密度降至2.3g/L，但可能係由於恰在鉀降低之後非蓄意地將細胞停留時間縮短至27小時的結果。添加鉀至反應器來升高濃度至78.7ppm。即刻出現效果，CO吸收、H2吸收、乙醇及酸濃度升高。隨著鉀的增加，丁醇濃度緩慢降回約0.53g/L。
一旦培養似乎回復至鉀受限制之前觀察的程度，培養基內之鉀濃度於t=139小時降至59.0ppm。再度，監視培養參數的任何變化。如前述，鉀濃度減低後約8小時，H2吸收開始降低。但此時CO吸收不受影響。丁醇小量增高至約0.57g/L。乙酸濃度下降，但如此有在鉀濃度降低前所見的持續減低趨勢。乙醇濃度維持於約22g/L。細胞密度顯示隨著鉀濃度從3.0g/L降至2.8g/L細胞密度小量減低。資料的散度允許只報告約略細胞密度濃度。鉀添加至反應器來將濃度升高至78.7ppm。即刻觀察的效果，H2吸收、乙醇濃度、酸濃度及細胞密度增高，證實培養的鉀受限制。
將鉀降低至59.0ppm之總體效應係小於降低至39.3ppm，但該濃度仍然被視為極限。因此培養基中78.7ppm的鉀濃度被視為接近極限。為了決定該濃度是否確實為極限，於t=243小時培養基內之鉀濃度升高至98.3ppm。隨著鉀濃度的升高，H2吸收從約0.61mmol/min升高至約0.71
mmol/min。細胞密度也從約3.0增加至約3.3g/l。乙酸濃度為約3.3g/L，比較當鉀濃度於78.7ppm時為2.6g/L。丁醇濃度或多或少恆定，但資料分散。乙醇濃度似乎顯示小量增加至24g/l，但資料分散使得難以決定。由於從鉀增加至98.3ppm有若干正面效果，於t=375小時時，鉀濃度進一步升高至118ppm。對培養參數唯一的確切影響係細胞濃度進一步增加至約3.9g/L。全部其它參數皆維持恆定但資料分散。
於生物反應器(紐布朗威百歐佛I或IIc)進行實驗，操作為直通式CSTR，不具有細胞循環回路。生物反應器操作條件如下：
培養型別為俊達氏梭菌C01。
培養溫度維持於38-39℃。
攪動在類比讀出值為900rpm。
已喚醒培養體積為約1650毫升。
培養pH設定點為4.5。使用7.5% NaHCO3溶液進行pH控制。
進給氣體為15% H2、45% N2、30% CO及10% CO2之合成摻合物以279毫升/分鐘速率進給至培養。
培養基係以約0.83-0.86毫升/分鐘，或約1220毫升/日進給入反應器。
液體及細胞保留時間為約28-30小時。
所使用之起始培養基說明如下。
實驗開始時，半胱胺酸係於正常乙醇培養基濃度或250ppm。培養參數穩定於約3g/L細胞密度；23g8L乙醇；2.4g/L乙醯基；3.1mmol/min CO吸收；及0.56mmol/min H2吸收。培養基中之半胱胺酸降至187.5ppm，始於t=0小時。當半胱胺酸從反應器內洗出時，監視全部參數有關極限徵象。半胱胺酸濃度維持於該濃度歷經167小時或5 XRT。全部參數皆保持恆定。187.5ppm濃度半胱胺酸足夠
維持3g/L培養具有33小時細胞停留時間。
於t=167小時，培養基內之半胱胺酸濃度從187.5ppm進一步降至125ppm。幾乎即刻H2吸收及轉換率開始下降伴隨乙酸濃度減低。CO吸收及轉換率及細胞密度為恆定。H2吸收降至0.36mmol/min，H2轉換率降至21%及乙酸降至1.7g/L。於培養基及生物反應器二者中的半胱胺酸濃度降至187.5ppm，然後降至250ppm。培養快速回復。125ppm半胱胺酸濃度不足以維持3g/L培養於33小時細胞停留時間。
培養已經完全回復後，再度測試半胱胺酸極限。於t=407小時，培養基內之半胱胺酸降至162.5ppm。如前文可知，H2轉換率及吸收幾乎即刻開始下降。乙酸濃度再度降低但不如半胱胺酸濃度為125ppm時般地快速或大幅度。H2吸收降至0.49mmol/min，H2轉換率降至29%及乙酸從3.0g/L降至2.7g/L。162.5ppm半胱胺酸濃度不足以維持3g/L培養於33小時細胞停留時間。
於生物反應器(紐布朗威百歐佛I或IIc)進行實驗，操作為直通式CSTR，生物反應器操作條件如下：
培養型別為俊達氏梭菌C01。
培養溫度維持於38-39℃。
攪動在類比讀出值為950rpm。
已喚醒培養體積為約1950毫升。
培養pH設定點為4.5。使用7.5% NaHCO3溶液進行pH控制。
進給氣體為15% H2、45% N2、30% CO及10% CO2之合成摻合物以279毫升/分鐘速率進給至培養。
培養基係以約0.84-0.86毫升/分鐘，或約1220毫升/日進給入反應器。
液體及細胞保留時間為約30-32小時。
所使用之起始培養基說明如下。
