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TWI532991B - 檢測可減脂化合物之方法 - Google Patents

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TWI532991B
TWI532991B TW101150219A TW101150219A TWI532991B TW I532991 B TWI532991 B TW I532991B TW 101150219 A TW101150219 A TW 101150219A TW 101150219 A TW101150219 A TW 101150219A TW I532991 B TWI532991 B TW I532991B
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insulin
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古惠珍
張欣蕙
郭佑啟
崔以威
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國立中央大學
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    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
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Description

檢測可減脂化合物之方法
本發明係關於一種檢測可減脂化合物之方法,特別是關於一種藉由細胞內特定蛋白質的表現量檢測食品或食品添加物所含之化合物的方法。
臨床證實,肥胖是一種常見的疾病,與癌症、糖尿病、高血壓以及心血管疾病都有相關。根據研究指出,肥胖是第二型糖尿病的危險因子,會造成胰島素抗性(insulin resistance)。依據醫學研究的結果顯示內分泌及營養都會影響到對肥胖的調節作用,其中第一型及第二型類胰島素生長因子(insulin-like growth factor I/II,IGF-I/II)在脂肪前驅細胞(pre-adipocytes)分化時期時,刺激脂肪前驅細胞進行增生(proliferation)及脂肪形成(adipogenesis),進而使已分化的脂肪細胞成熟,並抑制脂肪的分解作用及增加對葡萄糖的攝取。
再者,世界衛生組織(World Health Organization,WHO)及美國食品藥物管理局(Food and Drug Administration,FDA)已經於1996年將肥胖列為慢性疾病之一,強調「維持理想體重」之重要性。相對於先天的基因性肥胖症,多數的醫學及衛生專家認為,經由後天的減脂飲食管理,以減少脂肪囤積,即可有效降低因肥胖引發的慢性病發生率,而讓個人達到有效的健康管 理及對慢性病的預防。
一般來說,造成肥胖的關鍵多由飲食引起,因此減少過度熱量的攝取已成為目前控制體重的主要方法。事實上,在食物或食品添加物所含的化合物中,存在有可調節脂肪細胞以減少對葡萄糖的攝取,而可應用於改善肥胖產生的問題。然而,相關食品衛生檢驗單位或食品工業卻未曾對此部分的食物、食品添加物或藥品中的化合物提出具體的檢測方法。
故,有必要提供一種檢測方法,用以檢測飲食或藥品中可調節脂肪細胞減少對葡萄糖攝取的化合物,以利健康體重的管理。
本發明之主要目的在於提供一種檢測可減脂化合物之方法,其係利用細胞內一特定蛋白質表現量,來檢測一待測化合物是否具備可調節或減少脂肪細胞對葡萄糖攝取能力,以利食品衛生之檢驗及標示,進而應用該化合物及其產品,達到健康體重管理之目的。
本發明之次要目的在於提供一種檢測可減脂化合物之方法,其係利用細胞內一特定蛋白質轉位(translocation)至細胞膜上的表現量,來檢測一待測化合物是否具備可調節或減少脂肪細胞對葡萄糖攝取能力,以利食品工業或減脂藥物之產品應用,進而達到健康減脂之目的。
為達上述之目的,本發明一實施例提供一種檢測可減脂化合物之方法,其步驟包含:提供一脂肪細胞株,培養於一培養皿上;加入一待測化合物之稀釋液於該培養皿內,並持續一第一時間;加入一類胰島素生長因子於該培養皿內,並持續一第二時間;及收集該脂肪細胞,以檢測該脂肪細胞內至少一特定蛋白質之表現量,以作為該待測化合物減少脂肪或減少葡萄糖運送之參考值。
