TWI425091B

TWI425091B - 水禽及家畜疫苗用之ｄｎａ佐劑

Info

Publication number: TWI425091B
Application number: TW100100846A
Authority: TW
Inventors: Chunyen Chu; Yumin Lin
Original assignee: Univ Nat Pingtung Sci & Tech
Priority date: 2011-01-10
Filing date: 2011-01-10
Publication date: 2014-02-01
Also published as: TW201229238A

Description

水禽及家畜疫苗用之DNA佐劑

本發明是有關於一種疫苗佐劑，特別是有關於一種水禽及家畜疫苗用之DNA佐劑。

目前動物用疫苗主要使用的佐劑有鋁膠佐劑及油質佐劑，惟其缺點在於兩者均為化學性佐劑，無法提升特異性Th1細胞的免疫反應，尤其對不活化疫苗及活毒減毒疫苗，無法產生足夠保護力之體液性及細胞性的免疫反應。

Krieg A. M.等人於1995年首次在自然(Nature)期刊中以小鼠為動物試驗模式，證實含有未甲基化(unmethylated)之胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸模組(CpG motif)的去氧核醣核酸(deoxyribonucleic acid；DNA)具有促進多種免疫細胞活化、誘導多種細胞因子產生、易被組織吸收等功效，後於1998年被確認其有效性，復於2003年更被證實具有疫苗佐劑效用。含有CpG模組的寡核苷酸(oligodeoxynucleotides；ODN)可以刺激多種大型家畜動物，包括牛、豬、羊等之淋巴細胞及抗原呈現細胞的活性，增加樹突狀細胞(Dendritic Cell；DC)的抗原呈現活化及成熟作用，促進免疫系統對特定抗原趨向Th1細胞反應。例如本案發明人曾提出利用對水禽具有種別專一性、經磷硫化修飾(phosphorothioate-modified；PTO-modified)之含有CpG模組的寡核苷酸及包含不同套數CpG模組之質體對水禽具有免疫促進活性。

含有CpG模組的寡核苷酸可透過以下機制：(1)增加樹突狀細胞的活化、成熟及抗原呈現作用；(2)樹突狀細胞遷移作用的增加；(3)顯著增加小鼠及人樹突狀細胞的細胞標記(例如MHC-II、CD40、CD80、CD86及IL-12)的表現；(4)增加未刺激的樹突狀細胞(priming DC)對特定抗原的Th1細胞反應；(5)增加CD8⁺ T細胞的活性，可誘發對特定病毒或腫瘤的細胞毒殺作用(cytotoxicity；CTL)等，提昇免疫作用。運用含有CpG模組的寡核苷酸，在先天免疫反應上可產生具有保護性的免疫反應對抗病毒、細菌及胞外寄生蟲的感染，而與疫苗共同作用時可活化B細胞產生抗體、活化抗原呈獻細胞(antigen-presenting cell；APC)分泌細胞激素，例如干擾素-γ(interferon-γ；IFN-γ)，以促進疫苗的免疫反應，因此含有CpG模組的寡核苷酸可取而代之作為佐劑。

一般而言，含有CpG模組的寡核苷酸之CpG模組多為未甲基化CpG模組，而習知技術係以化學方法合成含有CpG模組的磷硫化修飾寡核苷酸。惟以人工合成的含有CpG模組的寡核苷酸必須利用化學修飾核酸之間的磷酸二酯鍵，以硫取代磷(即前述之磷硫化修飾)，降低去氧核醣核酸酶(deoxyribonuclease；DNase)分解含有CpG模組的寡核苷酸的速率，不僅合成費時、無法量產且價格昂貴，且又可能喪失持續誘發免疫反應的效果。

