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TWI648265B - ８－苯基異喹啉及其醫藥組合物用於治療腸躁症候群 - Google Patents

８－苯基異喹啉及其醫藥組合物用於治療腸躁症候群 Download PDF

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TWI648265B
TWI648265B TW107107111A TW107107111A TWI648265B TW I648265 B TWI648265 B TW I648265B TW 107107111 A TW107107111 A TW 107107111A TW 107107111 A TW107107111 A TW 107107111A TW I648265 B TWI648265 B TW I648265B
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TW
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compound
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pharmaceutical composition
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TW107107111A
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TW201833083A (zh
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忻凌偉
余佳慧
李宗錞
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國立臺灣大學
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Abstract

本發明係關於下列通式之新穎化合物或其藥學上可接受的鹽：
本發明亦關於一種醫藥組合物，其包含藥學上可接受的載體及治療有效量的此新穎化合物或其藥學上可接受的鹽。此外，本發明關於一種使用上述醫藥組合物治療腸躁症候群的方法。

Description

8-苯基異喹啉及其醫藥組合物用於治療腸躁症候群
本發明係關於用於治療腸躁症候群(IBS)的一系列8-苯基異喹啉衍生物。
5-HT7受體(5-HT7R)係5-HT受體家族之14個亞型中的最新成員。其廣泛分佈於中樞神經系統(CNS)(在下視丘、視丘、海馬迴、及皮質中含量最豐富)以及周邊器官(例如脾、腎、腸、心臟及冠狀動脈)中，這意味著其在各種生理功能及病理過程中具有作用。5-HT7R與腺苷酸環化酶正向偶合，且與其他5-HT受體亞型具有低的序列同源性(低於40%)。基於使用選擇性5-HT7R配體及剔除(knock-out)小鼠模型進行的研究，5-HT7R參與晝夜節律調節、體溫調節、睡眠障礙、情感疾患、疼痛、學習及記憶。因此，5-HT7R配體是治療各種5-HT7R相關疾病及失調的潛在治療劑。5-HT7R拮抗劑可能是抑鬱、焦慮、精神分裂症、及失智症的有效治療劑，而5-HT7R促效劑可能是疼痛及疼痛症狀(特別是神經性病變疼痛及發炎性疼痛)的潛在治療劑。
此外，5-HT7R也是偏頭痛(WO2009029439 A1)、高血壓、各種黏膜發炎(WO2012058769 A1)(諸如腸躁症候群)、及尿失禁的潛在藥物標靶，其分別透過對中樞及周邊血管以及腸、結腸、及膀胱組織的有效平滑肌鬆弛作用。幾種治療劑(諸如三環抗鬱劑、典型和非典型抗精神病藥物及一些5-HT2受體拮抗劑)被發現對5-HT7R表現出中度至高度的親和力。
考慮到5-HT7R配體的多種治療潛力，已經有許多努力集中在選擇性5-HT7R促效劑及拮抗劑的發現和開發上。不同結構類型的5-HT7R配體已被報導，包括5-HT7R促效劑(諸如AS-19、LP-44、LP-12、LP-211、及E-55888)以及5-HT7R拮抗劑(諸如SB-258719、SB-269970、SB-656104,、DR-4004及JNJ-18038683)。儘管這許多努力，仍然需要進一步開發具有適當物理化學和藥物動力學性質的新型5-HT7R配體作為用於治療5-HT7R相關疾病及失調的潛在治療劑。
腸躁症候群(IBS)主要特徵為沒有可識別的器官原因或外觀損傷的情況下，與排便習慣改變相關的復發性腹痛。在亞洲和西方國家的腸胃科門診病人中，約有10至15%與IBS有關。嚴重的腹痛是IBS的臨床特徵，其係最可能導致醫療諮詢的症狀。IBS的亞型包括以腹瀉為主的IBS-D、以便秘為主的IBS-C、或交替的IBS-A。IBS病症的發展據信與腦腸軸(brain-gut axis)紊亂有關；然而，發病機制仍然知之甚少。
患者中腸血清素(serotonin(5-HT))水平的改變係經驗證的IBS生物標記。然而，以5-HT受體為標靶用於IBS治療的臨床藥物目前是有限的，只有在緊急研究藥物方案(emergency investigational drug protocol)下才能開此藥方。阿洛司瓊(alosetron)(一種用於治療IBS-D的5-HT3R拮抗劑) 已因為嚴重的副作用(例如缺血性結腸炎、腦血管或心血管缺血)被FDA撤回，之後重新引入僅限用於症狀嚴重的女性。其他可用的症狀緩解劑(例如解痙藥、止瀉藥、滲透劑、鎮靜劑、抗憂鬱劑等等)對於患者而言並不是廣泛有效的。IBS發病機制的醫學研究很大程度上依賴於患者切片檢體的分析。具有內臟過敏反應的動物模式已被建立，雖然每種模式都有其對IBS轉譯價值的弱點和優勢。因此，IBS治療發展的進展受到阻礙。迄今為止，用於IBS臨床治療的新型靶向藥物開發是非常需要的。
已經發現包括心理壓力、腸感染、免疫和發炎反應、遺傳易感性(genetic predisposition)、及腸道微生物相變化的多種危險因素會促成IBS症狀發展。有高比率的IBS患者報告過去在兒童期或成年期的創傷事件。IBS症狀可能在傳染性胃腸炎發作之後開始，稱為感染後(PI)-IBS。挪威水傳播梨形鞭毛蟲病疫情(waterborne giardiasis outbreak)的後續研究報告指出，超過40%的患者在急性梨形鞭毛蟲(Giardia lamblia)感染後經歷類IBS(IBS-like)症狀持續三年。該感染後症狀的惡化與身體或精神壓力的經歷相關。病原體感染清除後及化學誘導性小腸結腸炎解除後的實驗模式表現出腸道痛覺過敏。此外，受到心理壓力的動物也表現出對結直腸擴張(colorectal distension)的內臟過敏反應。使用具有類IBS內臟過敏反應的兩種小鼠模式(包括以梨形鞭毛蟲感染後(Giardia postinfection)結合心理壓力雙重刺激，以及在三硝基苯磺酸(TNBS)誘導的結腸炎解除後)來測試新穎5-HT7R配體的鎮痛作用。
