TWI505831B

TWI505831B - 用於治療微小核糖核酸病毒感染的益生菌組合物及其用途

Info

Publication number: TWI505831B
Application number: TW102141587A
Authority: TW
Inventors: Ya Fang Wang; Jen Ren Wang; Yi Hsing Chen
Original assignee: Genmont Biotech Inc
Priority date: 2013-11-15
Filing date: 2013-11-15
Publication date: 2015-11-01
Also published as: TW201517914A

Description

用於治療微小核糖核酸病毒感染的益生菌組合物及其用途

本發明係關於新穎乳桿菌分離株之分離，及其於治療微小核糖核酸病毒感染之技術領域。

腸病毒71型屬於微小核糖核酸病毒科(Family Picornaviridae)之腸病毒屬(genus Enterovirus)。病毒外鞘呈正二十面體(icosahedral)的結構，無外套膜包裹，環境中的酸、鹼及溫度變化都不易影響病毒的活性，因此可在環境中存活長久並藉由糞口傳播達到廣泛傳播。病毒的基因體是由7440大小的單股正股RNA核酸組成，可轉譯出一條含2194個胺基酸聚合蛋白質(polyprotein)，包括結構性蛋白的P1區域，以及非結構性蛋白的P2和P3區域。聚合蛋白由2A蛋白質酶(protease)切割成P1、P2、P3，由3D蛋白質酶將P1區域切割成VP1、VP2、VP3及VP4四個結構蛋白，將P2區域切割成2A protease、2B及2C nucleotide triphosphatase，將P3區域切割成3A與3CD等非結構蛋白。病毒蛋白外殼(capsid)由VP1-VP4四個結構蛋白構成，大小約20-30奈米(nm)。

根據腸病毒的生物特性和分子特性，腸病毒在2003年已被重新區分為五大類，分別是(1)小兒麻痺病毒，(2)腸病毒A群(CAV2至CAV8，CAV10，CAV12，CAV14，CAV16和EV71)，(3)腸病毒B群(CAV9，CBV1至CBV6，E1至E7，E9，E11至E21，E24至E27，E29至E33和EV69及EV73)，(4)腸病毒C群(CAV1，CAV11，CAV13，CAV15，CAV17至CAV22和CAV24)，(5)腸病毒D群(EV68和70)。腸病毒71型最初於1969年在美國加州於患有中樞神經疾病之病患所分離出來，1974年由Melnick定名為腸病毒71型。

腸病毒71型自1969年被分離出來後，已在世界各大洲造成廣泛的流行，如1969至1973年在美國，1978年在日本，1986年在澳洲維多利亞城、巴西、1986年在香港都曾爆發大流行並引起嚴重的腦炎及類小兒麻痺症候群。台灣在1998年也爆發腸病毒71型大流行，總計共有13萬人感染，405名重症病童因手足口症合併無菌性腦膜炎、腦炎或急性遲緩性麻痺而住院，造成78位病童死亡，重症案例中有75%證實為腸病毒71型造成，而死亡案例中則有92%分離出腸病毒71型。自1998年的大流行後，每年春夏交替及夏季時期都會出現幼童感染腸病毒71型的病例，是台灣目前一項重要的公共衛生健康課題。

腸病毒71型具有神經侵犯性，與小兒麻痺病毒同樣會造成肢體麻痺的嚴重神經症狀，因腸病毒71型感染大多侵襲三歲以下嬰幼兒且易導致嚴重的中樞神經病變，腸病毒71型可被視為繼小兒麻痺病毒後另一不可忽視的嗜神經性(neurotropic)病毒。一般認為腸病毒是經由糞口傳染途徑感染，病毒以消化道為入口侵犯宿主，進而感染到其他標的器官，特別是神經系統。急性腸病毒71型的感染至今尚未有有效的抗病毒藥物，臨床上的治療雖使用IVIG，但治療效果有限，目前仍以症狀治療的支持療法為主。使用疫苗來預防傳染性疾病有很好的歷史，但目前腸病毒71型疫苗尚在研發狀態，至上市至臨床使用時程未定；而疫苗株選用對其他基因型或其他種腸病毒是否有交叉保護效果仍需研究證實。