此外，含有CpG模組的寡核苷酸具有種別專一性，不同物種間具有較佳免疫促進作用的CpG模組的結構亦有差異。目前已確知對人及小鼠有免疫調節作用之CpG模組序列並不相同，因此對不同物種之有效CpG模組序列仍須經由實驗進一步證實。含有CpG模組的寡核苷酸運用在家禽產業的研究始於2002年，但多以化學合成之含有CpG模組的寡核苷酸進行活體外(in vitro )的評估，活體內(in vivo )評估也侷限於針對抗體產生的體液性免疫方面，對於病毒感染細胞時真正有效的細胞性免疫反應並無深入探討。

有鑑於此，亟需提出一種動物免疫刺激性(immunostimulatory)寡核苷酸，藉以提供適用於動物用疫苗之CpG DNA佐劑並改善習知DNA佐劑必須利用化學修飾之繁瑣步驟。

因此，本發明之一態樣是在提供一種水禽及家畜疫苗用之DNA佐劑，其中此DNA佐劑為含多套(multi-copy)水禽類專一性CpG模組且未經磷硫化處理之免疫刺激性寡核苷酸或含此之重組質體。此DNA佐劑可利用原核生物表現系統大量生產，又可免去習知DNA佐劑必須利用化學修飾之繁瑣步驟。

其次，本發明之另一態樣是在提供一種疫苗組成物，其係包括抗原以及DNA佐劑，其中DNA佐劑為水禽類專一性免疫刺激性寡核苷酸或含此之重組質體，且此免疫刺激性寡核苷酸含有多套水禽類專一性CpG模組且未經磷硫化處理。當此疫苗組成物施用於至少一受免疫(immunized)動物(例如水禽類、牛或豬)時，藉以促進至少一受免疫動物之周邊免疫細胞增生，不僅可降低習知佐劑的使用量及成本，又可增進抗原免疫性較為不足之疫苗的效力。

根據本發明之上述態樣，提出一種水禽及家畜疫苗用之DNA佐劑。在一實施例中，此DNA佐劑之特徵在於為水禽類專一性免疫刺激性寡核苷酸或含此之重組質體，且未經磷硫化處理。上述水禽類免疫刺激性寡核苷酸可包括但不限於如序列辨識編號1所示序列之第一聚核苷酸、如序列辨識編號2所示序列之第二聚核苷酸或如序列辨識編號3所示序列之第三聚核苷酸。上述DNA佐劑施用於至少一受免疫動物(例如水禽類、牛或豬)時，可促進至少一受免疫動物之周邊免疫細胞增生。

根據本發明之其他態樣，提出一種疫苗組成物。在一實施例中，此疫苗組成物可包含一抗原以及一DNA佐劑，其中此DNA佐劑為含多套水禽類專一性CpG模組且未經磷硫化處理之免疫刺激性寡核苷酸或含此之重組質體。在一例示中，此水禽類專一性免疫刺激性寡核苷酸可包括但不限於如序列辨識編號1所示序列之第一聚核苷酸、如序列辨識編號2所示序列之第二聚核苷酸或如序列辨識編號3所示序列之第三聚核苷酸。當前述疫苗組成物施用於至少一受免疫動物(例如水禽類、牛或豬)時，可促進至少一受免疫動物之周邊免疫細胞増生。

依據本發明一實施例，上述之疫苗組成物可包括但不限於重組蛋白、活毒疫苗或不活化疫苗。在一例示中，前述之重組蛋白可例如序列辨識編號4所示序列之多肽。

應用本發明水禽及家畜疫苗用之DNA佐劑，其係利用含多套水禽類專一性CpG模組且未經磷硫化處理之免疫刺激性寡核苷酸或含此之重組質體，作為疫苗佐劑，可免去習知DNA佐劑必須利用化學修飾之繁瑣步驟。當含有此DNA佐劑與抗原之疫苗組成物施用於至少一受免疫動物(例如水禽類、牛或豬)時，不僅可促進動物體內之周邊免疫細胞増生，降低習知佐劑的使用量及成本，又可增進抗原免疫性較為不足之疫苗的效力。

