TWI429748B

TWI429748B - Cellulase and fiber oligosaccharide production method

Info

Publication number: TWI429748B
Application number: TW096130348A
Authority: TW
Inventors: Kazunobu Konishi; Koji Isaka; Naoaki Yamasaki
Original assignee: Asahi Kasei Chemicals Corp
Priority date: 2006-02-17
Filing date: 2007-08-16
Publication date: 2014-03-11
Also published as: JP2007215505A; TW200909583A

Description

纖維素酶及纖維寡糖之製造方法

本發明係關於一種酵素液之製造方法，其係選擇性地以高產率製造纖維寡糖之方法，其纖維素酶活性高，且纖維寡糖選擇率高；以及提供一種使用該酵素液之纖維寡糖之製造方法。

纖維寡糖係纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖、纖維五糖、纖維六糖之總稱，係葡萄哌喃糖單元為1~6個，經β-1,4鍵結之各種糖類。近年來，纖維寡糖與其他寡糖相同，其生理機能逐漸變得明確，且期待其用作功能性食品之新素材(參照非專利文獻1)。通常，作為獲得纖維二糖之方法，已知有：(1)使用以蔗糖為原料利用酵素之合成反應的方法，及(2)使用以纖維素為原料利用酵素之分解反應的方法。

作為上述(1)之利用酵素之合成反應，已知有如下之方法：於磷酸之存在下，以蔗糖為原料，依次使蔗糖磷酸化酶、葡萄糖異構酶及纖維二糖磷酸化酶與之反應，藉此獲得纖維二糖之方法(參照專利文獻1)。然而，於該方法中，為獲得纖維二糖而使用3種價格昂貴之酵素，且必須分別進行3階段之反應，若考慮及工業生產，則存在耗費酵素之成本，且生產性低之問題。

另一方面，作為上述(2)之利用酵素之分解反應，已眾所周知有將纖維素系材料以纖維素酶分解之方法。關於該酵素分解反應，其關鍵在於：由纖維素生產纖維寡糖時，如何提高含有纖維素酶之酵素液的纖維寡糖生產性之方面，及如何防止所生成之纖維二糖分解為葡萄糖之方面(參照非專利文獻2)。

就上述問題，先前已進行較多嘗試以提高纖維素酵素分解時之纖維寡糖的產率。

作為藉由使用纖維素酶，將纖維素酵素分解而選擇性地獲得纖維寡糖之方法，可列舉如下者。

於專利文獻2中，揭示有如下之纖維寡糖之製造方法：使用大量含有非晶形纖維素之纖維素原料，於木質素之存在下進行利用纖維素酶之水解反應，且隨時自反應液中至少採集由水解反應生成之纖維寡糖中之纖維二糖；於專利文獻3中，揭示有如下之纖維寡糖之製造方法：將含有天然木質纖維素之原料蒸解，於蒸解後不經乾燥而將所得之濕漿，藉由纖維素酶進行部分水解，至少採集纖維寡糖中之纖維二糖。

該等製造方法係使纖維素酶中所含有之作為纖維寡糖分解酵素之β-葡萄糖苷酶吸附於木質素上，抑制β-葡萄糖苷酶之作用，藉此抑制纖維寡糖分解為葡萄糖，從而提高纖維寡糖之反應選擇率。然而，於該等製造方法中，所得之糖化液中含有大量之木質素，其結果纖維寡糖之產率變低。又，存在如下問題：為獲得高純度之纖維寡糖，必須進行自糖化液之脫木質素處理，故使純化步驟變得複雜。

於專利文獻4中，揭示有如下之製造方法：藉由使含有 1~20質量%之木質素的木質纖維素與纖維素酶及白色腐朽菌等木質素分解菌一同反應，而製造纖維寡糖中之一種之纖維二糖。於該製造方法中，可不經纖維素之脫木質素處理，而提高纖維素酶對受質之作用，但於其分解產物中除纖維二糖以外亦混入有木質素分解物，故與上述相同，纖維寡糖之產率變低。又，存在如下之問題：為獲得高純度之纖維二糖，必須進行木質素分解物之除去步驟，而使純化步驟變得複雜。

又，作為使用特定之纖維素酶，將纖維素酵素分解，而提高纖維寡糖之產率的方法，可列舉如下者。

專利文獻5中，藉由屬於cellovibrio屬之微生物所生產的纖維素酶的作用，於水性反應液中，由纖維素系物質製造纖維寡糖的方法中，揭示有如下之纖維寡糖之製造方法：藉由組合超過濾反應器而解除產物抑制，生成蓄積纖維寡糖。根據該方法，可獲得僅包含纖維二糖、纖維三糖的纖維寡糖，作為纖維素系物質之酵素分解的分解產物。然而，存在如下之問題：屬於cellovibrio屬之微生物所生產的酵素難以對結晶性纖維素起作用，故為縮短反應時間、提高產率，必需以非晶態纖維素作為受質，而使步驟變得複雜。

專利文獻6中，於以纖維素酶分解纖維素，生成纖維寡糖的方法中，揭示有如下之纖維寡糖之製造方法：預先使纖維素酶與平衡化為pH值3.5~5.0的弱酸性陽離子交換樹脂接觸，藉此選擇性地除去纖維素酶中的β-葡萄糖苷酶，再使已除去該β-葡萄糖苷酶之纖維素酶與纖維素接觸。利用該製造方法，可藉由纖維素之酵素分解，減低葡萄糖，而獲得纖維寡糖為60%以上之分解產物。然而，於該製造方法中，存在如下問題：必須除去纖維素中之β-葡萄糖苷酶的步驟，而使纖維寡糖製造步驟變得複雜。又，於該纖維素酶純化步驟中，存在如下問題：相對於未處理之纖維素酶，必須75~1000倍之陽離子交換樹脂，因此纖維素酶處理量受到限制，纖維寡糖之生產性並不充分，纖維素酶純化成本、陽離子交換樹脂的分離純化劑成本變高。

