TWI599577B - Methods to alter the isoelectric point of antibodies using amino acid substitutions of CDR regions - Google Patents

Description

利用置換CDR區胺基酸來改變抗體等電點的方法

本發明係關於藉由CDR區胺基酸置換，保持抗體對於抗原之結合活性同時改變等電點之方法、控制抗體之血漿中藥物動力學(血中動態)之方法，及含有等電點經改變之抗體作為有效成分之醫藥組成物，及其製造方法等。

又，本發明，係關於藉由將露出於抗IL-6受體抗體、抗Glypican3抗體、及抗IL-31受體抗體之CDR區域表面之胺基酸殘基改變，控制該抗體抗IL-6受體抗體、抗Glypican3抗體、及抗IL-31受體抗體之血漿中半衰期之方法、藉由胺基酸殘基改變而使血漿中半衰期受到控制之抗體(抗IL-6受體抗體、抗Glypican3抗體，及抗IL-31受體抗體)、含有該抗體作為有效成分之醫藥組成物，及該等醫藥組成物之製造方法。

再者，本發明係關於含有抗IL-6受體抗體作為有效成分之醫藥組成物，及其製造法等。

抗體由於血漿中半衰期長、副作用亦少，因此作為醫藥品受到重視。其中，IgG型之抗體醫藥已有多數上市，現在亦有多數抗體醫藥正在開發中(非專利文獻1、非專利文獻2)。現在已上市的抗體醫藥，幾乎都是嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體，但是將人類化抗體或人類抗體改良而使藥效‧便利性‧成本改善，具更優異特性之抗體醫藥， 現在也已開發多數。就能應用於該等抗體醫藥之技術而言，已開發各式各樣的技術，已有人報告使效應子(effector)功能、抗原結合能力力、藥物動力學、安定性提升，或使免疫原性風險降低的技術等。就使藥效增強或使投予量減低之方法而言，有人報告藉由將IgG抗體之Fc區域之胺基酸置換，而使得抗體依存性細胞抑制活性(ADCC活性)或補體依存性細胞抑制活性(CDC活性)增強之技術(非專利文獻3、4)。又，就使抗原結合能力、抗原中和能力提升之技術而言，有人報告親和性成熟(affinity maturation)技術(非專利文獻5)，藉由對於可變區域之CDR區域等之胺基酸導入變異，能提升對於抗原之結合活性。

現在的抗體醫藥抱持的問題在於，例如：由於投予蛋白質量非常大，造成高製造成本。又，關於投予形態，於慢性自體免疫疾病之情形，希望是皮下投予製劑，但一般而言，皮下投予製劑需要高濃度製劑，於IgG型抗體製劑之情形，從安定性等觀點，一般而言考量約100mg/mL之製劑為極限(非專利文獻6)。藉由以使能發揮持續治療效果之方式之抗體血漿中半衰期增長，能減小投予蛋白質質量，以長投予間隔進行皮下投予，能提供具低成本且高便利性之優異特性的抗體醫藥。

抗體之長血漿中半衰期，與FcRn很相關，關於抗體之同種異構型(isotype)間之血漿中半衰期差異，已知以IgG1及IgG2血漿中半衰期最長，IgG3及IgG4較差(非專利文 獻7)。就使血漿中半衰期優異之IgG1及IgG2之抗體血漿中半衰期更延長之方法而言，有人報告增強對於FcRn結合之固定區域之胺基酸置換(非專利文獻8、9、10)。然而，對於固定區域以人工導入胺基酸變異，從免疫原性之觀點，存在問題。相對於此，最近，有人報告：藉由在抗體可變區域之胺基酸導入變異，使抗體之藥物動力學提升之方法(專利文獻1)。

依照專利文獻1，報告：可藉由使等電點變化，控制IgG之藥物動力學，藉由在抗體可變區域之框架導入胺基酸置換，能不使抗體對於抗原之結合活性減弱，而使抗體之等電點降低，增長抗體之血漿中半衰期。具體而言，例如在kabat編號中的H10、H12、H23、H39、H43、H105導入胺基酸置換，能不使抗體對於抗原之結合活性減弱，而使抗體之等電點降低。再者，對於其他框架序列，亦能不使結合活性減弱地導入胺基酸變異，但是為了使等電點大幅降低，有人考慮到僅對於框架序列導入胺基酸置換，有時不足。原因在於：由於胺基酸置換後之框架序列一般為了使免疫原性降低，使用人類抗體序列，但是，人類抗體框架區域序列由於高度保守，多樣性少，因此，對於胺基酸置換之自由度小。因此，僅對於框架導入胺基酸置換，當使抗體之等電點降低不足時，欲進一步使等電點降低有困難。

另一方面，CDR序列，由於體細胞變異具龐大多樣性，且又為了獲得對抗原結合之多樣性，所以，胺基酸置換之自由度相較於框架顯著較大。然而，CDR序列係為了發揮 對於抗原之強結合活性的最重要要素，一般已知CDR序列之胺基酸置換會影響抗體對於抗原之結合活性。所以，欲以CDR序列胺基酸置換使抗體對於抗原之結合活性不會大幅減弱而要使抗體之等電點降低是困難的。又，CDR序列，由於視抗原種類而差異大，所以，有人認為不論抗體之種類，欲使抗體對於抗原之結合活性不大幅減弱，而將抗體之CDR序列之胺基酸進行置換極為困難。實際上，此想法可由以下所示諸事項而輕易推察。

於將非人類動物種之抗體予以人類化時，一般使用將非人類動物種之CDR序列移植到人類框架序列之CDR移植法。當藉由CDR移植法得到之人類化抗體與嵌合抗體未顯示同等結合活性時，可藉由將決定CDR構造之框架序列的一部分進行胺基酸置換為該抗體所由來的非人類動物種之抗體之框架序列，而使結合活性回復(非專利文獻11)。如此，CDR之序列及構造，對於該抗體具有之對於抗原之結合活性與專一性極重要。又，廣為人所知的，抗體CDR中，天冬醯胺酸殘基之異構化反應、天冬醯胺殘基之脫醯胺化反應、甲硫胺酸殘基之氧化反應所致抗體CDR殘基之變化會造成抗體對於抗原之結合活性減弱(非專利文獻12)，由此亦可知CDR序列在抗體對於抗原之結合活性方面極重要。再者，有人報告：當對於抗體之H鏈CDR2序列導入胺基酸置換時，許多情形，抗原結合活性大幅減弱，且抗體之表現量亦減少(非專利文獻13~15)。尤其，對於H51導入胺基酸置換時，已知抗體之表現量顯著減少(非專利文 獻16)。又，有人報告對於抗體之H鏈CDR3序列導入變異時，幾乎所有情形抗原結合活性大幅減弱(非專利文獻17、18)。又，進行抗體之CDR序列之丙胺酸‧掃描時，藉由將CDR區中存在之胺基酸置換為丙胺酸，許多情形，該抗體對於抗原之結合活性大幅減弱(非專利文獻19~23)，又，有人考慮：當置換為丙胺酸時，所對於抗原之結合活性的影響因為抗體之種類而異。亦即，一般而言，藉由抗體之CDR序列之胺基酸置換，認為對於抗原之結合活性減弱，而不論抗體之種類，不使抗體對於抗原之結合活性大幅減弱之胺基酸置換處，至今尚未有人報告過。

為了創製具有更優異特性之抗體分子的抗體工程中，大部分對於抗體之CDR序列進行胺基酸置換均以親和性‧成熟為目的進行。親和性‧成熟，係對於一般抗體分子之CDR序列，將具有經隨機化CDR序列的抗體庫提示在噬菌體或核糖體上，並藉由對於抗原之淘篩，取得對於抗原之結合活性更提高之抗體的方法，藉此方法，能找出使對抗原之結合活性提高之抗體之CDR序列胺基酸置換(非專利文獻5、24~26)。然而，此方法得到之使對於抗原之結合活性提高的胺基酸置換，由於依照抗體之種類而異，所以，不論抗體之種類，能使對於抗原之結合活性提升之CDR序列之胺基酸置換處，至今尚無人報告。親和性‧成熟以外，有人報告藉由將特定處的CDR序列的胺基酸置換，使抗體於哺乳類細胞之表現量提高的方法(專利文獻2)。依照專利文獻2，藉由使特定處CDR序列之胺基酸置換為特定序 列，能不論抗體之種類，使抗體於哺乳類細胞之表現量提高。又，有人報告為了使抗體之免疫原性減弱，而進行將抗體之CDR序列中存在之T細胞抗原決定基避開的去免疫化(de-immunization)，但是，不論抗體之種類，能不使抗體之結合活性減弱，而將CDR序列中存在之T細胞抗原決定基除去的胺基酸置換方法，至今尚無人報告(非專利文獻27、28)。

如此，由於抗體之CDR序列對於與抗原之結合密切相關，CDR序列之胺基酸置換所致結合活性減弱為一般的，CDR序列之胺基酸置換所致對於抗原結合活性之影響，視抗體之種類而異。專利文獻1中，顯示CDR之胺基酸置換所致等電點之控制例，但是，視抗體之種類，認為可能減弱對於抗原之結合活性。又，雖然有人報告不論抗體之種類，藉由共通之胺基酸置換使抗體之表現提升的方法，但是，使抗體對於抗原之結合活性提升、不使抗體對於抗原之結合活性大幅減弱地而將T細胞抗原決定基除去之方法，至今尚無人報告。而且，不論抗體之種類，不使抗體對於抗原之結合活性大幅減弱，而能將胺基酸置換之抗體之CDR序列相關報告，亦完全闕如。

又，本發明之先前技術文獻如下所示。

【非專利文獻1】 Monoclonal antibody successes in the clinic, Janice M Reichert, Clark J Rosensweig, Laura B Faden & Matthew C Dewitz, Nature Biotechnology 23, 1073 - 1078 (2005)

【非專利文獻2】 Pavlou AK, Belsey MJ., The therapeutic antibodies market to 2008., Eur J Pharm Biopharm. 2005 Apr;59(3):389-96.

【非專利文獻3】 Presta LG. Engineering of therapeutic antibodies to minimize immunogenicity and optimize function. Adv Drug Deliv Rev. 2006 Aug 7;58(5-6):640-56.

【非專利文獻4】 Kim SJ, Park Y, Hong HJ., Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies., Mol Cells. 2005 Aug 31;20(1):17-29. Review.

【非專利文獻5】 Fujii I. Antibody affinity maturation by random mutagenesis. Methods Mol Biol. 2004;248:345-59.

【非專利文獻6】Shire SJ, Shahrokh Z,Liu J. Challenges in the development of high protein concentration formulations. J Pharm Sci. 2004 Jun;93(6):1390-402.

【非專利文獻7】 Salfeld JG. Isotype selection in antibody engineering. Nat Biotechnol. 2007 Dec;25(12):1369-72.

【非專利文獻8】 Hinton PR, Johlfs MG, Xiong JM, Hanestad K, Ong KC, Bullock C, Keller S, Tang MT, Tso JY, Vasquez M, Tsurushita N. Engineered human IgG antibodies with longer serum half-lives in primates. J Biol Chem. 2004 Feb 20;279(8):6213-6.

【非專利文獻9】 Hinton PR, Xiong JM, Johlfs MG, Tang MT, Keller S, Tsurushita N., An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life., J Immunol. 2006 Jan 1;176(1):346-56

【非專利文獻10】 Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, Ober RJ, Ward ES., Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis., Nat Biotechnol. 1997 Jul;15(7):637-40

【非專利文獻11】 Almagro JC, Fransson J. Humanization of antibodies. Front Biosci. 2008 Jan 1;13:1619-33.

【非專利文獻12】 Liu H, Gaza-Bulseco G, Faldu D, Chumsae C, Sun J. Heterogeneity of monoclonal antibodies. J Pharm Sci. 2008 Jul;97(7):2426-47

【非專利文獻13】 Chen C, Roberts VA, Rittenberg MB. Generation and analysis of random point mutations in an antibody CDR2 sequence: many mutated antibodies lose their ability to bind antigen. J Exp Med. 1992 Sep 1;176(3):855-66.

【非專利文獻14】 Chen C, Martin TM, Stevens S, Rittenberg MB .Defective secretion of an immunoglobulin caused by mutations in the heavy chain complementarity determining region 2. J Exp Med. 1994 Aug 1;180(2):577-86

【非專利文獻15】 Wiens GD, Heldwein KA, Stenzel-Poore MP, Rittenberg MB. Somatic mutation in VH complementarity-determining region 2 and framework region 2: differential effects on antigen binding and Ig secretion. J Immunol. 1997 Aug 1;159(3):1293-302.

【非專利文獻16】 Wiens GD, Lekkerkerker A, Veltman I, Rittenberg MB. Mutation of a single conserved residue in VH complementarity-determining region 2 results in a severe Ig secretion defect. J Immunol. 2001 Aug 15;167(4):2179-86.

【非專利文獻17】 Zwick MB, Komori HK, Stanfield RL, Church S, Wang M, Parren PW, Kunert R, Katinger H, Wilson IA, Burton DR. The long third complementarity-determining region of the heavy chain is important in the activity of the broadly neutralizing anti-human immunodeficiency virus type 1 antibody 2F5. J Virol. 2004 Mar;78(6):3155-61.

【非專利文獻18】 Komissarov AA, Marchbank MT, Calcutt MJ, Quinn TP, Deutscher SL Site-specific mutagenesis of a recombinant anti-single-stranded DNA Fab. Role of heavy chain complementarity-determining region 3 residues in antigen interaction. J Biol Chem. 1997 Oct 24;272(43):26864-70.

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【非專利文獻20】Vajdos FF, Adams CW, Breece TN, Presta LG, de Vos AM, Sidhu SS. Comprehensive functional maps of the antigen-binding site of an anti-ErbB2 antibody obtained with shotgun scanning mutagenesis. J Mol Biol. 2002 Jul 5;320(2):415-28.

【非專利文獻21】Pons J, Rajpal A, Kirsch JF. Energetic analysis of an antigen/antibody interface: alanine scanning mutagenesis and double mutant cycles on the HyHEL-10/lysozyme interaction.

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【非專利文獻22】 Leong SR, DeForge L, Presta L, Gonzalez T, Fan A, Reichert M, Chuntharapai A, Kim KJ, Tumas DB, Lee WP, Gribling P, Snedecor B, Chen H, Hsei V, Schoenhoff M, Hale V, Deveney J, Koumenis I, Shahrokh Z, McKay P, Galan W, Wagner B, Narindray D, Hebert C, Zapata G. Adapting pharmacokinetic properties of a humanized anti-interleukin-8 antibody for therapeutic applications using site-specific pegylation. Cytokine. 2001 Nov 7;16(3):106-19.

【非專利文獻23】 Xiang J, Srivamadan M, Rajala R, Jia Z. tudy of B72. 3 combining sites by molecular modeling and site-directed mutagenesis. Protein Eng. 2000 May;13(5):339-44.

【非專利文獻24】 Rothe A, Hosse RJ, Power BE. Ribosome display for improved biotherapeutic molecules. Expert Opin Biol Ther. 2006 Feb;6(2):177-87.

【非專利文獻25】 Schmitz U, Versmold A, Kaufmann P, Frank HG. Phage display: a molecular tool for the generation of antibodies--a review. Placenta. 2000 Mar-Apr;21 Suppl A:S106-12.

【非專利文獻26】 Rajpal A, Beyaz N, Haber L, Cappuccilli G, Yee H, Bhatt RR, Takeuchi T, Lerner RA, Crea R A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries.. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Jun 14;102(24):8466-71.

【非專利文獻27】 De Groot AS, Knopp PM, Martin W. De-immunization of therapeutic proteins by T細胞epitope modification. Dev Biol (Basel). 2005;122:171-94.

【非專利文獻28】 http://www.algonomics.com/proteinengineering/tripole_applications.php

【專利文獻1】 WO/2007/114319

【專利文獻2】 US/2006/0019342

本發明係有鑑於此種狀況而為之，目的在於提供保持含抗體可變區域之多胜肽對於抗原之結合活性而同時改變等電點之方法、控制抗體之血漿中半衰期之方法、含血漿中半衰期受到控制之抗體作為有效成分之醫藥組成物，及該抗體及含該抗體作為有效成分之醫藥組成物之製造方法。

又，本發明之目的在於提供：藉由將露出抗IL-6受體抗體、抗Glypican3抗體、及抗IL-31受體抗體之CDR區域之表面之胺基酸殘基改變，控制該抗體之血漿中半衰期之方法、藉由胺基酸殘基改變使血漿中減期受到控制之抗IL-6受體抗體、抗Glypican3抗體、及抗IL-31受體抗體、該抗體之製造方法、及含該抗體作為有效成分之醫藥組成物。

再者，本發明目的在於：藉由將人類化抗IL-6受體IgG1抗體TOCILIZUMAB之可變區域及固定區域之胺基酸序列改變，使抗原中和能力增強，同時藉由提高血漿中滯留性，使投予頻度減少並且發揮持續治療效果，且使免疫原性、安全性、物性改善，提供較TOCILIZUMAB更為優異之第2世代分子所構成之醫藥組成物，及該等醫藥組成物之製造方法。

本案發明人等，對於在包含抗體可變區域之多胜肽中，保持該可變區域對於抗原之結合活性且改變該多胜肽之等電點之方法，努力研究。其結果，本案發明人等發現，構成抗體可變區域之互補性決定區域(CDR)之胺基酸殘基之中，能夠保持該可變區域對於抗原之結合活性同時能改變其等電點之CDR胺基酸序列上特定位置。又，藉由控制含抗體可變區域之多胜肽之等電點，能控制該多胜肽之血漿中半衰期，再者，藉由利用等電點之差異，能夠以良好效率製造由異多元體所構成，含抗體可變區域之多胜肽。具體而言，於構成抗體可變區域之胺基酸序列中之胺基酸殘基之中，鑑別出抗體可變區域對於抗原之結合活性等抗體具有的功能，或其構造，不造成影響，而能調節抗體分子表面電荷之特定CDR胺基酸序列上之位置。再者，本案發明人等，確認藉由調節該抗體表面電荷而改變等電點，能控制含抗體可變區域之多胜肽之血漿中半衰期，並確認以此方式血漿中半衰期受控制之抗體，實際上保持著對抗抗原之結合活性。再者，本案發明人等，確認藉由控制抗體之血漿中半衰期，能增大包含抗體之發揮細胞傷害活性的抗體具有之對抗癌細胞的腫瘤增殖抑制效果，乃完成本發明。又，確認藉由調節CDR區之電荷而改變等電點，能將由結合於不同的2個以上抗原之抗體所構成的異二元體予以分離‧精製。

再者，本案發明人等，藉由將第1代人類化抗IL-6受體IgG1抗體TOCILIZUMAB之可變區域及固定區域之胺基酸 序列予以改變，朝向創製藉由使藥效增強且血漿中滯留性提高，以減少投予頻度並發揮持續治療效果，且免疫原性、安全性、物性(安定性及均一性)改善，較TOCILIZUMAB更為優異之第2代分子，而努力研究。其結果，本案發明人等，發現TOCILIZUMAB之可變區域中，使對於抗原之結合能力(親和性)提升的多個CDR變異，並成功將其組合而使親和性大幅提升。又，本案發明人等，成功地藉由導入使可變區域序列之等電點降低的改變，而提高血漿中滯留性。又，本案發明人等，成功地使殘存於TOCILIZUMAB框架之小鼠由來之序列及可變區域中，以電腦模擬(in silico)預測之T細胞抗原決定基胜肽之數減低，使免疫原性風險減低。又，同時，亦成功地使於高濃度的安定性提高。再者，本案發明人等，成功地發現在TOCILIZUMAB之固定區域中，使新T細胞抗原決定基胜肽之出現為最小限度，同時對於Fc γ受體不顯示結合，使於酸性條件下之安定性、鉸鏈區域之雙硫鍵由來之異質性(heterogeneity)、H鏈C末端由來之異質性、高濃度製劑之安定性改善之新穎固定區域序列。藉由組合該等CDR區域胺基酸序列之改變、可變區域胺基酸序列之改變、固定區域胺基酸序列之改變，成功地創製較TOCILIZUMAB更為優異之第2代分子。

更具體而言，提供以下[1]~[44]。

[1]一種使包含抗體可變區域之多胜肽中，保持該可變區域對於抗原之結合活性同時改變等電點之方法，包含：使能露出於該多胜肽之互補性決定區域(CDR)表面之至少1個胺 基酸殘基之電荷改變。

[2]如[1]之方法，其中前述包含抗體可變區域的多胜肽，尚包含FcRn結合區域。

[3]如[1]之方法，其中前述包含抗體可變區域的多胜肽，為IgG抗體。

[4]如[1]之方法，其中前述包含抗體可變區域的多胜肽，為嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。

[5]如[1]之方法，其中前述包含抗體可變區域的多胜肽，為與至少2種類抗原結合之多重專一性多胜肽。

[6]如[1]之方法，其中前述胺基酸殘基之電荷之改變，係胺基酸置換。

[7]如[1]之方法，其中前述胺基酸殘基之電荷之改變，係使理論等電點變化1.0以上之改變。

[8]如[1]之方法，其中能露出於CDR區域表面的胺基酸殘基，係擇自於重鏈可變區域中Kabat編號31位、61位、62位、64位及65位之胺基酸殘基或輕鏈可變區域之中Kabat編號24位、27位、53位、54位及55位之胺基酸殘基中至少1個胺基酸殘基。

[9]一種等電點經過改變之包含抗體可變區域多胜肽，由[1]~[8]中任一項之方法所得到。

[10]一種控制多胜肽之血漿中藥物動力學之方法，包含藉由[1]~[8]中任一項之方法而改變含抗體可變區域之多胜肽之等電點。

[11]如[10]之方法，其中，前述藥物動力學之控制，係使 血漿中廓清(CL)、濃度曲線下面積(AUC)、平均血漿中滯留時間、血漿中半衰期(t1/2)中任一參數增加或減少。

[12]一種血漿中藥物動力學受控制之包含抗體可變區域多胜肽，由[10]之方法所得到。

[13]一種製造等電點經過改變之包含抗體可變區域之多胜肽之方法，包含：(a)使編碼為含該胺基酸殘基之多胜肽的核酸改變，使得能露出於該多胜肽之CDR區域表面之至少1個胺基酸殘基之電荷改變，(b)培養寄主細胞，使得該核酸表現，(c)從寄主細胞培養物回收含抗體可變區域之多胜肽。

[14]如[13]之方法，其中，前述包含抗體可變區域的多胜肽，更包含FcRn結合區域。

[15]如[13]之方法，其中，前述包含抗體可變區域的多胜肽，為IgG抗體。

[16]如[13]之方法，其中，前述包含抗體可變區域的多胜肽，為嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。

[17]如[13]之方法，其中，前述包含抗體可變區域的多胜肽，為與至少2種之抗原結合之多重專一性多胜肽。

[18]如[13]之方法，其中，前述胺基酸殘基之電荷改變，為胺基酸置換。

[19]如[13]之方法，其中，前述胺基酸殘基之電荷之改變，係使理論等電點變化1.0以上之改變。

[20]如[13]之方法，其中，能露出於CDR區域表面之胺基 酸殘基，係擇自於重鏈可變區域中Kabat編號31位、61位、62位、64位及65位之胺基酸殘基或輕鏈可變區域之中Kabat編號24位、27位、53位、54位及55位之胺基酸殘基中至少1個胺基酸殘基。

[21]一種等電點經過改變之包含抗體可變區域多胜肽，由[13]~[20]中任一項之方法所得到。

[22]一種製造血漿中藥物動力學受控制之包含抗體可變區域之多胜肽之方法，包含藉由[13]~[20]中任一項之方法而改變包含抗體可變區域之多胜肽之等電點。

[23]如[22]之方法，其中，前述藥物動力學之控制，係使血漿中廓清(CL)、濃度曲線下面積(AUC)、平均血漿中滯留時間、血漿中半衰期(t1/2)中任一參數增加或減少。

[24]一種血漿中藥物動力學受控制之包含抗體可變區域之多胜肽，由[22]之方法所製造。

[25]一種製造包含具抗體可變區域之第1多胜肽及第2多胜肽之多重專一性多胜肽之方法，包含(a)將編碼為含該胺基酸殘基之多胜肽的核酸予以改變，使得能露出於該多胜肽之CDR區域表面之至少1個胺基酸殘基之電荷改變，該核酸之改變，相較於改變前，係改變編碼為第1多胜肽之胺基酸殘基之核酸及編碼為第2多胜肽之胺基酸殘基之核酸兩者或任一者，使得第1多胜肽與第2多胜肽之等電點差異增大；(b)培養寄主細胞，使得該核酸表現；(c)從寄主細胞培養物回收多重專一性抗體。

[26]如[25]之方法，其中，從寄主細胞培養物回收含第1多胜肽及第2多胜肽之多重專一性多胜肽之步驟，以標準層析進行。

[27]如[25]之方法，其中，前述核酸之改變中，將核酸予以改變成使得第1多胜肽之同多元體、第2多胜肽之同多元體、及第1多胜肽與第2多胜肽之異多元體使用標準層析之分析所得峰部，相較於改變前，成為更分離的峰部。

[28]如[25]之方法，其中，前述多重專一性多胜肽為多重專一性抗體。

[29]一種多重專一性抗體，藉由[27]之方法製造。

[30]如[29]之多重專一性抗體，其中，前述多重專一性抗體為雙重專一性抗體。

[31]一種抗體，包含擇自於人類由來之CDR、人類以外之動物由來之CDR、及合成CDR所構成群組之CDR、人類由來之框架區域(FR)，及人類固定區域，且能露出於CDR表面之至少1個胺基酸殘基，係具有與野生型CDR之對應位置之胺基酸殘基相異電荷之胺基酸殘基，相較於改變前之抗體，保持對於抗原之結合活性，同時等電點經過改變。

[32]如[31]之抗體，其中，前述人類固定區域包含人類Fc區域。

[33]如[31]之抗體，其中，藉由等電點之改變使血漿中藥物動力學受控制。

[34]一種IgG抗體，擇自於重鏈可變區域中Kabat編號31位、61位、62位、64位及65位之胺基酸殘基或輕鏈可變 區域之中Kabat編號24位、27位、53位、54位及55位之胺基酸殘基中至少1個胺基酸殘基之電荷經過改變，與該胺基酸殘基之改變前相較，等電點經過改變。

[35]如[34]之抗體，其中前述經改變之胺基酸殘基，擇自於以下(a)或(b)其中之一群組包含之胺基酸殘基；(a)谷胺酸(E)、天冬醯胺酸(D)；(b)離胺酸(K)、精胺酸(R)、組胺酸(H)。

[36]一種多重專一性抗體，包含第1多胜肽及第2多胜肽，擇自於第1多胜肽之重鏈可變區域中Kabat編號31位、61位、62位、64位及65位之胺基酸殘基或輕鏈可變區域之中Kabat編號24位、27位、53位、54位及55位之胺基酸殘基中至少1個胺基酸殘基具有電荷，且第1多胜肽與第2多胜肽之等電點彼此不同。

[37]如[36]之抗體，其中，擇自於第2多胜肽之重鏈可變區域中Kabat編號31位、61位、62位、64位及65位之胺基酸殘基或輕鏈可變區域之中Kabat編號24位、27位、53位、54位及55位之胺基酸殘基中至少1個胺基酸殘基之電荷，與前述第1多胜肽中選擇之胺基酸殘基具有之電荷具有相反電荷或不具電荷。

[38]如[36]之抗體，其中，具有前述電荷之胺基酸殘基與具有與該胺基酸殘基相反電荷之胺基酸殘基之組合，分別擇自於以下(a)或(b)其中之一群組包含之胺基酸殘基；(c)谷胺酸(E)、天冬醯胺酸(D)；(d)離胺酸(K)、精胺酸(R)、組胺酸(H)。

[39]如[36]之抗體，其中，係包含前述第1多胜肽及第2多胜肽之多重專一性抗體，第1多胜肽之同多元體及第2多胜肽之同多元體利用標準層析之分析，成為分離峰部。

[40]一種組成物，包含[31]~[39]之抗體及醫藥上可容許之擔體。

[41]一種核酸，編碼為構成[31]~[39]之抗體的多胜肽。

[42]一種寄主細胞，具有[41]之核酸。

[43]一種製造[31]~[39]之抗體之方法，包含培養[42]之寄主細胞之步驟，從細胞培養物回收多胜肽之步驟。

[44]一種胺基酸殘基置換方法，於包含抗體可變區域之多胜肽中，保持該多胜肽對於抗原的結合活性，同時將能露出於該多胜肽之互補性決定區域(CDR)表面之胺基酸殘基置換，係將擇自於至少重鏈可變區域之中以Kabat編號為31位、61位、62位、64位及65位之胺基酸殘基或輕鏈可變區域之以Kabat編號為24位、27位、53位、54位及55位之胺基酸殘基中至少1個胺基酸殘基置換。

又，本發明，提供以下[1]~[38]。

[1]一種製造血中動態受控制之Glypican3抗體之方法，由以下階段構成，包含；(a)將編碼為造成能露出於Glypican3抗體表面之至少一胺基酸殘基之電荷改變之至少一胺基酸殘基的核酸予以改變，(b)培養保持該核酸之寄主細胞，使得該核酸表現，(c)從該寄主細胞之培養物回收Glypican3抗體。

[2]如[1]之方法，其中，前述血中動態之控制，係血中半衰期、平均血中滯留時間、血中廓清任一參數之伸張或減縮。

[3]如[1]之方法，其中，步驟(a)中，胺基酸殘基之電荷改變，係利用胺基酸置換進行。

[4]如[1]之方法，其中，能露出於前述Glypican3抗體表面之胺基酸殘基，位於Glypican3抗體中之FcRn結合區域以外之區域。

[5]如[4]之方法，其中，前述FcRn結合區域，由Fc區域構成。

[6]如[1]之方法，其中，Glypican3抗體為IgG抗體。

[7]如[6]之方法，其中，該電荷經過改變之胺基酸殘基，為IgG抗體之重鏈可變區域或輕鏈可變區域之胺基酸殘基。

[8]如[7]之方法，其中，前述Glypican3抗體包含互補性決定區域(CDR)、人類由來之框架區域(FR)及人類固定區域，步驟(a)中，胺基酸殘基之電荷改變，係從供改變之抗體之CDR或FR中能露出於抗體表面之至少一胺基酸殘基，改變為具有與該胺基酸殘基相異電荷之胺基酸殘基。

[9]如[8]之方法，其中，前述Glypican3抗體，結合於其Fc區域之海藻糖含量降低。

[10]一種Glypican3抗體，依照[1]至[9]之方法製造。

[11]一種Glypican3抗體之安定化方法，特徵在於：由以下階段構成，將帶來包含互補性決定區域(CDR)、人類由來之 框架區域(FR)及人類固定區域之Glypican3抗體之Tm值增大之構成Glypican3抗體之至少一胺基酸殘基改變；(a)將編碼為造成供改變之Glypican3抗體之Tm值增大之至少一胺基酸殘基之核酸予以改變，(b)培養保持該核酸之寄主細胞，使得該核酸表現，(c)從該寄主細胞之培養物回收抗體。

[12]如[11]之方法，其中，步驟(a)中，胺基酸殘基存在於其H鏈或L鏈之FR1區域或/及FR2區域。

[13]如[12]之方法，其中，將[12]之H鏈之FR2區域之胺基酸殘基置換為VH4次類之FR2區域之胺基酸殘基。

[14]如[12]之方法，其中，將[12]之L鏈之FR2區域之胺基酸殘基置換為VK3次類之FR2區域之胺基酸殘基。

[15]一種控制抗體之細胞傷害活性之方法，由以下階段構成；(a)將編碼為造成能露出於具細胞傷害活性之抗體表面之至少一胺基酸殘基之電荷改變的至少一胺基酸殘基的核酸予以改變，(b)培養保持該核酸之寄主細胞，使得該核酸表現，(c)從該寄主細胞之培養物回收抗體。

[16]如[15]之方法，其中，前述血中動態之控制，係血中半衰期、平均血中滯留時間、血中廓清任一參數之控制。

[17]如[15]之方法，其中，步驟(a)中，胺基酸殘基之電荷改變，係利用胺基酸置換。

[18]如[15]之方法，其中，能露出於前述抗體表面之胺基 酸殘基，位於抗體中之FcRn結合區域以外之區域。

[19]如[18]之方法，其中，前述FcRn結合區域由Fc區域所構成。

[20]如[15]之方法，其中，Glypican3抗體為IgG抗體。

[21]如[20]之方法，其中，該電荷經改變之胺基酸殘基，為IgG抗體之重鏈可變區域或輕鏈可變區域之胺基酸殘基。

[22]如[21]之方法，其中，前述抗體包含人類以外之動物由來之互補性決定區域(CDR)、人類由來之框架區域(FR)及人類固定區域，步驟(a)中，胺基酸殘基之電荷改變，係從於供改變之抗體之CDR或FR中能露出抗體表面之至少一胺基酸殘基，改變為具有與該胺基酸殘基相異電荷之胺基酸殘基。

[23]如[22]之方法，其中，結合於前述抗體之Fc區域的低海藻糖含量抗體。

[24]一種抗體，依照[15]至[23]之方法製造。

[25]如[24]之抗體，其中，抗體為Glypican3抗體。

[26]一種抗體，包含H鏈V區域及L鏈V區域，該H鏈V區域係對於構成以序列識別號：195表示之H鏈V區域之胺基酸殘基以下述任一或複數個置換；(a)19號之胺基酸殘基K置換為T，(b)43號之胺基酸殘基Q置換為E，(c)63號之胺基酸殘基K置換為S，(d)65號之胺基酸殘基K置換為Q， (e)66號之胺基酸殘基G置換為D，該L鏈V區域，係對於構成以序列識別號：201表示之L鏈V區域之胺基酸殘基施加以下任一或複數個置換；(f)27號之胺基酸殘基Q置換為E，(g)79號之胺基酸殘基K置換為T，(h)82號之胺基酸殘基R置換為S。

[27]如[26]之抗體，其中，由序列識別號：197表示之H鏈及序列識別號：203表示之L鏈構成。

[28]如[26]之抗體，其中，由序列識別號：198表示之H鏈及序列識別號：204表示之L鏈構成。

[29]一種抗體，包含H鏈V區域及L鏈V區域，該H鏈V區域係對於構成以序列識別號：195表示之H鏈V區域之胺基酸殘基施加以下任一或更多置換；(a)43號之胺基酸殘基Q置換為K，(b)52號之胺基酸殘基D置換為N，(c)107號之胺基酸殘基Q置換為R，該L鏈V區域，係對於構成以序列識別號：201表示之L鏈V區域之胺基酸殘基施加以下任一或更多置換；(d)17號之胺基酸殘基E置換為Q，(e)27號之胺基酸殘基Q置換為R，(f)105號之胺基酸殘基Q置換為R。

[30]如[29]之抗體，其中，包含序列識別號：198表示之H鏈可變區域及序列識別號：204表示之L鏈可變區域。

[31]如[29]之抗體，其中，包含序列識別號：199表示之H 鏈可變區域及序列識別號：205表示之L鏈可變區域。

[32]如[26]至[31]之抗體，其中，包含人類抗體之C區域。

[33]一種組成物，包含[32]之抗體，及醫藥上可容許之擔體。

[34]一種癌治療劑，包含[32]之抗體作為有效成分。

[35]如[34]之癌治療劑，其中，癌為肝癌。

[36]一種核酸，編碼為構成[26]至[31]之抗體的多胜肽。

[37]一種寄主細胞，保持[36]之核酸。

[38]一種製造如[26]至[31]之抗體之方法，包含培養[37]之寄主細胞之步驟，及從細胞培養物回收多胜肽之步驟。

又，本發明提供以下[1]~[41]。

[1]一種抗IL-6受體抗體，記載於以下(a)~(y)任一項；

(a)一種包含重鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：1所記載之胺基酸序列中，1號之Ser被置換為其他胺基酸之CDR1。

(b)一種包含重鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：1所記載之胺基酸序列中，5號之Trp被置換為其他胺基酸之CDR1。

(c)一種包含重鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：2所記載之胺基酸序列中，1號之Tyr被置換為其他胺基酸之CDR2。

(d)一種包含重鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：2所記載之胺基酸序列中，8號之Thr被置換為其他胺基酸之CDR2。

(e)一種包含重鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：2所記載之胺基酸序列中，8號之Thr被置換為其他胺基酸之CDR2。

(f)一種包含重鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：3所記載之胺基酸序列中，1號之Ser被置換為其他胺基酸之CDR3。

(g)一種包含重鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：3所記載之胺基酸序列中，2號之Leu被置換為其他胺基酸之CDR3。

(h)一種包含重鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：3所記載之胺基酸序列中，5號之Thr被置換為其他胺基酸之CDR3。

(i)一種包含重鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：3所記載之胺基酸序列中，7號之Ala被置換為其他胺基酸之CDR3。

(j)一種包含重鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：3所記載之胺基酸序列中，8號之Met被置換為其他胺基酸之CDR3。

(k)一種包含重鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：3所記載之胺基酸序列中，1號之Ser及5號之Thr被置換為其他胺基酸之CDR3。

(l)一種包含重鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：3所記載之胺基酸序列中，2號之Leu、7號之Ala及8號之Met被置換為其他胺基酸之CDR3。

(m)一種包含輕鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：4所記載之胺基酸序列中，1號之Arg被置換為其他胺基酸之CDR1之鏈可變區域，(n)一種包含輕鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：4所記載之胺基酸序列中，4號之Gln被置換為其他胺基酸之CDR1。

(o)一種包含輕鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：4所記載之胺基酸序列中，9號之Tyr被置換為其他胺基酸之CDR1。

(p)一種包含輕鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：4所記載之胺基酸序列中，11號之Asn被置換為其他胺基酸之CDR1。

(q)一種包含輕鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：5所記載之胺基酸序列中，2號之Thr被置換為其他胺基酸之CDR2。

(r)一種包含輕鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：6所記載之胺基酸序列中，1號之Gln被置換為其他胺基酸之CDR3。

(s)一種包含輕鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：6所記載之胺基酸序列中，3號之Gly被置換為其他胺基酸之CDR3。

(t)一種包含輕鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：4所記載之胺基酸序列中，9號之Tyr被置換為其他胺基酸之CDR1，及序列識別號：6所記載之胺基酸序列中，3號之 Gly被置換為其他胺基酸之CDR3。

(u)一種包含輕鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：6所記載之胺基酸序列中，5號之Thr被置換為其他胺基酸之CDR3。

(v)一種包含輕鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：6所記載之胺基酸序列中，1號之Gln及5號之Thr被置換為其他胺基酸之CDR3。

(w)一種包含重鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：2所記載之胺基酸序列中，9號之Thr被置換為其他胺基酸之CDR2、及序列識別號：3所記載之胺基酸序列中，1號之Ser及5號之Thr被置換為其他胺基酸之CDR3。

(x)一種抗體，包含(k)之重鏈可變區域及(v)之輕鏈可變區域，或(y)如(x)所記載的抗體，更包含(e)之CDR2。

[2]序列識別號：5所記載之胺基酸序列中，2號之Thr被置換為其他胺基酸之CDR2之輕鏈可變區域的抗IL-6受體抗體、[3]以下(a)~(y)任一項之抗IL-6受體抗體；(a)一種包含重鏈可變區域的抗體，具有序列識別號：7所記載之胺基酸序列中，13號之Arg被置換為其他胺基酸之FR1。

(b)一種包含重鏈可變區域的抗體，具有序列識別號：7所記載之胺基酸序列中，16號之Gln被置換為其他胺基酸之FR1。

(c)一種包含重鏈可變區域的抗體，具有序列識別號：7所記載之胺基酸破裂中，23號之Thr被置換為其他胺基酸之FR1。

(d)一種包含重鏈可變區域的抗體，具有序列識別號：7所記載之胺基酸序列中，30號之Thr被置換為其他胺基酸之FR1。

(e)一種包含重鏈可變區域的抗體，具有序列識別號：7所記載之胺基酸序列中，13號之Arg、16號之Gln、23號之Thr及30號之Thr被置換為其他胺基酸之FR1。

(f)一種包含重鏈可變區域的抗體，具有序列識別號：8所記載之胺基酸序列中，8號之Arg被置換為其他胺基酸之FR2。

(g)一種包含重鏈可變區域的抗體，具有序列識別號：9所記載之胺基酸序列中，4號之Met被置換為其他胺基酸之FR3。

(h)一種包含重鏈可變區域的抗體，具有序列識別號：9所記載之胺基酸序列中，5號之Leu被置換為其他胺基酸之FR3。

(i)一種包含重鏈可變區域的抗體，具有序列識別號：9所記載之胺基酸序列中，16號之Arg被置換為其他胺基酸之FR3。

(j)一種包含重鏈可變區域的抗體，具有序列識別號：9所記載之胺基酸序列中，27號之Val被置換為其他胺基酸之FR3。

(k)一種包含重鏈可變區域的抗體，具有序列識別號：9所記載之胺基酸序列中，4號之Met、5號之Leu、16號之Arg及27號之Val被置換為其他胺基酸之FR3。

(l)一種包含重鏈可變區域的抗體，具有序列識別號：10所記載之胺基酸序列中，3號之Gln被置換為其他胺基酸之FR4。

(m)一種包含輕鏈可變區域的抗體，具有序列識別號：11所記載之胺基酸序列中，18號之Arg被置換為其他胺基酸之FR1。

(n)一種包含輕鏈可變區域的抗體，具有序列識別號：12所記載之胺基酸序列中，11號之Lys被置換為其他胺基酸之FR2。

(o)一種包含輕鏈可變區域的抗體，具有序列識別號：13所記載之胺基酸序列中，23號之Gln被置換為其他胺基酸之FR3。

(p)一種包含輕鏈可變區域的抗體，具有序列識別號：13所記載之胺基酸序列中，24號之Pro被置換為其他胺基酸之FR3。

(q)一種包含輕鏈可變區域的抗體，具有序列識別號：13所記載之胺基酸序列中，27號之Ile被置換為其他胺基酸之FR3。

(r)一種包含輕鏈可變區域的抗體，具有序列識別號：13所記載之胺基酸序列中，23號之Gln、24號之Pro及27號之Ile被置換為其他胺基酸之之FR3。

(s)一種包含輕鏈可變區域的抗體，具有序列識別號：14所記載之胺基酸序列中，10號之Lys被置換為其他胺基酸之FR4。

(t)一種包含重鏈可變區域的抗體，具有序列識別號：10所記載之胺基酸序列中，5號之Ser被置換為其他胺基酸之FR4。

(u)一種包含重鏈可變區域的抗體，具有序列識別號：10所記載之胺基酸序列中，3號之Gln及5號之Ser被置換為其他胺基酸之FR4。

(v)一種包含重鏈可變區域的抗體，具有序列識別號：184之胺基酸序列之FR3。

(w)一種包含重鏈可變區域的抗體，具有(e)之FR1、(f)之FR2、(k)之FR3及(l)或(u)之FR4。

(x)一種包含輕鏈可變區域的抗體，具有(m)之FR1、(n)之FR2、(r)之FR3及(s)之FR4或(y)一種抗體，包含(w)之重鏈可變區域及(x)之輕鏈可變區域。

[4]以下(a)~(l)任一項之抗IL-6受體抗體；(a)一種包含重鏈可變區域的抗體，具有序列識別號：1所記載之胺基酸序列中，1號之Ser被置換為其他胺基酸之CDR1。

(b)一種包含重鏈可變區域的抗體，具有序列識別號：2所記載之胺基酸序列中，9號之Thr被置換為其他胺基酸之CDR2。

(c)一種包含重鏈可變區域的抗體，具有序列識別號：2所記載之胺基酸序列中，16號之Ser被置換為其他胺基酸之CDR2。

(d)一種包含重鏈可變區域的抗體，具有序列識別號：2所記載之胺基酸序列中，9號之Thr及16號之Ser被置換為其他胺基酸之CDR2。

(e)一種包含輕鏈可變區域的抗體，具有序列識別號：4所記載之胺基酸序列中，1號之Arg被置換為其他胺基酸之CDR1。

(f)一種包含輕鏈可變區域的抗體，具有序列識別號：5所記載之胺基酸序列中，2號之Thr被置換為其他胺基酸之CDR2。

(g)一種包含輕鏈可變區域的抗體，具有序列識別號：5所記載之胺基酸序列中，4號之Arg被置換為其他胺基酸之CDR2。

(h)一種包含輕鏈可變區域的抗體，具有序列識別號：5所記載之胺基酸序列中，2號之Thr及4號之Arg被置換為其他胺基酸之CDR2。

(i)一種包含輕鏈可變區域的抗體，具有序列識別號：6所記載之胺基酸序列中，5號之Thr被置換為其他胺基酸之CDR3。

(j)一種包含重鏈可變區域的抗體，具有(a)之CDR1、(d)之CDR2及序列識別號：3之胺基酸序列之CDR3。

(k)一種包含輕鏈可變區域的抗體，具有(e)之CDR1、(h) 之CDR2及(i)之CDR3，或(l)一種抗體，包含(j)之重鏈可變區域及(k)之輕鏈可變區域。

[5]以下(a)~(f)任一項之抗IL-6受體抗體；(a)一種包含重鏈可變區域的抗體，具有序列識別號：1之胺基酸序列中，1號之Ser置換為其他胺基酸序列之CDR1、序列識別號：2之胺基酸序列中，9號之Thr及16號之Ser被置換為其他胺基酸之CDR2、及序列識別號：3之胺基酸序列中，1號之Ser及5號之Thr被置換為其他胺基酸之CDR3。

(b)一種包含輕鏈可變區域的抗體，具有序列識別號：4之胺基酸序列中，1號之Arg被置換為其他胺基酸之CDR1、序列識別號：5之胺基酸序列中，2號之Thr及4號之Arg被置換為其他胺基酸之CDR2、及序列識別號：6之胺基酸序列中，1號之Gln及5號之Thr被置換為其他胺基酸之CDR3。

(c)一種抗體，包含具序列識別號：22之胺基酸序列之重鏈可變區域。

(d)一種抗體，包含具序列識別號：23之胺基酸序列之輕鏈可變區域。

(e)一種抗體，包含(a)之重鏈可變區域及(b)之輕鏈可變區域。

或

(f)一種抗體，包含(c)之重鏈可變區域及(d)之輕鏈可變區 域的。

[6]以下(a)~(c)任一項之人類抗體固定區域；

(a)人類抗體固定區域，特徵在於：序列識別號：19之胺基酸序列中，329號(EU編號446號)之Gly與330號(EU編號447號)之Lys兩者欠缺。

(b)人類抗體固定區域，特徵在於：序列識別號：20之胺基酸序列中，325號(EU編號446號)之Gly與326號(EU編號447號)之Lys兩者欠缺。

(c)人類抗體固定區域，，特徵在於：序列識別號：21之胺基酸序列中，326號(EU編號446號)之Gly與327號(EU編號447號)之Lys兩者欠缺。

[7]IgG2固定區域，序列識別號：20之胺基酸序列中，209號(EU編號330號)、210號(EU編號331號)及218號(EU編號339號)之胺基酸被置換為其他胺基酸。

[8]一種IgG2固定區域，序列識別號：20之胺基酸序列中，276號(EU編號397號)之胺基酸被置換為其他胺基酸。

[9]一種IgG2固定區域，序列識別號：20之胺基酸序列中，14號(EU編號131號)、102號(EU編號219號)，及/或16號(EU編號133號)之胺基酸被置換為其他胺基酸。

[10]如[9]之IgG2固定區域，其中，序列識別號：20之胺基酸序列中，20號(EU編號137號)及21號(EU編號138號)之胺基酸尚置換為其他胺基酸。

[11]一種IgG2固定區域，序列識別號：20之胺基酸序列中，147號(EU編號268號)之His、234號(EU編號355號) 之Arg及/或298號(EU編號419號)之Gln被置換為其他胺基酸。

[12]一種IgG2固定區域，序列識別號：20之胺基酸序列中，209號(EU編號330號)、210號(EU編號331號)、218號(EU編號339號)、276號(EU編號397號)、14號(EU編號131號)、16號(EU編號133號)、102號(EU編號219號)、20號(EU編號137號)及21號(EU編號138號)之胺基酸被置換為其他胺基酸之胺基酸序列。

[13]如[12]之IgG2固定區域，尚具325號(EU編號446號)之Gly及326號(EU編號447號)之Lys欠缺之胺基酸序列。

[14]一種IgG2固定區域，具有於序列識別號：20之胺基酸序列中，276號(EU編號397號)、14號(EU編號131號)、16號(EU編號133號)、102號(EU編號219號)、20號(EU編號137號)及21號(EU編號138號)之胺基酸被置換為其他胺基酸之胺基酸序列。

[15]如[14]之IgG2固定區域，尚具325號(EU編號446號)之Gly及326號(EU編號447號)之Lys欠缺之胺基酸序列。

[16]IgG2固定區域，具有於序列識別號：20之胺基酸序列中，14號(EU編號131號)之Cys、16號(EU編號133號)之Arg、102號(EU編號219號)之Cys、20號之(EU編號137號)之Glu、21號(EU編號138號)之Ser、147號(EU編號268號)之His、234號(EU編號355號)之Arg及298號(EU編號419號)之Gln被置換為其他胺基酸之胺基酸序列。

[17]如[16]之IgG2固定區域，尚具325號(EU編號446號)之Gly及326號(EU編號447號)之Lys欠缺之胺基酸序列。

[18]一種IgG2固定區域，具有於序列識別號：20之胺基酸序列中，14號(EU編號131號)之Cys、16號(EU編號133號)之Arg、102號(EU編號219號)之Cys、20號之(EU編號137號)之Glu、21號(EU編號138號)之Ser、147號(EU編號268號)之His、234號(EU編號355號)之Arg、298號(EU編號419號)之Gln、及313號(EU編號434號)之Asn被置換為其他胺基酸之胺基酸序列。

[19]如[18]之IgG2固定區域，更具325號(EU編號446號)之Gly及326號(EU編號447號)之Lys欠缺之胺基酸序列。

[20]一種IgG4固定區域，特徵在於：序列識別號：21之胺基酸序列中，289號(EU編號409號)之胺基酸置換為其他胺基酸。

[21]一種IgG4固定區域，具有於序列識別號：21之胺基酸序列中，289號(EU編號409號)、14號、16號、20號、21號、87號、100號、102號、103號、104號及105號(EU編號131、133、137、138、214、217、219、220、221、222號)、113號、114號及115號(EU編號233、234、235號)之胺基酸置換為其他胺基酸，且116號(EU編號236號)之胺基酸欠缺之胺基酸序列。

[22]如[21]之IgG4固定區域，326號(EU編號446號)之Gly與327號(EU編號447號)之Lys缺失。

[23]一種IgG2固定區域，具有於序列識別號：20之胺基 酸序列中，209號(EU編號330號)之Ala、210號(EU編號331號)之Pro、218號(EU編號339號)之Thr、14號(EU編號131號)之Cys、16號(EU編號133號)之Arg、102號(EU編號219號)之Cys、20號(EU編號137號)之Glu、21號(EU編號138號)之Ser被置換為其他胺基酸之胺基酸序列。

[24]如[23]之IgG2固定區域，更具有325號(EU編號446號)之Gly及326號(EU編號447號)之Lys欠缺之胺基酸序列。

[25]一種IgG2固定區域，具有於序列識別號：20之胺基酸序列中，14號(EU編號131)之Cys、16號(EU編號133)之Arg、102號(EU編號219)之Cys、20號(EU編號137)之Glu、21號之(EU編號138)之Ser被置換為其他胺基酸之胺基酸序列。

[26]如[25]之IgG2固定區域中，更具有325號(EU編號446號)之Gly及326號(EU編號447號)之Lys欠缺之胺基酸序列。

[27]一種固定區域，具序列識別號：24之胺基酸序列。

[28]一種固定區域，具序列識別號：118之胺基酸序列。

[29]一種固定區域，具序列識別號：25之胺基酸序列。

[30]一種固定區域，具序列識別號：151之胺基酸序列。

[31]一種固定區域，具序列識別號：152之胺基酸序列。

[32]一種固定區域，具序列識別號：153之胺基酸序列。

[33]一種固定區域，具序列識別號：164之胺基酸序列。

[34]一種人類抗體固定區域，具序列識別號：194(M40△GK)之胺基酸序列。

[35]一種人類抗體固定區域，具序列識別號：192(M86△GK)之胺基酸序列。

[36]一種抗體，具[6]~[35]任一固定區域。

[37]如[36]之抗體，結合於IL-6受體。

[38]一種抗人類IL-6受體抗體，對於IL-6受體之結合活性為1nM以下。

[39]一種抗人類IL-6受體抗體，全長抗體之實測等電點為7.0以下或可變區域之理論等電點為5.0以下。

[40]一種抗IL-6受體抗體，特徵在於：於20mM Histidine-HCl,150mM NaCl,pH6.5~7.0之緩衝液下且抗體濃度100mg/mL之條件中，於25℃經過1個月後之抗體之聚集體比率增加為0.3%以下。

[41]一種醫藥組成物，含[36]~[40]任一項之抗體。

[發明之實施形態]

本發明提供將包含抗體可變區域之多胜肽中，保持該可變區域對於抗原的結合活性並改變等電點之方法，包含將能露出於該多胜肽之互補性決定區域(CDR)表面之至少1個胺基酸殘基之電荷變換。又，本發明提供包含依照該方法得到之等電點經過改變之抗體可變區域的多胜肽(例如，為包含擇自於人類由來之CDR、人類以外動物由來之 CDR及合成CDR所構成群組之CDR，人類由來之框架區域(FR)，及人類固定區域之抗體，能露出於CDR表面之至少1個胺基酸殘基為與野生型CDR之對應位置之胺基酸殘基具相異電荷之胺基酸殘基，相較於改變前之抗體，保持對於抗原之結合活性且等電點經改變)。

本發明之方法之較佳態樣，係包含改變能露出於抗體表面之至少一胺基酸殘基之電荷之方法。亦即，改變抗體之胺基酸殘基之電荷，藉由使其等電點(pI)變化，能控制該抗體之血漿中藥物動力學(血中動態)。其結果，血漿中藥物動力學受控制之抗體相較於未受控制之抗體，例如能對於癌細胞發揮更優異之抗腫瘤活性。

本發明之方法中，保持對於抗原之結合活性，係指相較於改變前之胜肽之結合活性，具至少80%以上，較佳為85%以上，尤佳為90%以上之活性。又，抗體與抗原結合時，只要保持該抗體具有功能能維持程度之結合活性即可，例如於生理條件下、37℃中，測定之親和性為100nM以下即可，較佳為50nM以下，更佳為10nM以下，又更佳為1nM以下。本發明之方法得到之等電點經過改變之包含抗體可變區域之多胜肽，是否保持著對於抗原之結合活性，可利用公知方法，例如BIACORE(分子間交互作用解析)、細胞增殖分析、ELISA(酵素結合免疫吸附檢定法)、EIA(酵素免疫測定法)、RIA(放射免疫測定法)或螢光免疫法等測定。

本發明之「包含抗體可變區域之多胜肽」，例如抗體、低分子化抗體、支架(Scaffold)蛋白質等，但不限於該等。

本發明中，支架(Scaffold)蛋白質，只要是能結合於至少1個抗原之立體構造安定的胜肽即能使用。如此種胜肽，例如抗體可變區域片段、纖維連結蛋白(fibronectin)、Protein A結構域、LDL受體A結構域、lipocalin等，此外例如Nygren等人(Current Opinion in Structural Biology,7：463-469(1997)、Journal of Immunol Methods,290：3-28(2004))、Binz等人(Nature Biotech 23：1257-1266(2005))、Hosse等人(Protein Science 15：14-27(2006))之分子。

本發明中，「抗體」之用語係以最廣義使用，只要呈現所望生物學活性，包含單株抗體、多株抗體、抗體變異體(嵌合抗體、人類化抗體、低分子化抗體(抗體片段亦包含在內)、多重專一性抗體等)。本發明中，該等抗體之取得(製作)時，可適當使用本發明之抗體改變方法。

本發明中，「抗體」，包含對於如上所述胺基酸殘基之電荷經改變之抗體，進一步藉由胺基酸置換、缺失、加成及/或插入等，使胺基酸序列改變之抗體。又，包含胺基酸之置換、缺失、加成及/或插入、或嵌合化或人類化等胺基酸序列經改變之抗體，進一步使胺基酸殘基之電荷改變的抗體。亦即，可於進行小鼠抗體人類化之步驟同時進行改變，或將人類化抗體進一步改變亦可。

胺基酸之置換、缺失、加成及/或插入、及人類化、嵌合化等胺基酸序列之改變，可利用對該技術領域中具通常知識者為公知方法實施。同樣地，本發明中，將抗體製作 成重組抗體時利用之抗體可變區域及固定區域，亦可藉由胺基酸之置換、缺失、加成及/或插入、或嵌合化或人類化等而將其胺基酸序列改變。

本發明中，抗體可為小鼠抗體、人類抗體、大鼠抗體、兔抗體、山羊抗體、駱駝抗體等任一動物由來之抗體。再者，例如嵌合抗體，可為其中又將人類化抗體等胺基酸序列置換成的改變抗體。又，可為使各種分子結合成的抗體修飾物、抗體片段、低分子抗體等各種抗體。

「嵌合抗體」，係指將不同動物由來之序列組合製作之抗體。例如，小鼠抗體之重鏈、輕鏈之可變(V)區域與人類抗體之重鏈、輕鏈之固定(C)區域所構成之抗體。嵌合抗體之製作，為公知，例如將編碼為抗體V區域之DNA與編碼為人類抗體C區域之DNA連結，並將其嵌入表現載體後導入寄主使生產，藉此可得嵌合抗體。

又，本發明中，低分子化抗體只要具有對於抗原之結合能力，則其構造、製造法等不特別限定。低分子化抗體之中，尚存在較全長抗體更高活性之抗體(Orita et al.,Blood(2005)105：562-566)。本說明書中，「低分子化抗體」，只要是全長抗體(完整抗體，例如完整IgG等)之一部分，即不特別限定，但以含重鏈可變區域(VH)或輕鏈可變區域(VL)較佳。較佳抗體片段之例，例如Fab、F(ab’)2、Fab’、Fv等。抗體片段中之VH或VL之胺基酸序列，可藉由置換、缺失、加成及/或插入加以改變。再者，只要保持對於抗原之結合能力，則VH及VL可以一部分欠缺。例如， 前述抗體片段之中「Fv」，為包含完整抗原認識部位及結合部位的最小抗體片段。「Fv」，係將1個VH及1個VL以非共價鍵強力結合之二元體(VH-VL二元體)。可藉由各可變區域之3個互補鏈決定區域(complementarity determining region；CDR)，在VH-VL二元體表面形成抗原結合部位。6個CDR在抗體提供抗原結合部位。然而，即使為1個可變區域(或僅含有對於抗原具專一性之3個CDR的Fv的一半)，雖較完全結合部位之親和性為低，但認識抗原，且具有結合之能力。因此，如此較Fv更小的分子，在本發明中亦包含在低分子化抗體。又，低分子化抗體可變區域可經嵌合化或人類化。

低分子化抗體，較佳為含VH及VL雙方。低分子化抗體之例，例如Fab、Fab’、F(ab’)2及Fv等抗體片段，及利用抗體片段製作之scFv(單鏈Fv)(Huston et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85：5879-83；Pluckthun「The Pharmacology of Monoclonal Antibodies」Vol.113,Resenburg及Moore編，Springer Verlag,New York,pp.269-315,(1994))、雙價抗體(Diabody)(Holliger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90：6444-8；EP404097號；WO93/11161號；Johnson et al.,Method in Enzymology(1991)203：88-98；Holliger et al.,Protein Engineering(1996)9：299-305；Perisic et al.,Structure(1994)2：1217-26；John et al.,Protein Engineering(1999)12(7)：597-604；Atwell et al., Mol.Immunol.(1996)33：1301-12)、sc(Fv)2(Hudson et al,J Immunol.Methods(1999)231：177-89；Orita et al.,Blood(2005)105：562-566)、三價抗體(Triabody)(Journal of Immunological Methods(1999)231：177-89)，及串連雙價抗體(tandem Diabody)(Cancer Research(2000)60：4336-41)等。