在1908年，俄國諾貝爾獎得主Elie Metchnikoff發現發酵後的牛乳中所含的乳桿菌對人體的健康具有益處。到了1965年，Lilly and Stilweel則近一步地將益生菌定義為：任何可以促進腸道菌種平衡，增加人體健康效益的微生物。越來越多研究指出，對於微生物引起之腸道感染，益生菌可以促進腸道之免疫反應。本案申請人之前案US 7,666,407指出Lactobacillus paracasei GMNL-33具有抑制細菌造成之牙病用途；US 7,901,926指出Lactobacillus reuteri GMNL-89具有抗發炎用途。然而目前對於益生菌是否能有效治療腸病毒的症狀，則尚未有文獻報導是否有其功效。

本發明之目的即在於提供一種新穎乳桿菌分離株，乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei GMNL-277)之寄存編號為BCRC 910585與CCTCC M 2013197。

本發明之另一目的即在於提供一種用於治療微小核糖核酸病毒感染的醫藥組合物，其包含乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei GMNL-277)之寄存編號為BCRC 910585與CCTCC M 2013197。

為達成前述發明目的，其中該醫藥組合物可進一步包含副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei GMNL-33)之寄存編號為BCRC 910314與CCTCC M 206133以及羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri GMNL-89)之寄存編號為BCRC 910340與CCTCC M 207154至少一種。

為達成前述發明目的，其中該微小核糖核酸病毒為腸病毒。

為達成前述發明目的，其中該腸病毒為腸病毒71型。

為達成前述發明目的，其中該醫藥組合物是呈一可供口服投藥的劑型。其中該劑型是選自於下列所構成的群組：溶液、懸浮液、乳劑、粉末、錠劑、丸劑、糖漿、口含錠、片劑、口嚼膠、濃漿以及膠囊。

本發明之另一目的即在於提供一種食品產品，其包含乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei GMNL-277)之寄存編號為BCRC 910585與CCTCC M 2013197。

為達成前述發明目的，其中該食品產品可進一步包含副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei GMNL-33)之寄存編號為BCRC 910314與CCTCC M 206133以及羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri GMNL-89)之寄存編號為BCRC 910340與CCTCC M 207154至少一種。

為達成前述發明目的，其中該食品產品可進一步包含至少一種選自於下列群組中的益生菌：乳桿菌屬物種(lactobacillus sp. )、雙叉桿菌屬物種(Bifidobacterium sp. )、鏈球菌屬物種(Streptococcus sp. )及酵母菌(yeasts)。

為達成前述發明目的，可進一步包含一可食性材料，該可食性材料包含水、流體乳品、牛奶、濃縮牛奶、優酪乳、酸乳、冷凍優格、乳桿菌發酵飲料、奶粉、冰淇淋、乳酪、乾酪、豆奶、發酵豆奶、蔬果汁、果汁、運動飲料、甜點、果凍、糖果、嬰兒食品、健康食品、動物飼料、中草藥材或膳食補充品。

本發明之另一目的即在於提供一種益生菌用於製備治療微小核糖核酸病毒感染之組合物的方法，其中該益生菌包含副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei GMNL-33)之寄存編號為BCRC 910314與CCTCC M 206133、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri GMNL-89)之寄存編號為BCRC 910340與CCTCC M 207154以及乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei GMNL-277)之寄存編號為BCRC 910585與CCTCC M 2013197至少一種。

為達成前述發明目的，其中該微小核糖核酸病毒為腸病毒。

為達成前述發明目的，其中該腸病毒為腸病毒71型。

為達成前述發明目的，其中該組合物為醫藥組合物，是呈一可供口服投藥的劑型。其中該劑型是選自於下列所構成的群組：溶液、懸浮液、乳劑、粉末、錠劑、丸劑、糖漿、口含錠、片劑、口嚼膠、濃漿以及膠囊。

本發明之另一目的即在於提供一種治療微小核糖核酸病毒感染的方法，包含一組合物；其中該組合物包含副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei GMNL-33)之寄存編號為CCTCC M 206133、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri GMNL-89)之寄存編號為CCTCC M 207154以及乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei GMNL-277)之寄存編號為CCTCC M 2013197至少一種。