專利文獻7中，揭示有：纖維素酶純化方法，其係將纖維素酯、或纖維素醚酯之任一者或者兩者與纖維素酶溶解，保溫固定時間後，使pH值變化，將不溶之固形餾分與溶液分離，藉此選擇性地除去纖維素酶中所含有之β-葡萄糖苷酶；又，纖維二糖之製造方法，其係將已除去該β-葡萄糖苷酶之纖維素酶及纖維素添加於水介質中，製成懸濁液，將該懸濁液保溫固定時間，使該懸濁液中生成纖維二糖，再採集該纖維二糖。

專利文獻8中，揭示有：纖維素酶之純化方法，其係於調整pH值以可溶解聚葡萄胺糖的水介質中，溶解上述聚葡萄胺糖及纖維素酶，保溫固定時間後，使pH值變化，將不溶之固形餾分與溶液分離，藉此選擇性地除去纖維素酶中所含有之β-葡萄糖苷酶；又，纖維二糖之製造方法，其係將已除去該β-葡萄糖苷酶之纖維素酶及纖維素添加於水介質中，製成懸濁液，將該懸濁液保溫固定時間，於該懸濁液中生成纖維二糖，再採集該纖維二糖。

根據該等製造方法，以纖維素衍生物或者聚葡萄胺糖對纖維素酶進行吸附分離處理，使其於吸附在纖維素衍生物或者聚葡萄胺糖上之狀態下與纖維素接觸，藉此提高纖維二糖之產率。然而，存在如下課題：該製造方法必須進行纖維素酶之純化處理，故會使製造步驟變得複雜，且纖維素酶純化中所使用之纖維素衍生物、聚葡萄胺糖價格昂貴，會使成本變高。又，亦存在如下問題：將纖維素酶與纖維素衍生物或者聚葡萄胺糖一同用於纖維素酵素分解中，因此，必須進行自分解反應液中將該等去除之步驟。

專利文獻9中，揭示有：將不溶性纖維素或者含纖維素之物質與來自木黴菌(Trichoderma)的纖維素酶，於水介質中保溫後，分離固形餾分，於該固形餾分中添加水溶性溶液，而獲得纖維二糖的方法。根據該製造方法，可減少纖維二糖製造步驟中所混入之β-葡萄糖苷酶，而選擇性地獲得纖維二糖。然而，存在如下問題：必須進行使纖維素酶吸附於固形餾分上之步驟以及分離固形餾分之步驟，使製程變得非常複雜。

[非專利文獻1]Cellulose Communications, 5, No2, 91-97 (1998)

[非專利文獻2]「纖維素酶」講談社Scientific發行，97-104 (1987)

[專利文獻1]日本專利特開平03-130086公報

[專利文獻2]日本專利特開平05-317073號公報

[專利文獻3]日本專利特開平07-184678號公報

[專利文獻4]日本專利特開平08-089274號公報

[專利文獻5]日本專利特開平01-256394號公報

[專利文獻6]日本專利特開平05-115293號公報

[專利文獻7]日本專利特開平05-227957號公報

[專利文獻8]日本專利特開平05-227958號公報

[專利文獻9]日本專利特開昭63-226294號公報

本發明所欲解決之問題在於提供以纖維素系物質為原料，且於纖維素酶之存在下，藉由酵素分解而選擇性地生產纖維二糖時，無需進行繁雜之步驟即可大量確保纖維素酶活性高，且纖維寡糖選擇率高之培養上清酵素液的酵素液之製造方法，及使用該酵素液之纖維寡糖之製造方法。

本發明者等發現：若以含有0.1~10重量%棉籽粕之培養基，培養屬於木黴菌屬的微生物，可獲得纖維素酶活性高之培養液。又，於除棉籽粕以外，進而含有0.01%以上之硫酸銨的培養基中，接種屬於木黴菌屬之微生物，將其於適宜條件下培養，藉此成功地降低了β-葡萄糖苷酶活性。

即，本發明係如下所述。

(1)一種含有纖維素酶之酵素液的製造方法，其包括：於含有來自屬於錦葵科之植物種子之成分的液體培養基中，培養屬於木黴菌屬之微生物。

(2)如(1)之酵素液之製造方法，其中：屬於錦葵科之植物種子係棉籽。

(3)如(2)之酵素液之製造方法，其係於含有0.1~10質量%之棉籽粕作為來自棉籽之成分的液體培養基中，培養屬於木黴菌屬之微生物。

(4)如(1)至(3)中任一項之酵素液之製造方法，其中：液體培養基含有自硫酸根離子、硫酸氫根離子及銨離子中選擇之至少一種。

(5)如(1)至(3)中任一項之酵素液之製造方法，其中：微生物係屬於里氏木黴菌之菌株。

(6)如(4)之酵素液之製造方法，其中：微生物係屬於里氏木黴菌之菌株。

(7)如(5)之酵素液之製造方法，其中：屬於里氏木黴菌之菌株，係里氏木黴菌GL-1株(獨立行政法人產業技術綜合研究所，專利生物寄存中心，寄存編號：FERM BP-10323)、及/或里氏木黴菌AKC-015株(獨立行政法人產業技術綜合研究所，專利生物寄存中心，寄存編號：FERM BP-10839)、及/或以GL-1株或AKC-015株作為母株而獲得之突變株。

