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TWI430811B - 聚乙二醇化促紅血球生成素偶聯物和其製備方法與用途 - Google Patents

聚乙二醇化促紅血球生成素偶聯物和其製備方法與用途 Download PDF

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TWI430811B
TWI430811B TW097125013A TW97125013A TWI430811B TW I430811 B TWI430811 B TW I430811B TW 097125013 A TW097125013 A TW 097125013A TW 97125013 A TW97125013 A TW 97125013A TW I430811 B TWI430811 B TW I430811B
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Description

聚乙二醇化促紅血球生成素偶聯物和其製備方法與用途
本發明涉及一種聚乙二醇化促紅血球生成素偶聯物，該偶聯物具有提高體內血紅蛋白含量和網織紅血球數目的生物學活性，本發明的應用領域涉及生物化學、藥物化學以及人類疾病的治療。
促紅血球生成素(erythropoietin,EPO)是一種糖蛋白激素，分子量約34kD。血漿中存在的促紅血球生成素由165個氨基酸組成，糖基化程度很高，糖基成分主要是唾液酸。根據碳水化合物含量不同，天然存在的促紅血球生成素分為兩種類型，α型含34%的碳水化合物，β型含26%的碳水化合物。兩種類型在生物學特性、抗原性及臨床應用效果上均相同。人類促紅血球生成素基因位於7號染色體長22區。1985年其cDNA被成功克隆，並利用基因重組技術開始大量生產重組人促紅血球生成素(recombinant human erythropoietin,rHuEPO),廣泛用於臨床。應用重組DNA技術已經生物合成出促紅血球生成素(Egrie,JC,Strickland,TW,Lane,J等(986)免疫生物學(lmmunobiol)72：213－224)，其是插入到中國倉鼠的卵巢組織細胞(CHO細胞)中並且表現的克隆的人促紅血球生成素基因的產物。天然存在的人促紅血球生成素首先翻譯成含有166個氨基酸並且第166位是精氨酸的多肽鏈。在翻譯後修飾中用羥肽酶裂解掉第166位精氨酸。沒有糖基的人EPO的多 膚鏈的分子量是18236Da.在完整的促紅血球生成素分子中，糖基占整個分子量的大約40%(J.Biol.Chem.262：12059)。
促紅血球生成素是最早應用於臨床的細胞因數，是迄今所知作用最單一、且安全可靠的升血紅蛋白製劑。對於腎貧血、再生障礙性貧血、多發性骨髓瘤及陣發性夜間血尿等均有一定療效；此外，應用EPO還可減少手術中的輸血量，並能在一定程度上糾正由惡性腫瘤、化療及類風濕性關節炎引起的貧血。由於促紅血球生成素主要由腎小管內皮細胞產生，腎性疾患引起的貧血是促紅血球生成素的首選適應症；EPO糾正腎性貧血的療效幾乎100%，但並不能改善腎功能。促紅血球生成素的治療安全、有效，適合長期治療，也能避免血源緊張。在2006年的全球生物技術藥市場上，促紅血球生成素類的重組藥物占了119億美元，有巨大的市場容量。
早在1989年，美國FDA就正式批准重組人促紅素(EPOGEN)用於腎性貧血的治療，但直到1992年才在中國大陸上市。中國大陸慢性腎炎的年發病率約為0.25%，其中相當一部分患者最終會轉為腎衰，每年的腎性貧血患者約50－60萬。根據保守的用藥量估算，如果按當前的價格30－40元/支(本文中之幣值係指人民幣)，加上癌症相關性貧血等其他病人的用藥，大陸市場容量約12－16億元甚至更大(病人平均體重按50Kg計算)。自20世紀90年代後期，EPO已進入中國大陸重點城市醫院暢銷藥品行列，2003 年在大陸重點城市樣本醫院用藥金額6213萬元，排名第56位。2004年，大陸重點城市樣本醫院購藥金額增長到8049萬元，同比增長了30%。