為達成前述發明目的，其中該微小核糖核酸病毒為腸病毒。

為達成前述發明目的，其中該腸病毒為腸病毒71型。

本發明之另一目的即在於提供一種用於治療微小核糖核酸病毒感染的組合物，其中該組合物包含副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei GMNL-33)之寄存編號為CCTCC M 206133、羅伊氏乳桿菌 (Lactobacillus reuteri GMNL-89)之寄存編號為CCTCC M 207154以及乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei GMNL-277)之寄存編號為CCTCC M 2013197至少一種。

為達成前述發明目的，其中該微小核糖核酸病毒為腸病毒。

為達成前述發明目的，其中該腸病毒為腸病毒71型。

本發明之另一實施例為腸病毒，腸病毒為一群病毒的總稱，包含小兒麻痺病毒、克沙奇病毒A型及B型、伊科病毒及腸病毒等60餘型，近年來又陸續發現多種型別，依據基因序列分析結果將之重新歸類。

本發明之另一實施例為微小核糖核酸病毒，微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)(小核糖核酸病毒科)微小病毒科是沒有套膜，正股RNA，正20面體蛋白殼體的病毒，它的基因體在5'端有一個蛋白是用來當作RNA複製的primer。微小病毒科可分為九屬，分別為腸道病毒屬(Enterovirus)，代表種：小兒麻痺症病毒(Poliovirus脊髓灰質炎病毒)；鼻病毒屬(Rhinovirus)，代表種：人類鼻病毒A(Human rhinovirus A)；肝病毒屬(Hepatovirus)，代表種：肝炎A型病毒(Hepatitis A virus,HAV)；心病毒屬(Cardiovirus)，代表種：腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus)；鵝口瘡病毒屬(Aphthovirus)，代表種：口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus)；副腸內細胞病變人類孤兒病毒屬(Parechovirus副腸孤病毒屬)，代表種：人類副腸內細胞病變人類孤兒病毒(Human parechovirus人副腸孤病毒)；馬鼻病毒屬(Erbovirus)；脊病毒屬(Kobuvirus)；與捷申病毒屬(Teschovirus)。

圖一為益生菌(GMNL-277)之顯微照片

圖二為益生菌吸附病毒之能力

本說明書中所述之所有技術性及科學術語，除非另外有所定義，皆為該所屬領域具有通常技藝者可共同瞭解的意義。

本發明係一種治療微小核糖核酸病毒感染的組合物，其包含副乾酪乳桿菌(GMNL-33)之寄存編號為CCTCC M 206133、羅伊氏乳桿菌(GMNL-89)之寄存編號為CCTCC M 207154及乾酪乳桿菌(GMNL-277)其寄存編號為CCTCC M 2013197至少一種，及藥學上可接受之載劑。其中該乾酪乳桿菌GMNL-277為新穎乳桿菌分離株。另，本發明亦關於藉由該組合物或該乳桿菌用以治療微小核糖核酸病毒感染之新穎用途，其作用機制為益生菌GMNL-277、GMNL-33及GMNL-89菌株與病毒結合，而降低病毒感染細胞之能力。

其中該乳桿菌分離株亦包含其繼代培養之後代，或突變株，但仍具有與本發明所述之菌種特性、基因體(genomic)、或用途(用於治療腸病毒)相同者。

本文所述組合物係可包含，但不限於：食品、飲品、健康食品、動物飲水添加物、動物飼料添加物、動物用及人類用醫療組合物、食品添加物、飲料添加物等適用本發明之應用形式。

術語"治療"、"治療中"及其類術語係指延緩、改善、減少或逆轉目前正折磨著患者之該病症或該病症相關之任何症狀的方法以及預防該病症或其任何正出現之症狀的方法。

術語"藥學上可接受"意謂物質或組合物必須與調配物之其他成份相容，且對患者無害。

術語"微小核糖核酸病毒科"根據巴爾的摩分類法歸類為第四綱，基因體大小從7.2kb至9.0kb，微小病毒科的mRNA在5'端並沒有CAP而是一種蛋白質稱為VPg，3'端一樣具有poly A tail，基因體兩端均有UTR(un-translated region非轉譯區)。