抗體片段，可將抗體以酵素例如木瓜酵素、胰蛋白酶等蛋白酶處理得到(參考Morimoto et al.,J.Biochem.Biophys.Methods(1992)24：107-17；Brennan et al.,Science(1985)229：81)。又，可以依據該抗體片段之胺基酸序列，以基因重組製造。

具有抗體片段經過改變構造之低分子化抗體，可利用藉由酵素處理或基因重組得到之抗體片段構建。或，構建編碼為低分子化抗體全體之基因，並將其導入表現載體後，於適當寄主細胞使表現(例如，參考Co et al.,J.Immunol.(1994)152：2968-76；Better and Horwitz,Methods Enzymol.(1989)178：476-96；Pluckthun and Skerra,Methods Enzymol.(1989)178：497-515；Lamoyi,Methods Enzymol.(1986)121：652-63；Rousseaux et al.,Methods Enzymol.(1986)121：663-9；Bird and Walker,Trends Biotechnol.(1991)9：132-7)。

又，上述「scFv」，係將2個可變區域，視需要透過連結子等使結合之單鏈多胜肽。scFv包含之2個可變區域，通常為1個VH及1個VL，但亦可為2個VH或2個VL。 一般而言，scFv多胜肽，在VH及VL結構域之間包含連結子，藉此形成為了抗原結合必要之VH及VL之配對部分。 通常，為了在同分子內於VH及VL之間形成配對部分，一般而言，使連結VH及VL之連結子為10個胺基酸以上長度之胜肽連結子。然而，本發明中，scFv之連結子，只要不妨礙scFv形成，不限定於如此種胜肽連結子。scFv之綜論，可參考Pluckthun『The Pharmacology of Monoclonal Antibody』Vol.113(Rosenburg and Moore ed.,Springer Verlag,NY,pp.269-315(1994))。

又，「雙價抗體(diabody；Db)」，係指藉由基因融合構建之二價(bivalent)抗體片段(P.Holliger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)、EP404,097號、WO93/11161號等)。雙價抗體，係由2條多胜肽鏈構成之二元體，多胜肽鏈各在同鏈中以輕鏈可變區域(VL)及重鏈可變區域(VH)無法彼此結合程度之短例如約5個殘基的連結子所結合。編碼在同多胜肽鏈上之VL與VH，由於其間之連結子短，因此無法形成單鏈V區域片段，而形成二元體，所以雙價抗體成為具2個抗原結合部位。此時，若使對於2個相異抗原決定基(a、b)之VL及VH以VLa-VHb與VLb-VHa之組合利用約5個殘基之連結子連結者同時表現，則會分泌雙重專一性Db。

雙價抗體(Diabody)由於包含2分子scFv，因此包含4個可變區域，其結果成為具2個抗原結合部位。與不形成二元體之scFv之情形相異，以雙價抗體(Diabody)形成為 目的時，通常將各scFv分子內之VH及VL間連結之連結子，為胜肽連結子時，定為約5個胺基酸。然而，形成雙價抗體(Diabody)之scFv之連結子，只要不妨礙scFv表現、不妨礙雙價抗體(Diabody)形成，則不限於如此種胜肽連結子。

於多種抗體之同種異構型之中，IgG抗體由於其分子量十分大，因此其主要代謝路徑非經腎排泄之路徑。具有Fc區域作為該分子一部分之IgG抗體，已知藉由在血管等內皮細胞表現之胎兒性Fc受體(FcRn)之廢物利用(salvage)路徑再回收，而具長生體內半衰期。IgG抗體被認為主要以內皮細胞之代謝路徑代謝(He XY,Xu Z,Melrose J,Mullowney A,Vasquez M,Queen C,Vexler V,Klingbeil C,Co MS,Berg EL.Humanization and pharmacokinetics of a monoclonal antibody with specificity for both E- and P-selectin.J Immunol.(1998),160(2),1029-35)。亦即，被內皮細胞非專一性攝入之IgG抗體藉由與FcRn結合，而將IgG抗體再回收，另一方面，未能結合之IgG抗體被代謝。以降低對於FcRn之結合活性之方式使其Fc部分經改變的IgG抗體，血漿中半衰期縮短。反之，為了提高對於FcRn之結合活性，藉由將構成IgG抗體之Fc區域的胺基酸殘基改變，能使IgG抗體之血漿中半衰期伸長(He XY,Xu Z,Melrose J,Mullowney A,Vasquez M,Queen C,Vexler V,Klingbeil C,Co MS,Berg EL.Humanization and pharmacokinetics of a monoclonal antibody with specificity for both E-and P-selectin.J Immunol.(1998),160(2),1029-35)。 如前述，習知IgG抗體之血漿中藥物動力學之控制方法，藉由改變構成Fc區域之胺基酸殘基來改變對於FcRn之結合活性而進行。但是，亦如下述實施例所示可知，本發明中，抗體之血漿中半衰期以高相關性依存於pI。亦即顯示，該改變可以不改變可能獲得免疫原性之構成Fc的胺基酸序列，而控制抗體之血漿中半衰期。

雖無意圖受特定理論拘束，本案發明人等目前考量如下。內皮細胞攝入非專一性IgG抗體之速度，被認為依存於帶負電荷之細胞表面與IgG抗體之物理化學性庫侖交互作用。因此，藉由使IgG抗體之pI降低(上升)使庫侖交互作用減低(增大)，使對內皮細胞之非專一性攝入減少(增大)的結果，能藉由使內皮細胞之代謝減少(增大)，而控制血漿中藥物動力學。由於內皮細胞與細胞表面負電荷之庫侖交互作用係物理化學性交互作用，因此，可認為該交互作用並非無歧異地依存於構成抗體之胺基酸序列本身。因此，本發明發現的血漿中藥物動力學之控制方法，不僅能應用在特定抗體，可廣泛應用在含抗體可變區域的任意多胜肽。就如此胜肽而言，以分子量5萬以上之胜肽較佳，分子量10萬以上的胜肽更佳，分子量14萬以上之胜肽又更佳。如為此種胜肽，主代謝路徑非腎排泄，能充分得到本發明之血漿中藥物動力學控制效果。又，本發明中，庫侖交互作用之減低(增大)，意指以斥力表示之庫侖力之增大(減少)。

本發明中，含FcRn結合區域之多胜肽，不限於IgG抗體，只要是能與Fc受體(FcRn)結合(具結合活性或親和性之)之蛋白質即可。較佳為，本發明中，含FcRn結合區域之多胜肽，不特別限制，但為含抗體之Fc區域或類Fc區域之蛋白質。亦可使用Fc區域經改變之Fc區域，例如，可使用前述J Immunol.(1998),160(2),1029-35之經改變之Fc區域。本發明中，含FcRn結合區域之多胜肽例如，IgG抗體。又，即使為該等抗體(蛋白質)之改變體，只要是能與FcRn結合之蛋白質，則包含在本發明之含FcRn結合區域的多胜肽。本發明中，含FcRn結合區域之多胜肽之最佳例，例如：IgG抗體。

本發明之抗體使用IgG抗體時，只要是IgG型抗體分子，可為各種次型，亦可為多重專一性(例如雙重專一性)之IgG抗體。該雙重專一性抗體為對於2種相異抗原決定基具專一性之抗體，除了認識相異抗原之抗體以外，尚包含認識同一抗原上之相異抗原決定基的抗體。又，即使為抗體分子，如scFv或Fab以腎排泄為主要代謝路徑之低分子化抗體之情形，如前述以pI雖無法控制血漿中藥物動力學，但是，本發明只要是非以腎排泄為主要代謝路徑之包含抗體可變區域的多胜肽，則可應用各種抗體分子形，例如，scFv-Fc、dAb-Fc、Fc融合蛋白質等。該等分子之腎排泄由於非主要代謝路徑，因此，能利用本發明發現的方法使pI變化，藉此控制血漿中藥物動力學。本發明能應用之抗體分子，亦可為類抗體分子。類抗體分子，係指藉由 與標靶分子結合，而能發揮功能的分子(Binz HK,Amstutz P,Pluckthun A.,Engineering novel binding proteins from nonimmunoglobulin domains.,Nat Biotechnol.2005 Oct；23(10)：1257-68.)，例如，DARPins、Affibody、Avimer等。

又，本發明之抗體為例如雙重專一性之抗Glypican3抗體之情形，該抗體亦可對於Glypican3及Glypican3以外抗原之抗原決定基專一性結合。例如，Glypican3以外之抗原，為了充實(recruit)NK細胞、細胞傷害性T細胞、LAK細胞等，較佳為利用對於該等細胞專一性結合之表面抗原。使用從認識腺癌關連抗原MUC1之抗體MUSE11與認識LAK細胞表面抗原之抗體OKT3所製作之雙重專一性抗體，顯示對於膽管癌發揮LAK細胞造成之細胞傷害活性(Katayose Y,Kudo T,Suzuki M,Shinoda M,Saijyo S,Sakurai N,Saeki H,Fukuhara K,Imai K,Matsuno S.MUC1-specific targeting immunotherapy with bispecific antibodies：inhibition of xenografted human bile duct carcinoma growth.Cancer Res.(1996)56(18),4205-12)。取代認識前述MUC1之抗體MUSE11，較佳可應用本發明提供之血漿中藥物動力學經改善之Glypican3抗體。又，本發明提供之雙重專一性之Glypican3抗體，亦可較佳利用認識Glypican3分子之相異抗原決定基的抗體。

又，上述「雙重專一性抗體」，可為例如，重鏈可變 區域及輕鏈可變區域連結成單鏈之構造的抗體(例如，sc(Fv)2)。又，亦可為將重鏈可變區域(VH)及輕鏈可變區域(VL)連結成之scFv(或sc(Fv)2)與Fc區域(欠缺CH1結構域之固定區域)結合成之類抗體分子(例如，scFv-Fc)。 scFv-Fc所構成之多重專一性抗體，為第1多胜肽乃VH1-linker-VL1-Fc、第2多胜肽乃VH2-linker-VL2-Fc所構成之(scFv)2-Fc型構造。或可為使單結構域抗體(single domain antibody)與Fc區域結合成之類抗體分子(Curr Opin Drug Discov Devel.2006,9(2),184-93)。

本發明中，胺基酸殘基電荷之改變，可通過胺基酸置換實施。胺基酸置換可利用後述方法實施。

又本發明中，成為置換對象之能露出於CDR區域表面之胺基酸殘基，從對於抗原之結合活性保持之觀點，較佳為擇自於重鏈可變區域之Kabat編號31位、61位、62位、64位及65位之胺基酸殘基或輕鏈可變區域之Kabat編號24位、27位、53位、54位及55位之胺基酸殘基中至少1個胺基酸殘基。該等胺基酸殘基之置換，於保持胺基酸殘基之置換前含抗體可變區域的多胜肽所有之功能(對於抗原之結合活性等)之觀點，及該置換不受抗體之種類影響之觀點為有用。

又，本發明，藉由使含抗體可變區域之多胜肽之等電點改變，提供控制該多胜肽之藥物動力學之方法。再者，依照該方法得到之藥物動力學受控制之包含抗體可變區域的多胜肽，亦包含在本發明。

本發明中，「血漿中藥物動力學受控制」，係指比較構成抗體之胺基酸之改變前與改變後之抗體血漿中藥物動力學時，血漿中藥物動力學往所望方向改變。亦即，當希望抗體之藥物(血漿中)半衰期伸長時，「血漿中藥物動力學之控制」，係指抗體之血漿中半衰期伸長。當希望抗體之血漿中半衰期縮短時，「血漿中藥物動力學之控制」意指抗體之血漿中半衰期縮短。

本發明中，抗體之血漿中藥物動力學是否往所望方向改變，亦即血漿中藥物動力學是否如所望受控制，可利用實施使用例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猴等之動態試驗而適當評價。又，本發明中，「血漿中半衰期之伸長」或「血漿中半衰期之縮短」，更具體而言，係指除利用稱為血漿中半衰期(t1/2)之參數以外，利用平均血漿中滯留時間、血漿中廓清(CL)、濃度曲線下面積(AUC)、血漿中半衰期等任一參數亦能把握(「利用藥物動力學演習而得之理解」(南山堂))。例如，依照體內動態解析軟體WinNonlin(Pharsight)所附的說明書，實施Noncompartmental解析，可使用該等參數適當評價本發明提供之「血漿中動態之控制」。

又，可藉由血漿中藥物動力學之控制使抗體之功能持續。例如，若將本發明方法應用於具細胞抑制活性之抗體，則能使其功能持續，可調節細胞抑制活性效果、拮抗劑活性、協同劑活性等改變前多胜肽具有之功能之持續時間。

本發明中，「能露出於表面之胺基酸殘基」，通常意 指位在構成抗體之多胜肽表面的胺基酸殘基。「位於多胜肽表面之胺基酸殘基」，意指其側鏈能接觸溶劑分子(通常多為水分子。)之胺基酸殘基，不一定要其側鏈全部接觸溶劑分子，當只要其側鏈一部接觸溶劑分子時，則該胺基酸殘基規定為位在表面之胺基酸。藉由使用市售軟體之同源性模型化等，該技術領域中具通常知識者能製作多胜肽或抗體之同源性模型。依據該同源性模型，能適當選擇位於構成適當抗體之多胜肽表面之胺基酸殘基作為「位在多胜肽表面之胺基酸殘基」。

本發明中，「能露出於表面之胺基酸殘基」，不特別限制，較佳為位於抗體中之FcRn結合區域之外之胺基酸殘基。該FcRn結合區域，較佳為例如Fc區域。

本發明之抗體中，應改變電荷之胺基酸殘基，較佳為構成抗體之重鏈可變區域或輕鏈可變區域的胺基酸殘基。 該可變區域具體而言，較佳為例如互補性決定區域(CDR)、框架區域(FR)。

若為該技術領域中具通常知識者，則可利用同源性模型化等所製作之同源性模型，適當選擇抗體可變區域之中的表面胺基酸殘基。亦即，依據H鏈可變區域之Kabat編號，可從胺基酸殘基H1、H3、H5、H8、H10、H12、H13、H15、H16、H19、H23、H25、H26、H31、H39、H42、H43、H44、H46、H61、H62、H64、H65、H68、H71、H72、H73、H75、H76、H81、H82b、H83、H85、H86、H105、H108、H110、H112當中，適當選擇抗體可變區域之中的表面胺基酸殘 基。例如，序列識別號：195表示之人類化Glypican3抗體之H鏈FR區域中，例如1、3、5、8、10、12、13、15、16、19、23、25、26、39、42、43、44、46、69、72、73、74、76、77、82、85、87、89、90、107、110、112、114號之胺基酸殘基為表面胺基酸，但本發明不限於該等。且，H鏈CDR中表面胺基酸殘基，亦可藉由同樣的同源性模型選擇。亦即，依據Kabat編號，胺基酸殘基H97幾乎在所有抗體露出於表面。例如，序列識別號：195表示之人類化Glypican3抗體之H鏈CDR中，101號之絲胺酸相當於該胺基酸殘基。序列識別號：195表示之人類化Glypican3抗體之H鏈CDR中，其他胺基酸殘基，較佳例如52、54、62、63、65、66號之胺基酸殘基。

L鏈可變區域中，可依據Kabat編號，從胺基酸殘基L1、L3、L7、L8、L9、L11、L12、L16、L17、L18、L20、L22、L24、L27、L38、L39、L41、L42、L43、L45、L46、L49、L53、L54、L55、L57、L60、L63、L65、L66、L68、L69、L70、L74、L76、L77、L79、L80、L81、L85、L100、L103、L105、L106、L107當中，適當選擇抗體可變區域中之表面胺基酸殘基。例如序列識別號：195表示之人類化Glypican3抗體之、1、3、7、8、9、11、12、16、17、18、20、22、43、44、45、46、48、49、50、54、62、65、68、70、71、73、74、75、79、81、82、84、85、86、90、105、108、110、111、112為表面胺基酸，但本發明不限於該等。且，L鏈CDR中之表面胺基酸殘基，可藉此方式，利用H 鏈CDR中之表面胺基酸殘基已決定之同源性模型同樣的同源性模型選擇。序列識別號：201表示之人類化Glypican3抗體之L鏈CDR之中，胺基酸殘基較佳例如24、27、33、55、59號之胺基酸殘基。

本發明提供之方法中，胺基酸殘基之「改變」具體而言，係指原本之胺基酸殘基置換為其他胺基酸殘基、使原本之胺基酸殘基缺失、添加新胺基酸殘基等，但較佳為使原本之胺基酸殘基置換為其他胺基酸殘基。亦即，本發明中，「胺基酸殘基之電荷改變」，較佳為胺基酸置換。

本發明提供之Glypican3抗體，為了進行上述「胺基酸殘基之電荷之改變」，將例如擇自於構成序列識別號：195表示之人類化Glypican3抗體之H鏈可變區域中之19、43、52、54、62、63、65、66、107號之胺基酸殘基至少1個胺基酸殘基之電荷適當改變。又，可將擇自於構成例如序列識別號：201表示之人類化Glypican3抗體之L鏈可變區域中之17、24、27、33、55、59、79、82、105號之胺基酸殘基至少1個胺基酸殘基之電荷適當改變。前述胺基酸殘基之中，該電荷經改變之胺基酸殘基以外之胺基酸殘基，若能得到目的之血漿中藥物動力學控制效果，則無需改變，但可適當改變為與經適當改變之胺基酸殘基具同種電荷或不具電荷。

本發明提供之抗人類IL-6受體抗體(6R_a_H1L1)之CDR中，為了保持對於抗原之結合活性，且進行上述「胺基酸殘基之電荷之改變」，例如，可將擇自於構成序列識 別號：221表示之抗人類IL-6受體抗體之H鏈可變區域中之kabat編號31、64、65號之胺基酸殘基當中至少1個胺基酸殘基之電荷適當改變。又，可將擇自於構成例如序列識別號：224表示之抗人類IL-6受體抗體之L鏈可變區域之kabat編號24、27、53、55號之胺基酸殘基當中至少1個胺基酸殘基之電荷適當改變。前述胺基酸殘基之中，該電荷經改變之胺基酸殘基以外之胺基酸殘基，只要能得到目的之血漿中藥物動力學之控制效果則無需改變，但可適當改變成與經適當改變之胺基酸殘基具同種電荷或不具電荷。

本發明提供之抗人類IL-6受體抗體(6R_b_H1L1)之CDR中，為了保持對抗原之結合活性且進行上述「胺基酸殘基之電荷之改變」，例如可將擇自於構成序列識別號：227表示之抗人類IL-6受體抗體之H鏈可變區域中之kabat編號31號之胺基酸殘基當中至少1個胺基酸殘基之電荷適當改變。又，可將擇自於構成例如序列識別號：229表示之抗人類IL-6受體抗體之L鏈可變區域中之kabat編號24、53、54、55號之胺基酸殘基當中至少1個胺基酸殘基之電荷適當改變。前述胺基酸殘基之中，該電荷經改變之胺基酸殘基以外之胺基酸殘基，只要能得到目的之血漿中藥物動力學之控制效果則無需改變，但可適當改變成與經適當改變之胺基酸殘基具同種電荷或不具電荷。

本發明提供之抗人類GPC3抗體之CDR中，為了保持對抗原之結合活性且進行上述「胺基酸殘基之電荷之改變」， 例如可將擇自於構成例如序列識別號：233表示之抗人類GPC3抗體之H鏈可變區域中kabat編號61、62、64、65號之胺基酸殘基當中至少1個胺基酸殘基之電荷適當改變。又，例如可將擇自於構成序列識別號：236表示之抗人類GPC3抗體之L鏈可變區域中kabat編號之24、27號之胺基酸殘基當中至少1個胺基酸殘基之電荷適當改變。 前述胺基酸殘基之中，該電荷經改變之胺基酸殘基以外之胺基酸殘基，只要能得到目的之血漿中藥物動力學之控制效果則無需改變，但可適當改變成與經適當改變之胺基酸殘基具同種電荷或不具電荷。

本發明提供之抗人類IL-31受體抗體之CDR中，為了保持對抗原之結合活性且進行上述「胺基酸殘基之電荷之改變」，例如可將擇自於構成例如序列識別號：239表示之抗人類IL-31受體抗體之H鏈可變區域中kabat編號61、62、64、65號之胺基酸殘基當中至少1個胺基酸殘基之電荷適當改變。又，例如將擇自於構成序列識別號：242表示之抗人類IL-31受體抗體之L鏈可變區域中kabat編號24、54號之胺基酸殘基當中至少1個胺基酸殘基之電荷適當改變。前述胺基酸殘基之中，該電荷經改變之胺基酸殘基以外之胺基酸殘基，只要能得到目的之血漿中藥物動力學之控制效果則無需改變，但可適當改變成與經適當改變之胺基酸殘基具同種電荷或不具電荷。

胺基酸之中，已知存在帶電荷之胺基酸。一般而言，帶正電荷之胺基酸(正電荷胺基酸)，已知有離胺酸(K)、精 胺酸(R)、組胺酸(H)。帶負電荷之胺基酸(負電荷胺基酸)，已知有天冬醯胺酸(D)、谷胺酸(E)等。該等以外之胺基酸，已知為不帶電荷之胺基酸。

上述「經改變之胺基酸殘基」，較佳為適當擇自於以下(a)或(b)任一群組所含胺基酸殘基，但不特別限制於該等胺基酸。

(a)谷胺酸(E)、天冬醯胺酸(D) (b)離胺酸(K)、精胺酸(R)、組胺酸(H)

又，原本(改變前之)胺基酸殘基已具電荷時，改變成不帶電荷之胺基酸殘基的改變亦為本發明之較佳態樣之一。亦即，本發明中，改變例如：(1)從具電荷之胺基酸置換成不具電荷之胺基酸、(2)從具電荷之胺基酸置換為具與該胺基酸相反電荷之胺基酸、(3)從不帶電荷之胺基酸置換為具電荷之胺基酸。

本發明中，較佳為使構成抗體之胺基酸殘基改變成使抗體之等電點(pI)變化。又，當欲改變之胺基酸殘基存在多數時，供改變之胺基酸殘基中可包含少數不帶電荷之胺基酸殘基。

本發明提供之Glypican3抗體中，「胺基酸殘基之電荷之改變」較佳例如下。使pI值增加之改變，例如，可將構成序列識別號：195表示之人類化Glypican3抗體之H鏈可變區域中之Q43K、D52N、Q107R至少1個進行置換，尤佳為改變為序列識別號：198表示之胺基酸序列。又，例如，可將構成序列識別號：201表示之人類化Glypican3 抗體之L鏈可變區域中之E17Q、Q27R、Q105R至少1個進行置換，尤佳為改變為序列識別號：204表示之胺基酸序列。另一方面，使pI值減少之改變，可將構成序列識別號：195表示之人類化Glypican3抗體之H鏈可變區域中之K19T、Q43E、K63S、K65Q、G66D至少1個進行置換，尤佳為改變為序列識別號：197表示之胺基酸序列。又，可將構成例如序列識別號：201表示之人類化Glypican3抗體之L鏈可變區域中之Q27E、K79T、R82S至少1個進行置換，尤佳為改變為序列識別號：203表示之胺基酸序列。

本發明提供之抗人類IL-6受體抗體(6R_a_H1L1)中，「胺基酸殘基之電荷之改變」較佳例，例如表20之胺基酸置換之中至少1個胺基酸置換。

本發明提供之抗人類IL-6受體抗體(6R_b_H1L1)中，「胺基酸殘基之電荷之改變」之較佳例，例如表22之胺基酸置換之中至少1個胺基酸置換。

本發明提供之抗人類GPC3抗體之中「胺基酸殘基之電荷之改變」之較佳例，例如表24之胺基酸置換之中至少1個胺基酸置換。

本發明提供之抗人類IL-31受體抗體之中「胺基酸殘基之電荷之改變」之較佳例，例如表27之胺基酸置換之中至少1個胺基酸置換。

本發明中，供改變之胺基酸殘基數，不特別限制，例如改變抗體可變區域時，為了不降低與抗原之結合活性，或為了不提高免疫原性，較佳為將為了達成目的之經控制 血漿中藥物動力學的必要最低限度之胺基酸殘基改變。 又，亦可適當將會帶來與抗原之結合活性增大之胺基酸殘基之改變，或會帶來免疫原性降低之胺基酸殘基之改變組合實施。

抗體之抗原結合活性之測定，可使用公知方法。例如，可使用ELISA(酵素結合免疫吸附檢定法)、EIA(酵素免疫測定法)、RIA(放射免疫測定法)或螢光免疫法等。一般的教科書「Antibodies A Laboratory Manual.Ed Harlow、David Lane、Cold Spring Harbor Laboratory、1988」中記載有前述方法。

測定抗體對於細胞之結合活性之方法，例如，Antibodies A Laboratory Manual.(Ed Harlow、David Lane、Cold Spring Harbor Laboratory、1988)359-420頁所記載之方法。亦即，可藉由以細胞作為抗原之BIACORE、細胞增殖分析、ELISA或FACS(fluorescence activated cell sorting)之原理評價。ELISA格式中，抗體對於細胞之結合活性，係藉由比較酵素反應產生之訊號水平而定量評價。亦即，在固定有各強制表現細胞之ELISA平盤加入受試抗體，利用認識受試抗體之酵素標識抗體，檢測結合於細胞之抗體。或，於FACS中，配製受試抗體之稀釋系列，並藉由決定對於各強制表現細胞之抗體結合力價(titer)，可比較對於細胞之結合活性。

未結合於ELISA平盤等擔體、表現於懸浮於緩衝液等之細胞表面上的抗原與對抗該抗原之抗體間的結合，可藉 由FACS格式測定。此種測定使用之流動細胞計數器，例如FACSCanto^TM II、FACSAria^TM、FACSArray^TM、FACSVantage^TM SE、FACSCalibur^TM(以上，為BD Biosciences)、EPICS ALTRA HyPerSort、Cytomics FC 500、EPICS XL-MCL ADC、EPICS XL ADC、Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(以上，為Beckman Coulter)等。

抗體對於抗原之結合活性的較佳測定方法之一例，例如：使表現抗原之細胞與受試抗體反應，以認識受試抗體之FITC標記二次抗體將細胞染色後，以FACSCalibur(BD)進行測定，使用CELL QUEST軟體(BD)解析其螢光強度之方法。依照本方法，將對於表現抗原之細胞表面上之抗原結合之受試抗體以專一性認識之FITC標識標記二次抗體染色後，利用FACSCalibur進行測定時，可將其螢光強度使用CELL QUEST軟體解析之方法得到之幾何平均值(受試幾何平均值)，與使用對照抗體得到之對照幾何平均值比較以判斷。求算幾何平均值(幾何平均)之計算式，記載於CELLQUEST軟體User’s Guide(BD biosciences公司)。

又，為了不使受投予抗體之人類體內之免疫原性上升，經改變之胺基酸序列以人類序列(被視為人類由來之天然抗體之序列)較佳，但本發明不限定於此。再者，較佳為能以使改變後多數FR的每一個(FR1、FR2、FR3、FR4)成為人類序列之方式，在以變化等電點之方式導入改變以外之處導入變異。如此將各FR置換為人類序列之方法，已報告於非專利文獻(Ono K、Ohtomo T、Yoshida K、Yoshimura Y、 Kawai S、Koishihara Y、Ozaki S、Kosaka M、Tsuchiya M.、The humanized anti-HM1.24 antibody effectively kills multiple myeloma cells by human effector cell-mediated cytotoxicity.,Mol Immunol.(1999)36(6)、387-395)。又，為了使抗體之等電點變化，能改變為其他人類FR，使得各FR之電荷變化(例如將能降低抗體之等電點的FR3交換為其他人類FR)。此種人類化方法，已報告在非專利文獻(Dall’Acqua WF、Damschroder MM、Zhang J、Woods RM、Widjaja L、Yu J、Wu H..、Antibody humanization by framework shuffling.、Methods.(2005)36(1)、43-60)。

又，當些許表面電荷之改變達不到目的之受控制血漿中藥物動力學時，可藉由反複表面電荷改變及血漿中藥物動力學之評價，適當取得顯示目的之受控制血漿中藥物動力學的所望抗體。

非專利文獻(He XY、Xu Z、Melrose J、Mullowney A、Vasquez M、Queen C、Vexler V、Klingbeil C、Co MS、Berg EL.Humanization and pharmacokinetics of a monoclonal antibody with specificity for both E- and P-selectin.J Immunol.(1998),160(2),1029-35)中，將抗E、P-Selectin抗體之嵌合抗體(IgG4)chimeric EP5C7.g4與人類化抗體(IgG4)HuEP5C7.g4於普通獼猴(學名Macaca mulatta)之血漿中藥物動力學比較，顯示兩者之血漿中藥物動力學為同等。又，非專利文獻(Gobburu JV、Tenhoor C、Rogge MC、Frazier DE Jr、Thomas D、Benjamin C、Hess DM、Jusko WJ.Pharmacokinetics/dynamics of 5c8、a monoclonal antibody to CD154(CD40 ligand)suppression of an immune response in monkeys.J Pharmacol Exp Ther.(1998)286(2),925-30)中，比較抗CD154抗體之嵌合型抗體ch5d8與人類化抗體Hu5c8於長尾獼猴之血漿中藥物動力學，顯示兩者血漿中藥物動力學為同等。非專利文獻(Kashmiri SV、Shu L、Padlan EA、Milenic DE、Schlom J、Hand PH.、Generation、characterization、and in vivo studies of humanized anticarcinoma antibody CC49.、Hybridoma.(1995)14(5)、461-73)中，顯示嵌合抗體之cCC49與人類化抗體之HuCC49之小鼠之血漿中藥物動力學為同等。又，非專利文獻(Graves SS、Goshorn SC、Stone DM、Axworthy DB、Reno JM、Bottino B、Searle S、Henry A、Pedersen J、Rees AR、Libby RT.、Molecular modeling and preclinical evaluation of the humanized NR-LU-13antibody.、Clin Cancer Res.(1999)5(4),899-908)及非專利文獻(Couto JR、Blank EW、Peterson JA、Ceriani RL.、Anti-BA46 monoclonal antibody Mc3：humanization using a novel positional consensus and in vivo and in vitro characterization.、Cancer Res.(1995)55(8)、1717-22)中，顯示小鼠之評價中，小鼠抗體與人類化抗體之血漿中藥物動力學‧分布為同等，小鼠Fc及人類Fc均 雜交於小鼠FcRn，因此可認為同嵌合抗體與同人類化抗體之血漿中藥物動力學‧分布為同等。如該等例所示，具相同CDR之嵌合抗體與人類化抗體之間，血漿中藥物動力學為同等。亦即，利用非專利文獻(Ghetie V、Popov S、Borvak J、Radu C、Matesoi D、Medesan C、Ober RJ、Ward ES.、Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis.、Nat Biotechnol.(1997)15(7)、637-40)等所示公知方法進行人類化時，相較於嵌合抗體，血漿中藥物動力學為同等，以公知方法無法製作血漿中藥物動力學受控制之人類化抗體。

相對於此，若使用本發明發現之方法，當將嵌合抗體人類化時，除了對於能露出於嵌合抗體表面之胺基酸殘基改變以外，使抗體之pI改變，能製造相較於嵌合抗體，血漿中藥物動力學受控制之(亦即，其血漿中半衰期伸長，或其血漿中半衰期縮短)之人類化抗體。為了控制血漿中藥物動力學之能露出於人類化抗體表面之胺基酸改變，可與抗體之人類化同時實施，或以人類化抗體作為出發材料將能露出於表面之胺基酸殘基改變，並將人類化抗體之pI進一步改變。

本發明中，等電點值，可利用該技術領域中具通常知識者公知之等電點電泳測定。又，理論等電點之值，可使用基因及胺基酸序列解析軟體(Genetyx等)計算。本發明中，例如，於為了將血漿中藥物動力學充分控制等使等電點大幅變化之情形為有用。尤其，使理論等電點值改變1.0 以上等電點值之情形為較佳，需要3.0以上時更佳。

非專利文獻(Adams CW、Allison DE、Flagella K、Presta L、Clarke J、Dybdal N、McKeever K、Sliwkowski MX.Humanization of a recombinant monoclonal antibody to produce a therapeutic HER dimerization inhibitor、pertuzumab.、Cancer Immunol Immunother.(2006)55(6)、717-27)之中，使用相同人類抗體之FR序列進行人類化之3種人類化抗體trastuzumab、bevacizumab、pertuzumab之血漿中藥物動力學，據記載大致同等。亦即，使用相同FR序列進行人類化時，血漿中藥物動力學大致同等。依照本發明發現之方法，藉由在如上述人類化步驟以外，更對於能露出於抗體表面之胺基酸殘基改變，此外使抗體之pI改變，能控制藥物(血漿中)濃度。

又，本發明之方法亦能應用在人類抗體。除了對於從人類抗體庫或人類抗體生產小鼠等製作之能露出於人類抗體表面之胺基酸殘基改變以外，使人類抗體之pI改變，藉此能相較於最初製作之人類抗體之血漿中藥物動力學，製作其血漿中藥物動力學受控制之(亦即，其血漿中半衰期伸長或其血漿中藥物動力學縮短)人類抗體。

藉由使抗體具有之pI值減少，抗體之血漿中半衰期伸長。反之，藉由使抗體之pI值增大，血漿中半衰期縮短，且已知抗體之組織移動性提高(Vaisitti T、Deaglio S、Malavasi F.、Cationization of monoclonal antibodies：another step towards the "magic bullet"？、J Biol Regul HomeostAgents,(2005)19(3-4)、105-12、Pardridge WM、Buciak J、Yang J、Wu D.Enhanced endocytosis in cultured human breast carcinoma cells and in vivo biodistribution in rats of a humanized monoclonal antibody after cationization of the protein.(1998)286(1)、548-54)。然，由於該抗體使免疫原性增加且對於細胞內之內在化活性亦增大，因此，當應用在ADCC或CDC活性等對於細胞內之內在化活性成為發揮活性之妨礙要因的通過細胞傷害活性等機構發揮對於癌治療之效果的抗體，要求更進一步改良。亦即，關於ADCC或CDC活性等對於細胞內之內在化活性成為發揮活性之妨礙要因的通過細胞傷害活性等機構發揮對於癌治療之效果的抗體，不了解是否pI值之增加或減少其中之一會帶來腫瘤抑制效果增強。本發明中，製作pI值減少之人類化抗體之改變抗體及pI值增加之人類化抗體之改變抗體，藉由比較研究兩者之抗腫瘤效果，驗證是否其中之一改變會帶來高腫瘤抑制效果。其結果意外發現，pI值減少之人類化抗體對於肝癌發揮較優異的效果。

本發明中，「抗體」包含以如上所述胺基酸殘基之電荷經改變的抗體作為出發材料，將構成該抗體之胺基酸殘基置換、缺失、加成及/或插入等以將其胺基酸序列進一步改變之抗體。又，本發明中，「抗體」亦包含，以藉由胺基酸殘基之置換、缺失、加成及/或插入、或嵌合化或人類化等，使胺基酸序列經過改變之抗體作為出發材料，使構 成該抗體之胺基酸殘基電荷進一步改變之抗體。

就以提升本發明提供抗體之特性為目的之改變例，例如以提高抗體安定性為目的之改變(以下稱為安定性改變。)。水溶液中之抗體，於天然狀態與不活化變性狀態之二狀態間平衡化。天然狀態之安定性如熱力學第二法則(△G=△H-T△S)所示，依存於系之Gibbs氏自由能(Gibbs free energy)變化△G及其分解項焓變化△H(起因於多胜肽鏈中之疏水性交互作用或氫鍵等變化)與熵變化△S(起因於溶劑和及立體構造之自由度變化)之平衡。 正值之△G意指蛋白質之天然狀態較蛋白質之變性狀態更為安定，△G為較大正值時，代表蛋白質天然狀態之安定性更增大。為了使蛋白質變性，必需破壞貢獻於安定化之力。例如，藉由將蛋白質溶液暴露於高溫使立體構造之自由度增大，並藉由使貢獻於蛋白質安定化之因子減弱，引發蛋白質熱變性，此情形-T△S項支配變性。因為蛋白質熱變性造成折疊展開之△H，可利用本說明書所記載之實施例中具體記載之方式，使用DSC(differential scanning calorimetry；差示掃描熱量測定法)直接測定。蛋白質之熱變性過程中，DSC曲線夾著稱為變性中點(Tm)的受試蛋白質固有的溫度成為吸熱峰部。將該峰部積分可得變性焓變化。一般而言，Tm之值為熱安定性之一指標。亦可利用DSC測定發生蛋白質熱變性時之熱容量變化(△Cp)。附隨熱變性產生之熱容量變化，主要起因於蛋白質以天然狀態存在時未露出於分子表面之胺基酸殘基隨著蛋白質變性而 露出於溶劑分子之結果而水和所致。

如前述，本發明提供方法中，胺基酸殘基之「改變」，具體而言，將原本胺基酸殘基置換為其他胺基酸殘基、使原本胺基酸殘基缺失、添加新胺基酸殘基等，但較佳為將原本胺基酸殘基置換為其他胺基酸殘基。亦即，本發明中為了改變抗體安定性，較佳為使用利用胺基酸置換的改變。對於構成抗體之胺基酸殘基施加安定性改變之結果，抗體之前述Tm值增大。亦即，前述Tm值適於作為施加抗體之安定性改變的指標。

本發明提供之Glypican3抗體，為了進行上述「安定性之改變」，例如較佳為將擇自於構成序列識別號：195表示之人類化Glypican3抗體之H鏈可變區域中之37、40、48、51號之胺基酸殘基當中至少1個胺基酸殘基改變。又，較佳為將擇自於構成例如序列識別號：201表示之人類化Glypican3抗體之L鏈可變區域中之2、25、42、48、50、83、84號之胺基酸殘基當中至少1個胺基酸殘基改變。前述胺基酸殘基之中，施加該安定性改變之胺基酸殘基以外之胺基酸殘基，只要能得到所望Tm值則不需要改變，但可適當改變為成與供改變之人類化Glypican3抗體之Tm值為同程度或更高Tm值。

安定性之改變，可藉由將構成供改變之人類化抗體的各胺基酸殘基隨機改變以實施。又，構成供改變之人類化抗體的胺基酸序列一部分，為構成高Tm值之既存抗體之胺基酸序列，且從供該改變之人類化抗體之胺基酸序列一部 分與抗體之立體構造相關之觀點，可藉由置換為對應序列而實施。被置換之胺基酸殘基位置不限定，但較佳為改變FR區域中之胺基酸殘基。又，即使為CDR區域中之胺基酸殘基，只要不伴隨對於抗原之結合活性減縮，可適當改變。 又，經改變之胺基酸殘基數不特別限定，可藉由將FR區域之特定片段置換為所望片段而實施。該片段在FR區域之中，可將FR1、FR2、FR3、FR4各片段均改變，又，可將一以上之各片段改變組合實施。

當改變FR區域之片段時，例如H鏈或L鏈之FR2區域為較佳例。例如，將具有序列識別號：195表示之VH1b次類之人類化Glypican3抗體之H鏈FR2改變為VH4之次類的胺基酸殘基改變，亦即將37號之纈胺酸置換為異白胺酸之V37I，同樣地A40P、M48I、L51I之改變，為較佳具體例。又，例如，將具有序列識別號：201表示之VK2之次類的人類化Glypican3抗體之L鏈FR2區域改變為VK3之次類，亦即L42Q、S48A、Q50R之改變，又，相當於改變為FR1之生殖細胞系列之序列之改變的V2I之改變，為較佳具體例。

構成抗體之胺基酸殘基之置換、缺失、加成及/或插入、及人類化、嵌合化等胺基酸序列之改變，均可由該技術領域中具通常知識者以公知方法實施。同樣地，製作本發明提供之抗體作為重組抗體時，可將構成抗體可變區域及固定區域之胺基酸殘基之置換、缺失、加成及/或插入適當實施。

本發明中，抗體可使用小鼠抗體、人類抗體、大鼠抗體、兔抗體、山羊抗體、駱駝抗體等各種動物由來之抗體。 再者，例如，嵌合抗體，其中又以如人類化抗體等，其胺基酸序列經置換之改變抗體為可適當使用者。又，結合有各種分子之抗體修飾物亦可適當使用。

「嵌合抗體」，係將相異動物由來之序列組合製作之抗體。例如，由小鼠抗體之H鏈、L鏈之可變(V)區域與人類抗體之H鏈、L鏈固定(C)區域構成之抗體為較佳例。嵌合抗體之製作方法為公知。例如，將編碼為抗體V區域之DNA與編碼為人類抗體C區域之DNA於框架內(inframe)融合成的重組DNA，嵌入通常使用之表現載體。藉由培養導入有該載體之寄主細胞，能從其培養液適當取得或單離嵌合抗體。

人類化抗體，亦稱為再構成(reshaped)人類抗體，係將從人類以外之哺乳動物例如小鼠等單離之抗體之互補性決定區域(CDR；complementary determining region)與人類抗體之框架區域(FR；framework region)連結成之抗體。編碼為人類化抗體之DNA序列，可使用多個寡核苷酸作為模板之重疊PCR反應合成。重疊PCR反應之材料、其實施方法，記載於WO98/13388等。編碼為本發明人類化抗體可變區域的DNA，可藉由從製作成具彼此重疊之核苷酸序列之多個寡核苷酸，以重疊PCR得到，此等與編碼為人類抗體固定區域之DNA連結成於框架內形成密碼子序列。以前述方式連結之DNA，接著以該DNA能表現之方式插入 表現載體，並導入寄主。

用於鑑定CDR之方法為公知(Kabat et al.、Sequence of Proteins of Immunological Interest(1987)、National Institute of Health、Bethesda、Md.；Chothiaet al.、Nature(1989)342、877)。又，其一般基因重組手法亦為公知(參考歐洲專利申請案公開編號EP 125023號公報、WO 96/02576號公報)。藉使用該等公知方法，例如決定從小鼠抗體等非人類動物取得之抗體之CDR後，構建編碼為該CDR與人類抗體之FR連結成之重組抗體的DNA。選擇經由CDR連結之人類抗體之FR，使得CDR形成良好抗原結合部位。視需要，可將抗體可變區域之FR之胺基酸殘基適當改變，使得再構成人類抗體之CDR形成適當抗原結合部位(Sato et al.、Cancer Res.(1993)53、851-6)。供改變之FR中之胺基酸殘基，包含對於抗原以非共價鍵直接結合之殘基(Amit et al.、Science(1986)233、747-53)、對於CDR構造影響或作用之殘基(Chothia et al.、J.Mol.Biol.(1987)196、901-17)及與VH-VL交互作用相關連之殘基(EP239400號專利公報)。

藉由插入有該DNA之通常使用的表現載體轉形或形質導入的寄主細胞所生產之該DNA所編碼的人類化抗體，可藉由培養該寄主細胞，而從該培養液單離。

本發明提供之抗體為抗體、人類化抗體或人類抗體時，該抗體之C區域較佳為使用人類抗體由來之C區域。例如H鏈C區域，較佳為各使用C γ 1、C γ 2、C γ 3、C γ 4， L鏈C區域較佳為各使用C κ、C λ。又，為了改善抗體或其生產安定性，可將人類抗體C區域適當修飾。本發明提供之嵌合抗體，較佳為由人類以外哺乳動物取得之抗體之V區域與人類抗體之C區域構成。另一方面，人類化抗體，較佳為由人類以外哺乳動物取得之抗體之CDR，及人類抗體之FR及C區域構成。又，人類抗體，較佳為由從人類取得之抗體之CDR。及人類抗體之FR及C區域構成。人類抗體之C區域，由對應於IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA、IgD及IgE等同種異構型之固有胺基酸序列構成。本發明提供之人類化抗體之C區域，亦可適當用於屬於任一同種異構型之抗體之C區域。較佳為。使用人類IgG之C區域，但不限於此等。又，利用作為人類化抗體或人類抗體之FR之人類抗體之FR，亦不特別限定，可適當使用屬於任一同種異構型之抗體之FR。

以降低免疫原性為目的，可使用與非專利文獻(Ono K、Ohtomo T、Yoshida K、Yoshimura Y、Kawai S、Koishihara Y、Ozaki S、Kosaka M、Tsuchiya M.、The humanized anti-HM1.24 antibody effectively kills multiple myeloma cells by human effector cell-mediated cytotoxicity.、Mol Immunol.(1999)36(6)、387-395)記載之方法類似之方法，將構成FR區域之胺基酸殘基之全部或一部分置換為生殖細胞系列之序列。依據生殖細胞系列之序列應該免疫原性低之合理預測，將構成人類化抗體之FR區域的胺基酸序列與生殖細胞系列之胺基酸序列藉 由排列比較(Abhinandan K.R.and Martin C.R.、J.Mol.Biol.、(2007)369、852-862)。於不喪失對於抗原之結合活性的範圍，在該比較當中構成相異人類化抗體之FR區域的胺基酸殘基，可置換為生殖細胞系列之序列之胺基酸殘基。具體例，例如將構成以序列識別號：195表示之H鏈可變區域之胺基酸殘基當中，將70號之L置換為I，87號之T置換為R，97號之T置換為A之改變等。又，可將構成以序列識別號：201表示之L鏈可變區域之胺基酸殘基當中，25號之S置換為A之改變等。

本發明提供之經改變的嵌合抗體、人類化抗體及人類抗體可變區域及固定區域，只要對於抗原顯示結合專一性，則可將構成供改變之抗體可變區域及固定區域的一以上之胺基酸適當施加缺失、置換、插入及/或加成等。

利用人類由來之序列的嵌合抗體、人類化抗體及人類抗體，由於人類體內之免疫原性降低，因此可認為作為以治療目的等對於人類投予之治療用抗體使用時為有用。

本發明之方法中，編碼為變異導入前之抗體之H鏈或L鏈的基因序列，可使用既知之序列，此外，可利用該技術領域中具通常知識者公知之方法，取得抗體基因之新穎序列。該基因，例如可從抗體庫適當取得。再者，該基因亦可使用以生產單株抗體之融合瘤之mRNA作為模板的RT-PCR法等公知手法予以選殖而取得。

抗體庫已有許多抗體庫為公知。又，由於抗體庫之製作方法亦為公知，故該技術領域中具通常知識者能取得或 製作適當抗體庫。例如，就適當抗體庫而言，例如於Clackson et al.、Nature(1991)352、624-8、Marks et al.、J.Mol.Biol.(1991)222、581-97、Waterhouseset al.、Nucleic Acids Res.(1993)21、2265-6、Griffiths et al.、EMBO J.(1994)13、3245-60、Vaughan et al.、Nature Biotechnology(1996)14、309-14、及日本特表平20-504970號公報等文獻所揭示之抗體噬菌體庫。此外，真核細胞中，製作庫之方法(WO95/15393號小冊)或核糖體提示法等公知方法亦可適當使用。再者，以人類抗體庫作為出發材料，利用淘篩取得人類抗體之技術，為該技術領域中具通常知識者已知。亦即，將人類抗體之H鏈及L鏈之可變區域於框架內經融合之單鏈抗體(scFv)藉由噬菌體呈現法表現於噬菌體表面。藉由選擇對於抗原結合之噬菌體，將編碼為結合於抗原之scFv的基因從該噬菌體單離。藉由鑑別該基因之序列，可決定編碼為與抗原結合之抗體之H鏈及L鏈的可變區域的DNA序列。將具該序列之抗體基因插入適當表現載體，並如後述表現在適當寄主細胞中，可適當取得人類抗體。該等方法已為周知，例如WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388揭示之方法。

從生產單株抗體之融合瘤取得編碼為抗體之基因的方法，基本上可採公知技術。以下詳述，但簡單而言，依照通常免疫方法以所望感作抗原將動物免疫後，將從該動物得到之免疫細胞，供給以通常細胞融合法與公知母細胞進 行細胞融合。依照通常之篩選法，篩選單株抗體生產細胞(融合瘤)，以選擇之融合瘤取得之mRNA作為模板，以反轉錄酵素合成抗體可變區域(V區域)之cDNA。藉由將該cDNA與編碼為所望抗體固定區域(C區域)之DNA在框架內進行融合，能適當取得抗體基因。

更具體而言，可舉以下例，但本發明不限於該等例。 為了得到本發明提供之抗體使用之感作抗原，可為具免疫原性之完全抗原，亦可為含不具免疫原性之半抗原等的不完全抗原。例如，可適當使用全長蛋白質，或其部分多胜肽或胜肽等。具體例可舉以序列識別號：207表示之可溶型GPC3核多胜肽。此外，已知多糖類、核酸、脂質等構成之物質亦作用為抗原，本發明之抗體所結合之抗原不特別限定於上述物質之態樣。抗原之製備，可依照該技術領域中具通常知識者公知之方法實行，例如，可適當採用使用桿狀病毒之方法(例如，WO98/46777等)等。抗原之免疫原性低時，可利用結合有白蛋白等具免疫原性之巨大分子的該抗原將動物適當免疫。又，感作抗原為貫穿細胞膜之分子時，視需要，可適當使用該分子之細胞外區域之多胜肽片段作為感作抗原。或，可適當使用將該分子表現於細胞表面上之細胞作為感作抗原。再者，當感作抗原為不溶性分子時，可藉由將該分子與其他水溶性分子結合而可溶化，並以該可溶化結合分子作為感作抗原適當使用。

抗體生產細胞，可使用前述適當感作抗原將動物免疫而適當得到。或，可將能生產抗體之淋巴球於體外免疫， 而取得抗體生產細胞。受免疫之動物，可使用各種之脊椎動物、哺乳動物。尤其，囓齒目、兔目、靈長目之動物一般作為免疫動物使用。小鼠、大鼠、倉鼠等囓齒目、兔等兔目、長尾獼猴(Macaca fascicularis)、恆河獼猴(Macaca mulatta)、阿拉伯狒狒(Papio hamadryas)、黑猩猩等猴等靈長目動物。此外，已知有在其基因體上保持人類抗體基因曲目之基因轉殖動物，可藉由使用此種動物得到人類抗體(參考WO96/34096；Mendez et al.、Nat.Genet.(1997)15、146-56)。可取代此基因轉殖動物之使用，將例如人類淋巴球於體外以所望抗原或表現所望抗原之細胞感作後，與人類骨髓瘤細胞例如U266進行細胞融合，藉此得到對該抗原具有結合活性之所望人類抗體(參考日本特公平1-59878號公報)。又，藉由將在其基因體上保持人類抗體基因全部的曲目的基因轉殖動物以所望抗原免疫，能適當取得(參考WO93/12227、WO92/03918、WO94/02602、WO96/34096、WO96/33735)所望的人類抗體。

動物之免疫，例如可將感作抗原以磷酸緩衝鹽液(PBS)或生理食鹽水等適當稀釋、懸浮，視需要與佐劑混合而乳化後，將該感作抗原注射到動物腹腔內或皮下以實施。之後，較佳為，將與佛洛依得不完全佐劑混合的感作抗原以每4~21日投予數次。確認經免疫之動物中之對抗感作抗原之抗體生產，可藉由以慣用方法例如酵素結合免疫吸附分析(ELISA)、流動細胞計數器(FACS)等公知分析法測定該該動物血清中對抗感作抗原之抗體力價實施。

融合瘤，可藉由將從以所望感作抗原免疫之動物或從淋巴球得到之抗體生產細胞，使用為了細胞融合慣用之融合劑(例如，聚乙二醇)，與骨髓瘤細胞融合而製作(Goding、Monoclonal Antibodies：Principles and Practice、Academic Press、(1986)59-103)。融合瘤之製作，可依照例如Milstein等人之方法(G.Kohler and C.Milstein、Methods Enzymol.(1981)73、3-46)等適當實行。藉由將以前述方法製作之融合瘤細胞培養‧增殖，可取得對於該融合瘤所生產之抗原蛋白質專一性結合之單株抗體。依照免疫沈降、放射免疫分析(RIA)、酵素結合免疫吸附分析(ELISA)、流動細胞計數器(FACS)等公知分析法，可適當測定該單株抗體對於抗原蛋白質的結合專一性。之後，視需要，能將經測定產生所望專一性、結合活性或活性之抗體的融合瘤，以極限稀釋法等手法適當次選殖，將該融合瘤生產之單株抗體單離。

接著，從上述融合瘤或抗體生產細胞(感作淋巴球等)，將編碼為所選擇抗體之基因，使用能對於該基因專一性結合之探針(例如，與編碼為抗體固定區域之序列互補的寡核苷酸等)進行選殖。又，可利用從融合瘤或抗體生產細胞(感作淋巴球等)取得之mRNA為模板，以RT-PCR法選殖。 免疫球蛋白，依據其構造及功能之差異，分類為IgA、IgD、IgE、IgG及IgM 5個不同的類別。再者，各類再分成數個同種異構型(例如，IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4；IgA1及IgA2等)。依照本發明提供之抗體，可以為屬於該等任一 類及次類之抗體由來者，雖不特別限定為其中任一類及次類，但以例如屬於IgG類之抗體尤佳。

編碼為構成抗體之H鏈及L鏈的胺基酸序列的基因，可利用基因工程手法適當改變。例如，藉由將編碼為構成小鼠抗體、大鼠抗體、兔抗體、倉鼠抗體、羊抗體、駱駝抗體等構成抗體之胺基酸序列的核酸殘基改變，可適當製作以降低對於人類之異種抗原性等為目的之施加人為改變的基因重組抗體，例如嵌合抗體、人類化抗體等。嵌合抗體，係將由人類以外之哺乳動物例如小鼠由來之抗體之H鏈、L鏈之可變區域與人類抗體之H鏈、L鏈之固定區域所構成之抗體，例如可藉將編碼為從小鼠由來之抗體可變區域的DNA與編碼為人類抗體之固定區域的DNA連結，並將之嵌入表現載體成之重組載體導入寄主後表現而得。人類化抗體也稱為再構成(reshaped)人類抗體，為將從人類以外之哺乳動物，例如從小鼠等單離之抗體之互補性決定區域(CDR；complementary determining region)與人類抗體之框架區域，在框架內連結成使形成密碼子序列之抗體。 編碼為該人類化抗體之DNA序列，可藉由以多數個寡核苷酸為模板，利用重疊PCR反應合成。重疊PCR反應之材料、其實施方法，記載於WO98/13388等。

編碼為本發明基因重組抗體可變區域的DNA，可利用重疊PCR，從以具有彼此重疊之核苷酸序列的方式製作的多個寡核苷酸得到，將該等與編碼為人類抗體固定區域之DNA在框架內以能形成密碼子序列之方式連結。將以前述 方式連結之DNA，接著插入於表現載體使該DNA能表現，並導入於寄主。該DNA所編碼之抗體，藉由培養該寄主而表現。表現的抗體，可從該寄主之培養液等適當精製(參考EP239400；WO96/02576)得到。經由CDR連結之人類化抗體之FR，選擇互補性決定區域對於抗原形成良好抗原結合部位者。視需要，可將構成經選擇之抗體可變區域之FR的胺基酸殘基進行適當置換改變，使得再構成人類抗體之互補性決定區域能形成對於抗原之適當抗原結合部位(K.Sato et al.、Cancer Res.(1993)53、851-856)。

上述人類化改變以外，例如，可實施改善與抗體所認識抗原之結合活性等抗體之生物學特性為目的之改變。本發明中，改變可利用點專一性突然變異(例如，參考Kunkel、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82、488)、PCR變異、匣盒變異等方法適當進行。一般而言，其生物學特性經改善之改變構成抗體之胺基酸序列，相對於構成供改變之抗體(亦即，成為改變抗體之基礎的抗體)之胺基酸序列，有70%以上、更佳為為80%以上、更佳為90%以上(例如，95%以上、97%、98%、99%等)之同一性及/或類似性。 本說明書中，序列之同一性及/或類似性，係指將以使序列同一性成為最大值之方式，視需要將序列予以整列化，及導入間隔(gap)後，與成為改變抗體之基礎的構成抗體之胺基酸殘基為同一(相同殘基)或類似(依據一般胺基酸之側鏈特性分類成同群組之胺基酸殘基)的胺基酸殘基之比例。通常，天然之胺基酸殘基，依據其側鏈性質，分類為 以下群組：(1)疏水性：丙胺酸、異白胺酸、纈胺酸、甲硫胺酸及白胺酸；(2)中性親水性：天冬醯胺、谷醯胺酸、半胱胺酸、蘇胺酸及絲胺酸；(3)酸性：天冬醯胺酸及谷胺酸；(4)鹼性：精胺酸、組胺酸及離胺酸；(5)影響鏈配向之殘基：甘胺酸及脯胺酸；及(6)芳香族性：酪胺酸、色胺酸及苯丙胺酸。

又，以增強抗體功能為目的之改變，例如一具體態樣為，使包含人類化抗體在內之抗體所發揮之細胞傷害活性提高。細胞傷害活性，例如抗體依存性細胞中介性細胞傷害(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity：ADCC)活性、補體依存性細胞傷害(complement-dependent cytotoxicity：CDC)活性等。本發明中，CDC活性，意指由於補體系之細胞傷害活性。另一方面，ADCC活性意指當專一性抗體附著在標的細胞之細胞表面抗原時，擁有Fc γ受體之細胞(免疫細胞等)經由Fc γ受體結合於抗體Fc部分，而對於標的細胞造成傷害之活性。受試抗體是否具ADCC活性，或是否具CDC活性，能以公知方法測定(例如，Current protocols in Immunology、Chapter7.Immunologic studies in humans、Editor、John E、Coligan et al.、John Wiley & Sons、Inc.,(1993)等)。

具體而言，首先製備效應子細胞、補體溶液、標的細胞。

(1)效應子細胞之製備

從CBA/N小鼠等摘取脾臟，在RPMI1640培養基 (Invitrogen)中將脾臟細胞分離。以含10%胎牛血清(FBS、HyClone)之同培養基清洗後，藉由製備細胞濃度為5 x 10⁶細胞/ml，製備效應子細胞。

(2)補體溶液之製備

將幼兔補體(Baby Rabbit Complement)(CEDARLANE)以10% FBS含有培養基(Invitrogen)稀釋10倍，製備補體溶液。

(3)標的細胞之製備

將表現受試抗體結合之抗原蛋白質的細胞，與0.2mCi之51Cr-鉻酸鈉(GEHealthcarebioscience)同時在含10% FBS之DMEM培養基中於37℃進行1小時培養，使該標靶細胞經放射性標定。表現受試抗體結合之抗原蛋白質的細胞，可使用以編碼為受試抗體所結合之抗原蛋白質的基因轉形的細胞、卵巢癌、前列腺癌、乳癌、子宮癌、肝癌、肺癌、胰臟癌、胃癌、膀胱癌、及大腸癌細胞等。放射性標定後，將該細胞以含10% FBS之RPMI1640培養基清洗3次，製備細胞濃度為2 x 10⁵細胞/ml，以製備該標靶細胞。

ADCC活性、或CDC活性可依照下述方法測定。測定ADCC活性之情形，在96井U底平盤(Becton Dickinson)，逐一加入標靶細胞及受試抗體50μl，於冰上實施15分鐘反應。之後，將加有效應子細胞100μl的反應混合液，於二氧化碳培養箱內溫育4小時。受試抗體之終濃度可於0至10μg/ml之範圍內適當使用。該溫育後，將100μl之上清回收，以伽瑪計數器(COBRAII AUTO-GAMMA、MODEL D5005、Packard Instrument Company)測定該上清具有之放射活性。細胞傷害活性(%)，可使用得到之放射活性值，依據(A-C)/(B-C) x 100之計算式計算。A為使用各受試抗體之試樣時之放射活性(cpm)，B為使用加有1% NP-40(nacalai tesque)之試樣時之放射活性(cpm)，C為使用僅含標靶細胞之試樣時之放射活性(cpm)。