促紅血球生成素作為一種作用於骨髓造血細胞，促進紅系祖細胞增生、分化，最終成熟的內分泌激素。對有機體供氧狀況發揮重要的調控作用。在胚胎早期，EPO由肝生成，然後逐漸向腎轉移，出生後主要由腎小管間質細胞分泌。
在促紅血球生成素誘導紅組細胞分化過程中，球蛋白被誘導，這能使細胞吸收更多的鐵而合成功能性的血紅蛋白，這種功能性的血紅蛋白可以和成熟的紅血球中的氧結合，因此，紅血球和血紅蛋白在提供有機體氧方面扮演了極其重要的角色。這一過程是由促紅血球生成素與紅組細胞的表面受體之間的相互作用引起的。
當人體處於健康狀態時，組織可以從已經存在的紅血球中吸收足夠多的氧，此時體內的促紅血球生成素濃度很低，這種正常的較低的促紅血球生成素濃度完全可以刺激促進由於年齡的問題而正常損失的紅血球。
當循環系統中的依靠紅血球進行氧輸送的水準被降低進而出現缺氧情況時，促紅血球生成素在體內的數量將會增加，有機體缺氧狀態可以由以下原因引起的：過量的輻射、因高緯度或長期昏迷造成的氧攝入量減少、各種類型的貧血等等。作為對組織處於缺氧壓力的應答,促紅血球生成素水準的提高可以刺激紅組細胞的分化達到提高紅血 球生成的能力。當體內的紅血球的數量大於正常組織的需求時，循環系統中促紅血球生成素的水準被降低。正是由於促紅血球生成素對於紅血球的生成有著至關重要的作用，因此這類激素對於治療和診斷以紅血球生成低下和缺陷為特徵的血液病方面有著很廣泛的前景。最近的研究為推測促紅血球生成素療法在多種疾病、紊亂和血液學異常情況中的效用提供了基礎，這些疾病包括：慢性腎衰竭(CRF)患者貧血症的治療中使用促紅血球生成素和在愛滋病和接受化療的癌症患者貧血症的治療中使用EPO(Danna,RP,Rudnick，SA，Abels，RI，於：MB，Garnick編著，臨床應用中的促紅血球生成素一國際展望(Erythropoietin in Clinical Applications－An International Perspective.Marcel Dekker；1990：p301－324)。
但是當前可獲得未被修飾的促紅血球生成素的血漿半衰期短，容易遭受蛋白酶降解，利用率不高，這些缺陷阻止它們取得最大的臨床療效。因此獲得長效的促紅血球生成素已經成了各大研究機構及制藥企業競相研發的重點，如已經上市的amgen公司的長效促紅血球生成素產品(aransp)是通過基因工程的手段增加糖基化的位元點數目，進而提高糖基化的程度，達到每兩週注射一次，改善了促紅血球生成素在體內的半衰期，但是這種產品由於仍然無法避免體內蛋白酶的酶解影響，因此延長體內半衰期的程度有限，並且生產成本較高。
本發明的目的在於提供一種生物學活性更好，生物利用度更高的的聚乙二醇修飾的促紅血球生成素偶聯物以及該偶聯物的製備方法。
本發明目的還在於提供一種含有該被修飾的促紅血球生成素偶聯物的藥物組合物，用於治療以缺乏紅血球生成素或紅血球群缺少或缺陷為特徵的疾病。
本發明所公開的一種新的聚乙二醇修飾的促紅血球生成素偶聯物，其結構式為 P－NH－CH2 －X－S－Y－(OCH2 CH2 )m1 －OCH3 所述偶聯物是由甲氧基聚乙二醇基團經由式－CH2 －X－S－Y－中的－CH2 －基團與促紅血球生成素的氨基形成－NH－CH2 －鍵連接而得到，其中P是指重組人促紅血球生成素，X是－(CH2 )k －或－CH2 (OCH2 CH2 )k －，k的數目選自2至10，m1選自100至2000之間的整數，Y選自： 其中m、n的數目各自獨立地選自2至10。
其中重組人促紅血球生成素較佳為重組人促紅血球生成素α或β，特別是α。促紅血球生成素的製備是經由本領域公開的技術而得到。
在本方案中，其中m,n較佳的整數為2。
在本方案中，其中X是-(CH2 )k -，k選自2至10。
在本方案中，k的數目較佳為2至4，更佳為2。
在本方案中，甲氧基聚乙二醇基團的平均分子量較佳為5,000至40,000道爾頓，更佳為20,000道爾頓。