(8)如(6)之酵素液之製造方法，其中：屬於里氏木黴菌之菌株，係里氏木黴菌GL-1株(獨立行政法人產業技術綜合研究所，專利生物寄存中心，寄存編號：FERM BP-10323)、及/或里氏木黴菌AKC-015株(獨立行政法人產業技術綜合研究所，專利生物寄存中心，寄存編號：FERM BP-10839)、及/或以GL-1株或AKC-015株為母株而獲得之突變株。

(9)一種含有纖維素酶之酵素液之製造方法，其包含：培養里氏木黴菌AKC-015株(獨立行政法人產業技術綜合研究所、專利生物寄存中心、寄存編號：FERM BP-10839)之步驟。

(10)一種纖維寡糖之製造方法，其包括：使用以請求項(1)、(2)、(3)、(6)、(7)、(8)及(9)中之任一項所述之製造方法製造的酵素液，將纖維素系物質酵素分解之步驟。

(11)一種纖維寡糖之製造方法，其包括：使用以(4)所述之製造方法製造的酵素液，將纖維素系物質酵素分解。

(12)一種纖維寡糖之製造方法，其包括：使用以(5)所述之製造方法製造的酵素液，將纖維素系物質酵素分解。

根據本發明，可製造纖維素酶活性高，且纖維寡糖選擇率高之酵素液，且藉由於纖維寡糖之製造中使用該酵素液，可不經過繁雜之步驟而以高產率製造纖維寡糖。

本發明中之所謂纖維素酶，係分解纖維素之酵素的總稱，若其具有纖維素分解活性，則包含於本發明中所稱之纖維素酶中。又，本發明中之纖維素酶活性，可表示為分解羧甲基纖維素(CMC)之酶活性(CMC-ase)、分解結晶纖維素(MCC)之酶活性(MCC-ase)，且藉由如下所述之方法進行測定。該等纖維素酶活性越高，纖維素之分解速度、分解率越提高，故較好。

(1)CMC-ase活性

準備480μl之溶解於20mM醋酸-醋酸鈉緩衝液(pH值為5)中的1%羧甲基纖維素鈉鹽溶液。於其中添加適當稀釋之酵素液20μl，於40℃下使其反應30分鐘。於95℃下，加熱15分鐘，使反應停止後，藉由3,5-二硝基水場酸法對還原糖進行比色定量。使用纖維二糖標準溶液作成標準曲線，將以纖維二糖換算於1分鐘內使1μmol之還原糖游離的酵素量定義為1酵素單位(1U)。

(2)MCC-ase活性

於50mM醋酸-醋酸鈉緩衝液(pH值為5)中懸濁有1.25質量%的結晶性纖維素(將旭化成化學製，商品名：Ceolus PH-101製成水分60%，以三英製作所製造、商品名：萬能攪拌混合機，藉由鉤片以90分鐘、126rpm進行混練攪拌者)的受質液0.4ml中添加適當稀釋之酵素液0.1ml，於40℃下使其反應30分鐘後，於95℃下加熱15分鐘，使反應停止後，藉由3,5-二硝基水楊酸法對還原糖進行比色定量。使用纖維二糖標準溶液作成標準曲線，將以纖維二糖換算於1分鐘內使1μmol之還原糖游離的酵素量定義為1酵素單位(1U)。

又，本發明中之所謂β-葡萄糖苷酶，係指分解纖維寡糖，而生成葡萄糖之酵素，可以β-葡萄糖苷酶活性進行定量。藉由纖維素之酵素分解，而獲得葡萄糖之情形時，酵素液之β-葡萄糖苷酶活性越高，葡萄糖之生成速度以及分解率變得越高，故較為有效。相反，為了以高產率獲得纖維寡糖，較為有效的是使用上述之纖維素酶活性高，且β-葡萄糖苷酶活性低之酵素液。該β-葡萄糖苷酶活性可藉由以下方法進行測定。

(3)β-葡萄糖苷酶活性

於200mM醋酸-醋酸鈉緩衝液(pH值為5)中溶解有2.0質量%纖維二糖(Aldrich製造；特等)受質液0.3ml中添加酵素液0.3ml，於40℃下使其反應30分鐘後，於95℃下加熱15分鐘，使反應停止後，使用組合有變旋酶與葡萄糖氧化酶之酵素法試劑即葡萄糖定量套組(葡萄糖CII-Test Wako，和光純藥工業公司製)，定量反應液中之葡萄糖濃度。將於1分鐘內使1μmol之葡萄糖游離的酵素量定義為1酵素單位(1U)。

本發明中使用之纖維素酶生產菌係屬於木黴菌屬之微生物。藉由接種、培養屬於木黴菌屬之微生物，可製造本發明之纖維素酶活性高之酵素。

將本發明之酵素液用於製造纖維寡糖之情形時，需獲得纖維素酶活性高、且纖維寡糖選擇率高之酵素液，上述屬於木黴菌屬之微生物中，較好的是使用屬於里氏木黴菌之菌株，特別好的是使用里氏木黴菌GL-1株(獨立行政法人產業技術綜合研究所，專利生物寄存中心，寄存編號：FERM BP-10323)、或者里氏木黴菌AKC-015株(獨立行政法人產業技術綜合研究所，專利生物寄存中心，寄存編號：FERM BP-10839)。於上述方法中，進而好的是，為了以高產率製造纖維寡糖，使用以上述之里氏木黴菌GL-1株或者AKC-015株為母株，可以高產率且高選擇率獲得纖維寡糖之，實施有公知之突變處理的突變株。