另一方面，於測定CDC活性之情形，在96井平底平盤(Becton Dickinson)，逐一加入標靶細胞及受試抗體50μl，於冰上實施15分鐘反應。之後，將加有補體溶液100μl之反應混合液，於二氧化碳培養箱內溫育4小時。受試抗體之終濃度可於0至3μg/ml之範圍內適當使用。培養後，將100μl之上清回收，以伽瑪計數器測定該上清具有之放射活性。細胞傷害活性與ADCC活性之測定同樣地計算得到。

另一方面，測定抗體接合(conjugate)所致細胞傷害活性之情形，於96井平底平盤(Becton Dickinson)，逐一加入標靶細胞及受試抗體接合體50μl，於冰上實施15分鐘反應。將該平盤於二氧化碳培養箱內溫育1至4小時。 抗體之終濃度可在0至3μg/ml之範圍內適當使用。培養後，將100μl之上清回收，以伽瑪計數器測定該上清具有之放射活性。細胞傷害活性與ADCC活性之測定同樣地計算得到。

抗體之H鏈及L鏈之可變區域，如上所述通常由3個CDR及4個FR構成。本發明之較佳態樣中，供「改變」之 胺基酸殘基，可從例如構成CDR或FR之胺基酸殘基之中適當選擇。

又，只要是該技術領域中具通常知識者，可利用Kabat等公共資料庫等適當取得構成抗體可變區域之FR的胺基酸序列，且為人類或小鼠等生物中實在的序列。

本發明之較佳態樣中，以本發明之方法提供血漿中藥物動力學受控制之人類化抗體。該人類化抗體，係包含例如人類以外之動物由來之互補性決定區域(CDR)、人類由來之框架區域(FR)及人類C區域之人類化抗體，於CDR或FR中，能露出於抗體表面之至少一胺基酸殘基係與對應於原本抗體之CDR或FR之位置之胺基酸殘基具相異電荷之胺基酸殘基，相較於具相同C區域之嵌合抗體，血漿中藥物動力學受控制。

再者，本發明之較佳態樣中，以本發明之方法提供血漿中藥物動力學受控制之人類抗體。該人類抗體，為含例如人類由來之互補性決定區域(CDR)、人類由來之框架區域(FR)及人類C區域之人類抗體，CDR或FR中，能露出於抗體表面之至少一胺基酸殘基，係與對應於原本抗體之CDR或FR之位置之胺基酸殘基具相異之電荷胺基酸殘基，相較於具相同C區域之嵌合抗體，血漿中藥物動力學受控制。

上述人類固定區域，較佳為指包含野生型人類Fc區域之區域，但亦可使用經改變之Fc。前述「經改變之Fc」，包含構成該Fc之胺基酸殘基經改變者，又，可包含對於該Fc部分所施加之修飾經改變者。改變對於該Fc部分加成 之糖鏈修飾之樣式，具體例例如前述修飾之改變。本說明書中，作為參考實施例具體揭示之「與抗體之Fc區域結合之海藻糖含量降低之抗體」，為如此種較佳具體例。

「與抗體之Fc區域結合之低海藻糖含量抗體」，係指與作為對照之抗體比較，結合之海藻糖量顯著少，較佳為無法檢測之抗體。通常，結合於構成抗體1分子之2分子H鏈之Fc區域中存在的2處糖鏈結合部位的N-糖苷結合糖鏈，加成有海藻糖。本發明中，「與抗體之Fc區域結合之低海藻糖含量抗體」，係指以通常之抗體為對照比較時，該抗體具有對照抗體具有之總糖鏈含量之50%以下，較佳為25%以下，更佳為10%以下，尤佳為0%以下之海藻糖含量。海藻糖含量，可使用下述參考實施例具體顯示之解析方法測定。該海藻糖含量降低之抗體之製作方法，除了本發明參考實施例記載以外，可利用例如海藻糖基轉移酶缺失之動物細胞製作之方法(Biotechnol Bioeng.(2004)、87(5)、614-22)、利用複合分支糖鏈修飾經改變之動物細胞製作之方法(Biotechnol Bioeng.(2006)93(5)、851-61)等。又，以動物細胞以外之細胞為寄主細胞製作之方法，例如：以植物細胞製作之方法(Nature Biotechnology(2006)24、1591-7)或以酵母細胞製作之方法(Nature Biotechnology(2006)24、210-5)等。

本發明之製造方法之較佳態樣，為製造等電點經改變之包含抗體可變區域的多胜肽之方法，包含以下步驟：(a)將編碼為含該胺基酸殘基之多胜肽的核酸改變，使得能 露出於該多胜肽之CDR區域表面之至少1個胺基酸殘基之電荷變換；(b)培養寄主細胞使得該核酸表現；(c)從寄主細胞培養物回收含抗體可變區域之多胜肽。

又，本發明之製造方法之較佳態樣，係製造包含血漿中藥物動力學受控制之抗體可變區域之多胜肽之方法，包含以下步驟：(a)將編碼為含該胺基酸殘基之多胜肽的核酸改變，使得能露出於該多胜肽之CDR區域表面之至少1個胺基酸殘基之電荷變換；(b)培養寄主細胞使得該核酸表現；(c)從寄主細胞培養物回收含抗體可變區域之多胜肽。

再者，依照該方法製造之血漿中藥物動力學受控制之包含抗體可變區域的多胜肽，亦包含在本發明。

又，本發明提供具第1多胜肽及第2多胜肽之包含抗體可變區域的多重專一性多胜肽之製造方法。再者，本發明提供依該方法製造之多重專一性多胜肽。本發明之製造方法之較佳態樣，包含使編碼為第1多胜肽之胺基酸殘基之核酸及編碼為第2多胜肽之胺基酸殘基之核酸之兩者或其中之一改變，以使得第1多胜肽及第2多胜肽之等電點差異增大。亦即，藉由使第1多胜肽與第2多胜肽之胺基酸殘基之電荷改變，能使多胜肽的等電點(pI)差異增大，利用該等電點之差異可製造多重專一性抗體。詳言之，製造方法包含以下(a)~(c)之步驟。 (a)包含將編碼為含該胺基酸殘基之多胜肽的核酸予以改變，使得能露出於第1多胜肽與第2多胜肽之CDR區域表面之至少1個胺基酸殘基之電荷改變，且將編碼為第1多胜肽之胺基酸殘基之核酸及編碼為第2多胜肽之胺基酸殘基之核酸之兩者或其中之一改變，使得該核酸之改變相較於改變前，第1多胜肽與第2多胜肽之等電點差異增大；(b)培養寄主細胞使得該核酸表現；(c)從寄主細胞培養物回收多重專一性抗體。

本發明中，多胜肽係指通常約10個胺基酸以上長度之胜肽及蛋白質。又，通常為生物由來之多胜肽，但不特別限定，例如亦可為人工設計的序列所構成之多胜肽。又，可為天然多胜肽或合成多胜肽、重組多胜肽等任一者。再者，上述多胜肽之片段亦包含在本發明之多胜肽。

本發明中，「包含具抗體可變區域之第1多胜肽及第2多胜肽的多重專一性多胜肽」，係指包含與至少2種以上相異抗原或同一抗原內之相異抗原決定基結合的抗體可變區域的多胜肽，關於包含抗體可變區域之多胜肽，如上述，包含例如抗體、低分子化抗體、支架(Scaffold)蛋白質等。

本發明中，「多胜肽之等電點之差異增大」，係指2種以上多胜肽中，藉由進行表面胺基酸之電荷改變，使得彼此的等電點不相等，或使2種以上多胜肽間之等電點差更大。等電點之差，可利用例如等電點電泳等手法觀察。 又，本發明中，較佳為保持該多胜肽之構造或功能(活性) 且控制等電點。

亦即，本發明提供一種多重專一性抗體之製造方法，係製造包含具抗體可變區域之第1多胜肽及第2多胜肽的多重專一性多胜肽，包含以下步驟(a)將編碼為第1多胜肽之胺基酸殘基之核酸及編碼為第2多胜肽之胺基酸殘基之核酸之兩者或其中之一改變，使得能露出CDR區域表面之至少1個胺基酸殘基之電荷改變使得第1多胜肽與第2多胜肽之等電點差成為1.0以上，較佳為1.2以上，更佳為1.5以上；(b)培養寄主細胞使得該核酸表現、(c)從寄主細胞培養物回收多重專一性抗體。

又，本發明提供一種多重專一性多胜肽之改變方法，用於精製包含具抗體可變區域之第1多胜肽及第2多胜肽的多重專一性多胜肽。本發明之精製方法之較佳態樣，包含將編碼為第1多胜肽之胺基酸殘基之核酸及編碼為第2多胜肽之胺基酸殘基之核酸之兩者或其中之一改變，使得第1多胜肽與第2多胜肽之等電點之差異增大。亦即，藉由將第1多胜肽與第2多胜肽之胺基酸殘基之電荷改變，於多胜肽導入等電點(pI)之差異，利用該等電點之差異，可精製多重專一性抗體。詳言之，精製方法係包含以下(a)~(c)之步驟。

(a)包含將編碼為含該胺基酸殘基之多胜肽的核酸予以改變，使得能露出於第1多胜肽與第2多胜肽之CDR區域表面之至少1個胺基酸殘基之電荷改變，且使得該核酸之改 變相較於改變前，將編碼為第1多胜肽之胺基酸殘基之核酸及編碼為第2多胜肽之胺基酸殘基之核酸之兩者或其中之一改變，使第1多胜肽與第2多胜肽之等電點差異增大；(b)培養寄主細胞使得該核酸表現、(c)從寄主細胞培養物以標準層析，將該多重專一性抗體精製。

又，包含以上述精製方法精製之步驟的多重專一性抗體之製造方法，亦包含在本發明內。

本發明之上述方法中，「將核酸予以改變」，係指在本發明中，將核酸序列改變，使得成為與因為「改變」而導入之胺基酸殘基對應之密碼子。更具體而言，將相當於改變前胺基酸殘基之密碼子，成為因為改變而導入之胺基酸殘基之密碼子之方式，將構成供改變之密碼子的核酸予以改變。通常，意指進行如將構成密碼子之核酸之至少1鹼基置換的基因操作或變異處理，使得成為編碼為目的胺基酸殘基之密碼子。亦即，編碼為供改變之胺基酸殘基的密碼子，置換成編碼為因為改變而導入之胺基酸殘基的密碼子。如此核酸之改變，可使用該技術領域中具通常知識者公知之技術例如點專一性變異誘發法、PCR變異導入法等適當實施。

又，本發明中，核酸通常保持(插入)於適當載體，並導入到寄主細胞。該載體，只要能將插入的核酸安定保持即不特別限定，例如寄主若使用大腸菌，則選殖用載體以pBluescript載體(Stratagene)等較佳，但是亦可使用市 售的各種載體。為了生產本發明之多胜肽，使用載體時，尤以表現載體為有用。表現載體，只要是在試管內、大腸菌內、培養細胞內、生物個體內表現多胜肽之載體，即不特別限制，例如，若在試管內表現，以pBEST載體(promega)較佳，在大腸菌表現則以pET載體(Invitrogen)較佳，在培養細胞表現，以pME18S-FL3載體(GenBank Accession No.AB009864)較佳，在生物個體表現，則以pME18S載體(Mol Cell Biol.(1988)8、466-472)等較佳。本發明之DNA插入載體，可利用常法，例如利用限制酶切開部位之接合酶反應適當進行(Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel et al.(1987)Publish.John Wiley & Sons.Section 11.4-11.11)。

上述寄主細胞不特別限制，可視目的使用各種寄主細胞。為了使多胜肽表現之細胞，例如細菌細胞(例：鏈球菌(Streptococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、大腸菌、鏈黴菌(Streptomyces)、枯草菌)、真菌細胞(例：酵母、Aspergillus)、昆蟲細胞(例：DrosofilaS2、SpodopteraSF9)、動物細胞(例：CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowes黑色素瘤細胞)及植物細胞。載體導入寄主細胞，例如可利用，磷酸鈣沉澱法、電脈衝穿孔法(Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel et al.(1987)Publish.John Wiley & Sons.Section 9.1-9.9)、脂轉染法、微注射法等公知方法進行。

寄主細胞中，為了使表現的多胜肽(抗體)分泌到小胞體之內腔、細胞周邊腔，或細胞外之環境。較佳為在目的抗體嵌入適當的分泌訊號。該等訊號可適當利用目的多胜肽(抗體)特有的內因性訊號，或異種訊號。

上述製造方法之中。多胜肽(抗體)之回收，於本發明之多胜肽(抗體)分泌到培養基時，可藉由回收培養基實施。本發明之抗體於細胞內生產時，可先將該細胞溶解，之後將抗體回收。

為了將從重組細胞培養物回收之本發明抗體精製，可適當使用包含硫酸銨或乙醇沉澱、酸萃取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水性交互作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析及凝集素(Lectin)層析的公知方法。

本發明中，將核酸予以改變之多胜肽，較佳為第1多胜肽之同多元體、第2多胜肽之同多元體、及第1多胜肽與第2多胜肽之異多元體。第1多胜肽之同多元體、第2多胜肽之同多元體、及第1多胜肽與第2多胜肽之異多元體，例如實施例者，但不限於該等。

本發明中，標準層析例如陽離子交換層析、陰離子交換層析、疏水層析、羥基磷灰石層析、疏水電荷交互作用層析、色層焦集法(chromatofocusing)等，但不限於該等。

本發明之上述方法中，第1多胜肽及第2多胜肽，以含重鏈可變區域(VH)較佳。該可變區域，亦可含例如互補性決定區域(CDR)、框架區域(FR)。

再者，本發明之上述方法中，多重專一性多胜肽之可變區域，以含輕鏈可變區域較佳。

再者，本發明之上述方法中，第1多胜肽及第2多胜肽，以含重鏈固定區域較佳。重鏈固定區域，以使第1多胜肽與第2多胜肽產生pI差者更佳。如此重鏈固定區域，例如具pI差之抗體之重鏈固定區域，亦可使用原本pI有差異的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4之重鏈固定區域而於第1與第2多胜肽導入pI差，亦可於第1與第2多胜肽中之重鏈固定區域僅改變起因於該等次類間之等電點差異的胺基酸，或將不影響該等之等電點的鄰接胺基酸同時改變，藉此製作非野生型人類固定區域，並在2個固定區域導入pI差。為了在固定區域導入pI差之改變處，例如H鏈固定區域之EU編號為H鏈137號、196號、203號、214號、217號、233號、268號、274號、276號、297號、355號、392號、419號、435號。

又，由於將重鏈固定區域之糖鏈除去會產生pI差，因此糖鏈加成部位之297號，亦為用於導入pI鏈之改變處例。

又，本發明，相對於上述第1多胜肽及第2多胜肽包含重鏈固定區域之方法，亦包含將上述第1多胜肽及第2多胜肽為重鏈可變區域之方法，及/或包含前述多重專一性抗體為輕鏈可變區域之第3多胜肽，且前述第1多胜肽及前述第2多胜肽各與該第3多胜肽形成多元體之方法予以組合之方法。

再者，依照上述方法製造之多重專一性多胜肽，亦包 含於本發明。

再者，本發明提供之多重專一性抗體之中，第1多胜肽含重鏈可變區域時，為了上述「等電點之差異增大」，例如使擇自於該重鏈可變區域之中Kabat編號31位、61位、62位、64位及65位之胺基酸殘基中至少1個胺基酸殘基具電荷之態樣。又，含輕鏈可變區域時，為了上述「等電點之差異增大」，例如使擇自於該輕鏈可變區域之中Kabat編號24位、27位、53位、54位及55位之胺基酸殘基中至少1個胺基酸殘基具電荷之態樣。上述編號所示第1多胜肽之胺基酸殘基中，該具電荷之胺基酸殘基以外之胺基酸殘基，只要第1多胜肽與第2多胜肽之等電點有差異，則可為與該具電荷之胺基酸殘基為同種電荷，又可為不具電荷、亦可具相反電荷。

本發明之上述多重專一性抗體，較佳為，第2多胜肽具有與第1多胜肽之具電荷之胺基酸殘基為相反電荷或不具電荷。詳言之，為一多重專一性抗體，第2多胜肽含重鏈可變區域，擇自於該重鏈可變區域之中Kabat編號31位、61位、62位、64位及65位之胺基酸殘基至少1個胺基酸殘基，與擇自於於前述第1多胜肽之可變區域所含具電荷之胺基酸殘基具相反電荷或不具電荷。又，為一多重專一性抗體，當含輕鏈可變區域時，擇自於該輕鏈可變區域之中Kabat編號24位、27位、53位、54位及55位之胺基酸殘基至少1個胺基酸殘基，與擇自於前述第1多胜肽所含可變區域中具電荷之胺基酸殘基具相反電荷或不具 電荷。上述編號所示第2多胜肽之胺基酸殘基之中，該具電荷胺基酸殘基以外之胺基酸殘基，只要第1多胜肽與第2多胜肽之等電點有差異，則可為與該具電荷之胺基酸殘基為同種電荷，亦可不具電荷，亦可具相反電荷。

再者，多重專一性抗體含抗體固定區域時，為了使其等電點降低，希望如以下應用：例如137位為IgG2或IgG4之序列、196位為IgG1或IgG2或IgG4之序列、203位為IgG2或IgG4之序列、214位為IgG2之序列、217位為IgG1或IgG3或IgG4之序列、233位為IgG1或IgG3或IgG4之序列、268位為IgG4之序列、274位為IgG2或IgG3或IgG4之序列、276位為IgG1或IgG2或IgG4之序列、355位為IgG4之序列、392位為IgG3之序列、419位為IgG4之序列、435位為IgG1或IgG2或IgG4之序列。又，為了使等電點上升，希望如以下應用：例如，137位為IgG1或IgG3之序列、196位為IgG3之序列、203位為IgG1或IgG3之序列、214位為IgG1或IgG3或IgG4之序列、217位為IgG2之序列、233位為IgG2之序列、268位為IgG1或IgG2或IgG3之序列、274位為IgG1之序列、276位為IgG3之序列、355位為IgG1或IgG2或IgG3之序列、392位為IgG1或IgG2或IgG4之序列、419位為IgG1或IgG2或IgG3之序列、435位為IgG3之序列。

該等之序列之應用，只要在兩H鏈能提供充足的等電點之差即可，不一定要應用所有之序列。

上述抗體中，「具同種之電荷」，意指例如重鏈可變 區域之中上述Kabat編號之胺基酸殘基，或重鏈固定區域之中上述EU編號之胺基酸殘基任一者，具下述(a)或(b)之任一群組包含之胺基酸殘基。

(a)谷胺酸(E)、天冬醯胺酸(D) (b)離胺酸(K)、精胺酸(R)、組胺酸(H)

又，「具相反電荷」，係例如具重鏈可變區域及/或重鏈固定區域之第2多胜肽中，上述Kabat編號或上述EU編號之胺基酸殘基其中至少1個胺基酸殘基，為第1多胜肽所含重鏈可變區域及/或重鏈固定區域之中對應位置之胺基酸殘基，且當具上述(a)或(b)任一群組所含胺基酸殘基時，其餘之胺基酸殘基具不同群所含胺基酸殘基之意。

亦即，本發明提供一種多重專一性抗體，前述具同種電荷之胺基酸殘基，擇自於上述(a)或(b)任一群組所含胺基酸殘基。

又，原本的(改變前)胺基酸殘基已具電荷時，改變成不具電荷之胺基酸殘基，亦為本發明較佳態樣之一。

本發明中，較佳為使胺基酸殘基改變成第1多胜肽與第2多胜肽之等電點(pI)差異增大。又，以改變導入之胺基酸殘基有多數之情形，在該等胺基酸殘基之中可含少數不帶電荷之胺基酸殘基。

又，本發明係關於一種組成物(藥劑)，包含本發明之方法得到之血漿中藥物動力學受控制之多胜肽(例如IgG抗體等抗體)，及醫藥上容許之擔體。

本發明中，醫藥組成物通常為疾病治療或預防、或檢 查‧診斷用之藥劑。

本發明之醫藥組成物，可由該技術領域中具通常知識者公知之方法適當製劑化得到。例如，可以將與水或水以外之藥學可容許液體的無菌性溶液、或懸浮液劑之注射劑形式，以非經口的使用。例如，可將藥理學上容許之擔體或媒體，具體而言滅菌水或生理食鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、界面活性劑、安定劑、香味劑、賦形劑、媒劑(vehicle)、防腐劑、結合劑等適當組合，依照一般而言承認的製藥實務要求的單位用量形態混合，而適當製劑化。 該等製劑之中，有效成分量，可設定為可得指示範圍之適當用量。

注射用之無菌組成物，可使用如注射用蒸餾之媒劑，依照通常之製劑實務，適當處方得到。

注射用之水溶液，例如生理食鹽水、含葡萄糖或此外之輔助藥(例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化鈉)之等張液。可適當併用適合的溶解輔助劑、例如醇(乙醇等)、聚醇(丙二醇、聚乙二醇等)、非離子性界面活性劑(聚山梨糖醇酐80(TM)、HCO-50等)。

油性液，例如麻油、大豆油，可適當併用苯甲酸苄酯及/或苄醇作為溶解輔助劑。又，可適當配合緩衝劑(例如，磷酸鹽緩衝液及乙酸鈉緩衝液)、止痛劑(例如，鹽酸普卡因)、安定劑(例如，苄醇及苯酚)、抗氧化劑。如前述製備之注射液，通常充填在適當的安瓿。

本發明之醫藥組成物，較佳為以非經口投予投予。例 如，可適當製備成注射劑型、經鼻投予劑型、經肺投予劑型、經皮投予型之組成物。例如，可利用靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射等，對於全身或局部適當投予。

投予方法，可依照患者年齡、症狀適當選擇。包含抗體或編碼為抗體之聚核苷酸之醫藥組成物之投予量，例如，可適當設定在一次每1kg體重0.0001mg至1000mg之範圍。或例如可對每一位患者設定或製備0.001~100000mg之投予量，但本發明不一定限定於該等數值。投予量及投予方法，會依照患者體重、年齡、症狀等變動，但是只要是該技術領域中具通常知識者，可考慮此等條件，並設定適當投予量及投予方法。

又，本發明提供編碼為本發明之方法所得血漿中藥物動力學受控制之抗體(例如，人類化Glypican3抗體等)之核酸。再者，載持該核酸之載體也包含於本發明。

再者，本發明提供含前述核酸之寄主細胞。該寄主細胞之種類，不特別限制，例如，大腸菌等細菌細胞或各種動物細胞等。該寄主細胞，可適當使用為本發明抗體製造或表現用之生產系。亦即，本發明提供用於使用該寄主細胞製造抗體之生產系。該生產系，可適當使用體外及體內生產系。體外生產系中，使用之寄主細胞，可適當使用真核細胞，及原核細胞。

使用為寄主細胞之真核細胞，例如，動物細胞、植物細胞、真菌細胞。動物細胞，例如：哺乳類細胞，例如CHO(J. Exp.Med.(1995)108、945)、COS、HEK293、3T3、骨髓瘤、BHK(baby hamster kidney)、HeLa、Vero等、兩生類細胞、例如非洲爪蟾卵母細胞(Valle et al.、Nature(1981)291、338-340)，及昆蟲細胞例如Sf9、Sf21、Tn5。本發明之抗體之表現中，較佳為使用CHO-DG44、CHO-DX11B、COS7細胞、HEK293細胞、BHK細胞。當以動物細胞大量表現為目的時，尤以CHO細胞作為寄主細胞較佳。例如，可利用磷酸鈣法、DEAE葡聚糖法、使用陽離子性微脂體DOTAP(Boehringer Mannheim)之方法、電穿孔法、脂質轉染等方法，對於寄主細胞導入重組載體等。

植物細胞，已知例如煙草(Nicotiana tabacum)由來之細胞及浮萍(Lemna minor)為蛋白質生產系，藉由將該細胞進行癒合組織培養之方法，可生產本發明之抗體。真菌細胞，以使用酵母例如，糖化酵母(Saccharomyces)屬之細胞釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖性酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)等)、及絲狀菌例如麴菌(Aspergillus)屬之細胞(黑麴菌(Aspergillus niger)等)之蛋白質表現系為公知，可利用為生產本發明抗體之寄主細胞。

使用原核細胞時，較佳為使用細菌細胞之生產系。細菌細胞，已知除了前述大腸菌(E.coli)以外，有使用枯草菌(B.subtilis)之生產系，該等細菌細胞均可適用在本發明抗體之生產。

為了使用本發明之寄主細胞生產抗體，培養經過包含 編碼為本發明抗體之聚核苷酸之表現載體轉形之寄主細胞，於該培養中，表現編碼為抗體之聚核苷酸。培養可依公知方法適當進行。例如，使用動物細胞為寄主時，培養液可適當使用例如DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM。此時，較佳併用FBS、牛胎兒血清(FCS)等血清補液。又，可利用無血清培養培養細胞。雖依存於寄主細胞，但培養時以pH約6~8之條件下較佳。培養通常於約30~40℃進行約15~200小時，視需要，進行培養基之交換、通氣、攪拌。

另一方面，於體內生產本發明之抗體之生產系，例如可適當採用使用動物之生產系或使用植物之生產系。亦即，對於該等動物或植物導入編碼為本發明抗體之聚核苷酸，在動物或植物體內生產Glypican3抗體並回收之。本發明中，「寄主」，包含該等動物、植物。

寄主使用動物時，可利用使用哺乳類動物、昆蟲之生產系。哺乳類動物可適當使用山羊、豬、羊、小鼠、牛等(Vicki Glaser、SPECTRUM Biotechnology Applications(1993))。又，使用哺乳類動物時，可使用基因轉殖動物。

例如，編碼為本發明抗體之聚核苷酸，製備成與如山羊β酪蛋白之編碼為在乳汁中專一性生產之多胜肽之基因之融合基因。接著，將含此融合基因之聚核苷酸片段注入山羊胚，將該胚移植到雌山羊。從收容胚之山羊產下的基因轉殖山羊或其子孫生產之乳汁，可得目的抗體。為了使該基因轉殖山羊所生產之含抗體的乳汁量增加，可將適當激素對於該基因轉殖山羊投予(Ebert et al.、 Bio/Technology(1994)12、699-702)。

又，生產本發明抗體之昆蟲，例如可使用家蠶。使用家蠶時，將編碼為目的抗體之聚核苷酸插入於病毒基因體上而成的桿狀病毒對於家蠶感染。從該經感染之家蠶之體液，可得目的Glypican3抗體(Susumu et al.、Nature(1985)315、592-4)。

再者，植物用於本發明抗體之生產時，植物可使用例如煙草。使用煙草時，可將編碼為目的抗體之聚核苷酸，插入於植物表現用載體例如pMON 530，將結果得到之重組載體導入於如農桿腫瘤菌(Agrobacterium tumefaciens)之細菌。該細菌用於感染煙草例如，Nicotiana tabacum(Ma et al.、Eur.J.Immunol.(1994)24、131-8)，從經感染之煙草葉，可得所望Glypican3抗體。又，同樣的細菌用於感染浮萍(Lemna minor)，從經選殖化之經感染浮萍細胞，可得所望Glypican3抗體(Cox KM et al.Nat.Biotechnol.(2006)24(12)、1591-7)。

依此方式得到之本發明抗體，可從寄主細胞內或細胞外(培養基、乳汁等)單離，精製成實質純粹且均一的抗體。 抗體之分離、精製，可適當使用通常多胜肽精製使用之分離、精製方法，但不限於該等。例如，可適當選擇層析管柱、過濾、超過濾、鹽析、溶劑沉澱、溶劑萃取、蒸餾、免疫沈降、SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳、等電點電泳法、透析、再結晶等，並組合而將抗體適當分離、及精製。

層析例如親和層析、離子交換層析、疏水性層析、凝 膠過濾層析、逆相層析、吸附層析等(Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshaket al.(1996)Cold Spring Harbor Laboratory Press)。該等層析，液相層析例如可使用HPLC、FPLC等液相層析進行。親和層析使用之管柱，例如Protein A管柱、Protein G管柱。例如，使用Protein A之管柱，例Hyper D、POROS、Sepharose F.F.(Pharmacia製)等。

如上所述，包含培養本發明之寄主細胞並從該細胞之培養物回收Glypican3抗體之步驟的血漿中藥物動力學受控制之本發明抗體之製造方法，亦為本發明之較佳態樣之一。

本發明藉由將人類化抗IL-6受體IgG1抗體TOCILIZUMAB之可變區域及固定區域之胺基酸序列改變，能使藥效增強，同時提升血漿中滯留性，藉此減少投予頻度且持續發揮治療效果，且使免疫原性、安全性、物性改善，提供較TOCILIZUMAB更為優異之第2代分子所構成之醫藥組成物，及此等醫藥組成物之製造方法。再者，本發明提供適於作為醫藥品使用之抗體固定區域。

本發明係關於具優異抗原結合活性、中和活性、血漿中滯留性、安定性及/或均一性，且免疫原性風險減低之抗IL-6受體抗體。

較佳為，抗IL-6受體抗體係人類化PM-1抗體(TOCILIZUMAB)。更具體而言，本發明，提供藉由胺基酸置換使抗原結合活性增強之人類化PM-1抗體、中和活性增強 之人類化PM-1抗體、血漿中滯留性提升之人類化PM-1抗體、免疫原性風險降低之人類化PM-1抗體、安定性提升之人類化PM-1抗體，及均一性提升之人類化PM-1抗體。

人類化PM-1抗體，與人類IL-6受體結合，抑制人類IL-6與人類IL-6受體之結合。本說明書中，人類化PM-1抗體之胺基酸序列與序列表之序列識別號之對應如下。

重鏈胺基酸序列 序列識別號：15

輕鏈胺基酸序列 序列識別號：16

重鏈可變區域之胺基酸序列 序列識別號：17

輕鏈可變區域之胺基酸序列 序列識別號：18

重鏈CDR1(HCDR1)之胺基酸序列 序列識別號：1

重鏈CDR2(HCDR2)之胺基酸序列 序列識別號：2

重鏈CDR3(HCDR3)之胺基酸序列 序列識別號：3

重鏈FR1(HFR1)之胺基酸序列 序列識別號：7

重鏈FR2(HFR2)之胺基酸序列 序列識別號：8

重鏈FR3(HFR3)之胺基酸序列 序列識別號：9

重鏈FR4(HFR4)之胺基酸序列 序列識別號：10

輕鏈CDR1(LCDR1)之胺基酸序列 序列識別號：4

輕鏈CDR2(LCDR2)之胺基酸序列 序列識別號：5

輕鏈CDR3(LCDR3)之胺基酸序列 序列識別號：6

輕鏈FR1(LFR1)之胺基酸序列 序列識別號：11

輕鏈FR2(LFR2)之胺基酸序列 序列識別號：12

輕鏈FR3(LFR3)之胺基酸序列 序列識別號：13

輕鏈FR4(LFR4)之胺基酸序列 序列識別號：14

<親和性‧中和活性增強抗體>

本發明提供對於人類IL-6受體之結合活性及/或中和活性高之抗人類IL-6受體抗體。更具體而言，本發明提供以下(a)~(y)之抗體，及該抗體之製造方法。

(a)一種抗人類IL-6受體抗體，具有序列識別號：1之胺基酸序列(HCDR1)中，1號之Ser被置換為其他胺基酸之重鏈CDR1。

置換後之胺基酸不特別限定，較佳為置換為Trp(RD_68)、Thr(RD_37)、Asp(RD_8)、Asn(RD_11)、Arg(RD_31)、Val(RD_32)、Phe(RD_33)、Ala(RD_34)、Gln(RD_35)、Tyr(RD_36)、Leu(RD_38)、His(RD_42)、Glu(RD_45)或Cys(RD_46)。

序列識別號：1之胺基酸序列中，1號之Ser置換為Trp後之序列以序列識別號：26表示。

序列識別號：1之胺基酸序列中，1號之Ser置換為Thr後之序列以序列識別號：27表示。

序列識別號：1之胺基酸序列中，1號之Ser置換為Asp後之序列以序列識別號：28表示。

序列識別號：1之胺基酸序列中，1號之Ser置換為Asn後之序列以序列識別號：29表示。

序列識別號：1之胺基酸序列中，1號之Ser置換為Arg後之序列以序列識別號：30表示。

序列識別號：1之胺基酸序列中，1號之Ser置換為Val後之序列以序列識別號：31表示。

序列識別號：1之胺基酸序列中，1號之Ser置換為Phe後之序列以序列識別號：32表示。

序列識別號：1之胺基酸序列中，1號之Ser置換為Ala後之序列以序列識別號：33表示。

序列識別號：1之胺基酸序列中，1號之Ser置換為Gln後之序列以序列識別號：34表示。

序列識別號：1之胺基酸序列中，1號之Ser置換為Tyr後之序列以序列識別號：35表示。

序列識別號：1之胺基酸序列中，1號之Ser置換為Leu後之序列以序列識別號：36表示。

序列識別號：1之胺基酸序列中，1號之Ser置換為His後之序列以序列識別號：37表示。

序列識別號：1之胺基酸序列中，1號之Ser置換為Glu後之序列以序列識別號：38表示。

序列識別號：1之胺基酸序列中，1號之Ser置換為Cys後之序列以序列識別號：39表示。(b)一種抗人類IL-6受體抗體，具有序列識別號：1之胺基酸序列(HCDR1)中，5號之Trp被置換為其他胺基酸之重鏈CDR1。

置換後之胺基酸不特別限定，置換為Ile(RD_9)或Val(RD_30)較佳。

序列識別號：1之胺基酸序列中，5號之Trp置換為Ile後之序列以序列識別號：40表示。

序列識別號：1之胺基酸序列中，5號之Trp置換為 Val後之序列以序列識別號：41表示。

(c)一種抗人類IL-6受體抗體序列，具有編號：2之胺基酸序列(HCDR2)中，1號之Tyr被置換為其他胺基酸之重鏈CDR2。

置換後之胺基酸不特別限定，置換為Phe(RD_82)較佳。

序列識別號：2之胺基酸序列中，1號之Tyr置換為Phe後之序列以序列識別號：42表示。

(d)一種抗人類IL-6受體抗體，具有序列識別號：2之胺基酸序列(HCDR2)中，8號之Thr被置換為其他胺基酸之重鏈CDR2。

置換後之胺基酸不特別限定，置換為Arg(RD_79)較佳。

序列識別號：2之胺基酸序列中，8號之Thr置換為Arg後之序列以序列識別號：43表示。

(e)一種抗人類IL-6受體抗體，具有序列識別號：2之胺基酸序列(HCDR2)中，9號之Thr被置換為其他胺基酸之重鏈CDR2。

置換後之胺基酸不特別限定，置換為Ser(RD_12)或Asn(RD_61)較佳。

序列識別號：2之胺基酸序列中，9號之Thr置換為Ser後之序列以序列識別號：44表示。

序列識別號：2之胺基酸序列中，9號之Thr置換為Asn後之序列以序列識別號：45表示。

(f)一種抗人類IL-6受體抗體，具有序列識別號：3之胺基酸序列(HCDR3)中，1號之Ser被置換為其他胺基酸之重 鏈CDR3。

置換後之胺基酸不特別限定，置換為Ile(RD_2)、Val(RD_4)、Thr(RD_80)或Leu(RD_5)較佳。

序列識別號：3之胺基酸序列中，1號之Ser置換為Ile後之序列以序列識別號：46表示。

序列識別號：3之胺基酸序列中，1號之Ser置換為Val後之序列以序列識別號：47表示。

序列識別號：3之胺基酸序列中，1號之Ser置換為Thr後之序列以序列識別號：48表示。

序列識別號：3之胺基酸序列中，1號之Ser置換為Leu後之序列以序列識別號：49表示。

(g)一種抗人類IL-6受體抗體序列，具有編號：3之胺基酸序列(HCDR3)中，2號之Leu被置換為其他胺基酸之重鏈CDR3。

置換後之胺基酸不特別限定，置換為Thr(RD_84)較佳。

序列識別號：3之胺基酸序列中，2號之Leu置換為Thr後之序列以序列識別號：50表示。

(h)一種抗人類IL-6受體抗體，具有序列識別號：3之胺基酸序列(HCDR3)中，5號之Thr被置換為其他胺基酸之重鏈CDR3。

置換後之胺基酸不特別限定，置換為Ala(RD_3)或Ile(RD_83)較佳。其他之較佳置換，例如5號之Thr置換為Ser(RDC_14H)。

序列識別號：3之胺基酸序列中，5號之Thr置換為

Ala後之序列以序列識別號：51表示。

序列識別號：3之胺基酸序列中，5號之Thr置換為Ile後之序列以序列識別號：52表示。

序列識別號：3之胺基酸序列中，5號之Thr置換為Ser後之序列以序列識別號：53表示。

(i)一種抗人類IL-6受體抗體，具有序列識別號：3之胺基酸序列(HCDR3)中，7號之Ala被置換為其他胺基酸之重鏈CDR3。

置換後之胺基酸序列不特別限定，置換為Ser(RD_81)或Val(PF_3H)較佳。

序列識別號：3之胺基酸序列中，7號之Ala置換為Ser後之序列以序列識別號：54表示。

序列識別號：3之胺基酸序列中，7號之Ala置換為Val後之序列序列識別號：55表示。

(j)一種抗人類IL-6受體抗體，具有序列識別號：3之胺基酸序列(HCDR3)中，8號之Met被置換為其他胺基酸之重鏈CDR3。

置換後之胺基酸序列不特別限定，置換為Leu(PF_4H)較佳。

序列識別號：3之胺基酸序列中，8號之Met置換為Leu後之序列以序列識別號：56表示。

(k)一種抗人類IL-6受體抗體，具有序列識別號：3之胺基酸序列(HCDR3)中，1號之Ser及5號之Thr被置換為其他胺基酸之重鏈CDR3。

置換後之胺基酸不特別限定，1號之Ser置換為Leu，5號之Thr置換為Ala較佳(RD_6)。又，其他之較佳置換，例如1號之Ser置換為Val，及5號之Thr置換為Ala(RDC_2H)、1號之Ser置換為Ile，及5號之Thr置換為Ala(RDC_3H)、1號之Ser置換為Thr及5號之Thr置換為Ala(RDC_4H)、1號之Ser置換為Val及5號之Thr置換為Ile(RDC_5H)、1號之Ser置換為Ile及5號之Thr置換為Ile(RDC_6H)、1號之Ser置換為Thr及5號之Thr置換為Ile(RDC_7H)、或1號之Ser置換為Leu及5號之Thr置換為Ile(RDC_8H)。

序列識別號：3之胺基酸序列中，1號之Ser置換為Leu、5號之Thr置換為Ala後之序列，以序列識別號：57表示。

序列識別號：3之胺基酸序列中，1號之Ser置換為Val、5號之Thr置換為Ala後之序列以序列識別號：58表示。

序列識別號：3之胺基酸序列中，1號之Ser置換為Ile、5號之Thr置換為Ala後之序列以序列識別號：59表示。

序列識別號：3之胺基酸序列中，1號之Ser置換為Thr、5號之Thr置換為Ala後之序列以序列識別號：60表示。

序列識別號：3之胺基酸序列中，1號之Ser置換為Val、5號之Thr置換為Ile後之序列以序列識別號：61表 示。

序列識別號：3之胺基酸序列中，1號之Ser置換為Ile、5號之Thr置換為Ile後之序列以序列識別號：62表示。

序列識別號：3之胺基酸序列中，1號之Ser置換為Thr、5號之Thr置換為Ile後之序列以序列識別號：63表示。

序列識別號：3之胺基酸序列中，1號之Ser置換為Leu、5號之Thr置換為Ile後之序列以序列識別號：64表示。 (l)一種抗人類IL-6受體抗體，具有序列識別號：3之胺基酸序列(HCDR3)中，2號之Leu、7號之Ala及8號之Met被置換為其他胺基酸之具重鏈CDR3。

置換後之胺基酸不特別限定，2號之Leu置換為Thr、7號之Ala置換為Val、8號之Met置換為Leu較佳(RD_78)。

序列識別號：3之胺基酸序列中，2號之Leu置換為Thr、7號之Ala置換為Val、8號之Met置換為Leu後之序列以序列識別號：65表示。

(m)一種抗人類IL-6受體抗體，具有序列識別號：4之胺基酸序列(LCDR1)中，1號之Arg被置換為其他胺基酸之輕鏈CDR1。

置換後之胺基酸序列不特別限定，置換為Phe(RD_18)較佳。

序列識別號：4之胺基酸序列中，1號之Arg置換為

Phe後之序列以序列識別號：66表示。

(n)一種抗人類IL-6受體抗體，具有序列識別號：4之胺基酸序列(LCDR1)中，4號之Gln被置換為其他胺基酸之輕鏈CDR1。

置換後之胺基酸序列不特別限定，置換為Arg(RD_26)或Thr(RD_20)較佳。

序列識別號：4之胺基酸序列中，4號之Gln置換為Arg後之序列以序列識別號：67表示。

序列識別號：4之胺基酸序列中，4號之Gln置換為Thr後之序列以序列識別號：68表示。

(o)一種抗人類IL-6受體抗體，具有序列識別號：4之胺基酸序列(LCDR1)中，9號之Tyr被置換為其他胺基酸之輕鏈CDR1。

置換後之胺基酸不特別限定，置換為Phe(RD_73)較佳。

序列識別號：4之胺基酸序列中，9號之Tyr置換為Phe後之序列以序列識別號：69表示。

(p)一種抗人類IL-6受體抗體，具有序列識別號：4之胺基酸序列(LCDR1)中，11號之Asn被置換為其他胺基酸之輕鏈CDR1。

置換後之胺基酸序列不特別限定，置換為Ser(RD_27)較佳。

序列識別號：4之胺基酸序列中，11號之Asn置換為Ser後之序列以序列識別號：70表示。

(q)一種抗人類IL-6受體抗體，具有序列識別號：5之胺

基酸序列(LCDR2)中，2號之Thr被置換為其他胺基酸之輕鏈CDR2。

置換後之胺基酸序列不特別限定，置換為Gly較佳。

序列識別號：5之胺基酸序列中，2號之Thr置換為Gly後之序列以序列識別號：71表示。

(r)一種抗人類IL-6受體抗體，具有序列識別號：6之胺基酸序列(LCDR3)中，1號之Gln被置換為其他胺基酸之輕鏈CDR3。

置換後之胺基酸序列不特別限定，置換為Gly(RD_28)、Asn(RD_29)或Ser(RDC_15L)較佳。

序列識別號：6之胺基酸序列中，1號之Gln置換為Gly後之序列以序列識別號：72表示。

序列識別號：6之胺基酸序列中，1號之Gln置換為Asn後之序列以序列識別號：73表示。

序列識別號：6之胺基酸序列中，1號之Gln置換為Ser後之序列以序列識別號：74表示。

(s)一種抗人類IL-6受體抗體，具有序列識別號：6之胺基酸序列中，3號之Gly被置換為其他胺基酸之輕鏈CDR3。

置換後之胺基酸序列不特別限定，置換為Ser較佳。

序列識別號：6之胺基酸序列中，3號之Gly置換為Ser後之序列以序列識別號：75表示。

(t)一種抗人類IL-6受體抗體，具有序列識別號：4之胺基酸序列(LCDR1)中，9號之Tyr被置換為其他胺基酸之輕鏈CDR1，且序列識別號：6之胺基酸序列(LCDR3)中，3號 之Gly被置換為其他胺基酸之輕鏈CDR3。

置換後之胺基酸不特別限定，序列識別號：4之胺基酸序列(LCDR1)之中9號之Tyr置換為Phe較佳，序列識別號：6之胺基酸序列(LCDR3)之中，3號之Gly置換為Ser較佳(RD_72)。

(u)一種抗人類IL-6受體抗體，具有序列識別號：6之胺基酸序列(LCDR3)中，5號之Thr被置換為其他胺基酸之輕鏈CDR3。

置換後之胺基酸不特別限定，置換為Arg(RD_23)或Ser較佳。

序列識別號：6之胺基酸序列中，5號之Thr置換為Arg後之序列以序列識別號：76表示。

序列識別號：6之胺基酸序列中，5號之Thr置換為Ser後之序列以序列識別號：77表示。

(v)一種抗IL-6受體抗體，具有序列識別號：6之胺基酸序列(LCDR3)中，1號之Gln及5號之Thr被置換為其他胺基酸之輕鏈CDR3。

置換後之胺基酸不特別限定，1號之Gln置換為Gly、5號之Thr置換為Ser較佳(RD_22)。又，其他較佳置換，例如1號之Gln置換為Gly及5號之Thr置換為Arg(RDC_11L)。

序列識別號：6之胺基酸序列中，1號之Gln置換為Gly、5號之Thr置換為Ser後之序列以序列識別號：78表示。

序列識別號：6之胺基酸序列中，1號之Gln置換為Gly、5號之Thr置換為Arg後之序列以序列識別號：79表示。

(w)一種抗IL-6受體抗體，包含序列識別號：2之胺基酸序列(HCDR2)中，9號之Thr被置換為其他胺基酸之重鏈CDR2、序列識別號：3之胺基酸序列(HCDR3)中，1號之Ser及5號之Thr被置換為其他胺基酸之重鏈CDR3。

序列識別號：2之胺基酸序列(HCDR2)之中9號之Thr置換為Asn較佳。又，序列識別號：3之胺基酸序列(HCDR3)之中，1號之Ser及5號之Thr置換後之胺基酸之較佳組合，例如：Leu及Ala(RDC_27H)、Val及Ala(RDC_28H)、Ile及Ala(RDC_30H)、Thr及Ala(RDC_4H)、Val及Ile(RDC_29H)、Ile及Ile(RDC_32H)、Thr及Ile(RDC_7H)、Leu及Ile(RDC_8H)。

(x)一種抗體，包含具(k)之重鏈CDR3之可變區域及具(v)之輕鏈CDR3的可變區域。

(y)如(x)之抗體，尚包含(e)之重鏈CDR2。

本發明提供至少含上述(a)~(y)任一胺基酸置換之抗體及該抗體之製造方法。因此，本發明之抗體中，除了上述(a)~(y)任一胺基酸置換以外，尚包含上述(a)~(y)之胺基酸置換以外之胺基酸置換的抗體。又，本發明之抗體，尚包含將上述(a)~(y)任一胺基酸置換多數組合之抗體。 上述(a)~(y)之胺基酸置換，例如將上述CDR胺基酸序列置換為其他胺基酸。上述(a)~(y)之胺基酸置換以外之胺 基酸置換，例如，其他CDR部分之胺基酸序列置換、缺失、加成及/或插入等。又，例如FR之胺基酸序列置換、缺失、加成及/或插入等。又，例如固定區域之胺基酸序列置換、缺失、加成及/或插入等。

又，本發明之抗體，尚包含將本發明發現之高親和性CDR，移植到人類化PM-1抗體以外任一框架而成之抗體。 又，本發明之抗體，包含將本發明發現之高親和性CDR移植到人類化PM-1抗體以外框架結果親和性降低之抗體中，為了得到原本親和性之抗體，於框架部分導入變異(參考例如，Curr Opin Biotechnol.1994 Aug；5(4)：428-33)之抗體，及為了得到原本親和性之抗體，於CDR部分導入變異(參考例如，US2006/0122377)之抗體。

本發明中，上述(a)~(y)任一胺基酸置換，以對於人類化PM-1抗體進行較佳。人類化PM-1抗體中，實施上述(a)~(y)任一胺基酸置換之抗體，對於IL-6受體具高的中和活性。人類化PM-1抗體中，經實施上述(a)~(y)任一胺基酸置換之抗體，對於IL-6相關連之風濕性關節炎等發炎症性疾病等治療藥為有效。

又，包含上述(a)~(y)任一胺基酸置換之抗體，亦可如例如下述(1)或(2)之方式表現。在此，記載(a)之抗體為例，但是關於(b)~(y)之抗體，亦可同樣地表現。

(1)一種包含重鏈可變區域之抗體，具於序列識別號：1之胺基酸序列中，1號之Ser置換為其他胺基酸之胺基酸序列之CDR1。

(2)一種包含H鏈的抗體，就CDR1而言，具序列識別號：1之胺基酸序列中，1號之Ser置換為其他胺基酸之胺基酸序列。

<結合活性增強之抗體>

本發明尚提供對於IL-6受體之結合活性高的抗IL-6受體抗體。本發明中，對於IL-6受體之結合活性高的抗IL-6受體抗體，係通常於生理條件下，於37℃測定之親和性為1nM以下之抗體，較佳為親和性0.1nM以下之抗體，更佳為親和性0.04nM以下之抗體。如此對於IL-6受體之結合活性高的抗IL-6受體抗體，被認為能提升抗原之生物作用之中和能力。

本發明之對於IL-6受體之結合活性高的抗IL-6受體抗體中，導入之胺基酸置換不特別限定，例如上述胺基酸置換。

IL-6受體不特別限定，以人類IL-6受體較佳。

結合活性之測定，可利用該技術領域中具通常知識者公知方法進行，例如可藉由使用SPR之Biacore(BIACORE)等測定。

<使CDR序列之免疫原性風險降低之抗體>

又，本發明提供免疫原性降低之抗IL-6受體抗體，尤其人類化PM-1抗體。抗體序列中若存在與HLA結合之T細胞抗原決定基，則被認為抗體之免疫原性增高。因此，藉由將抗體之序列置換而除去存在於抗體序列中之T細胞抗原決定基，能使抗體之免疫原性風險降低。

本發明提供將抗體之胺基酸序列，尤其CDR序列中之胺基酸置換為其他胺基酸，藉此除去T細胞抗原決定基之免疫原性降低的人類化抗人類IL-6受體抗體，尤其人類化PM-1輕鏈可變區域。又，本發明提供含該輕鏈可變區域之抗體。

更具體而言，本發明提供序列識別號：5之胺基酸序列(LCDR2)中，2號之Thr置換為其他胺基酸之輕鏈CDR2。

又，本發明提供含該輕鏈CDR2之輕鏈可變區域。又，本發明提供含該輕鏈可變區域之抗IL-6受體抗體。置換後之胺基酸序列不特別限定，置換為Gly較佳。序列識別號：5之胺基酸序列中，2號之Thr置換為Gly後之序列以序列識別號：71表示。該胺基酸置換，較佳為在人類化PM-1抗體之輕鏈可變區域中進行。

<H53/L28之FR及CDR>

本發明尚提供血漿中藥物動力學性、安定性及/或免疫原性改善之抗人類IL-6受體抗體。發現到IgG中具相同Fc區域之IgG之血漿中半衰期，與pI以高相關係數相關。

所以，嘗試使對抗相異抗原之2種抗體中，可變區域之pI改變，成功地不論抗原種類，不改變Fc區域而控制血漿中半衰期。抗體非專一性進入內皮細胞之速度，可認為依存於帶負電荷之細胞表面與IgG之物理化學庫侖交互作用。

藉由使IgG之pI降低，庫侖交互作用減低，非專一性進入內皮細胞減少，結果使內皮細胞之中代謝減少，藉此能增加血漿中滯留性。

亦即，本發明提供藉由置換抗IL-6受體抗體尤其人類化PM-1抗體之胺基酸序列，使等電點降低，使血漿中滯留性增加之抗人類IL-6受體抗體。具體而言，Kabat編號(Kabat EA et al.、1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest.NIH)中，人類化PM-1之H13(序列識別號：7之13號之胺基酸)、H16(序列識別號：7之16號之胺基酸)、H43(序列識別號：8之8號之胺基酸)、H81(序列識別號：9之16號之胺基酸)、H105(序列識別號：10之3號之胺基酸)、L18(序列識別號：11之18號之胺基酸)、L45(序列識別號：12之11號之胺基酸)、L79(序列識別號：13之23號之胺基酸)、L107(序列識別號：14之10號之胺基酸)、H31(序列識別號：1之1號之胺基酸)、L24(序列識別號：4之1號之胺基酸)及/或L53(序列識別號：5之4號之胺基酸)置換為等電點降低之其他胺基酸。

藉此，能不對於人類化PM-1之結合活性或安定性造成影響地使等電點降低。又，人類化PM-1抗體中，當將小鼠序列人類化時，為了保持結合活性，會有數個胺基酸殘基留下來維持是小鼠序列。具體而言，上述Kabat編號中，人類化PM-1抗體之H27(序列識別號：7之27號之胺基酸)、H28(序列識別號：7之28號之胺基酸)、H29(序列識別號：7之29號之胺基酸)、H30(序列識別號：7之30號之胺基酸)及H71，係維持利用小鼠序列。關於HFR1，可藉由置換H13、H16、H23、H30，就HFR1而言變換為人類序列，可認為能製作相較於人類化抗體PM-1免疫原性風險更降低之

抗體。再者，人類化PM-1由於係藉由CDR移植法而人類化之抗體，因此關於安定性被認為有改善的餘地。例如，藉由將露出抗體可變區域表面之胺基酸殘基置換為親水性之胺基酸，被認為能使抗體安定化。再者，藉由將CDR序列改變為一致性序列，亦能將抗體安定化。人類化PM-1抗體中，可藉由將上述Kabat編號H69(序列識別號：9之4號之胺基酸)之Met置換為Ile(疏水核構造之安定化)、H70(序列識別號：9之5號之胺基酸)之Leu置換為Ser(表面露出殘基之親水化)、H58(序列識別號：2之9號之胺基酸)之Thr置換為Asn(重鏈CDR2改變為一致性序列)、H65(序列識別號：2之16號之胺基酸)之Ser置換為Gly(β轉角(β turn)部分置換為Gly、重鏈CDR2改變為一致性序列)，或L93(序列識別號：6之5號之胺基酸)之Thr置換為Ser(表面露出殘基之親水化)，可使抗體安定化。又，藉由將上述LCDR2(序列識別號：5)之2號L51之Thr置換為Gly，能不影響結合活性或安定性，而使以電腦模擬(in silico)預測之T細胞抗原決定基除去而降低免疫原性風險。將該等胺基酸置換組合，可得抗體之血漿中藥物動力學性、免疫原性、安定性改善之抗IL-6受體抗體。

如此種抗體之例，例如下述(1)~(37)任一抗體。

(1)一種包含重鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：7之胺基酸序列中，13號之Arg被置換為其他胺基酸之FR1。

置換後之胺基酸序列不特別限定，置換為Lys較佳。

序列識別號：7之胺基酸序列中，13號之Arg置換為 Lys後之序列以序列識別號：80表示。

(2)一種包含重鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：7之胺基酸序列中，16號之Gln被置換為其他胺基酸之FR1。

置換後之胺基酸序列不特別限定，置換為Glu較佳。

序列識別號：7之胺基酸序列中，16號之Gln置換為Glu後之序列以序列識別號：81表示。

(3)一種包含重鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：7之胺基酸序列中，23號之Thr被置換為其他胺基酸之FR1。

置換後之胺基酸序列不特別限定，置換為Ala較佳。

序列識別號：7之胺基酸序列中，23號之Thr置換為Ala後之序列以序列識別號：82表示。

(4)一種包含重鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：7之胺基酸序列中，30號之Thr被置換為其他胺基酸之FR1。

置換後之胺基酸序列不特別限定，置換為Ser較佳。

序列識別號：7之胺基酸序列中，30號之Thr置換為Ser後之序列以序列識別號：83表示。

(5)一種包含重鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：7之胺基酸序列中，13號之Arg、16號之Gln、23號之Thr及30號之Thr被置換為其他胺基酸之FR1。

置換後之胺基酸不特別限定，13號之Arg置換為Lys、16號之Gln置換為Glu、23號之Thr置換為Ala、30號之Thr置換為Ser較佳。

序列識別號：7之胺基酸序列中，13號之Arg置換為Lys、16號之Gln置換為Glu、23號之Thr置換為Ala、30 號之Thr置換為Ser後之序列以序列識別號：84表示。

(6)一種包含重鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：8之胺基酸序列中，8號之Arg被置換為其他胺基酸之FR2。

置換後之胺基酸不特別限定，置換為Glu較佳。

序列識別號：8之胺基酸序列中，8號之Arg置換為Glu後之序列以序列識別號：85表示。

(7)一種包含重鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：9之胺基酸序列中，4號之Met被置換為其他胺基酸之FR3。

置換後之胺基酸不特別限定，置換為Ile較佳。

序列識別號：9之胺基酸序列中，4號之Met置換為Ile後之序列以序列識別號：86表示。

(8)一種包含重鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：9之胺基酸序列中，5號之Leu被置換為其他胺基酸之FR3。

置換後之胺基酸序列不特別限定，置換為Ser較佳。

序列識別號：9之胺基酸序列中，5號之Leu置換為Ser後之序列以序列識別號：87表示。

(9)一種包含重鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：9之胺基酸序列中，16號之Arg被置換為其他胺基酸之FR3。

置換後之胺基酸不特別限定，置換為Lys較佳。

序列識別號：9之胺基酸序列中，16號之Arg置換為Lys後之序列以序列識別號：88表示。

(10)一種包含重鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：9之胺基酸序列中，27號之Val被置換為其他胺基酸之FR3。

置換後之胺基酸序列不特別限定，置換為Ala較佳。

序列識別號：9之胺基酸序列中，27號之Val置換為Ala後之序列以序列識別號：89表示。

(11)一種包含重鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：9所記載(HFR3)之胺基酸序列中，4號之Met、5號之Leu、16號之Arg及27號之Val被置換為其他胺基酸之FR3。

置換後之胺基酸不特別限定，4號之Met置換為Ile、5號之Leu置換為Ser、16號之Arg置換為Lys、27號之Val置換為Ala較佳。

序列識別號：9之胺基酸序列中，4號之Met置換為Ile、5號之Leu置換為Ser、16號之Arg置換為Lys、27號之Val置換為Ala後之序列以序列識別號：90表示。

(12)一種包含重鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：10所記載(HFR4)之胺基酸序列中，3號之Gln被置換為其他胺基酸之FR4。

置換後之胺基酸不特別限定，置換為Glu較佳。

序列識別號：10之胺基酸序列中，3號之Gln置換為Glu後之序列以序列識別號：91表示。

(13)一種包含輕鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：11所記載(LFR1)之胺基酸序列中，18號之Arg被置換為其他胺基酸之具FR1之鏈可變區域。

置換後之胺基酸不特別限定，置換為Ser較佳。

序列識別號：11之胺基酸序列中，18號之Arg置換為Ser後之序列以序列識別號：92表示。

(14)一種包含輕鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：12 所記載(LFR2)之胺基酸序列中，11號之Lys被置換為其他胺基酸之FR2。

置換後之胺基酸不特別限定，置換為Glu較佳。

序列識別號：12之胺基酸序列中，11號之Lys置換為Glu後之序列以序列識別號：93表示。

(15)一種包含輕鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：13之胺基酸序列中，23號之Gln被置換為其他胺基酸之FR3。

置換後之胺基酸不特別限定，置換為Glu較佳。

序列識別號：13之胺基酸序列中，23號之Gln置換為Glu後之序列以序列識別號：94表示。

(16)一種包含輕鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：13之胺基酸序列中，24號之Pro被置換為其他胺基酸之FR3。

置換後之胺基酸序列不特別限定，置換為Ala較佳。

序列識別號：13之胺基酸序列中，24號之Pro置換為Ala後之序列以序列識別號：95表示。

(17)一種包含輕鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：13之胺基酸序列中，27號之Ile被置換為其他胺基酸之FR3。

置換後之胺基酸序列不特別限定，置換為Ala較佳。

序列識別號：13之胺基酸序列中，27號之Ile置換為Ala後之序列以序列識別號：96表示。

(18)一種包含輕鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：13所記載(LFR3)之胺基酸序列中，23號之Gln、24號之Pro及27號之Ile被置換為其他胺基酸之FR3。