本發明的組合物係可利用熟習此技藝者所詳知的技術，將上述的乳桿菌分離株，與一藥學上可接受之載劑(pharmaceutically acceptable vehicle)，製備成一適用本發明組合物之劑形。其中該劑形包含但不限於：溶液(solution)、乳劑(emulsion)、懸浮液(suspension)、粉末(powder)、錠劑 (tablet)、丸劑(pill)、口含錠(lozenge)、片劑(troche)、口嚼膠(chewing gum)、膠囊(slurry)以及其他類似或適用本發明之劑形。

其中該藥學上可接受之載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤滑劑(lubricant)、表面活性劑(surfactant)，及其他類似或適用本發明之載劑。

上述組合物中，亦可視需要適宜地添加一或多種以上製劑領域內通常使用之溶解補助劑、緩衝劑、保存劑、着色劑、香料、風味劑等。

另一較佳實施例中，本發明所提供之前述組合物，可進一步添加一可食性材料，以製備為一種食品產品或保健產品。其中該可食性材料包含，但不限於：水(water)、流體乳品(fluid milk products)、牛奶(milk)、濃縮牛奶(concentrated milk)；發酵乳品(fermented milk)，諸如優酪乳(yogurt)、酸乳(sour milk)、冷凍優格(frozen yogurt)、乳桿菌發酵飲料(lactic acid bacteria-fermented beverages)；奶粉(milk powder)；冰淇淋(ice cream)；乳酪(cream cheeses)；乾酪(dry cheeses)；豆奶(soybean milk)；發酵豆奶(fermented soybean milk)；蔬果汁(vegetable-fruit juices)；果汁(juices)；運動飲料(sports drinks)；甜點(confectionery)；果凍(jellys)；糖果(candies)；嬰兒食品(infant formulas)；健康食品(health foods)；動物飼料(animal feeds)；中草藥材(Chinese herbals)；膳食補充品(dietary supplements)等。

此外，本發明所發現之新穎菌種，亦可與其他習知菌種一併被包含於一組成物中。

其中該組合物，可進一步包含至少一種選自於下列群組中的習知益生菌：乳桿菌屬物種(lactobacillus sp. )、鏈球菌屬物種(Streptococcus sp. )、雙叉桿菌屬物種(Bifidobacterium sp. )、酵母菌(yeasts)。

其中該習知乳桿菌屬物種(lactobacillus sp. )包含但不限於：乳酸乳桿菌(lactobacillus lactis )、嗜酸乳桿菌(lactobacillus acidophilus )、瑞士乳桿菌(lactobacillus helveticus )、雙岐乳桿菌(lactobacillus bifidus )、乳酪乳桿菌(lactobacillus casei )、副乳酪乳桿菌副乳酪亞種(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei )、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus )、加氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri )、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri )、發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum )、或其組合。

其中該習知鏈球菌屬物種(Streptococcus sp. )包含但不限於：乳酸鏈球菌(Streptococcus lactis )、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus )、乳酪鏈球菌(Streptococcus cremoris )、或其組合。

其中該習知雙叉桿菌屬物種(Bifidobacterium sp. )包含但不限於：短型雙叉桿菌(Bifidobacterium breve )、乳酸雙叉桿菌(Bifidobacterium lactis )、長型雙叉桿菌(Bifidobacterium longum )、雙叉型雙叉桿菌(Bifidobacterium bifidum )、或其組合。

其中該習知酵母菌(yeasts)包含但不限於：啤酒酵母菌(Saccharomyces cereviseae )、乳酒假絲酵母菌(Candida kefyr )、弗羅稜酵母菌(Saccharomyces florentinus )、或其組合。

另，本發明亦提供前述乳桿菌用於製備治療微小核糖核酸病毒感染之組合物的方法或用途。

本發明所提供之組合物及其用於治療微小核糖核酸病毒感染之方法，其投藥路徑，可視需求適宜調整，並未特別限定，較佳者為經口投予適用劑形。

本發明係以下面的實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例所限制。本發明所用之藥物、生物材料皆市售易於取得，下列僅為示例可取得之管道。