在本發明之一實施例中,該待測化合物為一食品添加物、一食品或一藥物,該稀釋液之溶劑為0.9重量%氯化鈉溶液、磷酸緩衝液、二甲基亞碸(DMSO)或甲醇。
在本發明之一實施例中,該第一時間為30分鐘至120分鐘;及該第二時間為5分鐘至30分鐘。
在本發明之一實施例中,該類胰島素生長因子選自一第一型或第二型人類類胰島素生長因子之至少一種。
在本發明之一實施例中,該脂肪細胞為3T3-L1脂肪前驅細胞分化而成之細胞。
在本發明之一實施例中,該特定蛋白質係選自葡萄糖轉運子4(GLUT4)蛋白質及層黏素受體(67LR)蛋白質。
本發明一實施例另提供一種檢測可減脂化合物之方法,其步驟包含: 提供一脂肪細胞株,培養於一培養皿上;加入一待測化合物之稀釋液於該培養皿內,並持續一第一時間;加入一第一型及第二型人類類胰島素生長因子於該培養皿內,並持續一第二時間;及收集該脂肪細胞,以檢測該脂肪細胞膜上一特定蛋白質之表現量,以作為該待測化合物減少脂肪或減少葡萄糖運送之參考值。
在本發明之一實施例中,該脂肪細胞為3T3-L1脂肪前驅細胞分化而成之細胞。
在本發明之一實施例中,該待測化合物為綠茶唲茶素(EGCG)。
在本發明之一實施例中,該特定蛋白質為葡萄糖轉運子4(GLUT4)蛋白質。
為了讓本發明之上述及其他目的、特徵、優點能更明顯易懂,下文將特舉本發明較佳實施例,並配合所附圖式,作詳細說明如下。再者,本發明所提到的方向用語,例如上、下、頂、底、前、後、左、右、內、外、側面、周圍、中央、水平、橫向、垂直、縱向、軸向、徑向、最上層或最下層等,僅是參考附加圖式的方向。因此,使用的方向用語是用以說明及理解本發明,而非用以限制本發明。
請參照第1圖所示,本發明第一實施例之檢測可減脂化合物之方法主要包含下列步驟:(S1)、提供一脂肪細胞株,培養於一培養皿上;(S2)、加入一待測化合物之稀釋液於該培養皿內,並持續一第一時間;(S3)、加入一類胰島素生長因子於該培養皿內,並持續一第二時間;及(S4)、收集該脂肪細胞,以檢測該脂肪細胞內至少一特定蛋白質之表現量,以作為該待測化合物減少脂肪或減少葡萄糖運送之參考值。本發明將於下文利用第2至6圖逐一詳細說明一較佳實施例之上述各步驟的實施細節及其原理。
請再參照第1圖所示,本發明第一實施例之檢測可減脂化合物之方法首先係:(S1)、取得一脂肪細胞株,培養於一培養皿上。在本步驟中,該脂肪細胞株為3T3-L1脂肪前驅細胞株(pre-adipocyte strain),以6x104 cells/plate的密度種植於無菌12-孔盤(12-wells plate)上。該脂肪細胞種植後第三天更換培養液,於第五天加入一分化劑(加入該分化劑當天設定為第0天的分化細胞)。該培養液為含有10重量%胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)的改良Eagle’s培養液(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium,DMEM),而該分化劑的配製則是於上述培養一中加入0.5 mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-Isobutyl-1-methylxanthine,IBMX)、5 μg/ml胰島素(Insulin)及1 μM地塞米松(Dexamethasone,DEX)。該細胞於加入分化劑兩天後,換置含有5 μg/ml胰島素及10 重量%胎牛血清的改良Eagle’s培養液進行培養。之後,每兩天更換一次上述之培養液,並於第六天開始,將分化中的該細胞培養於只含有10重量%胎牛血清的改良Eagle培養液中。接著,每兩天更換一次該培養液,直到該細胞分化到第十天,始可進行本發明實施例中之例示性實驗。