在5-HT受體亞型中，5-HT7R是最新發現的家族成員，具有未知的病理生理作用。5-HT7R的刺激引起圓形平滑肌的過度放鬆，其意味 著無效的氣體推進及腹脹。已經在結腸中的腸神經元(即腸肌傳入神經元(myenteric afferent neuron)及黏膜神經纖維)、平滑肌、及樹突細胞中，以及腰背根神經節(lumbar dorsal root ganglion)及腦中鑑定出5-HT7R的表現。本發明證實了一系列8-苯基異喹啉衍生物在兩種IBS動物模式中減輕腸痛的作用。
本發明提供一種具有下列通式的新穎化合物或其藥學上可接受的鹽： 其中R1係選自由氫、C1-10直鏈烷基、C1-10支鏈烷基、(CH2)n(Hete)R10R11R12及(CH2)nArR10R11R12所組成之群組，其中n係一0至6的整數、Hete係一芳香雜環基、Ar係一芳香環基、且R10、R11及R12係分別選自由氫、鹵基、硝基、胺基、氰基、乙醯基、C1-6直鏈飽和烷基、C1-6直鏈飽和烷氧基及C1-6直鏈飽和鹵烷基所組成之群組；R2係氫或C1-6直鏈飽和烷基；及X1、X2、X3、X4及X5係分別選自由氫、鹵基、硝基、胺基、氰基、乙醯基、C1-6直鏈飽和烷基、C1-6支鏈飽和烷基、C1-6直鏈飽和烷氧基、C1-6支鏈飽和烷氧基、C1-6直鏈飽和烷硫基、C1-6支鏈飽和烷硫基、C1-6直鏈飽和鹵烷基及C1-6支鏈飽和鹵烷基所組成之群組。
在本發明的一個實施例中，該新穎化合物的鹵基係選自由氟、氯、溴及碘所組成之群組。在本發明的另一個實施例中，該新穎化合 物的芳香雜環基係選自由吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、嘧啶基、噻唑基、吲哚基、異吲哚基、吲唑基、苯并呋喃基、異苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并咪唑基、苯并唑基及苯并噻唑基所組成之群組。
在本發明的一較佳實施例中，該新穎化合物係選自6-甲氧-8-(2-甲氧苯基)-2-(3-(4-硝苯基)丙基)-1,2,3,4-四氫異喹啉-7-醇(化合物7)、6-甲氧-8-(2-甲氧苯基)-2-(3-(吡啶-4-基)丙基)-1,2,3,4-四氫異喹啉-7-醇(化合物8)、6-甲氧-8-(2-甲氧苯基)-2-(3-(吡啶-3-基)丙基)-1,2,3,4-四氫異喹啉-7-醇(化合物9)、及6,7-二甲氧-8-(2-甲氧苯基)-2-(3-(吡啶-4-基)丙基)-1,2,3,4-四氫異喹啉(化合物10)的化合物、或其藥學上可接受的鹽。在本發明的一更佳實施例中，該新穎化合物係6-甲氧-8-(2-甲氧苯基)-2-(3-(吡啶-4-基)丙基)-1,2,3,4-四氫異喹啉-7-醇(化合物8)或其藥學上可接受的鹽。
本發明進一步提供一種醫藥組合物，其包含藥學上可接受的載體及治療有效量的下列通式的新穎化合物： 其中R1係選自由氫、C1-10直鏈烷基、C1-10支鏈烷基、(CH2)n(Hete)R10R11R12及(CH2)nArR10R11R12所組成之群組，其中n係一0至6的整數、Hete係一芳香雜環基、Ar係一芳香環基、且R10、R11及R12係獨立選自由氫、鹵基、硝基、胺基、氰基、乙醯基、C1-6直鏈飽和烷基、C1-6直鏈飽和烷氧基及C1-6直鏈飽和鹵烷基所組成之群組；R2係氫或C1-6直鏈飽和烷基；及X1、X2、X3、X4及X5係分別選自由氫、鹵基、硝基、胺基、氰基、乙醯基、C1-6直鏈飽和烷 基、C1-6支鏈飽和烷基、C1-6直鏈飽和烷氧基、C1-6支鏈飽和烷氧基、C1-6直鏈飽和烷硫基、C1-6支鏈飽和烷硫基、C1-6直鏈飽和鹵烷基及C1-6支鏈飽和鹵烷基所組成之群組。
在本發明的一個實施例中，該醫藥組合物的新穎化合物的鹵基係選自由氟、氯、溴及碘所組成之群組。在本發明的另一個實施例中，該醫藥組合物的新穎化合物的芳香雜環基係選自由吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、嘧啶基、噻唑基、吲哚基、異吲哚基、吲唑基、苯并呋喃基、異苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并咪唑基、苯并唑基及苯并噻唑基所組成之群組。
在本發明的一較佳實施例中包含藥學上可接受的載體及治療有效量的6-甲氧-8-(2-甲氧苯基)-2-(3-(吡啶-4-基)丙基)-1,2,3,4-四氫異喹啉-7-醇(化合物8)或其藥學上可接受的鹽。
「藥學上可接受的載體」或「賦形劑」或「藥學上可接受的載體或賦形劑」或「生物可利用的(bioavailable)載體」或「生物可利用的載體或賦形劑」包括但不限於為了保存的溶劑、分散劑、塗料、抗微生物劑、抗真菌劑或為了製備配方的延遲吸收劑及任何其他已知的化合物。一般而言，這些載體或賦形劑本身不具有治療疾病的活性。藉由使用本發明中揭露之新穎化合物或其衍生物結合藥學上可接受的載體或賦形劑而製備的醫藥組合物或配方不會引起動物或人類的副作用、過敏或其他不適當的反應。因此，本發明中揭露之新穎化合物或其衍生物與藥學上可接受的載體或賦形劑的組合可應用於人類臨床。包含本發明之新穎化合物或其衍生物的醫藥組合物或配方可透過靜脈注射、口服、吸入或透過鼻、直腸、陰道或舌下的局部投予來達到治療效果。在一個實施例中，每天將0.1mg至100mg的化合物的活性成分投予患有不同疾病的患者。
要使用的載體根據要製備的醫藥組合物或配方而不同。無菌注射用組合物可懸浮在無菌靜脈內注射稀釋劑或溶劑中，例如1,3-丁二醇。可接受的載體可以是甘露醇或水。此外，油固定或合成的單甘油酯/雙甘油酯懸浮介質係常用的溶劑。可製備脂肪酸(諸如油酸、橄欖油、蓖麻油、甘油酯衍生物，特別是聚氧乙烯化形式)用於注射及天然的藥學上可接受的油。這些油溶液或懸浮液包括長鏈醇稀釋劑、分散劑、羧甲基纖維素或類似的分散劑。常用的其它表面活性劑包括Tween、Spans、其他類似的乳化劑、用於製藥工業的藥學上可接受的固體、液體、或其它用於開發配方的生物可利用的增強劑。
將用於口服投予的組合物調整為口服可接受的組合物或配方，其中該等類型包括膠囊、口含錠(lozenge)、錠劑(troche)、乳化劑、液體懸浮液、分散劑及溶劑。用於口服投予(諸如口含錠)的常用載體可為例如作為基本添加劑的乳糖、玉米澱粉、潤滑劑、硬脂酸鎂。用於膠囊的稀釋劑包括乳糖、乾玉米澱粉。液體懸浮液或乳化劑配方的配製係藉由結合乳化劑或懸浮劑的油界面來懸浮或溶解活性成分。亦可包括甜味劑、調味劑或著色劑。
用於口服使用的氣溶膠噴霧劑或吸入組合物係由已知的配方技術製備。例如，將組合物溶解於生理食鹽水中，加入苯甲醇、其他合適的防腐劑或促吸收劑(absorbefacient)以增強生物可利用性。本發明所提供之化合物的組合物亦可製成透過直腸或陰道投予的栓劑。
注射包括皮下、腹腔、靜脈、肌肉、關節腔、顱內、滑液、鞘內注射、主動脈注射、胸腔注射、病灶注射或其他合適的給藥技術。