本發明係以下面的實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例所限制。

益生菌、細胞與病毒

細胞培養，RD細胞，人類橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)，培養於含10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的High-glucose-Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)中。HT-29細胞，人類結腸癌細胞(colorectal adenocarcinoma)，培養於含10% FBS的Roswell Park Memorial Institute-1640(RPMI1640)中。Caco-2細胞，人類結腸癌細胞(colorectal adenocarcinoma)，則培養於含20% FBS及1.0mM sodium pyruvate的High-glucose DMEM中。細胞於37℃，5% CO₂ 培養箱培養，細胞需繼代時，將舊的培養基吸取丟棄，以無菌PBS洗滌細胞，加入trypsin-EDTA於37℃作用數分鐘，加入適當細胞培養基並將細胞打散。將細胞依適當比例稀釋後加入新的細胞培養液繼續培養。

病毒培養，本研究使用腸病毒71型(EV71-N4643/TW98)病毒株。將RD細胞培養於75cm² flask中，待細胞長滿後，接種病毒液，待細胞病變(cytopathic effect,CPE)約達90%後收集病毒液，並刮取下受感染之細胞，經冷凍解凍及離心後，吸取上清液分裝至病毒保存管，存放於-80℃備用。

益生菌，本研究使用三株不同益生菌菌粉，代號分別為GMNL-33、GMNL-89及GMNL-277。

實驗設計與方法

細胞毒性試驗(Cytotoxicity assay)

種植RD細胞於96孔盤，37℃培養overnight。菌粉以病毒培養液配置，分別加入濃度10⁷ 及10⁸ CFU/mL的益生菌，處理細胞24小時，加入WST-1試劑，以ELISA reader偵測每孔吸光值。

抗病毒試驗(Antiviral assay)

(a)前處理細胞(Pre-treatment of cell)：分別將RD、HT-29及Caco-2細胞接種至12孔培養盤，37℃培養overnight。加入益生菌於37℃處理細胞6小時，吸去上清液，以PBS清洗細胞後加入腸病毒71型感染，於37℃培養24小時後，收取細胞及上清液，保存於-80℃待測病毒量。

(b)同時處理細胞(Co-incubation with virus)(competition assay)：分別將RD、HT-29及Caco-2細胞接種至12孔培養盤，37℃培養overnight。將益生菌與腸病毒71型同時加入細胞於37℃培養24小時，收取細胞及上清液，保存於-80℃待測病毒量。

(c)後處理細胞(Post-treatment of cell)：分別將RD、HT-29 及Caco-2細胞接種至12孔培養盤，37℃培養overnight。加入腸病毒71型於37℃感染細胞6小時後，將益生菌加入已感染細胞於37℃培養24小時，收取細胞及上清液，保存於-80℃待測病毒量。

病毒定量：半組織培養感染劑量(50% tissue culture infective dose,TCID ₅₀ )

將RD細胞培養於96孔盤中於37℃培養overnight。取待測病毒以十倍序列稀釋，將序列稀釋好的病毒液依序加入RD細胞中，在37℃，5% CO₂ 培養箱培養24小時。24小時後，吸去稀釋培養液，加入80%冰丙酮固定細胞。利用抗腸病毒71型之單株抗體進行酵素免疫分析法(ELISA)測定病毒量。在波長450nm下測定吸光值。測定後所得結果中，計算細胞控制組(僅含細胞以及稀釋培養液)之平均吸光值，平均後結果乘以2，若吸光值大於此數值則判定為病毒感染之陽性，小於此數值則為陰性。判讀後，以Reed-Muench方法計算該病毒之TCID₅₀ 。

益生菌與腸病毒71型之交互作用(EV71 adsorption by the probiotics)

將100TCID₅₀ 病毒液與益生菌(10⁷ CFU/mL)混合於1.5mL離心管內，置於37℃，5% CO₂ 培養箱1.5個小時。離心10分鐘後取上清液測病毒濃度(TCID₅₀ )。