請參照第2A及2B圖所示,本發明第一實施例之檢測可減脂化合物之方法接著係:(S2)、加入一待測化合物之稀釋液於該細胞培養皿內,並持續一第一時間;及(S3)加入一類胰島素生長因子於該培養皿內,並持續一第二時間。在步驟(S2)中,該待測化合物之稀釋液係以綠茶唲茶素((-)-epigallocatechin gallate,EGCG)之二甲基亞碸(DMSO)稀釋液作為本發明例示性實施例之應用,但不限於此,例如該稀釋液之溶劑亦可為0.9重量%氯化鈉溶液、磷酸緩衝液或甲醇。本發明第一實施例以葡萄糖攝取試驗(2-Deoxyglucose uptake assay)來測量該脂肪細胞內葡萄糖運輸蛋白(glucose transporter)之運送能力,用以釐清不同濃度之綠茶唲茶素對第一型類胰島素生長因子(Insulin-like growth factor-I,IGF-I)及第二型類胰島素生長因子(Insulin-like growth factor-II,IGF-II)引起葡萄糖攝取的影響。
首先,於該脂肪細胞中加入不同濃度之綠茶唲茶素,例如1、2、5、10、20及50 μM,並以120分鐘作為一第一時間之前處理(pre-treatment),其中,該第一 時間為30分鐘至120分鐘,但不限於此。再以10 nM第一型類胰島素生長因子(IGF-I)或第二型類胰島素生長因子(IGF-II)處理10分鐘作為一第二時間,其中,該第二時間為5分鐘至30分鐘,但不限於此。接著,以30 nM的2-[1,2-3H]-deoxy-D-glucose(2-DOG)處理30分鐘。之後,加入1毫升(ml)的冰KRPH緩衝液(Krebs Ringer Phosphate Hepes),以終止細胞內葡萄糖的攝取,並以冰KRPH緩衝液清洗該細胞兩次,移除清洗液後加入500微升(μl)的RIPA緩衝液(RadioImmunoPrecipitation Assay)以打破該細胞。最後,取出450微升(μl)細胞液並加入4毫升(ml)的閃爍液(scintillation liquid)混合均勻,再利用β-counter測量出放射線含量。
如第2A圖所示,本發明第一實施例中僅以上述不同濃度之綠茶唲茶素(EGCG)進行前處理,而未加入第一型類胰島素因子(IGF-I)於該脂肪細胞,則該脂肪細胞之葡萄糖攝取量僅在50μM綠茶唲茶素(EGCG)的作用下,有明顯的減少。然而,以上述不同濃度之綠茶唲茶素(EGCG),進行前處理2小時後,加入第一型類胰島素因子(IGF-I)於該脂肪細胞10分鐘,則在該脂肪細胞中,原本大量增加的葡萄糖攝取量於10、20及50μM綠茶唲茶素(EGCG)的作用下顯著減少。另外,如第2B圖所示,本發明第一實施例中僅以上述不同濃度之綠茶唲茶素(EGCG),進行前處理,而未加入第二型類胰島 素因子(IGF-II)於該脂肪細胞,該脂肪細胞之葡萄糖攝取量僅在50 μM綠茶唲茶素(EGCG)的作用下,有明顯的減少。然而,以上述不同濃度之綠茶唲茶素(EGCG),進行前處理後,加入第二型類胰島素因子(IGF-II)於該脂肪細胞,則在該脂肪細胞中,原本大量增加的葡萄糖攝取量於20μM及50μM綠茶唲茶素(EGCG)的作用下顯著減少。因此,依據本發明第一實施例之結果,本發明後續實施例以20μM綠茶唲茶素(EGCG)作為前處理該脂肪細胞之該待測化合物稀釋液之濃度。
請參照第3A及3B圖所示,在本發明第二實施例中,以葡萄糖攝取試驗(2-Deoxyglucose uptake assay)來測量該脂肪細胞內葡萄糖運輸蛋白(glucose transporter)之運送能力,用以釐清在不同時間的前處理,綠茶唲茶素對第一型類胰島素生長因子(Insulin-like growth factor-I,IGF-I)及第二型類胰島素生長因子(Insulin-like growth factor-II,IGF-II)引起葡萄糖攝取的影響。因此,在本發明第二實施例之方法係相似於本發明第一實施例,其差異在於:該脂肪細胞以20μM綠茶唲茶素(EGCG)前處理不同時間後,例如0.5、1、2及4小時,加入10nM第一型類胰島素生長因子(IGF-I)或第二型類胰島素生長因子(IGF-II)處理10分鐘,再對該脂肪細胞進行葡萄糖攝取試驗(2-Deoxyglucose uptake assay)來測量該脂肪細胞內葡萄糖運輸蛋白(glucose transporter)之運送能力。