在本方案中，一個較佳實施方案所對應的偶聯物的結構式為： 其中P是指重組人促紅血球生成素，X是-(CH2 )k -或-CH2 (OCH2 CH2 )k -,k的數目選自2至10，m、n的數目選自2至10，m1 選自100至2000之間的整數。
其中X較佳為-(CH2 )k -，k的數目可更佳為自2至4，最佳的是2。
更佳地，本發明的一個實施方案對應的結構式為： m1 選自450至600的整數，其中P是指重組人促紅血球生 成素，更佳為重組人促紅血球生成素α或β，最佳為α。本發明還提供一種如下結構式的偶聯物： 其中P是指重組人促紅血球生成素糖蛋白，X是－(CH2 )k －或－CH2 (OCH2 CH2 )k －,k的數目選自2至10，m的數目選自2至10，m1 選自100至2000之間的整數。
更佳為，該結構式中P是指重組人促紅血球生成素α ；X是－(CH2 )k －，其中k是2；m的數目選自2；m1 選自450至600的整數。
本發明還提供一種如下結構式的偶聯物： 其中P是指重組人促紅血球生成素，X是-(CH2 )k -或-CH2 (OCH2 CH2 )k -,k的數目選自2至10，m1 選自100至2000之間的整數。
更佳為，該結構式中P是指重組人促紅血球生成素α；X是-(CH2 )k -，其中k是2；m1 選自450至600的整數。
本發明還提供一種如下結構式的偶聯物： 其中P是指重組人促紅血球生成素，X是-(CH2 )k -或-CH2 (OCH2 CH2 )k -,k的數目選自2至10，m1 選自100至2000之間的整數。
更佳為，該結構式中P是指重組人促紅血球生成素α；X是-(CH2 )k -，其中k是2；m1 選自450至600的整數。
本發明還提供一種如下結構式的偶聯物： 其中P是指重組人促紅血球生成素，X是-(CH2 )k -或-CH2 (OCH2 CH2 )k -,k的數目選自2至10，m、n的數目選自2至10，m1 選自100至2000之間的整數。
更佳為，該結構式中P是指重組人促紅血球生成素α；X是-(CH2 )k -，其中k是2；m、n的數目選自2；m1 選自450至600的整數。
本發明還提供一種如下結構式的偶聯物： 其中P是指重組人促紅血球生成素，X是－(CH2 )k －或－CH2 (OCH2 CH2 )k －,k的數目選自2至10，m1 選自100至2000之間的整數。
更佳為，該結構式中P是指重組人促紅血球生成素α ；X是－(CH2 )k －，其中k是2；m1 選自450至600的整數。
本發明還提供一種如下結構式的偶聯物： 其中P是指重組人促紅血球生成素，X是－(CH2 )k －或－CH2 (OCH2 CH2 )k －,k的數目選自2至10，m、n的數目選自2至10，m1 選自100至2000之間的整數。
更佳為，該結構式中P是指重組人促紅血球生成素α ；X是－(CH2 )k －，其中k是2；m、n的數目選自2；m1 選自450至600的整數。
本發明所公開的偶聯物是促紅血球生成素經由連接體(－CH2 －X－S－Y－)與甲氧基聚乙二醇基團共價連接進而被修飾，關鍵在於促紅血球生成素與連接體以形成－NH2 －CH2 －鍵形式而連接，與未被修飾的促紅血球生成素相比，本發明提供的偶聯物能夠提高血漿的停留時間和循環半衰期，降低清除率，在體內的生物活性更高，並且具有和促紅血球生成素一樣的用途。與以形成－NH－CO－鍵形式的聚乙二醇化促紅血球生成素偶聯物相比具有反應位點更單一，品質更可控的優點。本發明提供的聚乙二醇化促紅血球生成素偶聯物可以被用來治療以缺乏紅血球生成素或紅血球群缺少或缺陷為特徵的疾病。
本發明還公開了上述偶聯物的一種製備方法，包括以下步驟：首先是促紅血球生成素和含有已保護巰基的醛類物質發生還原胺化反應，形成經由－NH－CH2 －鍵連接的活化促紅血球生成素，然後，將所述活化促紅血球生成素脫保護，與活性甲氧基聚乙二醇衍生物偶聯，經由進一步的分離純化而得到。
本發明還公開了一種藥物組合物，包含：(1)治療量的上述聚乙二醇化促紅血球生成素偶聯物；(2)藥學可接受的藥物載體。