統計方法

實驗結果採用unpaired t test檢定是否具統計上差異，結果以means±SD表示，p值小於0.05視為具統計上差異。

實施例一

本案申請人(景岳生物科技公司)係由健康成人胃腸道檢體中，分離六百餘株分離株，以建立一分離株菌種庫。採集地位、獲取時間、採集者、採集者聯絡方式如下表一。

從菌種庫中挑選可抑制腸病毒的乳桿菌，挑選分析結果之前三名乳桿菌以進行抑制病毒生長分析。該三株乳桿菌之寄存編號、寄存日期及菌株名稱，如表二所示；其中副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei )GMNL-33，羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri )GMNL-89上述皆為一公開之菌種，其菌株特徵、寄存證明、存活試驗報告等證明文件正本及相關資訊，已包含於多國專利中；其中，乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei )GMNL-277為本發明新分離出之新穎乳桿菌分離株。下以實施例二分述該株乳桿菌之菌株特徵、Biolog微生物鑑定系統分析、16S rDNA分析。

實施例二

乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei )GMNL-277之學名鑑定，將分離株GMNL-277委託台灣新竹食品工業發展研究所進行細菌學名鑑定，分述如下：分離株GMNL-277背景資料：分離源為人體腸胃道；培養基為MRS；培養溫度為37℃；病原性：無。

分析結果顯示分離株GMNL-277為革蘭氏陽性桿菌，不具觸酶、氧化酶及運動性，於好氧環境及厭氧環境下皆會生長，不會產生內孢子(如圖一所示)。另，分離株GMNL-277之16S rDNA部分序列如SEQ ID No：1所示，根據16S rDNA分析，分離株GMNL-277與乾酪乳桿菌相似度高達99%以上。再藉由Biolog微生物鑑定系統分析，分離株GMNL-277最接近乾酪乳桿菌。因此，綜合上述結果顯示，分離株GMNL-277為乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei )。

實施例三

益生菌抑制腸病毒71型之能力：本實驗使用三種不同益生菌，測試三株細胞株，利用了三種不同模式測試益生菌抑制腸病毒71型能力，分別為前處理(pre-treatment)、同時處理(co-incubation)及後處裡(post-treatment)，接著利用TCID₅₀ assay測定益生菌處理後病毒量之差異，益生菌濃度在10⁷ CFU/mL，對於RD、HT-29及Caco-2細胞株較無細胞毒性，以10⁷ CFU/mL之益生菌濃度進行；抑制病毒效果以100 TCID₅₀ 為最佳，實驗結果如表三。

結果顯示在前處理實驗中在RD細胞中，本發明三株益生菌均會抑制腸病毒71型生長，且差異具有統計上意義；然而在HT-29細胞培養則只有GMNL-89有統計上差異之抑制效果，Caco-2細胞則亦只有GMNL-89有統計上差異之抑制效果。而在同時處理實驗中結果發現，在RD細胞易有較多菌株可看到抑制效果，包括GMNL-277、GMNL-33及GMNL-89，而在HT-29細胞中沒有菌株有統計上差異之抑制效果。然而在後處裡實驗中，其結果較不相同，在HT-29細胞中則有較多菌株有統計上差異之抑制能力，包括GMNL-277、GMNL-33、GMNL-89；Caco-2細胞則有GMNL-33有統計上意義之抑制效果。

綜合以上實驗結果顯示，確認GMNL-277、GMNL-33及GMNL-89菌株具有在不同細胞株中抑制腸病毒71型之能力。所以將GMNL-277、GMNL-33及GMNL-89菌株視為具有抗腸病毒潛力之主要菌株進行後續病毒吸附試驗。

實施例四

益生菌是否與腸病毒71型產生交互作用而抑制病毒複製：本實驗由三株抗腸病毒71型之潛力菌株，進一步探討其可能的作用機制為何，因此先評估益生菌是否會吸附病毒進而抑制病毒感染細胞之能力。我們分別將這三株益生菌與腸病毒71型共同培養，再經由離心方式讓益生菌沉澱，取上清液測試病毒量。結果發現GMNL-277、GMNL-33及GMNL-89降低腸病毒71型病毒量達66.04%、56.09%及63.15%(表四及圖二)，顯示益生菌GMNL-277、GMNL-33及GMNL-89皆會與腸病毒71型結合，因此益生菌可能藉由與病毒結合而降低病毒感染細胞之能力。