置換後之胺基酸不特別限定，23號之Gln置換為Glu、

24號之Pro置換為Ala、27號之Ile置換為Ala較佳。

序列識別號：13之胺基酸序列中，23號之Gln置換為Glu、24號之Pro置換為Ala、27號之Ile置換為Ala後之序列以序列識別號：97表示。

(19)一種包含輕鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：14所記載(LFR4)之胺基酸序列中，10號之Lys被置換為其他胺基酸之FR4。

置換後之胺基酸不特別限定，置換為Glu較佳。

序列識別號：14之胺基酸序列中，10號之Lys置換為Glu後之序列以序列識別號：98表示。

(20)一種包含重鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：10所記載(HFR4)之胺基酸序列中，5號之Ser被置換為其他胺基酸之FR4。

置換後之胺基酸不特別限定，置換為Thr較佳。

序列識別號：10之胺基酸序列中，5號之Ser置換為Thr後之序列以序列識別號：132表示。

(21)一種包含重鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：10所記載(HFR4)之胺基酸序列中，3號之Gln及5號之Ser被置換為其他胺基酸之FR4。

置換後之胺基酸不特別限定，3號之Gln置換為Glu、5號之Ser置換為Thr較佳。

序列識別號：10之胺基酸序列中，3號之Gln置換為Glu、5號之Ser置換為Thr後之序列以序列識別號：133表示。

(22)一種抗體，包含進行(5)、(6)、(11)及(21)之胺基酸置換之人類化PM-1重鏈可變區域。

(23)一種抗體，包含進行(13)、(14)、(18)及(19)之胺基酸置換之人類化PM-1輕鏈可變區域。

(24)一種抗體，包含(22)之重鏈可變區域及(23)之輕鏈可變區域。

(25)一種包含重鏈可變區域之抗體，具序列識別號：1所記載(HCDR1)之胺基酸序列中，1號之Ser被置換為其他胺基酸之CDR1。

置換後之胺基酸不特別限定，置換為Asp較佳。

序列識別號：1之胺基酸序列中，1號之Ser置換為Asp後之序列以序列識別號：28表示。

(26)一種包含重鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：2之胺基酸序列中，16號之Ser被置換為其他胺基酸之CDR2。

置換後之胺基酸不特別限定，置換為Gly較佳。

序列識別號：2之胺基酸序列中，16號之Ser置換為Gly後之序列以序列識別號：99表示。

(27)一種包含重鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：2所記載(HCDR2)之胺基酸序列中，9號之Thr及16號之Ser被置換為其他胺基酸之具CDR2之重鏈可變區域。

置換後之胺基酸不特別限定，9號之Thr置換為Asn、16號之Ser置換為Gly較佳。

序列識別號：2之胺基酸序列中，9號之Thr置換為Asn、16號之Ser置換為Gly後之序列以序列識別號：100 表示。

(28)一種包含輕鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：4所記載(LCDR1)之胺基酸序列中，1號之Arg被置換為其他胺基酸之CDR1。

置換後之胺基酸不特別限定，置換為Gln較佳。

序列識別號：4之胺基酸序列中，1號之Arg置換為Gln後之列以序列識別號：101表示。

(29)一種包含輕鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：5之胺基酸序列中，4號之Arg被置換為其他胺基酸之CDR2。

置換後之胺基酸不特別限定，置換為Glu較佳。

序列識別號：5之胺基酸序列中，4號之Arg置換為Glu後之序列以序列識別號：102表示。

(30)一種包含輕鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：5所記載(LCDR2)之胺基酸序列中，2號之Thr及4號之Arg被置換為其他胺基酸之CDR2。

置換後之胺基酸不特別限定，2號之Thr置換為Gly、4號之Arg置換為Glu較佳。

序列識別號：5之胺基酸序列中，2號之Thr置換為Gly、4號之Arg置換為Glu後之序列以序列識別號：103表示。

(31)一種包含輕鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：6所記載(LCDR3)之胺基酸序列中，5號之Thr被置換為其他胺基酸之CDR3。

置換後之胺基酸不特別限定，置換為Ser較佳。

序列識別號：6之胺基酸序列中，5號之Thr置換為Ser後之序列以序列識別號：77表示。

(32)一種抗體，包含進行(25)及(27)之胺基酸置換之重鏈可變區域。

(33)一種抗體，包含進行(28)、(30)及(31)之胺基酸置換之輕鏈可變區域。

(34)一種抗體，包含(32)之重鏈可變區域及(33)之輕鏈可變區域。

(35)一種包含重鏈可變區域之抗體，具序列識別號：104所記載(H53/L28之VH)之胺基酸序列。

(36)一種包含輕鏈可變區域之抗體，具序列識別號：105所記載(H53/L28之VL)之胺基酸序列。

(37)一種抗體，具(35)之重鏈可變區域及(36)之輕鏈可變區域。

上述(1)~(37)任一之胺基酸置換，以對於人類化PM-1抗體進行較佳。本發明提供包含至少上述(1)~(37)任一之胺基酸置換之抗體及該抗體之製造方法。因此本發明之抗體，除了上述(1)~(37)任一之胺基酸置換以外，尚包含含有上述(1)~(37)之胺基酸置換以外之胺基酸置換之抗體。又，本發明之抗體中，尚包含將上述(1)~(37)任一之胺基酸置換多數組合的抗體。上述(1)~(37)之胺基酸置換，例如，上述FR及CDR區胺基酸序列之置換。上述(1)~(37)之胺基酸置換以外之胺基酸置換，例如上述以外之FR及CDR序列之置換、缺失、加成及/或插入等。又，例 如固定區域之胺基酸序列之置換、缺失、加成及/或插入等。

再者，上述胺基酸改變以外之不使抗IL-6受體抗體之活性降低，使等電點降低之改變，例如將序列識別號：2之胺基酸序列中，15號之Lys及/或16號之Ser置換為其他胺基酸之改變。置換後之胺基酸不特別限定，15號之Lys置換為Gln、16號之Ser置換為Asp較佳。序列識別號：2之胺基酸序列中，15號之Lys置換為Gln、16號之Ser置換為Asp後之序列以序列識別號：121表示。又，如此之胺基酸置換亦可對於序列識別號：100之胺基酸序列進行。 序列識別號：100之胺基酸序列中，15號之Lys置換為Gln、16號之Gly置換為Asp後之序列以序列識別號：122表示。 因此，本發明提供包含重鏈可變區域之抗體，具有序列識別號：2或序列識別號100之胺基酸序列中，15號之Lys及/或16號之Ser被置換為其他胺基酸之CDR2。

再者，使等電點降低之其他改變，例如序列識別號：4之胺基酸序列中，4號之Gln置換為其他胺基酸之改變。 置換後之胺基酸不特別限定，置換為Glu較佳。序列識別號：4之胺基酸序列中，4號之Gln置換為Glu後之胺基酸序列以序列識別號：123表示。又，此胺基酸置換亦可對於序列識別號：101之胺基酸序列進行。序列識別號：101之胺基酸序列中，4號之Gln置換為Glu後之胺基酸序列以序列識別號：124表示。因此，本發明提供一種包含輕鏈可變區域之抗體，具序列識別號：4或序列識別號101之胺基酸序列中，4號之Gln被置換為其他胺基酸之CDR1。

再者，使等電點降低之其他改變，例如將序列識別號：5之胺基酸序列中，6號之His置換為其他胺基酸之改變。 置換後之胺基酸不特別限定，置換為Glu較佳。序列識別號：5之胺基酸序列中，6號之His置換為Glu後之胺基酸序列以序列識別號：125表示。又，此胺基酸置換亦可對於序列識別號：103之胺基酸序列進行。序列識別號：103之胺基酸序列中，6號之His置換為Glu後之胺基酸序列以序列識別號：126表示。因此，本發明提供一種包含輕鏈可變區域之抗體，具序列識別號：5或序列識別號：103之胺基酸序列中，6號之His被置換為其他胺基酸之CDR2。

再，序列識別號：90之重鏈FR3之胺基酸序列中，就使免疫原性風險減低之改變而言，例如27號(Kabat編號H89)之Ala置換為Val之改變。序列識別號：90之胺基酸序列中，27號之Ala置換為Val後之胺基酸序列以序列識別號：127表示。因此，本發明提供一種包含重鏈可變區域之抗體，具序列識別號：90之胺基酸序列中，27號之Ala置換為Val後之FR3。

又，序列識別號：9或序列識別號：90之重鏈FR3之胺基酸序列中，關於唯一殘存之小鼠序列6號(Kabat編號H71)之Arg，藉由將H71於Arg保守之人類VH1次類(序列識別號：128)、或人類VH3次類(序列識別號：129)之人類序列作為FR3序列，被認為可製作框架完全為人類序列之抗人類IL-6受體抗體。因此，本發明提供一種包含重鏈可變區域之抗體，具序列識別號：128或序列識別號：129之 FR3。

再者，序列識別號：10之重鏈FR4之胺基酸序列中，就使安定性提升之改變而言，例如5號(Kabat編號H107)之Ser置換為Ile之改變。序列識別號：10之胺基酸序列中，5號之Ser置換為Ile後之胺基酸序列以序列識別號：130表示。又，此胺基酸序列可對於序列識別號：91之胺基酸序列進行。序列識別號：91之胺基酸序列中，5號之Ser置換為Ile後之胺基酸序列以序列識別號：131表示。 因此，本發明提供一種包含重鏈可變區域之抗體，具序列識別號：10或序列識別號：91之胺基酸序列中，5號之Ser置換為Ile之FR4。

如此之胺基酸置換，對於人類化PM-1抗體、H53/L28(含序列識別號：104之重鏈可變區域、序列識別號：105之輕鏈可變區域的抗體)、或PF1抗體(含序列識別號：22之重鏈可變區域、序列識別號：23之輕鏈可變區域的抗體)進行較佳。本發明提供包含至少此種胺基酸置換之抗體及該抗體之製造方法。因此本發明之抗體中，尚包含除了此種胺基酸置換以外，含有上述(1)~(37)之胺基酸置換及/或上述(1)~(37)以外之胺基酸置換之抗體。上述(1)~(37)之胺基酸置換以外之胺基酸置換，例如上述以外之FR及CDR序列之置換、缺失、加成及/或插入等。又，例如固定區域之胺基酸序列之置換、缺失、加成及/或插入等。

<等電點低之抗人類IL-6受體抗體>

本發明尚提供低等電點的抗IL-6受體抗體。本發明之低等電點抗體，包含全長抗體之實測等電點低的抗體及可變區域(VH/VL)之理論等電點低的抗體。

本發明中，全長抗體之實測等電點低的抗IL-6受體抗體，通常為實測等電點7.5以下之抗體，較佳為實測等電點7.0以下之抗體，更佳為實測等電點6.0以下之抗體。 實測等電點可以該技術領域中具通常知識者公知之方法測定，例如可利用非變性凝膠等電點電泳或毛細管等電點電泳等方法測定。

本發明中，可變區域之理論等電點低的抗IL-6受體抗體，通常為理論等電點5.5以下之抗體，較佳為理論等電點5.0以下之抗體，更佳為理論等電點4.0以下之抗體。 理論等電點可利用該技術領域中具通常知識者公知之方法計算，例如藉由GENETYX(GENETYX CORPORATION)等軟體，可計算可變區域之VH及VL之理論等電點。

本發明之等電點低的抗IL-6受體抗體中，導入之胺基酸置換不特別限定，例如上述胺基酸置換。此種等電點低的抗IL-6受體抗體，可認為血漿中之滯留性提高。

IL-6受體不特別限定，人類IL-6受體較佳。

<於高濃度安定的抗人類IL-6受體抗體>

再者，本發明提供於高濃度安定的抗IL-6受體抗體。

本發明中，"於高濃度安定"，係指於在適於皮下投予之pH6.5~7.0之範圍適當選擇的緩衝液條件(例如，20mM histidine-HCl、150mM NaCl)，抗IL-6受體抗體100mg/mL 高濃度抗體溶液於25℃每1個月之聚集體比率(凝膠過濾層析上之聚集體峰部面積/總峰部面積×100)之增加為0.3%以下，較佳為0.2%以下，更佳為0.1%以下。又，抗IL-6受體抗體之濃度為100mg/mL以上即可，例如可為200mg/mL或300mg/mL等。

本發明之於高濃度安定的抗IL-6受體抗體，不特別限定，可利用例如上述胺基酸置換等製作。

IL-6受體不特別限定，人類IL-6受體較佳。

本發明尚提供對於經上述(1)~(37)任一之胺基酸置換之人類化PM-1抗體，再進行上述(a)~(y)任一之使結合活性及/或中和活性提升之胺基酸置換的抗體。如此抗體之一態樣，例如抗體(PF1)：具序列識別號：22所記載(PF1_H)之胺基酸序列之重鏈可變區域、及具序列識別號：23所記載(PF1_L)之胺基酸序列之輕鏈可變區域，但不限定於此。

再者，本發明提供以下之抗體之(A)~(I)任一之抗IL-6受體抗體。

(A)重鏈可變區域，包含：具序列識別號：165之胺基酸序列(VH5-M83之CDR1)之CDR1、具序列識別號：166之胺基酸序列(VH5-M83之CDR2)之CDR2、具序列識別號：167之胺基酸序列(VH5-M83之CDR3)之CDR3。

(B)輕鏈可變區域，包含：具序列識別號：101之胺基酸序列(VL5之CDR1)之CDR1、具序列識別號：168之胺基酸序列(VL5之CDR2)之CDR2、具序列識別號：79之胺基酸序列(VL5之CDR3)之CDR3。

(C)抗體，包含(A)之重鏈可變區域及(B)之輕鏈可變區域。

(D)重鏈可變區域，包含：具序列識別號：169之胺基酸序列(VH3-M73之CDR1)之CDR1、具序列識別號：170之胺基酸序列(VH3-M73之CDR2)之CDR2、具序列識別號：171之胺基酸序列(VH3-M73之CDR3)之CDR3。

(E)輕鏈可變區域，包含：具序列識別號：172之胺基酸序列(VL3之CDR1)之CDR1、具序列識別號：173之胺基酸序列(VL3之CDR2)之CDR2、具序列識別號：78之胺基酸序列(VL3之CDR3)之CDR3。

(F)抗體，包含(D)之重鏈可變區域及(E)之輕鏈可變區域。

(G)重鏈可變區域，包含：具序列識別號：169之胺基酸序列(VH4-M73之CDR1)之CDR1、具序列識別號：174之胺基酸序列(VH4-M73之CDR2)之CDR2、具序列識別號：171之胺基酸序列(VH4-M73之CDR3)之CDR3。

(H)輕鏈可變區域，包含：具序列識別號：175之胺基酸序列(VL1之CDR1)之CDR1、具序列識別號：173之胺基酸序列(VL1之CDR2)之CDR2、具序列識別號：79之胺基酸序列(VL1之CDR3)之CDR3。

(1)抗體，包含(G)之重鏈可變區域及(H)之輕鏈可變區域。

再者，本發明提供以下之(a)~(q)任一之抗IL-6受體抗體。

(a)一種包含重鏈可變區域之抗體，具序列識別號：159之胺基酸序列(H96-IgG1可變區域)。

(b)一種包含重鏈可變區域之抗體，具具序列識別號：159 之胺基酸序列(H96-IgG1可變區域)中，35號之Trp、51號之Tyr、63號之Ser、65號之Lys、66號之Gly、99號之Val、103號之Ile、108號之Tyr、111號之Glu、113號之Thr之中至少1個胺基酸被置換為其他胺基酸之胺基酸序列。

(c)一種包含重鏈可變區域之抗體，具具序列識別號：159之胺基酸序列(H96-IgG1可變區域)中，65號之Lys、66號之Gly、99號之Val、103號之Ile、111號之Glu、113號之Thr被置換為其他胺基酸之胺基酸序列

(d)一種包含重鏈可變區域之抗體，具序列識別號：159之胺基酸序列(H96-IgG1可變區域)中，35號之Trp、51號之Tyr、63號之Ser、65號之Lys、66號之Gly、99號之Val、103號之Ile、108號之Tyr被置換為其他胺基酸之胺基酸序列。

(e)一種包含重鏈可變區域之抗體，具序列識別號：160之胺基酸序列(F2H-IgG1可變區域)。

(f)一種包含重鏈可變區域之抗體，具序列識別號：161之胺基酸序列(VH5-M83可變區域)。

(g)一種包含輕鏈可變區域之抗體，具序列識別號：23之胺基酸序列(PF1L)中，27號之Gln及/或55號之His被置換為其他胺基酸之胺基酸序列。

(h)一種包含輕鏈可變區域之抗體，具序列識別號：162之胺基酸序列(L39可變區域)。

(i)一種包含輕鏈可變區域之抗體，具序列識別號：163之 胺基酸序列(VL5-kappa可變區域)。

(j)一種包含重鏈可變區域之抗體，具序列識別號：176之胺基酸序列(VH3-M73可變區域)。

(k)一種包含重鏈可變區域之抗體，具序列識別號：178之胺基酸序列(VH4-M73可變區域)。

(l)一種包含輕鏈可變區域之抗體，具序列識別號：177之胺基酸序列(VL3-kappa可變區域)之輕鏈可變區域。

(m)一種包含輕鏈可變區域之抗體，具序列識別號：179之胺基酸序列(VL1-kappa可變區域)。

(n)抗體，包含(e)之重鏈可變區域與(h)之輕鏈可變區域。

(o)抗體，包含(f)之重鏈可變區域與(i)之輕鏈可變區域(FV5-M83之可變區域組合)、(p)抗體，包含(j)之重鏈可變區域與(1)之輕鏈可變區域(FV4-M73之可變區域組合)、(q)抗體，包含(k)之重鏈可變區域與(m)之輕鏈可變區域(FV3-M73之可變區域組合)。

上述(a)~(d)之重鏈可變區域之胺基酸置換中，置換後之胺基酸不特別限定，35號之Trp置換為Val、51號之Tyr置換為Phe、63號之Ser置換為Thr、65號之Lys置換為Gln、66號之Gly置換為Asp、99號之Val置換為Leu、103號之Ile置換為Ala、108號之Tyr置換為Val、111號之Glu置換為Gln、113號之Thr置換為Ile較佳。又、上述(g)之輕鏈可變區域之胺基酸置換中，置換後之胺基酸不特別限定，27號之Gln置換為Glu、55號之His置換為 Glu較佳。又，可進行上述胺基酸置換以外之胺基酸之置換、缺失、插入及/或加成等。

本發明之抗體之固定區域不特別限定，可使用任何固定區域。例如，具IgG1、IgG2、IgG4等天然序列之固定區域，或藉由將具天然序列之固定區域中之胺基酸之置換、缺失、加成及/或插入等所製作之改變型固定區域等。改變型固定區域之例，例如後述固定區域。

又，使用上述本發明之可變區域之抗體之例，例如以下抗體。

(1)一種包含重鏈之抗體，具序列識別號：134之胺基酸序列(H96-IgG1)。

(2)一種包含重鏈之抗體，具序列識別號：135之胺基酸序列(F2H-IgG1)。

(3)一種包含重鏈之抗體，具序列識別號：137之胺基酸序列(VH5-IgG1)。

(4)一種包含重鏈之抗體，具序列識別號：139之胺基酸序列(VH5-M83)。

(5)一種包含輕鏈之抗體，具序列識別號：136之胺基酸序列(L39)。

(6)一種包含輕鏈之抗體，具序列識別號：138之胺基酸序列(VL5-kappa)。

(7)一種包含重鏈之抗體，具序列識別號：180之胺基酸序列(VH3-M73)。

(8)一種包含重鏈之抗體，具序列識別號：182之胺基酸序 列(VH4-M73)。

(9)一種包含輕鏈之抗體，具序列識別號：181之胺基酸序列(VL3-kappa)。

(10)一種包含輕鏈之抗體，具序列識別號：183之胺基酸序列(VL1-kappa)。

(11)一種抗體，具(2)之重鏈及(5)之輕鏈。

(12)一種抗體，包含(3)之重鏈及(6)之輕鏈。

(13)一種抗體，包含(4)之重鏈及(6)之輕鏈(FV5-M83)。

(14)一種抗體，包含(7)之重鏈及(9)之輕鏈(FV4-M73)。

(15)一種抗體，包含(8)之重鏈及(10)之輕鏈(FV3-M73)。

(16)一種抗體，具與(1)~(15)任一抗體同等活性。

在此「具同等活性」，意指對於抗原之結合活性及/或中和活性為同等。本發明中，同等活性不必要為相同活性，例如指具50%以上之活性，較佳為70%以上之活性，更佳為90%以上之活性。

再者，本發明提供以下之(i)~(xxii)任一CDR或FR。

(i)具序列識別號：84之胺基酸序列之重鏈FR1(VH5之重鏈FR1)

(ii)具序列識別號：186之胺基酸序列之重鏈FR1(VH3、VH4之重鏈FR1)

(iii)具序列識別號：85之胺基酸序列之重鏈FR2(VH3、VH4、VH5之重鏈FR2)

(iv)具序列識別號：184之胺基酸序列之重鏈FR3(VH3、VH4、VH5之重鏈FR3)

(v)具序列識別號：133之胺基酸序列之重鏈FR4(VH3、VH4、VH5之重鏈FR4)

(vi)具序列識別號：92之胺基酸序列之輕鏈FR1(VL1、VL3、VL5之輕鏈FR1)

(vii)具序列識別號：93之胺基酸序列之輕鏈FR2(VL1、VL3、VL5之輕鏈FR2)

(viii)具序列識別號：97之胺基酸序列之輕鏈FR3(VL1、VL3、VL5之輕鏈FR3)

(ix)具序列識別號：98之胺基酸序列之輕鏈FR4(VL1、VL3、VL5之輕鏈FR4)

(x)具序列識別號：169之胺基酸序列之重鏈CDR1(VH3、VH4之重鏈CDR1)

(xi)具序列識別號：165之胺基酸序列之重鏈CDR1(VH5之重鏈CDR1)

(xii)具序列識別號：170之胺基酸序列之重鏈CDR2(VH3之重鏈CDR2)

(xiii)具序列識別號：174之胺基酸序列之重鏈CDR2(VH4之重鏈CDR2)

(xiv)具序列識別號：166之胺基酸序列之重鏈CDR2(VH5之重鏈CDR2)

(xv)具序列識別號：171之胺基酸序列之重鏈CDR3(VH3、VH4之重鏈CDR3)

(xvi)具序列識別號：167之胺基酸序列之重鏈CDR3(VH5之重鏈CDR3)

(xvii)具序列識別號：175之胺基酸序列之輕鏈CDR1(VL1之輕鏈CDR1)

(xviii)具序列識別號：172之胺基酸序列之輕鏈CDR1(VL3之輕鏈CDR1)

(xix)具序列識別號：101之胺基酸序列之輕鏈CDR1(VL5之輕鏈CDR1)

(xx)具序列識別號：173之胺基酸序列之輕鏈CDR2(VL1、VL3之輕鏈CDR2)

(xxi)具序列識別號：168之胺基酸序列之輕鏈CDR2(VL5之輕鏈CDR2)

(xxii)具序列識別號：79之胺基酸序列之輕鏈CDR3(VL1、VL3、VL5之輕鏈CDR3)

又，本發明之抗體，尚包含將含上述任一胺基酸置換之抗體之片段或其修飾物。例如，抗體之片段，例如Fab、F(ab’)2、Fv或H鏈及L鏈之Fv以適當連結子連結成之單鏈Fv(scFv)、H鏈單獨結構域或L鏈單獨結構域(例如，Nat Biotechnol.2005 Sep；23(9)：1126-36.)、Unibody(WO2007059782 A1)、SMIP(WO2007014278 A2)。又，抗體之由來不特別限定，例如：人類抗體、小鼠抗體、大鼠抗體、兔抗體等。又，本發明之抗體，可為嵌合抗體、人類化抗體、完全人類化抗體等。

具體而言，將抗體以酵素例如，木瓜酵素、胰蛋白酶處理並生成抗體片段，或建構編碼該等抗體片段之基因並將該等導入於表現載體後，於適當寄主細胞使表現(參考例 如，Co、M.S.et al.、J.Immunol.(1994)152、2968-2976、Better、M.& Horwitz、A.H.Methods in Enzymology(1989)178、476-496、Pluckthun、A.& Skerra、A.Methods in Enzymology(1989)178、497-515、Lamoyi、E.、Methods in Enzymology(1989)121、652-663、Rousseaux、J.et al.、Methods in Enzymology(1989)121、663-66、Bird、R.E.et al.、TIBTECH(1991)9、132-137)。

scFv可藉由將抗體之H鏈V區域與L鏈V區域連結得到。該scFv中，H鏈V區域與L鏈V區域經由連結子較佳為經由胜肽連結子連結(Huston、J.S.et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85、5879-5883)。scFv之中，H鏈V區域及L鏈V區域，可為上述記載為抗體者任一者由來的。將V區域連結之胜肽連結子，可使用例如胺基酸12-19殘基所構成之任意單鏈胜肽。

<抗體固定區域>

本發明尚提供以下(i)~(xxi)任一之胺基酸經置換、改良之抗體固定區域。固定區域意指IgG1、IgG2、IgG4型之固定區域。人類IgG1固定區域、人類IgG2固定區域及人類IgG4固定區域之胺基酸序列為公知(人類IgG1固定區域：序列識別號：19、人類IgG2固定區域：序列識別號：20、人類IgG4固定區域：序列識別號：21)。又，人類IgG4固定區域，係導入有用於改善鉸鏈部分安定性之改變(Mol Immunol.1993 Jan；30(1)：105-8.)的序列。再者，本發明提供包含該胺基酸經置換之抗體固定區域的抗體。抗體固 定區域較佳為人類抗體固定區域。

又，本發明之胺基酸經置換之抗體固定區域，只要包含下述(i)~(xxi)任一之胺基酸置換，則亦可含其他胺基酸置換或修飾。因此、本發明中，當從序列識別號：20之胺基酸序列對於已經1或多數胺基酸置換及/或修飾之IgG2固定區域進行本發明之胺基酸置換時，或進行本發明之胺基酸置換後進行1或多數之胺基酸置換及/或修飾時，具序列識別號：20之胺基酸序列之IgG2固定區域，相當於本發明之經胺基酸置換之IgG2固定區域。關於具序列識別號：19之胺基酸序列之IgG1固定區域、序列識別號：21之IgG4固定區域，亦同。

又，EU編號(參考Sequences of proteins of immunological interest、NIH Publication No.91-3242)之297號之糖鏈可為任何糖鏈構造，又亦可不結合糖鏈(例如以大腸菌等未加成糖鏈之寄主細胞生產之固定區域等)。

(i)IgG2固定區域於酸性之安定性改善

本發明之胺基酸經置換之IgG2固定區域之一態樣，例如具序列識別號：20之胺基酸序列之IgG2固定區域中，276號(EU編號之397號)之Met被置換為其他胺基酸之IgG2固定區域。置換後之胺基酸不特別限定，置換為Val較佳。序列識別號：20之胺基酸序列中，將276號(EU編號之397號)之Met置換為其他胺基酸，能使抗體於酸性條件化之安定性提高。

(ii)IgG2固定區域之異質性之改善

又，本發明之胺基酸經置換之IgG2固定區域之一態樣，例如：具序列識別號：20之胺基酸序列之IgG2固定區域中，14號(EU編號131號)之Cys、16號(EU編號之133號)之Arg、及102號(EU編號之219號)之Cys被置換為其他胺基酸之IgG2固定區域。置換後之胺基酸不特別限定，14號(EU編號131號)之Cys置換為Ser較佳、16號(EU編號之133號)之Arg置換為Lys較佳、102號(EU編號之219號)之Cys置換為Ser較佳(IgG2-SKSC)。

藉由該等置換，能使IgG2鉸鏈區域由來之異質性減低。本發明之胺基酸經置換之IgG2固定區域，包含上述3種胺基酸置換之中至少1種胺基酸經置換之IgG2固定區域，但14號之Cys及102號之Cys置換為其他胺基酸，或上述3種所有之胺基酸經置換較佳。

(iii)IgG2固定區域對於FcγR之結合減低

又，本發明之胺基酸經置換之IgG2固定區域之一態樣，提供具序列識別號：20之胺基酸序列之IgG2固定區域中，209號(EU330)之Ala置換為Ser、210號(EU331)之Pro置換為Ser，及/或218號(EU339)之Thr置換為Ala後之IgG2固定區域。209號(EU330)之Ala、210號(EU331)之Pro置換，能使對於Fcγ受體之結合降低之事，已有人報告(Eur J Immunol.1999 Aug；29(8)：2613-24.)，但是由於此改變會出現能成為T細胞抗原決定基之非人類由來之胜肽，因此從免疫原性風險之觀點不宜。而，藉由同時進行將218號(EU339)之Thr置換為Ala，能僅直接使用人 類由來之胜肽作為成為T細胞抗原決定基之9~12胺基酸，使IgG2對於Fcγ受體之結合減低。

本發明之胺基酸經置換之IgG2固定區域，只要為上述3處之胺基酸置換之中至少1處之胺基酸經置換即可，但較佳為上述3處所有之胺基酸經置換。因此，本發明之胺基酸經置換之IgG2固定區域之較佳態樣，例如：具序列識別號：20之胺基酸序列之IgG2固定區域中，209號(EU330)之Ala置換為Ser，210號(EU331)之Pro置換為Ser，且218號(EU339)之Thr置換為Ala後之IgG2固定區域。

(iv)IgG2固定區域之C末端異質性之改善

本發明提供IgG2固定區域，具序列識別號：20之胺基酸序列之IgG2固定區域中，325號(EU編號之446號)之Gly及326號(EU編號之447號)之Lys欠缺。藉由使該等胺基酸兩方欠缺，首度能使抗體之H鏈C末端由來之異質性減低。

(v)IgG2固定區域之改變所致血漿中滯留性之提升

又，本發明之胺基酸經置換之IgG2固定區域之一態樣，例如具序列識別號：20之胺基酸序列之IgG2固定區域中，147號(EU編號之268號)之His、234號(EU編號之355號)之Arg、298號(EU編號之419號)之Gln置換為其他胺基酸後之IgG2固定區域。藉由該等胺基酸置換，能使抗體之血漿中滯留性提升。置換後之胺基酸不特別限定，147號(EU編號268號)之His置換為Gln較佳、234號(EU編號之355號)之Arg置換為Gln較佳、298號(EU編號之 419號)之Gln置換為Glu較佳。本發明之胺基酸經置換之IgG2固定區域，包含上述3種胺基酸置換之中至少1種胺基酸經置換之IgG2固定區域，但上述3種所有之胺基酸經置換較佳。

(vi)IgG4固定區域於酸性之安定性改善

本發明提供IgG4固定區域，具序列識別號：21之胺基酸序列之IgG4固定區域中，289號(EU編號409號)之Arg被置換為其他胺基酸。置換後之胺基酸不特別限定，置換為Lys較佳。序列識別號：21之胺基酸序列中，藉由使289號(EU編號之409號)之Arg置換為其他胺基酸，能使抗體於酸性條件化之安定性提升。

(vii)IgG4固定區域之C末端異質性之改善

本發明提供IgG4固定區域，具序列識別號：21之胺基酸序列之IgG4固定區域中，326號(EU編號之446號)之Gly及327號(EU編號之447號)之Lys欠缺。藉由使該等胺基酸兩方欠缺，首度能使抗體之H鏈C末端由來之異質性減低。

(viii)IgG1固定區域之C末端異質性之改善

本發明提供IgG1固定區域，具序列識別號：19之胺基酸序列之IgG1固定區域中，329號(EU編號之446號)之Gly及330號(EU編號之447號)之Lys欠缺。藉由使該等胺基酸兩方欠缺，能首度使抗體之H鏈C末端由來之異質性。

(ix)

本發明提供IgG1固定區域，具序列識別號：19之胺基酸序列之IgG1固定區域中，317號(EU編號之434號)之Asn被置換為其他胺基酸之胺基酸序列。

置換後之胺基酸不特別限定，置換為Ala較佳。

(x)

本發明提供IgG2固定區域，具序列識別號：20之胺基酸序列中，209號(EU編號330號)之Ala、210號(EU編號331號)之Pro、218號(EU編號339號)之Thr、276號(EU編號397號)之Met、14號(EU編號131號)之Cys、16號(EU編號133號)之Arg、102號(EU編號219號)之Cys、20號(EU編號137號)之Glu及21號(EU編號138號)之Ser被置換為其他胺基酸之胺基酸序列。

置換後之胺基酸不特別限定，209號之Ala置換為Ser、210號之Pro置換為Ser、218號之Thr置換為Ala、276號之Met置換為Val、14號之Cys置換為Ser、16號之Arg置換為Lys、102號之Cys置換為Ser、20號之Glu置換為Gly、21號之Ser置換為Gly較佳。

(xi)

本發明提供IgG2固定區域，具序列識別號：20之胺基酸序列中，209號(EU編號330號)之Ala、210號(EU編號331號)之Pro、218號(EU編號339號)之Thr、276號(EU編號397號)之Met、14號(EU編號131號)之Cys、16號(EU編號133號)之Arg、102號(EU編號219號)之Cys、20號(EU編號137號)之Glu及21號(EU編號138號)之Ser 置換為其他胺基酸、且325號(EU編號446號)之Gly及326號(EU編號447號)之Lys欠缺之胺基酸序列。

置換後之胺基酸不特別限定，209號之Ala置換為Ser、210號之Pro置換為Ser、218號之Thr置換為Ala、276號之Met置換為Val、14號之Cys置換為Ser、16號之Arg置換為Lys、102號之Cys置換為Ser、20號之Glu置換為Gly、21號之Ser置換為Gly較佳。

(xii)

本發明提供IgG2固定區域，具序列識別號：20之胺基酸序列中，276號(EU編號397號)之Met、14號(EU編號131號)之Cys、16號(EU編號133號)之Arg、102號(EU編號219號)之Cys、20號(EU編號137號)之Glu及21號(EU編號138號)之Ser被置換為其他胺基酸之胺基酸序列。

置換後之胺基酸不特別限定，276號之Met置換為Val、14號之Cys置換為Ser、16號之Arg置換為Lys、102號之Cys置換為Ser、20號之Glu置換為Gly、21號之Ser置換為Gly較佳。

(xiii)

本發明提供IgG2固定區域，具序列識別號：20之胺基酸序列中，276號(EU編號397號)之Met、14號(EU編號131號)之Cys、16號(EU編號133號)之Arg、102號(EU編號219號)之Cys、20號(EU編號137號)之Glu及21號(EU編號138號)之Ser置換為其他胺基酸、且325號(EU編號446號)之Gly及326號(EU編號447號)之Lys欠缺 之胺基酸序列。

置換後之胺基酸不特別限定，276號之Met置換為Val、14號之Cys置換為Ser、16號之Arg置換為Lys、102號之Cys置換為Ser、20號之Glu置換為Gly、21號之Ser置換為Gly較佳。

(xiv)

本發明提供IgG2固定區域，具序列識別號：20之胺基酸序列中，14號(EU編號131號)之Cys、16號(EU編號133號)之Arg、102號(EU編號219號)之Cys、20號(EU編號137號)之Glu、21號(EU編號138號)之Ser、147號(EU編號268號)之His、234號(EU編號355號)之Arg及298號(EU編號419號)之Gln置換為其他胺基酸、且325號(EU編號446號)之Gly及326號(EU編號447號)之Lys欠缺之胺基酸序列。

置換後之胺基酸不特別限定，14號之Cys置換為Ser、16號之Arg置換為Lys、102號之Cys置換為Ser、20號之Glu置換為Gly、21號之Ser置換為Gly、147號之His置換為Gln、234號之Arg置換為Gln、298號之Gln置換為Glu較佳。

(xv)

本發明提供IgG2固定區域，具序列識別號：20之胺基酸序列中，14號(EU編號131號)之Cys、16號(EU編號133號)之Arg、102號(EU編號219號)之Cys、20號(EU編號137號)之Glu、21號(EU編號138號)之Ser、147號 (EU編號268號)之His、234號(EU編號355號)之Arg、298號(EU編號419號)之Gln、及313號(EU編號434號)之Asn置換為其他胺基酸、且325號(EU編號446號)之Gly及326號(EU編號447號)之Lys欠缺之胺基酸序列。

置換後之胺基酸不特別限定，14號之Cys置換為Ser、16號之Arg置換為Lys、102號之Cys置換為Ser、20號之Glu置換為Gly、21號之Ser置換為Gly、147號之His置換為Gln、234號之Arg置換為Gln、298號之Gln置換為Glu、313號之Asn置換為Ala較佳。

(xvi)

本發明提供IgG4固定區域，具序列識別號：21之胺基酸序列中，289號(EU編號409號)之Arg、14號之Cys、16號之Arg、20號之Glu、21號之Ser、97號之Arg、100號之Ser、102號之Tyr、103號之Gly、104號之Pro及105號之Pro(EU編號131、133、137、138、214、217、219、220、221、222號)、113號之Glu、114號之Phe及115號(EU編號233、234、235號)之Leu置換為其他胺基酸、且116號(EU編號236號)之Gly欠缺之胺基酸序列。

置換後之胺基酸不特別限定，14號(EU編號131)之Cys置換為Ser、16號(EU編號133)之Arg置換為Lys、20號(EU編號137)之Glu置換為Gly、21號(EU編號138)之Ser置換為Gly、97號(EU編號214)之Arg置換為Thr、100號(EU編號217)之Ser置換為Arg、102號(EU編號219)之Tyr置換為Ser、103號(EU編號220)之Gly置換為Cys、 104號(EU編號221)之Pro置換為Val、105號(EU編號222)之Pro置換為Glu、113號(EU編號233)之Glu置換為Pro、114號(EU編號234)之Phe置換為Val、115號(EU編號235)之Leu置換為Ala、289號(EU編號409)之Arg置換為Lys較佳。

(xvii)

本發明提供IgG4固定區域，具序列識別號：21之胺基酸序列中，289號(EU編號409號)之Arg、14號之Cys、16號之Arg、20號之Glu、21號之Ser、97號之Arg、100號之Ser、102號之Tyr、103號之Gly、104號之Pro及105號之Pro(EU編號131、133、137、138、214、217、219、220、221、222號)、113號之Glu、114號之Phe及115號之Leu(EU編號233、234、235號)置換為其他胺基酸、且116號(EU編號236號)之Gly、326號(EU編號446號)之Gly及327號(EU編號447號)之Lys欠缺之胺基酸序列。

置換後之胺基酸不特別限定，14號(EU編號131)之Cys置換為Ser、16號(EU編號133)之Arg置換為Lys、20號(EU編號137)之Glu置換為Gly、21號(EU編號138)之Ser置換為Gly、97號(EU編號214)之Arg置換為Thr、100號(EU編號217)之Ser置換為Arg、102號(EU編號219)之Tyr置換為Ser、103號(EU編號220)之Gly置換為Cys、104號(EU編號221)之Pro置換為Val、105號(EU編號222)之Pro置換為Glu、113號(EU編號233)之Glu置換為Pro、114號(EU編號234)之Phe置換為Val、115號(EU編號235) 之Leu置換為Ala、289號(EU編號409)之Arg置換為Lys較佳。

(xviii)

本發明提供IgG1固定區域，具序列識別號：19之胺基酸序列之IgG1固定區域中，317號(EU編號之434號)之Asn置換為其他胺基酸、且329號(EU編號之446號)之Gly及330號(EU編號之447號)之Lys欠缺之胺基酸序列。

317號(EU編號之434號)之Asn置換後之胺基酸不特別限定，置換為Ala較佳。

(xix)

再者本發明就鉸鏈區域之異質性改善，及/或對於Fcγ受體之結合活性減低之IgG2之較佳態樣，舉以下之IgG2。

一種抗體，係具序列識別號：20之胺基酸序列所構成之固定區域之IgG2中，209號之Ala、210號之Pro、218號之Thr、14號之Cys、16號之Arg、102號之Cys、20號Glu、21號之Ser被置換為其他胺基酸。

置換後之胺基酸不特別限定，209號(EU編號330)之Ala置換為Ser、210號(EU編號331)之Pro置換為Ser、218號(EU編號339)之Thr置換為Ala、14號(EU編號131)之Cys置換為Ser、16號(EU編號133)之Arg置換為Lys、102號(EU編號219)之Cys置換為Ser、20號(EU編號137)之Glu置換為Gly、21號(EU編號138)之Ser置換為Gly較佳。

如此種IgG2固定區域之例，例具序列識別號：191(M86) 之胺基酸序列之IgG2固定區域。

又，本發明之IgG2固定區域之其他較佳態樣，例如於上述IgG2固定區域中，為使C末端異質性減低，進一步使325號之Gly及326號之Lys欠缺之IgG2固定區域。此種抗體之例，例如：具序列識別號：192(M86△GK)之胺基酸序列所構成之固定區域之IgG2。

(xx)

再者，本發明就鉸鏈區域之異質性改善之IgG2固定區域之較佳態樣，例以下之IgG2固定區域。

具序列識別號：20之胺基酸序列之IgG2固定區域中，14號之Cys、16號之Arg、102號之Cys、20號之Glu、21號之Ser被置換為其他胺基酸之IgG2固定區域。

置換後之胺基酸不特別限定，14號(EU編號131)之Cys置換為Ser、16號(EU編號133)之Arg置換為Lys、102號(EU編號219)之Cys置換為Ser、20號(EU編號137)之Glu置換為Gly、21號之(EU編號138)之Ser置換為Gly較佳。

如此之IgG2固定區域之例，可舉具序列識別號：193(M40)之胺基酸序列之IgG2固定區域為例。

又，本發明之IgG2固定區域之其他較佳態樣，可舉例如上述IgG2固定區域中，尚使325號之Gly及326號之Lys欠缺之IgG2固定區域。如此之抗體之例，可舉例如具序列識別號：194(M40△GK)之胺基酸序列之IgG2固定區域。

(xxi)M14△GK、M17△GK、M11△GK、M31△GK、M58、M73、 M83、M86△GK、M40△GK

本發明尚提供具序列識別號：24之胺基酸序列之抗體固定區域(M14△GK)。再者，本發明提供具序列識別號：116之胺基酸序列之抗體固定區域(M17△GK)。再者，本發明提供具序列識別號：25之胺基酸序列之抗體固定區域(M11△GK)。再者，本發明提供具序列識別號：118之胺基酸序列之固定區域(M31△GK)。再者本發明提供序列識別號：151之胺基酸序列之固定區域(M58)。再者，本發明提供具序列識別號：153之胺基酸序列之固定區域(M73)。 再者，本發明提供具序列識別號：164之胺基酸序列之固定區域(M83)。再者，本發明提供具序列識別號：192之胺基酸序列之固定區域(M86△GK)。再者，本發明提供具序列識別號：194之胺基酸序列之固定區域(M40△GK)。 該等抗體固定區域，為具有對於Fcγ受體之結合活性降低、免疫原性風險減低、於酸性條件下之安定性提升、異質性減低、血漿中滯留性提升及/或與IgG1固定區域比較之製劑中之高安定性的性質的經最適化抗體固定區域。

本發明提供包含上述(i)~(xxi)任一抗體固定區域之抗體。只要具上述抗體固定區域，不限抗原種類、抗體由來等，可為任意抗體。較佳抗體之例，例如與IL-6受體結合之抗體。又，其他之較佳抗體之例，例如人類化抗體。如此之抗體例，例如具人類化PM1抗體可變區域的抗體。人類化PM1抗體可變區域可經上述胺基酸置換，亦可進行其他胺基酸之置換、缺失、加成及/或插入。具體置換例， 例如使上述(a)~(y)之親和性提升之改變、(i)~(viii)之使等電點降低之改變、後述(α)~(ζ)之使安定性提升之改變、使免疫原性降低之改變，但不限於該等。

如此之抗體之一態樣，例如抗體(PF1)，具序列識別號：113所記載(PF_1+M14△GK)之胺基酸序列之重鏈可變區域、及具序列識別號：23所記載(PF1_L)之胺基酸序列之輕鏈可變區域(輕鏈固定區域可為kappa亦可為1amda亦可為此等之改變體)，但不限於此等。

又，包含上述抗體固定區域及/或上述抗體固定區域之抗體分子，可結合於類抗體結合分子(scaffold分子)、生理活性胜肽、結合胜肽等成為Fc融合分子。

本發明之抗體，除了實施例之方法以外，亦可例如以下方式取得。取得本發明抗體之一態樣中，首先將擇自於該技術領域中具通常知識者公知之抗IL-6受體抗體之CDR區域、FR區域、及固定區域所構成之群中至少1個區域中，1或多數胺基酸殘基置換為目的之其他胺基酸。該技術領域中具通常知識者公知之抗IL-6受體抗體之取得方法不限制。將擇自於CDR區域、FR區域、及固定區域所構成之群中至少1個區域中，1或多數胺基酸殘基置換為目的之其他胺基酸之方法，例如，點專一性變異誘發法(Hashimoto-Gotoh、T、Mizuno、T、Ogasahara、Y、and Nakagawa、M.(1995)An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis.Gene 152、271-275、Zoller、MJ、and Smith、 M.(1983)Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors.Methods Enzymol.100、468-500、Kramer,W、Drutsa,V、Jansen,HW、Kramer,B、Pflugfelder,M、and Fritz,HJ(1984)The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction.Nucleic Acids Res.12、9441-9456、Kramer W、and Fritz HJ(1987)Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods.Enzymol.154、350-367、Kunkel,TA(1985)Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U S A.82、488-492)。使用該方法，可將抗體之所望胺基酸置換為目的之其他胺基酸。置換為其他胺基酸之方法，可藉由使用框架曳步(shuffling)(Mol Immunol.2007 Apr；44(11)：3049-60)及CDR修補(US2006/0122377)等庫技術，對於適當框架及CDR進行胺基酸置換。

為了取得抗體之其他態樣，首先可利用該技術領域中具通常知識者周知之方法，得到與IL-6受體結合之抗體。 取得之抗體若是非人類動物抗體，可將之人類化。其次，利用該技術領域中具通常知識者周知之方法判定取得之抗體是否具中和活性。抗體之結合活性或中和活性，可利用例如實施例之方法測定，但不限此方法。接著，將擇自於抗體之CDR區域、FR區域、及固定區域所構成之群中至少1個區域中之1或多數胺基酸殘基，置換為目的之其他胺 基酸。

更具體而言，本發明係關於包含以下(a)及(b)之步驟，中和活性增強、結合活性增強、安定性提升、或免疫原性降低之抗體之製造方法。

(a)使編碼為擇自於CDR區域、FR區域、及固定區域所構成之群中至少1個區域中之1或多數胺基酸殘基置換為目的之其他胺基酸後之H鏈的DNA，使編碼為擇自於及CDR區域及FR區域所構成之群中至少1個區域中之1或多數胺基酸殘基置換為目的之其他胺基酸後之L鏈的DNA表現。

(b)將步驟(a)表現產物回收

本發明之製造方法中，首先使編碼為抗IL-6受體抗體之變異體之H鏈的DNA，即擇自於CDR區域、FR區域、及固定區域所構成之群中至少1個區域中之1或多數胺基酸殘基置換為目的之其他胺基酸後之H鏈之DNA，以及編碼為抗IL-6受體抗體之L鏈之DNA，即編碼為擇自於CDR區域及FR區域所構成之群中至少1個區域中之1或多數胺基酸殘基置換為目的之其他胺基酸後之L鏈的DNA表現。編碼為擇自於CDR區域、FR區域及固定區域所構成之群中至少1個區域中之1或多數胺基酸殘基置換為目的之其他胺基酸後之H鏈的DNA，例如可取得編碼為野生型H鏈之DNA之CDR區域、FR區域、或固定區域部分，並將編碼為擇自於該CDR區域、FR區域、及固定區域所構成之群中至少1個區域中之特定胺基酸的密碼子置換為目的之其他胺基酸的方式，導入適當置換而得。又，編碼為擇自於CDR區域 及FR區域所構成之群中至少1個區域中之1或多數胺基酸殘基置換為目的之其他胺基酸後之L鏈的DNA，可例如取得編碼為野生型L鏈之DNA之CDR區域及/或FR區域，並將編碼為該CDR區域、FR區域中之特定胺基酸的密碼子置換為目的之其他胺基酸之方式導入適當置換而得。

又，可預先設計編碼為擇自於野生型H鏈之CDR區域、FR區域、及固定區域所構成之群中至少1個區域中之1或多數胺基酸殘基置換為目的之其他胺基酸後之蛋白質的DNA，將該DNA以化學合成，藉此得到編碼為擇自於CDR區域、FR區域、及固定區域所構成之群中至少1個區域中之1或多數胺基酸殘基置換為目的之其他胺基酸後之H鏈的DNA。又，關於L鏈，亦能設計編碼為野生型L鏈之CDR區域及/或FR區域之1或多數之胺基酸殘基置換為目的之其他胺基酸後之蛋白質的DNA，將該DNA化學合成，藉此得到編碼為CDR區域及/或FR區域之1或多數胺基酸殘基置換為目的之其他胺基酸後之L鏈的DNA。

胺基酸置換之種類，不限定於此等，例如本說明書之置換。

又，編碼為擇自於CDR區域、FR區域、及固定區域所構成之群中至少1個區域中1或多數胺基酸殘基置換為目的之其他胺基酸後之H鏈的DNA，可分成部分DNA製造。 部分DNA之組合，例如編碼為可變區域之DNA及編碼為固定區域之DNA，或編碼為Fab區域之DNA及編碼為Fc區域之DNA等，但不限於該等組合。編碼為L鏈之DNA也可同 樣地分成部分DNA製造。

使上述DNA表現之方法，例如以下方法。例如，將編碼為H鏈可變區域之DNA，與編碼為H鏈固定區域之DNA同時嵌入表現載體，構建H鏈表現載體。同樣地，將編碼為L鏈可變區域之DNA，與編碼為L鏈固定區域之DNA同時嵌入表現載體，構建L鏈表現載體。該等H鏈、L鏈之基因亦可嵌入單一載體。表現載體例如可使用SV40病毒系載體、EB病毒系載體、BPV(乳頭狀瘤病毒)系載體等，但不限於該等。

利用以上方法製作之抗體表現載體，將寄主細胞共轉形。寄主細胞除了CHO細胞(中國倉鼠卵巢)等上述細胞以外，亦可使用大腸菌、酵母或枯草菌等微生物或動植物個體(Nature Biotechnology 25、563-565(2007)、Nature Biotechnology 16、773-777(1998)、Biochemical and Biophysical Research Communications 255、444-450(1999)、Nature Biotechnology 23、1159-1169(2005)、Journal of Virology 75、2803-2809(2001)、Biochemical and Biophysical Research Communications 308、94-100(2003))。又，轉形可適當使用脂質轉染法(R.W.Malone et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,6077(1989)、P.L.Felgner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,7413(1987)、電穿孔法、磷酸鈣法(F.L.Graham & A.J.van der Eb,Virology 52,456-467(1973))、DEAE-葡聚糖法等。

抗體之製造中，其次將步驟(a)得到之表現產物回收。 表現產物之回收，例如可培養轉形體後，從轉形體之細胞內或培養液分離以進行。抗體之分離、精製，可將離心分離、硫安區分、鹽析、超過濾、1q、FcRn、Protein A、Protein G管柱、親和性層析、離子交換層析、凝膠過濾層析等方法適當組合以進行。

又，本發明之固定區域，若為該技術領域中具通常知識者，可依照抗體之取得方法適當進行。

再者，本發明係關於包含以下(A)~(X)所構成之群中至少1個步驟，增強抗IL-6受體抗體對於IL-6受體之結合活性或中和活性之方法。

(A)將序列識別號：1之胺基酸序列(HCDR1)中，1號之Ser置換為其他胺基酸

(B)將序列識別號：1之胺基酸序列(HCDR1)中，5號之Trp置換為其他胺基酸

(C)將序列識別號：2之胺基酸序列(HCDR2)中，1號之Tyr置換為其他胺基酸

(D)將序列識別號：2之胺基酸序列(HCDR2)中，8號之Thr置換為其他胺基酸

(E)將序列識別號：2之胺基酸序列(HCDR2)中，9號之Thr置換為其他胺基酸

(F)將序列識別號：3之胺基酸序列(HCDR3)中，1號之Ser置換為其他胺基酸

(G)將序列識別號：3之胺基酸序列(HCDR3)中，2號之Leu置換為其他胺基酸

(H)將序列識別號：3之胺基酸序列(HCDR3)中，5號之Thr置換為其他胺基酸

(I)將序列識別號：3之胺基酸序列(HCDR3)中，7號之Ala置換為其他胺基酸

(J)將序列識別號：3之胺基酸序列(HCDR3)中，8號之Met置換為其他胺基酸

(K)將序列識別號：3之胺基酸序列(HCDR3)中，1號之Ser及5號之Thr置換為其他胺基酸

(L)將序列識別號：3之胺基酸序列(HCDR3)中，2號之Leu、7號之Ala及8號之Met置換為其他胺基酸

(M)將序列識別號：4之胺基酸序列(LCDR1)中，1號之Arg置換為其他胺基酸

(N)將序列識別號：4之胺基酸序列(LCDR1)中，4號之Gln置換為其他胺基酸

(O)將序列識別號：4之胺基酸序列(LCDR1)中，9號之Tyr置換為其他胺基酸

(P)將序列識別號：4之胺基酸序列(LCDR1)中，11號之Asn置換為其他胺基酸

(Q)將序列識別號：5之胺基酸序列(LCDR2)中，2號之Thr置換為其他胺基酸

(R)將序列識別號：6之胺基酸序列(LCDR3)中，1號之Gln置換為其他胺基酸

(S)將序列識別號：6之胺基酸序列(LCDR3)中，3號之Gly置換為其他胺基酸

(T)將序列識別號：4之胺基酸序列(LCDR1)中，9號之Tyr置換為其他胺基酸

及序列識別號：6之胺基酸序列(LCDR3)中，3號之Gly置換為其他胺基酸

(U)將序列識別號：6之胺基酸序列(LCDR3)中，5號之Thr置換為其他胺基酸

(V)將序列識別號：6之胺基酸序列(LCDR3)中，1號之Gln及5號之Thr置換為其他胺基酸

(W)將序列識別號：2之胺基酸序列(HCDR2)中，9號之Thr置換為其他胺基酸

及序列識別號：3之胺基酸序列(HCDR3)中，1號之Ser及5號之Thr置換為其他胺基酸

(X)(V)及(W)之步驟。

上述(A)中，置換後之胺基酸只要親和性提升則不特別限定，但置換為Trp、Thr、或Asp、Asn、Arg、Val、Phe、Ala、Gln、Tyr、Leu、His、Glu或Cys較佳。

上述(B)中，置換後之胺基酸只要親和性提升則不特別限定，但置換為Ile或Val較佳。

上述(C)中，置換後之胺基酸只要親和性提升則不特別限定，但置換為Phe較佳。

上述(D)中，置換後之胺基酸只要親和性提升則不特別限定，但置換為Arg較佳。

上述(E)中，置換後之胺基酸只要親和性提升則不特別限定，但置換為Ser或Asn較佳。

上述(F)中，置換後之胺基酸只要親和性提升則不特別限定，但置換為Ile、Val、Thr或Leu較佳。

上述(G)中，置換後之胺基酸只要親和性提升則不特別限定，但置換為Thr較佳。

上述(H)中，置換後之胺基酸只要親和性提升則不特別限定，但置換為Ala、Ile或Ser較佳。其他之較佳置換，例如5號之Thr置換為Ser。

上述(I)中，置換後之胺基酸只要親和性提升則不特別限定，但置換為Ser或Val較佳。

上述(J)中，置換後之胺基酸只要親和性提升則不特別限定，但置換為Leu較佳。

上述(K)中，置換後之胺基酸只要親和性提升則不特別限定，1號之Ser置換為Leu、5號之Thr置換為Ala較佳。 又，其他之較佳置換，例如：1號之Ser置換為Val及5號之Thr置換為Ala、1號之Ser置換為Ile及5號之Thr置換為Ala、1號之Ser置換為Thr及5號之Thr置換為Ala、1號之Ser置換為Val及5號之Thr置換為Ile、1號之Ser置換為Ile及5號之Thr置換為Ile、1號之Ser置換為Thr及5號之Thr置換為Ile、或1號之Ser置換為Leu及5號之Thr置換為Ile。

上述(L)中，置換後之胺基酸只要親和性提升則不特別限定，2號之Leu置換為Thr、7號之Ala置換為Val、8號之Met置換為Leu較佳。

上述(M)中，置換後之胺基酸只要親和性提升則不特別 限定，置換為Phe較佳。

上述(N)中，置換後之胺基酸只要親和性提升則不特別限定，置換為Arg或Thr較佳。

上述(O)中，置換後之胺基酸只要親和性提升則不特別限定，置換為Phe較佳。

上述(P)中，置換後之胺基酸只要親和性提升則不特別限定，置換為Ser較佳。

上述(Q)中，置換後之胺基酸只要親和性提升則不特別限定，置換為Gly較佳。

上述(R)中，置換後之胺基酸只要親和性提升則不特別限定，置換為Gly、Asn或Ser較佳。

上述(S)中，置換後之胺基酸只要親和性提升則不特別限定，置換為Ser較佳。

上述(T)中，置換後之胺基酸只要親和性提升則不特別限定，序列識別號：4之胺基酸序列(LCDR1)之Tyr置換為Phe較佳、序列識別號：6之胺基酸序列(LCDR3)之Gly置換為Ser較佳。

上述(U)中，置換後之胺基酸只要親和性提升則不特別限定，置換為Arg或Ser較佳。

上述(V)中，置換後之胺基酸只要親和性提升則不特別限定，1號之Gln置換為Gly、5號之Thr置換為Ser較佳。 又，其他之較佳置換，例如：1號之Gln置換為Gly及5號之Thr置換為Arg。

上述(W)中，序列識別號：2之胺基酸序列(HCDR2)之9 號之Thr置換為Asn較佳。又，序列識別號：3之胺基酸序列(HCDR3)之1號之Ser及5號之Thr之置換後之胺基酸之較佳組合，例如Leu及Ala、Val及Ala、Ile及Ala、Thr及Ala、Val及Ile、Ile及Ile、Thr及Ile、或Leu及Ile。

上述(A)~(X)之步驟中，進行胺基酸置換之方法不特別限定，例如可利用上述點專一性變異誘發法或實施例之方法進行。胺基酸置換對重鏈可變區域進行時，成為置換前之基的重鏈可變區域之胺基酸序列，以人類化PM-1之重鏈可變區域之胺基酸序列較佳，胺基酸置換對輕鏈可變區域進行時，成為置換前之基的輕鏈可變區域之胺基酸序列，以人類化PM-1之輕鏈可變區域之胺基酸序列較佳。 又，上述(A)~(X)之步驟之胺基酸置換，以對於人類化PM-1抗體進行較佳。

本發明之使抗IL-6受體抗體之結合活性或中和活性增強之方法，至少含上述(A)~(X)任一步驟即可。亦即，本發明之方法，可在上述(A)~(X)任一步驟之中，含2以上步驟。再者，只要含上述(A)~(X)任一步驟，則也可含其他步驟(例如，上述(A)~(X)以外之胺基酸之置換、缺失、加成及/或插入等)。又，可對於例如，FR之胺基酸序列進行置換、缺失、加成及/或插入等，也可對於固定區域之胺基酸序列進行置換、缺失、加成及/或插入等。上述胺基酸置換，對於人類化PM-1抗體較佳。

<使抗IL-6受體抗體免疫原性風險減低之方法>

又，本發明係關於將序列識別號：5之胺基酸序列 (LCDR2)中，2號之Thr置換為Gly之步驟，使抗IL-6受體抗體之免疫原性降低之方法。本發明之使抗IL-6受體抗體之免疫原性降低之方法，只要含有將序列識別號：5之胺基酸序列(LCDR2)中，2號之Thr置換為Gly之步驟，則亦可含其他胺基酸置換。胺基酸置換之方法不特別限定，例如可利用上述點專一性變異誘發法或實施例記載之方法進行。