本發明含有任意的上述治療量的聚乙二醇化促紅血球生成素偶聯物用於治療以缺乏紅血球生成素或紅血球群缺少或缺陷為特徵的疾病。特別是治療下述疾病：末期腎功能衰竭或透析；AIDS相關性貧血，自身免疫性疾病，或 惡性腫瘤；囊性纖維變性；早期早熟性貧血；與慢性炎性疾病相關的貧血；脊髓損傷；急性失血；衰老和伴有異常紅血球產生的腫瘤疾病。
促紅血球生成素的製備
促紅血球生成素的製備方法是經由內源基因啟動表達蛋白質的方法，都是本領域公知的技術。其製備及治療應用詳細描述於美國專利US5547933、US5621080和US5955422，EP－B0209539和EP－B0148605和EP－B0209539，以及Huang,S.L.，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)(1984)2708－2712等。
重組促紅血球生成素的純化一般使用羥基磷灰石凝膠，離子交換層析，凝膠層析等本領域公知的純化方法進行純化，並在美國專利No.5547933、5621080和5955422等專利中均有詳細描述；Nobuo,I.等，生物化學雜誌(J.Biochem)107(1990)352－359也描述了重組EPO的純化方法。
聚乙二醇化促紅血球生成素偶聯物的製備
本發明提供一種製備聚乙二醇化促紅血球生成素偶聯物的製備方法，其步驟包括：(1)經由本領域技術人員所公知的技術製備結構式I的小分子醛化合物，如將硫代乙酸與烯醛類化合物進行邁克爾加成反應： 其中k的數目選自2至10，較佳為2；(2)將結構式I的小分子醛化合物與促紅血球生成素在緩衝液裏反應，並加入還原劑得到結構式為II的活化促紅血球生成素； 其中P是指重組人促紅血球生成素α 或β ，較佳為重組人促紅血球生成素α ，緩衝液的pH選自4.0至6.0，較佳為6.0，還原劑可以是硼氰化鈉、氰基硼氰化鈉，較佳為氰基硼氰化鈉；(3)利用本領域公知的技術在含有活化促紅血球生成素的緩衝液裏加入脫保護劑，脫去結構式為(II)的活化促紅血球生成素的乙醯基保護基，隨後加入結構式為III的活化甲氧基聚乙二醇進行聚乙二醇化反應。
其中加入的脫保護劑較佳為羥胺；緩衝體系的pH選自5.0至7.0，較佳為pH6.2；AG選自： 其中m、n的數目選自2至10，較佳為2；(4)聚乙二醇化促紅血球生成素偶聯物的純化方法採用本領域技術人員公知的技術，如離子交換層析、凝膠層析。
生物學活性的測試
經由本領域公知的各種測試可以測定促紅血球生成素或本發明提供的聚乙二醇化促紅血球生成素偶聯物的生物學活性。體內活性的測試經由小鼠皮下注射促紅血球生成素及本發明提供的聚乙二醇化促紅血球生成素偶聯物，連續三天，然後處死小鼠，取全血進行外周血細胞及網織紅血球計數，血細胞計數採用全自動血球計數儀計數。對獼猴靜脈注射進行藥效學研究，單次給藥劑量1.35mg/kg，作為對比藥物使用的促紅血球生成素給藥劑量為240μ/kg，每週三次，連續給藥六週，採集血樣進行相關血液學指標分析。
經由對本發明提供的聚乙二醇化促紅血球生成素偶聯物的測試資料表明：本發明提供的聚乙二醇化促紅血球生 成素偶聯物能夠明顯刺激小鼠外周血網織紅血球計數的升高，說明它們刺激紅血球生成，同時還能夠大大延長偶聯物在體內的半衰期。聚乙二醇化促紅血球生成素偶聯物對成熟的紅血球、血細胞壓積、血紅蛋白含量沒有明顯的影響，對外周血白細胞計數液沒有明顯影響。
藥物組合物的製備
可以經由本領域公知的方法用藥學可接受載體或賦形劑製成適合注射的藥物組合物。用於配製本發明的產物的較佳的藥學可接受載體是人血清白蛋白，人血漿蛋白質等。本發明的化合物可以在含有132mm氯化鈉的10mM磷酸鈉/鉀緩衝液pH7中配製。視需要，藥物組合物可以含有防腐劑。藥物組合物可以含有不同量的促紅血球生成素，較佳為10－1000微克/毫升。
 實施例1：乙醯基巰基丙醛的製備