上述多項功效，實屬充分符合新穎性及進步性之法定發明專利要件，爰依法提出申請，懇請貴局核准本件發明專利申請案，以勵發明。

【生物材料寄存】國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】

1.新竹食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心、寄存日期為2006年3月22日、寄存編號為BCRC 910314。

2.新竹食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心、寄存日期為2006年11月14日、寄存編號為BCRC 910340。

3.新竹食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心、寄存日期為2013年5月16日、寄存編號為BCRC 910585。

國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】

1.中國典型培養物保藏中心、寄存日期為2006年11月27日、寄存編號為CCTCC M 206133。

2.中國典型培養物保藏中心、寄存日期為2007年11月19日、寄存編號為CCTCC M 207154。

3.中國典型培養物保藏中心、寄存日期為2013年5月9日、寄存編號為CCTCC M 2013197。

<110> 景岳生物科技股份有限公司

<120> 用於治療微小核糖核酸病毒感染的益生菌組合物及其用途

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1522

<212> DNA

<213> 乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)GMNL-277

<400> 1

Claims

一種用於治療腸病毒71型的乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei GMNL-277)，該乾酪乳桿菌之寄存編號為BCRC 910585與CCTCC M 2013197。
一種用於治療腸病毒71型感染的醫藥組合物，其包含乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei GMNL-277)之寄存編號為BCRC 910585與CCTCC M 2013197。
如申請專利範圍第2項之用於治療腸病毒71型感染的醫藥組合物，其中該醫藥組合物可進一步包含副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei GMNL-33)之寄存編號為BCRC 910314與CCTCC M 206133以及羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri GMNL-89)之寄存編號為BCRC 910340與CCTCC M 207154至少一種。
如申請專利範圍第2或3項之用於治療腸病毒71型的醫藥組合物，其中該醫藥組合物是呈一可供口服投藥的劑型。
如申請專利範圍第4項之用於治療腸病毒71型的醫藥組合物，其中該劑型是選自於下列所構成的群組：溶液、懸浮液、乳劑、粉末、錠劑、丸劑、糖漿、口含錠、片劑、口嚼膠、濃漿以及膠囊。
一種食品產品，其包含乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei GMNL-277)及一可食性材料，該乾酪乳桿菌之寄存編號為BCRC 910585與CCTCC M 2013197。
如申請專利範圍第6項所述之食品產品，其中該食品產品可進一步包含副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei GMNL-33)之寄存編號為BCRC 910314與CCTCC M 206133以及羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri GMNL-89)之寄存編號為BCRC 910340與CCTCC M 207154至少一種。
如申請專利範圍第6或7項所述之食品產品，可進一步包含至少一種選自於下列群組中的益生菌：乳桿菌屬物種(lactobacillus sp. )、雙叉桿菌屬物種(Bifidobacterium sp. )、鏈球菌屬物種(Streptococcus sp. )及酵母菌(yeasts)。
如申請專利範圍第6項所述之食品產品，該可食性材料包含水、流體乳品、牛奶、濃縮牛奶、優酪乳、酸乳、冷凍優格、乳桿菌發酵飲料、奶粉、冰淇淋、乳酪、乾酪、豆奶、發酵豆奶、蔬果汁、果汁、運動飲料、甜點、果凍、糖果、嬰兒食品、健康食品、動物飼料、中草藥材或膳食補充品。
一種益生菌用於製備治療腸病毒71型感染之組合物的方法，其中該益生菌包含副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei GMNL-33)之寄存編號為BCRC 910314與CCTCC M 206133、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri GMNL-89)之寄存編號為BCRC 910340與CCTCC M 207154以及乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei GMNL-277)之寄存編號為BCRC 910585與CCTCC M 2013197至少一種。
如申請專利範圍第10項之益生菌用於製備治療腸病毒71型感染之組合物的方法，其中該組合物為醫藥組合物，是呈一可供口服投藥的劑型。
如申請專利範圍第11項之益生菌用於製備治療腸病毒71型感染之組合物的方法，其中該劑型是選自於下列所構成的群組：溶液、懸浮液、乳劑、粉末、錠劑、丸劑、糖漿、口含錠、片劑、口嚼膠、濃漿以及膠囊。