承前所述，本發明提供一種水禽及家畜疫苗用之DNA佐劑，此DNA佐劑為含多套水禽類專一性CpG模組且未經磷硫化處理之免疫刺激性寡核苷酸或含此之重組質體(recombinant plasmid)。此DNA佐劑可利用原核生物表現系統大量生產，又可免去習知DNA佐劑必須利用化學修飾之繁瑣步驟。

製備DNA佐劑

在一實施例中，此處所述之多套「水禽類專一性CpG模組」，係指頭尾相接之多個「單套水禽類專一性CpG模組」。在一例示中，「單套水禽類專一性CpG模組」即單一CpG模組序列，從5’端至3’端之序列可例如「GACGTT」。前述之「單套水禽類專一性CpG模組」以頭尾相接的方式，即連接成含多套(multi-copy)水禽類專一性CpG模組之免疫刺激性寡核苷酸。

在一例示中，前述之水禽類專一性免疫刺激性寡核苷酸可包括6套至24套水禽類專一性CpG模組。在另一例示中，此水禽類專一性免疫刺激性寡核苷酸可包括但不限於如序列辨識編號1所示序列之第一聚核苷酸、如序列辨識編號2所示序列之第二聚核苷酸或如序列辨識編號3所示序列之第三聚核苷酸。

在另一例示中，亦可先利用含一或多套水禽類專一性CpG模組的重組質體，經由重複進行數次特定限制酶之切割、接合特定之序列以及核酸選殖技術，而得到上述免疫刺激性寡核苷酸之重組質體。

請參閱第1A圖至第1C圖，其係繪示根據本發明數個實施例之DNA佐劑的製造方法的部分流程圖。

在第1A圖中，首先提供含三套CpG模組的重組質體(n=3) P1。在一例示中，上述重組質體所含之三套CpG模組(n=3)可利用第1表所示之引子對(明欣生技公司代為合成，台北，台灣)進行聚合酶鏈鎖反應(PCR)而獲得。上述引子對之上游引子可如序列辨識編號4所示序列，而下游引子可如序列辨識編號5所示序列：

利用第1表之引子對進行黏合反應，所得到的核酸片段(n=3)係含有三套CpG模組，如序列辨識編號6所示序列之第四聚核苷酸，其中由5’端至3’端依序可包括限制酶A切位、三套CpG模組以及限制酶B切位。在一例示中，前述第四聚核苷酸(n=3)之三套CpG模組之間可包括連接基(例如第1表圖號*所示)，以確保在後續的選殖過程中序列的正確。

在一例示中，前述第四聚核苷酸(n=3)之5’端的限制酶A切位可例如為BglII (切位序列為5’-A↓GATCT-3’，↓表示酶切割點)，如第1表中斜體文字所標示之序列GATCT 。其次，前述核酸片段(n=3)之3’端的限制酶B切位可例如為BamHI (切位序列為5’-G↓GATCC-3’，↓表示酶切割點)，如第1表中斜體文字所標示之序列GATCC 。此外，以pET-32a載體(約5900 kb)為例，在載體上另設計有限制酶C切位，例如PstI (切位序列為5’-CTGCA↓G-3’，↓表示酶切割點)，以利於後續進行接合更多套數之CpG模組。惟需說明的是，上述限制酶A切位、限制酶B切位以及限制酶C切位之序列端視欲連接的載體而異，故不限於此處所舉。接著，上述所得之第四聚核苷酸(n=3)可選殖到商業上可取得之任何載體中，如重組質體(n=3)P1之所示。

在本發明一實施例中，DNA佐劑可為含六套CpG模組之重組質體(n=6)。請再參閱第1A圖。可利用限制酶A與限制酶C切割重組質體(n=3) P1(例如約5885 bp)，而獲得片段N1(約4547 bp)；並利用限制酶B與限制酶C切割而獲得片段N2(約1366 bp)。上述片段N1的5’端具有三套CpG模組(以內部空白表示)，而另一片段N2的3’端則具有三套CpG模組(以填滿灰色表示)。