再者，GL-1株係於2005年4月15日，寄存於獨立行政法人產業技術綜合研究所，專利生物寄存中心(日本國茨城縣築波市東1丁目1番地1中央第6(郵政編號305-8566))，寄存編號：FERM BP-10323；AKC-015株係於2007年6月13日，寄存於獨立行政法人產業技術綜合研究所，專利生物寄存中心(日本國茨城縣築波市東1丁目1番地1中央第6(郵政編號305-8566))，寄存編號：FERM BP-10839。又，GL-1株係於2005年10月7日，寄存於中華民國(臺灣)食品工業發展研究所(FIRDI)，寄存編號BCRC930082。

此處所謂之公知之突變處理，係指如下之處理：若有需要則使用紫外線照射或如亞硝基胍之突變誘發劑，對具有纖維素酶生產能力之微生物進行突變誘導處理，自該等菌株中選擇纖維寡糖生產效率高之菌株。作為用於突變誘導處理之微生物，較好的是使用里氏木黴菌GL-1株(獨立行政法人產業技術綜合研究所，專利生物寄存中心，寄存編號：FERM BP-10323)、或者里氏木黴菌AKC-015株(獨立行政法人產業技術綜合研究所，專利生物寄存中心，寄存編號：FERM BP-10839)作為母株。

作為突變處理之一例，例如可列舉以下方法。

將里氏木黴菌GL-1株或者AKC-015株，於馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基上，於28℃下培養3~10日。將所生成之孢子懸濁於生理食鹽水中，以成為100,000~100,000,000個/ml，而EMS(ethyl methane sulfonate，甲基磺酸乙酯)實施突變處理(100~500μg/ml，pH值為7.0，28℃，5~24小時)。分泌纖維寡糖生產性高之纖維素酶的菌株之選擇，可藉由如下方法而達成：自該突變誘導處理孢子的懸濁液，以離心分離收集孢子，進行充分清洗，以葡萄糖等作為碳源進行培養，以公知之方法測定培養物之酶活性。例如，可使用各突變處理菌株之培養物，將纖維二糖或者結晶纖維素作為受質進行酵素分解，再對所生成之還原糖進行定量；亦可使用公知之顯色受質，使其與培養物進行酵素反應，藉此定性選擇目標菌株。

本發明之酵素液之製造方法中所使用之主培養用培養基，必須含有來自屬於錦葵科之植物種子之成分。作為屬於錦葵科之植物的種子，可列舉：棉、秋葵、朱槿、木槿、芙蓉、蜀葵等之種子，較好地可使用棉籽等。作為來自屬於錦葵科之植物種子之成分，例如可使用棉籽粕。此處所謂之棉籽，係指屬於錦葵科棉屬之植物種子及其外皮；所謂之棉籽粕，係自棉籽榨取棉籽油後之殘渣。本發明之棉籽粕，除上述棉籽之外，亦包含種子、棉籽殼、棉絨、棉花、花瓣等。用於培養屬於木黴菌屬之微生物的培養基中之棉籽的添加量，係與酵素液之纖維素酶活性具有密切關聯者，為獲得強力價之纖維素酶，培養基中之棉籽粕的添加量必須為0.1~10質量%。培養基中之棉籽粕的更好添加量為0.2~7質量%，進而較好的是2~5質量%。

為獲得可選擇性地製造本發明之纖維寡糖的β-葡萄糖苷酶活性得以減低的酵素液，除來自屬於錦葵科之植物種子之成分之外，較好的是將自硫酸根離子、硫酸氫根離子以及銨離子中選擇之至少一種添加於液體培養基中，特別好的是將硫酸銨添加於液體培養基中。作為培養基中之硫酸銨之添加量，為使β-葡萄糖苷酶活性減低，較好的是0.01~10質量%，更好的是0.02~2質量%。特別好的範圍為0.1~0.5質量%。

主培養中所使用之培養基中，除上述所揭示者之外，作為碳源，可列舉：纖維素粉末、纖維二糖、濾紙、一般紙類、鋸屑、麥麩、稻殼、甘蔗渣、大豆粕、咖啡粕、澱粉、乳糖、葡萄糖、甘油、酒精、有機酸等。又，作為氮源，可添加硝酸銨等無機銨鹽，尿素、胺基酸、肉汁、酵母萃取物、聚蛋白腖、蛋白分解物等有機含氮化合物。作為無機鹽類，可使用KH₂ PO₄ 、MgSO₄ ‧7H₂ O、CaCl₂ ‧2H₂ O、FeCl₃ ‧6H₂ O、MnCl₃ ‧4H₂ O、ZnSO₄ ‧7H₂ O等。若有需要，則可使用含有有機微量營養物之培養基。

培養若使用通常之通氣攪拌培養裝置或者固體培養裝置，且使用上述培養基，於溫度為20~40℃、較好的是26~30℃，培養pH值為2~8、較好的是2.5~5.5下進行培養，則於3~10日纖維素酶活性達到最高。繼而，以離心分離、過濾等公知之方法自培養液中除去菌體獲得上清液。該上清液可直接作為粗酵素液。

