TWI516591B

TWI516591B - 乳酸桿菌、其組成物及其用途

Info

Publication number: TWI516591B
Application number: TW103120467A
Authority: TW
Inventors: 蔡英傑; 吳健誠; 彭武舜; 周庚鋌; 鍾明娟; 蔡蕙嬪
Original assignee: 聯亞益生生物科技股份有限公司
Priority date: 2014-06-13
Filing date: 2014-06-13
Publication date: 2016-01-11
Also published as: TW201546274A

Description

乳酸桿菌、其組成物及其用途

本發明係關於一種乳酸桿菌，尤其是關於一種具有抑制轉糖鏈球菌形成生物膜的新穎乳酸桿菌菌株。

人類的口腔中具有相當複雜的微生物相，而許多研究顯示，齲齒及牙周病等口腔疾病的產生皆與口腔中微生物相的變化有關。自然界中微生物多以生物膜(biofilm)的型態生存，形成生物膜有助於細菌的固著、菌落形成(colonization)、抵抗外界環境壓力及宿主免疫系統攻擊等。在口腔中，細菌也是以多物種的生物膜型態存活，而其中造成齲齒的主要病原菌-轉糖鏈球菌(Streptococcus mutans)，則會在牙齒的表面形成致病性的生物膜，也就是所謂的牙菌斑(dental plaque)，接著破壞口腔中菌相及其代謝能力的平衡、酸化周圍環境來抑制其他口腔細菌生長，最後對牙齒產生酸蝕作用而形成齲齒。轉糖鏈球菌主要藉由產生糖苷轉化酶B(glucosyltransferase B，簡稱GtfB)與糖苷轉化酶C(glucosyltransferase C，簡稱GtfC)，將口腔中的蔗糖轉化為不可溶的胞外多醣(exopolysaccharide，簡稱EPS)，以作為生物膜的主要構成物。目前許多具有口腔保健功效的天然物已被證實係藉由抑制轉糖鏈球菌生長以及其生物膜形成，來預防齲齒產生。而近年來許多研究也指出，使用益生菌(probiotic)產品可降低口腔中轉糖鏈球菌的數量、抑制牙菌斑的形成，進而達到預防齲齒的功效。

一種乳酸桿菌，係唾液乳酸桿菌唾液亞種(Lactobacillus salivarius subsp.salivarius)。

唾液乳酸桿菌唾液亞種K43(以下簡稱K43)已於2014年4月8日寄存於食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心，並取得該中心所給予的登錄號BCRC 910616。此生物材料已進行並通過存活性測試。

本發明進一步提供一種組成物，其係包含K43(亦即，唾液乳酸桿菌唾液亞種K43)及其載體。

於本發明之一具體實施例中，該組成物係用於抑制轉糖鏈球菌形成生物膜。

於本發明之一具體實施例中，K43係藉由抑制轉糖鏈球菌之生長而抑制轉糖鏈球菌形成生物膜。

於本發明之一具體實施例中，該組成物係用於抑制轉糖鏈球菌表現糖苷轉化酶的活性。

於本發明之一具體實施例中，該糖苷轉化酶係選自糖苷轉化酶B(glucosyltransferase B)及糖苷轉化酶C(glucosyltransferase C)所組成群組之至少一者。

於本發明之一具體實施例中，該轉糖鏈球菌形成生物膜與口腔疾病有關。

本發明復提供一種使用該K43在製備用於治療或預防口腔疾病之醫藥組成物的用途。

此外，前述該口腔疾病係齲齒或牙周病。

本發明之唾液乳酸桿菌可抑制轉糖鏈球菌表現GtfB及GtfC糖苷轉化酶之活性，以有效抑制轉糖鏈球菌生長及生物膜的形成，適合用於開發用於治療或預防口腔疾病之醫藥組成物或口腔保健產品。