然後，例如可利用接合酶，進行接合反應，使片段N2的3’端的三套CpG模組(以填滿灰色表示)接合於片段N1的5’端的三套CpG模組(以內部空白表示)，而形成具有頭尾相接、含六套CpG模組之重組質體(n=6) P2(約5913 kb)，如第1A圖所示。在一例示中，此含6套CpG模組之免疫刺激性寡核苷酸為如序列辨識編號1所示序列之第一聚核苷酸，且含6套CpG模組或含此之重組質體(n=6) P2可為DNA佐劑。

在本發明另一實施例中，DNA佐劑可為含十二套CpG模組或含此之重組質體(n=12)。請參閱第1B圖，可參考與第1A圖相同的策略，利用上述所得含六套CpG模組之重組質體(n=6) P2，經由重複進行特定限制酶之切割，接合片段N3與片段N4以及核酸選殖技術，而得到含十二套CpG模組之重組質體(n=12) P3(約5969 kb)。在一例示中，含有12套CpG模組之免疫刺激性寡核苷酸為如序列辨識編號2所示序列之第二聚核苷酸。

在本發明又一實施例中，DNA佐劑亦可為含廿四套CpG模組或含此之重組質體(n=24)。請參閱第1C圖，可參考與第1A圖或第1B圖相同的策略，可利用上述所得含十二套CpG模組之重組質體(n=12) P3，經由重複進行特定限制酶之切割、接合片段N5與片段N6以及核酸選殖技術，而得到含廿四套CpG模組之重組質體(n=24) P4(約6081 kb)。在一例示中，含有24套CpG模組之免疫刺激性寡核苷酸為如序列辨識編號3所示序列之第三聚核苷酸。

上述所得之含多套CpG模組之重組質體，例如重組質體(n=6) P2、重組質體(n=12) P3、重組質體(n=24)P4，可進一步轉型至宿主細胞，例如大腸桿菌(Escherichia coli )，以進行大量生產，因此當可免去習知DNA佐劑必須利用化學修飾(例如磷硫化處理)之繁瑣步驟。由於細菌體之轉型與大量培養等步驟係利用習知技術進行，實為本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者所熟知，故在此不再逐一贅述。

疫苗組成物

本發明此處所稱之「疫苗組成物」主要指包括習知動物用疫苗以及上述DNA佐劑，其中適用的DNA佐劑包括含多套水禽類專一性CpG模組的免疫刺激性寡核苷酸、含此免疫刺激性寡核苷酸之重組質體、轉型株、或上述之任意組合。

當前述疫苗組成物施用於至少一受免疫動物(例如禽類、牛或豬)時，可促進至少一受免疫動物之周邊免疫細胞増生。再者，由此所得之水禽用或其他動物用疫苗之組成物，經分別與動物周邊血液單核球細胞的細胞模式實驗證實，本發明所得之含多套水禽類專一性CpG模組的重組質體確實可有效誘發至少一受免疫動物(例如水禽類以及家畜)之周邊血液細胞增生。

惟需說明的是，本發明之水禽及家畜疫苗用之DNA佐劑，不僅可降低佐劑的使用量及成本，增進抗原免疫性較為不足之疫苗的效力，其效果亦遠超出一套、二套或三套CpG模組之產量，更提升水禽類用或其他動物用疫苗的效力所能預測之程度。值得一提的是，本發明之水禽及家畜疫苗用之DNA佐劑可引起至少一受免疫動物(例如水禽類、牛或豬)體內的抗體力價維持至少5個月。

以下利用數個實施例以說明本發明之應用，然其並非用以限定本發明，本發明技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾。