上述胺基酸置換，對於人類化PM-1抗體、或其改變(置換、欠缺、插入)體進行較佳。

<使抗IL-6受體抗體之等電點降低之方法>

又，本發明係關於使抗IL-6受體抗體之等電點降低之方法，包含擇自以下之(i)~(xv)所構成之群中至少1個步驟。

(i)將序列識別號：7之胺基酸序列(HFR1)中，16號之Gln置換為其他胺基酸

(ii)將序列識別號：8之胺基酸序列(HFR2)中，8號之Arg置換為其他胺基酸

(iii)將序列識別號：9之胺基酸序列(HFR3)中，16號之Arg置換為其他胺基酸

(iv)將序列識別號：10之胺基酸序列(HFR4)中，3號之Gln置換為其他胺基酸

(v)將序列識別號：11之胺基酸序列(LFR1)中，18號之Arg置換為其他胺基酸

(vi)將序列識別號：12之胺基酸序列(LFR2)中，11號之 Lys置換為其他胺基酸

(vii)將序列識別號：13之胺基酸序列(LFR3)中，23號之Gln置換為其他胺基酸

(viii)將序列識別號：14之胺基酸序列(LFR4)中，10號之Lys置換為其他胺基酸

(ix)將序列識別號：1之胺基酸序列(HCDR1)中，1號之Ser置換為其他胺基酸

(x)將序列識別號：4之胺基酸序列(LCDR1)中，1號之Arg置換為其他胺基酸

(xi)將序列識別號：5之胺基酸序列(LCDR2)中，4號之Arg置換為其他胺基酸

(xii)將序列識別號：7之胺基酸序列(HFR1)中，13號之Arg置換為其他胺基酸

(xiii)將序列識別號：2之胺基酸序列(HFR1)或序列識別號：100之胺基酸序列中，15號之Lys及/或16號之Ser置換為其他胺基酸。

(xiv)將序列識別號：4之胺基酸序列(LCDR1)或序列識別號：101之胺基酸序列中，4號之Gln置換為其他胺基酸(xv)將序列識別號：5之胺基酸序列(LCDR2)或序列識別號：103之胺基酸序列中，6號之His置換為其他胺基酸

上述(i)中，置換後之胺基酸只要等電點降低即不特別限定，但置換為Glu較佳。

上述(ii)中，置換後之胺基酸只要等電點降低即不特別限定，但置換為Glu較佳。

上述(iii)中，置換後之胺基酸只要等電點降低即不特別限定，但置換為Lys較佳。

上述(iv)中，置換後之胺基酸只要等電點降低即不特別限定，但置換為Glu較佳。

上述(v)中，置換後之胺基酸只要等電點降低即不特別限定，但置換為Ser較佳。

上述(vi)中，置換後之胺基酸只要等電點降低即不特別限定，但置換為Glu較佳。

上述(vii)中，置換後之胺基酸只要等電點降低即不特別限定，但置換為Glu較佳。

上述(viii)中，置換後之胺基酸只要等電點降低即不特別限定，但置換為Glu較佳。

上述(ix)中，置換後之胺基酸只要等電點降低即不特別限定，但置換為Asp較佳。

上述(x)中，置換後之胺基酸只要等電點降低即不特別限定，但置換為Gln較佳。

上述(xi)中，置換後之胺基酸只要等電點降低即不特別限定，但置換為Glu較佳。

上述(xii)中，置換後之胺基酸只要等電點降低即不特別限定，但置換為Lys較佳。

上述(xiii)中，置換後之胺基酸只要等電點降低即不特別限定，但15號之Lys置換為Gln、16號之Ser置換為Asp較佳。

上述(xiv)中，置換後之胺基酸只要等電點降低即不特 別限定，但置換為Glu較佳。

上述(xv)中，置換後之胺基酸只要等電點降低即不特別限定，但置換為Glu較佳。

上述(i)~(xv)步驟中，胺基酸之置換方法不特別限定，可藉例如上述點專一性變異誘發法或實施例之方法進行。胺基酸置換對重鏈可變區域進行時，成為置換前之基的重鏈可變區域之胺基酸序列，以人類化PM-1之重鏈可變區域之胺基酸序列較佳，胺基酸置換對於輕鏈可變區域進行時，成為置換前之基之輕鏈可變區域之胺基酸序列，以人類化PM-1之輕鏈可變區域之胺基酸序列較佳。又，上述(i)~(xv)步驟之胺基酸置換，對人類化PM-1抗體進行較佳。

本發明之使抗IL-6受體抗體之等電點降低之方法，至少包含上述(i)~(xv)任一步驟即可。亦即，本發明之方法，在上述(i)~(xv)之步驟之中，包含2以上步驟亦可。 再者，只要含上述(i)~(xv)任一步驟，則亦可含其他步驟(例如，上述(i)~(xv)以外之胺基酸之置換、缺失、加成及/或插入等)。又，例如可對於固定區域之胺基酸序列進行置換、缺失、加成及/或插入等。

<使抗IL-6受體抗體安定性提升之方法>

又，本發明係關於使抗IL-6受體抗體之安定性增加之方法，包含擇自於以下之(α)~(ζ)所構成之群中至少1個步驟。

(α)將序列識別號：9之胺基酸序列(HFR3)中，4號之Met 置換為其他胺基酸。

(β)將序列識別號：9之胺基酸序列(HFR3)中，5號之Leu置換為其他胺基酸。

(γ)將序列識別號：2之胺基酸序列(HCDR2)中，9號之Thr置換為其他胺基酸。

(δ)將序列識別號：6之胺基酸序列(LCDR3)中，5號之Thr置換為其他胺基酸。

(ε)將序列識別號：2之胺基酸序列(HCDR2)中，16號之Ser置換為其他胺基酸。

(ζ)將序列識別號：10之胺基酸序列(FR4)中，5號之Ser置換為其他胺基酸。

上述(α)中，置換後之胺基酸只要安定性增加即不特別限定，但置換為Ile較佳。

上述(β)中，置換後之胺基酸只要安定性增加即不特別限定，但置換為Ser較佳。

上述(γ)中，置換後之胺基酸只要安定性增加即不特別限定，但置換為Asn較佳。

上述(δ)中，置換後之胺基酸只要安定性增加即不特別限定，但置換為Ser較佳。

上述(ε)中，置換後之胺基酸只要安定性增加即不特別限定，但置換為Gly較佳。

上述(ζ)中，置換後之胺基酸只要安定性增加即不特別限定，但置換為Ile較佳。

上述(α)~(ζ)之步驟中，胺基酸之置換方法不特別 限定，例如可藉由上述點專一性變異誘發法或實施例之方法進行。胺基酸置換對於重鏈可變區域進行時，成為置換前之基的重鏈可變區域之胺基酸序列，以人類化PM-1之重鏈可變區域之胺基酸序列較佳，胺基酸置換對於輕鏈可變區域進行時，成為置換前之基的輕鏈可變區域之胺基酸序列，以人類化PM-1之輕鏈可變區域之胺基酸序列較佳。 又，上述(α)~(ζ)之胺基酸置換，對於人類化PM-1抗體進行較佳。

本發明之使抗IL-6受體抗體之安定性增加之方法，至少包含上述(α)~(ζ)任一步驟即可。亦即，本發明之方法，可包含上述(α)~(ζ)之步驟之中，2以上步驟。再者，只要包含上述(α)~(ζ)任一步驟，則亦可含其他步驟(例如，上述(α)~(ζ)以外之胺基酸之置換、缺失、加成及/或插入等)。又，例如可對於固定區域之胺基酸序列進行置換、缺失、加成及/或插入等。

<使抗IL-6受體抗體之免疫原性降低之方法>

再者，本發明係關於使抗IL-6受體抗體尤其人類化PM-1抗體之免疫原性降低之方法，包含將序列識別號：7之胺基酸序列(HFR1)中，13號之Arg置換為Lys、16號之Gln置換為Glu、23號之Thr置換為Ala、及/或30號之Thr置換為Ser之步驟。本發明之使抗IL-6受體抗體之免疫原性降低之方法，只要包含將序列識別號：7之胺基酸序列(HFR1)中，30號之Thr置換為Ser之步驟，則亦可包含其他胺基酸置換。

再者，本發明係關於使抗IL-6受體抗體尤其人類化PM-1抗體之免疫原性降低之方法，包含將序列識別號：90之胺基酸序列(HFR3)中，27號之Ala置換為Val之步驟。 本發明之使抗IL-6受體抗體之免疫原性降低之方法，只要包含將序列識別號：90之胺基酸序列(HFR3)中，27號之Ala置換為Val之步驟，則亦可包含其他胺基酸置換。

胺基酸置換方法不特別限定，可藉由例如上述點專一性變異誘發法或實施例記載之方法進行。

再者，本發明係關於使抗體之免疫原性降低之方法，使抗IL-6受體抗體尤其人類化PM-1抗體、H53/L28、或PF1抗體之FR3，為具序列識別號：128或序列識別號：129之胺基酸序列之FR3。

<使抗體於酸性條件之安定性提升之方法>

又，本發明係關於使抗體於酸性條件之安定性提升之方法，包含將序列識別號：20之胺基酸序列(IgG2)中，276號(EU編號之397號)之Met置換為其他胺基酸。本發明之使抗體於酸性條件之安定性提升之方法，只要包含將序列識別號：20之胺基酸序列(IgG2)中，276號(EU編號之397號)之Met置換為其他胺基酸，則亦可包含其他胺基酸置換。置換後之胺基酸不特別限定，置換為Val置換較佳。 胺基酸置換方法不特別限定，可藉由例如上述點專一性變異誘發法或實施例之方法進行。

成為對象之抗體不特別限定，抗人類IL-6受體抗體較佳，再者，人類化PM-1抗體、或其改變(置換、欠缺、插 入)體較佳。

<使IgG2固定區域之鉸鏈部分由來之異質性改善之方法>

又，本發明係關於包含改善抗體之異質性之方法，包含將序列識別號：20之胺基酸序列(IgG2)中，14號(EU編號131號)之Cys置換為其他胺基酸、16號(EU編號之133號)之Arg置換為其他胺基酸、及/或102號(EU編號之219號)之Cys置換為其他胺基酸。置換後之胺基酸不特別限定，14號之Cys置換為Ser、16號之Arg置換為Lys、102號之Cys置換為Ser較佳。本發明之改善抗體之異質性之方法，只要包含將序列識別號：20之胺基酸序列(IgG2)中，14號(EU編號131號)之Cys置換步驟、16號(EU編號之133號)之Arg置換步驟、及/或102號(EU編號之219號)之Cys置換步驟，則亦可包含其他胺基酸置換。胺基酸置換方法不特別限定，可藉由例如上述點專一性變異誘發法或實施例記載之方法進行。置換之胺基酸可為將上述3個胺基酸全部置換，或將1或2(例如14號與102號、等)之胺基酸置換。

成為對象之抗體不特別限定，抗人類IL-6受體抗體較佳，再者人類化PM-1抗體、或其改變(置換、欠缺、插入)體較佳。

<使IgG2固定區域之C末端胺基酸欠缺由來之異質性減低之方法>

又，本發明係關於改善抗體之異質性之方法，包含使具序列識別號：20之胺基酸序列之IgG2固定區域中，325 號(EU編號之446號)之Gly及326號(EU編號之447號)之Lys欠缺之步驟。本發明之改善抗體之異質性之方法，只要包含使具序列識別號：20之胺基酸序列之IgG2固定區域中，325號(EU編號之446號)之Gly及326號(EU編號之447號)之Lys欠缺之步驟，則亦可含其他胺基酸置換。胺基酸置換方法不特別限定，例如可藉上述點專一性變異誘發法或實施例記載之方法進行。

成為對象之抗體不特別限定，抗人類IL-6受體抗體較佳，再者人類化PM-1抗體、或其改變(置換、欠缺、插入)體較佳。

<維持著IgG2固定區域之人類序列，使對於FcγR之結合減低之方法>

又，本發明係關於使抗體對於FcγR之結合減低之方法，包含將具序列識別號：20之胺基酸序列之IgG2固定區域中，209號(EU330)之Ala置換為Ser、210號(EU331)之Pro置換為Ser、及218號(EU339)之Thr置換為Ala之步驟。本發明之使抗體對於FcγR之結合減低之方法，只要包含將具序列識別號：20之胺基酸序列之IgG2固定區域中，209號(EU330)之Ala置換為Ser、210號(EU331)之Pro置換為Ser、及218號(EU339)之Thr置換為Ala之步驟，則亦可含其他胺基酸置換。胺基酸置換方法不特別限定，可藉例如上述點專一性變異誘發法或實施例記載之方法進行。

<藉由置換IgG2固定區域之胺基酸，使血漿中滯留性提升 之方法>

又，本發明係關於使抗體之血漿中滯留性提升之方法，包含將具序列識別號：20之胺基酸序列之IgG2固定區域中，147號(EU268)之His、234號(EU355)之Arg及/或298號(EU419)之Gln置換為其他胺基酸。本發明之使血漿中滯留性提升之方法，只要含上述步驟，則亦可含其他胺基酸置換。置換後之胺基酸不特別限定，147號(EU268)之His置換為Gln、234號(EU355)之Arg置換為Gln、298號(EU419)之Gln置換為Glu較佳。

又，本發明係關於使抗體之血漿中滯留性提升之方法，包含將具序列識別號：20或序列識別號：151(M58)之胺基酸序列的IgG2固定區域中，313號(EU434)之Asn置換為其他胺基酸。置換後之胺基酸不特別限定，置換為Ala較佳。本發明之提升血漿中滯留性之方法，只要含上述步驟，則亦可含其他胺基酸置換。

成為對象之抗體不特別限定，抗人類IL-6受體抗體較佳，又人類化PM-1抗體或其改變(置換、欠缺、插入)體較佳。

又，本發明係關於包含將具序列識別號：20之胺基酸序列之IgG2固定區域中，進行下述步驟，使IgG2之鉸鏈部分由來之異質性減低之方法、使於酸性條件下之安定性提升之方法、使C末端由來之異質性減低之方法及/或使抗體對於FcγR之結合減低之方法(M14△GK)。

(a)將序列識別號：20之209號(EU編號330)之Ala置換 為Ser、(b)將序列識別號：20之210號(EU編號331)之Pro置換為Ser、(c)將序列識別號：20之218號(EU編號339)之Thr置換為Ala、(d)將序列識別號：20之276號(EU編號397)之Met置換為Val、(e)將序列識別號：20之14號(EU編號131)之Cys置換為Ser、(f)將序列識別號：20之16號(EU編號133)之Arg置換為Lys、(g)將序列識別號：20之102號(EU編號219)之Cys置換為Ser、(h)將序列識別號：20之20號(EU編號137)之Glu置換為Gly、(i)將序列識別號：20之21號(EU編號138)之Ser置換為Gly、及(j)使序列識別號：20之325號之Gly及326號之Lys(EU編號446及447)欠缺。

本發明之方法，只要含上述步驟，則亦可含其他胺基酸置換或欠缺、其他步驟。使胺基酸之置換或欠缺之方法不特別限定，可藉例如上述點專一性變異誘發法或實施例記載之方法進行。

成為對象之抗體不特別限定，抗人類IL-6受體抗體較佳，再者。人類化PM-1抗體、或其改變(置換、欠缺、插入)體較佳。

又，本發明係關於包含具序列識別號：20之胺基酸序列之IgG2固定區域中，進行下述步驟，使IgG2之鉸鏈部分由來之異質性減低之方法、使於酸性條件下之安定性提升之方法，及/或使C末端由來之異質性減低之方法(M31△GK)。

(a)將序列識別號：20之276號(EU編號397)之Met置換為Val、(b)將序列識別號：20之14號(EU編號131)之Cys置換為Ser、(c)將序列識別號：20之16號(EU編號133)之Arg置換為Lys、(d)將序列識別號：20之102號(EU編號219)之Cys置換為Ser、(e)將序列識別號：20之20號(EU編號137)之Glu置換為Gly、(f)將序列識別號：20之21號(EU編號138)之Ser置換為Gly、及(g)使序列識別號：20之325號之Gly及326號之Lys(EU編號446及447)欠缺。

又，本發明係關於包含具序列識別號：20之胺基酸序 列之IgG2固定區域中，進行下述步驟，使IgG2之鉸鏈部分由來之異質性減低之方法、使血漿中滯留性提升之方法及/或使C末端由來之異質性減低之方法(M58)。

(a)將序列識別號：20之14號(EU編號131號)之Cys置換為Ser、(b)將序列識別號：20之16號(EU編號133號)之Arg置換為Lys、(c)將序列識別號：20之102號(EU編號219號)之Cys置換為Ser、(d)將序列識別號：20之20號(EU編號137號)之Glu置換為Gly、(e)將序列識別號：20之21號(EU編號138號)之Ser置換為Gly、(f)將序列識別號：20之147號(EU編號268號)之His置換為Gln、(g)將序列識別號：20之234號(EU編號355號)之Arg置換為Gln、(h)將序列識別號：20之298號(EU編號419號)之Gln 置換為Glu、(i)使序列識別號：20之325號(EU編號446號)之Gly及326號(EU編號447號)之Lys欠缺。

又，本發明係關於包含具序列識別號：20之胺基酸序列之IgG2固定區域中，進行下述步驟，使IgG2之鉸鏈部分由來之異質性減低之方法、使血漿中滯留性提升之方法 及/或使C末端由來之異質性減低之方法(M73)。

(a)將序列識別號：20之14號(EU編號131號)之Cys置換為Ser、(b)將序列識別號：20之16號(EU編號133號)之Arg置換為Lys、(c)將序列識別號：20之102號(EU編號219號)之Cys置換為Ser、(d)將序列識別號：20之20號(EU編號137號)之Glu置換為Gly、(e)將序列識別號：20之21號(EU編號138號)之Ser置換為Gly、(f)將序列識別號：20之147號(EU編號268號)之His置換為Gln、(g)將序列識別號：20之234號(EU編號355號)之Arg置換為Gln、(h)將序列識別號：20之298號(EU編號419號)之Gln 置換為Glu、(i)將序列識別號：20之313號(EU編號434號)之Asn置換為Ala、(j)使序列識別號：20之325號(EU編號446號)之Gly及326號(EU編號447號)之Lys欠缺。

又，本發明係關於包含具序列識別號：20之胺基酸序列之IgG2固定區域中，進行下述步驟、使IgG2之鉸鏈部分由來之異質性減低之方法、使C末端由來之異質性減低 之方法及/或使抗體對於FcγR之結合減低之方法(M86△GK)。

(a)將序列識別號：20之209號(EU編號330)之Ala置換為其他胺基酸、(b)將序列識別號：20之210號(EU編號331)之Pro置換為其他胺基酸、(c)將序列識別號：20之218號(EU編號339)之Thr置換為其他胺基酸、(d)將序列識別號：20之14號(EU編號131)之Cys置換為其他胺基酸、(e)將序列識別號：20之16號(EU編號133)之Arg置換為其他胺基酸、(f)將序列識別號：20之102號(EU編號219)之Cys置換為其他胺基酸、(g)將序列識別號：20之20號(EU編號137)之Glu置換為其他胺基酸、(h)將序列識別號：20之21號(EU編號138)之Ser置換為其他胺基酸、及(i)使序列識別號：20之325號之Gly及326號之Lys(EU編號446及447)欠缺。

置換後之胺基酸不特別限定，209號(EU編號330)之Ala置換為Ser、210號(EU編號331)之Pro置換為Ser、218號(EU編號339)之Thr置換為Ala、14號(EU編號131) 之Cys置換為Ser、16號(EU編號133)之Arg置換為Lys、102號(EU編號219)之Cys置換為Ser、20號(EU編號137)之Glu置換為Gly、21號(EU編號138)之Ser置換為Gly較佳。

再者，本發明係關於包含具序列識別號：20之胺基酸序列之IgG2固定區域中，進行下述步驟、使IgG2之鉸鏈部分由來之異質性減低之方法及/或使C末端由來之異質性減低之方法(M40△GK)。

(a)將序列識別號：20之14號(EU編號131)之Cys置換為其他胺基酸、(b)將序列識別號：20之16號(EU編號133)之Arg置換為其他胺基酸、(c)將序列識別號：20之102號(EU編號219)之Cys置換為其他胺基酸、(d)將序列識別號：20之20號(EU編號137)之Glu置換為其他胺基酸、(e)將序列識別號：20之21號(EU編號138)之Ser置換為其他胺基酸、及(f)使序列識別號：20之325號之Gly及326號之Lys(EU編號446及447)欠缺。

置換後之胺基酸不特別限定，14號(EU編號131)之Cys置換為Ser、16號(EU編號133)之Arg置換為Lys、102號(EU編號219)之Cys置換為Ser、20號(EU編號137)之Glu 置換為Gly、21號(EU編號138)之Ser置換為Gly較佳。

本發明之方法，只要含上述，則亦可含其他胺基酸置換或欠缺、其他步驟。使胺基酸之置換或欠缺之方法不特別限定，可藉例如上述點專一性變異誘發法或實施例記載之方法進行。

成為對象之抗體不特別限定，抗人類IL-6受體抗體較佳，再者，人類化PM-1抗體或其改變(置換、欠缺、插入)體較佳。

<使IgG4固定區域於酸性條件之安定性提升之方法>

本發明又關於包含具序列識別號：21之胺基酸序列之IgG4固定區域(Mol Immunol.1993 Jan；30(1)：105-8.)中，289號(EU編號409號)之Arg置換為其他胺基酸，使抗體於酸性條件之安定性提升之方法。本發明之使抗體於酸性條件之安定性提升之方法，只要包含將序列識別號：21之胺基酸序列(人類IgG4固定區域)中，289號(EU編號409號)之Arg置換為其他胺基酸，則亦可含其他胺基酸置換。置換後之胺基酸不特別限定，置換為Lys較佳。胺基酸置換方法不特別限定，可藉例如上述點專一性變異誘發法或實施例記載之方法進行。

成為對象之抗體不特別限定，抗人類IL-6受體抗體較佳，再者，人類化PM-1抗體或其改變(置換、欠缺、插入)體較佳。

<使IgG4固定區域之C末端胺基酸欠缺由來之異質性減低之方法>

又，本發明係關於改善抗體之異質性之方法，包含使具序列識別號：21之胺基酸序列之IgG4固定區域(Mol Immunol.1993 Jan；30(1)：105-8.)中，326號(EU編號之446號)之Gly及327號(EU編號之447號)之Lys欠缺之步驟。本發明之改善異質性之方法，只要包含使具序列識別號：21之胺基酸序列之IgG4固定區域(Mol Immunol.1993 Jan；30(1)：105-8.)中，327號(EU編號之447號)之Lys及/或326號(EU編號之446號)之Gly欠缺之步驟，則亦可含其他胺基酸置換。胺基酸置換方法不特別限定，可藉例如上述點專一性變異誘發法或實施例記載之方法進行。

成為對象之抗體不特別限定，抗人類IL-6受體抗體較佳，再者，人類化PM-1抗體、或其改變(置換、欠缺、插入)體較佳。

又，本發明係關於包含具序列識別號：21之胺基酸序列之IgG4固定區域(Mol Immunol.1993 Jan；30(1)：105-8.)中，進行下述步驟，使IgG4於酸性條件下之安定性提升之方法、使C末端由來之異質性減低之方法、使抗體對於FcγR結合減低之方法(M11△GK)。

(a)將序列識別號：21之14號(EU編號131)之Cys置換為Ser、(b)將序列識別號：21之16號(EU編號133)之Arg置換為Lys、(c)將序列識別號：21之20號(EU編號137)之Glu置換為Gly、 (d)將序列識別號：21之21號(EU編號138)之Ser置換為Gly、(e)將序列識別號：21之97號(EU編號214)之Arg置換為Thr、(f)將序列識別號：21之100號(EU編號217)之Ser置換為Arg、(g)將序列識別號：21之102號(EU編號219)之Tyr置換為Ser、(h)將序列識別號：21之103號(EU編號220)之Gly置換為Cys、(i)將序列識別號：21之104號(EU編號221)之Pro置換為Val、(j)將序列識別號：21之105號(EU編號222)之Pro置換為Glu、(k)將序列識別號：21之113號(EU編號233)之Glu置換為Pro、(l)將序列識別號：21之114號(EU編號234)之Phe置換為Val、(m)將序列識別號：21之115號(EU編號235)之Leu置換為Ala、(n)使序列識別號：21之116號(EU編號236)之Gly欠缺、(o)將序列識別號：21之289號(EU編號409)之Arg置換為Lys、及(p)使將序列識別號：21之326號(EU編號446)之Gly及 327號(EU編號447)之Lys欠缺。

本發明之方法，只要含上述步驟，亦可含其他胺基酸置換欠缺、其他步驟。使胺基酸之置換或欠缺之方法不特別限定，可藉例如上述點專一性變異誘發法或實施例記載之方法進行。

成為對象之抗體不特別限定，抗人類IL-6受體抗體較佳，再者人類化PM-1抗體、或其改變(置換、欠缺、插入)體較佳。

<使IgG1固定區域之C末端胺基酸欠缺由來之異質性減低之方法>

又，本發明係關於改善抗體之異質性之方法，包含使具序列識別號：19之胺基酸序列之IgG1固定區域中，329號(EU編號之446號)之Gly及330號(EU編號之447號)之Lys欠缺之步驟。本發明之改善抗體之異質性之方法，只要包含使具序列識別號：19之胺基酸序列之IgG1固定區域中，330號(EU編號之447號)之Lys及329號(EU編號之446號)之Gly欠缺之步驟，則亦可含其他胺基酸置換。胺基酸置換方法不特別限定，可藉例如上述點專一性變異誘發法或實施例記載之方法進行。

<藉由將IgG1固定區域之胺基酸置換使血漿中滯留性提升之方法>

又，本發明係關於使抗體之血漿中滯留性提升之方法，包含使具序列識別號：19之胺基酸序列之IgG1固定區域中，317號(EU434)之Asn置換為其他胺基酸。置換後 之胺基酸不特別限定，置換為Ala較佳。本發明之使血漿中滯留性提升之方法，只要含上述步驟，則亦可含其他胺基酸置換。

又，本發明係關於包含使具序列識別號：19之胺基酸序列之IgG1固定區域中，進行下述步驟，使血漿中滯留性提升之方法及/或C末端由來之異質性減低之方法(M83)。

(a)將序列識別號：19之317號(EU434)之Asn置換為其他Ala、(b)使序列識別號：19之330號(EU編號之447號)之Lys及329號(EU編號之446號)之Gly欠缺。

成為對象之抗體不特別限定，抗人類IL-6受體抗體較佳，再者人類化PM-1抗體、或其改變(置換、欠缺、插入)體較佳。

上述本發明之固定區域可與任意抗體由來之可變區域組合，但較佳為與對抗人類IL-6受體之抗體由來之可變區域組合。對抗人類IL-6受體之抗體可變區域之例，例：人類化PM-1抗體可變區域。人類化PM-1抗體可變區域，可為未進行胺基酸置換等之可變區域，亦可為經過上述胺基酸置換等之可變區域。

本發明提供包含本發明抗體之醫藥組成物。本發明之醫藥組成物，在風濕性關節炎等IL-6關連之疾病治療為有用。

本發明之醫藥組成物，除了抗體以外，可導入醫藥可容許之擔體並以公知方法製劑化。例如，可使用與水或其 他藥學容許之液的無菌性溶液、或懸浮液劑之注射劑形式，以非經口的使用。例如，可考量將藥理學上可容許之擔體或媒體，具體而言例如與滅菌水或生理食鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、界面活性劑、安定劑、香味劑、賦形劑、媒劑(vehicle)、防腐劑、結合劑等適當組合，以一般而言認可之製藥實務要求的單位用量形態混合而製劑化。該等製劑之中，有效成分量亦使得能得到指示範圍之適當容量者。

注射用之無菌組成物，可使用如注射用蒸餾水之媒劑(vehicle)，依照通常製劑實務處方。

注射用之水溶液，例如生理食鹽水、葡萄糖或含其他輔助藥之等張液，例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化鈉，可併用適當溶解輔助劑例如醇，具體而言乙醇、聚醇、例如丙二醇、聚乙二醇、非離子性界面活性劑、例如聚山梨糖醇酐80(TM)、HCO-50。

油性液例如麻油、大豆油，可併用作為溶解輔助劑之苯甲酸苄酯、苄醇。又，可配合緩衝劑例如磷酸鹽緩衝液、乙酸鈉緩衝液、止痛劑、例如，鹽酸普卡因、安定劑、例如苄醇、苯酚、抗氧化劑。製備之注射液通常充填在適當安瓿。

投予較佳為非經口投予，具體而言例：注射劑型、經鼻投予劑型、經肺投予劑型、經皮投予型等。注射劑型之例，例如，能以靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射等，以進行全身或局部投予。

又，可依照患者年齡、症狀選擇適當投予方法。含抗體或編碼為抗體之聚核苷酸之醫藥組成物之投予量，可從例如每次體重1kg 0.0001mg至1000mg之範圍選擇。或例如，從每位患者0.001至100000mg/body之範圍選擇投予量，但不一定限於該等數值。投予量、投予方法，依照患者體重或年齡、症狀等而變動，但若為該技術領域中具通常知識者，可適當選擇。

本說明書使用之胺基酸之3字母記號及1字母記號之對應如下。

丙胺酸：Ala：A

精胺酸：Arg：R

天冬醯胺：Asn：N

天冬醯胺酸：Asp：D

半胱胺酸：Cys：C

谷醯胺酸：Gln：Q

谷胺酸：Glu：E

甘胺酸：Gly：G

組胺酸：His：H

異白胺酸：Ile：I

白胺酸：Leu：L

離胺酸：Lys：K

甲硫胺酸：Met：M

苯丙胺酸：Phe：F

脯胺酸：Pro：P

絲胺酸：Ser：S

蘇胺酸：Thr：T

色胺酸：Trp：W

酪胺酸：Tyr：Y

纈胺酸：Val：V

又，本說明書中，引用之所有先前技術文獻，作為參考納入本說明書。

【實施例】

以下對本發明以實施例具體說明，但本發明不限於該等實施例。

[實施例1]利用使用親和性成熟技術之CDR改變提升抗原結合能力 SR344之製備

製作J.Biochem.108、673-676(1990)中所報告之由N末端側1號至344號之胺基酸序列所構成之可溶性人類IL-6R(以下、SR344)(Yamasaki等人、Science 1988；241：825-828(GenBank # X12830))之CHO細胞固定表現株。

從SR344表現CHO細胞得到之培養上清，利用Blue Sepharose 6 FF管柱層析、將對抗SR344之專一性抗體固定之管柱所為之親和層析、凝膠過濾管柱層析之3種管柱層析，將SR344精製。

於經20mM Tris鹽酸緩衝液、pH 8.0平衡化之Blue Sepharose 6 FF column(GEHealthcarebioscience)中，直接添加培養上清，以同緩衝液將非吸附分部完全流洗掉。 之後，將管柱以含300mMKCl之同緩衝液清洗。再者，以300mM KCl存在下之同緩衝液中，利用0M至0.5M的KSCN直線濃度梯度，洗提吸附的蛋白。將以KSCN濃度梯度洗提之分部，以使用對於SR344為專一性之抗體的西方墨點法分析，並收集含SR344之分部。

固定有對抗SR344為專一之抗體的管柱，事先以TBS(Tris-緩衝鹽液)平衡。於其中，將第一步驟得到之SR344分部利用Amicon Ultra-15(MILLIPORE、分子量截止10kDa)進行超過濾並濃縮，以TBS進行2倍稀釋後添加。 以TBS將管柱清洗後，以100mM甘胺酸-鹽酸緩衝液、pH 2.5，洗提吸附的蛋白。洗提的分部，添加1M Tris、pH 8.1使回到pH成中性。將得到之分部以SDS-PAGE分析，收集含SR344之分部。

將第二步驟得到之分部，以Amicon Ultra-15(分子量截止10kDa)濃縮，添加在經PBS平衡之Superdex200管柱(GEHealthcarebioscience)。以洗提成為主峰部之分部，作為SR344之最終精製品。

人類gp130表現BaF3細胞株之建立

為了得到顯示IL-6依存增殖性之細胞株，以如下所示，建立表現人類gp130之BaF3細胞株。

將全長人類gp130 cDNA(Hibi等人、Cell 1990；63：1149-1157(GenBank # NM_002184))以PCR放大，將pCHOI(Hirata等人、FEBS Letter 1994；356：244-248)之DHFR基因表現部位除去，選殖於插入有Zeocin耐性基因表現部 位之表現載體pCOS2Zeo，構建pCOS2Zeo/gp130。將全長人類IL-6R cDNA以PCR放大，選殖於pcDNA3.1(+)(Invitrogen)，並構建hIL-6R/pcDNA3.1(+)。

將10μgpCOS2Zeo/gp130混合到懸浮於PBS之BaF3細胞(0.8x10⁷細胞)，使用Gene Pulser(Bio-Rad)，以0.33kV、950μFD之容量施加脈衝。將經電穿孔處理進行基因導入的BaF3細胞，以含0.2ng/mL小鼠介白素-3(Peprotech)、10%胎牛血清(以下FBS、HyClone)之RPMI1640培養基(Invitrogen)培養一日夜，加入含100ng/mL人類介白素-6(R&D systems)、100ng/mL人類介白素可溶受體(R&D systems)及10% FBS之RPMI1640培養基選拔，建立人類gp130表現BaF3細胞株(以下、BaF3/gp130)。此BaF/gp130在人類介白素-6(R&D systems)及SR344存在下增殖，因此可用於評價抗IL-6受體抗體之增殖抑制活性(亦即IL-6受體中和活性)。

CDR改變庫之構建

首先，進行人類化PM1抗體(Cancer Res.1993 Feb 15；53(4)：851-6)之scFv化。將VH、VL區域以PCR放大，製作在VH、VL之間帶有連結子序列GGGGSGGGGSGGGGS(序列識別號：106)之人類化PM1 HL scFv。

以製作之人類化PM1 HL scFv DNA作為模板之PCR，製作各CDR胺基酸之其中一胺基酸成為X之標靶庫，及僅使CDR中之熱點序列成為隨機序列之庫。關於各CDR胺基酸之其中一胺基酸成為X之標靶庫，藉由以欲庫化之胺基 酸作為NNS之引子，以PCR反應構建庫部分，並將此外之部分以通常PCR製作，以組合PCR法連結並構建。此時，僅一CDR被庫化(J.Mol.Biol 1996；256：77-88參考)。 又，關於僅將熱點序列作為隨機序列之庫，利用以全部熱點胺基酸作為NNS之引子以PCR同樣地構建。此時，構建僅VH之熱點庫化之庫、僅VL之熱點庫化之庫(Nature Biotechnology 1999 June；17：568-572參考)。

使用該等庫，依照J.Immunological Methods 1999；231：119-135，構建核糖體顯示用庫。為了進行大腸菌無細胞系體外轉譯，在5’側加成SDA序列(核糖體結合位)、T7啟動子，就核糖體顯示用之連結子，在3’側將gene3部分序列使用Sfi I接合。

利用核糖體顯示(ribosome display)取得高親和性scFv

依照Nature Biotechnology 2000 Dec；18：1287-1292，以核糖體顯示進行淘篩。使用製備的SR344、NHS-PEO4-生物素(Pierce)，進行生物素化製作為抗原。 為了有效率地取得高親和性之scFv，參考JBC 2004；279(18)：18870-18877，進行解離速率篩選(off-rate selection)。生物素化抗原量定為1nM、競爭抗原量定為1uM、於4^th回合之競爭時間定為10 O/N。

scFv插入phagemide及抗原結合活性、序列解析

以4^th回合得到之DNA集合物為模板，使用專一性引子進行PCR，將HL scFv復原。以Sfi I消化，並插入於同樣地以Sfi I消化之phagemide載體pELBG lacI載體， 轉形到XL1-Blue(stratagene)。使用得到的群落，以phage ELISA進行抗原結合活性評價及HL scFv序列解析。依照J.Mol.Biol 1992；227：381-388，使用將SR344以1ug/mL塗覆的平盤，進行phage-ELISA。對於認為對於SR344具結合活性之選殖體，使用專一性引子進行序列解析。

從scFv之IgG化與IgG表現及精製

使用動物細胞表現用載體進行IgG表現。對於認為變異處濃縮之選殖體，將VH及VL各以PCR放大，並藉由XhoI/NheI消化及EcoRI消化，插入於動物細胞表現用載體。各DNA片段之鹼基序列，使用BigDye Terminator Cycle定序套組(Applied Biosystems)，於DNA定序儀ABI PRISM 3730xL DNA Sequencer或ABI PRISM 3700 DNA Sequencer(Applied Biosystems)，依照所附說明書記載之方法定序。

IgG化抗體之表現

抗體之表現使用以下方法進行。將人類胎兒腎癌細胞由來HEK293H株(Invitrogen)懸浮於含10%胎牛血清(Invitrogen)之DMEM培養基(Invitrogen)，以5~6×10⁵個/mL之細胞密度接種到黏著細胞用皿(直徑10cm、CORNING)之各皿各10mL，於CO₂培養箱(37℃、5% CO₂)內培養一晝夜後，將培養基吸除，添加CHO-S-SFM-II(Invitrogen)培養基6.9mL。將製備的質體DNA混合液(合計13.8μg)與1μg/mL聚乙二亞胺(Polysciences Inc.)20.7μL及CHO-S-SFMII培養基690μL混合，於室溫10 分鐘靜置者，投入各皿之細胞，於CO₂培養箱(37℃，5% CO₂)內溫育4~5小時。之後，添加CHO-S-SFM-II(Invitrogen)培養基6.9mL，於CO₂培養箱內培養3日。將培養上清回收後，進行離心分離(約2000g、5分鐘、室溫)將細胞除去，再通過0.22μm濾膜MILLEX^(R)-GV(Millipore)滅菌。該樣本於4℃保存直到使用為止。

IgG化抗體之精製

在得到之培養上清，添加懸浮於TBS中之50μLrProtein A Sepharose^TM Fast Flow(Amersham Biosciences)，於4℃倒轉混合4小時以上。將此溶液移到0.22μm濾杯Ultrafree^(R)-MC(Millipore)，以TBS 500μL清洗3次後，於rProtein A Sepharose^TM樹脂懸浮100μL 50mM乙酸鈉水溶液、pH 3.3，並靜置2分鐘後，洗提抗體。立即，加入6.7μL之1.5M Tris-HCl、pH 7.8進行中和。洗提進行2次，得200μL之精製抗體。將含抗體之溶液2μL供ND-1000 Spectrophotometer(NanoDrop)、或50μL供分光光度計DU-600(BECKMAN)，測定於280nm之吸光度。從得到之值使用下式計算抗體濃度。

抗體濃度(mg/mL)=吸光度×稀釋倍率÷14.6×10

經IgG化之選殖體之人類IL-6受體中和活性評估

使用顯示IL-6/IL-6受體依存性增殖之BaF3/gp130，評價IL-6受體中和活性。將BaF3/gp130以含10% FBS之RPMI1640培養基清洗3次後，懸浮於含60ng/mL之人類 介白素-6(TORAY)、60ng/mL之重組可溶性人類IL-6受體(SR344)及10% FBS之RPMI1640培養基，使成為5x10⁴cells/mL，並在96井盤(CORNING)之各井，各分注50μL。 其次，將精製的抗體以含10% FBS之RPMI1640稀釋，在各井分別混合50μL。於37℃、5% CO₂條件下，培養3日，將經PBS稀釋2倍之WST-8試藥(Cell Counting Kit-8、同仁化學研究所股份有限公司)以20μL/井添加，之後立即使用SUNRISE CLASSIC(TECAN)測量450nm之吸光度(參考波長620nm)。培養2小時後，再度測定450nm之吸光度(參考波長620nm)，以2小時之吸光度變化為指標，評價IL-6受體中和活性。

其結果，相較於人類化PM1抗體(野生型：WT)，可得多種活性較高之抗體。相較於WT呈現高活性之抗體之變異處如圖4所示。例如如圖1所示可知，RD_6相較於WT，就100%抑制濃度而言，呈現約50倍程度之高中和活性。

經IgG化之選殖體以Biacore所為之親和性解析

對於活性高於野生型者，使用Biacore T100(BIACORE)，進行抗原抗體反應之速度論的解析。於感應晶片上將rec-Protein A(ZYMED)(以下稱Protein A)以1800RU至2600RU固定化，並使各種抗體結合，對其流通抗原作為分析物，測定抗體與抗原之交互作用。抗原使用調整為各種濃度之重組人類IL-6R sR(R&D systems)(以下稱為rhIL-6sR)。測定均於25℃進行。從測定得到之感應圖形，計算動力參數結合速度常數k_a(1/Ms)及解離速度 常數k_d(1/s)，並依據此值計算K_D(M)。各參數之計算使用Biacore T100 Evaluation軟體(BIACORE)。

其結果，得到親和性相較於人類化PM1抗體(野生型：WT)較高之多個抗體。例如，野生型(WT)與RD_6之感應圖如圖2及3所示。利用動力參數解析結果，可知RD_6較WT顯示約50倍高的親和性(表1)。次外，亦可得具數10倍高親和性之抗體。顯示親和性高於WT之變異處如圖4所示。

[實施例2]利用各CDR改變之組合所為抗原結合能力提升

對於活性及親和性高之變異處，進行變異處之融合，製作更高活性、高親和性之抗體。

改變抗體之製作‧表現‧精製

在選定處進行為了製作改變抗體之胺基酸改變。具體而言，使用QuikChange點突變套組(Stratagene)，以附屬說明書記載之方法，在製作之H(WT)可變區域(H(WT)、鹼基序列識別號：107)，及L(WT)鏈可變區域(L(WT)、鹼基序列識別號：108)導入變異。將目的之人類化抗體可變區域基因序列經確認的H鏈抗體基因片段插入質體以XhoI及NotI消化後，將L鏈抗體基因片段插入質體以EcoRI消化後，將反應液供1%瓊脂凝膠電泳。將目的長度(約400bp) 之DNA片段使用QIAquick凝膠萃取套組(QIAGEN)，依照附屬說明書記載之方法精製，並以滅菌水30μl洗提。之後，在動物細胞表現用載體插入H鏈抗體基因片段，製作目的之H鏈表現製作載體。又，同樣地製作L鏈表現製作載體。連結反應使用快速DNA接合套組(Roche Diagnostics)，將大腸菌DH5α株(東洋紡織)轉形。各DNA片段之鹼基序列使用BigDye Terminator Cycle定序套組(Applied Biosystems)，於0DNA定序儀ABI PRISM 3730xL DNA定序儀或ABI PRISM 3700 DNA定序儀(Applied Biosystems)，依照附屬說明書記載之方法決定。使用製作的表現載體，以實施例1記載之方法進行表現、精製。

人類IL-6受體中和活性評估

精製抗體之中和活性評價依照實施例1所示方法進行。惟，人類介白素-6(TORAY)濃度定為600ng/mL進行中和活性之評價。顯示活性高於WT之新穎抗體可得多種，此等之CDR序列如圖5所示。其中，就顯示高活性之抗體，H鏈使用RDC_5H、L鏈使用RDC_11L之抗體(定為RDC_23)之中和活性如圖6所示。可知RDC_23相較於WT，100%抑制濃度而言，具約100倍高之活性。不僅是H鏈使用RDC_5H、L鏈使用RDC_11L之抗體RDC_23，H鏈使用RDC_2H、RDC_3H、RDC_4H、RDC_5H、RDC_6H、RDC_7H、RDC_8H、RDC_27H、RDC_28H、RDC_29H、RDC_30H、RDC_32H、L鏈使用L(WT)之抗體(各為RDC_2、RDC_3、RDC_4、RDC_5、RDC_6、 RDC_7、RDC_8、RDC_27、RDC_28、RDC_29、RDC_30、RDC_32)，及H鏈使用H(WT)、L鏈使用RDC_11L之抗體(定為RDC_11)中，確認中和活性提升，藉由將於親和性成熟發現的變異處組合，可得具更高中和活性之抗體。又，該等變異處組合之抗體由於中和活性提升，因此可認為親和性亦提升。

使用ProteinA之Biacore所為親和性解析

所以，對於中和活性經提升之抗體當中的RDC_2、RDC_3、RDC_4、RDC_5、RDC_6、RDC_7、RDC_8、RDC_11、RDC_23，使用Biacore T100(BIACORE)，進行抗原抗體反應之速度論的解析。感應晶片上以胺偶合法將rec-Protein A(ZYMED)將4400RU至5000RU固定化，使其與各種抗體結合，並使抗原流過作為分析物，測定抗體與抗原之交互作用。抗原使用調整成各種濃度之rhIL-6sR。測定均在25℃進行。從測定得到之感應圖形，計算動力學參數即結合速度常數k_a(1/Ms)及解離速度常數k_d(1/s)，並與此值為依據，計算K_D(M)。各參數之計算，使用Biacore T100 Evaluation軟體(BIACORE)。其結果，組合變異處而成RDC_2、RDC_3、RDC_4、RDC_5、RDC_6、RDC_7、RDC_8、RDC_11、RDC_23，較同時測定之變異處為1處之RD_28具較小K_D值(表2)。其中關於顯示高親和性之RDC_23，顯示於圖7感應圖形。

由此可考量：該等抗體之親和性較變異處組合前之抗體為強。與中和活性同樣地，藉由將親和性成熟發現的變異處組合，可取得具更高親和性之抗體。相較於WT顯示較高活性或親和性之變異體之胺基酸序列，如以下所示(自WT之變異處畫底線)。

(HCDR2)

序列識別號：45 YISYSGITNYNPSLKS

(HCDR3)

序列識別號：57 LLARATAMDY

序列識別號：58 VLARATAMDY

序列識別號：59 ILARATAMDY

序列識別號：60 TLARATAMDY

序列識別號：61 VLARITAMDY

序列識別號：62 ILARITAMDY

序列識別號：63 TLARITAMDY

序列識別號：64 LLARITAMDY

(LCDR3)

序列識別號：79 GQGNRLPYT

亦即，藉由製作HCDR2之9號胺基酸為Asn、HCDR3之1號胺基酸擇自於Leu、Val、Ile、Thr任一，HCDR3之5號胺基酸擇自於Ala、Ile任一，LCDR3之1號胺基酸為Gly、LCDR3之5號之胺基酸為Arg之抗體，能製作中和活性及親和性顯著較WT提升之抗IL-6受體抗體。

使用Protein A/G之以Biacore所為之親和性解析

使用Biacore T100(BIACORE)，進行WT及RDC_23之抗原抗體反應之速度論的解析。在感應晶片上固定經純化的Recomb Protein A/G(Pierce)(以下稱Protein A/G)，使其與各種抗體結合，並使抗原流過作為分析物，測定抗體與抗原之交互作用。抗原使用調整成各種濃度之rhIL-6sR(R&D systems)，及重組可溶型IL-6受體(實施例1中，製備的SR344)。相對於由桿狀病毒感染昆蟲細胞生產之rhIL-6sR其糖鏈構造為高甘露糖型，由CHO細胞生產之SR344其糖鏈構造在複合型糖鏈末端被認為鍵結有唾液酸。由於實際人類生體內之可溶型IL-6受體之糖鏈構造被認為在複合型糖鏈末端鍵結有唾液酸，因此SR344被認為較接近人類生體內之可溶型IL-6受體之構造，本實驗實施rhIL-6sR與SR344之比較試驗。

從測定得到之感應圖形，計算動力學參數即結合速度常數k_a(1/Ms)及解離速度常數k_d(1/s)，依據此值，計算K_D(M)。各參數之計算，使用Biacore T100 Evaluation 軟體(BIACORE)。

感應晶片，係藉由胺偶合法將Protein A/G約3000RU固定化在CM5(BIACORE)而製作。使用製作的感應晶片，進行與Protein A/G結合之抗體(WT與RDC_23)與rhIL-6sR及SR344之2種可溶型IL-6受體間的交互作用之速度論的解析。電泳緩衝液使用HBS-EP+，流速定為20μL/min。各抗體製備成約100RU結合在Protein A/G。作為分析物使用之rhIL-6sR使用HBS-EP+，製備為0、0.156、0.313、0.625μg/mL，SR344調整為0、0.0654、0.131、0.261μg/mL。測定，首先使目的抗體WT與RDC_23結合於Protein A/G，使分析物溶液進行3分鐘交互作用，之後轉換成HBS-EP+(BIACORE)，測定10分鐘解離相。解離相測定結束後，以10uL之10mM甘胺酸-HCl(pH1.5)清洗，將感應晶片再生。該結合‧解離‧再生定為分析之1週期。實驗均在37℃進行。

對於WT及RDC_23，依照其週期進行測定，就rhIL-6sR及SR344之2種可溶型IL-6受體得到之感應圖形，如圖8、圖9、圖10及圖11所示。就得到之感應圖形，使用Biacore專用之資料解析軟體Biacore T100 Evaluation軟體進行速度論的解析(表3)。其結果，rhIL-6sR之SR344比較中可知，WT及RDC_23均以使用SR344者得到之親和性變成弱2~3倍。RDC_23對於rhIL-6sR及SR344兩者，相較於WT，提升約40~60倍親和性，對於利用親和性成熟得到之各CDR改變之組合，被認為接近人類生體內可溶 型IL-6受體構造之SR344，亦與WT比較顯示非常強的親和性。以下實施例中，測定均於37℃中，進行使用SR344及protein A/G之抗原抗體反應之速度論的解析。

[實施例3]以CDR及框架改變所為血漿中滯留性之提升及使免疫原性風險減低之H53/L28之創製

Cancer Res.1993 Feb 15；53(4)：851-6中，為了使經人類化小鼠PM1抗體(以下稱野生型，簡稱WT，H鏈WT稱為H(WT)，L鏈WT稱為L(WT))之血漿中滯留性提升、免疫原性風險減低、及安定性之提升，實施如以下之改變。 為了使血漿中滯留性提升，在WT之H鏈可變區域及L鏈可變區域序列導入使等電點降低之改變。

人類化PM1抗體之立體構造模型之製作

首先，為了確認露出於人類化PM1抗體(H(WT)/L(WT))之可變區域表面之胺基酸殘基，使用MOE軟體(Chemical Computing Group Inc.)，利用同源性模型化製作經人類化之小鼠PM1抗體之Fv區域模型。

為了使人類化PM1抗體之等電點降低之改變處之選定

藉由製作的模型詳細解析，就作為使等電點降低之改變導入處，在FR序列中，露出於表面之胺基酸中，考慮H16、H43、H81、H105、L18、L45、L79、L107(Kabat編號、 Kabat EA et al.1991.Sequences of Proteins of Immunological Interest.NIH)，就CDR序列而言，考慮H31、H64、H65、L24、L27、L53、L55，是不會使活性或安定性降低，能使等電點降低之候選者。

將殘存於人類化PM1抗體之小鼠序列除去

人類化PM1抗體係將小鼠PM1抗體人類化之抗體序列(Cancer Res.1993 Feb 15；53(4)：851-6)。人類化PM1抗體之H鏈，係在人類抗體可變區域NEW之框架移植CDR，但是，H鏈之H27、H28、H29、H30、H71為了活性保持，直接利用小鼠序列。若考慮免疫原性之風險，小鼠序列愈少愈好，因此搜尋為了使H27、H28、H29、H30為人類序列之序列。

以人類化PM1抗體之安定性提升為目的之改變處選定

人類化PM1抗體(H(WT)/L(WT))之可變區域中，藉由將H65之絲胺酸置換為甘胺酸(轉角構造之安定化、藉由HCDR2改變為一致性序列以安定化)、H69之甲硫胺酸置換為異白胺酸(將疏水核構造安定化)及H70之白胺酸置換為絲胺酸(藉由使表面露出殘基親水化而安定化)、H58之蘇胺酸置換為天冬醯胺(藉由HCDR2改變為一致性序列以安定化)、L93之蘇胺酸置換為絲胺酸(藉由將表面露出殘基親水化而安定化)、H107之絲胺酸置換為異白胺酸(β摺板之安定化)，被認為能使安定性提升，該等改變被認為是使安定性提升之候選者。

將人類化PM1抗體於電腦試驗(In silico)預測之T細胞抗 原決定基除去

首先，將人類化PM1抗體(H(WT)/L(WT))之可變區域使用TEPITOPE(Methods.2004 Dec；34(4)：468-75)解析。其結果，顯示在L鏈CDR2存在多數結合於HLA之T細胞抗原決定基。所以，在TEPITOPE解析中，探討使L鏈CDR2之免疫原性風險減低，且不使安定性、結合活性、中和活性降低之改變。其結果得知，藉由將L鏈CDR2之L51之蘇胺酸置換為甘胺酸，能不降低安定性、結合活性、中和活性，能將與HLA結合之T細胞抗原決定基除去。

各框架序列之選定

從一般公開的Kabat資料庫(ftp：//ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/kabat/)及IMGT資料庫(http：//imgt.cines.fr/)，取得人類抗體胺基酸序列資料，藉由使用構建的資料庫，可分成各框架進行同源性検索。當人類框架選定時，從等電點降低、殘存小鼠序列之除去、安定性提升之觀點，將具上述各項目改變之人類框架序列於資料庫進行探討。其結果，如以下所示，藉由使改變抗體H53/L28之各框架為以下序列，可知能不使結合活性、中和活性降低，能滿足上述項目。Source為該人類序列之由來，序列之中底線部之胺基酸殘基，為相較於WT已導入改變之胺基酸。

又，上述H53之FR3由於存在非人類序列，希望將免疫原性風險更減低。就減低免疫原性風險之改變，可認為將H89之Ala置換為Val之序列(序列識別號：127)。再者H53之FR3之H71之Arg由於對於結合活性重要(Cancer Res.1993 Feb 15；53(4)：851-6)，藉由使用H71保守為Arg之人類VH1次類之FR3序列(序列識別號：128)、或人類VH3次類之FR3序列(序列識別號：128)，能製作H鏈、L鏈均就框架而言完全為人類序列之抗人類IL-6受體抗體。

各CDR序列之選定

CDR序列，從第一不使結合活性、中和活性降低、且能使等電點降低、安定性提升、T細胞抗原決定基除去之觀點，選定H53/L28之各CDR序列如下。

改變抗體之表現載體製作‧表現‧精製

經改變之抗體之表現載體製作‧表現‧精製，以實施例1記載之方法進行。依序導入改變，使得成為選定為經人類化之小鼠PM1抗體之H(WT)變異導入用載體、L(WT)變異導入用載體之框架序列、CDR序列。使用具編碼為最終得到、決定的框架序列、CDR序列的H53/L28(抗體胺基酸序列H53序列識別號：104、L28序列識別號：105)的動物細胞表現用載體，進行H53/L28表現‧精製，用於以下之評價。

以改變抗體H53/L28之等電點電泳所為之等電點評價

為了評價對於可變區域之胺基酸改變所致全長抗體之等電點變化，將WT與改變抗體H53/L28以等電點電泳實施分析。等電點電泳如以下進行。使用Phastsystem Cassette(Amersham Biosciences公司製)，以下列膨潤液使 Phast-Gel Dry IEF(Amersham Biosciences公司製)凝膠膨潤約30分鐘。

miliQ水 1.5mL

IEF用Pharmalyte 5-8(Amersham Biosciences公司製)50μL

IEF用Pharmalyte 8-10.5(Amersham Biosciences公司製)50μL

使用經膨潤的凝膠，以PhastSystem(Amersham Biosciences公司製)，依以下規畫進行電泳。樣本於步驟2添加到凝膠。pI標記使用pI用校正套組(Amersham Biosciences公司製)。

步驟1：2000V 2.5mA 3.5W 15℃ 75Vh

步驟2：200V 2.5mA 3.5W 15℃ 15Vh

步驟3：2000V 2.5mA 3.5W 15℃ 410Vh

電泳後之凝膠以20% TCA固定後，使用銀染色套組、蛋白質(Amersham Biosciences公司製)，依照套組所附的實驗方法進行銀染色。染色後，從pI標記之既知等電點計算樣本(全長抗體)之等電點。其結果，WT之等電點約9.3、改變抗體H53/L28之等電點約6.5~6.7，從WT經胺基酸置換可使等電點降低約2.7之H53/L28。又，將該H53/L28之可變區域(VH、VL序列)之理論等電點以GENETYX(GENETYX CORPORATION)計算，得到理論等電點為4.52。 從WT之理論等電點9.20，可得從WT經胺基酸置換使可變區域之理論等電點降低約4.7之H53/L28。

H53/L28之人類IL-6受體中和活性評價

將WT與H53/L28依照實施例1所示方法實施。結果如圖12所示。其結果，改變抗體H53/L28與WT比較，可知BaF/gp130之中和活性提升數倍。亦即，H53/L28與WT比較，能使等電點降低且使中和活性提升。

利用Biacore所為H53/L28對於人類IL-6受體之親和性解析

WT與H53/L28對於人類IL-6受體之親和性評價，使用Biacore T100(BIACORE)進行速度論的解析。於感應晶片上將經精製之Recomb Protein A/G(Pierce)(以下稱為Protein A/G)固定化，使其與各種抗體結合，並使流過作為抗原分析物，測定抗體與抗原之交互作用。抗原使用調整為各種濃度之重組可溶型IL-6受體(SR344)。測定條件與實施例2以相同條件實施。

得到之WT與H53/L28之感應圖形如圖13所示。使用Biacore專用之資料解析軟體Biacore T100 Evaluation軟體進行速度論的解析，結果如表6所示。其結果，發現H53/L28相較於WT，K_D降低約6倍，親和性約提升6倍。 亦即，H53/L28相較於WT，能降低等電點，且使親和性提升約6倍。詳細探討的結果，可認為貢獻於親和性提升之胺基酸變異，係L51之蘇胺酸置換為甘胺酸之變異。亦即，藉由使L51之蘇胺酸置換為甘胺酸，能使親和性提升。

利用TEPITOPE所為H53/L28之T細胞抗原決定基預測

實施H53/L28之TEPITOPE解析(Methods.2004 Dec；34(4)：468-75)。其結果可知，相較於WT，與HLA可能結合之胜肽數大幅減少，可認為人類之中免疫原性風險減低。

[實施例4]H53/L28之血漿中滯留性評價 改變抗體H53/L28之正常小鼠血漿中動態評價

為了評價使等電點降低後之改變抗體H53/L28之血漿中滯留性，比較WT與改變抗體H53/L28在正常小鼠之血漿中動態。

將WT及H53/L28對於小鼠(C57BL/6J、日本Charles River)以1mg/kg進行靜脈內及皮下單次投予，並於投予前及投予後15分鐘、2小時、8小時、1日、2日、5日、7日、14日、21日、28日抽血。惟，投予後15分鐘僅從靜脈內投予群抽血。抽取的血液立即於4℃以15,000rpm離心分離15分鐘，得血漿。分離的血漿，直到實施測定為止，保存在設定為-20℃以下的冷凍庫。

小鼠血漿中濃度測定以ELISA法測定。首先重組人類IL-6 sR(R&D Systems公司製)使用EZ-LinkTM Sulfo-NFS-生物素化套組(PIERCE公司製)進行生物素 化。將此生物素化人類-sIL-6R分注到Reacti-結合鏈親和素高結合能力(HBC)包覆平盤(PIERCE公司製)，於室溫靜置靜置1小時以上，製作人類-sIL-6R固相化平盤。就血漿中濃度，製備3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05μg/mL之檢量線試樣及小鼠血漿測定試樣，分注到人類-sIL-6R固相化平盤，於室溫靜置1小時。之後，使與抗-人類IgG-AP(SIGMA公司製)反應，以BluePhos Microwell Phosphatase Substrates System(Kirkegaard & Perry Laboratories公司製)為基質，進行發色反應，以微平盤讀取儀測定650nm之吸光度。小鼠血漿中濃度，從檢量線之吸光度使用解析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices公司製)計算。WT及H53/L28之靜脈內投予後於血漿中濃度變化顯示於圖14，皮下投予後之血漿中濃度變化如圖15所示。