以下對纖維寡糖之製造方法加以說明。

酵素分解方法，可使用公知之方法，並無特殊限制，作為其中一例，可列舉如下之方法：將作為受質之纖維素系物質懸濁於水介質中，添加本發明之纖維素酶，一面進行攪拌或者振盪，一面加溫進行糖化反應。

於上述方法中，懸濁方法、攪拌方法、纖維素酶‧受質之添加方法‧添加順序、該等之濃度等反應條件，可加以適宜調整，以使其可以更高產率獲得纖維寡糖。此時之反應液之pH值及溫度，於酵素不會失活之範圍內即可，通常，於常壓下進行反應之情形時，溫度於5~95℃、pH值為1~11之範圍內即可。又，其壓力、溫度、pH值，與上述相同，可加以適宜調整，以使其可以更高產率獲得纖維寡糖，但於使用以上述之里氏木黴菌GL-1株及/或AKC-015株、或者該等之突變株作為纖維素酶生產菌而獲得之纖維素酶時，纖維素之酵素分解，較好的是於常壓下，於醋酸或者磷酸緩衝液中，於溫度50~60℃，pH值為3.0~5.5之範圍內進行。

本發明中所使用之纖維素系物質，較好的是含有纖維素之水不溶性纖維質物質。其來源可為植物性亦可為動物性，作為產生其之動植物，例如可列舉：木材、竹、麥桿、稻草、玉米芯粉、棉、苧麻、甘蔗渣、洋麻、甜菜、海鞘、細菌纖維素等。又，本發明中，除上述動植物所產生之天然纖維素系物質之外，亦可使用使天然纖維素系物質暫時化學性‧物理性溶解、或者膨潤後，進行再生而獲得之再生纖維素系物質，以及將纖維素系原料化學改性而成之纖維素衍生物系物質。該等之纖維素系物質，於工業上，亦可為紙、纖維素粉末、結晶纖維素等天然纖維素系原料，嫘縈等再生纖維素，鹼纖維素、磷酸膨潤纖維素等各種再生纖維素系原料，羧甲基纖維素鈉等各種纖維素衍生物系原料。其中，將所得之纖維寡糖使用於醫藥品、食品、化妝品時，更好的是使用天然纖維素系原料。作為原料，可使用該等之中1種纖維素系物質，亦可使用將2種以上混合而成者。

該酵素反應，可以批次式進行，亦可以連續式進行。於酵素分解反應中，為避免纖維二糖所造成之產物抑制，將反應系統內之纖維二糖濃度保持在特定範圍，於提高纖維寡糖之生產性方面較重要。作為將反應系統內之纖維二糖濃度保持在特定範圍之方法，可為如下之方法：藉由超濾、逆滲透過濾等膜過濾，自反應系統提取出所生成之纖維二糖的方法；將活性炭、竹、木材等乾燥植物粉等有機多孔基材，二氧化矽等無機多孔基材等導入至反應系統，使纖維二糖吸附於其等之上的方法；將纖維素受質固定於管柱等中，使含有纖維素酶之反應液流通之方法；將纖維素酶固定於高分子等中，使含有纖維素之反應液流通之方法。

以由上述之酵素分解而獲得之纖維寡糖為主成分的水溶液，可視需要實施脫色、脫鹽、除去酵素等純化處理。純化方法若為公知之方法則無特別限制，例如可使用活性碳處理，離子交換樹脂處理，層析處理，微濾、超濾、逆滲透過濾等過濾處理，晶析處理等，該等可單獨使用，亦可組合2種以上。

以上述方法純化之以纖維寡糖為主成分的水溶液，可直接使用，亦可視需要藉由乾燥使其固化。乾燥方法若為公知之方法則無特別限制，例如可使用噴霧乾燥、冷凍乾燥、轉筒乾燥、薄膜乾燥、層板乾燥、氣流乾燥、真空乾燥等，該等可單獨使用，亦可組合2種以上。

作為上述純化、乾燥處理時之纖維寡糖的介質，除水以外，亦可視需要使用有機溶劑等。此處所使用之有機溶劑亦無特別限制，例如較好的是於製造醫藥品、食品以及該等之添加劑之步驟中所使用者，可列舉於「醫藥品添加物事典」(藥事日報社(股)發行)、「日本藥典」、「食品添加物公定書」(均為廣川書店發行)中分類為溶劑者。水、有機溶劑可單獨使用，亦可併用2種以上，均為自由，亦可以1種介質暫時使其分散後，除去該介質，而使其分散於不同之介質中。

經過上述步驟之纖維寡糖之形態，並無特別限制，例如可於常溫下，以固體、懸濁液、乳液、糖漿、溶液狀使用。作為固體狀纖維寡糖之一例，可列舉粉末、顆粒、糰粒、成形體、積層體、固體分散體等。

藉由本發明而獲得之纖維寡糖的用途，並無特別限制，例如可於食品、化妝品、醫藥品、一般工業製品等領域，用作食品成分、化妝品成分、色素成分、香料成分、醫藥品藥效成分、農藥成分、飼料成分、肥料成分、培養基成分、分析用試劑成分，以及添加劑、中間原料、醱酵原料等。