實施例一：製備DNA佐劑

1.　構築含三套水禽類專一性CpG模組的重組質體

在此實施例中，首先，利用第1表所示之引子對進行聚合酶鏈鎖反應(PCR)，而獲得如序列辨識編號6所示序列之第四聚核苷酸(n=3)。

將第1表之引子對之上游引子以及下游引子，各取10 μL置於200 μL的微量離心管後，置入溫度循環控制器(Thermocycler；TaKaRa,Shiga,Japan)，加熱至約55 ℃進行約5分鐘。然後，將反應物置於室溫5小時，使其自然的黏合，而形成第四聚核苷酸(n=3；約28 kb)。

以限制酶A及限制酶B切割pET-32a質體(空質體；Novagen,Darmatadt,Germany)，切割後將純化的質體DNA，與如序列辨識編號6所示序列之第四聚核苷酸(n=3；約28 bp)，進行接合反應，而形成含三套CpG模組之重組質體(n=3；約5885 bp)。之後，以熱休克方式將所接合好之質體轉型進入宿主細胞，例如大腸桿菌(E. coli ) DH5α之勝任細胞(competent cell)，以作為上述重組質體之轉殖及保存的宿主。之後，利用抗生素篩選的方式，例如將菌液均勻塗抹於含有50 μg/mL Ampicillin之LB plate，置於37 ℃培養箱中，培養14小時後，挑選轉形成功的單一菌落，並定序確定構築之序列無誤的菌落後，即可進行大量培養。惟上述有關構築重組質體、轉型至宿主細胞、抗生素篩選、大量培養、抽取質體DNA等為本技術領域中任何具有通常知識者所熟知，故在此不另贅述。

接下來，再將重組質體(pET-32a)之三套CpG模組。再構築至pGEM-T easy質體(空載體；pGEM-T Easy Vector system；Promega,WI,U.S.A.)，以利於後續製備含多套水禽類專一性CpG模組之重組質體(n=6～24)。

申言之，可利用前述構築之含三套CpG模組之重組質體(n=3)，經由限制酶A及限制酶B切割出第四聚核苷酸後，為了後續方便構築於pGEM-T Easy質體中，利用Taq聚合酶(polymerase)於第四聚核苷酸之3’端加上突出的A(3'-A overhand)，其反應試劑如第2表所例示：

上述反應試劑於前述溫度循環控制器中，在72℃反應25分鐘後，再於4℃ 10分鐘。然後，3’端加上突出的A之第四聚核苷酸，與pGEM-T easy質體(空載體；pGEM-T Easy Vector system；Promega,WI,U.S.A.) DNA，直接進行接合反應，而形成含三套CpG模組之重組質體(n=3；約5885 bp)，其中pGEM-T Easy空載體不需經任何限制酶的切割。

之後，上述重組質體可進一步轉型(transform)至適當的宿主，例如大腸桿菌(E. coli ) BL21(DE3)菌株之勝任細胞(competent cell)，以作為上述重組表現質體之轉殖及保存的宿主。之後，進行藍白篩選，於含100 mg/mL Ampicillin之LB培養皿中，並利用5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactopyranoside；X-gal)使轉型成功之菌落顯色，並經PCR及DNA定序確定構築之序列無誤的菌落後，即可進行大量培養。

上述轉殖成功的宿主細胞萃取出的質體DNA(n=3)，分別經由限制酶A及限制酶C、或者限制酶B及限制酶C切割後，進行DNA電泳分析，確認含三套CpG ODN模組之第四聚核苷酸(n=3)嵌入所構築的質體中，而形成含三套CpG模組之重組質體(n=3)無誤(圖未繪示)，其中限制酶A、限制酶B及限制酶C之種類悉如前述所例舉，此處不贅。

其次，上述之第四聚核苷酸(n=3)的片段經DNA定序確認後，其結果如第5圖之所示。請參閱第5圖，其係顯示根據本發明一實施例之含多套(n=3)水禽類專一性CpG模組之免疫刺激性寡核苷酸的DNA定序圖，其係利用上游引子委託明新生物科技有限公司(台北，台灣)，以核酸序列自動定序儀進行DNA定序。