將11.2 g(20mmol)丙烯醛與乾燥的100 ml THF加入到反應瓶中，冷卻至0℃，然後緩慢滴加1.52g(0.2 mol)硫代乙酸/20ml THF的混合溶液。滴加完畢保溫反應2小時後。35℃減壓濃縮除去過量的丙烯醛。然後快速管柱層析(洗脫液純正己烷→正己烷/乙酸乙酯＝50/1)，合併收集產物點，減壓濃縮至乾而獲得油狀液體0.6g。
實施例2：mPEG－MAL－01(20kD)的製備
將20g(1mmol)mPEG－OH(20kD)投入到200ml的單口瓶中，加入100ml甲苯，回流分水反應2.5hr；然後蒸出甲苯，冷卻至室溫，再加入100mlDCM，隨後加入1.18g(4mmol)的三光氣(triphosgene)，室溫密閉攪拌反應過夜；次日處理：將反應液於通風廚中沖析入200ml的無水乙醚中，過濾後真空乾燥得白色固體15g。將15g上述白色固體投入到200ml的單口瓶中，加入100ml Toluene/DCM(2：1)的溶液，再加入0.25g的HOSu，隨後加入0.3g三乙胺，室溫密閉攪拌反應4hr(或過夜)；反應結束後，將反應液過濾，濾液直接沖析入100ml的無水乙醚中，過濾，真空乾燥得白色固體14g，即為SC－mPEG(20kD)；將1.4g無水乙二胺用50ml DCM於200ml反應瓶中溶解，再取14g SC－mPEG(20kD)溶解於100ml的DCM溶解 後加入到上述乙二胺溶液中，反應過夜；次日停止反應並過濾，濾液加入500ml的飽和食鹽水洗滌，分出有機層，水層用DCM提取三次(200ml×3)，合併有機層，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮至100ml，於500ml無水乙醚中沉降析出固體，過濾，真空乾燥得白色固體13g，即為mPEG－NHCH2 CH2 NH2 (20kD)；將1.9g的MAL－ONP用50mL DCM溶解，加入0.04g的三乙胺，再將13g的mPEG－NHCH2 CH2 NH2 (20kD)用100ml的新開的DCM溶解，然後加入上述MAL－ONP的DCM溶液中，室溫反應過夜；次日減壓濃縮出DCM，殘餘物加入200ml的無水乙醚中，沉降析出固體，真空乾燥得白色固體12.5g，即為mPEG－MAL－01(20kD)。
實施例3：mPEG－MAL－02(20kD)的製備
將2.0g的MAL－ONP用50mL DCM溶解，加入0.05g的三乙胺，再將15g的mPEG－NH2 (20kD)用100ml的新開的DCM溶解，然後加入上述MAL－ONP的DCM溶液中，室溫反應過夜；次日減壓濃縮出DCM，殘餘物加入200ml 的無水乙醚中，沉降析出固體，真空乾燥得白色固體13g，即為mPEG－MAL－02(20kD)。
實施例4：mPEG－OPPS－01(20kD)的製備
將0.5g MPPS用50mlDCM溶解，隨後加入0.05g三乙胺和20g mPEG－NH2 (20kD)，室溫攪拌反應過夜，次日減壓濃縮出DCM，殘餘物加入200ml的無水乙醚，析出固體，過濾，真空乾燥得白色固體19g，即為mPEG－OPPS－01(20kD)。
實施例5：mPEG－OPPS－02(20kD)的製備
將0.5g MPPS用50mlDCM溶解，隨後加入0.05g三乙胺和20g mPEG－NHCH2 CH2 NH2 (20kD)，室溫攪拌反應過 夜，次日減壓濃縮出DCM，殘餘物加入200ml的無水乙醚，析出固體，過濾，真空乾燥得白色固體18.5g，即為mPEG－OPPS－02(20kD)。
實施例6：活化促紅血球生成素的製備
取促紅血球生成素原液60毫克，蛋白濃度為1.5毫克/毫升，共40毫升，體系為0.1M磷酸鈉鹽緩衝液，pH6.0；取2.5毫克乙醯基巰基丙醛溶於80微升乙腈後加入上述蛋白溶液；再稱取50毫克氰基硼氫化鈉加入上述反應液，並於慢速攪拌下反應，以冰浴控制反應溫度在10℃，反應24小時；然後將反應液轉入透析袋(截留分子量3500),對0.1M磷酸鈉鹽緩衝液，含2mM EDTA,pH6.25進行透析，以除掉過量的小分子醛，然後再加入羥胺脫去乙醯基，得活化促紅血球生成素。
實施例7：HH－EPO－014A的製備