此外，本發明提供了一種用於治療腸躁症候群的方法，其包含步驟如下：向需要該治療的患者投予有效量的上述醫藥組合物。在本發明的一個實施例中，該醫藥組合物的鹵基係選自氟、氯、溴及碘。在本發明的另一個實施例中，該醫藥組合物的芳香雜環基係選自由吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、嘧啶基、噻唑基、吲哚基、異吲哚基、吲唑基、苯并呋喃基、異苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并咪唑基、苯并唑基及苯并噻唑基所組成之群組，其提供了對5-HT7受體的拮抗作用。
在本發明的另一個實施例中，該腸躁症候群係藉由提供對5-HT7受體的拮抗作用來治療。在本發明的又一個實施例中，該腸躁症候群包含由感染及之後的壓力所引起的疼痛，以及由化學誘導的發炎所引起的疼痛。
在本發明的又一個實施例中，該腸躁症候群係藉由抑制由感染及之後的壓力所引起的疼痛來治療。在本發明的另一個實施例中，該腸躁症候群係藉由抑制由化學誘導的發炎所引起的疼痛來治療。
在檢閱詳細描述及附圖之後，本發明之上述態樣及優點對所屬技術領域中具有通常知識者而言將變得顯而易見。
圖1、8-苯基異喹啉新衍生物的合成方案1。
圖2、8-苯基異喹啉新衍生物的合成方案2。
圖3、8-苯基異喹啉新衍生物的合成方案3。
圖4、8-苯基異喹啉新衍生物的合成方案4。
圖5、在類IBS小鼠模式中以梨形鞭毛蟲(Giardia)結合壓力進行雙重刺激所觀察到的內臟過敏反應。(A)將對結直腸擴張的內臟運動反應(visceromoter response(VMR))表示為曲線下面積(AUC)並在每隻小鼠中測定以作為腸痛指標。(B)PN和GW小鼠中結腸組織學的代表性圖像。(C)PN和GW小鼠結腸組織中的免疫染色的5-HT7R的代表性圖像(a小圖)以及肌肉/神經及黏膜層中的5-HT7R免疫反應性的定量(b小圖及c小圖)。(D)西方印漬術(Western blotting)結果顯示GW小鼠中5-HT7R蛋白水平增加。
圖6、在TNBS誘導的結腸炎解除後在類IBS小鼠模式中注意到的內臟過敏反應。(A)將對結直腸擴張的內臟運動反應(visceromoter response(VMR))表示為曲線下面積(AUC)並在每隻小鼠中測定以作為腸痛指標。(B)檢驗腸的髓過氧化物酶(myeloperoxidase(MPO))活性作為發炎白血球活化的指標。(C)小鼠結腸組織的組織病理學評分。(D)在假手術(sham)和TNBS小鼠中的結腸組織學的代表性圖像。(E)在假手術(sham)和TNBS-d24小鼠的結腸組織中的5-HT7R的免疫染色。5-HT7R染色的代表性圖像(a小圖)以及肌肉/神經及黏膜層中的5-HT7R免疫反應性的定量(b小圖及c小圖)。(F)5-HT7R在小鼠結腸中的蛋白質水平。(G)5-HT7R在小鼠結腸中的轉錄水平。
圖7、5-HT7R拮抗劑SB269970(SB7)在類IBS小鼠模型中的止痛作用。
圖8、在GW小鼠中口服投予新穎8-苯基異喹啉衍生物的鎮痛作用。
圖9、化合物8在GW小鼠腸痛中的劑量與時間反應。(A)在疼痛分析之前90分鐘以各種劑量腹腔內投予化合物8。(B)在疼痛分析之前90分鐘以各種劑量口服投予化合物8。(C)在疼痛分析之前1.5、4或12小時口服投予化合物8(5mg/Kg)。(D)在一個10天的療程中在疼痛分析之前以多劑量(m.d.)重複地口服投予化合物8(3mg/Kg)。
圖10、8-苯基異喹啉衍生物在TNBS小鼠中的止痛作用。
圖11、GW和TNBS小鼠中化合物8與參考標準物的鎮痛作用及不良反應的比較。(A)GW小鼠的腸痛水平。(B)TNBS小鼠的腸痛水平。(C)每個處理組的結腸組織學的代表性光學圖像。在ALN組中觀察到充血(*)及顆粒性白血球浸潤(箭頭)，但在其他組中則沒有觀察到。
現在將參考下列實例更具體地描述本發明。應該注意的是，在此僅出於說明和描述的目的而呈現本發明之下列描述；並非意欲窮舉或限於所揭露之確切形式。
本發明提供8-苯基異喹啉的新衍生物庫。合成包括以下4方案。
方案1(如圖1所示)：如圖1所描繪，從市售的7-羥-6-甲氧-3,4-二氫異喹啉(化合物20)開始合成N-苯乙基取代的8-苯基四氫異喹啉-7-醇衍生物。以溴苯乙烷(phenylethyl bromide)將化合物20 N-烷基化，然後用NaBH4還原，得出胺21。將苯乙胺21以Pb(OAc)4處理，然後用HBr進行芳族取代，產出8-溴四氫異喹啉22。然後使用各種經取代的芳基硼烷(arylborane)，利用鈴木(Suzuki)偶合反應條件從22合成中等產率之所欲目標 化合物29至45。
方案2(如圖2所示)：如方案2所示，亦從市售的化合物20開始製備N-取代的8-(2,4-二甲氧苯基)-四氫異喹啉-7-醇。用各種鹵化物處理化合物20，然後用NaBH4還原，產出N-取代的四氫異喹啉-7-醇11及61至75。使用Pb(OAc)4在乙酸中氧化化合物11及61至75，然後用1,3-二甲氧苯進行TFA催化的芳族取代，分別得到相應的N-取代的8-(2,4-二甲氧苯基)-6-甲氧基四氫異喹啉-7-醇6及101至125。
方案3(如圖3所示)：如方案3所描繪，用各種3-芳基丙基溴處理化合物20，然後用NaBH4還原，得到相應的N-3-芳基丙基取代的四氫異喹啉-7-醇衍生物12至14及78。用Pb(OAc)4處理化合物12至14及78，然後分別用HBr進行芳族取代，得到溴化物15至17及98。在NaH的存在下用碘甲烷進行酚16的O-甲基化，產出6,7-二甲氧基四氫異喹啉18。在鈴木(Suzuki)反應條件下用各種經取代的芳基硼烷進行化合物15至18及98的芳基偶合反應，分別得到中等產率的N-3-芳基丙基取代的6-甲氧-8-苯基四氫異喹啉-7-醇7至10及142。
方案4(如圖4所示)：如方案4所描繪，使用N-苯乙基取代的8-溴-6-甲氧基四氫異喹啉-7-醇60至96製備N-苯乙基取代的6,7-二甲氧-8-苯基四氫異喹啉衍生物157至173。在NaH的存在下用碘甲烷進行酚60至96的O-甲基化，分別得出6,7-二甲氧基四氫異喹啉150至154。在鈴木(Suzuki)反應條件下，化合物150至154與各種經取代的芳基硼烷的芳基偶合反應分別提供了6,7-二甲氧-8-苯基四氫異喹啉157至173。
上述方案1至4中描述的那些化合物的具體合成步驟如下：
化合物21：將化合物20(100mg,0.56mmol)、2-溴苯乙烷(311mg,1.68mmol)、與2-丙醇(3.5mL)之混合物回流15小時。將所得溶液濃縮並加入MeOH(5mL)以溶解殘餘物。將該溶液在冰浴中冷卻，然後在N2下緩慢加入NaBH4(49mg,1.29mmol)。將該混合物再攪拌10分鐘，然後濃縮。將殘餘物用H2O(20mL)及CHCl3(20mL)處理，然後將有機層用鹽水洗滌，用MgSO4乾燥，過濾並蒸發。將粗殘餘物進行層析(矽膠，MeOH/CH2Cl2=1/100)以得出呈白色固體之化合物21(146mg,0.52mmol,92%)。