由第5圖之結果可知，本發明一實施例之含多套(n=3)水禽類專一性CpG模組的核酸片段經DNA定序後，確認上述序列無誤。

2.構築含多套水禽類專一性CpG模組的重組質體

此實施例係利用前述構築之含三套CpG模組之重組質體(n=3；約5885kb，以下簡稱為P1)，利用第1A圖至第1C圖所例舉之方式，重複進行數次特定限制酶之切割、接合特定之序列以及核酸選殖技術，而分別得到含6套、12套、24套CpG模組(n=6、12、24；約5913、5969、6081kb)之重組質體(以下分別簡稱為P2、P3、P4)。其流程悉如前述，此處不贅。

上述轉殖成功的宿主細胞萃取出的質體DNA(P2、P3、P4)，分別經由限制酶A及限制酶C、或者限制酶B及限制酶C切割後，進行DNA電泳分析，確認第一聚核苷酸(n=6；約56bp)、第二聚核苷酸(n=12；約112bp)、第三聚核苷酸(n=24；約224bp)分別嵌入所構築的質體中，而形成含6、12、24套CpG模組(n=6、12、24)之重組質體無誤(圖未繪示)，其中限制酶A、限制酶B及限制酶C之種類亦如前例舉，此處不贅。

其次，上述之第一聚核苷酸(n=6)、第二聚核苷酸(n=12)、第三聚核苷酸(n=24)以及第四聚核苷酸(n=3)的片段經DNA定序確認後，其結果如第6圖至第8圖之所示。

請參閱第6圖至第8圖，其係分別顯示根據本發明一實施例之含多套(n=6、12、24)水禽類專一性CpG模組之免疫刺激性寡核苷酸的DNA定序圖，其係利用上游引子委託明新生物科技有限公司(台北，台灣)，以核酸序列自動定序儀進行DNA定序。由第6圖至第8圖之結果可知，本發明一實施例之含多套水禽類專一性CpG模組的核酸片段經DNA定序後，確認上述序列無誤。

實施例二：評估含多套水禽類專一性CpG模組的重組質體於細胞模式之免疫促進效果

1.周邊血液單核球細胞之抽取

此實施例係抽取健康的實驗動物(鴨、牛、豬)之周邊血液單核球細胞(peripheral blood mononuclear cell；PBMC)。

首先，採取健康鴨、牛及豬隻的全血，加入EDTA(0.2%)抗凝劑後，於4℃以1300 ×g之轉速離心約30分鐘，收集白血球層(buffy coat)。將前述之白血球層與等體積之1×PBS(pH 7.2，37℃)混合後，再將其加入等體積之密度梯度溶液，例如Ficoll-Paque(GE Healthcare,Stgiles,Sweden)，於約4℃下以200×g離心25分鐘。

接著，將細胞層吸出，先以1×PBS清洗一次，於4℃以200×g下離心10分鐘後，再以RPMI-1640培養液(例如含有2.05 mM之L-glutamine、25 mM之HEPES buffer、2 g之sodium bicarbonate)(GIBCO,NY,U.S.A.)清洗兩次，取得純化之淋巴細胞。在計數細胞後，利用細胞培養液，例如含10%胎牛血清、青黴素(40 μg/mL)、及5x10^-5 M β-Mercaptoethanol之RPMI-1640(GIBCO,NY,U.S.A.)，將細胞濃度調整為1×10⁷ 細胞/mL後，分別於96孔細胞培養盤中加入100 μL的細胞液(1×10⁶ 細胞/mL)。

2.　含多套水禽類專一性CpG模組的重組質體於鴨隻脾臟細胞之免疫促進活性評估

2.1　刺激原之刺激

此實施例係將實驗動物(鴨、牛、豬)之周邊血液單核球細胞(PBMC)分成4組試驗組及3組對照組，評估含多套水禽類專一性CpG模組的重組質體作為刺激原之免疫刺激效果。