通常添加至培養基的維生素溶液為0.0505g/L泛酸鹽，0.040g/L生物素及0.10g/L噻胺溶液。用於本研究，維生素溶液分成三個溶液，各個成分各有一個溶液。該等溶液之濃度維持與原先維生素混合液中的相等濃度。藉此方式可視需要調整各個成分的濃度而無需改變其它維生素的濃度。
本實驗開始時，培養基內之泛酸濃度為0.03535ppm或每升培養基0.7毫升0.0505g/L泛酸溶液。培養基之生物素濃度為正常維生素濃度的25%或於培養基內為0.0070ppm。如此相當於每升培養基添加0.175毫升0.04g/L生物素溶液。培養基中之噻胺濃度為正常維生素濃度的25%或0.0175ppm。如此相當於每升培養基添加0.175毫升0.10g/L噻胺溶液。於t=0小時，培養基中之噻胺濃度降至正常濃度之15%或0.0105ppm。對細胞密度未見即刻影響。但H2吸收、總乙醯基濃度、及乙醇濃度皆幾乎即刻下降，指示0.0175ppm的先前噻胺濃度已經接近極限。同時，CO吸收從3.1略增至3.2mmol/min。可為該期間質量轉移增加的指示，即便攪動速率維持恆定亦復如此。為了證實培養生產力減低的起因，於t=43小時首先添加0.5毫升泛酸溶液至反應器。當如此對培養不產生影響時，0.115ml噻胺溶液於t=84小時回加至反應器來將反應器內之噻胺濃度升高至約0.0175ppm。如此對培養即刻產生影響。氫吸收、酸濃度、及乙醇濃度皆開始升高。培養需要額外的噻胺。
對反應器未做進一步改變以便將添加的泛酸及
噻胺從反應器內洗出返回來自培養基添加的0.0354ppm泛酸及0.0105ppm噻胺。當維生素被洗出後228小時，H2吸收首次增加至約0.53mmol/min，然後降至低值約0.31mmol/min，如同額外泛酸鹽及噻胺被洗出反應器般。但對維生素濃度或任何其它培養未做任何改變，於約t=273小時，H2吸收開始穩定增加至達到約0.5mmol/min。酸及乙醇濃度並不遵照固定模式，反而改變成約25g/L乙醇及1.1-2.4g/L酸。CO吸收維持恆定於3.2mmol/min，細胞密度維持相當恆定於2.8-3.0g/L。
實驗開始時，當培養基中之噻胺濃度從0.0175ppm降至0.0105ppm時，幾乎即刻對培養參數產生影響，只是0.0175ppm噻胺濃度已經接近極限。計算得的參數用來將營養素的添加相較於降至0.0105ppm噻胺前的培養效能產生良好相關性如下：每毫莫耳氣體吸收之噻胺添加微克量為約0.0041μg/mmol。每克細胞製造量之添加噻胺微克量為約6.5μg/g。進一步證實噻胺確實的極限係在0.0105ppm，當反應器內之噻胺濃度暫時升高至0.0175ppm時培養參數即刻改良。
雖然此處揭示之發明已經利用特定面向、實施例及其應用作說明，但熟諳技藝人士可未悖離如申請專利範圍陳述之本發明之範圍而於其中做出多項修改及變化。
Claims (12)
- 一種包含在一發酵培養基發酵合成氣的發酵方法，該方法係有效用以提供至少1克乙醇/(升．日．克細胞)的一特定空間時間產率(STY)，其中該發酵包括將該合成氣與一或多個乙酸生成性細菌接觸；其中該發酵培養基包括：每克細胞至少112至125毫克氮，每克細胞至少10.5至15毫克磷，及每克細胞至少26至36毫克鉀；其中該發酵培養基係具有少於0.025ppm硼，少於0.0025ppm錳，少於0.001ppm鉬，以及少於0.01ppm銅。
- 如請求項1之發酵方法，其中該氮係由一氮源提供，該氮源係選自由下列所組成之群組：氯化銨、磷酸銨、硫酸銨、硝酸銨及其等之混合物；該磷係由一磷源所提供，該磷源係選自由下列所組成之組群：磷酸、磷酸銨、磷酸鉀及其等之混合物；及該鉀係由一鉀源所提供，該鉀源係選自由下列所組成之組群：氯化鉀、磷酸鉀、硝酸鉀、硫酸鉀及其等之混合物。
- 如請求項1之發酵方法，其中該發酵培養基係包括下列中之一或多者：每克細胞2.7至5毫克鐵，每克細胞10至30微克鎢，每克細胞34至40微克鎳，每克細胞9至30微克鈷，每克細胞4.5至10毫克鎂，每克細胞11至20毫克硫，及每克細胞6.5至20微克噻胺。
- 如請求項3之發酵方法，其中該鐵係由一鐵源所提供，該鐵源係選自由下列所組成之組群：氯化亞鐵、硫酸亞鐵及其等之混合物；該鎢係由一鎢源所提供，該鎢源係選自由下列所組成之組群：鎢酸鈉、鎢酸鈣、鎢酸鉀及其等之混合物；該鎳係由一鎳源所提供，該鎳源係選自由下列所組成之組群：氯化鎳、硫酸鎳、硝酸鎳及其等之混合物；該鈷係由一鈷源所提供，該鈷源係選自由下列所組成之組群：氯化鈷、氟化鈷、溴化鈷、碘化鈷及其等之混合物；該鎂係由一鎂源所提供，該鎂源係選自由下列所組成之組群：氯化鎂、硫酸鎂、磷酸鎂；及該硫係由一硫源所提供，該硫源係選自由下列所組成之組群：半胱胺酸、硫化鈉及其等之混合物。