藉由本發明而獲得之纖維寡糖，於食品方面，例如可用於：果凍、布丁、酸奶酪等凝膠狀食品，蛋黃醬、沙拉醬、沙司、調味汁類、湯、蔬菜加工品等調味料，咖喱、肉丁、肉醬、燉菜(肉)、湯等之罐頭食品、冷藏食品，漢堡包、酶肉、臘腸、義大利臘腸、火腿類等畜產加工品，魚糕、魚卷、魚肉火腿‧臘腸、炸魚糕等水產製品，麵包、生麵條、乾麵、通心粉、義大利麵、包子皮、蛋糕混料粉、麵包預混粉、白醬料、餃子‧春捲等之皮類等小麥加工食品，咖喱、醬料、湯、甜烹海味、果醬等之罐裝、瓶裝類，糖果、糖錠、硬糖、巧克力、餅乾、曲奇、米餅、日式點心、西式點心、小點心、蜜餞、布丁等點心類、油炸食品類，炸肉餅、餃子、包子等烹飪加工品，蔬菜糊、肉末、水果糊、魚貝類之糊等糊類。又，亦可使用於霜淇淋、冰牛奶、奶冰、泡沫乳油、煉乳、黃油、酸奶酪、乳酪、白醬料等乳製品，人造黃油、脂肪塗抹食品、酥油等油脂加工品等中。進而，亦可使用於可樂等碳酸飲料、加入有碳酸、酒精且與乳製品混合而成之水果飲料、果汁或者含水果飲料、乳性飲料等飲料，咖啡、牛奶、豆奶、可可奶、果奶、酸奶酪等乳酸/乳性飲料等，煎茶、烏龍茶、抹茶、紅茶等茶飲料等中。

以本發明中所獲得之纖維寡糖，可期待其具有乳酸菌、乳酸桿菌等之活性化等賦活腸內有用細菌群落，降低血糖濃度、血中胰島素濃度，降低血膽固醇，降低體脂肪百分比，促進脂肪代謝‧糖質代謝的功能，改善排便‧便臭，抗齲齒性等各種生理活性，因此，除上述通常食品用途外，其亦可作為生理活性物質，而用於機能性食品、健康食品、保健食品等用途中。

又，藉由本發明而獲得之纖維寡糖，為高純度者，因此可用作各種纖維寡糖衍生物之化學轉化原料。

[實施例]

基於實施例等對本發明加以更具體之說明，但本發明並不受該等實施例等之任何限制。

[實施例1]

將里氏木黴菌GL-1株(獨立行政法人產業技術綜合研究所，專利生物寄存中心，寄存編號：FERM BP-10323)，於馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基上，於28℃下培養7日，使孢子充分形成。將其1鉑耳量、棉籽粕(pharmamedia，Trader's公司製造)：0.15g、KH₂ PO₄ ：0.06g、(NH₄ )₂ SO₄ ：0.045g、MgSO₄ ‧7H₂ O：0.009g、CaCl₂ ‧2H₂ O：0.009g、ADEKA NOL LG109：0.03ml、微量元素液(將H₃ BO₃ 6mg、(NH₄ )₆ Mo₇ O₂₄ ‧4H₂ O 26mg、FeCl₃ ‧6H₂ O 100mg、CuSO₄ ‧5H₂ O 40mg、MnSO₄ ‧5H₂ O 8mg、ZnSO₄ ‧7H₂ O 200mg溶解並懸濁於100ml水中而成之溶液)：0.03ml溶解並懸濁於水：30ml中，將pH值調整為4.0，分注30ml於容積為150ml之錐形燒瓶中，添加結晶纖維素(旭化成化學公司製造，商品名PH-101)0.3g後，將其接種於經高壓釜滅菌之預培養用培養基上，於28℃下培養3日。

繼而將該培養液、棉籽粕：2g、KH₂ PO₄ ：0.2g、MgSO₄ ‧7H₂ O：0.03g、CaCl₂ ‧2H₂ O：0.03g、ADEKA NOL LG109：0.1ml、微量元素液：0.1ml溶解及懸濁於水：100ml中，將pH值調整為4.0，分注100ml於容積為500ml之錐形燒瓶中，添加結晶纖維素(旭化成化學公司製造，商品名PH-101)2g後，將其接種於經高壓釜滅菌之主培養用培養基上，於28℃下培養6日。於第6日將培養液離心分離，測定其上清液1ml之纖維素酶活性(CMCase)。將其結果作為pharmamedia-2%示於圖1。

[實施例2]

將里氏木黴菌GL-1株於馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基上，於28℃下培養7日，使孢子充分形成。將其1鉑耳量、棉籽粕(pharmamedia，Trader's公司製造)：0.15g、KH₂ PO₄ ：0.06g、(NH₄ )₂ SO₄ ：0.045g、MgSO₄ ‧7H₂ O：0.009g、CaCl₂ ‧2H₂ O：0.009g、ADEKA NOL LG109：0.03ml、微量元素液(將H₃ BO₃ 6mg、(NH₄ )₆ MO₇ O₂₄ ‧4H₂ O 26mg、FeCl₃ ‧6H2O 100mg、CuSO₄ ‧5H₂ O 40mg、MnSO₄ ‧5H₂ O 8mg、ZnSO₄ ‧7H₂ O 200mg溶解並懸濁於水100ml中而成之溶液)：0.03ml溶解並懸濁於水：30ml中，將pH值調整為4.0，分注30ml於容積為150ml之錐形燒瓶中，添加結晶纖維素(旭化成化學公司製造，商品名PH-101)0.3g後，將其接種於經高壓釜滅菌之預培養用培養基上，於28℃下培養3日。