化合物30：在一10-mL厚壁Pyrex反應容器中，在C18H20BrNO2(50mg,0.14mmol)於2-丙醇(2.0mL)中的溶液中加入4-甲氧苯基硼酸(26mg,0.19mmol)。攪拌30分鐘後，加入Pd(OAc)2(1.3mg,0.006mmol)、PPh3(4.7mg,0.02mmol)、2M Na2CO3(aq)(0.09mL,0.17mmol)、及H2O(0.1mL)。接著將該混合物在微波合成器中於140℃加熱10分鐘，加入H2O(0.35mL)，然後冷卻至室溫。將所得溶液用H2O(5mL)稀釋並用EtOAc(5mL)萃取。將有機層用5% NaHCO3(aq)及鹽水洗滌。將有機溶液用Darco G-60(100mg)處理並在室溫下攪拌30分鐘，然後用MgSO4乾燥，過濾(將燒結的玻璃漏斗裝入矽藻土(Celite)至1cm的深度，並將Florisil均勻塗佈在矽藻土的頂部)並蒸發。將粗殘餘物進行層析(矽膠，EtOAc/正己烷=2/1)以得出橙色油狀物(40mg,0.10mmol,73%)。
化合物29及31至40：表1係一參數表。將「參數1」加入反應容器中進行微波輔助加熱，並用「參數2」mL 2-丙醇溶解。該溶液外觀為「參數3」，在其中加入試劑「參數4」，並攪拌「參數5」分鐘。所得到的溶液的外觀為「參數6」。加入Pd(OAc)2「參數7」、PPh3「參數8」、2M Na2CO3(aq) 「參數9」及「參數10」mL H2O並以「參數11」的條件加熱。在該溶液溫度降低之前加入「參數12」mL H2O，在空氣中攪拌直至達到室溫，用「參數13」mL EtOAc稀釋，並用「參數14」mL H2O萃取。將有機層用5% NaHCO3(aq)洗滌，用鹽水洗滌，加入「參數15」mg Darco G-60，攪拌「參數16」分鐘，加入MgSO4以乾燥，攪拌「參數17」分鐘，用覆蓋有約1cm矽藻土(Celite)及Florisil薄層的燒結玻璃漏斗過濾，濃縮乾燥並藉由快速管柱層析(flash column chromatography)(矽膠，「參數18」)純化以獲得「參數19」。
化合物44：向在10-mL厚壁Pyrex反應容器中的C18H20BrNO2(100mg,0.28mmol)於2-丙醇(1.5mL)中的溶液中加入3,5-二甲氧苯硼酸(62mg,0.34mmol)。攪拌30分鐘後，加入Pd(OAc)2(2.2mg,0.01mmol)、PPh3(8.0mg,0.03mmol)、2M Na2CO3(aq)(0.17mL,0.34mmol)、及H2O(0.7mL)。接著將該混合物在微波合成器中於140℃加熱10分鐘，加入H2O(0.35mL)，然後冷卻至室溫。將所得溶液用H2O(10mL)稀釋並用EtOAc(10mL)萃取。將有機層用5% NaHCO3(aq)(10mL)及鹽水洗滌。將有機溶液用Darco G-60(100mg)處理並在室溫下攪拌30分鐘，然後用MgSO4乾燥，過濾(將燒結的玻璃漏斗裝入矽藻土(Celite)至1cm的深度，並將Florisil均勻塗佈在矽藻土的頂部)並蒸發。將粗殘餘物進行層析(矽膠，EtOAc/正己烷=1/1)以得出黃色油狀物(76mg,0.18mmol,65%)。
化合物45：在一10-mL厚壁Pyrex反應容器中，在C18H20BrNO2(100mg,0.28mmol)於2-丙醇(2.0mL)中的溶液中加入2,3-二甲氧苯基硼酸(62mg,0.34mmol)。攪拌30分鐘後，加入Pd(OAc)2(2.0mg,0.009mmol)、PPh3(3.7mg,0.014mmol)、2M Na2CO3(aq)(0.18mL,0.36mmol)、及H2O(0.2mL)。接著將該混合物在微波合成器中於120℃加熱10分鐘，加入H2O(0.7mL)，然後冷卻至室溫。將所得溶液用H2O(5mL)稀釋並用EtOAc(5mL)萃 取。將有機層用5% NaHCO3(aq)(5mL)及鹽水洗滌。將有機溶液用Darco G-60(100mg)處理並在室溫下攪拌30分鐘，然後用MgSO4乾燥，過濾(將燒結的玻璃漏斗裝入矽藻土(Celite)至1cm的深度，並將Florisil均勻塗佈在矽藻土的頂部)並蒸發。將粗殘餘物進行層析(矽膠，EtOAc/正己烷=1/1)以得出黃色油狀物(82mg,0.20mmol,71%)。
化合物15、60、85、95至96、及98：表2係一參數表。在N2下於室溫將起始材料「參數1」加入到反應燒瓶中，並在其中加入「參數2」mL HOAc。加入Pb(OAc)4「參數3」，然後該溶液係「參數4」，倒入錐形瓶中並緩慢加入「參數5」mL Na2CO3(sat)。該水層的pH值係鹼性的(pH=「參數6」)。過濾中和所產生的固體。用CH2Cl2洗滌濾餅。將濾液用「參數7」mL CH2Cl2萃取。將有機層用鹽水洗滌，加入MgSO4以乾燥，攪拌5分鐘，用燒結的玻璃漏斗過濾並濃縮乾燥以得到「參數8」產物。將該粗產物用於下面的反應而不再進一步純化。
在室溫空氣中在該溶液中加入HBr「參數9」且該溶液的外觀係「參數10」。在攪拌「參數11」小時之後，將「參數12」mL Na2CO3(sat)及「參數13」mL CH2Cl2緩慢加入到該溶液中。該水層的pH係鹼性的(pH=「參數14」)，然後加入「參數15」mL CH2Cl2及「參數16」mL H2O用於萃取。將有機層用鹽水洗滌，加入MgSO4以乾燥，攪拌5分鐘，用燒結的玻璃漏斗過濾並濃縮乾燥以得到粗產物「參數17」mg。在快速管柱層析(矽膠，「參數18」)之後得出「參數19」。
化合物11至12、63至67、67至70、74至75、及78：表3係一參數表。在N2下於室溫將起始材料「參數1」加入到一燒瓶中，然後在其中 加入「參數2」mL IPA及「參數3」。該起始材料在「參數4」℃溶解。反應溶液的外觀在約「參數6」分鐘時為「參數5」及「參數7」，然後將該溶液在110至120℃加熱「參數8」小時並在室溫下濃縮。加入「參數9」mL MeOH並將所得之混合物攪拌「參數10」分鐘。向在冰浴中為「參數11」的溶液中在N2下緩慢加入NaBH4(s)「參數12」並攪拌「參數13」分鐘。將為「參數14」的該溶液加入「參數15」mL H2O並用「參數16」mL CHCl3萃取。將有機層加入MgSO4以乾燥，攪拌「參數17」分鐘，過濾並濃縮以得到「參數18」。在快速管柱層析(矽膠，「參數19」)之後得出「參數20」。
化合物68：將C10H11NO2(300mg,1.69mmol)、C8H8Br2(1.00g,3.79mmol)、與2-丙醇(10mL)之混合物加熱至回流持續23小時。將所得溶液冷卻至室溫並蒸發。將該粗製物溶解於MeOH(15mL)中，在冰浴中冷卻至0℃，然後在N2下分批加入NaBH4(420mg,11.1mmol)。將該混合物再攪拌20分鐘，然後濃縮。將殘餘物用CHCl3(30mL)及H2O(30mL)處理，然後將有機層用MgSO4乾燥，過濾並蒸發。藉由沉澱法進行純化。將粗產物用5mL的EtOAc溶解，然後用10mL的正己烷沉澱出產物以得出米色固體(620mg,1.71mmol)。