經由實施例6得到的10mg活化促紅血球生成素(1.4毫克/毫升，0.1M磷酸鈉鹽緩衝液，含2mM EDTA,pH6.25)，加入100毫克mPEG－MAL－01(20kD)。攪拌反應60分鐘；再加入N－甲基馬來醯亞胺至濃度為5mM，室溫反應30分鐘，以去除蛋白上剩餘的巰基；然後將反應液於20mM乙酸－乙酸鹽緩衝液體系進行透析。
反應液的純化依次使用離子交換層析(SP Sepharose H.P)和凝膠層析(Superdex 200)，即可得到聚乙二醇化促紅血球生成素(HH－EPO－014A),約5mg。
實施例8：HH－EPO－014B的製備
經由實施例6得到的含有游離巰基的10mg活化促紅血球生成素(1.4毫克/毫升，0.1M磷酸鈉鹽緩衝液，含2mM EDTA,pH6.25)，加入100毫克mPEG－MAL－02(20kD)。攪拌反應60分鐘(25℃)；再加入N－甲基馬來醯亞胺至濃度為5mM，室溫反應30分鐘，以去除蛋白上剩餘的巰基；然後將反應液於20mM乙酸－乙酸鹽緩衝液體系進行透析。
反應液的純化依次使用離子交換層析(SP Sepharose H.P)和凝膠層析(Superdex 200)，即可得到聚乙二醇化促紅血球生成素(HH－EPO－014B),約5.5mg。
實施例9：HH－EPO－014C的製備
於實施例6得到的10mg活化促紅血球生成素(1.4毫克/毫升，0.1M磷酸鈉鹽緩衝液，含2mM EDTA,pH6.25)溶液中加入100毫克mPEG－MAL(20KD),攪拌反應60分鐘(25℃),再加入N－甲基馬來醯亞胺至濃度為5mM，室溫反應30分鐘，以去除蛋白上剩餘的巰基；然後將反應液於20mM乙酸－乙酸鹽緩衝液體系進行透析。
反應液的純化依次使用離子交換層析(SP Sepharose H.P)和凝膠層析(Superdex 200)，即可得到聚乙二醇化促紅血球生成素(HH－EPO－014C),約6.2mg。
實施例10：HH－EPO－014D的製備
於實施例6得到的10mg活化促紅血球生成素(1.4毫克/毫升，0.1M磷酸鈉鹽緩衝液，含2mM EDTA,pH6.25)溶液中加入100毫克mPEG－OPPS(20KD),攪拌反應60分鐘 (25℃),再加入N－甲基馬來醯亞胺至濃度為5mM，室溫反應30分鐘，以去除蛋白上剩餘的巰基；然後將反應液於20mM乙酸－乙酸鹽緩衝液體系進行透析。
反應液的純化依次使用離子交換層析(SP Sepharose H.P)和凝膠層析(Superdex 200)，即可得到聚乙二醇化促紅血球生成素(HH－EPO－014D),約6.0mg。
實施例11：HH－EPO－014E的製備
於實施例6得到的10mg活化促紅血球生成素(1.4毫克/毫升，0.1M磷酸鈉鹽緩衝液，含2mM EDTA,pH6.25)溶液中加入100毫克mPEG－OPPS－01(20KD),攪拌反應60分鐘(25℃),再加入N－甲基馬來醯亞胺至濃度為5mM，室溫反應30分鐘，以去除蛋白上剩餘的巰基；然後將反應液於20mM乙酸－乙酸鹽緩衝液體系進行透析。
反應液的純化依次使用離子交換層析(SP Sepharose H.P)和凝膠層析(Superdex 200)，即可得到聚乙二醇化促紅血球生成素(HH－EPO－014E),約5.6mg。
實施例12：HH－EPO－014F的製備
於實施例6得到的10mg活化促紅血球生成素(1.4毫克/毫升，0.1M磷酸鈉鹽緩衝液，含2mM EDTA,pH6.25)溶液中加入100毫克mPEG－OPPS－02(20KD)，攪拌反應60分鐘(25℃)，再加入N－甲基馬來醯亞胺至濃度為5mM，室溫反應30分鐘，以去除蛋白上剩餘的巰基；然後將反應液於20mM乙酸－乙酸鹽緩衝液體系進行透析。
反應液的純化依次使用離子交換層析(SP Sepharose H.P)和凝膠層析(Superdex 200)，即可得到聚乙二醇化促紅血球生成素(HH－EPO－014F),約5.6mg。
實驗例 實驗例1：聚乙二醇化促紅血球生成素偶聯物對小鼠的作用
實驗目的： 評價並比較聚乙二醇化促紅血球生成素偶聯物及促紅血球生成素蛋白對小鼠紅血球生成的影響。