試驗組係分別於每孔加10 μg之含多套水禽類專一性CpG模組的重組質體(P1、P2、P3、P4)、空載體以及人工合成磷硫化二套CpG模組之序列(以下簡稱CpG ODN)。陽性對照組則加入2 μg之T細胞裂殖素(mitogen)，例如刀豆素A(Concanavalin A；Con A；Sigma,MO,U.S.A.)。陰性對照組之細胞則未加入抗原和ConA。以上所有之細胞均具有3重複，於37℃、5% CO₂ 下培養72小時。上述各組樣本具有顯著性差異(p＜0.05)。

2.2 MTT試驗

在上述每孔細胞中，每孔加入20 μL之MTS試劑，例如CellTiter套組試劑內之3-(4，5-二甲基唑-2)-5-(3-羧基甲氧苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四氮唑[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium；MTS四氮唑；5 mg/mL；Promega,WI,U.S.A.]混合均勻後，避光於37℃、5% CO₂ 反應4小時，利用ELISA判讀儀(Anthos 2020,Cambridge,Austria)，偵測於波長492 nm之吸光值(OD_492nm )。

2.3　細胞增生指數(stimulation index；SI)之計算

有關細胞增生指數(stimulation index；SI)之計算可根據下式(II)得出：

在式(II)中，上述背景值為細胞只添加RPMI-1640培養基與20μL之MTS反應後，所偵測之OD_{492 nm} 值。其結果如第2圖所示。

請參閱第2圖，其係繪示免疫本發明一實施例之DNA佐劑於鴨隻之細胞性免疫反應試驗結果圖，其中橫軸代表抗原，縱軸代表細胞增生指數(SI)，空白柱狀代表空載體試驗組，左斜密集對角線柱狀代表CpG ODN試驗組，交叉疏鬆對角線柱狀代表重組質體(P1)試驗組，疏鬆網點柱狀代表重組質體(P2)試驗組，密集網點柱狀代表重組質體(P3)試驗組，大棋盤格柱狀代表重組質體(P4)試驗組，黑底柱狀代表陽性對照組(ConA)。第2圖之統計分析係利用SAS 9.0版進行分析，並以Tukey型多重比較檢定法(Tukey-type multiple comparison test)以t化殘差(studentized)比較各組間差異顯著性。圖號a、b、c、d之平均值依序為a>b>c>d。相同的圖號(例如a與a之間)表示各組間不具顯著性的差異。反之，不同圖號間(例如b與c)表示各組間具有顯著性的差異。至於圖號bc則表示此數值與b及c皆不具顯著性差異。

由第2圖之結果可知，空載體DNA無法有效引起鴨隻PBMC之細胞增生。其次，重組質體(P1)試驗組與合成的CpG ODN試驗組對於鴨隻PBMC之細胞增生的效果，在統計上並無顯著性的差異。然而，相較於重組質體(P1)試驗組或合成的CpG ODN試驗組，重組質體(P2、P3、P4)具有顯著性的差異，代表實施例一之重組質體(P2、P3、P4)對鴨隻PBMC無毒害的作用。尤其重組質體(P4)引起鴨隻PBMC之細胞增生的效果良好，但與陽性對照組ConA無顯著性的差異。因此，第2圖之結果顯示實施例一之重組質體(P2、P3、P4)對鴨隻PBMC無毒害的作用，具有促進水禽類動物之免疫活性的效果，但此效果並無隨著CpG模組數目的增加而有相對應的差異。

3.　含多套水禽類專一性CpG模組的重組質體於牛隻血液單核球細胞之免疫促進活性評估

此實施例係將牛隻之周邊血液單核球細胞(PBMC)分成4組試驗組及3組對照組，評估含多套水禽類專一性CpG模組的重組質體作為刺激原之免疫刺激效果。有關刺激原之刺激、MTT試驗與SI之計算等悉如前述，此處不另贅言。