化合物121：在C19H23NO2(250mg,0.84mmol)於HOAc(4.2mL)中的溶液中加入Pb(OAc)4(579mg,1.31mmol)並將該混合物在N2下於 室溫攪拌15分鐘。用CH2Cl2稀釋該反應混合物並緩慢加入Na2CO3(sat)(20mL)。將中和所形成的固體藉由過濾除去並用CH2Cl2洗滌。將合併的濾液用CH2Cl2(35mL)萃取，然後將有機層用鹽水洗滌，用MgSO4乾燥，過濾並蒸發以得出棕色油狀物(480mg,1.35mmol)，將其不經進一步純化即用於下面的反應中。在該粗製油狀物於CH2Cl2(17mL)中的溶液中加入1,3-二甲氧苯(0.17mL,1.3mmol)及三氟乙酸(0.84mL)。將所得混合物在室溫下攪拌30分鐘，然後緩慢加入Na2CO3(sat)(20mL)。將所得溶液用CH2Cl2(18mL)萃取，然後將有機層用鹽水洗滌，用MgSO4乾燥，過濾並蒸發。將粗殘餘物進行層析(矽膠，MeOH/CH2Cl2=1/10)以得出紅棕色油狀物(214mg,0.49mmol,59%)。
化合物6、105至110、114至115、120、122、123及125：表4係一參數表。在N2下於室溫將起始材料「參數1」加入到燒瓶中並用「參數2」mL HOAc溶解。在為「參數3」的該溶液中加入Pb(OAc)4「參數4」，然後將為「參數5」的所得溶液攪拌「參數6」分鐘，倒入125mL的錐形瓶中，攪拌並緩慢加入「參數7」mL Na2CO3(sat)。該水層的pH值係鹼性的(pH=8至9)。過濾中和所產生的固體並用CH2Cl2洗滌。將濾液用「參數8」mL CH2Cl2萃取。將有機層用鹽水洗滌，加入MgSO4以乾燥，攪拌5分鐘，過濾並濃縮以得出「參數9」。將該粗產物用於下面的反應而不再進一步純化。
將該粗產物在N2下於室溫溶解於「參數10」mL CH2Cl2中。在為「參數11」的該溶液中加入1,3-二甲氧基苯「參數12」及三氟乙酸「參數13」。該溶液的顏色變成「參數14」。在攪拌該溶液「參數15」分鐘後，緩慢加入「參數16」mL Na2CO3(sat)。該水層的pH係鹼性的(pH=8至9)， 加入「參數17」mL CH2Cl2以萃取。將有機層用鹽水洗滌，加入MgSO4以乾燥，攪拌5分鐘，過濾並濃縮以得出「參數18」mg粗產物。在快速管柱層析(矽膠，「參數19」)之後得出「參數20」。
化合物7及142：表5係一參數表。向反應容器中加入「參數1」及2-甲氧苯基硼酸(46mg,0.30mmol)進行微波輔助加熱並用2-丙醇(2mL)溶解，攪拌30分鐘。加入Pd(OAc)2「參數2」、PPh3「參數3」、2M Na2CO3(aq)(0.14mL,0.28mmol)、及H2O(0.2mL)，並使用微波合成器將該混合物於120℃加熱20分鐘。在該溶液溫度降低之前在該溶液中加入H2O(0.7mL)，在空氣中攪拌直至達到室溫，用10mL的EtOAc稀釋，並用10mL的H2O萃取。將有機層用5% NaHCO3(aq)洗滌，用鹽水洗滌，加入「參數4」mg Darco G-60，攪拌10分鐘，加入MgSO4以乾燥，攪拌10分鐘，用覆蓋有約1cm矽藻土(Celite)及Florisil薄層的燒結玻璃漏斗過濾並濃縮。將該粗產物藉由快速管柱層析(矽膠，「參數5」)純化以獲得黃色油狀物「參數6」。將游離鹼「參數7」溶解於CH2Cl2中，然後加入HCl於CH2Cl2中的溶液直至pH=1。將所得混合物濃縮以獲得鹽酸鹽「參數8」。
化合物150：在C18H20BrNO2(100mg,0.28mmol)於DMF(2mL)中的溶液中，加入三甲基苯基氯化銨((CH3)3PhNCl,102mg,0.59mmol)及t-BuOK(67mg,0.60mmol)。在N2下將該懸浮液加熱至60℃持續3.5小時，然後加入(CH3)3PhNCl(102mg,0.59mmol)並加熱至70℃持續4.5小時。在冷卻至室溫後，將該反應混合物用CHCl3(10mL)及5% NaOH(aq)(20mL)處理。將有機層用鹽水洗滌，用MgSO4乾燥，過濾並蒸發。將粗殘餘物進行層析(矽膠，EtOAc/正己烷=1/4)以得出黃色固體(83mg,0.22mmol,79%)。
化合物152：在冷卻至0℃並除氣的C18H19BrN2O4(406mg,1.00mmol)於DMF(9mL)中的溶液中，加入於DMF(1mL)中的NaH(40mg,1.67mmol)及CH3I(0.06mL,0.98mmol)。攪拌10分鐘後，加入NH4Cl(111mg,2.08mmol)，然後將該反應混合物用乙醚(100mL)及H2O(100mL)處理。將有機層用鹽水洗滌，用MgSO4乾燥，過濾並蒸發。將粗殘餘物進行層析(矽膠，EtOAc/正己烷=1/2)以得出黃色固體(123mg,0.29mmol,30%)。
化合物153：在C18H19BrClNO2(300mg,0.75mmol)於DMF(6mL)中的溶液中，加入(CH3)3PhNCl(542mg,3.16mmol)及t-BuOK(333mg, 2.97mmol)。在N2下將該懸浮液加熱至60℃持續16小時，然後加熱至70℃持續1小時。在冷卻至室溫後，將該反應混合物用Et2O(100mL)及H2O(100mL)處理。將有機層用鹽水洗滌，用MgSO4乾燥，過濾並蒸發。將粗殘餘物進行層析(矽膠，EtOAc/正己烷=1/4)以得出白色固體(189mg,0.46mmol,61%)。
化合物154：在C18H19BrFNO2(400mg,1.05mmol)於DMF(8mL)中的溶液中，加入(CH3)3PhNCl(727mg,4.23mmol)及t-BuOK(468mg,4.17mmol)。在N2下將該懸浮液加熱至70℃持續16小時。在冷卻至室溫後，將該反應混合物用Et2O(100mL)及H2O(100mL)處理。將有機層用鹽水洗滌，用MgSO4乾燥，過濾並蒸發。將粗殘餘物進行層析(矽膠，EtOAc/正己烷=1/4)以得出白色固體(247mg,0.63mmol,60%)。
化合物157至159、165-168及171-173：表6係一參數表。將「參數1」加入反應容器中進行微波輔助加熱，並用「參數2」mL 2-丙醇溶解。在其中加入「參數3」並攪拌30分鐘。加入Pd(OAc)2「參數4」、PPh3「參數5」、2M Na2CO3(aq)「參數6」及「參數7」mL H2O並使用微波合成器將其加熱至120℃持續20分鐘。在該溶液溫度降低之前加入「參數8」mL H2O，然後冷卻至室溫，用10mL EtOAc稀釋，並用10mL H2O萃取。將有機層用5% NaHCO3(aq)洗滌，再用鹽水洗滌，加入「參數9」mg Darco G-60，攪拌10分鐘，用覆蓋有約1cm矽藻土(Celite)及Florisil薄層的燒結玻璃漏斗過濾，濃縮並藉由快速管柱層析(矽膠，「參數10」)純化以獲得「參數11」。
表6：用於合成化合物157至159、165至168及171至173的參數表
化合物6至10的5-HT7受體親和力、5-HT2A受體親和力、及log D數據係顯示於表8中。
動物
使用從國立台灣大學動物中心獲得的無特定病原體 C57BL/6小鼠(4至6週齡)進行研究。將動物飼養在一12/12小時光暗循環的溫度控制室(20±2℃)中，並以任意採食(ad libitum)方式餵以普通小鼠飼料及水。所有實驗程序均經國立台灣大學實驗動物照護及使用委員會批准。