材料及方法： 聚乙二醇化促紅血球生成素偶聯物HH－EPO－014A、HH－EPO－014B、HH－EPO－014C、HH－EPO－014D、HH－EPO－014E、HH－EPO－014F由江蘇豪森藥業股份有限公司提供；促紅血球生成素(陽性對照)：購自瀋陽三生制藥有限責任公司；昆明種小鼠，購自中科院上海實驗動物中心，體重25至30g，♀，各組動物數：10隻。
小鼠皮下注射聚乙二醇化促紅血球生成素偶聯物及促紅血球生成素，連續三天，然後處死小鼠，取全血進行外周血細胞及網織紅血球計數，血細胞計數用全自動血球計數儀計數。
結果與討論： 按照目前的給藥方案，聚乙二醇化促紅血球生成素偶聯物及促紅血球生成素均能明顯刺激小鼠外周血網織紅血球計數的升高，說明它們刺激紅血球生成(見表一)。聚乙二醇化促紅血球生成素偶聯物對成熟的紅血球、血細胞壓 積、血紅蛋白含量沒有明顯的影響(見表二)，對外周血白細胞計數液沒有明顯影響(見表三)。
實驗例2：聚乙二醇化促紅血球生成素偶聯物對獼猴的作用
實驗目的： 評價聚乙二醇化促紅血球生成素偶聯物對獼猴紅血球生成的影響
材料及方法： 聚乙二醇化促紅血球生成素偶聯物HH－EPO－014A，由江蘇豪森藥業股份有限公司提供；促紅血球生成素(陽性對照)：購自瀋陽三生制藥有限責任公司。使用前以含0.1% BSA的生理鹽水稀釋。
獼猴，體重5.5至8.5kg，雌雄不限，購自蘇州西山中科實驗動物中心。獼猴根據基礎血紅蛋白分組，每組三隻。HH－EPO－014A,1.35mg/kg，靜脈注射－次；EPO 240μ/kg，三次/週，連續給藥6週，每週測1至2次血液學指標。
結果及討論： HH－EPO－014A單次靜脈注射導致獼猴外周血血紅蛋白含量上升，血細胞壓積升高，說明HH－EPO－014A刺激血紅蛋白生成，該刺激作用在給藥35天后達到頂峰，隨後緩慢下降，對血紅蛋白的刺激作用大約為33%。陽性對照促紅血球生成素同樣升高獼猴外周血血紅蛋白含量，升高血細胞壓積，其作用在停藥後緩慢減弱。按照目前的給藥方案，單次靜脈注射HH－EPO－014A和多次連續靜脈注射促紅血球生成素對獼猴血紅蛋白生成的刺激作用相當(見附第1、2圖)。
第1圖係聚乙二醇化促紅血球生成素偶聯物(HH－EPO－014A)對獼猴血細胞壓積的影響。
第2圖係聚乙二醇化促紅血球生成素偶聯物(HH－EPO－014A)對獼猴血紅蛋白含量的影響。

Claims (30)

  1. 一種聚乙二醇化促紅血球生成素偶聯物，其結構式為P-NH-CH2 -X-S-Y-(OCH2 CH2 )m1 -OCH3 所述偶聯物是由甲氧基聚乙二醇基團通過式-CH2 -X-S-Y-中的-CH2 -基團與促紅血球生成素的氨基形成-NH-CH2 -鍵連接而得到，其中P是指重組人促紅血球生成素，X是-(CH2 )k -或-CH2 (OCH2 CH2 )k -，k的數目選自2至10，m1選自100至2000之間的整數，Y選自： 其中m、n的數目各自獨立地選自2至10。
  2. 如申請專利範圍第1項之偶聯物，其中，上述重組人促紅血球生成素是重組人促紅血球生成素α或β。
  3. 如申請專利範圍第2項之偶聯物，其中，上述重組人促紅血球生成素是重組人促紅血球生成素α。
  4. 如申請專利範圍第1項之偶聯物，其中，m=2，n=2。
  5. 如申請專利範圍第1項之偶聯物，其中，X是-(CH2 )k -，k選自2至10。
  6. 如申請專利範圍第5項之偶聯物，其中，k選自2至4。
  7. 如申請專利範圍第6項之偶聯物，其中，k為2。
  8. 如申請專利範圍第1項之偶聯物，其中，上述甲氧基聚乙二醇基團的平均分子量為5,000至40,000道爾頓(Dalton)。
  9. 如申請專利範圍第8項之偶聯物，其中，甲氧基聚乙二醇基團的平均分子量為20,000道爾頓。
  10. 如申請專利範圍第1項之偶聯物，其中，偶聯物的結構式為： ，P是指重組人促紅血球生成素，X是-(CH2 )k -或-CH2 (OCH2 CH2 )k -，k的數目選自2至10，m、n選自2至10，m1 選自100至2000之間的整數。