第1圖係顯示以重複性序列基礎聚合酶連鎖反應技術(repetitive sequence-based polymerase chain reaction，簡稱rep-PCR)分析唾液乳酸桿菌的基因體指紋圖譜(genomic fingerprinting)；(A)表示腸細菌基因間共有重複序列PCR(以下簡稱ERIC-PCR)之指紋圖譜；(B)表示BOX-PCR之指紋圖譜；(C)表示(GTG)₅-PCR之指紋圖譜；其中，M排代表DNA片段大小標記(marker)(100至3000個鹼基對)；第1排代表唾液乳酸桿菌唾液亞種K35；第2排代表唾液乳酸桿菌唾液亞種K43；第2圖係顯示生物膜形成活性評估；(A)單一菌種的生物膜形成活性，結果顯示雷曼式乳酸桿菌(Lactobacillus rhamnosus)GG(簡稱LGG)比K43具有較高的生物膜形成活性；(B)共培養生物膜形成活性，Sm代表轉糖鏈球菌，*p<0.01表示具有顯著性差異；第3圖係顯示掃描式電子顯微鏡(scanning electron microscope，簡稱SEM)之觀察影像(放大倍率3000倍)。(A)表示轉糖鏈球菌單獨存在時，(B)表示轉糖鏈球與K43共同培養時；(C)表示轉糖鏈球菌與LGG共同培養時；其中，Sm代表轉糖鏈球菌、K43代表唾液乳酸桿菌唾液亞種K43及LGG代表雷曼式乳酸桿菌GG；第4圖係顯示在生物膜共培養實驗下，K43可抑制轉糖鏈球菌的生長。其中，Sm代表轉糖鏈球菌、K43代表唾液乳酸桿菌唾液亞種K43、LGG代表雷曼式乳酸桿菌GG及hk-LGG代表熱失活之LGG；第5圖係顯示以定量即時聚合酶連鎖反應(quantitative real-time PCR，以下簡稱qRT-PCR)評估轉糖鏈球菌(Sm)之GtfB與GtfC之基因表現。其中，K43代表唾液乳酸桿菌唾液亞種K43、LGG代表雷曼式乳酸桿菌GG及hk-LGG代表熱失活之LGG，*p<0.01表示具有顯著性差異。

以下係藉由特定的具體實施例說明本發明之實施方式，熟習此專業之人士可由本說明書所揭示之內容輕易地瞭解本發明之優點及功效。本發明亦可藉由其它不同之實施方式加以施行或應用，本說明書中的各項細節亦可基於不同觀點與應用，在不悖離本發明所揭示之精神下賦予不同之修飾與變更。

除非文中另有說明，否則說明書及所附申請專利範圍中所使用之單數形式「一」及「該」包括複數個體。

除非文中另有說明，否則說明書及所附申請專利範圍中所使用之術語「或」包括「及/或」之含義。

一種乳酸桿菌K43，其係經分離之乳酸桿菌菌株。乳酸桿菌K43已寄存於食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心，寄存編號為BCRC 910616。

該乳酸桿菌K43(文中有時稱K43或唾液乳酸桿菌唾液亞種K43)為新穎的乳酸桿菌菌株。根據菌種鑑定的結果，乳酸桿菌K43為唾液乳酸桿菌唾液亞種之新穎菌株。

根據本發明之一具體實施例，唾液乳酸桿菌唾液亞種K43，或含有該唾液乳酸桿菌唾液亞種K43的組成物，可用於抑制轉糖鏈球菌(Streptococcus mutans)形成生物膜。

根據本發明之一具體實施例，唾液乳酸桿菌唾液亞種K43，或含有該唾液乳酸桿菌唾液亞種K43的組成物，可藉由抑制該轉糖鏈球菌之生長而抑制轉糖鏈球菌形成生物膜。

根據本發明之一具體實施例，唾液乳酸桿菌唾液亞種K43，或含有該唾液乳酸桿菌唾液亞種K43的組成物，可用於抑制該轉糖鏈球菌表現糖苷轉化酶的活性。於一實例中，唾液乳酸桿菌唾液亞種K43，或含有該唾液乳酸桿菌唾液亞種K43的組成物，能抑制糖鏈球菌表現糖苷轉化酶B及/或糖苷轉化酶C的活性。