試劑
新穎的8-苯基異喹啉衍生物係藉由下述程序製備。將SB-269970鹽酸鹽(SB7)(一種5-HT7R拮抗劑，Sigma #S7389)、阿洛司瓊(alosetron)鹽酸鹽(ALN)(一種5-HT3R拮抗劑，Sigma #SML0346)、及洛哌丁胺(loperamide)鹽酸鹽(LPM)(一種μ型類鴉片受體(μ-opioid receptor)促效劑；Sigma #L4762)以單劑量或多劑量腹腔內(i.p.)或口服(p.o.)投予至小鼠以分析腸痛。
兩種內臟過敏反應的實驗模型
(1)梨形鞭毛蟲感染後結合避水壓力(water avoidance stress)的雙重刺激
在該研究中使用兩種表現出內臟過敏反應的IBS動物模型，包括感染後結合心理壓力的雙重刺激，以及發炎後。在第一個模型中，將小鼠分成兩組，其中一組接受梨形鞭毛蟲感染後及避水壓力的雙重刺激(GW)，而另一組則以生理鹽水對飼育(pair-fed)且未經處理(PN)以作為未感染無壓力的正常對照組。體外(in vitro)培養Axenic梨形鞭毛蟲(Giardia lamblia)滋養體(品系GS/M，ATCC 50581)並在對數期收穫，如Singer等人(T-cell-dependent control of acute Giardia lamblia infections in mice.Infect.Immun.2000；68：170-175)及Davids等人(Polymeric immunoglobulin receptor in intestinal immune defense against the lumen-dwelling protozoan parasite Giardia.J Immunol 2006；177：6281-6290)所述。將小鼠經口灌胃(gavage)懸浮於0.2ml無菌磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中的107個梨形鞭毛蟲滋養體，或以相同體積的PBS對飼育。在4至7天後，藉由遵循冷休克方案(cold-shock protocol)在小腸中計數能動的滋養體來驗證梨形鞭毛蟲感染的狀態(揭示於Scott KG,Yu LCH,Buret AG.Role of CD8+ and CD4+ T lymphocytes in jejunal mucosal injury during murine giardiasis.Infect.Immun.2004；72：3536-3542及Scott KG,Meddings JB,Kirk DR,et al.Intestinal infection with Giardia spp.reduces epithelial barrier function in a myosin light chain kinase-dependent fashion.Gastroenterology 2002；123：1179-1190)。在小腸中未能檢測到滋養體的感染後第六週(清除後階段)，使小鼠受到慢性心理壓力。WAS的程序包括將小鼠放置在具有3cm(垂直高度)室溫水的容器(56 x 50cm)的中心平台(3 x 6cm)上。將小鼠留在該平台上1小時，以避免浸水作為一種心理壓力，沒有身體上的傷害。連續10天進行該1小時的壓力時間以模擬慢性重複壓力，並在9：00至12：00之間進行以使晝夜節律的影響最小化。將未感染及無壓力的未處理動物作為正常對照組飼養在籠中。在該壓力時間的最後一天，在小鼠中測量腸痛。
為了測試GW模型中的止痛作用，在測量腸痛之前90或240分鐘以單劑量向小鼠投予新的5-HT7R配體。在另外的設置中，在每次壓力時間開始之前30分鐘，連續10天重複投予該等新配體，並且在最後一次壓力時間之後立即測量腸痛。
(2)發炎後模型
在第二個模型中，透過22口徑(22-gauge)餵食針結腸內投予於0.2ml 50%乙醇中的10% 2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)以誘導腸道發炎。給予假手術對照組相同體積的PBS。在投予TNBS後於各種不同的時間點測量腸道發炎參數及疼痛水平。
為了測試該TNBS後模型中的止痛作用，在90或240分鐘之前向小鼠投予單劑量的新穎5-HT7R配體或在測量腸痛之前連續10天重複投予多劑量的新穎5-HT7R配體。
對結直腸擴張的痛覺評估
依照先前描述的方法加上些微修改，由小鼠中對結直腸擴張(CRD)的內臟運動反應(VMR)來測量腹痛(Lu CL,Hsieh JC,Dun NJ,et al.Estrogen rapidly modulates 5-hydroxytrytophan-induced visceral hypersensitivity via GPR30 in rats.Gastroenterology 2009；137：1040-1050；Hong S,Zheng G,Wu X,et al.Corticosterone mediates reciprocal changes in CB 1 and TRPV1 receptors in primary sensory neurons in the chronically stressed rat.Gastroenterology 2011；140：627-637 e4)。簡言之，在VMR實驗前至少15天將由Teflon塗覆的不銹鋼絲製成的電極(A-M systems,Carlsborg,WA)植入小鼠的腹部外斜肌中。將該等電極外露到頸部的背面。在VMR實驗之前，使小鼠習慣處於塑膠玻璃圓筒中，每天30分鐘連續3天。在CRD實驗期間，該圓筒被用於部分限制清醒的小鼠。為了記錄，將電極連接到肌電圖採集系統(electromyogram acquisition system)(AD instruments,New south wales,Australia)。將插入肛門內使其在靠近肛門1.5cm處終止的氣球導管充氣以擴張結腸。使小鼠接受四次10秒的擴張(15、40及65mmHg)，休 息間隔為3分鐘。使用連接到P511 AC放大器(Grass instruments,CA,USA)的變換器(AD instruments)及Powerlab裝置，以Chart 5軟體(AD instruments)放大並數字化肌電圖(EMG)活動。矯正EMG活動，並將反應記錄為CRD期間EMG振幅的曲線下面積(AUC)相對於基線期間的增加。
組織病理學檢查
將腸組織固定於4%聚甲醛(PFA)中，並且包埋在石蠟中使腺窩絨毛軸(crypt to villus axis)適當定向，然後進行切片。將5-μm厚的切片用二甲苯及分級乙醇去石蠟，用蘇木精及伊紅(H&E)染色，並在光學顯微鏡下觀察。
反轉錄聚合酶連鎖反應