如第3A圖所示,在本發明第二實施例中,則該脂肪細胞之葡萄糖攝取量以20μM綠茶唲茶素(EGCG)前處理0.5小時後,即有明顯的減少,並於處理2小時後,該脂肪細胞之葡萄糖攝取量與未加入第一型類胰島素因子(IGF-I)之控制組相同。同樣地,如第3B圖所示,則該脂肪細胞之葡萄糖攝取量以20μM綠茶唲茶素(EGCG)前處理0.5小時後,即有明顯的減少,且於處理2小時後,該脂肪細胞之葡萄糖攝取量與未加入第二型類胰島素因子(IGF-II)之控制組相同。因此,依據本發明第一及第二實施例之結果,該脂肪細胞以20μM綠茶唲茶素(EGCG)前處理2小時,接著以10nM第一型類胰島素生長因子(IGF-I)或第二型類胰島素生長因子(IGF-II)處理10分鐘,則該脂肪細胞之葡萄糖攝取量可回復到正常狀態。
請參照第4A及4B圖所示,在本發明第三實施例之檢測可減脂化合物之方法中,為釐清該脂肪細胞之細胞膜上不同的受體(receptor)對該脂肪細胞之葡萄糖攝取量的影響。本發明第三實施例之方法係相似於本發明第二實施例,其差異在於:該脂肪細胞以20μM綠茶唲茶素(EGCG)前處理之前,先以2μg/ml的正常兔子(normal rabbit)免疫球蛋白G(Immunoglobulin G,IgG)抗體或層黏素受體(67-kDa Laminin Receptor,67LR)抗體預先處理1小時。之後,加入10 nM第一型類胰島素生長因子(IGF-I)或第二型類胰島素生長因子(IGF-II)處理10分 鐘,再對該脂肪細胞進行葡萄糖攝取試驗(2-Deoxyglucose uptake assay)來測量該脂肪細胞內葡萄糖運輸蛋白(glucose transporter)之運送能力。
如第4A及4B圖所示,在本發明第三實施例中,以正常兔子(normal rabbit)免疫球蛋白G(Immunoglobulin G,IgG)抗體,再以20μM綠茶唲茶素(EGCG)進行前處理後,則無論加入第一型類胰島素生長因子(IGF-I)或第二型類胰島素生長因子(IGF-II),皆抑制了該脂肪細胞之葡萄糖攝取量。然而,以層黏素受體(67LR)抗體預先處理該脂肪細胞1小時,再以20μM綠茶唲茶素(EGCG)進行前處理後,則該脂肪細胞之葡萄糖攝取量與未加入20μM綠茶唲茶素(EGCG)相同。因此,依據上述之結果,綠茶唲茶素(EGCG)抑制第一型類胰島素生長因子(IGF-I)或第二型類胰島素生長因子(IGF-II)處理所增加該脂肪細胞之葡萄糖攝取量,是透過該脂肪細胞之層黏素受體(67LR)的作用。
請參照第5A、5B、5C、6A、6B及6C圖所示,在本發明第四實施例之檢測致肥胖化合物之方法接著係:(S4)、收集該脂肪細胞,以檢測該脂肪細胞內至少一特定蛋白質之表現量,以做為該待測化合物導致肥胖(或增加葡萄糖運送)之參考值。在本發明第四實施例中,該特定蛋白質為葡萄糖轉運子1(GLUT1)蛋白質及葡萄糖轉運子4(GLUT4)蛋白質,且該實施例是以西方點墨法(Western blot)分析該脂肪細胞在全蛋白質(total lysate)、漿膜蛋白質(plasma membrane)及低密度微體(low-density microsome)中,葡萄糖轉運子1(GLUT1)蛋白質及葡萄糖轉運子4(GLUT4)蛋白質的表現量。第5A、5B及5C圖係加入第一型類胰島素生長因子(IGF-1);第6A、6B及6C圖係加入第二型類胰島素生長因子(IGF-2)。
如第5A及6A圖所示,在該脂肪細胞之全蛋白質(total lysate)中,葡萄糖轉運子1(GLUT1)蛋白質及葡萄糖轉運子4(GLUT4)蛋白質的表現量並無差異。並且,如第5B、5C、6B及6C圖所示,在該脂肪細胞之漿膜蛋白質(plasma membrane)及低密度微體(low-density microsome)中,無論是否以20μM綠茶唲茶素(EGCG)進行前處理,葡萄糖轉運子1(GLUT1)蛋白質的表現量皆無明顯變化。然而,如第5B及6B圖所示,在該脂肪細胞之漿膜蛋白質(plasma membrane)中,僅加入10nM第一型類胰島素生長因子(IGF-I)或第二型類胰島素生長因子(IGF-II),葡萄糖轉運子4(GLUT4)蛋白質的表現量呈現明顯增加;但以20μM綠茶唲茶素(EGCG)進行前處理後,則可抑制由第一型類胰島素生長因子(IGF-I)或第二型類胰島素生長因子(IGF-II)所引起的葡萄糖轉運子4(GLUT4)蛋白質之表現量。