- 如請求項1之發酵方法，其中該發酵培養基之pH係維持於4.2至4.8之一範圍。
- 如請求項1之發酵方法，其中該合成氣係具有至少0.75之CO/CO2比。
- 如請求項1之發酵方法，其中該乙酸生成性細菌係選自於由下列所組成之組群：凱伍產醋菌(Acetogenium kivui)、潮濕厭氧醋菌(Acetoanaerobium noterae)、伍氏醋酸桿菌(Acetobacterium woodii)、巴奇嗜鹼菌CP11(Alkalibaculum bacchi CP11)(ATCC BAA-1772)、產生性布洛堤菌(Blautia producta)、嗜甲基丁酸桿菌(Butyribacterium methylotrophicum)、地下嗜熱厭氧菌(Caldanaerobacter subterraneous)、太平洋地下嗜熱厭氧菌(Caldanaerobacter subterraneous pacificus)、產氫羧基嗜熱菌(Carboxydothermus hydrogenoformans)、醋酸梭菌(Clostridium aceticum)、丙酮丁醇梭桿菌(Clostridium acetobutylicum)、丙酮丁醇梭桿菌P262(Clostridium acetobutylicum P262)(德國DSMZ之DSM 19630)、自產乙醇梭桿菌(Clostridium autoethanogenum)(德國DSMZ之DSM 19630)、自產乙醇梭桿菌(德國DSMZ之DSM 10061)、自產乙醇梭桿菌(德國DSMZ之DSM 23693)、自產乙醇梭桿菌(德國DSMZ之DSM 24138)、羧基梭菌P7(Clostridium carboxidivorans P7)(ATCC PTA-7827)、克氏梭菌(Clostridium coskatii)(ATCC PTA-10522)、德可氏梭菌(Clostridium drakei)、俊達氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)PETC(ATCC 49587)、俊達氏梭菌ERI2(ATCC55380)、俊達氏梭菌C-01(ATCC55988)、俊達氏梭菌O-52(ATCC55889)、大梭菌(Clostridium magnum)、巴斯德氏梭菌(Clostridium pasteurianum)(德國DSMZ之DSM 525)、拉格拉氏梭菌P11(Clostridium ragsdali P11)(ATCC BAA-622)、糞味梭菌(Clostridium scatologenes)、熱醋梭菌(Clostridium thermoaceticum)、雅爾氏梭菌(Clostridium ultunense)、庫茲氏脫硫菌(Desulfotomaculum kuznetsovii)、黏液真桿菌(Eubacterium limosum)、硫還原地桿菌(Geobacter sulfurreducens)、乙酸甲烷八疊球菌(Methanosarcina acetivorans)、巴氏甲烷八疊球菌(Methanosarcina barkeri)、熱醋莫雷拉氏菌(Morrella thermoacetica)、自嗜熱莫雷拉氏菌(Morrella thermoautotrophica)、芬尼產醋桿菌(Oxobacter pfennigii)、產生消化鏈球菌(Peptostreptococcus productus)、產生瘤胃球菌(Ruminococcus productus)、凱伍熱厭氧菌(Thermoanaerobacter kivui)及其等之混合物。
- 如請求項1之發酵方法，其中該方法係有效用以提供至少1.0克/升之細胞密度。
- 如請求項1之發酵方法，其中該方法係有效用以提供至少5至99%之CO轉換率。
- 如請求項1之發酵方法，其中該發酵培養基係具有低於0.01克/升酵母萃取物。
- 如請求項1之發酵方法，其中該發酵培養基係具有低於0.01克/升碳水化合物。
- 如請求項1之發酵方法，其中B、Mn、Mo或Cu源從培養基之製備中去除。
Applications Claiming Priority (12)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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