根據製造商的說明，使用Trizol試劑(Invitrogen)從組織樣本中萃取出全部的RNA。在20μL反應體積中，使用RevertAidTM First Strant cDNA合成套組(Thermo)將RNA(2μg)以寡(dT)15反轉錄。接著將所得之對應於0.1μg初始RNA的cDNA進行PCR，加入含有1X PCR緩衝液、1U DreamTaqTM DNA聚合酶、0.2mM dNTP混合物、0.4μM上游引子、及0.4μM下游引子的混合試劑(master mix)。PCR反應的特異性引子對如下：小鼠5-HT7R(正向：5’-TCTTCGGATGGGCTCAGAATGT-3’及反向：5’-AACTTGTGTTTGGCTGCGCT-3’)以及β-肌動蛋白(正向：5’-GGGAAATCGTGCGTGAC-3’及反向：5’-CAAGAAGGAAGGCTGGAA-3’)(如Forcen R,Latorre E,Pardo J,et al.Toll-like receptors 2 and 4 modulate the contractile response induced by serotonin in mouse ileum：analysis of the serotonin receptors involved. Neurogastroenterol Motil 2015；27：1258-66中所揭露者)。編程DNA熱循環儀以執行如下方案：95℃持續3分鐘1個循環；95℃持續30秒(變性(denaturation))、55℃持續30秒(黏合(annealing))、及72℃持續30秒(延長(extension))30個循環；以及72℃持續7分鐘進行最後的延長。用未反轉錄的缺乏cDNA的樣本進行陰性對照。接著將RT-PCR產物在0.5μg/mL溴化乙錠存在下於1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳，用紫外透射儀(ultraviolet transilluminator)顯現，並拍攝照片。使用Gel-Pro Analyzer 4.0軟體分析DNA條帶(band)的強度。
5-HT 7 R的免疫螢光染色
將去石蠟的組織切片以含有0.05% Tween-20的10mM檸檬酸三鈉緩衝液(pH 6.0)培養並在微波中煮沸。將切片置於室溫下冷卻。在室溫下用於PBS中的1mg/ml NaBH4(pH 8.0)淬熄終止反應15分鐘後，在室溫下用1%牛血清白蛋白阻斷組織2小時。將組織切片以一級抗體、兔多株抗5-HT7R(1：300,Abcam)、兔PGP9.5抗體(1：250,GeneTex)或同型對照在4℃培養整夜。用PBS洗滌該等切片並以接合至Alexa Fluor 488(1：250,Molecular Probes)的二級山羊抗兔IgG在室溫下培養一小時。接著將該等組織以Hoechst染料(1μg/ml於PBS中)(Sigma)另外培養30分鐘。在螢光顯微鏡下觀察載玻片並拍攝圖像。
西方印漬術(Western Blotting)
用完整的放射免疫沉澱(RIPA)緩衝液萃取腸黏膜蛋白質並進行SDS/聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)(4至13%聚丙烯醯胺)(如Kuo WT,Lee TC,Yang HY,et al.LPS receptor subunits have antagonistic roles in epithelial apoptosis and colonic carcinogenesis.Cell Death Differ 2015；22：1590-1604；Wu LL,Peng WH,Kuo WT,et al.Commensal Bacterial Endocytosis in Epithelial Cells Is Dependent on Myosin Light Chain Kinase-Activated Brush Border Fanning by Interferon-gamma.Am J Pathol 2014；184：2260-2274；及Yu LC,Shih YA,Wu LL,et al.Enteric dysbiosis promotes antibiotic-resistant bacterial infection：systemic dissemination of resistant and commensal bacteria through epithelial transcytosis.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2014；307：G824-35中所述)。接著在半乾式轉漬器(semi-dry blotter)中將解析出的蛋白質電性轉印(electrotransfer)到PVDF或硝化纖維素膜上。將印跡用於Tris緩衝鹽水(TBS)中的5%(w/v)脫脂奶粉或於含有Tween 20的TBS(TBS-T；0.1%(v/v)Tween-20於TBS中)中的5%(w/v)牛血清白蛋白阻斷1小時，用TBS-T洗滌，並以一級抗體在4℃培養整夜。洗滌該膜並用二級抗體培養1小時。洗滌後，將該等膜以化學發光溶液培養並檢測信號。使用的一級抗體包括兔多株抗5-HT7R(1：500,Abcam)及抗β-肌動蛋白(1：10000,Sigma)。使用的二級抗體係與山葵過氧化酶(horseradish peroxidase)接合的山羊抗兔IgG(1：1000,Cell Signaling)。
統計分析
所有數值均以平均值±SEM表示，並藉由配對Student t檢定進行比較。顯著性建立在P<0.05。
在兩個類IBS小鼠模型中，腸的痛覺過敏(hypernociception)與結腸5-HT 7 R表現的上調相關
利用類IBS內臟過敏反應的兩種動物模型來檢查一系列為 新穎5-HT7R配體的8-苯基異喹啉衍生物的止痛作用。將小鼠分成兩組，一組接受梨形鞭毛蟲感染後及避水壓力(GW)，另一組則對飼育(pair-fed)且未經處理(PN)以作為未感染無壓力的正常對照組。將對結直腸擴張的內臟運動反應(visceromoter response(VMR))表示為曲線下面積(AUC)並在每隻小鼠中測定以作為腸痛指標。
在第一個模型中，藉由梨形鞭毛蟲感染後結合心理壓力(GW)的雙重刺激，與正常對照組相比觀察到增加的腹痛(圖5(A))。圖5B顯示PN及GW小鼠中結腸組織學的代表性圖像。GW小鼠與正常對照組之間的結腸形態相似(圖5(B))。將PN及GW小鼠的結腸組織中的5-HT7R免疫染色。圖5(C)顯示5-HT7R染色的代表性圖像(a小圖)以及肌肉/神經及黏膜層中的5-HT7R免疫反應性的定量(b小圖及c小圖)。圖5(D)顯示西方印漬術(Western blotting)的結果，其顯示GW小鼠中5-HT7R蛋白水平增加。在GW小鼠的結腸組織中觀察到5-HT7R的表現上調(圖5(C)及圖5(D))，在平滑肌、腸神經、及黏膜區域有較高的水平(圖5(C))。