根據本發明之一具體實施例，唾液乳酸桿菌唾液亞種K43，或含有該唾液乳酸桿菌唾液亞種K43的組成物，可藉由抑制該轉糖鏈球菌之生長，或抑制該轉糖鏈球菌表現糖苷轉化酶的活性，以抑制轉糖鏈球菌形成生物膜。該轉糖鏈球菌形成生物膜係與口腔疾病(例如，但不限於：齲齒或牙周病)有關。

含有寄存編號為BCRC 910616之唾液乳酸桿菌唾液亞種K43的組成物，可為任何形式(例如固體、液體、混合物或其他形式)。

含有該唾液乳酸桿菌唾液亞種K43的組成物可為，例如醫藥組成物或食品。含有該唾液乳酸桿菌唾液亞種K43的組成物中，可包含生理上可接受的載劑，例如，但不限於：醫藥上可接受之載劑。本文中，「生理上可接受之載劑」係指不會干擾生理活性及所投予組成物的性質且不刺激個體的載劑或稀釋劑。舉例而言，用於固體形式之組成物時，生理上可接受之載劑可包括黏結劑、潤滑劑、崩散劑、賦形劑、增溶劑、分散劑、安定劑、懸浮劑、著色劑及香料；用於液體形式之組成物時，生理上可接受之載劑可包括緩衝劑、保藏劑、止痛劑、增溶劑、等張劑及安定劑。

含有該唾液乳酸桿菌唾液亞種K43的組成物中也可進一步包含添加劑，例如：防腐劑、抗氧化劑、著色劑、甜味劑等。

含有該唾液乳酸桿菌唾液亞種K43的組成物中亦可進一步包含其他益生菌，亦可與其他益生菌/益生菌衍生物並用。

寄存編號為BCRC 910616之唾液乳酸桿菌唾液亞種K43的組成物，可用於製備治療或預防口腔疾病之醫藥組成物。

根據本發明之一具體實施例，該醫藥組成物係藉由抑制轉糖鏈球菌形成生物膜，以治療或預防口腔疾病(例如，預防、改善或減輕口腔疾病之症狀)。上述口腔疾病係與轉糖鏈球菌形成生物膜有關之疾病，例如，但不限於：齲齒或牙周病。

使用唾液乳酸桿菌唾液亞種K43預防或治療口腔疾病的方法，包括對個體投予有效量的唾液乳酸桿菌唾液亞種K43 BCRC 910616。

實施例

本發明將藉由下列實施例更具體地說明，但該等實施例並非用於限制本發明之範疇。

菌株及其培養

轉糖鏈球菌ATCC25175及雷曼式乳酸桿菌(Lactobacillus rhamnosus)GG(以下簡稱LGG)係購自生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center，簡稱BCRC)；唾液乳酸桿菌唾液亞種K43係單離自人類唾液。K43係培養於deMan、Rogosa、Sharpe培養液(簡稱MRS)，而轉糖鏈球菌係培養於腦心浸萃培養液(brain heart infusion，簡稱BHI)(其BHI含有1.75微克/毫升(μg/ml)多黏菌素B(polymyxin B)、0.3U/ml枯草桿菌素(bacitracin)以及0.005%結晶紫(crystal violet))(購自BD Difco，MD，USA)。所有菌株均係在37℃之厭氧環境下(10% CO₂-10% H₂-80% N₂)培養20小時。

統計分析

本發明之各實驗均重複3次，且所呈現的實驗數據均表示為平均值±標準偏差。數值之間的差異係以Prism5軟體(GraphPad)進行單因子變異數分析(one-way ANOVA)，隨後再由Bonferroni事後比較檢定修正(Bonferroni post hoc correction)，當P值<0.01時認定為統計上顯著。