接著,如第5C及6C圖所示,僅加入10nM第一型類胰島素生長因子(IGF-I)或第二型類胰島素生長因子(IGF-II)於該脂肪細胞之低密度微體(low-density microsome)中,相對於漿膜蛋白質(plasma membrane),則葡萄糖轉運子4(GLUT4)蛋白質的表現量明顯減少,顯示原本位於該脂肪細胞細胞質中的葡萄糖轉運子4(GLUT4)蛋白質轉位(translocation)至該脂肪細胞的漿膜上。也因此,以20μM綠茶唲茶素(EGCG)進行前處理後,抑制了該脂肪細胞細胞質中的葡萄糖轉運子4(GLUT4)蛋白質之轉位(translocation)作用。
藉由上述實施例之說明,本發明之檢測可減脂化合物之方法,其步驟揭示以分析該已分化的脂肪細胞之層黏素受體(67LR)及葡萄糖轉運子4(GLUT4)蛋白質之轉位(translocation)作用,來檢測食物、食品添加物或藥物中是否具有可減少對葡萄糖攝取的化合物,用以作為食品衛生之檢驗及食品工業之產品標示,進而作為減脂食品或減脂藥物,以實現健康減脂之目的。
雖然本發明已以較佳實施例揭露,然其並非用以限制本發明,任何熟習此項技藝之人士,在不脫離本發明之精神和範圍內,當可作各種更動與修飾,因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
S1-S4‧‧‧步驟
第1圖:本發明第一實施例之檢測可減脂化合物之方法之步驟流程圖。
第2A及2B圖:本發明第一實施例之檢測可減脂化合物之方法之葡萄糖攝取試驗(2-DOG)分析圖。
第3A及3B圖:本發明第二實施例之檢測可減脂化合物之方法之葡萄糖攝取試驗(2-DOG)分析圖。
第4A及4B圖:本發明第三實施例之檢測可減脂化合物之方法之葡萄糖攝取試驗(2-DOG)柱狀圖。
第5A、5B及5C圖:本發明第四實施例之檢測可減脂化合物之方法,以西方點墨法偵測蛋白質表現量之柱狀圖。
第6A、6B及6C圖:本發明第四實施例之檢測可減脂化合物之方法,以西方點墨法偵測蛋白質表現量之柱狀圖。
S1-S4‧‧‧步驟

Claims (7)

  1. 一種檢測可減脂化合物之方法,其步驟包含:提供一脂肪細胞株,培養於一培養皿上;加入一待測化合物之稀釋液於該培養皿內,並持續一第一時間;加入一類胰島素生長因子於該培養皿內,並持續一第二時間;及收集該脂肪細胞,以檢測該脂肪細胞內至少一特定蛋白質之表現量,並藉由檢測該脂肪細胞內該特定蛋白質轉位至該脂肪細胞之細胞膜上的表現量,以做為該待測化合物減少脂肪或減少葡萄糖運送之參考值,其中該特定蛋白質係選自葡萄糖轉運子4(GLUT4)蛋白質,其中該待測化合物為綠茶唲茶素(EGCG)。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之檢測可減脂化合物之方法,其中該待測化合物為一食品添加物、一食品或一藥物,該稀釋液之溶劑為0.9重量%氯化鈉溶液、磷酸緩衝液、二甲基亞碸或甲醇。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之檢測可減脂化合物之方法,其中該第一時間為30分鐘至120分鐘;及該第二時間為5分鐘至30分鐘。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之檢測可減脂化合物之方法,其中該類胰島素生長因子選自一第一型或第二型人類類胰島素生長因子之至少一種。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之檢測可減脂化合物之方法,其中該脂肪細胞為3T3-L1脂肪前驅細胞分化而成之細胞。
  6. 一種檢測可減脂化合物之方法,其步驟包含:提供一脂肪細胞株,培養於一培養皿上;加入一待測化合物之稀釋液於該培養皿內,並持續一第一時間;加入一第一型或第二型人類類胰島素生長因子於該培養皿內,並持續一第二時間;及收集該脂肪細胞,以檢測該脂肪細胞膜上一特定蛋白質之表現量,並藉由檢測該脂肪細胞內該特定蛋白質轉位至該脂肪細胞之細胞膜上的表現量,以做為該待測化合物減少脂肪或減少葡萄糖運送之參考值,其中該特定蛋白質係選自葡萄糖轉運子4(GLUT4)蛋白質,其中該待測化合物為綠茶唲茶素(EGCG)。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之檢測可減脂化合物之方法,其中該脂肪細胞為3T3-L1脂肪前驅細胞分化而成之細胞。
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