得到之血漿中濃度變化之資料使用藥物動力學解析軟體WinNonlin(Pharsight公司製)進行非模型依存的解析，計算藥物動力學的參數(AUC、廓清(CL)、半衰期(T1/2))。T1/2從最終3點或從WinNonlin所自動設定之最終相的血漿中濃度計算。BA，從皮下投予後之AUC相對於靜脈內投予後之AUC的比計算。得到之藥物動力學的參數如表7所示。

H53/L28之靜脈內投予後之血漿中半衰期(T1/2)延長為WT之約1.3倍，廓清降低約1.7倍。H53/L28之皮下投予後之T1/2，延長為WT之約2倍，廓清降低約2.1倍。如此，藉使WT之等電點降低，能使H53/L28於血漿中滯留性大幅提升。

H53/L28，相較於人類化PM-1抗體(WT)，為使結合活性、中和活性提升、免疫原性風險減低，且使血漿中滯留性大幅提升之人類化抗IL-6受體抗體，可認為作為醫藥品在開發方面，以H53/L28應用之改變極為有用。

[實施例5]PF1抗體之製作 人類化PM1抗體之表現載體及變異導入載體之製作

對於實施例4製作之H53/L28，導入實施例2所發現使RDC_23之親和性提升之H鏈2處、L鏈2處、合計4處之CDR變異。以對於H53/L28導入RDC_23變異的H鏈作為PF1_H，對於H53/L28導入RDC_23之變異的L鏈作為PF1_L，製作‧表現‧精製改變抗體，依實施例1記載之方法實施。PF1_H之胺基酸序列以序列識別號：22表示，PF1_L之胺基酸序列以序列識別號：23表示。

人類IL-6受體中和活性評價

經精製之PF1抗體之中和活性評價依照實施例1所示方法進行。惟，人類介白素-6(TORAY)濃度定為600ng/mL，進行中和活性之評價。WT與PF1之中和活性如圖16所示。 PF1與WT相較，可得知就100%抑制濃度而言，具約100~1000倍之活性。

利用Biacore進行PF1抗體對於人類IL-6受體之親和性解析

本測定與實施例2以同樣條件進行。電泳緩衝液使用HBS-EP+，流速定為20μL/min。各抗體製備成對於Protein A/G結合約100RU。作為分析物使用之SR344，使用HBS-EP+，調整成0、0.065、0.131、0.261μg/mL。測定首先使抗體溶液結合於Protein A/G，於其中，使分析物溶液進行3分鐘交互作用，之後轉換為HBS-EP+，測定10或15分鐘解離相。解離相測定結束後，以10μL之10mM甘胺酸-HCl(pH1.5)清洗，將感應晶片再生。該結合‧解離‧再生定為分析的1週期。對於各種抗體，依照其週期進行測定。

得到之PF1之感應圖形如圖17所示。對於得到之感應圖形，使用Biacore專用之資料解析軟體Biacore T100 Evaluation軟體，進行速度論的解析，將WT與H53/L28之結果一併顯示於表8。其結果可知，PF1之親和性相較於WT，提升約150倍。藉由親和性成熟之組合得到之高親和性之RDC_23，及血漿中滯留性提升且親和性提升之H53/L28組合得到PF1之親和性，由於相加效果得到較該等更高者。

PF1抗體之利用差示掃描型熱量測定(DSC)所為之熱安定性評價

為了實施PF1抗體之熱安定性評價，進行利用差示掃描型熱量測定(DSC)所為之熱變性中間溫度(Tm值)之評價。將WT與PF1之精製抗體對於20mM乙酸鈉、150mM NaCl、pH6.0之溶液進行透析(EasySEP、TOMY)，以約0.1mg/mL蛋白質濃度，於40℃至100℃，以1℃/min升溫速度進行DSC測定。其結果可知，WT之Fab部分之Tm值約94℃、PF1之Fab部分之Tm值為91℃。由於一般IgG1型抗體分子之Fab部分之Tm值落在約60℃~85℃之範圍(Biochem Biophys Res Commun.2007 Apr 13；355(3)：751-7.、Mol Immunol.2007 Apr；44(11)：3049-60)，因此得到之PF1抗體之熱安定性相較於一般IgG1分子，顯示極高安定性。

PF1抗體之高濃度安定性評價

進行PF1抗體在高濃度製劑中之安定性評價。將WT與PF1之精製抗體對於20mM氯化組胺酸、150mM NaCl、pH6.5之溶液，進行透析(EasySEP、TOMY)，之後以超過濾膜濃縮，進行高濃度安定性試驗。條件如下。

抗體：WT及PF1

緩衝液：20mM氯化組胺酸、150mM NaCl、pH6.0

濃度：145mg/mL

保存溫度與期間：25℃-2週、25℃-4週、25℃-7週

聚集體評價法：系統 Waters Alliance

管柱 G3000SWxl(TOSOH)

移動相 50mM磷酸鈉、300mM KCl、pH7.0

流速‧波長 0.5ml/min、220nm

將樣本稀釋為1/100後分析

以上述凝膠過濾層析法評價起始(剛製備製劑後)及於各條件保存後製劑之聚集體含量，關於從起始起聚集體含量之變化量(增加量)如圖18所示。其結果，WT及PF1均顯示非常高安定性，可知於25℃-7週之聚集體量增加量，於WT約0.7%、於PF1約0.3%，各於25℃-1個月之聚集體增加量，約0.4%及約0.17%，PF1尤其在高濃度中，顯示極高安定性。WO 2003/039485中，作為IgG之高濃度製劑已上市之Daclizumab之100mg/mL製劑，在25℃顯示安定性資料，但是，Daclizumab之100mg/mL製劑，於25℃-1個月之聚集體增加量約0.3%，PF1相較於Daclizumab，在高濃度之安定性極優異，作為醫藥品開發高濃度溶液製劑方面，聚集體增加為一大課題，但是PF1抗體顯示在高濃度，聚集體之增加極少。

PF1，相對於WT，係為了使抗原結合能力提升、因為等電點降低使血漿中滯留性提升、由於殘存小鼠序列除去 及T細胞抗原決定基除去使免疫原性風險減低、安定性提升，為目的而施加改變的分子，但實際上在100mg/mL以上之高濃度製劑，安定性亦相較於WT，明顯地非常高，使用如此之分子，能提供安定且便利性高之高濃度皮下投予製劑。

[實施例6]PF1抗體之利用人類IL-6受體基因轉殖小鼠所為之PK/PD試驗 使用人類IL-6受體基因轉殖小鼠之體內動態試驗

對於WT及實施例5中製作之PF1，評價人類IL-6受體基因轉殖小鼠(hIL-6R tg小鼠、Proc Natl Acad Sci U S A.1995 May 23；92(11)：4862-6)之中，體內動態及人類可溶型IL-6受體於體內之中和能力。將WT及PF1對於hIL-6R tg小鼠，以10mg/kg進行靜脈內單次投予，並於投予前及投予後15分鐘、2小時、4小時、8小時、1日、2日、4日、7日進行採血。將採取之血液立刻於4℃以15,000rpm進行15分鐘離心分離，得血漿。分離之血漿，保存在設定成-20℃以下之冷凍庫測定直到實施為止。

小鼠血漿中濃度測定以ELISA法測定。就血漿中濃度而言，調整為6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1μg/mL之檢量線試樣。將檢量線試樣及小鼠血漿測定試樣，分注到以抗人類IgG(γ-鏈專一性)F(ab’)2(Sigma公司製)固相化之免疫平盤(Nunc-Immuno Plate,MaxiSorp(Nalge nunc International公司製))，於室溫靜置1小時後，依序使山羊抗人類IgG-BIOT(Southern Biotechnology Associates公司製)及鏈親和素-鹼性磷解酶接合物(Roche Diagnostics公司製)反應，以BluePhos Microwell磷解酶基質系統(Kirkegaard & Perry Laboratories公司製)為基質，進行發色反應，以微平盤讀取儀測定650nm之吸光度。小鼠血漿中濃度，從檢量線之吸光度，使用解析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices公司製)計算。WT及PF1之血漿中濃度變化，如圖19所示。PF1之投予4日後之血漿中濃度，相較於WT，為約5倍高之值，因此可知，PF1相較於WT，在人類IL-6受體基因轉殖小鼠中，血漿中滯留性提升。

可知人類IL-6受體基因轉殖小鼠，於血漿中生產人類可溶型IL-6受體。因此，藉由對於人類IL-6受體基因轉殖小鼠投予抗人類IL-6受體抗體，能評價存在於血漿中之人類可溶型IL-6受體之中和效果。

為了藉由WT或PF1之投予，評價人類可溶型IL-6受體中和之程度，測定小鼠血漿中，非結合型人類可溶型IL-6受體濃度。將小鼠之血漿6μL以含BSA之稀釋緩衝液稀釋為2倍，於0.22μm之濾杯(Millipore)中，添加在經乾燥之適量rProtein A Sepharose Fast Flow(GE Healthcare)樹脂，藉此使血漿中存在之所有IgG型抗體(小鼠IgG、抗人類IL-6受體抗體及抗人類IL-6受體抗體-人類可溶型IL-6受體複合體)吸附於proteinA。之後，以高速離心機使旋轉沉降，回收通過(pass)溶液。由於通過溶液不含結合於proteinA之抗人類IL-6受體抗體-人類可溶型IL-6 受體複合體，因此藉由測定通過溶液中之人類可溶型IL-6受體濃度，能測定非結合型之可溶型IL-6受體濃度。可溶型IL-6受體濃度，使用Quantikine人類IL-6 sR(R&D Systems)。WT及PF1投予小鼠4小時後、8小時後、24小時後、48小時後、96小時後、168小時後之非結合型之可溶型IL-6受體濃度測定，依照所附說明書實施。

結果如圖20所示。將WT及PF1以10mg/kg對於靜脈內單次投予4小時後、8小時後為止，WT及PF1均為非結合型之可溶型IL-6受體濃度10ng/mL以下，確認人類可溶型IL-6受體經中和。但是，相對於24小時後WT之非結合型之可溶型IL-6受體濃度為500ng/mL程度，PF1之非結合型之可溶型IL-6受體濃度為10ng/mL以下，因此發現PF1相較於WT，持續地將人類可溶型IL-6受體中和。

PF1係將於親和性成熟發現之RDC_23與血漿中滯留性等經改善之H53/L28組合者，被認為於體內能發揮長血漿中滯留性及高中和活性。實際上，生產人類可溶型IL-6受體之人類IL-6受體基因轉殖小鼠中，顯示PF1在中和效果及血漿中濃度，較WT更為持續。

PF1於高濃度製劑之安定性及免疫原性風險，均較WT(人類化PM-1抗體)更為優異，且於人類IL-6受體基因轉殖小鼠亦為IL-6受體中和效果及血漿中滯留性優異，因此可認為在開發作為醫藥品方面，於PF1應用之改變極有用。

[實施例7]IgG2及IgG4於酸性條件下之安定性提升 製作‧表現IgG2、IgG4化人類化IL-6受體抗體表現載體

為了使對於Fc γ受體之結合活性降低，製作人類化PM1抗體(Cancer Res.1993 Feb 15；53(4)：851-6)之固定區域為IgG1同種異構型，將固定區域置換為IgG2之分子(WT-IgG2、序列識別號：109)及置換為IgG4(Mol Immunol.1993 Jan；30(1)：105-8.)之分子(WT-IgG4、序列識別號：110)。IgG表現使用動物細胞表現用載體。構建將實施例1使用之人類化PM1抗體(IgG1)之固定區域部分以NheI/NotI消化及接合，而將固定區域置換為IgG2或IgG4之表現載體。各DNA片段之鹼基序列，使用BigDye Terminator Cycle定序套組(Applied Biosystems)，於DNA定序儀ABI PRISM 3730xL DNA定序儀或ABI PRISM 3700 DNA定序儀(Applied Biosystems)，依照所述說明書記載之方法決定。L鏈使用WT，WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4表現依照實施例1記載之方法實施。

(1)人類化PM1抗體(WT-IgG1)H鏈：序列識別號：15(胺基酸序列)

(2)WT-IgG2H鏈：序列識別號：109(胺基酸序列)

(3)WT-IgG4H鏈：序列識別號：110(胺基酸序列)

WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4利用Protein A鹽酸洗提精製

於得到之培養上清，添加懸浮在TBS之50μLrProtein A Sepharose^TM Fast Flow(Amersham Biosciences)，於4℃進行4小時以上倒轉混合。將此溶液移到0.22μm之濾杯 Ultrafree^(R)-MC(Millipore)，於TBS 500μL清洗3次後，於rProtein A Sepharose^TM樹脂pH2.0懸浮100μL之10mM HCl、150mM NaCl，靜置2分鐘後，洗提抗體(鹽酸洗提法)。立即，加入6.7μL之1.5M Tris-HCl、pH 7.8並中和。洗提進行2次，得200μL之精製抗體。

利用鹽酸洗提法精製之WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4之凝膠過濾層析分析

為了評價利用鹽酸洗提法得到之精製品之聚集體含量，進行凝膠過濾層析分析。

聚集體評價法：系統 Waters Alliance

管柱 G3000SWxl(TOSOH)

移動相 50mM磷酸鈉、300mM KCl、pH7.0

流速‧波長 0.5ml/min、220nm

結果如圖21所示。WT-IgG1精製後之聚集體含量，為約2%，相對於此，WT-IgG2及WT-IgG4精製後之聚集體含量約25%。由此可認為IgG1對於鹽酸洗提時之酸為安定，但IgG2及IgG4對於鹽酸洗提時之酸為不安定而進行變性‧聚集化，IgG2及IgG4，相較於IgG1，明顯在酸性條件下之安定性低。IgG分子精製時，常用Protein A，但IgG分子從Protein A之洗提，係在酸性條件下進行。又，開發IgG分子作為醫藥品方面所必要之病毒不活化，一般而言，係於酸性條件中進行。由此等希望IgG分子於酸性條件之安定性較高，但是可知IgG2及IgG4分子於酸性條件下之安定性較IgG1為差，首度明確了開發作為醫藥品時， 存在於酸性條件下之變性‧聚集化的課題。開發作為醫藥品時，希望考慮解決變性‧聚集化之課題，但至此為止尚未有藉由胺基酸置換來解決此課題之方法被報告。

WT-IgG2、WT-IgG4之CH3結構域改變體之製作及評價

IgG2及IgG4分子於酸性條件之安定性顯示劣於IgG1，因此，探討改善IgG2及IgG4分子於酸性條件下之安定性的改變體。藉由IgG2及IgG4分子之固定區域模型，考慮酸性條件下之不安定要因，為CH3結構域之CH3/CH3界面之不安定性，並進行各種探討，結果考慮IgG2中EU編號之397號之甲硫胺酸，IgG4中EU編號之409號之精胺酸，分別使IgG2及IgG4之CH3/CH3界面不安定化。所以，製作將IgG2之EU編號397號之甲硫胺酸改變為纈胺酸之抗體(IgG2-M397V序列識別號：111(胺基酸序列)及將IgG4之EU編號409號之精胺酸改變為離胺酸之抗體(IgG4-R409K序列識別號：112(胺基酸序列)。

目的抗體之表現載體之製作‧表現‧精製，使用上述鹽酸洗提之方法進行。為了評價從Protein A之鹽酸洗提法得到之精製品之聚集體含量，進行凝膠過濾層析分析。

聚集體評價法：系統 Waters Alliance

管柱 G3000SWxl(TOSOH)

移動相 50mM磷酸鈉、300mM KCl、pH7.0

流速‧波長 0.5ml/min、220nm

結果如圖21所示。WT-IgG1精製後之聚集體含量為約2%，相對於此，WT-IgG2及WT-IgG4精製後之聚集體含量 約25%。相對於此，CH3結構域改變體IgG2-M397V及IgG4-R409K之聚集體含量與IgG1為同等級之約2%。可知，藉由將IgG2之EU編號397號之甲硫胺酸改變為纈胺酸，或將IgG4之EU編號409號之精胺酸改變為離胺酸，能使IgG2抗體及IgG4抗體於酸性條件下之安定性提升。又，與實施例5以同樣方法，測定WT-IgG2、WT-IgG4、IgG2-M397V及IgG4-R409K之熱變性中間溫度，結果相較於WT-IgG2、WT-IgG4，可知對於IgG2-M397V、IgG4-R409K各導入改變後之CH3結構域之Tm值高。由此可知，IgG2-M397V、IgG4-R409K，各相較於WT-IgG2、WT-IgG4，熱安定性優異。

IgG2及IgG4由於在使用Protein A之精製步驟及病毒不活化步驟中暴露於酸性條件下，因此，同步驟之變性‧聚集化為課題，但是藉由IgG2及IgG4之固定區域序列使用IgG2-M397V及IgG4-R409K，明確可解決此課題，可知該改變在開發IgG2及IgG4抗體為醫藥品方面極有用。 又，由IgG2-M397V及IgG4-R409K之熱安定性優異之觀點，亦可知為有用。

[實施例8]IgG2之雙硫鍵由來之異質性改善 WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4利用Protein A乙酸洗提所為之精製

於實施例7得到之培養上清，添加懸浮於TBS 50μL之rProtein A Sepharose^TM Fast Flow(Amersham Biosciences)，於4℃進行4小時以上倒轉混合。將此溶 液移到0.22μm之濾杯Ultrafree^(R)-MC(Millipore)，以TBS 500μL清洗3次後，於pH 3.3，使100μL之50mM乙酸鈉水溶液懸浮於rProtein A Sepharose^TM樹脂，靜置2分鐘後，將抗體洗提。立即加入6.7μL之1.5M Tris-HCl、pH 7.8使中和。洗提進行2次，得200μL之精製抗體。

WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4之陽離子交換層析(IEC)分析

為了評價經精製之WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4之均一性，以陽離子交換層析進行分析。

IEC評價法：系統 Waters Alliance

管柱 ProPac WCX-10(Dionex)

移動相 A：25mM MES-NaOH、pH6.1

B：25mM MES-NaOH、250mM Na-Acetate、pH6.1

流速‧波長 0.5ml/min、280nm

梯度B：50%-75%(75min)WT-IgG1分析時

B：30%-55%(75min)WT-IgG2、WT-IgG4分析時

結果如圖22所示。可知WT-IgG1、WT-IgG4於離子交換分析為單一峰部，但WT-IgG2存在複數峰部。IgG2分子相較於IgG1或IgG4，異質性多。實際上，IgG2之同種異構型，據報告為鉸鏈區域之雙硫鍵由來之異質性(不均一性)(Chu GC、Chelius D、Xiao G、Khor HK、Coulibaly S、Bondarenko PV.Accumulation of Succinimide in a Recombinant Monoclonal Antibody in Mildly Acidic Buffers Under Elevated Temperatures.Pharm Res.2007 Mar 24；24(6)：1145-56)，圖22所示IgG2之異質峰部， 亦被認為是此等由來之目的物質/關連物質。欲維持目的物質/關連物質之異質性之製造間差異同時大量製作為醫藥品有困難，開發為醫藥品之抗體分子希望儘可能為均勻(異質性少)的物質。因此，野生型IgG2開發抗體作為醫藥品時，均一性被認為是重要課題。實際上，US20060194280(A1)中，天然型IgG2在離子交換層析分析中，觀察到雙硫鍵由來之各種異質峰部，該等峰部間據報告生物活性相異。就將此異質峰部單一化之方法而言，在US20060194280(A1)中報告在精製步驟之中的再折疊(refolding)，但若在製造中使用該等步驟，會提高成本且煩雜，因此希望較佳為利用胺基酸置換使異質峰部單一化之方法。開發為醫藥品時，希望解決鉸鏈區域之雙硫鍵由來之異質性，但至今為止尚無利用胺基酸置換解決此課題之方法被報告。

WT-IgG2之CH1結構域、鉸鏈區域之改變體製作及評價

如圖23所示，關於IgG2分子，考量各種雙硫鍵樣式。就IgG2之鉸鏈區域由來之異質性之原因而言，考慮雙硫鍵之結合方式差異及游離半胱胺酸之存在。IgG2在上部鉸鏈區域具2個半胱胺酸(EU編號219號及220號，與該上部鉸鏈之2個半胱胺酸鄰接之半胱胺酸，例如：存在於H鏈之CH1結構域的EU編號131號之半胱胺酸及L鏈之C末端之半胱胺酸及2量化的對象H鏈之相同上部鉸鏈之2個半胱胺酸。亦即，在IgG2之上部鉸鏈周邊，於H2L2之聚集狀態合計有8個半胱胺酸鄰接，藉此，可認為由於雙硫鍵之結合方式差異及游離半胱胺酸造成存在各種異質性。

為了減低IgG2之鉸鏈區域由來之異質性，進行IgG2之鉸鏈區域序列與CH1結構域之改變。進行避免IgG2中，雙硫鍵之結合方式差異及游離半胱胺酸所致異質性之探討。各種改變體之探討結果，認為藉由將野生型IgG2固定區域序列之中、H鏈之CH1結構域存在的EU編號131號之半胱胺酸及133號之精胺酸分別改變為絲胺酸及離胺酸，將H鏈上部鉸鏈存在之EU編號219號之半胱胺酸改變為絲胺酸(以下，稱IgG2-SKSC)(IgG2-SKSC：序列識別號：120)，能不使熱安定性降低，而能避免異質性。藉此，可認為IgG2-SKSC之H鏈與L鏈之共價鍵，能藉由EU編號220號之半胱胺酸與L鏈C末端之半胱胺酸，利用雙硫鍵均勻形成(圖24)。

IgG2-SKSC表現載體之製作、表現、精製，依照實施例1記載之方法實施。為了評價經精製之IgG2-SKSC及野生型IgG2(WT-IgG2)之均勻性，利用陽離子交換層析進行分析。

IEC評價法：系統 Waters Alliance

管柱 ProPac WCX-10(Dionex)

移動相 A：25mM MES-NaOH、pH5.6

B：25mM MES-NaOH、250mM Na-Acetate、pH5.6

流速‧波長 0.5ml/min、280nm

梯度 B：50%-100%(75min)

結果如圖25所示。如上所述可知，WT-IgG2存在複數峰部，但IgG2-SKSC洗提為單一峰部。IgG2之鉸鏈區域之 雙硫鍵由來之異質性，顯示可藉由導入如以EU編號220號之半胱胺酸與L鏈C末端之半胱胺酸形成單一雙硫鍵之IgG2-SKSC之改變而避免。又，與實施例5以同樣方法，測定WT-IgG1、WT-IgG2及IgG2-SKSC之熱變性中間溫度之結果，WT-IgG2相較於WT-IgG1，觀察到顯示低Tm值之Fab結構域之峰部，但是，IgG2-SKSC未認為有此峰部。由此可知，IgG2-SKSC相較於WT-IgG2，熱安定性亦優異。

野生型IgG2在開發抗體作為醫藥品時，被認為在重要的均勻性存在課題，但是藉由以IgG2-SKSC作為IgG2之固定區域序列使用，明確可解決此課題，可知IgG2開發作為醫藥品方面極有用。又，從IgG2-SKSC於熱安定性亦優異之觀點亦有用。

[實施例9]IgG分子之C末端異質性之改善 WT-IgG1之H鏈C末端△GK抗體之表現載體構建

就抗體之C末端序列之異質性，有人報告C末端胺基酸之離胺酸殘基之欠缺及C末端之2胺基酸之甘胺酸、離胺酸之欠缺所致C末端胺基之醯胺化(Johnson KA、Paisley-Flango K、Tangarone BS、Porter TJ、Rouse JC.Cation exchange-HPLC and mass spectrometry reveal C-terminal amidation of an IgG1 heavy chain.Anal Biochem.2007 Jan 1；360(1)：75-83.)，開發作為醫藥品方面，希望不存在該等異質性。實際上，人類化PM-1抗體TOCILIZUMAB中，其主成分係將鹼基序列上存在之C末端胺基酸之離胺酸藉由轉譯後修飾而欠缺之序列，但離胺酸 殘存之副成分亦存在成為異質性。所以為了使C末端胺基酸之異質性減低，進行C末端胺基酸之改變。具體而言，探討藉由使野生型IgG1之H鏈固定區域之C末端之離胺酸及甘胺酸從鹼基序列上預先欠缺，是否能抑制C末端之2胺基酸之甘胺酸、離胺酸之欠缺所致末端胺基之醯胺化。

使用實施例1得到之人類化PM1抗體(WT)之pB-CH載體，在H鏈C末端序列導入變異。使用QuikChange點突變套組(Stratagene)，以所附說明書記載之方法，對於編碼為EU編號447號之Lys及/或EU編號446號之Gly之鹼基序列，導入以此等作為終止密碼子之變異。藉此，製作C末端之1胺基酸之離胺酸(EU編號447)預先欠缺之抗體、C末端之2胺基酸之甘胺酸(EU編號446)、離胺酸(EU編號447)預先欠缺之抗體之表現載體。藉由表現人類化PM1抗體之L鏈，得H鏈C末端△K抗體及H鏈C末端△GK抗體。表現‧精製依實施例1記載之方法實施。

經精製之H鏈C末端△GK抗體之陽離子交換層析分析，以如下進行。使用經精製之H鏈C末端△GK抗體，以下列方法進行陽離子交換層析所為分析，評價C末端欠缺對於異質性帶來的影響。陽離子交換層析分析條件如下，比較人類化PM1抗體、H鏈C末端△K抗體、H鏈C末端△GK抗體之層析圖。

管柱：ProPac WCX-10、4×250mm(Dionex)

移動相：A：25mmol/L MES/NaOH、pH 6.1

B：25mmol/L MES/NaOH、250mmol/L NaCl、 pH 6.1

流速：0.5mL/min

梯度：25%B(5min)→(105min)→67%B→(1min)→100%B(5min)

檢測：280nm

未改變人類化PM-1抗體、H鏈C末端△K及H鏈C末端△GK抗體之分析結果，如圖26所示。從非專利文獻(Chu GC、Chelius D、Xiao G、Khor HK、Coulibaly S、Bondarenko PV.Accumulation of Succinimide in a Recombinant Monoclonal Antibody in Mildly Acidic Buffers Under Elevated Temperatures.Pharm Res.2007 Mar 24；24(6)：1145-56)，在滯留時間晚於主峰部之鹼性峰部，包含H鏈C末端449號之Lys殘存體、447號之Pro醯胺體，但是在H鏈C末端△K未認為之鹼性峰部大幅減少，在H鏈C末端△GK抗體被認為有，因此首度可知藉使H鏈C末端之2胺基酸欠缺，能減輕H鏈C末端異質性。

為了評價H鏈C末端之2殘基之欠缺對於熱安定性的影響，進行利用DSC之H鏈C末端△GK抗體之熱變性溫度測定。將DSC測定用含150mM NaCl之20mM乙酸緩衝液，藉由於pH6.0透析，置換緩衝液。將人類化PM1抗體、H鏈C末端△GK抗體及參考溶液(透析外液)充分脱氣後，將該等分別密封到熱量計小室，充分進行於40℃之熱平衡化。其次，DSC掃描於40℃~100℃以約1K/分掃描速度進行。對於得到之變性峰部，以非專利文獻(Rodolfo等人、 Immuuology Letters、1999年、p47-52)為參考，進行峰部指定，確認C末端欠缺不影響CH3結構域之熱變性溫度。

藉此，藉由使H鏈固定區域之C末端之離胺酸及甘胺酸從鹼基序列上預先欠缺，能不影響抗體之熱安定性，而使C末胺基酸之異質性減低。人類抗體固定區域IgG1、IgG2、IgG4中，C末端序列均為EU編號447號為Lys、EU編號446號為Gly，因此本案等發現之C末胺基酸之異質性減低之方法，可認為亦能應用在IgG2固定區域及IgG4固定區域、或此等之改變體。

[實施例10]新穎最適化固定區域M14△GK序列之製作

以中和抗原為目的之抗體醫藥，必需要Fc區域具有之ADCC等效應子功能，因此，不需要結合到Fc γ受體。若考慮免疫原性或副作用之觀點，對於Fc γ受體結合不佳(Strand V、Kimberly R、Isaacs JD.Biologic therapies in rheumatology：lessons learned、future directions.Nat Rev Drug Discov.2007 Jan；6(1)：75-92.、Gessner JE、Heiken H、Tamm A、Schmidt RE.The IgG Fc receptor family.Ann Hematol.1998 Jun；76(6)：231-48.)。人類化抗IL-6受體IgG1抗體TOCILIZUMAB會對於IL-6受體專一性結合。藉由中和其生物學作用，可利用於作為風濕性關節炎等IL-6相關疾病之治療藥，不需要結合到Fc γ受體。

Fc γ受體非結合之最適化固定區域M14△GK之製作及評價

就使對於Fc γ受體之結合降低之方法而言，考慮將 IgG抗體之同種異構型從IgG1改變為IgG2或IgG4同種異構型之方法(Ann Hematol.1998 Jun；76(6)：231-48.)。為完全消除對於Fc γ受體之結合之方法，據報告有將人工改變導入Fc區域之方法。例如，由於抗CD3抗體或抗CD4抗體會誘發抗體之效應子功能為副作用，因此，進行在Fc區域之Fc γ受體結合部分導入野生型序列不存在之胺基酸變異(Cole MS、Anasetti C、Tso JY.Human IgG2 variants of chimeric anti-CD3 are nonmitogenic to T cells.J Immunol.1997 Oct 1；159(7)：3613-21.、Reddy MP、Kinney CA、Chaikin MA、Payne A、Fishman-Lobell J、Tsui P、Dal Monte PR、Doyle ML、Brigham-Burke MR、Anderson D、Reff M、Newman R、Hanna N、Sweet RW、Truneh A.Elimination of Fc receptor-dependent effector functions of a modified IgG4 monoclonal antibody to Human CD4.J Immunol.2000 Feb 15；164(4)：1925-33.)後之Fc γ受體非結合型抗CD3抗體或抗CD4抗體之臨床試驗(Strand V、Kimberly R、Isaacs JD.Biologic therapies in rheumatology：lessons learned、future directions.Nat Rev Drug Discov.2007 Jan；6(1)：75-92.、Chau LA、Tso JY、Melrose J、Madrenas J.HuM291(Nuvion)、a humanized Fc receptor-nonbinding antibody against CD3、anergizes peripheral blood T cells as partial agonist of the T cell receptor.Transplantation.2001 Apr 15；71(7)：941- 50.)。又，藉由使IgG1之Fc γ R結合部位(EU編號：233、234、235、236、327、330、331號)為IgG2(EU編號：233、234、235、236)及IgG4(EU編號：327、330、331號)之序列，據報告能製作Fc γ受體非結合型抗體(Kim SJ、Park Y、Hong HJ.、Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies.、Mol Cells.2005 Aug 31；20(1)：17-29.Review.)。然而，若對於IgG1將該等變異全部導入，則可能出現天然不存在之T細胞抗原決定基胜肽的9胺基酸的新胜肽序列，免疫原性風險上升。就開發為醫藥品之方面，希望將免疫原性風險儘量降低。

為了解決上述課題，探討對於IgG2之固定區域改變。 IgG2之固定區域在Fc γ R結合部位中，EU編號：233、234、235、236為非結合型，但Fc γ R結合部位之中，EU編號：327、330、331號為與非結合型之IgG4相異之序列，因此需要將EU編號：327、330、331號之胺基酸改變為IgG4之序列(Eur J Immunol.1999 Aug；29(8)：2613-24之中G2△a)。然而，相對於IgG4之EU編號：338號之胺基酸為丙胺酸，IgG2為蘇胺酸，因此僅是將EU編號：327、330、331號之胺基酸改變為IgG4之序列，會出現成為天然不存在之T細胞抗原決定基胜肽的9胺基酸之新胜肽序列，免疫原性風險上升，故不佳。所以發現，除了上述改變，藉由另外將IgG2之EU編號：339號之蘇胺酸改變為丙胺酸，能防止新胜肽序列出現。

除了該等變異以外，導入於實施例7發現之使IgG2於 酸性條件之安定性提升之將IgG2之EU編號397號之甲硫胺酸變異為纈胺酸、於實施例8發現之使鉸鏈區域之雙硫鍵由來之異質性改善之使EU編號131號之半胱胺酸變異為絲胺酸、使133號之精胺酸變異為離胺酸、219號之半胱胺酸變異為絲胺酸。再者，伴隨131號與133號之變異導入，會出現成為天然不存在之T細胞抗原決定基胜肽的9胺基酸之新胜肽序列，產生免疫原性風險，因此，藉由使EU編號137號之谷胺酸變異為甘胺酸、138號之絲胺酸變異為甘胺酸，使131號至139號附近之胜肽序列與天然存在之人類序列相同。再者，為了C末端由來之異質性減低，使H鏈C末端之EU編號之446、447號之甘胺酸及離胺酸欠缺。該等變異全部導入之固定區域序列定為M14△GK(M14△GK：序列識別號：24)。M14△GK，就可能成為T細胞抗原決定基胜肽之9胺基酸之新胜肽序列而言，存在1處導入219號之半胱胺酸變異為絲胺酸之變異，但由於半胱胺酸與絲胺酸就胺基酸序列而言之性質相似，因此認為免疫原性之風險極小，利用TEPITOPE進行之免疫原性預測中，亦未認為免疫原性變化。

依照實施例1記載之方法，製作具WT為可變區域序列，且具M14△GK為固定區域序列之H鏈抗體序列(M14△GK：序列識別號：24、WT-M14△GK：序列識別號：113)之表現載體，使用WT-M14△GK為H鏈、使用WT為L鏈，依照實施例1記載之方法進行表現‧精製。

又，以同樣方法，為了使IgG1固定區域對於Fc γ受 體結合降低，於EU編號：233、234、235、236、327、330、331、339號導入變異(Eur J Immunol.1999 Aug；29(8)：2613-24之中G1△ab)，再者為了使C末端之異質性降低，使EU編號446號及447號欠缺(實施例9)之WT-M17△GK(M17△GK：序列識別號：116、WT-M17△GK：序列識別號：115)。製作表現載體，其中，為了使IgG4固定區域對於於Fc γ受體結合降低，對於EU編號：233、234、235、236號導入變異(Eur J Immunol.1999 Aug；29(8)：2613-24之中G4△b，此改變由於產生新非人類序列，因此免疫原性風險上升)，為了使免疫原性風險減低，除了上述改變以外，為了使鉸鏈區域之雙硫鍵樣式與M14△GK相同，對於EU編號：131、133、137、138、214、217、219、220、221、222號導入變異，再者，為了提升於酸性條件之安定性，對於EU編號409號導入變異(實施例7)，為了使C末端之異質性降低，使EU編號446號及447號欠缺(實施例9)WT-M11△GK(M11△GK：序列識別號：25、WT-M11△GK：序列識別號：114)。使用WT-M17△GK或WT-M11△GK為H鏈、使用WT為L鏈，依照實施例1記載之方法進行表現‧精製。

WT-M14△GK、WT-M17△GK、WT-M11△GK之Fc γ受體結合活性評價

對於Fc γ RI之結合評價如以下方式進行。使用Biacore T100，使固定於感應晶片之人類由來Fc γ receptor I(以下、Fc γ RI)與作為分析物之IgG1、IgG2、 IgG4、M11△GK、M14△GK、M1△GK 7交互作用，比較其結合量。人類由來之Fc γ RI，使用重組人類FcRIA/CD64(R&D systems)，樣本使用IgG1、IgG2、IgG4、M11△GK、M14△GK、M17△GK，進行測定。以胺偶合法在感應晶片CM5(BIACORE)固定Fc γ RI。最終的hFc γ RI之固定量，約13000RU(共振單元)。電泳緩衝液使用HBS-EP+，流速定為20μL/min。樣本使用HBS-EP+調整為100μg/mL之濃度。分析，以注射抗體溶液10μL2分鐘作為結合相，之後轉換為HBS-EP+，進行4分鐘解離相。解離相結束後，藉由注射20μL之5mM氫氧化鈉，使感應晶片再生。以此結合‧解離‧再生作為分析的1週期，注射各種抗體溶液，得感應圖形。分析物各依IgG4、IgG2、IgG1、M11、M14、M17之順序流動，並反複進行2次。比較測定的結合量資料的結果，如圖27所示。其結果，結合量依IgG1>IgG4>>IgG2=M11△GK=M14△GK=M17△GK之順序減少，可知野生型IgG2、M11△GK、M14△GK、M17△GK，相較於野生型IgG1、IgG4，對於Fc γ RI之結合較弱。

對於Fc γ RIIa之結合評價如以下方式進行。使用Biacore T100，使固定於感應晶片之人類由來Fc γ受體IIa(以下、Fc γ RIIa)與作為分析物之IgG1、IgG2、IgG4、M11△GK、M14△GK、M17△GK交互作用，比較其結合量。 人類由來之Fc γ RIIa，使用重組人類FcRIIA/CD32a(R&D systems)，樣本使用IgG1、IgG2、IgG4、M11△GK、M14△GK、M17△GK，進行測定。利用胺偶合法，在感應晶片CM5 (BIACORE)固定Fc γ RIIa。最終固定約3300RU的Fc γ RIIa。電泳緩衝液使用HBS-EP+，流速定為20μL/min。之後，使電泳緩衝液流動直到基線穩定，測定於基線穩定後進行。對於經固定化的Fc γ RIIa，使作為分析物之各IgG同種異構型(IgG1、IgG2、IgG4)及導入有變異之抗體(M11△GK、M14△GK、M17△GK)交互作用，觀察其結合量。電泳緩衝液使用HBS-EP+，流速定為20μL/min、測定溫度定為25℃。各IgG及改變體調整為100μg/mL，流過20μL作為分析物，使與經固定化之Fc γ RIIa交互作用。交互作用後，藉由使200μL之電泳緩衝液流動，從Fc γ RIIa使分析物解離，使感應晶片再生。分析物分別以IgG4、IgG2、IgG1、M11△GK、M14△GK、M17△GK之順序流動，並反複2次。比較測定的結合量資料之結果，如圖29所示。其結果，結合量依照IgG1>IgG2=IgG4>M11△GK=M14△GK=M17△GK的順序減少，可知M11△GK、M14△GK、M17△GK較野生型IgG1、IgG2、IgG4任一者，對於Fc γ RIIa的結合弱。

對於Fc γ RIIb之結合評價如以下方式進行。使用Biacore T100，使固定在感應晶片之人類由來Fc γ受體IIb(以下、Fc γ RIIb)與作為分析物使用之IgG1、IgG2、IgG4、M11△GK、M14△GK、M17△GK交互作用，比較其結合量。人類由來之Fc γ RIIb，使用重組人類FcRIIB/C(R&D systems)，樣本使用IgG1、IgG2、IgG4、M11△GK、M14△GK、M17△GK，進行測定。藉由胺偶合法在感應晶片 CM5(BIACORE)固定Fc γ RIIb。最終將約4300RU之Fc γ RIIb固定化。之後使電泳緩衝液流動直到基線穩定，測定從基線穩定後進行。對於經固定化之Fc γ RIIb，使作為分析物之各IgG同種異構型(IgG1、IgG2、IgG4)及導入有變異之抗體(M11△GK、M14△GK、M17△GK)交互作用，觀察其結合量。電泳緩衝液使用HBS-EP+(10mM HEPES、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05% v/v Surfactant P20)，流速定為20μL/min、測定溫度定為25℃。各IgG及改變體調整為200μg/mL，使20μL流動作為分析物，與經固定化之Fc γ RIIb交互作用。交互作用後藉由使200μL之電泳緩衝液流動，從Fc γ RIIb使分析物解離，使感應晶片再生。分析物各以IgG4、IgG2、IgG1、M11△GK、M14△GK、M17△GK之順序流動，反複2次。比較經測定之結合量資料，結果如圖28所示。其結果，結合量依IgG4>IgG1>IgG2>M11△GK=M14△GK=M17△GK順序減少，可知：M11△GK、M14△GK、M17△GK相較於野生型IgG1、IgG2、IgG4任一者，對於Fc γ RIIb之結合弱。

對於Fc γ RIIIa之結合評價如以下方式進行。使用Biacore T100，使固定於感應晶片之人類由來Fc γ受體IIIa(以下稱為Fc γ RIIIa)，與用為分析物之IgG1、IgG2、IgG4、M11△GK、M14△GK、M17△GK交互作用，比較其結合量。人類由來之Fc γ RIIIa，使用hFc γ RIIIaV-His6(重組hFc γ RIIIaV-His6：公司內製備品)，就樣本而言，使用IgG1、IgG2、IgG4、M11△GK、M14△GK、M17△GK進行 測定。以胺偶合法，在感應晶片CM5(BIACORE)固定Fc γ RIIIa。最終hFc γ RIIIaV-His6之固定量，約8200RU(共振單元)。電泳緩衝液使用HBS-EP+，流速定為5μL/min。樣本使用HBS-EP+製備成250μg/mL之濃度。 分析，以注射抗體溶液10μL2分鐘為結合相，之後轉換為HBS-EP+，進行4分鐘之解離相。解離相結束後，藉由注射20μL之5mM鹽酸，使感應晶片再生。以此結合‧解離‧再生為分析之1週期，注射各種抗體溶液，得感應圖形。 分析物各依IgG4、IgG2、IgG1、M11△GK、M14△GK、M17△GK之順序流動。比較經測定之結合量資料，結果如圖30所示。其結果、結合量依IgG1>>IgG4>IgG2>M17△GK>M11△GK=M14△GK之順序減少，可知M11△GK、M14△GK、M17△GK相較於野生型IgG1、IgG2、IgG4，對於Fc γ RIIIa結合弱。又，相較於Eur J Immunol.1999 Aug；29(8)：2613-24所報告含有G1△ab變異之M17△GK，可知M11△GK、M14△GK為較弱結合。

由以上，確認WT-M14△GK、WT-M17△GK、WT-M11△GK對於各種Fc γ受體之結合，相較於野生型IgG1顯著降低。 藉由使用WT-M14△GK、WT-M17△GK、WT-M11△GK為固定區域，能避免經由Fc γ受體導入到APC由來之免疫原性風險或ADCC等效應子功能由來之副作用，對於以抗原中和為目的之抗體醫藥之固定區域序列有用。

WT-M14△GK、WT-M17△GK、WT-M11△GK之高濃度安定性試驗

進行WT-M14△GK、WT-M17△GK、WT-M11△GK於高濃度製劑之安定性評價。將WT-IgG1、WT-M14△GK、WT-M17△GK、WT-M11△GK之精製抗體對於20mM氯化組胺酸、150mM NaCl、pH6.5之溶液進行透析(EasySEP、TOMY)，之後以超過濾膜濃縮，進行高濃度安定性試驗。條件如下。

抗體：WT-IgG1、WT-M14△GK、WT-M17△GK、WT-M11△GK

緩衝液：20mM氯化組胺酸、150mM NaCl、pH6.5

濃度：61mg/mL

保存溫度及期間：40℃-2W、40℃-1M、40℃-2M

聚集體評價法：系統 Waters Alliance

管柱 G3000SWxl(TOSOH)

移動相 50mM磷酸鈉、300mM KCl、pH7.0

流速‧波長 0.5ml/min、220nm

樣本稀釋為1/100後分析

起始(剛製備製劑後)及各條件保存後，製劑之聚集體含量，以上述凝膠過濾層析法評價，對於從起始之聚集體含量變化量，如圖31所示。其結果，相較於WT-IgG1，WT-M14△GK、WT-M17△GK、WT-M11△GK之聚集體增加量低，為WT之聚集體增加量之約1/2。又，如圖32所示，關於Fab片段之增加量，WT-IgG1與WT-M17△GK為同程度，但WT-M14△GK與WT-M11△GK為WT之Fab片段增加量之約1/4。IgG型抗體製劑之劣化路徑，如WO 2003/039485所記載，主要例如聚集體之生成及Fab分解物之生成。WT-M14△GK與WT-M11△GK，相較於WT-IgG1，在聚集體與 Fab片段之生成之2個點，據發現製劑安定性優異。藉此，即使於IgG1固定區域安定性不足夠，無法製作成開發作為醫藥品之高濃度溶液製劑之抗體，亦可藉由使用WT-M14△GK、WT-M17△GK、WT-M11△GK作為固定區域，而製作具高安定性之高濃度溶液製劑。

尤其M14△GK，作為於原本IgG2分子具有之酸性條件下之不安定性提升、使鉸鏈區域之雙硫鍵由來之異質性改善、不結合於Fc γ受體、使可能成為T細胞抗原決定基胜肽之9胺基酸之新胜肽序列壓抑在最小限度，且於高濃度製劑之安定性較IgG1更優異之新穎固定區域序列，極有用。

[實施例11]PF1-M14△GK抗體之製作

將於實施例5製作之PF1(固定區域為IgG1)之可變區域部分以XhoI/NheI切開，將實施例7製作之M14△GK(可變區域為WT)之固定區域部分以NheI/NotI切開，並於動物細胞表現用載體插入2個H鏈抗體基因片段，製作目的之PF1-M14△GK之H鏈表現載體(PF1_H-M14△GK：序列識別號：117)。L鏈使用PF1_L，以實施例1記載之方法，實施PF1-M14△GK抗體之表現‧精製。

PF1-M14△GK抗體，作為抗IL-6受體抗體之醫藥品，在各觀點優於WT(人類化PM-1抗體)，可認為極有用。

[實施例12]M31△GK之製作及評價

相對於實施例10製作之M14△GK，製作將EU編號：330、331、339號改變為IgG2之序列的M31△GK(M31△GK： 序列識別號：118)。依實施例1記載方法製作可變區域序列具WT，固定區域序列具M31△GK之H鏈抗體序列(WT-M31△GK：序列識別號：119)表現載體，使用WT-M31△GK為H鏈、使用WT為L鏈，依照實施例1記載之方法表現‧精製WT-M31。

除了WT-M31，同時將經表現‧精製之WT-IgG2及WT-M14△GK之陽離子交換層析分析如下進行。陽離子交換層析分析條件如下，比較WT-IgG2、WT-M14△GK、WT-M31△GK之層析圖。

管柱：ProPac WCX-10、4×250mm(Dionex)

移動相：A：25mmol/L MES/NaOH、pH 6.1

B：25mmol/L MES/NaOH、250mmol/L NaCl、pH 6.1

流速：0.5mL/min

梯度：0%B(5min)→(65min)→100%B→(1min)

檢測：280nm

WT-IgG2、WT-M14△GK、WT-M31△GK之分析結果如圖33所示。可知WT-IgG2存在複數峰部，但是WT-M31△GK與WT-M14△GK洗提為同樣單一峰部。WT-M31△GK亦顯示能避免IgG2之鉸鏈區域之雙硫鍵由來之異質性。

[實施例13]完全人類化抗體F2H/L39-IgG1之製作 PF1抗體之框架序列之完全人類化

於實施例5製作之PF1_H，僅71號(Kabat編號、Kabat EA et al.1991.Sequences of Proteins of Immunological Interest.NIH))之精胺酸維持殘存小鼠序列，因此從免疫原性之觀點不佳。一般而言，H鏈之71號殘基，為決定HCDR2構造之重要序列，實際製作人類化PM1抗體時，據報告對於小鼠PM1抗體之結合活性為重要，明確地，將71號從精胺酸置換為纈胺酸，則結合活性大幅降低(Cancer Research 53、851-856、1993)。同樣地，PF1_H分類在人類生殖系列基因之VH4家族，但VH4家族之中71號，高度保守為纈胺酸，71號之精胺酸若置換為纈胺酸，則確認中和活性大幅降低。

所以，為了將71號維持精胺酸殘基且小鼠序列完全除去，調查人類生殖系列基因及據報告之人類抗體序列，搜尋71號為精胺酸且對於抗體立體構造維持重要殘基保守之序列。其結果，發現如表9所示與PF1_H同源性低但保守重要殘基之候選序列。

相對於PF1_H-IgG1，藉由將Kabat編號66號至94號置換為上述候選序列，設計H96-IgG1(序列識別號：134胺基酸序列))。抗體可變區域，使用組合合成寡DNA之PCR法(assembly PCR)製作。固定區域，從IgG1表現載體使用PCR法進行放大。利用Assembly PCR法，使抗體可變區域與固定區域結合，插入到動物細胞表現用載體。H96/PF1L-IgG1表現、精製，依照實施例1所記載方法進 行。

框架完全人類化抗體H96/PF1L-IgG1之評價

使用經精製之H96/PF1L-IgG1，以實施例5之方法進行Tm值測定。

親和性之測定，原則與實施例5以同樣條件測定。惟，SR344之濃度調整為0、0.36、1.4μg/mL，且測定15分鐘解離相。

其結果，H96/PF1L-IgG1，顯示與PF1-IgG1大致同等Tm值及親和性(表10)。

以上，藉由使PF1抗體之H鏈為H96，能維持Tm值及親和性，將殘留於PF1抗體之小鼠序列完全除去，得到PF1抗體之框架完全人類化的抗體。H96/PF1L-IgG1，由於在框架序列不存在小鼠由來序列，因此於免疫原性之觀點，認為尤優異。

使pI降低及免疫原性風險減低之F2H/L39-IgG1之製作

如實施例4所示，藉由改變抗體可變區域之胺基酸並使pI降低，能提升血漿中滯留性。並且，相對於上述製作之H96-IgG1，再導入以下之胺基酸置換。為了使pI降低，導入64號離胺酸置換為谷醯胺酸、及65號之甘胺酸置換為天冬醯胺酸。又，為了使免疫原性風險減低，導入105號谷胺酸置換為谷醯胺、107號蘇胺酸置換為異白胺酸。 再者，導如於實施例2得到之親和性增強之改變，95號纈胺酸置換為白胺酸、99號異白胺酸置換為丙胺酸。對於H96-IgG1導入該等胺基酸置換之F2H-IgG1(序列識別號：135(胺基酸序列))，依實施例1記載之方法製作。

又，對於PF1L導入以下胺基酸置換。為了使pI降低，導入27號谷醯胺酸置換為谷胺酸、及55號白胺酸置換為谷胺酸。以實施例1記載之方法製作對於PF1L導入該等胺基酸置換之L39(序列識別號：136(胺基酸序列))。 F2H/L39-IgG1表現、精製，依照實施例1所記載之方法進行。

利用Biacore進行F2H/L39-IgG1對於人類IL-6受體之親和性解析

進行人類化PM1抗體(野生型、WT)、PF1抗體(實施例5製作)及F2H/L39-IgG1之親和性測定。本測定原則與實施例4以同樣條件測定。惟，SR344之濃度調整為0、0.36、1.4μg/mL且測定15分鐘解離相(表11)。

其結果可知，F2H/L39-IgG1其KD值維持10^-11等級，具極強親和性，但k_a相較於PF1-IgG1，降低成約1/2。

F2H/L39-IgG1之人類IL-6受體中和活性評價

以實施例1所示方法進行人類化PM1抗體(野生型、WT)及F2H/L39-IgG1之中和活性之評價。惟，將人類介白素 -6(TORAY)濃度定為600ng/mL，進行中和活性評價。如圖34所示，相較於WT，明確地，F2H/L39-IgG1就100%抑制濃度而言，具100倍以上之極強活性。

F2H/L39-IgG1之利用等電點電泳所為之等電點評價

F2H/L39-IgG1之等電點，依實施例3記載之方法測定。F2H/L39-IgG1之等電點為5.5，相較於實施例5製作之PF1抗體，可認為藉由使等電點更降低，使血漿中滯留性更改善。

又，該F2H/L39之可變區域(VH、VL序列)之理論等電點，以GENETYX(GENETYX CORPORATION)計算，結果理論等電點為4.3。WT之理論等電點為9.20，因此從WT經胺基酸置換得到可變區域之理論等電點降低約4.9的F2H/L39。

F2H/L39-IgG1之利用長尾獼猴(Macaca fascicularis)所為之PK/PD試驗

評價人類化PM1抗體(野生型、WT)、PF1抗體及F2H/L39-IgG1於長尾獼猴(Macaca fascicularis)之中，藥物動力學(PK)及藥效(PD)。將WT、PF1及F2H/L39-IgG1以1.0mg/kg對於皮下進行單次投予，於投予前及經時採血。 與實施例6同樣地，測定各抗體之血漿中濃度。WT、PF1及F2H/L39-IgG1之血漿中濃度變化，如圖35所示。為了評價長尾獼猴(Macaca fascicularis)膜型IL-6受體中和的程度之類的藥效，從抗體投予後第3日(day3)至第10日(day10)為止，將長尾獼猴(Macaca fascicularis)IL-65μg/kg對於腰背部連日皮下投予，測定24小時後之各個 體CRP濃度。WT及F2H/L39投子時之CRP濃度變化如圖36。 為了評價長尾獼猴可溶型IL-6受體中和程度等的藥效，測定長尾獼猴血漿中之非結合型長尾獼猴可溶型IL-6受體濃度。WT及F2H/L39投予時之非結合型長尾獼猴可溶型IL-6受體濃度變化，如圖37所示。

從該等結果，WT與PF1顯示大致同等血漿中濃度變化，相對於此，pI更降低之F2H/L39-IgG1，較該等，抗體血漿中濃度維持為高的。又，發現相對於IL-6受體之親和性強的F2H/L39-IgG1，相較於WT，CRP濃度及非結合型長尾獼猴可溶型IL-6受體濃度維持在較低。

[實施例14]WT-M14之血漿中滯留性評價 人類之中血漿中滯留性之預測方法

IgG分子之血漿中滯留性長(消失慢)，已知係作為IgG分子之廢物利用受體的FcRn作用的原故(Nat Rev Immunol.2007 Sep；7(9)：715-25)。利用胞飲進入食物小胞(endosome)之IgG分子，於食物小胞內之酸性條件下(pH6.0附近)，會與食物小胞內表現之FcRn結合。未能與FcRn結合之IgG分子，進入溶酶體，於溶酶體被分解，但，結合於FcRn之IgG分子往細胞表面移動，於血漿中之中性條件下(pH7.4附近)，藉由從FcRn解離，而再返回血漿中。

IgG型抗體已知IgG1、IgG2、IgG3、IgG4之同種異構型，該等於人類之血漿中半衰期，據報告IgG1、IgG2約36日、IgG3約29日、IgG4為16日(Nat Biotechnol.2007 Dec；25(12)：1369-72.)，IgG1及IgG2於血漿中滯留性被 認為最長。一般而言，抗體醫藥之同種異構型為IgG1、IgG2、IgG4，就使該等IgG抗體之血漿中滯留性進一步提升之方法，據報告有藉由將IgG之固定區域序列改變，而使對於上述人類FcRn之結合活性提升之方法(J Biol Chem.2007 Jan 19；282(3)：1709-17、J Immunol.2006 Jan 1；176(1)：346-56)。

小鼠FcRn與人類FcRn由於存在種差(Proc Natl Acad Sci U S A.2006 Dec 5；103(49)：18709-14)，為了預測固定區域之序列經改變之IgG抗體於人類之血漿中滯留性，希望進行對於人類FcRn之結合評價，及人類FcRn基因轉殖小鼠中，血漿中滯留性評價(Int Immunol.2006 Dec；18(12)：1759-69)。

對於人類FcRn之結合評價

FcRn為FcRn與β 2-微球蛋白之複合體。依據公開的人類FcRn基因序列(J.Exp.Med.180(6)、2377-2381(1994))，製作寡DNA引子。以人類cDNA(Human Placenta Marathon-Ready cDNA、Clontech)為模板，使用已製作的引子，以PCR法製備編碼為基因全長之DNA片段。以得到之DNA片段為模板，以PCR法將編碼為含訊號區域之細胞外區域(Met1-Leu290)的DNA片段，插入到動物細胞表現載體(人類FcRn胺基酸序列 序列識別號：140)。同樣地，依照公開的人類β 2-微球蛋白基因序列(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(26)、16899-16903(2002))，製作寡DNA引子。以人類cDNA(Hu-Placenta Marathon-Ready cDNA、 CLONTECH)為模板，使用製作的引子，以PCR法製備編碼為基因全長之DNA片段。以得到之DNA片段為模板、以PCR法將編碼為含訊號區域之β 2-微球蛋白全長(Met1-Met119)的DNA片段放大，插入到動物細胞表現載體(人類β 2-微球蛋白胺基酸序列 序列識別號：141)。

可溶型人類FcRn表現依以下步驟進行。將製備的人類FcRn及人類β 2-微球蛋白的質體，依使用10%胎牛血清(Invitrogen)的脂質轉染法法，導入到人類胎兒腎癌細胞由來HEK293H株(Invitrogen)之細胞。回收得到之培養上清後，使用IgG Sepharose 6 Fast Flow(Amersham Biosciences)，依照(J Immunol.2002 Nov 1；169(9)：5171-80.)之方法進行精製。之後，以HiTrap Q HP(GE Healthcare)精製。

對於人類FcRn之結合評價，使用Biacore 3000，依照使結合於固定於感應晶片之Protein L或兔抗人類IgG Kappa鏈抗體之抗體，與作為分析物之人類FcRn交互作用時之人類FcRn結合量，計算親和性(KD)。具體而言，電泳緩衝液使用含150mM NaCl之50mM Na-磷酸鹽緩衝液，使用pH6.0，以胺偶合法在感應晶片CM5(BIACORE)固定化Protein L或兔抗人類IgG Kappa鏈抗體。之後，將抗體以含0.02% Tween20之電泳緩衝液稀釋並注射，使抗體結合於晶片後，注射人類FcRn，評價人類FcRn對於抗體之結合活性[0]。

親和性計算，使用軟體BIAevaluation。從得到之感 應圖形，求出人類FcRn注射即將結束前對於抗體之hFcRn結合量，將此等以穩態親和性法擬合(fitting)，計算抗體對於人類FcRn之親和性。

人類FcRn基因轉殖小鼠之中血漿中滯留性之評價

人類FcRn基因轉殖小鼠(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 276 +/+ 小鼠、Jackson Laboratories)之中，體內動態之評價如以下進行。將抗體對小鼠以1mg/kg之投予量對靜脈內單次投予，並適時採血。採取之血液立即於4℃、15,000rpm進行15分鐘離心分離，得血漿。分離的血漿，保存在設定為-20℃以下之冷凍庫，直到實施測定為止。血漿中濃度使用ELISA法測定。

WT-M14於人類之血漿中滯留性之預測評價

WT-IgG1與WT-M14對於人類FcRn之結合活性評價，以BIAcore進行，結果如表12所示，WT-M14之結合活性僅稍優於WT-IgG1。

然而，進行WT-IgG1與WT-M14在人類FcRn基因轉殖小鼠之中血漿中滯留性評價，結果圖38所示，WT-IgG1與WT-M14呈現同等血漿中滯留性，但是M14之固定區域，在人類亦與IgG1之固定區域呈現同等血漿中滯留性。

[實施例15]使血漿中滯留性提升之WT-M44、WT-M58、WT-M73之製作 WT-M58分子之製作

如實施例14所示，WT-M14於人類FcRn基因轉殖小鼠之血漿中滯留性，與WT-IgG1同等。使血漿中滯留性提升之方法，已知使抗體之等電點降低之方法及使對於FcRn之結合活性增強之方法，但為了使WT-M14於血漿中滯留性提升，導入以下改變。具體而言，實施例4中，將從WT-M14製作之WT-M31△GK之EU編號397號之纈胺酸改變為甲硫胺酸，268號組胺酸改變為谷醯胺酸，355號精胺酸改變為谷醯胺酸，419號谷醯胺酸改變為谷胺酸。使該等4處之改變對於WT-M31△GK導入，製作WT-M58(序列識別號：142(胺基酸序列))。表現載體之製作，以實施例1之方法製作，使用WT-M58為H鏈，使用L(WT)為L鏈，依實施例1所記載方法進行WT-M58表現‧精製。