繼而將該培養液、棉籽粕：1g、KH₂ PO₄ ：0.2g、MgSO₄ ‧7H₂ O：0.03g、CaCl₂ ‧2H₂ O：0.03g、ADEKA NOL LG109：0.1ml、微量元素液：0.1ml溶解及懸濁於水：100ml中，將pH值調整為4.0，分注100ml於容積為500ml之錐形燒瓶中，添加結晶纖維素(旭化成化學公司製造、商品名PH-101)2g後，將其接種於經高壓釜滅菌之主培養用培養基上，於28℃下培養6日。於第6日將培養液離心分離，測定其上清液1ml之纖維素酶活性(CMCase)。將其結果作為pharmamedia-2%示於圖1。

[比較例1]

於與實施例1、或者2相同之方法中，使用包含麥麩(日本製粉)2g或者1g(分別記作麥麩-2%、1%)、玉米漿(和光純藥製)2g或者1g(分別記作玉米漿-2%、1%)的主培養用培養基，代替使用棉籽粕(實施例1中為1g，實施例2為2g)之主培養用培養基，除此之外以與實施例1相同之方法培養里氏木黴菌GL-1株6日。於第6日將培養液離心分離，測定其上清液1ml之纖維素酶活性(CMCase)，將各自之結果示於圖1。

[實施例3]

將里氏木黴菌GL-1株於馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基上，於28℃下培養7日，使孢子充分形成。將其1鉑耳量、棉籽粕(pharmamedia，Trader's公司製造)：0.15g、KH₂ PO₄ ：0.06g、(NH₄ )₂ SO₄ ：0.045g、MgSO₄ ‧7H₂ O： 0.009g、CaCl₂ ‧2H₂ O：0.009g、ADEKA NOL LG109：0.03ml、微量元素液(將H₃ BO₃ 6mg、(NH₄ )₆ Mo₇ O₂₄ ‧4H₂ O 26mg、FeCl₃ ‧6H₂ O 100mg、CuSO₄ ‧5H₂ O 40mg、MnSO₄ ‧5H₂ O 8mg、ZnSO₄ ‧7H₂ O 200mg溶解並懸濁於水100ml中而成之溶液)：0.03ml溶解並懸濁於水：30ml中，將pH值調整為4.0，分注30ml於容積為150ml之錐形燒瓶中，添加結晶纖維素(旭化成化學公司製造，商品名PH-101)0.3g後，將其接種於經高壓釜滅菌之預培養用培養基上，於28℃下培養3日。

繼而將該培養液、棉籽粕：2g、(NH₄ )₂ SO₄ ：0.15g、KH₂ PO₄ ：0.2g、MgSO₄ ‧7H₂ O：0.03g、CaCl₂ ‧2H₂ O：0.03g、ADEKA NOL LG109：0.1ml、微量元素液：0.1ml溶解及懸濁於水：100ml中，將pH值調整為4.0，分注100ml於容積為500ml之錐形燒瓶中，添加結晶纖維素(旭化成化學公司製造，商品名PH-101)2g後，將其接種於經高壓釜滅菌之主培養用培養基上，於28℃下培養6日。於第6日將培養液離心分離，測定其上清液1ml之纖維素酶活性(CMCase)、纖維素酶活性(MCCase)及β-葡萄糖苷酶活性，將各自之結果示於表1、2及表3。

[實施例4]

將里氏木黴菌GL-1株於馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基上，於28℃下培養7日，使孢子充分形成。將其1鉑耳量、棉籽粕(pharmamedia，Trader's公司製造)：0.15g、KH₂ PO₄ ：0.06g、(NH₄ )₂ SO₄ ：0.045g、MgSO₄ ‧7H₂ O： 0.009g、CaCl₂ ‧2H₂ O：0.009g、ADEKA NOL LG109：0.03ml、微量元素液(將H₃ BO₃ 6mg、(NH₄ )₆ Mo₇ O₂₄ ‧4H₂ O 26mg、FeCl₃ ‧6H₂ O 100mg、CuSO₄ ‧5H₂ O 40mg、MnSO₄ ‧5H₂ O 8mg、ZnSO₄ ‧7H₂ O 200mg溶解並懸濁於水100ml中而成之溶液)：0.03ml溶解並懸濁於水：30ml中，將pH值調整為4.0，分注30ml於容積為150ml之錐形燒瓶中，添加結晶纖維素(旭化成化學公司製造、商品名PH-101)0.3g後，將其接種於經高壓釜滅菌之預培養用培養基上，於28℃下培養3日。

繼而將該培養液、棉籽粕：1g、(NH₄ )₂ SO₄ ：0.15g、KH₂ PO₄ ：0.2g、MgSO₄ ‧7H₂ O：0.03g、CaCl₂ ‧2H₂ O：0.03g、ADEKA NOL LG109：0.1ml、微量元素液：0.1ml溶解及懸濁於水100ml中，將pH值調整為4.0，分注100ml於容積為500ml之錐形燒瓶中，添加結晶纖維素(旭化成化學公司製造，商品名PH-101)2g後，將其接種於經高壓釜滅菌之主培養用培養基上，於28℃下培養6日。於第6日將培養液離心分離，測定其上清液1ml之纖維素酶活性(CMCase)、纖維素酶活性(MCCase)及β-葡萄糖苷酶活性，將各自之結果示於表1、2及表3。

[實施例5]