實施例1 唾液乳酸桿菌唾液亞種K43的單離及菌種鑑定

1. 16S rDNA定序：自人類唾液中單離出唾液乳酸桿菌唾液亞種K43(簡稱K43)，再以PCR提取該基因體中之16S核醣體DNA(ribosomal DNA，以下簡稱rDNA)(SEQ ID NO：1)，加入美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information，簡稱NCBI)(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)在網路上提供的序列比對軟體，進行人工序列比對。如表1結果顯示，K43屬於唾液乳酸桿菌唾液亞種。

2. 碳水化合物代謝活性分析：利用API 50 CHL試劑來檢驗K43的碳水化合物代謝活性，藉以鑑定K43在屬或種上的差異。如表2之結果所示，K43與唾液乳酸桿菌唾液亞種之碳水化合物代謝活性相似，故鑑定出K43為唾液乳酸桿菌唾液亞種。

3. 重複性序列基礎聚合酶連鎖反應分析K43的基因體指紋圖譜：以三種不同的rep-PCR技術來鑑別二種不同的唾液乳酸桿菌唾液亞種K35及K43之基因體指紋圖譜。該三種不同的rep-PCR技術包括腸細菌基因間共有重複序列PCR(enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR，以下簡稱ERIC-PCR)、BOX-PCR以及(GTG)₅-PCR，其所使用的引子如表3所示。

ERIC-PCR之反應試劑係如表4所示，且其反應條件係如下：95℃反應2分鐘後，進行94℃反應30秒、50℃反應1分鐘、65℃反應5分鐘，共35個循環，最後以65℃反應4分鐘以進行延伸反應(elongation)。

BOX-PCR之反應試劑係如表5所示，其反應條件係如下：95℃反應2分鐘後，進行94℃反應1分鐘、52℃反應1分鐘、65℃反應4分鐘，共35個循環，最後以65℃反應2分鐘以進行延伸反應。

(GTG)₅-PCR之反應試劑係如表5所示，其反應條件係如下：94℃反應5分鐘後，進行94℃反應30秒、45℃反應1分鐘、65℃反應6分鐘，共35個循環，最後以65℃反應10分鐘以進行延伸反應。之後，將上述各PCR產物分別以1.5%瓊脂糖凝膠(agarose gel)電泳分離。

如第1圖所示，綜合三種rep-PCR技術，可發現與唾液乳酸桿菌唾液亞種K35相比，K43具有獨特的基因體指紋圖譜。其中，第1排代表唾液乳酸桿菌唾液亞種K35；第2排代表唾液乳酸桿菌唾液亞種K43(簡稱K43)，其結果顯示K43的擴增產物與其他菌株有不同的型樣。

唾液乳酸桿菌唾液亞種K43已於2014年4月8日寄存於食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心，並取得該中心所給予的登錄號BCRC 910616。此生物材料已進行並通過存活性測試。

實施例2 K43抑制轉糖鏈球菌形成生物膜

本實施例利用共培養乳酸桿菌(包括K43及LGG)及轉糖鏈球菌以測試K43對於轉糖鏈球菌生物膜形成之影響，並進一步測試K43是否藉由改變該共培養系統中之pH值而影響轉糖鏈球菌生物膜之形成。取出隔夜培養至生長平穩期(stationary phase)的K43、LGG與轉糖鏈球菌，分別調整其菌液之OD₆₀₀吸光值至1，而後以含有0.2%蔗糖之BHI培養液分別進行100倍稀釋，並再分別取出稀釋之K43菌液、LGG菌液、轉糖鏈球菌之菌液、K43與轉糖鏈球菌之混和菌液、LGG與轉糖鏈球菌之混和菌液，並以不含菌液者做為控制組，置於聚苯乙烯盤中(polystyrene plate)(Coring Inc.Costar，NY，USA)，於37℃之厭氧環境(10% CO₂，10% H₂，80% N₂)培養24小時。之後移除培養上清液，以去離子水清洗一次後，加入0.1%番紅染劑(safranin)對黏附於培養盤底部之生物膜進行30分鐘染色。而後移除染劑，以去離子水清洗三次後風乾，再加入33%醋酸溶液以溶解染劑，並以微量滴定盤吸光值讀取儀(microtiter plate absorbance reader)(Tecan，San Jose，CA)測定OD492吸光值以進行定量。將LGG與轉糖鏈球菌之共培養係作為對照組，LGG為一廣泛作為益生菌使用之菌株，臨床實驗亦證實其具有抗齲齒之功效。