  11. 如申請專利範圍第10項之偶聯物，其中，X是-(CH2 )k -。
  12. 如申請專利範圍第10項之偶聯物，其中，k選自2至4。
  13. 如申請專利範圍第12項之偶聯物，其中，k為2。
  14. 如申請專利範圍第1O項之偶聯物，其中，偶聯物的結構式為其中m1 選自450至600的整數。
  15. 如申請專利範圍第10項之偶聯物，其中，上述重組人促紅血球生成素是重組人促紅血球生成素α或β。
  16. 如申請專利範圍第15項之偶聯物，其中，上述重組人促紅血球生成素是重組人促紅血球生成素α。
  17. 如申請專利範圍第1項之偶聯物，其結構式為： ，其中P是指重組人促紅血球生成素，X是-(CH2 )k -或-CH2 (OCH2 CH2 )k -，k的數目選自2至10，m選自2至10，m1 選自100至2000之間的整數。
  18. 如申請專利範圍第17項之偶聯物，其中，P是指重組人促紅血球生成素α，其中k是2；m為2；m1 為選自450至600的整數。
  19. 如申請專利範圍第1項之偶聯物，其結構式為： 其中P是指重組人促紅血球生成素，X是-(CH2 )k -或-CH2 (OCH2 CH2 )k -，k選自2至10，m選自2至10，m1 選自100至2000之間的整數。
  20. 如申請專利範圍第19項之偶聯物，其中，P是指重組人促紅血球生成素α；X是-(CH2 )2 -；m為2；m1 選自 450至600的整數。
  21. q申請專利範圍第1項之偶聯物，其中，偶聯物的結構式為： 其qP是q重組人q紅血球生成素，X是-(CH2 )k -或-CH2 (OCH2 CH2 )k -，k選自2至10，m1 選自100至2000之間的整數。
  22. 如申請專利範圍第21項之偶聯物，其中，P是指重組人促紅血球生成素α；X是-(CH2 )2 -；m1 選自450至600的整數。
  23. 如申請專利範圍第1項之偶聯物，其中，偶聯物的結構式為： 其中P是指重組人促紅血球生成素，X是-(CH2 )k -或-CH2 (OCH2 CH2 )k -，k的數目選自2至10；m選自2至10；m1 選自100至2000之間的整數。
  24. 如申請專利範圍第23項之偶聯物，其中，P是指重組人促紅血球生成素α；X是-(CH2 )2 -；m為2，m1 選自450至600的整數。
  25. 如申請專利範圍第1項之偶聯物，其結構式為： 其中P是指重組人促紅血球生成素，X是-(CH2 )k -或-CH2 (OCH2 CH2 )k -，k的數目選自2至10，m、n選自2至10，m1 選自100至2000之間的整數。
  26. 如申請專利範圍第25項之偶聯物，其中，P是指重組人促紅血球生成素α；X是-(CH2 )2 -；m、n為2；m1 選自450至600的整數。
  27. 一種製備申請專利範圍第1至第26項之任一項之偶聯物的方法，包括以下步驟：(1)促紅血球生成素和含有已保護巰基的醛類物質發生還原胺化反應，形成通過-NH-CH2 -鍵連接的活化促紅血球生成素；(2)將所述活化促紅血球生成素脫保護，並與活性甲氧基聚乙二醇衍生物偶聯。
  28. 一種藥物組合物，包含：(1)治療量的如申請專利範圍第1至26項中任意一項所述的聚乙二醇化促紅血球生成素偶聯物，和(2)藥學可接受的藥物載體。
  29. 一種申請專利範圍第1至第26項中任一項的聚乙二醇化促紅血球生成素偶聯物的用途，其係製備用於治療以缺乏紅血球生成素或紅血球群缺少或缺陷為特徵的疾病的藥物。
  30. 如申請專利範圍第29項之用途，其中，缺乏紅血球生成素或紅血球群缺少或缺陷為特徵的疾病是末期腎功能衰竭或透析；AIDS相關性貧血，自身免疫性疾病，或惡性腫瘤；囊性纖維變性；早期早熟性貧血；與慢性炎性疾病相關的貧血；脊髓損傷；急性失血；衰老和伴有異常紅血球產生的腫瘤疾病。
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