對以與實施例1相同之方式培養而獲得之培養液之上清液1mL的纖維素酶活性(CMCase)、纖維素酶活性(MCCase)及β-葡萄糖苷酶活性進行測定，將各自之結果示於表1、2及表3。

[實施例6]

對以與實施例2相同之方式培養而獲得之培養液之上清液1mL的纖維素酶活性(CMCase)、纖維素酶活性(MCCase)及β-葡萄糖苷酶活性進行測定，將各自之結果示於表1、2及表3。

表1係於作為主培養用培養基之成分之棉籽粕(於表中記作pharmamedia)以及硫酸銨(於表中記作硫酸銨)的每種添加量下，對培養液之CMCase活性(相對值，單位為U)進行比較者。可知，若於培養基中添加硫酸銨，則即使棉籽粕為低添加量亦可增加CMCase。

表2係於作為主培養用培養基之成分之棉籽粕(於表中記作pharmamedia)以及硫酸銨(於表中記作硫酸銨)的每種添加量下，對培養液之MCCase活性(相對值，單位為U)進行比較者。可知，若於培養基中添加硫酸銨，則即使棉籽粕為低添加量亦可增加MCCase。

表3係於作為主培養用培養基之成分之棉籽粕(於表中記作pharmamedia)以及硫酸銨(於表中記作硫酸銨)的每種添加量下，對培養液之β-葡萄糖苷酶活性(相對值，單位為U)進行比較者。可知，若於培養基中添加硫酸銨，則可提高表1以及表2中所示之纖維素酶活性(CMCase、MCCase)，且降低β-葡萄糖苷酶活性。

因此，藉由於培養基中添加棉籽粕及硫酸銨，可提高纖維素酶活性，降低β-葡萄糖苷酶活性，因此，若於纖維素系物質之酵素分解中使用本發明之酵素液，則可期望以高產率獲得纖維寡糖。

[實施例7]

於主培養用培養基100ml中放入棉籽粕：5g，除此之外，以與實施例4相同之方式進行培養，於第7日將培養液離心分離後，上清液1ml之纖維素酶活性(CMCase)及纖維素酶活性(MCCase)分別為58.4及19.4。

[實施例8]

於主培養用培養基100ml中放入棉籽粕：7g，除此之外，以與實施例4相同之方式進行培養，於第7日將培養液離心分離後，上清液1mL之纖維素酶活性(CMCase)及纖維素酶活性(MCCase)分別為17.9及8.0。

[實施例9]

將里氏木黴菌GL-1株於馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基上，於28℃下培養7日，使孢子充分形成。將其1鉑耳量、棉籽粕(pharmamedia，Trader's公司製造)：0.15g、KH₂ PO₄ ：0.06g、(NH₄ )₂ SO₄ ：0.045g、MgSO₄ ‧7H₂ O：0.009g、CaCl₂ ‧2H₂ O：0.009g、ADEKA NOL LG109：0.03ml、微量元素液(將H₃ BO₃ 6mg、(NH₄ )₆ Mo₇ O₂₄ ‧4H₂ O 26mg、FeCl₃ ‧6H₂ O 100mg、CuSO₄ ‧5H₂ O 40mg、MnSO₄ ‧5H₂ O 8mg、ZnSO₄ ‧7H₂ O 200mg溶解並懸濁於水100ml中而成之溶液)：0.03ml溶解並懸濁於水：30ml中，將pH值調整為4.0，分注30ml於容積為150ml之錐形燒瓶中，添加結晶纖維素(旭化成化學公司製造，商品名PH-101)0.15g後，將其接種於經高壓釜滅菌之預培養用培養基上，於28℃下培養6日。於培養之第6日，將GL-1株之培養液離心分離後，測定其上清液1ml之纖維素酶活性(CMCase)以及β-葡萄糖苷酶活性，CMCase活性為29.4U，β-葡萄糖苷酶活性為0.145U。

於與上述相同之操作中，將所使用之菌株，由GL-1株換成AKC-015株，進行培養，將培養液離心分離後，測定其上清液1mL之纖維素酶活性(CMCase)以及β-葡萄糖苷酶活性，CMCase活性為37.0U，β-葡萄糖苷酶活性為0.046U。

[產業上之可利用性]

藉由本發明之製造方法而獲得之纖維寡糖，除通常之食品素材之外，亦可作為功能性食品素材、醫藥品以及其他化學品之中間體合成材料等化學轉換原料、醱酵原料，而較好地利用於食品、醫藥品、一般工業製品領域中。

圖1係將棉籽粕與其他主培養用培養基成分的CMCase活性(相對比)進行比較者。以棉籽粕培養之培養液，與其他培養基成分系相比，於相同培養條件下，顯示出更高之CMCase活性(相對比)。

Claims

一種含有纖維素酶之酵素液的製造方法，其包括：於直接添加0.1~10質量%之棉籽粕作為來自棉籽之成分的液體培養基中，培養屬於里氏木黴菌(Trichoderma reesei)之微生物。
如請求項1之酵素液的製造方法，其中液體培養基含有選自硫酸根離子、硫酸氫根離子及銨離子中之至少一種。
如請求項2之酵素液的製造方法，其中屬於里氏木黴菌之微生物為里氏木黴菌GL-1株(獨立行政法人產業技術綜合研究所，專利生物寄存中心，寄存編號：FERM BP-10323；寄存號碼BCRC 930082)。
一種纖維寡糖之製造方法，其包括：使用以如請求項1、2及3中任一項之製造方法製造的酵素液，將纖維素系物質酵素分解。