WT-M73分子之製作

另一方面，相對於IgG1，製作將EU編號：434號置換為丙胺酸之WT-M44(序列識別號：143(胺基酸序列))。再者對於M44為使H鏈C末端之異質性減低，製作使446號之甘胺酸及447號之離胺酸欠缺之WT-M83(序列識別號：185(胺基酸序列))。又，相對於WT-M58，製作使EU編號：434號置換為丙胺酸之WT-M73(序列識別號：144(胺基酸序列))。

該等表現載體之製作，以實施例1之方法製作，H鏈使用WT-M44或WT-M58或WT-M73，L鏈使用L(WT)，以實施例1所記載方法進行WT-M44及WT-M58及WT-M73表現‧ 精製。

WT-M44、WT-M58、WT-M73於人類之中血漿中滯留性之預測評價

WT-IgG1、WT-M44、WT-M58及WT-M73對於人類FcRn之結合活性評價，以BIAcore進行之結果，如表13所示，WT-M44、WT-M58及WT-M73之結合活性相較於WT-IgG1，各約2.7倍、約1.4倍及約3.8倍優異。

WT-IgG1、WT-M44、及WT-M58於人類FcRn基因轉殖小鼠之中血漿中滯留性評價之結果，如圖39所示，確認WT-M58相較於WT-IgG1及WT-M44，血漿中滯留性提升。再者，WT-IgG1、WT-M44、WT-M58及WT-M73於人類FcRn基因轉殖小鼠之中血漿中滯留性評價結果，如圖40所示，確認WT-M44、WT-M58及WT-M73均相較於WT-IgG1，血漿中滯留性改善，其血漿中滯留性之改善效果相關於對於人類FcRn之結合能力。其中，關於WT-M73，相較於WT-IgG1於28日後之血漿中濃度改善約16倍，因此可認為，人類中亦為具M73之固定區域的抗體，相較於具IgG1之固定區域的抗體，血漿中滯留性大幅提升。

[實施例16]利用各種抗體之新穎固定區域M14及M58所為之異質性減低效果

如實施例8所示，藉由將抗IL-6受體抗體人類化PM1抗體(WT)中，固定區域從IgG2變換為M14，確認能使IgG2之鉸鏈區域由來之異質性減低。所以，除了人類化PM1抗體以外，亦對於IgG2型抗體，探討是否藉由將固定區域變換為M14或M58能使異質性減低。

人類化PM1抗體以外之抗體，使用抗IL-6受體抗體F2H/L39(F2H/L39_VH胺基酸序列 序列識別號：145、F2H/L39 VL胺基酸序列 序列識別號：146)、抗IL-31受體抗體H0L0(H0L0_VH胺基酸序列 序列識別號：147、H0L0_VL胺基酸序列 序列識別號：148)、抗RANKL抗體DNS(DNS_VH胺基酸序列 序列識別號：149、DNS_VL胺基酸序列 序列識別號：150)。相對於此等抗體，製作固定區域為IgG1(序列識別號：19)、IgG2(序列識別號：20)及M14(序列識別號：24)或M58(序列識別號：151)者。

異質性之評價方法，利用陽離子交換層析進行評價。製作抗體之異質性評價，使用ProPac WCX-10(Dionex)為管柱，移動相A使用20mM乙酸鈉、pH5.0、移動相B使用20mM乙酸鈉、1M NaCl、pH5.0，使用適當流速及梯度實施。陽離子交換層析(IEC)所為評價結果，如圖41所示。

如圖41所示，不僅抗IL-6受體抗體人類化PM1抗體(WT)，抗IL-6受體抗體F2H/L39、抗IL-31受體抗體H0L0、抗RANKL抗體DNS，亦為藉由使固定區域從IgG1變換成IgG2，異質性增大，藉由固定區域變換為M14或M58，確認在任一抗體中，使異質性減低。藉此，藉由使H鏈之CH1 結構域存在之EU編號131號之半胱胺酸及H鏈之上部鉸鏈存在之EU編號219號之半胱胺酸改變為絲胺酸，則不論可變區域之抗體序列及抗原種類，能使天然型IgG2由來之異質性減低。

[實施例17]利用各種抗體之新穎固定區域M58所為之血漿中滯留性改善效果

如實施例15所示，藉由將抗IL-6受體抗體人類化PM1抗體(WT)中，固定區域從IgG1變換為M58，發現對於人類FcRn之結合活性提升，且人類FcRn基因轉殖小鼠中，血漿中滯留性提升。所以，對於人類化PM1抗體以外之IgG1抗體，亦探討藉由將固定區域變換為M58，是否能使血漿中滯留性提升。

人類化PM1抗體(WT)以外之抗體，使用抗IL-31受體抗體H0L0(H0L0_VH胺基酸序列 序列識別號：147、H0L0_VL胺基酸序列 序列識別號：148)、抗RANKL抗體DNS(DNS_VH胺基酸序列 序列識別號：149、DNS_VL胺基酸序列 序列識別號：150)。對於各抗體，製作固定區域為IgG1(序列識別號：19)及M58(序列識別號：151)者，依照實施例14所示方法，評價對於人類FcRn之結合活性。 其結果如表14所示。

如表14所示，抗IL-31受體抗體H0L0、抗RANKL抗體DNS中，亦為藉由使固定區域從IgG1變換為M58，確認與抗IL-6受體抗體WT同樣，對於人類FcRn之結合活性提升。藉此，不論可變區域之抗體序列及抗原之種類，藉由使固定區域從IgG1變換為M58，顯示人類之血漿中滯留性可提升。

[實施例18]CH1結構域之半胱胺酸對於異質性及安定性之影響

如實施例8所示，為了使天然型IgG2之異質性減低，將IgG2之鉸鏈部分之半胱胺酸及CH1結構域存在之半胱胺酸進行改變。各種改變體之探討結果，發現：藉由將野生型IgG2固定區域序列之中，H鏈之CH1結構域存在之EU編號131號之半胱胺酸及133號之精胺酸，分別改變為絲胺酸及離胺酸，將H鏈之上部鉸鏈存在之EU編號219號半胱胺酸改變為絲胺酸之固定區域SKSC(序列識別號：154)，能使安定性不降低，而減低異質性。

另一方面，就使異質性減低之方法，考慮僅將H鏈之上部鉸鏈存在之EU編號219號之半胱胺酸改變為絲胺酸之方法及僅使220號之半胱胺酸改變為絲胺酸之方法。製作 具IgG2之EU編號219號之半胱胺酸改變為絲胺酸之固定區域SC(序列識別號：155)及IgG2之EU編號220號之半胱胺酸改變為絲胺酸之固定區域CS(序列識別號：156)之固定區域的WT-SC(序列識別號：157)及WT-CS(序列識別號：158)，並進行WT-IgG1、WT-IgG2、WT-SKSC及WT-M58的異質性及熱安定性比較。又，就WT以外之抗體而言，對於相異之抗IL-6受體抗體F2H/L39(F2H/L39_VH胺基酸序列 序列識別號：145、F2H/L39_VL胺基酸序列 序列識別號：146)，製作固定區域分別為IgG1(序列識別號：19)、IgG2(序列識別號：20)、SC(序列識別號：155)、CS(序列識別號：156)、SKSC(序列識別號：154)、M14(序列識別號：24)之F2H/L39-IgG1、F2H/L39-IgG2、F2H/L39-SC、F2H/L39-CS、F2H/L39-SKSC、F2H/L39-M14，比較異質性及安定性。

WT-IgG1、WT-IgG2、WT-SC、WT-CS、WT-SKSC、WT-M58及F2H/L39-IgG1、F2H/L39-IgG2、F2H/L39-SC、F2H/L39-CS、F2H/L39-SKSC、F2H/L39-M14之異質性評價方法，利用陽離子交換層析進行評價。管柱使用ProPac WCX-10(Dionex)，移動相A使用20mM乙酸鈉、pH5.0，移動相B使用20mM乙酸鈉、1M NaCl、pH5.0，使用適當流量及梯度實施。利用陽離子交換層析所為之評價結果如圖42所示。

其結果，如圖42所示，WT與F2H/L39均為藉由使固定區域從IgG1變換為IgG2，異質性增大，但是藉由使固 定區域變換為SKSC及M14或M58，異質性大幅減低。另一方面，固定區域為SC時，與固定區域為SKSC時同樣地，異質性大幅減低，但是固定區域為CS時，異質性未充分改善。

一般而言，為了開發抗體為醫藥品，除希望異質性少，為了製備安定製劑，希望具高安定性。所以就安定性之評價方法，利用差示掃描型熱量測定(DSC)進行熱變性中間溫度(Tm值)評價(VP-DSC、Microcal公司製)。熱變性中間溫度(Tm值)為安定性之指標，為了製作安定製劑作為醫藥品，希望熱變性中間溫度(Tm值)高(J Pharm Sci.2008 Apr；97(4)：1414-26.)。將WT-IgG1、WT-IgG2、WT-SC、WT-CS、WT-SKSC、WT-M58對於20mM乙酸鈉、150mM NaCl、pH6.0之溶液進行透析(EasySEP、TOMY)，以約0.1mg/Ml之蛋白質濃度，從40℃至100℃，以1℃/min之升溫速度進行DSC測定。得到之DSC變性曲線如圖43，Fab部分之Tm值如以下表15所示。

WT-IgG1及WT-IgG2之Tm值大致同等，約94℃(IgG2低約1℃)，相對於此，WT-SC及WT-CS之Tm值約86℃，相較於WT-IgG1及WT-IgG2，顯著Tm值降低。另一方面， WT-M58、WT-SKSC之Tm值約94℃、大致與WT-IgG1及WT-IgG2同等。WT-SC及WT-CS安定性相較於IgG2，顯著低，因此為了開發為醫藥品，考慮CH1結構域之半胱胺酸亦改變為絲胺酸之WT-SKSC及WT-M58較佳。WT-SC及WT-CS之Tm值，相較於IgG2大幅降低之理由，認為是WT-SC及WT-CS與IgG2之雙硫鍵樣式採相異樣式的原故。

又，比較DSC變性曲線時，WT-IgG1、WT-SKSC、WT-M58之Fab部分之變性峰部尖銳且單一，相對於此，WT-SC及WT-CS與該等比較，Fab部分之變性峰部寬廣、WT-IgG2在Fab部分之變性峰部之低溫側認為有肩峰部。據認為：DSC之變性峰部為單一成分之情形，通常顯示尖銳變性峰部，但當存在Tm相異之複數成分(即異質性)時，變性峰部成為寬廣。亦即，暗示WT-IgG2、WT-SC及WT-CS有複數成分存在，WT-SC及WT-CS，天然型IgG2之異質性未充分減低。 由此，可認為野生型IgG2之異質性不僅是與鉸鏈部分之半胱胺酸，而與存在於CH1結構域之半胱胺酸兩者相關，為了使DSC上之異質性減低，不僅鉸鏈部分之半胱胺酸，CH1結構域之半胱胺酸也必需改變。又，如上所述，不僅鉸鏈部分之半胱胺酸，藉由改變CH1結構域之半胱胺酸，才能具與野生型IgG2同等安定性。

由以上，發現：就使IgG2之鉸鏈區域由來之異質性減低之固定區域而言，認為僅將鉸鏈部分之半胱胺酸置換為絲胺酸之固定區域SC與CS，在異質性及安定性之觀點不充足，除了鉸鏈部分之半胱胺酸，亦將CH1結構域存在之 EU編號131號之半胱胺酸置換為絲胺酸，才能維持與IgG2同等安定性且使異質性大幅減低。如此的固定區域，例如上述M14、M31、M58、M73等，尤其，M58及M73使血漿中滯留性提升且安定性高、使異質性減低，因此認為作為抗體醫藥品之固定區域非常有用。

[實施例19]PK/PD改善之完全人類化IL-6受體抗體之製作

為了製作相對於TOCILIZUMAB(H鏈WT-IgG1(序列識別號：15)、L鏈WT(序列識別號：105))，PK/PD改善之完全人類化IL-6受體抗體，如以下所示製作分子。

為了F2H-IgG1之ka提升，進行實施例2得到之親和性增強之改變、35號之色胺酸置換為纈胺酸、及50號酪胺酸置換為苯丙胺酸、62號絲胺酸置換為蘇胺酸。又，為了不使免疫原性風險上升而使pI降低，進行102號酪胺酸置換為纈胺酸、105號谷醯胺酸置換為谷胺酸、107號之異白胺酸置換為蘇胺酸，並就固定區域從IgG1置換為M83者，製作VH5-M83(序列識別號：138(胺基酸序列))。又，為了L39之ka提升，製作27號谷胺酸置換為谷醯胺酸之VL5-kappa(序列識別號：181(胺基酸序列))。再者，製作上述實施例發現之TOCILIZUMAB之可變區域及固定區域之變異及新發現之變異予以複數組合的TOCILIZUMAB改變體，實施各種篩選，結果就完全人類化IL-6受體抗體而言，發現Fv3-M73(H鏈VH4-M73序列識別號：182、L鏈VL1-kappa序列識別號：183)、Fv4-M73(H鏈VH3-M73序列識別號：180、L鏈VL3-kappa序列識別 號：181)、Fv5-M83(H鏈VH5-M83序列識別號：139、L鏈VL5-kappa序列識別號：138)。

製作的Fv3-M73、Fv4-M73、及Fv5-M83對於IL-6受體之親和性，與TOCILIZUMAB比較(方法參考參考例)。測定該等抗體對於IL-6受體之親和性結果，如表16所示。 又，BaF/gp130之中和活性，與TOCILIZUMAB及控制組(參考例之公知高親和性高IL-6受體抗體、US 2007/0280945之VQ8F11-21 hIgG1)比較(方法參考參考例)。該等抗體之利用BaF/gp130測定生物活性之結果，如圖44(IL-6終濃度300ng/mL：TOCILIZUMAB、控制組、Fv5-M83)及圖45(IL-6終濃度30ng/mL：TOCILIZUMAB、Fv3-M73、Fv4-M73)所示。如表16所示，Fv3-M73、Fv4-M73相較於TOCILIZUMAB，具約2~3倍強的親和性，Fv5-M83相較於TOCILIZUMAB，顯示約100倍強的親和性(Fv5-M83由於親和性測定困難，使用固定區域為IgG1之Fv5-IgG1測定親和性，固定區域一般而言認為不影響親和性)。又，圖45所示Fv3-M73、Fv4-M73，相較於TOCILIZUMAB顯示稍強活性，圖44所示Fv5-M83與TOCILIZUMAB比較，就50%抑制濃度顯示100倍以上之極強活性，且相較於公知高親和性高IL-6受體抗體控制組，亦就50%抑制濃度而言，顯示約10倍之高中和活性。

TOCILIZUMAB、控制組、Fv3-M73、Fv4-M73、及Fv5-M83之等電點，依照該技術領域中具通常知識者公知方法，以等電點電泳測定之結果，TOCILIZUMAB之等電點約9.3、控制組約8.4~8.5、Fv3-M73約5.7~5.8、Fv4-M73約5.6~5.7、Fv5-M83為5.4~5.5，任一抗體相較於TOCILIZUMAB及控制組，等電點均大幅降低。又，以GENETYX(GENETYX CORPORATION)計算可變區域VH/VL之理論等電點，結果TOCILIZUMAB之理論等電點為9.20、控制組為7.79、Fv3-M73為5.49、Fv4-M73為5.01、Fv5-M83為4.27，任一抗體相較於TOCILIZUMAB及控制組，等電點均大幅降低。因此，可認為Fv3-M73、Fv4-M73、及Fv5-M83相較於TOCILIZUMAB及控制組，血漿中滯留性提升。

TOCILIZUMAB、Fv3-M73、Fv4-M73、及Fv5-M83之可變區域序列存在之T細胞抗原決定基，使用TEPITOPE(Methods.2004 Dec；34(4)：468-75)解析。其結果，預測TOCILIZUMAB有多數序列存在與HLA結合之T細胞抗原決定基，但是，預測Fv3-M73、Fv4-M73、及Fv5-M83與T細胞抗原決定基結合之序列大幅減少。又，Fv3-M73、Fv4-M73、及Fv5-M83的框架不殘存小鼠序列，完全人類 化。由該等，暗示Fv3-M73、Fv4-M73、及Fv5-M83之免疫原性，相較於TOCILIZUMAB，免疫原性風險可能大幅減低。

[實施例20]完全人類化IL-6受體抗體之猴PK/PD試驗

TOCILIZUMAB、控制組、Fv3-M73、Fv4-M73、及Fv5-M83，對於長尾獼猴，以1mg/kg以靜脈內進行單次投予，評價血漿中濃度變化(方法參考參考例)。TOCILIZUMAB、Fv3-M73、Fv4-M73、及Fv5-M83於靜脈內投予後之血漿中濃度變化，如圖46所示。其結果，Fv3-M73、Fv4-M73、及Fv5-M83均相較於TOCILIZUMAB及控制組，在長尾獼猴中，血漿中滯留性大幅改善。其中，Fv3-M73與Fv4-M73之血漿中滯留性，相較於TOCILIZUMAB大幅改善。

為了評價長尾獼猴膜型IL-6受體中和程度的藥效評價，關於抗體投予，自第6日至18日(關於TOCILIZUMAB，為第3日至10日目)，對於長尾獼猴IL-6以5μg/kg對於腰背部連日皮下投予，測定24小時後各個體之CRP濃度(方法參考參考例)。各抗體投予時之CRP濃度變化如圖47所示。為了評價長尾獼猴可溶型IL-6受體中和程度的藥效，測定長尾獼猴血漿中，非結合型長尾獼猴可溶型IL-6受體濃度，計算可溶型IL-6受體之中和率(方法參考參考例)。各抗體投予時之可溶型IL-6受體之中和率之變化，如圖48所示。

Fv3-M73、Fv4-M73、及Fv5-M83，均相較於TOCILIZUMAB及公知高親和性抗IL-6受體抗體控制組，將長尾獼猴膜型IL-6受體更持續中和，長期間抑制CRP之增加。又， Fv3-M73、Fv4-M73、及Fv5-M83，均相較於TOCILIZUMAB及控制組，將長尾獼猴可溶型IL-6受體更持續中和，長期間抑制非結合型長尾獼猴可溶型IL-6受體之增加。藉此，關於膜型IL-6受體及可溶型IL-6受體之中和持續性，發現Fv3-M73、Fv4-M73、及Fv5-M83均較TOCILIZUMAB及控制組更優異。其中，Fv3-M73與Fv4-M73之中和持續性極優異。另一方面，Fv5-M83相較於Fv3-M73及Fv4-M73，CRP及非結合型長尾獼猴可溶型IL-6受體抑制地較低，因此，可考慮Fv5-M83相較於Fv3-M73及Fv4-M73及公知高親和性抗IL-6受體抗體控制組，能將膜型IL-6受體及可溶型IL-6受體更強力中和。此可認為，Fv5-M83相較於控制組，對於IL-6受體之親和性強，且BaF/gp130之中生物活性強之情事，在長尾獼猴體內反映之結果。

由該等，發現：相較於TOCILIZUMAB及控制組，Fv3-M73及Fv4-M73作為抗IL-6受體中和抗體作用之持續性極優異，能使投予頻度及投予量大幅減低，又，Fv5-M83作為抗IL-6受體中和抗體之作用強度極優異，且作用之持續性亦優異。因此，可認為Fv3-M73、Fv4-M73、及Fv5-M83作為IL-6拮抗劑形式之醫藥品有用。

[參考例] 重組長尾獼猴可溶型IL-6受體(cIL-6R)之製備

依據公開的普通獼猴(學名Macacamulatta)IL-6受體基因序列(Birney et al、Ensembl 2006、Nucleic Acids Res.2006 Jan 1；34(Database issue)：D556-61.)，製作 寡DNA引子，以從長尾獼猴胰臟製備之cDNA為模板，使用引子，以PCR法製備編碼為長尾獼猴IL-6受體基因全長之DNA片段。將得到之DNA片段插入到動物細胞表現載體，使用此等製作CHO固定表現株(cyno.sIL-6R生產CHO細胞)。將cyno.sIL-6R生產CHO細胞之培養液以HisTrap管柱(GEHealthcarebioscience)精製後，使用Amicon Ultra-15 Ultracel-10k(Millipore)濃縮，以Superdex200pg16/60凝膠過濾管柱(GEHealthcarebioscience)進一步精製，成為可溶型長尾獼猴IL-6受體(以下、cIL-6R)之最終精製品。

重組長尾獼猴IL-6(cIL-6)之製備

長尾獼猴IL-6如以下製備。製作編碼為登錄SWISSPROT Accession No.P79341之212胺基酸的鹼基序列，選殖到動物細胞表現載體，導入於CHO細胞，製作固定表現細胞株(cyno.IL-6生產CHO細胞)。將cyno.IL-6生產CHO細胞培養液以SP-Sepharose/FF管柱(GEHealthcarebioscience)精製後，使用Amicon Ultra-15 Ultracel-5k(Millipore)濃縮，以Superdex75pg26/60凝膠過濾管柱(GEHealthcarebioscience)進一步精製，使用Amicon Ultra-15 Ultracel-5k(Millipore)濃縮，成為長尾獼猴IL-6(以下、cIL-6)之最終精製品。

公知高親和性抗IL-6受體抗體之製作

就公知高親和性抗IL-6受體抗體而言，為了使US 2007/0280945 A1所記載之高親和性抗IL-6受體抗體 VQ8F11-21 hIgG1(US 2007/0280945 A1、H鏈胺基酸序列：序列識別號：19、L鏈胺基酸序列：序列識別號：27)表現，構建動物細胞表現用載體。關於抗體可變區域，使用組合合成寡DNA之PCR法(assembly PCR)製作，關於固定區域使用IgG1。以Assembly PCR法使抗體可變區域及固定區域結合，插入到動物表現用載體，製作目的之H鏈表現載體及L鏈表現載體。得到之表現載體之鹼基序列，以該技術領域中具通常知識者公知方法決定。使用製作的表現載體，進行表現‧精製。表現‧精製依實施例1所記載方法進行，得高親和性抗IL-6受體抗體(以下記載成控制組)。

利用Biacore所為對於IL-6受體之結合評價

使用Biacore T100(GE Healthcare)，進行抗原抗體反應之速度論的解析。於感應晶片上，以胺偶合法將抗IgG(γ-鏈專一性)F(ab’)₂固定適當量，其次，於pH7.4，使目的抗體結合，再於pH7.4中，將調整為各種濃度之IL-6受體SR344作為分析物流動，測定抗體與SR344之交互作用。測定均在37℃實施。從測定得到之感應圖形，計算動力學參數即結合速度常數k_a(1/Ms)、及解離速度常數k_d(1/s)，依據此值，計算K_D(M)。各參數計算，使用Biacore T100 Evaluation軟體(GE Healthcare)。

利用猴PK/PD試驗所為抗體血漿中濃度、CRP濃度、非結合型可溶型IL-6受體之測定

長尾獼猴血漿中濃度測定，以ELISA法，利用該技術領域中具通常知識者公知方法測定。 CRP濃度，係於Cyas R CRP(關東化學股份有限公司)，使用自動分析裝置(TBA-120FR、東芝Medical Systems股份有限公司)測定。

長尾獼猴血漿中之非結合型長尾獼猴可溶型IL-6受體濃度，如以下測定。使長尾獼猴之血漿30μL於0.22μm之濾杯(Millipore)中，添加到經乾燥之適量rProtein A Sepharose Fast Flow(GE Healthcare)樹脂，藉此使血漿存在的所有IgG型抗體(長尾獼猴IgG、抗人類IL-6受體抗體及抗人類IL-6受體抗體-長尾獼猴可溶型IL-6受體複合體)吸附於ProteinA。之後，以高速離心機旋轉沉降，將通過溶液回收。通過溶液不含結合於proteinA之抗人類IL-6受體抗體-長尾獼猴可溶型IL-6受體複合體，因此，藉由測定proteinA通過溶液中，長尾獼猴可溶型IL-6受體濃度，能測定非結合型之可溶型IL-6受體濃度。長尾獼猴可溶型IL-6受體濃度，使用上述製作之長尾獼猴可溶型IL-6受體(cIL-6R)為標準，以測定人類IL-6受體濃度之該技術領域中具通常知識者公知方法測定。可溶型IL-6受體之中和率，依以下計算式計算。

(抗體投予後之非結合型之可溶性IL-6受體濃度÷抗體投予前之可溶性IL-6受體濃度)×100

〔實施例21〕 (1)人類化H0L0抗體之點變異基因之製作

以WO2006/046751揭示之編碼為含人類化GC33抗體之CDR的Glypican3抗體的基因為出發材料，製作各種點變 異基因。依據含改變部位之順鏈及逆鏈之序列，合成經設計的寡DNA。使用市售QuikChange點突變套組(Stratagene)，製作複數點變異基因。點變異基因之製作，依以下條件，以PCR法實施。將10ng模板質體、10pmol順鏈及逆鏈之合成寡DNA，及套組所附10x緩衝液、dNTP mix及Pfu turbo DNA聚合酶所構成之反應混合物，於95℃加熱30秒後，實施以95℃ 30秒、55℃ 1分鐘、68℃ 4分鐘所構成之PCR反應週期18次。將套組所附DpnI添加到反應混合物後，於37℃繼續以限制酵素進行之限制消化反應1小時。利用該反應液使DH5 α勝任細胞(TOYOBO)轉形之結果，得轉形體。依據從該轉形體單離之質體DNA之鹼基序列決定，確認已導入點變異之點變異基因，預先轉殖到動物細胞中可表現插入基因之表現載體中。改變基因，依據具以下構成之改變取得。

人類化H0L0抗體及其點變異改變抗體之暫時性表現，依照使用聚乙二亞胺(Polysciences Inc.)之暫時性表現實施。將經胰蛋白酶EDTA(Invitrogen)剝離之HEK293細胞，接種到10cm²培養皿使為6 x 10⁶cells/10mL。次日，對於4.6μg之H鏈表現質體DNA及9.2μg之L鏈表現質體DNA，加入690μl之SFMII培養基及20.8μg之Polyetyleneimine混合後，將該混合液於室溫靜置10分鐘。將混合液全量，滴入於HEK293細胞經前述記載接種之培養皿。約72小時後，從回收的培養上清，使用rProteinA sepharoseTM Fast Flow(GE Healthcare)，依實驗步驟手 冊實施表現之人類化H0L0抗體及其點變異改變抗體之精製。

(1-1)人類化H0L0抗體之Tm值之改變

熱變性中間溫度(Tm)，由經一定程式化加熱速度將受試試樣溶液加熱後得到之熱譜(Cp對T)中，變性峰部之頂點決定。DSC測定用試樣溶液之製備，依以下方式實施，藉此測定人類化H0L0抗體之Tm值。首先，以含150mmol/l氯化鈉之20mol/l乙酸鈉緩衝溶液(pH6.0)為透析外液，將密封到透析膜之50-100μg相當量抗體溶液供透析一晝夜。之後，使用透析外液，將其抗體濃度製備為50-100μg/ml之試樣溶液作為DSC測定用試樣溶液使用。

適當DSC裝置例如DSC-II(Calorimetry Sciences Corporation)，可適當應用在本實驗。以前述方法製備之試樣溶液及參考溶液(透析外液)充分脱氣後，將各受試檢體密封到熱量計小室，於40℃進行熱充分平衡化。其次，DSC掃描於40℃~100℃，以約1K/分之掃描速度進行。該測定結果，就溫度函數而言之變性峰部頂點表示。參考非專利文獻(Rodolfo等人、Immunology Letters(1999)、47-52)，進行Fab結構域之峰部指定，計算人類化H0L0抗體之熱變性中間溫度。就具體例而言，Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗體之DSC(示差掃描熱量計)測定得到之圖表如圖49所例示。

依據前述記載方法之計算，序列識別號195表示之H鏈及序列識別號201表示之L鏈所構成之人類化H0L0抗體 之Tm值為76.6℃，例示既有抗體之Synagis及Herceptin之Tm值，各計測為85.4℃及81.8℃。因此，顯示人類化H0L0抗體之Tm值較既存抗體為低。

所以，為了使該Tm值提升，製作人類化H0L0抗體之改變抗體。製作對序列識別號195表示之H0L0抗體之H鏈FR2，施以將該VH1b次類改變為VH4次類之V37I、A40P、M48I、L51I之改變的H15(序列識別號196)。其Tm值改善為79.1℃。製作序列識別號201表示之H0L0抗體之L鏈FR2從VK2改變為VK3次類之L42Q、S48A、Q50R之改變，及FR1之V2置換為生殖細胞系列序列I之V2I之改變而得的L4(序列識別號202)。其Tm值改善為77.2℃。此2個改變體組合的H15L4抗體之Tm值，改善為80.5℃。

(1-2)人類化H0L0抗體之pI值之改變

由於抗體具有之pI值減少，抗體之血中半衰期伸長。反之，由於抗體之pI值增大，抗體之組織移動性改善。發揮對抗癌治療之效果的抗體之pI值增加或減少任一者，並不明瞭是否會帶來腫瘤抑制效果之增強。所以，製作pI值減少之人類化H0L0抗體之改變抗體及pI值增加之人類化H0L0抗體之改變抗體，比較探討兩者抗腫瘤效果，驗證哪一改變能帶來高腫瘤抑制效果。

各抗體之pI值依據等電點電泳所為之分析計算。該電泳如下進行。使用Phastsystem Cassette(AmerchamBioscience公司製)，以具下列組成之膨潤液，使Phast-Gel Dry IEF(AmerchamBioscience)凝膠膨潤約 60分鐘。

(a)高pI用膨潤液之組成：1.5ml之10%甘油

IEF用之100μlPharmalyte 8-10.5

(AmerchamBioscience)

(b)低pI用之膨潤液之組成：1.5ml之精製水

IEF用之20μlPharmalyte 8-10.5(AmerchamBioscience)

IEF用之80μlPharmalyte 5-8(AmerchamBioscience)

將約0.5μg之抗體施用到經膨潤之凝膠，以如下程式控制的PhastSystem(AmerchamBioscience)，進行等電點電泳。樣本在下述程式之中，步驟2的階段添加到凝膠。

pI標記，使用pI用校正套組(AmerchamBioscience)。

步驟1：2000V、2.5mA、3.5W、15℃、75Vh

步驟2：200V、2.5mA、3.5W、15℃、15Vh

步驟3：2000V、2.5mA、3.5W、15℃、410Vh

電泳後之凝膠以20% TCA固定化後，使用銀染色套組、protein(AmerchamBioscience)，依照套組所附實驗步驟手冊，進行銀染色。染色後，依據pI標記具有之既知等電點，計算受試試樣各抗體之等電點。圖50及圖51各顯示高pI等電點電泳之電泳像及低pI等電點電泳之電泳像。

(a)pI值增加之改變

製作對於H15進一步施加Q43K、D52N、Q107R之改變的Hspu2.2(Hu2.2)(序列識別號200)。又，製作對於L4將 E17Q、Q27R、Q105R、及CDR2之S25於生殖細胞系列置換為多A之S25A之改變的Lspu2.2(Lu2.2)(序列識別號206)。Hspu2.2(Hu2.2)及Lspu2.2(Lu2.2)所構成之抗體Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗體之Tm值，計測為76.8℃，pI值計測為9.6。H0L0抗體之pI值為8.9，因此Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗體之pI值增大0.7。

(b)pI值減少之改變

製作對於H15進一步施加K19T、Q43E、K63S、K65Q、G66D之改變的Hspd1.8(Hd1.8)(序列識別號199)。製作對於L4施加Q27E之改變，將構成L4之FR3之79-84之序列KISRVE改變為TISSLQ，對於Lspu2.2(Lu2.2)之改變同樣地施加S25A之改變的Lspd1.6(Ld1.6)(序列識別號205)。 Hspd1.8(Hd1.8)及Lspd1.6(Ld1.6)所構成之抗體Hspd1.8Lspd1.6(Hd1.8Ld1.6)抗體Tm值，計測為72.6℃，pI值計測為7.4。H0L0抗體之pI值為8.9，因此Hspd1.8Lspd1.6(Hd1.8Ld1.6)抗體之pI值減少1.5。

(2)利用競爭ELISA所為H0L0抗體之點變異改變抗體之結合活性之評價

將(1)精製之H0L0抗體及其點變異改變抗體利用競爭ELISA進行評價。將製備為1μg/ml之可溶型GPC3核多胜肽(序列識別號207)，添加在96孔平盤使每井100μl。該平盤於4℃靜置整夜，將可溶型GPC3核多胜肽固相化於該平盤。將固相化在該平盤之可溶型GPC3核多胜肽，使用Skan WASHER400(Molecular Devices)，以清洗緩衝液清洗 3次，加入200μl之阻斷緩衝液，於4℃阻斷一整夜以上。 將該可溶型GPC3核多胜肽經固相化、阻斷之平盤，其次使用SkanWASHER400，以清洗緩衝液清洗3次。之後，將各種濃度之H0L0抗體或其點變異改變抗體，與終濃度0.3μg/ml之經生物素化H0L0抗體的混合液100μl，對於平盤的每1井添加。H0L0抗體之生物素化，使用生物素標記套組(Roche)，依套組之實驗步驟手冊實施。將該平盤於室溫靜置1小時後，使用Skan WASHER400(Molecular Devices)，以清洗緩衝液清洗5次。對每1井，添加以基質緩衝液稀釋20,000倍之100μl山羊抗streptabidin鹼性磷解酶(ZYMED)後的該平盤，於室溫靜置1小時後，使用Skan WASHER400，以清洗緩衝液清洗5次。使用基質緩衝液製備磷解酶基質(Sigma)Sigma)使成1mg/ml，每1井加入100μl，並靜置1小時。使用Benchmark Plus(BIO-RAD)，以655nm為照吸光度，測定各井中之反應液於405nm之吸光度。

如圖52所示，H15L4抗體對抗抗原之結合活性，與供改變之H0L0抗體分別大致同等。又，如圖53所，Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗體對抗抗原之結合活性，顯示與供改變之H0L0抗體各大致同等。再者，如圖54所示，Hspd1.8Lspd1.6(Hd1.8Ld1.6)抗體對抗抗原之結合活性，顯示與供改變之H0L0抗體各大致同等。

〔參考實施例22〕CHO細胞之中，海藻糖輸送蛋白 (transporter)基因之破壞 (1)標靶載體之構建 (1-1)KO1載體之製作

藉由從pcDNA3.1/Hygro(Invitrogen)，以Hyg5-BH與Hyg3-NT之引子進行PCR，在潮黴素(Hygromycin)耐性基因(Hygr)之開始密碼子之5’側加成BamH I部位及TGCGC之序列，與海藻糖輸送蛋白基因之開始密碼子5’側成為相同序列，將包含直到SV40 polyA加成訊號為止之區域的3’側，加成Not I部位，將Hygr抽出。

順向(forward)引子Hyg5-BH 5’-GGATCCTGCGCATGAAAAAGCCTGAACTCACC-3’(序列識別號208)

逆向(reverse)引子Hyg3-NT 5’-GCGGCCGCCTATTCCTTTGCCCTCGGACG-3’(序列識別號208)

海藻糖輸送蛋白之標靶載體ver.1(以下稱為KO1載體)，係藉由在pMC1DT-A載體(Yagi T、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87、9918-22，)，分別插入海藻糖輸送蛋白之5’側(序列識別號210所示鹼基序列之No.2,780之SmaI至No.4,232之BamH I)、3’側(No.4,284至No.10,934之Sac I為止)，及Hygr片段而構建。載體之特徵在於，Hygr未加成啟動子，因此當發生相同重組時，由於海藻糖輸送蛋白之啟動子，會使Hygr表現。然而，即使以相同重組僅1副本載體導入細胞，只要能獲得對於潮黴素之耐性，則不限Hygr表現。又，將KO1載體以Not I切斷並導 入細胞。認為由於KO1載體，使海藻糖輸送蛋白含開始密碼子之顯譯子(exon)1之41鹼基對欠缺，為喪失功能者。

(1-2)pBSK-pgk-1-Hygr之製作

從pKJ2載體(Popo H、Biochemical Genetics(1990)28、299-308，)，將小鼠pgk-1基因之啟動子以EcoR I-Pst I切出，選殖到pBluescript(Stratgene)之EcoR I-Pst I部位，製作pBSK-pgk-1。Hygr由pcDNA3.1/Hygro以Hyg5-AV與Hyg3-BH之引子進行PCR，在Hygr之5’側加成EcoT22 I部位及Kozak序列，在包含到SV40 polyA加成訊號為止之區域的3’側，加成BamH I部位，將Hygr抽出。

順向引子Hyg5-AV 5’-ATGCATGCCACCATGAAAAAGCCTGAACTCACC-3’(序列識別號211)

逆向引子Hyg3-BH 5’-GGATCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTC-3’(序列識別號212)

將此Hygr(EcoT22 I-BamH I)片段插入到pBSK-pgk-1之Pst I-BamH I部位，製作pBSK-pgk-1-Hygr。

(1-3)KO2載體之製作

海藻糖輸送蛋白之標靶載體ver.2(以稱為KO2載體)，係藉由於pMC1DT-A載體插入海藻糖輸送蛋白之5’側(序列識別號210所示鹼基序列之No.2,780之Sma I至No.4,232之BamH I)、3’側(No.4,284至No.10,934之SacI為止)，及pgk-1-Hygr片段而構建。與KO1載體不同，KO2 載體在Hygr加成有pgk-1基因之啟動子，因此，即使相同重組僅1副本載體導入細胞，亦能獲得對於潮黴素B之耐性。又，將KO2載體以Not I切斷並導入細胞。認為由於KO2載體，使海藻糖輸送蛋白欠缺含開始密碼子之顯譯子1之46鹼基對，喪失功能。

(1-4)pBSK-pgk-1-Puror之製作

將pPUR載體(BD Biosciences)以Pst I及BamH I切斷，將切出的片段(Puror)插入到pBSK-pgk-1之Pst I-BamH I部位，製作pBSK-pgk-1-Puror。

(1-5)KO3載體之製作

海藻糖輸送蛋白之標靶載體ver.3(以下稱為KO3載體)，藉由在pMC1DT-A載體分別插入海藻糖輸送蛋白之5’側(序列識別號210所示鹼基序列之No.2,780之Sma I至No.4,232之BamH I)、3’側(No.4,284至No.10,934之SacI為止)，及pgk-1-Puror片段而構建。又，於pgk-1-Puror之3’末端，預先加成結合如以下所示篩選用引子序列。 又，將KO3載體以Not I切斷並導入細胞。認為為由KO3載體，使海藻糖輸送蛋白欠缺含開始密碼子之顯譯子1之46鹼基對，喪失功能。

逆向引子RSGR-A 5’-GCTGTCTGGAGTACTGTGCATCTGC-3’(序列識別號213)

使用以上3種標靶載體，嘗試海藻糖輸送蛋白基因之剔除(knock out)。

(2)載體對CHO細胞之導入

對於CHO-S-SFMII HT-(Invitrogen)，將HT Supplement(100x)(Invitrogen)及盤尼西林鏈黴素(Invitrogen)，以相對於CHO-S-SFMII HT-容量各1/100之量添加。將該等以培養用之培養基(以下稱SFMII(+))，將CHO細胞之DXB11株繼代，再者，基因導入後之培養亦以SFMII(+)進行。將8 x 10⁶個CHO細胞懸浮於0.8ml之Dulbecco磷緩衝液(以下簡稱PBS。Invitrogen)。於細胞懸浮液添加30μg之標靶載體，將細胞懸浮液移到Gene PulserCuvette(4mm)(Biorad)。於冰上放置10分鐘後，以GENE-PULSER II(Biorad)，以1.5kV、25μFD之條件，利用電穿孔法將載體導入細胞。將載體導入後，將細胞懸浮於200ml之SFMII(+)培養基，將細胞以100μl/井接種於20片96孔平底平盤(Iwaki)。將平盤於CO₂培養箱內，於37℃培養24小時後，添加藥劑。

(3)剔除的第一階段

將KO1載體、或KO2載體分別對CHO細胞導入，從載體導入24小時後，以潮黴素B(Invitrogen)進行選拔。 使潮黴素B溶解於SFMII(+)使成0.3mg/ml，並添加100μl/井。

(4)利用PCR進行相同重組體之篩選 (4-1)PCR用樣本之製備

相同重組體利用PCR法篩選。篩選使用之CHO細胞，於96孔平底平盤培養，將培養上清除去後，添加細胞溶解 用之緩衝液50μl/井，於55℃進行2小時加溫，接著於95℃加熱15分鐘，使蛋白酶K失活，作為PCR之模板。 細胞溶解用之緩衝液，由每1井10 X LA緩衝液II(Takara LATaq所附)5μl、10% NP-40(Roche)2.5μl、蛋白酶K(20mg/ml、Takara)4μl、及蒸餾水(Nacalai)38.5μl構成。

(4-2)PCR之條件

PCR反應混合物，定為上述PCR樣本1μl、10 x LA緩衝液II 5μl、MgCl2(25mM)5μl、dNTP(2.5mM)5μl、引子(各10μM)2μl、LA Taq(5IU/μl)0.5μl、及蒸餾水29.5μl(全50μl)。導入有KO1載體之細胞之篩選，TP-F4及THygro-R1、導入有KO2載體的細胞之篩選，將TP-F4及THygro-F1用為PCR引子。

導入有KO1載體之細胞之PCR，於95℃進行1分鐘前加熱、95℃進行30秒、60℃進行30秒、及60℃進行2分鐘之放大週期40週期，及於72℃進行7分鐘之複加熱。 導入有KO2載體之細胞之篩選，於95℃進行1分鐘前加熱、95℃進行30秒間、及70℃進行3分鐘之放大週期40週期，及於70℃進行7分鐘複加熱。

引子如下所示，發生相同重組之細胞樣本，於KO1載體約1.6kb、KO2載體約2.0kb之DNA被放大。引子在TP-F4設定為載體外側，且5’側海藻糖輸送蛋白之基因體區域，THygro-F1、及THygro-R1設定於載體內之Hygr。

順向引子(KO1、KO2) TP-F4 5’-GGAATGCAGCTTCCTCAAGGGACTCGC-3’(序列識別號214)

逆向引子(KO1)THygro-R1 5’-TGCATCAGGTCGGAGACGCTGTCGAAC-3’(序列識別號215)

逆向引子(KO2)THygro-F1 5’-GCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGC-3’(序列識別號216)

(5)PCR篩選結果

將導入有KO1載體之細胞解析918個，其中認為是相同重組體的細胞有1個(相同重組效率約0.1%)。又，將導入有KO2載體之細胞解析537個，其中認為是相同重組體之細胞為17個(相同重組效率約3.2%)。

(6)南方墨點解析

再者，亦以南方墨點法確認。從培養之細胞，依定法配製基因體DNA10μg，進行南方墨點。從序列識別號210所示鹼基序列之No.2,113-No.2,500之區域，使用以下二種引子，以PCR法製備387bp探針，並用於以南方墨點法確認。基因體DNA以Bgl II切斷。

順向引子Bgl-F：5’-TGTGCTGGGAATTGAACCCAGGAC-3’(序列識別號217)

逆向引子Bgl-R：5’-CTACTTGTCTGTGCTTTCTTCC-3’(序列識別號 218)

利用Bgl II切斷，從海藻糖輸送蛋白之染色體出現約3.0kb、以KO1載體發生相同重組之染色體出現約4.6kb、以KO2載體發生相同重組之染色體發生約5.0kb之譜帶。 由於KO1載體、及KO2載體而發生相同重組之細胞，各1、7種用於實驗。KO1載體唯一獲得之細胞命名為5C1，但之後解析明確化係複數細胞集團構成，故以極限稀釋進行選殖體化，用於之後之實驗。又，將以KO2載體獲得之細胞之一命名為6E2。

(7)剔除之第二階段

相對於以KO1載體、及KO2載體而相同重組成功的細胞，使用3種載體，嘗試建立海藻糖輸送蛋白基因完全欠缺之細胞株。載體與細胞之組合如下。方法1：KO2載體與5C1細胞(KO1)、方法2：KO2載體與6E2細胞(KO2)、方法3：KO3載體與6E2細胞(KO2)。將載體導入各細胞，從載體導入起24小時後，開始以潮黴素B、嘌呤黴素(Nacalai)選拔。潮黴素B在方法1，最終濃度1mg/ml，在方法2最終濃度為7mg/ml。再者方法3，添加使潮黴素B之最終濃度0.15mg/ml、嘌呤黴素之最終濃度為8μg/ml。

(8)利用PCR所為相同重組體之篩選

樣本之製備如前述。關於方法1之篩選，將以前述KO1載體、及KO2載體發生相同重組之細胞檢測兩者以PCR進行。關於方法2，設計下述PCR引子。序列識別號210所示鹼基序列之No.3,924-3,950之區域設定為TPS-F1， No.4,248-4,274設定為SHygro-R1。利用此PCR引子，從KO2載體將欠缺之海藻糖輸送蛋白之基因區域之350bp放大。因此，方法2之中，PCR篩選使350bp未放大者，視為海藻糖輸送蛋白基因完全欠缺之細胞。PCR條件，為於95℃進行1分鐘前加熱、95℃進行30秒、70℃進行1分鐘放大週期35週期，及於70℃進行7分鐘複加熱。

順向引子TPS-F1：5’-CTCGACTCGTCCCTATTAGGCAACAGC-3’(序列識別號219)

逆向引子SHygro-R1：5’-TCAGAGGCAGTGGAGCCTCCAGTCAGC-3’(序列識別號220)

關於方法3，順向引子使用TP-F4、逆向引子使用RSGR-A。PCR條件，定為於95℃進行1分鐘前加熱、95℃進行30秒、60℃進行30秒間、72℃進行2分鐘之放大週期35週期，及於72℃進行7分鐘之複加熱。以KO3載體發生相同重組之細胞樣本，約1.6kbDNA被放大。以此PCR檢測到由於KO3載體發生相同重組之細胞，同時，確認於KO2載體殘留相同重組。

(8)PCR篩選結果

方法1中解析616個，其中認為是相同重組體之細胞有18個(相同重組效率2.9%)。方法2中解析524個，其中認為是相同重組體之細胞有2個(相同重組效率約0.4%)。再者，方法3解析382個，其中認為是相同重組體 之細胞有7個(相同重組效率約1.8%)。

(10)南方墨點解析

依照前述方法進行解析。其結果，能解析之細胞之中，發現海藻糖輸送蛋白之基因完全欠缺之細胞有1個。第一階段之剔除，雖PCR與南方墨點之解析結果一致，但該第二階段之剔除，不一致。

(11)海藻糖表現解析

再者，進行於PCR判斷為相同重組體之26個細胞之中的海藻糖表現解析。以含5μg/ml扁豆凝集原(Lens culinaris Agglutinin)、FITC接合物(Vector Laboratory)、2.5% FBS、0.02%疊氮化鈉之PBS(以下稱FACS溶解液)100μl，將1×10⁶個細胞於冰冷中染色1小時。之後，以FACS溶解液將細胞清洗3次，以FACSCalibur(Becton Dickinson)進行測定。其結果可知，僅有於南方墨點解析判斷為海藻糖輸送蛋白之基因完全欠缺的細胞FTP-KO株，海藻糖表現降低。

〔參考實施例23〕FTP-KO株由來之抗體生產細胞建立及該細胞所生產抗體之精製

製備使SFMII(+)培養基中，潮黴素B之最終濃度成為1mg/ml，將實施例21得到之海藻糖輸送蛋白欠缺株(FT-KO細胞、選殖體名3F2)繼代。將8 x 10⁶個3F2懸浮於0.8ml之Dulbecco磷酸緩衝液。於細胞懸浮液中，添加25μg之人類化Glypican3抗體表現載體，將細胞懸浮液移到Gene Pulser Cuvette。在冰上放置10分鐘後，以GENE-PULSER II，以1.5kV、25μFD之條件，利用電穿孔法將載體導入細胞。將載體導入後，使細胞懸浮於SFMII(+)培養基40ml，將細胞以100μl/井接種在96孔平底平盤(Iwaki公司)。將平盤於CO₂培養箱內，37℃培養24小時後，添加Geneticin(Invitrogen)使終濃度0.5mg/ml。測定成為抗藥劑之細胞之抗體生產量，各建立人類化Glypican3抗體生產細胞株。

從抗體表現株回收培養上清，使用P-1泵浦(Pharmacia)，施用到Hitrap rProtein A(Pharmacia)管柱。管柱以結合緩衝液(20mM磷酸鈉(pH 7.0))清洗後，將結合的抗體以洗提緩衝液(0.1M Glycin-HCl(pH 2.7))洗提。將洗提液立即以中和緩衝液(1M Tris-HCl(pH 9.0))中和。以DC蛋白質分析(BIO-RAD)選擇抗體之洗提分部並合併後，將該洗提分部以Centriprep-YM10(Millipore)濃縮至約2ml。其次，該濃縮液使用含150mM NaCl之20mM乙酸緩衝液(pH 6.0)平衡化的Superdex200 26/60(Pharmacia)之凝膠過濾。回收洗提液之單體分部的峰部，將該分部以Centriprep-YM10濃縮。該濃縮液使用MILLEX-GW 0.22μm Filter Unit(Millipore)過濾後於4℃保存。精製的抗體濃度，依據於280nm波長測定之吸光度，從莫耳吸光係數換算並決定。

〔參考實施例24〕結合於FT-KO細胞所生產之人類化抗Glypican3抗體的糖鏈的解析 (1)2-胺基苯甲醯胺標定糖鏈(2-AB化糖鏈)之製備

本發明之FT-KO細胞生產抗體、及作為對照試樣的CHO細胞生產抗體，使N-糖苷酶F(Roche diagnostics)作用，藉此使與抗體結合之糖鏈從蛋白質游離(Weitzhandler M.et al.、Journal of Pharmaceutical Sciences(1994)83(12),,1670-5)。使用乙醇進行除蛋白質操作後(Schenk B.et al.、The Journal of Clinical Investigation(2001)、108(11)、1687-95)，使游離糖鏈濃縮乾固，接著以2-胺基吡啶施以螢光標定(Bigge J.C.et al.、Analytical Biochemistry(1995)230(2)、229-238)。得到之2-AB化糖鏈，利用使用纖維素卡匣之固相萃取脱試藥後，以離心分離濃縮，精製成2-AB化糖鏈，供以後之解析。其次，使β-半乳糖苷酶(生化學工業)作用於精製2-AB化糖鏈，製備無半乳糖苷2-AB化糖鏈。

(2)無半乳糖苷2-AB化糖鏈之順相HPLC所為分析

將於前項方法，從本發明之FT-KO細胞生產抗體、及作為對照試樣之CHO細胞生產抗體游離之糖鏈作為出發材料製備的無半乳糖苷2-AB化糖鏈，以醯胺管柱TSKgel Amide-80(Tosoh)利用順相HPLC分析，比較其層析圖。CHO細胞生產抗體中，G(0)以此糖鏈主成分存在，未加成海藻糖之G(0)-Fuc，依照從峰部面積比之計算，估計全糖鏈中存在約4%。另一方面，FT-KO細胞生產抗體中，G(0)-Fuc為主成分，從任一生產株生產之抗體中，依據峰部面積比之計算，全糖鏈中90%以上以未加成海藻糖的糖鏈存在。

〔實施例25〕人類化H0L0抗體及其點變異改變抗體之安定性表現株建立

將編碼為實施例21記載之方法製作的H0L0抗體之改變抗體Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗體及Hspd1.8Lspd1.6(Hd1.8Ld1.6)抗體、或供其改變之H0L0抗體的基因，選殖於表現載體。選殖體化時，將編碼為H鏈及L鏈之各基因分別插入各別表現載體，使編碼為構成抗體之H鏈及L鏈的各基因。將選擇如前述編碼為H鏈及L鏈之各基因使成所望組合後之二種表現載體，以PvuI切斷後，使用電穿孔導入參考實施例22所製作之FTP-KO株。

製作利用電穿孔使H0L0抗體及其改變抗體安定生產之轉形導入株，使用Gene PulserII(Bio Rad公司製)實施。將帶來構成所望H鏈及L鏈之組合的H鏈、L鏈表現質體DNA各10μg，及懸浮於PBS之CHO細胞(1x10⁷細胞/ml)0.75ml混合，將混合液於冰上靜置10分鐘。混合液移到Gene PulserII用透光管後，以1.5kV、25μFD之容量賦予電脈衝。經賦予脈衝之混合液，於室溫靜置10分鐘後，懸浮於CHO-S-SFMII/1% HT/1% PS培養基。對於96井培養用平盤之各井，分注以同培養基製備之5、10、50倍的各稀釋懸浮液100μl。將該平盤於維持5%CO₂濃度之CO₂培養箱中溫育24小時。之後，對於各井添加 Geneticin(GIBCO)，使最終濃度500μg/ml、添加Zeocin(Invitrogen)使最終濃度600μg/ml，將該平盤再溫育2週。顯示Geneticin及Zeocin耐性之轉形導入細胞之群落，藉由以含500μg/ml Geneticin(GIBCO)及600μg/ml Zeocin(Invitrogen)之同培養基繼代，進一步選拔。以前述方式選拔之該轉形導入細胞之培養上清中，抗體濃度使用BiacoreQ(BIACORE)評價，建立使所望抗體高表現之轉形導入株。培養上清中，抗體濃度測定依據BiacoreQ(BIACORE)所述實驗步驟手冊實施。

〔實施例26〕使用體內模型之人類化H0L0抗體及其點變異改變抗體之藥效試驗 (1)供體內模型移植之細胞株之維持

使用Hep G2細胞(ATCC)。Hep G2細胞，於含10%FBS、1mmol/l MEM丙酮酸鈉(Invitrogen)、1mmol/l MEM Non-Essential Amino Acid(Invitrogen)之Minimun Essential Medium Eagle培養基(SIGMA)(以下稱繼代用培養基。)中繼代維持。

(2)Hep G2細胞移植小鼠模型之製作

將Hep G2細胞之細胞懸浮液使用含繼代用培養基及MATRIGEL Matrix(BD Bioscience)為1：1的溶液，製備成5x10⁷細胞/ml。於細胞之移植前日，預先將抗缺唾酸基GM1抗體(和光純藥，1藥水瓶中之內容物以5ml該溶液溶解。)100μl，對於經腹胺內投予之SCID小鼠(雄、5週齡)(日本CLEA)之腹部皮下移植該細胞懸浮液 100μl(5x10⁶細胞/小鼠)。腫瘤體積，使用式：腫瘤體積=長徑×短徑×短徑/2計算，於腫瘤體積之平均成為120-330mm³之時點，判斷模型成立。

(3)含各受試抗體之投予試樣之製備

將含H0L0抗體、Hu2.2Lu2.2抗體、Hd1.8Ld1.6抗體之各抗體之投予試樣，在其投予當日，使用生理食鹽水，製備為成為0.5mg/ml(5mg/kg投予群)或0.1mg/ml(1mg/kg投予群)。

(4)含抗體之投予試樣之投予

對於(2)製作之小鼠模型，從Hep G2細胞移植後27日起每週1次，於3週期間，將上述(3)製備之投予試樣以10ml/kg之投予量從尾靜脈投予。就陰性對照而言，與生理食鹽水同樣地，每週1次，於3週期間，以10ml/kg之投予量從尾靜脈投予。各群均為，以5隻為1群，對於各群實施含各受試抗體之投予試樣之投予。與投予大約同時，從各群之中3隻個體，採靜脈血，作為用於測定各抗體之小鼠血中濃度使用的受試物質。具體而言，於初次投予後0.5小時、即將第二次投予前之二個時點，從背足靜脈採血。將20μl容量之採血以肝素處理，以離心分離製備血漿。

(5)各受試抗體之抗腫瘤效果之評價

人類肝癌移植小鼠模型之中，各受試抗體之抗腫瘤效果，從測定投予試樣投予之最終日起一週後之腫瘤體積評價。其結果如圖55所示，Hspd1.8Lspd1.6(Hd1.8Ld1.6) 抗體藥效有增強之傾向，Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗體，藥效有減弱的傾向。

(6)各受試抗體之血中濃度

小鼠血漿中於受試抗體之濃度，依照實施例21所記載之ELISA法方法測定。製備血漿中濃度，12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2μg/ml之檢量線試樣。將檢量線試樣及適當稀釋成所望濃度之小鼠血漿受試試樣，分注到固定有可溶Glypican-3 core(中外製藥公司製)之免疫平盤(Nunc-Immuno Plate、MaxiSoup(Nalge nunc International))，將該平盤於室溫靜置1小時。之後，依序分注山羊抗人類IgG-BIOT(Southern Biotechnology Associates)及鏈親和素-鹼性磷解酶接合體(Roche Diagnostics)，使用BluePhos Microwell磷解酶基質系統(Kirkegaard & PerryLaboratories)為基質，進行發色反應。各井中反應液呈色，使用微平盤讀取儀測定反應液於650nm之吸光度而計算。依據從各檢量線試樣之吸光度製作之檢量線，使用解析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)計算小鼠血漿中之抗體濃度。

投予30分鐘及7日後之小鼠血漿中濃度，如圖56所示。受試抗體之任一投予量，為只要受試抗體之pI更降低，則顯示投予7日後之小鼠血漿中之抗體濃度增高。

〔實施例27〕使用人類微血管單核球作為效應子細胞，各受試抗體之ADCC活性

人類微血管單核球(以下稱為人類PBMC。)作為效應子 細胞，將各受試抗體之ADCC活性以下列方式測定。

(1)人類PBMC溶液之製備

使用預先注入1000單位/ml肝素溶液(Novo‧Heparin注5千單位，Novonordisk)200μl之注射器，從中外製藥股份有限公司所屬之健常人自願者(成人男性)採取微血管血50ml。使用PBS(-)將稀釋成2倍的該微血管分成4等分，預先注入15mlFicoll-Paque PLUS，加入進行離心操作Leucosep淋巴球分離管(Greiner bio-one)。將分注有該微血管血之分離管，以2150rpm之速度於室溫進行10分鐘離心分離之操作後，分取單核球分部層。利用含10%FBS之Dulbecco’s Modified Eagle’培養基(SIGMA)(以下稱10%FBS/D-MEM。)，將該各分層含有之細胞清洗1次後，使該細胞懸浮於10%FBS/D-MEM中使細胞密度成為5x10⁶/ml。該細胞懸浮液作為人類PBMC溶液供以後之實驗。

(2)標靶細胞之製備

將Hep G2細胞從培養皿剝離，接種在96井U底平盤使成1x10⁴cells/井。該平盤於5%二氧化碳培養箱中，於37℃溫育一晚。次日。在該平盤之各井中加入5.55MBqCr-51，將該平盤在5%二氧化碳培養箱中，於37℃溫育3小時。存在該平盤各井中之Hep G2細胞作為標靶細胞，於以後ADCC活性之測定時使用。

(3)鉻游離試驗(ADCC活性)

ADCC活性，利用鉻釋放法，以專一性鉻游離率評價。 將(2)製備之標靶細胞以培養基清洗，添加製備成各濃度(0、0.004、0.04、0.4、4、40μg/ml)之H0L0抗體、Hu2.2Lu2.2抗體、Hd1.8Ld1.6抗體之各抗體100μl。該平盤於室溫進行15分鐘反應後，將抗體溶液除去。其次，對於各井中添加繼代用培養基各100μl之該平盤，於5%二氧化碳培養箱中，於37℃溫育1小時。各井中，加入有(1)製備之人類PBMC溶液各100μl(5x10⁵細胞/井)的該平盤，於5%二氧化碳培養箱中，於37℃靜置4小時後，進行離心分離操作。該平盤各井中之100μl培養上清的放射活性，使用伽瑪計數器測定。依據下式：專一性鉻游離率(%)=(A-C)×100/(B-C)求出專一性鉻游離率。

上式中，A代表各井中100μl培養上清之放射活性(cpm)之平均值。又，B代表對於標靶細胞添加100μl 2% NP-40水溶液(Nonidet P-40、Nacalai)及50μl 10% FBS/D-MEM培養基之井中100μl培養上清之放射活性(cpm)平均值。再者，C表示對於標靶細胞添加10% FBS/D-MEM培養基150μl之井中100μl培養上清之放射活性(cpm)平均值。試驗實施三重複，計算反映各受試抗體之ADCC活性的前述試驗之中，專一性鉻游離率(%)之平均值及標準偏差。