在第二個模型中，在第0天結腸內給予小鼠一推注(bolus)的致結腸炎化學物質(colitogenic chemical)TNBS或PBS，並且在各種不同的天數檢查及測量腸道發炎及疼痛。這些動物在給予TNBS後的第7、14及24天表現出增加的腹痛(圖6(A))。然而，結腸發炎指數(諸如髓過氧化酶活性)及組織病理學評分在第2天達到高峰，並在第7天顯示消除(圖6B至圖6D)。因此，將給予TNBS後的第24天用作檢查類IBS內臟過敏反應的時間點。在TNBS小鼠的結腸組織中觀察到5-HT7R的表現上調，在平滑肌、腸神經、及黏膜區域有較高的水平(圖6E及圖6F)。
5-HT 7 R活化參與IBS模型中的內臟過敏反應
為了驗證5-HT7R對於內臟過敏反應的作用以進行概念驗證(proof-of-concept)，將一種推定的用於研究的5-HT7R拮抗劑(SB-269970)腹腔內(i.p.,0.5mg/Kg)注射到該等動物模型中並藉由VMR測量腸痛。透過腹腔內投予SB7顯著地抑制了小鼠的腸痛水平(圖7)。
新穎5-HT 7 R配體的止痛作用
合成具有高結合親和力及水溶性的靶向5-HT7R的新穎8-苯基異喹啉衍生物(化合物I)(化合物6至10，顯示於表8中)。在最初的實驗中，將化合物6至10(5-HT7R配體)以5mg/kg口服(p.o.)投予至GW小鼠以評估對腹痛的抑制作用。在VMR分析之前90分鐘投予5mg/Kg的單劑量。所有測試的化合物均顯示出止痛作用，其中化合物8表現出相對於基線水平最強的腸痛抑制(圖8)。
為了檢查對止痛作用的劑量反應，將化合物8以0.05及0.5mg/kg腹腔內(i.p.)注射、或以1.5及5mg/kg口服(p.o.)注射到GW小鼠。在GW小鼠中觀察到化合物8有劑量依賴性鎮痛作用(圖9A及圖9B)。為了驗證該鎮痛作用是否持久，在疼痛測量之前1.5、4、或12小時向GW小鼠口服投予5mg/kg的CYY1005。在三個時間點觀察到疼痛水平降低(圖9C)。此外，重複投予化合物8(多劑量)也以劑量依賴的方式降低了GW小鼠的腸痛(圖9D)。
向TNBS小鼠口服(p.o.)注射載體(vehicle)或新穎的5-HT7R配體以評估對腹痛的抑制作用。在VMR分析之前90分鐘投予5mg/kg的單劑量。在這些TNBS小鼠中，以單劑量口服投予這些新穎5-HT7R配體可減輕腸 痛(圖10(A))。類似地，以多劑量重複投予化合物8也降低了TNBS小鼠的腸痛(圖10(B))。
比較新穎8-苯基異喹啉衍生物與參考標準物之間的鎮痛作用及不良反應
在兩種動物模型中口服投予化合物I(化合物6至10)與參考標準物以比較彼等之止痛效力。這些化合物及參考標準物包括SB7(一種5-HT7R拮抗劑)、阿洛司瓊(alosetron)(ALN，一種5-HT3R拮抗劑)、及洛哌丁胺(loperamide)(LPM，一種μ型類鴉片受體(μ-opioid receptor)促效劑)，將彼等在疼痛分析前90分鐘以5mg/Kg投予。在GW小鼠中，口服投予ALN減少了腸痛，但與GW小鼠中的化合物8相比效率較低(圖8(A))。另一方面，口服投予SB7及LPM對GW小鼠的腸道痛覺沒有影響(圖11(A))。在第二種動物模型中，投予ALN、SP7、或LPM對TNBS小鼠的腸痛沒有影響(圖11(B))。
所有投予載體或化合物的小鼠均顯示出正常的結腸組織學，除了給予ALN的那些小鼠。在14隻給予ALN的小鼠中，有2隻(14%)在結腸組織中觀察到充血及顆粒性白血球浸潤(圖11(C))。
新近FDA批准的藥物eluxadoline(一種混合的μ型類鴉片促效劑)及rifamixin(一種不可吸收的腸道特異性抗生素)在最近已被加入到IBS-D的治療選擇。這些藥劑代表不同於5-HT7R標靶的分子機制或環境因素。值得注意的是，任何類鴉片促效劑在長期治療後都會造成藥物成癮的風險。與傳統止痛藥(例如非類固醇抗消炎藥及抗膽鹼劑)或抗腹瀉類鴉片促效劑(例如洛哌丁胺(loperamide))相比，此系列8-苯基異喹啉衍生物 (即5-HT7R拮抗劑)是更有利的，因為它們可能外周選擇性地作用於痛覺過敏的腸。
在本發明中，IBS動物模型中的8-苯基異喹啉衍生物(I)(化合物6至10)與阿洛司瓊相比表現出更強的鎮痛作用而沒有副作用，因此它們適用於男性及女性患者，作為IBS治療的新選擇。

Claims (10)

  1. 一種下列通式的化合物或其藥學上可接受的鹽，
    Figure TWI648265B_C0001
    其中R1係(CH2)n(Hete)R10R11R12，其中該n係一1至4的整數，Hete係一芳香雜環基、且R10、R11及R12係獨立選自由氫、鹵基、硝基、胺基、氰基、乙醯基、C1-6直鏈飽和烷基、C1-6直鏈飽和烷氧基及C1-6直鏈飽和鹵烷基所組成之群組；R2係氫或C1-6直鏈飽和烷基；X1、X2及X3係分別選自由氫、鹵基、硝基、胺基、氰基、乙醯基、C1-6直鏈飽和烷基、C1-6支鏈飽和烷基、C1-6直鏈飽和烷氧基、C1-6支鏈飽和烷氧基、C1-6直鏈飽和烷硫基、C1-6支鏈飽和烷硫基、C1-6直鏈飽和鹵烷基及C1-6支鏈飽和鹵烷基所組成之群組；及X4及X5為氫。
  2. 如請求項1之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中該鹵基係選自由氟、氯、溴及碘所組成之群組。
  3. 如請求項1之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中該芳香雜環基係選自由吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、嘧啶基、噻唑基、吲哚基、異吲哚基、吲唑基、苯并呋喃基、異苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并咪唑基、苯并
    Figure TWI648265B_C0002
    唑基及苯并噻唑基所組成之群組。
  4. 如請求項1之化合物或其藥學上可接受的鹽，其係選自6-甲氧-8-(2-甲氧苯基)-2-(3-(吡啶-4-基)丙基)-1,2,3,4-四氫異喹啉-7-醇(化合物8)、6-甲氧-8-(2-甲氧苯基)-2-(3-(吡啶-3-基)丙基)-1,2,3,4-四氫異喹啉-7-醇(化合物9)、及6,7-二甲氧-8-(2-甲氧苯基)-2-(3-(吡啶-4-基)丙基)-1,2,3,4-四氫異喹啉(化合物10)。
  5. 如請求項1之化合物或其藥學上可接受的鹽，其係6-甲氧-8-(2-甲氧苯基)-2-(3-(吡啶-4-基)丙基)-1,2,3,4-四氫異喹啉-7-醇(化合物8)。
  6. 一種醫藥組合物，其包含藥學上可接受的載體及治療有效量的如請求項1、2、3、4、或5之化合物或其藥學上可接受的鹽。
  7. 一種醫藥組合物用於製備用於治療腸躁症候群之藥物的用途，其中該醫藥組合物係請求項6之醫藥組合物。
  8. 如請求項7之用途，其中該腸躁症候群係藉由提供對5-HT7受體的拮抗作用來治療。
  9. 如請求項7之用途，其中該腸躁症候群係藉由抑制由感染及之後的壓力所引起的疼痛來治療。
  10. 如請求項7之用途，其中該腸躁症候群係藉由抑制由化學誘導的發炎所引起的疼痛來治療。
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