如第2圖(A)之結果顯示，在單一菌種的生物膜形成實驗中，相較於LGG，K43並不具有明顯的生物膜形成活性。而在共培養實驗中，相較於轉糖鏈球菌單獨存在時，K43與轉糖鏈球菌共培養會造成生物膜之形成下降至約30.4%，而如第2圖(B)之結果顯示，將LGG與轉糖鏈球菌共培養時，則會造成生物膜之形成下降至約76%。此結果表示K43具有較佳的抑制轉糖鏈球菌形成生物膜能力，而K43本身並不具有顯著的生物膜形成活性。

本發明另以SEM(JSM-7600F，JEOL，Japan)觀測K43造成轉糖鏈球菌生物膜形態的變化。分別在24孔盤中單獨培養轉糖鏈球菌、K43或LGG與轉糖鏈球菌共同培養，並放置於經滅菌的玻璃蓋玻片，使其分別於該蓋玻片上生長。待生物膜形成後，將該蓋玻片以磷酸鹽緩衝液(phosphate-buffered saline，以下簡稱PBS)清洗一次，再以含有2.5%戊二醛(glutaraldehyde)及4%三聚甲醛(paraformaldehyde)之PBS進行固定。接著以濃度遞增之乙醇溶液進行脫水，再以液態CO₂進行乾燥。最後將該玻片以噴濺式方法(sputter-coated)鍍金以進行SEM觀察。

如第3圖(A)之結果顯示，轉糖鏈球菌單獨存在時，會形成島狀、厚重的生物膜構造，且其表面則包覆著網狀、由EPS構成的構造。然而，如第3圖(B)之結果顯示，在與K43共培養後，可觀察黏附於蓋玻片上的細菌數量亦明顯減少，菌體表面亦沒有出現網狀EPS構造包覆；如第3圖(C)之結果顯示，與LGG共培養後，蓋玻片表面仍可觀察到大量的轉糖鏈球菌及EPS網狀構造。故SEM的觀察結果亦顯示K43可抑制轉糖鏈球菌形成生物膜。

實施例3 K43抑制轉糖鏈球菌之生長

為了進一步測試K43抑制轉糖鏈球菌形成生物膜的機制，本實施例以菌落生成試驗(spot assay)檢測K43對於轉糖鏈球菌生長的影響。分別以轉糖鏈球菌單獨存在、K43、LGG或熱失活LGG與轉糖鏈球菌共培養24小時後，將各培養盤中之菌液與生物膜劇烈混和均勻，再分別以PBS進行連續稀釋為10^-1倍、10^-2倍、10^-3倍、10^-4倍、10^-5倍及10^-6倍。分別取5μl稀釋後的菌液塗抹於BHI培養基上，於37℃之厭氧環境中培養24小時後觀察。

如第4圖結果顯示，相較於轉糖鏈球菌單獨存在之控制組，在共培養系統中，K43可以顯著的抑制轉糖鏈球菌的生長，且其抑制效果高於LGG，而熱滅活LGG之負控制組並不具抑制轉糖鏈球菌生長之能力。此結果表示K43具有顯著抑制轉糖鏈球菌生長之能力。