(4)各受試抗體之ADCC活性之評價

經過各受試抗體發揮人類PBMC之ADCC活性經評價，結果認為所有受試抗體具ADCC活性。其結果如圖57所示。 於各濃度之各受試抗體所示專一性鉻游離率，進行顯著差異檢定，結果所有抗體濃度，各受試抗體顯示之專一性鉻游離率，在各受試抗體間不認為有顯著差異。統計解析使用SAS前臨床套裝軟體(SAS Institute Inc.)。依照以上結果，顯示pI經改變之各受試抗體之ADCC活性之間無差異。

[實施例28]抗人類IL-6受體抗體、抗人類GPC3抗體、抗人類IL-31受體抗體之製作 1 抗人類IL-6受體抗體之製作

製作2種抗體作為抗人類IL-6受體抗體。製作H鏈為6R_a_H1(序列識別號：221)及L鏈為6R_a_L1(序列識別號：224)所構成之6R_a_H1L1，及H鏈為6R_b_H1(序列識別號：227)及L鏈為6R_b_L1(序列識別號：229)所構成之6R_b_H1L1。依照參考例1、2，進行編碼為該等胺基酸序列之動物細胞表現載體之製作、表現、精製。

2 抗人類GPC3抗體之製作

製作抗人類GPC3抗體。製作H鏈為GPC3_H1(序列識別號：233)及L鏈為GPC3_L1(序列識別號：236)所構成之GPC3_H1L1。依照參考例1、2，進行編碼為各胺基酸序列之動物細胞表現載體之製作、表現、精製。

3 抗人類IL-31受體抗體

製作抗人類IL-31受體抗體。製作H鏈為31R_H1(序列識別號：239)及L鏈為31R_L1(序列識別號：242)所構成之31R_H1L1。依照參考例1、2，進行編碼為各胺基酸 序列之動物細胞表現載體之製作、表現、精製。

[實施例28]抗人類IL-6受體抗體、抗人類GPC3抗體、抗人類IL-31受體抗體之胺基酸置換所致等電點降低 1 搜尋不使對於抗原之結合活性減弱，而使等電點降低之CDR序列

WO/2007/114319中，顯示CDR之中胺基酸置換所致等電點之控制例，但是H鏈CDR3進行胺基酸置換，H鏈CDR3對於抗體對於抗原之結合活性大大相關，因此，可預測視抗體之種類，在同處之胺基酸置換無法不使對於抗原之結合活性減弱，而使等電點降低。所以，搜尋能不論抗體種類，不使對於抗原之結合活性減弱，而能使等電點降低之候選CDR序列。其結果，例如H鏈可變區域中H31、H52、H61、H62、H64、H65，L鏈可變區域中L24、L27、L27a、L53、L54、L55、L56(Kabat編號)，為不使對於抗原之結合活性減弱，能使等電點降低之候選CDR序列。所以，以下所示抗人類IL-6受體抗體、抗人類GPC3抗體及抗人類IL-31受體抗體中，對於各該等候選CDR序列之數個，進行胺基酸置換，探討是否不減弱對於抗原之結合活性，而能使等電點降低。

2 使等電點降低之抗人類IL-6受體抗體之製作、結合活性評價及等電點測定

對於構成抗人類IL-6受體抗體6R_a_H1L1之6R_a_H1(序列識別號：221)及6R_a_L1(序列識別號：224)，各導入有使等電點降低之胺基酸置換及其他胺基酸置換之 6R_a_H2(序列識別號：222)及6R_a_L2(序列識別號：225)，依照參考例1、2之方法，進行製作載體、6R_a_H2L2表現、精製。對於6R_a_H2L2，將進一步導入使等電點降低之胺基酸置換及其其他胺基酸置換之6R_a_H3(序列識別號：223)及6R_a_L3(序列識別號：226)，依照參考例1之方法，製作載體，進行6R_a_H3L3表現、精製。

6R_a_H1L1、6R_a_H2L2、6R_a_H3L3之對於抗原人類IL-6受體之解離常數(KD)，依參考例3之Biacore T100之方法測定。6R_a_H1L1、6R_a_H2L2、6R_a_H3L3對於IL-6受體之解離常數(KD)，如下表18所示為同等，胺基酸置換導入不認為使對於抗原之結合活性大幅降低。

以該技術領域中具通常知識者公知之等電點電泳，測定等電點，結果，相對於6R_a_H1L1之等電點約9.2，進行使等電點降低之胺基酸置換的6R_a_H2L2之等電點約6.1、6R_a_H3L3之等電點約5.4，各相較於6R_a_H1L1，等電點降低約3.1及約3.8。又，將可變區域VH/VL之理論等電點以GENETYX(GENETYX CORPORATION)計算，結果相對於6R_a_H1L1之理論等電點為9.37，6R_a_H2L2之理論等電點為4.63、6R_a_H3L3之理論等電點約4.27，各相較於6R_a_H1L1，理論等電點降低4.74及5.10。該等結果整 理於表19。

以下表20整理對於6R_a_H1L1導入之CDR序列之胺基酸置換。發現：該等CDR區胺基酸置換，對於抗人類IL-6受體抗體6R_a_H1L1，未使對於抗原之結合活性大幅降低，能使抗體分子之等電點降低。

接著，對於構成其他抗人類IL-6受體抗體6R_b_H1L1之6R_b_H1(序列識別號：227)及6R_b_L1(序列識別號：229)，各將導入有使等電點降低之胺基酸置換及其他胺基酸置換之6R_b_H2(序列識別號：228)及6R_b_L2(序列識別號：230)，依照參考例1、2之方法，製作載體，進行6R_b_H2L2表現、精製。對於6R_b_H2L2，進一步導入使等 電點降低之胺基酸置換及其他胺基酸置換之6R_b_L3(序列識別號：231)及6R_b_L4(序列識別號：232)，依照參考例1之方法，製作載體，進行6R_b_H2L3、6R_b_H2L4表現、精製。

6R_b_H1L1、6R_b_H2L2、6R_a_H2L3、6R_b_H2L4對於抗原人類IL-6受體之中和活性測定，依參考例4所示方法進行。6R_b_H1L1、6R_b_H2L2、6R_a_H2L3、6R_b_H2L4之中和活性，如圖58所示，大約同等，不認為胺基酸置換導入造成對於抗原之結合活性大幅降低。

以該技術領域中具通常知識者公知之等電點電泳測定等電點之結果，相對於6R_b_H1L1之等電點約9.3，進行使等電點降低之胺基酸置換之6R_b_H2L2之等電點約5.9，相較於6R_b_H1L1等電點降低約3.4。又，以GENETYX(GENETYX CORPORATION)計算可變區域VH/VL之理論等電點，結果相對於6R_b_H1L1之理論等電點為9.20，6R_b_H2L2之理論等電點為4.52、6R_b_H2L3之理論等電點約4.46、6R_b_H2L4之理論等電點約4.37，各相較於6R_b_H1L1，理論等電點降低4.68、4.74及4.83。該等結果整理於表21。

以下表22整理對於6R_b_H1L1導入之CDR序列之胺基酸置換。發現該等CDR區胺基酸置換，對於抗人類IL-6受體抗體6R_b_H1L1，不使對於抗原之結合活性大幅降低，能使抗體分子之等電點降低。

3 使等電點降低之抗人類GPC3抗體之製作、結合活性評價及等電點測定

將對於構成抗人類GPC3抗體GPC3_H1L1之GPC3_H1(序列識別號：233)及GPC3_L1(序列識別號：236)，導入有使等電點降低之胺基酸置換及其他胺基酸置換之GPC3_H2(序列識別號：234)及GPC3_L2(序列識別號：237)，依照參考例1、2之方法，製作載體，進行GPC3_H2L2表現、精製。對於GPC3_H2L2，進一步導入使等電點降低之胺基酸置換及其他胺基酸置換之GPC3_H3(序列識別號：235)及GPC3_L3(序列識別號：238)，依照參考例1之方法，製作載體，進行GPC3_H3L3表現、精製。

GPC3_H1L1、GPC3_H2L2、GPC3_H3L3對於抗原人類GPC3 之結合活性，使用參考例5所記載之競爭ELISA方法評價，其結果如圖59及圖60所示。GPC3-H1L1與GPC3-H2L2及GPC3-H2L2與GPC3-H3L3對於Glypican3之結合活性大致同等，不認為胺基酸置換導入使對於抗原結合活性大幅降低。

以該技術領域中具通常知識者公知之等電點電泳測定等電點之結果，相對於GPC3_H1L1之等電點約9.6，進行使等電點降低之胺基酸置換的GPC3_H2L2之等電點約8.9，GPC3_H2L2之等電點相較於GPC3_H1L1之等電點，降低0.7。同樣地，相對於GPC3_H2L2之等電點約8.7，進行使等電點降低之胺基酸置換之GPC3_H3L3之等電點約6.5，GPC3_H3L3之等電點相較於GPC3_H2L2之等電點，降低2.2。又，GPC3_H1L1之理論等電點為9.65，GPC3_H2L2之理論等電點為8.47，GPC3_H2L2之理論等電點相較於GPC3_H1L1，降低1.18。同樣地，GPC3_H2L2之理論等電點為8.47，GPC3_H3L3之理論等電點為4.93，GPC3_H2L2之理論等電點相較於GPC3_H1L1，降低3.54。該等結果整理於表23。

以下表24整理對於GPC3_H1L1導入之CDR序列之胺基酸置換。發現該等CDR區胺基酸置換，對於抗人類GPC3抗體GPC3_H1L1，不使對於抗原之結合活性大幅下降、能使抗體分子之等電點降低。

4 使等電點降低之抗人類IL-31受體抗體、結合活性評價及等電點測定

將對於構成31R_H1L1之31R_H1(序列識別號：238)及 31R_L1(序列識別號：242)，各導入使等電點降低之胺基酸置換及其他胺基酸置換的31R_H2(序列識別號：240)及31R_L2(序列識別號：243)，依照參考例1、2之方法，製作載體，進行31R_H2L2表現、精製。將對於31R_H2L2，進一步導入使等電點降低之胺基酸置換及其他胺基酸置換之31R_H3(序列識別號：241)，依照參考例1之方法製作載體，進行31R_H3L2表現、精製。

31R_H2L2、31R_H3L2對於IL-31之結合活性，依參考例6所記載之利用Biacore方法評價親和性，其結果整理於表25。如表25所示，31R_H2L2、31R_H3L2對於31R_H1L1之NR10的結合活性大致同等，不認為胺基酸置換導入使對於抗原之結合活性大幅降低。

依該技術領域中具通常知識者公知之等電點電泳測定等電點之結果，相對於31R_H1L1之等電點約7.76，進行使等電點降低之胺基酸置換之31R_H2L2之等電點約5.49、31R_H3L2之等電點約5.43，各相較於31R_H1L1，等電點降低約2.27及約2.33。又，相對於31R_H1L1之理論等電點為7.76，31R_H2L2之理論等電點為4.63、31R_H3L2之理論等電點約4.54，各相較於31R_H1L1，理論等電點降低約3.13及約3.22。該等結果整理於表26。

以下表27整理對於31R_H1L1導入之CDR序列之胺基酸置換。發現該等CDR區胺基酸置換，對於抗人類IL-31受體抗體31R_H1L1，不使對於抗原之結合活性大幅降低，能使抗體分子之等電點降低。

5 能使對於抗原之結合活性不減弱，使抗人類IL-6受體抗體、抗人類GPC3抗體、抗人類IL-31受體抗體之等電點降低之CDR序列

將上述探討中製作之2種抗人類IL-6受體抗體(6R_a及6R_b)、抗人類GPC3抗體(GPC3)、抗人類IL-31受體抗體(31R)之H鏈CDR序列整理於表28，L鏈CDR序列整理於 表29。能使對於抗原之結合活性不減弱，使等電點降低之胺基酸置換，以塗深表示。

藉此，發現H鏈可變區域中H31、H61、H62、H64、H65、L鏈可變區域中L24、L27、L53、L54、L55(Kabat編號)，不論抗體種類，為複數抗體中能導入使抗體對於抗原之結合活性不大幅減弱，使抗體之等電點降低之胺基酸置換的共通CDR處。

WO/2007/114319中，顯示藉由使抗體之等電點降低能使IgG之藥物動力學提升。WO/2007/114319中，為了不使 對於抗原之結合活性減弱，主要對於抗體可變區域之框架進行胺基酸置換，關於抗FactorIXa抗體，實測等電點為約0.9之變化、理論等電點約1.0之變化，關於抗FactorX抗體，實測等電點約0.5之變化、理論等電點約0.1之變化，等電點之變化程度小。

本發明中，發現不使對於抗原之結合活性減弱之CDR序列，不僅可對於抗體可變區域之框架，亦可對於CDR導入使等電點降低之胺基酸置換。藉此，上述抗人類IL-6受體抗體中，實測等電點能達成降低約3.8、理論等電點達成降低約5.1，抗人類GPC3抗體中，實測等電點能達成降低約3.1、理論等電點能達成降低約4.7，於抗人類IL-31受體抗體中，實測等電點能達成降低約3.2、理論等電點能達成降低約2.3，相較於僅對於框架進行胺基酸置換，能達成等電點大幅降低。

[實施例30]使等電點降低之抗人類IL-6受體抗體、抗人類GPC3抗體、抗人類IL-31受體抗體之藥物動力學評價1 長尾獼猴及小鼠之中抗人類IL-6受體抗體之藥物動力學評價

進行抗人類IL-6受體抗體6R_a_H1L1、及使等電點降低之抗人類IL-6受體抗體6R_a_H2L2及6R_a_H3L3於長尾獼猴中之藥物動力學評價。將6R_a_H1L1及6R_a_H2L2分別以1.0mg/kg對靜脈內進行單次投予，於投予前及投予後經時採血。又，將6R_a_H2L2及6R_a_H3L3分別以1.0mg/kg對皮下進行單次投予，於投予前及投予後經時採血。

血漿中濃度測定以ELISA法測定。將適當濃度之檢量線試樣及血漿測定試樣分注到固定有抗人類IgG(γ-鏈專一性)F(ab’)2(Sigma公司製)之免疫平盤(Nunc-Immuno Plate,MaxiSorp(Nalge nunc International公司製))，於室溫靜置1小時後，使依序與山羊抗人類IgG-BIOT(Southern Biotechnology Associates公司製)及鏈親和素-鹼性磷解酶接合體(Roche Diagnostics公司製)反應，以BluePhos Microwell磷解酶基質系統(Kirkegaard & Perry Laboratories公司製)作為基質進行發色反應，以微平盤讀取儀測定650nm之吸光度。血漿中濃度，從檢量線之吸光度使用解析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices公司製)計算。得到之血漿中濃度變化資料，以藥物動力學解析軟體WinNonlin(Pharsight公司製)進行非模型依存的解析，計算廓清(CL)，如表30所示。靜脈內投予之6R_a_H1L1與6R_a_H2L2比較時，使等電點降低後之6R_a_H2L2，廓清較小，確認藉由使等電點降低，藥物動力學提升。再者，將皮下投予之6R_a_H2L2與6R_a_H3L3比較時，使等電點降低之6R_a_H3L3，廓清較小，確認使等電點降低，藥物動力學提升。

接著，進行不同抗人類IL-6受體抗體6R_b_H1L1、及使等電點後之抗人類IL-6受體抗體6R_b_H2L2於小鼠(C57BL/6J、日本Charles River)中之藥物動力學評價。 將6R_b_H1L1及6R_b_H2L2分別以1.0mg/kg對靜脈內進行單次投予，於投予前及投予後經時採血。又，將6R_b_H1L1及6R_b_H2L2分別以1.0mg/kg對皮下單次投予，於投予前及投予後經時採血。

血漿中濃度測定以ELISA法測定。首先將重組人類IL-6 sR(R&D Systems公司製)使用EZ-LinkTM Sulfo-NFS-Biotinylation Kit(PIERCE公司製)生物素化。將該生物素化人類-sIL-6R分注到Reacti-結合鏈親和素高結合能力(HBC)塗覆平盤(PIERCE公司製)，於室溫進行1小時以上靜值，製作人類-sIL-6R固相化平盤。製備適當濃度之檢量線試樣及小鼠血漿測定試樣，分注到人類-sIL-6R固相化平盤，於室溫靜置1小時。之後使抗人類IgG-AP(SIGMA公司製)反應。以BluePhos Microwell磷解酶基質系統(Kirkegaard & Perry Laboratories公司製)作為基質進行發色反應，以微平盤讀取儀測定650nm之吸光度。血漿中濃度從檢量線之吸光度，使用解析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices公司製)計算。得到之血漿中濃度變化資料，以藥物動力學解析軟體WinNonlin(Pharsight公司製)進行非模型依存解析，計算廓清(CL)，如表31所示。靜脈內及皮下投予之6R_a_H1L1與6R_a_H2L2比較時，均為使等電點降低後之6R_a_H2L2 廓清較小，確認藉由使等電點降低，藥物動力學提升。

2小鼠之中抗人類GPC3抗體之藥物動力學之評價

評價抗人類GPC3抗體GPC3_H1L1、及使等電點降低後之抗人類GPC3抗體GPC3_H2L2及GPC3_H3L3於C.B-17/Icr-scid小鼠中之藥物動力學。將GPC3_H1L1、GPC3_H2L2、GPC3_H3L3各以5.0mg/kg對靜脈內進行單次投予，於投予前及投予後經時採血。

血漿中濃度測定以ELISA法測定。將適當濃度之檢量線試樣及適當稀釋成所望濃度之小鼠血漿受試試樣，分注到固定化有抗原GPC3(中外製藥公司製)之免疫平盤(Nunc-Immuno Plate、MaxiSoup(Nalge nunc International))，將該平盤於室溫靜置1小時。之後，將山羊抗人類IgG-BIOT(Southern Biotechnology Associates)及鏈親和素-鹼性磷解酶接合體(Roche Diagnostics)依序分注，以BluePhos Microwell磷解酶基質系統(Kirkegaard & Perry Laboratories公司製)為基質進行發色反應，以微平盤讀取儀測定650nm之吸光度。血漿中濃度，從檢量線之吸光度使用解析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices公司製)計算。得到之血漿中濃度 變化資料，以藥物動力學解析軟體WinNonlin(Pharsight公司製)進行非模型依存的解析，計算廓清(CL)，如表32所示。將GPC3_H1L1與GPC3_H2L2比較時，使等電點降低後之GPC3_H2L2，廓清較小，又，將GPC3_H2L2與GPC3_H3L3比較時，又，使等電點降低後之GPC3_H3L3廓清較小，確認藉由使等電點降低，藥物動力學提升。

3 小鼠之中抗人類IL-31受體抗體之藥物動力學評價

進行抗人類IL-31受體抗體31R_H1L1、及使等電點降低後之抗人類IL-31受體抗體31R_H2L2於小鼠(C57BL/6J、日本Charles River)中之藥物動力學評價。將31R_H1L1與31R_H2L2分別以1.0mg/kg於靜脈內進行單次投予，於投予前及投予後經時採血。

血漿中濃度測定以ELISA法測定。將適當濃度之檢量線試樣及血漿測定試樣，分注於以抗人類IgG(Fc-specific)antibody(Sigma公司製)固相化之免疫平盤(Nunc-Immuno Plate,MaxiSorp(Nalge nunc International公司製))，於室溫靜置1小時。使山羊抗人類IgG-ALP(Sigma公司製)於室溫進行1小時反應後，使用BluePhos Microwell磷解酶基質系統(Kirkegaard & Perry Laboratories公司製)為基質進行發色反應，以微 平盤讀取儀測定650nm之吸光度。血漿中濃度，從檢量線之吸光度使用解析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices公司製)計算。

將得到之血漿中濃度變化資料以藥物動力學解析軟體WinNonlin(Pharsight公司製)進行非模型依存解析，計算廓清(CL)，如表33所示。將31R_H1L1與31R_H2L2比較時，使等電點降低後之31R_H2L2，廓清較小，確認藉由使等電點降低，消失速度減小。

3 結論

本發明中吾人發現：在抗原種類相異的複數抗體中，藉由進行CDR序列之胺基酸置換，能使抗體對於抗原之結合活性不減弱，能使抗體之等電點降低、提升抗體之藥物動力學。發現的CDR序列之胺基酸置換中，發現：H鏈可變區域中H31、H61、H62、H64、H65、L鏈可變區域中L24、L27、L53、L54、L55(Kabat編號)，不依存於抗體種類，能於複數抗體中導入使抗體對於抗原之結合活性不大幅減弱，而使抗體之等電點降低之胺基酸置換，使藥物動力學提升之CDR序列之胺基酸置換。CDR序列中之該等變異處，被認為係不論抗原種類，能使抗體對於抗原之結合活性不大幅減弱，能使抗體之等電點降低，作為使抗體之藥物動力學提升之胺基酸置換部位有用。

[實施例31]使等電點降低之抗人類IL-6受體抗體、抗人類GPC3抗體、抗人類IL-31受體抗體之異二元體及同二元體以標準層析所為之峰部分離 1 抗Factor IX抗體/抗Factor X抗體之異二元體表現

於專利文獻WO/2007/114325，報告關於具共通L鏈之IgG型雙專一性抗體之精製法。為使具共通L鏈之IgG型雙專一性抗體表現，需使2種H鏈(A鏈及B鏈)及共通L鏈表現。此時，不僅是目的雙重專一性抗體A鏈B鏈異二元體，會表現A鏈同二元體及B鏈同二元體，需從3種抗體之混合物將目的雙重專一性抗體A鏈B鏈異二元體精製。該專利中，係以習知方法，利用標準層析將A鏈B鏈異二元體、A鏈同二元體及B鏈同二元體進行峰部分離，不能將A鏈B鏈異二元體精製，但是藉由將2種H鏈A鏈及B鏈之可變區域之胺基酸置換，在A鏈同二元體及B鏈同二元體導入等電點差異，顯示能以標準層析陽離子交換層析，將A鏈B鏈異二元體、A鏈同二元體及B鏈同二元體進行峰部分離，將A鏈B鏈異二元體精製。該專利中，就可變區域之胺基酸而言，認為CDR區胺基酸置換在抗體對於抗原之結合活性有所影響，因此，僅進行框架之胺基酸置換。然而，如上所述，以框架之胺基酸置換無法導入大幅等電點變化，為了使A鏈B鏈異二元體更有效率精製，希望對於A鏈同二元體及B鏈同二元體導入更大的等電點差異。所以，探討藉由在CDR之中導入使實施例28發現之抗體對於抗原之結合活性不大幅減弱，使抗體之等電點降 低之胺基酸置換，能不能將A鏈B鏈異二元體、A鏈同二元體及B鏈同二元體進行峰部分離。

2 抗人類IL-6受體抗體/pI降低抗人類IL-6受體抗體之異二元體表現

A鏈使用6R_a_H1(序列識別號：221)、B鏈使用已導入不使對於抗原之結合活性減弱而使等電點降低，使與A鏈具等電點差異之6R_a_H3(序列識別號：223)，及共通L鏈使用6R_a_L3(序列識別號：226)，以參考例2所示方法，進行6R_a_H1H3L3(A鏈B鏈異二元體(6R_a_H1/H3/L3)、A鏈同二元體(6R_a_H1/L3)及B鏈同二元體(6R_a_H3/L3)之混合物)表現‧精製。

3 抗人類GPC3抗體/pI降低抗人類GPC3抗體之異二元體表現

A鏈使用GPC3_H2(序列識別號：234)、B鏈使用已導入不使對於抗原之結合活性減弱，使等電點降低，使與A鏈具等電點差異之GPC3_H3(序列識別號：235)、及共通L鏈使用GPC3_L3(序列識別號：238)，以參考例2所示方法，進行GPC3_H2H3L3(A鏈B鏈異二元體(GPC3_H2/H3/L3)、A鏈同二元體(GPC3_H2/L3)及B鏈同二元體(GPC3_H3/L3)之混合物)表現‧精製。

4 抗人類IL-31受體抗體/pI降低抗人類IL-31受體抗體之異二元體表現

A鏈使用將31R_H1之固定區域改變過之31R_H1a(序列識別號：244)、B鏈使用將已導入不使對於抗原之結合活 性減弱，使等電點降低，使與A鏈具等電點差異之31R_H2之固定區域同樣地改變過的31R_H2a(序列識別號：245)、及共通L鏈使用31R_L2(序列識別號：243)，以參考例2所示方法，進行31R_H1aH2aL2(A鏈B鏈異二元體(31R_H1a/H2a/L2)、A鏈同二元體(31R_H1a/L2)及B鏈同二元體(31R_H2a/L2)之混合物)表現‧精製。

5 利用陽離子交換層析所為表現抗體之評價

將上述製作之抗體之A鏈同二元體與B鏈同二元體之VH/VL之理論等電點之差異，整理如以下表34。不僅是對於H鏈之框架，對於CDR序列亦導入使維持結合活性，使等電點降低之胺基酸置換，藉此，能於A鏈同二元體之B鏈同二元體之理論等電點導入最大1.56之差。專利文獻WO/2007/114325中，僅藉由對於A鏈同二元體之框架導入胺基酸置換使等電點降低，且僅對於B鏈同二元體之框架導入胺基酸置換藉此使等電點增大，顯示能在A鏈同二元體與B鏈同二元體之VH/VL之理論等電點導入1.13之差。 但本探討中，即便僅其中一鏈實施胺基酸置換(使等電點降低)，藉由不僅對框架，對於CDR序列亦導入胺基酸置換，顯示能於理論等電點導入最大1.56之差。亦即，就用以將A鏈同二元體及B鏈同二元體分離之胺基酸置換，藉由維持結合活性，不僅對於框架，對於CDR序列亦導入胺基酸置換，顯示能使兩者之等電點差異進一步增大。一般而言，以標準離子交換層析所為之分離，依存於欲分離之2成分之等電點差異，故可認為藉此使兩者更輕易分離。

評價6R_a_H1H3L3、GPC3_H2H3L3及31R_H1aH2aL2各自的A鏈B鏈異二元體、A鏈同二元體及B鏈同二元體，是否能以陽離子交換層析進行峰部分離。標準陽離子交換層析管柱使用ProPac WCX-10(Dionex)，移動相A使用25MES、pH5.0、移動相B使用25mM MES、1M NaCl、pH5.0，使用適當流量及梯度實施。利用陽離子交換層析所為之評價結果如圖61所示。其結果，6R_a_H1H3L3、GPC3_H2H3L3及31R_H1aH2aL2均發現：A鏈B鏈異二元體、A鏈同二元體及B鏈同二元體之峰部分離。

H鏈可變區域中H31、H61、H62、H64、H65(Kabat編號)，不依存於抗體種類，能藉由同一處之胺基酸置換，使抗體對於抗原之結合活性不大幅減弱，使抗體之等電點降低，藉此發現到，能將異二元體及同二元體以陽離子交換層析分離。CDR序列中之該等變異處，不論抗原種類，可認為能不使抗體對於抗原之結合活性大幅減弱，使抗體之等電點降低，作為用以使雙重專一性抗體之異二元體及同二元體間之等電點差異增大之胺基酸置換部位為有用。

[參考例1] 抗體表現載體基因之製作

各變異體之製作，利用QuikChange點突變套組(Stratagene)、或使用PCR之Assemble PCR進行。使用QuikChange點突變套組(Stratagene)之情形，依所附說明書之方法製作變異體。使用Assemble PCR之方法，使用以下任一方法進用。第1方法，係進行依據含改變部位之順鏈及逆鏈序列設計之寡DNA合成。將含改變部位之順鏈之寡DNA及插入有進行改變之基因的載體所結合之逆鏈之寡DNA、含改變部位之逆鏈之寡DNA及插入有進行改變之基因的載體所結合之順鏈之寡DNA，分別組合，使用PrimeSTAR(TAKARA)進行PCR，藉此製作5末端側與3末端側之2個含改變部位之片段。藉由將此2個片段以Assemble PCR接合，製作各變異體。第2方法，製作適當條數寡DNA，使涵蓋可變區域全體，將此等寡DNA使用Assemble PCR接合，以製作可變區域全體。將以該等方法製作之變異體插入能在動物細胞中表現插入基因之表現載體。得到之表現載體之鹼基序列以該技術領域中具通常知識者公知之方法決定。

[參考例2] 抗體之表現及精製

抗體之表現使用以下方法進行。使人類胎兒腎癌細胞由來HEK293H株(Invitrogen)懸浮於含10%胎牛血清(Invitrogen)之DMEM培養基(Invitrogen)，以5~6×10⁵個/mL之細胞密度，對於黏著細胞用皿(直徑10cm、CORNING) 之各皿各接種10mL，於CO₂培養箱(37℃、5% CO₂)內培養一晝夜後，將培養基吸除，添加CHO-S-SFM-II(Invitrogen)培養基6.9mL。將製備之質體以脂質轉染法導入細胞。將得到之培養上清回收後，進行離心分離(約2000g、5分鐘、室溫)將細胞除去，再通過0.22μm濾膜MILLEX(R)-GV(Millipore)，滅菌得培養上清。於得到之培養上清，使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，依該技術領域中具通常知識者公知之方法精製。精製抗體濃度，使用分光光度計，測定於280nm之吸光度。從得到之值，使用以PACE法計算之吸光係數，計算抗體濃度(Protein Science 1995；4：2411-2423)。

[參考例3] 利用Biacore所為之抗人類IL-6受體抗體對於IL-6受體之親和性評價方法 1.可溶型人類IL-6受體之製備

抗原人類IL-6受體之重組人類IL-6受體如以下方式製備。製作J.Biochem.108、673-676(1990)所報告之由N末端側1號至344號之胺基酸序列所構成之可溶型人類IL-6受體(Yamasaki等人、Science 1988；241：825-828(GenBank # X12830))之CHO細胞固定表現株。從可溶型人類IL-6受體表現CHO細胞得到之培養上清，進行Blue Sepharose 6 FF管柱層析、固定有對抗可溶型人類IL-6受體之專一抗體之管柱所為之親和層析、凝膠過濾管柱層析，3個管柱層析，將可溶型人類IL-6受體精製。洗提出 作為主峰部之分部，作為最終精製品。

2.利用Biacore所為之對於可溶型人類IL-6受體之親和性評價

使用Biacore T100(GEHealthcare Bio-Sciences)，進行抗人類IL-6受體抗體與可溶型人類IL-6受體之抗原抗體反應之速度論的解析。以該技術領域中具通常知識者公知方法，在感應晶片上固定化rec-Protein A(ZYMED)(以下稱為Protein A)，將抗體捕捉於此固定化Protein A，再使抗原作為分析物反應，測定抗體與抗原之交互作用。電泳緩衝液使用HBS-EP+，流速定為20μL/min。各抗體製備成約結合100RU於Protein A/G。使用作為分析物之可溶型人類IL-6受體，使用HBS-EP+，調製成0、0.065、0.131、0.261μg/mL。測定首先使抗體溶液與Protein A/G結合，使分析物溶液與其進行3分鐘交互作用，之後轉換為HBS-EP+，測定10或15分鐘解離相。解離相測定結束後，以10μL之10mM甘胺酸-HCl(pH1.5)清洗，將感應晶片再生。以此結合‧解離‧再生作為分析之1週期。對於各種抗體，依此週期測定。將得到之感應圖形使用Biacore專用之資料解析軟體Biacore T100 Evaluation軟體(GEHealthcare Bio-Sciences)，進行速度論的解析。

[參考例4] 利用BaF/6R細胞所為之抗人類IL-6受體抗體之IL-6受體中和活性評價方法

為了得到顯示IL-6依存增殖性之細胞株，如以下所示，進行表現人類gp130及人類IL-6R之BaF3細胞株之建立。將全長人類IL-6R cDNA以PCR放大，選殖於pcDNA3.1(+)(Invitrogen)，構建hIL-6R/pcDNA3.1(+)。將pCOS2Zeo/gp130以電穿孔處理，對於BaF3細胞進行基因導入，於人類介白素-6(R&D systems)、100ng/mL之人類介白素-6 soluble受體(R&D systems)存在下進行選拔，建立人類gp130表現BaF3細胞株(以下、BaF/gp130)。再者，將全長人類IL-6R cDNA以PCR放大，選殖於pcDNA3.1(+)(Invitrogen)，構建hIL-6R/pcDNA3.1(+)。將pcDNA3.1(+)/hIL-6R以電穿孔處理，對於上述製作之BaF/gp130細胞進行基因導入，於人類介白素-6(R&D systems)存在下進行選拔，建立人類IL-6R表現BaF3細胞株(以下、BaF/6R)。該BaF/6R，於人類介白素-6(R&D systems)存在下進行增殖，因此，能用於抗人類IL-6受體抗體之增殖抑制活性(亦即人類IL-6受體中和活性)之評價。

使用BaF/6R，評價抗人類IL-6受體抗體之人類IL-6受體中和活性。將BaF/6R以含10% FBS之RPMI1640培養基清洗3次後，懸浮於含20ng/mL人類介白素-6(TORAY)(終濃度10ng/mL)及10% FBS之RPMI1640培養基，使成2.5~5.0 x 10⁴cells/mL，對於96井盤(CORNING)之各井各分注50μL。其次，將抗人類IL-6受體抗體以含10% FBS之RPMI1640稀釋，對於各井各混合50μL。於 37℃、5% CO₂條件下，培養3日，加入以PBS稀釋為2倍之WST-8試藥(Cell Counting Kit-8、同仁化學研究所股份有限公司)20μL/井，立即使用SUNRISE CLASSIC(TECAN)測定於450nm之吸光度(參考波長620nm)。培養2小時後，再測定450nm之吸光度(參考波長620nm)，以2~4小時之吸光度變化為指標，評價人類IL-6受體中和活性。

[參考例5] 抗人類GPC3抗體之競爭ELISA所為之各變異改變抗體之結合活性評價

製作之抗體之結合活性，使用競爭ELISA進行。使製備成1μg/ml之可溶型GPC3核多胜肽(序列識別號：207)，對於96孔平盤以每1井加入100μl。該平盤於4℃靜置整夜，將可溶型GPC3核多胜肽固定化於該平盤。固定化於該平盤之可溶型GPC3核多胜肽，使用Skan WASHER400(Molecular Devices)，以清洗緩衝液清洗3次，添加200μl阻斷緩衝液，於4℃進行30分鐘以上阻斷。 將該可溶型GPC3核多胜肽經固相化、阻斷之平盤，其次使用Skan WASHER400，以清洗緩衝液清洗3次。之後，將各種濃度之GPC3-H2L2抗體或其他抗體，與終濃度0.3μg/ml之經生物素化之GPC3-H2L2抗體，各100μl混合後，將混合液200μl對於平盤每1井添加。GPC3-H2L2抗體之生物素化，使用生物素標記套組(Roche)，依套組之實驗步驟手冊實施。該平盤於室溫靜置1小時後，使用Skan WASHER400(Molecular Devices)，以清洗緩衝液清洗5次。 對此每1井加入以基質緩衝液稀釋為20,000倍之100μl山羊抗streptabidin鹼性磷解酶(ZYMED)的該平盤，於室溫靜置1小時後，使用Skan WASHER400，以清洗緩衝液清洗5次。使用基質緩衝液，製備磷解酶基質(Sigma)使成為1mg/ml，每1井添加100μl，靜置1小時。使用Benchmark Plus(BIO-RAD)，使用655nm之對照吸光度，測定各井中之反應液於405nm之吸光度。

[參考例6] 利用Biacore所為之抗人類IL-31受體抗體對於IL-31受體之親和性評價方法 1.可溶型人類IL-31受體之製備

以人類IL31受體之cDNA為模板，利用PCR法僅將細胞外區域放大，又，在C末端加成FLAG標籤序列，插入哺乳動物細胞用表現載體。將成直鏈狀之此載體10μg，以電穿孔法(BioRad Gene PulserII、25μF、1.5kV)導入中國倉鼠卵巢細胞株DG44，得顯示高表現之細胞株。從將此細胞株大量培養之培養上清，得抗FLAG抗體管柱(SIGMA製)，以凝膠過濾法精製，得可溶型NR10。可溶型人類IL31受體之胺基酸序列以序列識別號：246所示。

2.利用Biacore所為之對於可溶型人類IL-31受體之親和性評價

使用Biacore T100(GEHealthcare Bio-Sciences)，進行抗人類IL-31受體抗體與可溶型人類IL-31受體之抗原抗體反應之速度論的解析。以該技術領域中具通常知識 者公知之方法，在感應晶片上固定化rec-ProteinA(ZYMED)(以下、Protein A)，將抗體捕捉在此固定化Protein A，再以抗原作為分析物反應，測定抗體與抗原之交互作用。 各抗體製備為對於Protein A/G結合適當量。作為分析物之可溶型人類IL-31受體，使用HBS-EP+，製備為0、38.5、77.0、154nM。測定首先使抗體溶液與Protein A/G結合，並使分析物溶液與其進行3分鐘交互作用，之後轉換為HBS-EP+，測定5分鐘解離相。解離相測定結束後，以10μL之10mM甘胺酸-HCl(pH1.5)清洗，將感應晶片再生。此結合‧解離‧再生，作為分析之1週期。關於各種抗體，依照此週期進行測定。得到之感應圖形，使用Biacore專用之資料解析軟體Biacore T100 Evaluation軟體(GEHealthcare Bio-Sciences)，進行速度論的解析。

【產業利用性】

依照本發明，藉由將能露出於互補性決定區域(CDR)區域表面之至少1個胺基酸殘基之電荷，維持對於抗原之結合活性同時將該電荷改變，提供改變抗體之等電點的方法、將多重專一性抗體精製之方法、改善抗體之血漿中藥物動力學之方法、以含經等電點改變之抗體為有效成分之醫藥組成物及其製造方法。藉由將抗體之等電點改變，能將多重專一性抗體以良好效率高純度精製。又，藉由將抗體之等電點改變，能使血漿中藥物動力學改善，能減少投予頻度，並發揮持續治療效果。又，依照本發明之方法得到的 抗體，保持對於抗原之結合活性。

圖1顯示WT與RD_6之BaF/gp130中和活性。

圖2顯示rhIL-s6R(R&D systems)與WT之交互作用之感應圖形。

圖3顯示rhIL-s6R(R&D systems)與RD_6之交互作用之感應圖形。

圖4-1顯示相較於WT，親和性‧中和活性提升之CDR變異表。

圖4-2係接續於圖4-1。

圖5顯示利用組合，使親和性‧中和活性提升之CDR變異表。

圖6顯示WT與RDC23之BaF/gp130中和活性。

圖7顯示rhIL-s6R(R&D systems)與RDC23之交互作用之感應圖形。

圖8顯示rhsIL-6R與WT之交互作用之感應圖形。

圖9顯示rhsIL-6R與RDC23之交互作用之感應圖形。

圖10顯示SR344與WT之交互作用之感應圖形。

圖11顯示SR344與RDC23之交互作用之感應圖形。

圖12顯示WT與H53L28之BaF/gp130中和活性。

圖13顯示SR344與H53/L28之交互作用之感應圖形。

圖14顯示WT、H53/L28對於小鼠進行靜脈內投予後之血漿中濃度變化。

圖15顯示WT、H53/L28對於小鼠進行皮下投予後之血漿中濃度變化。

圖16顯示WT與PF1之BaF/gp130中和活性。

圖17顯示SR344與PF1之交互作用之感應圖形。

圖18顯示WT、PF1之高濃度安定性試驗結果。

圖19顯示WT、PF1對於人類IL-6受體基因轉殖小鼠進行靜脈內投予後，血漿中濃度變化。

圖20顯示WT、PF1對於人類IL-6受體基因轉殖小鼠進行靜脈內投予後，非結合型人類可溶型IL-6受體濃度變化。

圖21顯示利用鹽酸洗提法精製之WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4、IgG2-M397V、IgG4-R409K，以凝膠過濾層析所得聚集體含量之分析結果。

圖22顯示WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4之陽離子交換層析(IEC)分析結果。

圖23顯示WT-IgG2之鉸鏈區域之推定雙硫鍵樣式。

圖24顯示WT-IgG2-SKSC之鉸鏈區域之推定雙硫鍵樣式。

圖25顯示WT-IgG2與IgG2-SKSC之陽離子交換層析(IEC)分析結果。

圖26顯示人類化PM1抗體、H鏈C末端△K抗體、H鏈C末端△GK抗體之陽離子交換層析(IEC)分析結果。

圖27顯示WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4、WT-M14△GK、WT-M17△GK、WT-M11△GK對於Fc γ RI之結合量之比較。

圖28顯示WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4、WT-M14△GK、WT-M17△GK、WT-M11△GK對於Fc γ RIIa之結合量之比較。

圖29顯示WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4、WT-M14△GK、WT-M17△GK、WT-M11△GK對於Fc γ RIIb之結合量之比較。

圖30顯示WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4、WT-M14△GK、WT-M17△GK、WT-M11△GK對於Fc γ RIIIa(Val)之結合量之比較。

圖31顯示WT-IgG1、WT-M14△GK、WT-M17△GK、WT-M11△GK於高濃度安定性試驗之中聚集體增加量。

圖32顯示WT-IgG1、WT-M14△GK、WT-M17△GK、WT-M11△GK於高濃度安定性試驗之中Fab片段增加量。

圖33顯示WT-IgG2與WT-M14△GK與WT-M31△GK之陽離子交換層析(IEC)分析結果。

圖34顯示WT與F2H/L39-IgG1之BaF/gp130中和活性。

圖35顯示長尾獼猴中，將WT及PF1及F2H/L39-IgG1以1.0mg/kg進行皮下投予時，血漿中抗體濃度變化。

圖36顯示長尾獼猴之中，WT與F2H/L39-IgG1投予群之CRP濃度變化。

圖37顯示長尾獼猴之中，WT與F2H/L39-IgG1投予群之非結合型長尾獼猴IL-6受體濃度變化。

圖38顯示WT-IgG1及WT-M14對於人類FcRn基因轉殖小鼠進行靜脈內投予後，血漿中濃度變化。

圖39顯示WT-IgG1、WT-M14及WT-M58對於人類FcRn基因轉殖小鼠進行靜脈內投予後，血漿中濃度變化。

圖40顯示WT-IgG1、WT-M44、WT-M58、WT-M73對於人類FcRn基因轉殖小鼠進行靜脈內投予後，血漿中濃度變化。

圖41顯示抗IL-6受體抗體WT、抗IL-6受體抗體F2H/L39、抗IL-31受體抗體H0L0、抗RANKL抗體DNS之固定區域對於異質性之影響以陽離子交換層析評價之圖形。

圖42顯示抗IL-6受體抗體WT、抗IL-6受體抗體F2H/L39之CH1結構域之半胱胺酸對於異質性之影響以陽離子交換層析評價之圖形。

圖43顯示抗IL-6受體抗體WT之CH1結構域之半胱胺酸對於變性峰部之影響以DSC評價之圖。

圖44顯示TOCILIZUMAB、控制組及Fv5-M83於BaF/gp130之中和活性。

圖45顯示TOCILIZUMAB、Fv3-M73及Fv4-M73於BaF/gp130之中和活性。

圖46顯示TOCILIZUMAB、控制組、Fv3-M73、Fv4-M73、及Fv5-M83，對於長尾獼猴進行靜脈內投予後，血漿中濃度變化。

圖47顯示TOCILIZUMAB、控制組、Fv3-M73、Fv4-M73、及Fv5-M83對於長尾獼猴進行靜脈內投予後，CRP濃度變化。

圖48顯示TOCILIZUMAB、控制組、Fv3-M73、Fv4-M73、及Fv5-M83對於長尾獼猴進行靜脈內投予後，可溶型IL-6 受體之中和率之變化。

圖49顯示Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗體之DSC(示差掃描熱量計)測定得到之圖表。

圖50顯示高pI等電點電泳之中，H0L0抗體及Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗體之電泳像。

圖51顯示低pI等電點電泳之中，H0L0抗體及Hspd1.8Lspd1.6(Hd1.8Ld1.6)抗體之電泳像。

圖52顯示利用使用H15L4抗體及H0L0抗體所為之競爭ELISA，得到對於抗原Glypican3之結合活性。

圖53顯示利用使用Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗體及H0L0抗體之競爭ELISA，所得對於抗原Glypican3之結合活性。

圖54顯示利用使用Hspd1.8Lspd1.6(Hd1.8Ld1.6)抗體及H0L0抗體之競爭ELISA，所得對於抗原Glypican3之結合活性。

圖55顯示H0L0抗體、Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗體及Hspd1.8Lspd1.6(Hd1.8Ld1.6)抗體於人類肝癌移植小鼠模型中之抗腫瘤效果。

圖56顯示H0L0抗體、Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗體及Hspd1.8Lspd1.6(Hd1.8Ld1.6)抗體於人類肝癌移植小鼠模型中之抗體血漿中濃度。

圖57顯示對於人類肝癌細胞株Hep G2細胞，各受試抗體所得的ADCC活性。

圖58顯示5R_b_H1L1、6R_b_H2L2、6R_b_H2L3、 6R_b_H2L4於BaF/6R中之IL-6受體中和活性。

圖59顯示利用使用GPC_H1L1抗體及GPC_H2L2抗體之競爭ELISA，所得對於抗原Glypican3之結合活性。

圖60顯示利用使用GPC_H2L2抗體及GPC_H3L3抗體之競爭ELISA，所得對於抗原Glypican3之結合活性。

圖61顯示6R_a_H1H3L3、GPC3_H2H3L3及31R_H1aH2aL2利用陽離子交換層析所為之A鏈B鏈異二元體、A鏈同二元體及B鏈同二元體之峰部分離。

<110> 中外製藥股份有限公司

<120> 利用置換CDR區胺基酸來改變抗體等電點的方法

<130> C1-A0708P2-TW

<150> PCT/JP2008/67534

<151> 2008-09-26

<160> 246

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

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<212> PRT

<213> 家鼷鼠

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<213> 家鼷鼠

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<213> 人類

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<213> 人工序列

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<223> 人工合成之胜肽序列

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<213> 人工序列

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<223> 人工合成之胜肽序列

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<213> 人工序列

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<223> 人工合成之胜肽序列

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<213> 人工序列

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<223> 人工合成之胜肽序列

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<213> 人類

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<213> 人工序列

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<223> 人工合成之胜肽序列

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<213> 人工序列

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<223> 人工合成之胜肽序列

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<213> 人工序列

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<223> 人工合成之胜肽序列

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<213> 人工序列

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<223> 人工合成之胜肽序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 39

<210> 40

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 40

<210> 41

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 41

<210> 42

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 42

<210> 43

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 43

<210> 44

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 44

<210> 45

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 45

<210> 46

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 46

<210> 47

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 47

<210> 48

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 48

<210> 49

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 49

<210> 50

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 50

<210> 51

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 51

<210> 52

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 52

<210> 53

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 53

<210> 54

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 54

<210> 55

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 55

<210> 56

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 56

<210> 57

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 57

<210> 58

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 58

<210> 59

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 59

<210> 60

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 60

<210> 61

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 61

<210> 62

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 62

<210> 63

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 63

<210> 64

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 64

<210> 65

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 65

<210> 66

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 66

<210> 67

<211> 11

<212> PRT

<212> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 67

<210> 68

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 68

<210> 69

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 69

<210> 70

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 70

<210> 71

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 71

<210> 72

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 72

<210> 73

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 73

<210> 74

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 74

<210> 75

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 75

<210> 76

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<222> 人工合成之胜肽序列

<400> 76

<210> 77

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 77

<210> 78

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 78

<210> 79

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 79

<210> 80

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 80

<210> 81

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 81

<210> 82

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 82

<210> 83

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 83

<210> 84

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 84

<210> 85

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 85

<210> 86

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 86

<210> 87

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 87

<210> 88

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 88

<210> 89

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 89

<210> 90

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 90

<210> 91

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 91

<210> 92

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 92

<210> 93

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 93

<210> 94

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 94

<210> 95

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 95

<210> 96

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 96

<210> 97

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 97

<210> 98

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 98

<210> 99

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 99

<210> 100

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 100

<210> 101

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 101

<210> 102

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 102

<210> 103

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 103

<210> 104

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 104

<210> 105

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 105

<210> 106

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 106

<210> 107

<211> 414

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之核酸序列

<400> 107

<210> 108

<211> 378

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之核酸序列

<400> 108

<210> 109

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 109

<210> 110

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 110

<210> 111

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 111

<210> 112

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 112

<210> 113

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 113

<210> 114

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 114

<210> 115

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 115

<210> 116

<211> 327

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 116

<210> 117

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 117

<210> 118

<211> 324

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 118

<210> 119

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 119

<210> 120

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 120

<210> 121

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 121

<210> 122

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 122

<210> 123

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 123

<210> 124

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 124

<210> 125

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 125

<210> 126

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 126

<210> 127

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 127

<210> 128

<211> 32

<212> PRT

<213> 人類

<400> 128

<210> 129

<211> 32

<212> PRT

<213> 人類

<400> 129

<210> 130

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 130

<210> 131

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 131

<210> 132

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 132

<210> 133

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 133

<210> 134

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 134

<210> 135

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 135

<210> 136

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 136

<210> 137

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 137

<210> 138

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 138

<210> 139

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 139

<210> 140

<211> 267

<212> PRT

<213> 人類

<400> 140

<210> 141

<211> 99

<212> PRT

<213> 人類

<400> 141

<210> 142

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 142

<210> 143

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 143

<210> 144

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 144

<210> 145

<211> 119

<212> PRT

<213> 家鼷鼠

<400> 145

<210> 146

<211> 107

<212> PRT

<213> 家鼷鼠

<400> 146

<210> 147

<211> 120

<212> PRT

<213> 家鼷鼠

<400> 147

<210> 148

<211> 107

<212> PRT

<213> 家鼷鼠

<400> 148

<210> 149

<211> 122

<212> PRT

<213> 家鼷鼠

<400> 149

<210> 150

<211> 108

<212> PRT

<213> 家鼷鼠

<400> 150

<210> 151

<211> 324

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 151

<210> 152

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 152

<210> 153

<211> 324

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 153

<210> 154

<211> 326

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 154

<210> 155

<211> 326

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 155

<210> 156

<211> 326

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 156

<210> 157

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 157

<210> 158

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 158

<210> 159

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 159

<210> 160

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 160

<210> 161

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 161

<210> 162

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 162

<210> 163

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 163

<210> 164

<211> 328

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 164

<210> 165

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 165

<210> 166

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 166

<210> 167

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 167

<210> 168

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 168

<210> 169

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 169

<210> 170

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 170

<210> 171

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 171

<210> 172

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 172

<210> 173

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 173

<210> 174

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 174

<210> 175

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 175

<210> 176

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 176

<210> 177

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 177

<210> 178

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 178

<210> 179

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 179

<210> 180

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 180

<210> 181

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 181

<210> 182

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 182

<210> 183

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 183

<210> 184

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 184

<210> 185

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 185

<210> 186

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 186

<210> 187

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 187

<210> 188

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 188

<210> 189

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 189

<210> 190

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 190

<210> 191

<211> 326

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 191

<210> 192

<211> 324

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 192

<210> 193

<211> 326

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 193

<210> 194

<211> 324

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 194

<210> 195

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體H鏈

<400> 195

<210> 196

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體H鏈

<400> 196

<210> 197

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體H鏈

<400> 197

<210> 198

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體H鏈

<400> 198

<210> 199

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體H鏈

<400> 199

<210> 200

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體H鏈

<400> 200

<210> 201

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體L鏈

<400> 201

<210> 202

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體L鏈

<400> 202

<210> 203

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體L鏈

<400> 203

<210> 204

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體L鏈

<400> 204

<210> 205

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體L鏈

<400> 205

<210> 206

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體L鏈

<400> 206

<210> 207

<211> 545

<212> PRT

<213> 人類

<400> 207

<210> 208

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之引子序列

<400> 208

<210> 209

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之引子序列

<400> 209

<210> 210

<211> 10939

<212> DNA

<213> 中國倉鼠

<400> 210

<210> 211

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之引子序列

<400> 211

<210> 212

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之引子序列

<400> 212

<210> 213

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之引子序列

<400> 213

<210> 214

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之引子序列

<400> 214

<210> 215

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之引子序列

<400> 215

<210> 216

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之引子序列

<400> 216

<210> 217

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之引子序列

<400> 217

<210> 218

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之引子序列

<400> 218

<210> 219

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之引子序列

<400> 219

<210> 220

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之引子序列

<400> 220

<210> 221

<211> 449

<212> PRT

<213> 人類

<400> 221

<210> 222

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 222

<210> 223

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 223

<210> 224

<211> 214

<212> PRT

<213> 人類

<400> 224

<210> 225

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 225

<210> 226

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 226

<210> 227

<211> 449

<212> PRT

<213> 人類

<400> 227

<210> 228

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 228

<210> 229

<211> 214

<212> PRT

<213> 人類

<400> 229

<210> 230

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 230

<210> 231

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 231

<210> 232

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 232

<210> 233

<211> 445

<212> PRT

<213> 人類

<400> 233

<210> 234

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 234

<210> 235

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 235

<210> 236

<211> 219

<212> PRT

<213> 人類

<400> 236

<210> 237

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 237

<210> 238

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 238

<210> 239

<211> 447

<212> PRT

<213> 人類

<400> 239

<210> 240

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 240

<210> 241

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 241

<210> 242

<211> 214

<212> PRT

<213> 人類

<400> 242

<210> 243

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 243

<210> 244

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 244

<210> 245

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成之胜肽序列

<400> 245

<210> 246

<211> 514

<212> PRT

<213> 人類

<400> 246

Claims (23)

1. 一種使包含抗體可變區域之IgG抗體中，保持該可變區域對於抗原之結合活性並且控制該IgG抗體之血漿中藥物動力學之方法，包含改變能露出於該IgG抗體之互補性決定區域(CDR)表面之至少1個胺基酸殘基之電荷，其中，能露出於CDR區域表面之至少1個胺基酸殘基，係擇自於重鏈可變區域中Kabat編號31位、61位、62位、64位及65位之胺基酸殘基，或輕鏈可變區域中Kabat編號24位、27位、53位、54位及55位之胺基酸殘基。
2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該包含抗體可變區域的IgG抗體，更包含FcRn結合區域。
3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該包含抗體可變區域的IgG抗體為嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。
4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該包含抗體可變區域的IgG抗體為與至少2種抗原結合之多重專一性抗體。
5. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該胺基酸殘基之電荷改變為胺基酸置換。
6. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該胺基酸殘基之電荷改變係為使理論等電點變化1.0以上。
7. 如申請專利範圍第1項之方法，其中，該經改變之胺基酸殘基，係擇自於以下(a)或(b)中任一群組包含之胺基酸殘基：(a)谷胺酸(E)、天冬醯胺酸(D)； (b)離胺酸(K)、精胺酸(R)、組胺酸(H)。
8. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該藥物動力學之控制，係增加或減少血漿中廓清(CL)、濃度曲線下面積(AUC)、平均血漿中滯留時間、血漿中半衰期(t1/2)中任一參數。
9. 一種血漿中藥物動力學經控制之包含抗體可變區域之IgG抗體之製造方法，包含：(a)以使能露出於該IgG抗體之CDR區域表面之至少1個胺基酸殘基之電荷改變之方式，將編碼為含該胺基酸殘基之IgG抗體的核酸予以改變；(b)培養寄主細胞使得該核酸表現；(c)從寄主細胞培養物將含抗體可變區域之IgG抗體回收，其中，能露出於CDR區域表面之至少1個胺基酸殘基，係擇自於重鏈可變區域中Kabat編號31位、61位、62位、64位及65位之胺基酸殘基，或輕鏈可變區域中Kabat編號24位、27位、53位、54位及55位之胺基酸殘基。
10. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該包含抗體可變區域的IgG抗體更包含FcRn結合區域。
11. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該包含抗體可變區域的IgG抗體為嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。
12. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該包含抗體可變區域的IgG抗體為與至少2種抗原結合之多重專一性抗體。
13. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該胺基酸殘基 之電荷之改變為胺基酸置換。
14. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該胺基酸殘基之電荷之改變係使理論等電點變化1.0以上。
15. 如申請專利範圍第9項之方法，其中，該經改變之胺基酸殘基，係擇自於以下(a)或(b)中任一群組包含之胺基酸殘基：(a)谷胺酸(E)、天冬醯胺酸(D)；(b)離胺酸(K)、精胺酸(R)、組胺酸(H)。
16. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該藥物動力學之控制係增加或減少血漿中廓清(CL)、濃度曲線下面積(AUC)、平均血漿中滯留時間、血漿中半衰期(t1/2)中任一參數。
17. 一種包含抗體可變區域之多重專一性IgG抗體之精製方法，該IgG抗體包含第1多胜肽及第2多胜肽；包含：(a)以使能露出於該IgG抗體之CDR區域表面之至少1個胺基酸殘基之電荷改變之方式，將編碼為含該胺基酸殘基之IgG抗體的核酸予以改變；相較於改變前，該核酸之改變係以使第1多胜肽與第2多胜肽之等電點之差異增大之方式，改變編碼為第1多胜肽之胺基酸殘基之核酸及編碼為第2多胜肽之胺基酸殘基之核酸之兩者或其中之一；(b)培養寄主細胞使得該核酸表現；(c)從寄主細胞培養物以標準層析精製多重專一性IgG抗體，其為以第1多胜肽之同多元體、第2多胜肽之同多元 體、及第1多胜肽與第2多胜肽之異多元體之標準層析分析中的峰部，相較於改變前成為更分離之峰部為特徵的方法，其中，能露出於CDR區域表面之至少1個胺基酸殘基，係擇自於第1多胜肽之重鏈可變區域中Kabat編號31位、61位、62位、64位及65位之胺基酸殘基，或輕鏈可變區域中Kabat編號24位、27位、53位、54位及55位之胺基酸殘基。
18. 如申請專利範圍第17項之方法，其中，擇自於第2多胜肽之重鏈可變區域中Kabat編號31位、61位、62位、64位及65位之胺基酸殘基，或輕鏈可變區域中Kabat編號24位、27位、53位、54位及55位之胺基酸殘基中之至少1個胺基酸殘基的電荷，與擇自於該第1多胜肽中之胺基酸殘基具有的電荷，帶相反電荷或不帶電荷。
19. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該帶電荷之胺基酸殘基及帶有與該胺基酸殘基相反電荷之胺基酸殘基之組合，係分別擇自於以下(a)或(b)任一群組所包含之胺基酸殘基：(a)谷胺酸(E)、天冬醯胺酸(D)；(b)離胺酸(K)、精胺酸(R)、組胺酸(H)。
20. 如申請專利範圍第17項之方法，其中該多重專一性IgG抗體為雙重專一性抗體。
21. 一種血漿中藥物動力學經控制之人類化IgG抗體或人類IgG抗體之製造方法，該抗體包含擇自於人類由來之CDR、人類以外之動物由來之CDR、及合成CDR所構成之 群組之CDR、人類由來之框架區域(FR)及人類固定區域，該方法包含，將能露出於CDR表面之至少1個胺基酸殘基改變為與原CDR之對應位置之胺基酸殘基具相異電荷之胺基酸殘基，其中，能露出於CDR表面之至少1個胺基酸殘基，係擇自於重鏈可變區域中Kabat編號31位、61位、62位、64位及65位之胺基酸殘基，或輕鏈可變區域中Kabat編號24位、27位、53位、54位及55位之胺基酸殘基。
22. 如申請專利範圍第21項之方法，其中該人類固定區域包含人類Fc區域。
23. 如申請專利範圍第21項之方法，其中，該經改變之胺基酸殘基，係擇自於以下(a)或(b)中任一群組包含之胺基酸殘基：(a)谷胺酸(E)、天冬醯胺酸(D)；(b)離胺酸(K)、精胺酸(R)、組胺酸(H)。