實施例4 K43具有抑制轉糖鏈球菌表現GtfB及GtfC糖苷轉化酶之活性

為了再進一步測試K43對於轉糖鏈球菌的抑制機轉，本實施例以qRT-PCR分析轉糖鏈球菌形成生物膜時所必須之GtfB及GtfC的表現情形。根據製造商的使用說明，藉由使用RNeasy中型管柱(midi-column)(QIAGEN)自單獨存在的轉糖鏈球菌、K43、LGG或熱失活LGG與轉糖鏈球菌共培養之菌液單離出RNA(以不含菌液者作為控制組)，並以無核糖核酸分解酶(RNase-free)之去氧核醣核酸分解酶I(DNase I)(MoBioPlus)處理RNA以去除DNA的汙染。接著取出100ng該RNA，再以轉錄第一股互補DNA(complementary DNA，以下簡稱cDNA)合成套組(Roche)且使用隨機引子(random primer)進行反轉錄反應。qRT-PCR係使用Light Cycler TaqMan Master系統(Roche)偵測GtfB、GtfC及23S rRNA，所使用的引子(列於下表2中)及探針(probe)係利用Universal Probe Library Assay Design Center系統(Roche)所設計，qRT-PCR得出的數據係以Light-Cycler○R 1.5 Instrument軟體(Roche)進行分析。最後以轉糖鏈球菌之23S rRNA作為標準值，使用比較循環閾值2-△△CT方法(comparative threshold cycle 2-△△CT method)定量基因之相對表現量。

如第5圖結果顯示，相較於轉糖鏈球菌單獨存在時，轉糖鏈球菌在與K43共培養後，其GtfB及GtfC糖苷轉化酶的mRNA表現量顯著的減少(至10%以下)，相反的，在與LGG共培養後則其GtfB及GtfC糖苷轉化酶的mRNA表現量明顯的提高，但與熱失活LGG(作為負控制組)共培養後並未產生明顯的影響)。因此，此結果表示K43可減少轉糖鏈球菌表現GtfB及GtfC糖苷轉化酶活性。

<110> 聯亞益生生物科技股份有限公司

<120> 乳酸桿菌、其組成物及其用途

<160> 11

<210> 1

<211> 1103

<212> DNA

<213> 唾液乳桿菌唾液亞種K43

<223> 唾液乳桿菌唾液亞種K43之16s rDNA序列

<400> 1

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> ERIC-PCR所使用的引子1

<400> 2

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> ERIC-PCR所使用的引子2

<400> 3

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> BOX-PCR所使用的引子

<400> 4

<210> 5

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> (GTG)₅-PCR所使用的引子

<400> 5

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 擴增GtfB所使用的正向引子

<400> 6

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 擴增GtfB所使用的反向引子

<400> 7

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 擴增GtfC所使用的正向引子

<400> 8

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 擴增GtfC所使用的反向引子

<400> 9

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 擴增23S rRNA所使用的正向引子

<400> 10

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 擴增23S rRNA所使用的反向引子

<400> 11

Claims

一種乳酸桿菌，係唾液乳酸桿菌唾液亞種(Lactobacillus salivarius subspecies salivarius)K43，且以食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心的登錄號BCRC 910616寄存。
一種組成物，包含如申請專利範圍第1項所述之乳酸桿菌及其載體。
如申請專利範圍第2項所述之組成物，其係用於抑制轉糖鏈球菌(Streptococcus mutans)形成生物膜。
如申請專利範圍第3項所述之組成物，係藉由抑制該轉糖鏈球菌之生長而抑制轉糖鏈球菌形成生物膜。
如申請專利範圍第3項所述之組成物，係用於抑制該轉糖鏈球菌表現糖苷轉化酶的活性。
如申請專利範圍第5項所述之組成物，其中，該糖苷轉化酶係選自糖苷轉化酶B(glucosyltransferase B)及糖苷轉化酶C(glucosyltransferase C)所組成群組之至少一者。
如申請專利範圍第3項所述之組成物，其中，該轉糖鏈球菌所形成之生物膜與口腔疾病有關。
一種如申請專利範圍第1項所述之乳酸桿菌的用途，係用以製備治療或預防口腔疾病之醫藥組成物。
如申請專利範圍第8項所述之用途，其中，該口腔疾病係齲齒或牙周病。
如申請專利範圍第8項所述之用途，其中，該醫藥組成物係抑制轉糖鏈球菌形成生物膜。