請參閱第3圖，其係繪示免疫本發明一實施例之DNA佐劑於牛隻之細胞性免疫反應試驗結果圖，其中橫軸代表抗原，縱軸代表細胞增生指數(SI)，空白柱狀代表空載體試驗組，左斜密集對角線柱狀代表CpG ODN試驗組，交叉疏鬆對角線柱狀代表重組質體(P1)試驗組，疏鬆網點柱狀代表重組質體(P2)試驗組，密集網點柱狀代表重組質體(P3)試驗組，大棋盤格柱狀代表重組質體(P4)試驗組，黑底柱狀代表陽性對照組(ConA)。第3圖之統計分析係利用SAS 9.0版進行分析，並以Tukey型多重比較檢定法(Tukey-type multiple comparison test)以t化殘差(studentized)比較各組間差異顯著性。圖號a、b、c、d之平均值依序為a>b>c>d>e。相同的圖號(例如a與a之間)表示各組間不具顯著性的差異。反之，不同圖號間(例如b與c)表示各組間具有顯著性的差異。至於圖號bc則表示此數值與b及c皆不具顯著性差異。

由第3圖之結果可知，空載體DNA亦無法有效引起牛隻PBMC之細胞增生。其次，重組質體(P1)試驗組與合成的CpG ODN試驗組對於牛隻PBMC之細胞增生的效果，在統計上並無顯著性的差異。相較於合成的CpG ODN試驗組，重組質體(P2、P3)則具有顯著性的差異。再者，相較於重組質體(P1)試驗組或合成的CpG ODN試驗組，重組質體(P4)則具有顯著性的差異，但與陽性對照組ConA在統計上無顯著性的差異。因此，第3圖之結果顯示實施例一之重組質體(P2、P3、P4)對牛隻PBMC無毒害的作用，具有促進其他動物之免疫活性的效果，但此效果並無隨著CpG模組數目的增加而有相對應的差異。

4.　含多套水禽類專一性CpG模組的重組質體於豬隻血液單核球細胞之免疫促進活性評估

此實施例係將豬隻之周邊血液單核球細胞(PBMC)分成4組試驗組及3組對照組，評估含多套水禽類專一性CpG模組的重組質體作為刺激原之免疫刺激效果。有關刺激原之刺激、MTT試驗與SI之計算等亦參前所論，此處不贅述。

請參閱第4圖，其係繪示免疫本發明一實施例之DNA佐劑於豬隻之細胞性免疫反應試驗結果圖，其中橫軸代表抗原，縱軸代表細胞增生指數(SI)，空白柱狀代表空載體試驗組，左斜密集對角線柱狀代表CpG ODN試驗組，交叉疏鬆對角線柱狀代表重組質體(P1)試驗組，疏鬆網點柱狀代表重組質體(P2)試驗組，密集網點柱狀代表重組質體(P3)試驗組，大棋盤格柱狀代表重組質體(P4)試驗組，黑底柱狀代表陽性對照組(ConA)。第4圖之統計分析係利用SAS 9.0版進行分析，並以Tukey型多重比較檢定法(Tukey-type multiple comparison test)以t化殘差(studentized)比較各組間差異顯著性。圖號a、b、c、d之平均值依序為a>b>c>d。相同的圖號(例如a與a之間)表示各組間不具顯著性的差異。反之，不同圖號間(例如b與c)表示各組間具有顯著性的差異。至於圖號bc則表示此數值與b及c皆不具顯著性差異。

由第4圖之結果可知，空載體DNA無法有效引起豬隻PBMC之細胞增生。其次，重組質體(P1)試驗組與合成的CpG ODN試驗組對於豬隻PBMC之細胞增生的效果，在統計上並無顯著性的差異。相較於重組質體(P1)試驗組或合成的CpG ODN試驗組，重組質體(P2、P3)則具有顯著性的差異。再者，相較於重組質體(P1、P2、P3)試驗組或合成的CpG ODN試驗組，重組質體(P4)則具有顯著性的差異，但與陽性對照組ConA在統計上無顯著性的差異。因此，第4圖之結果顯示實施例一之重組質體(P2、P3、P4)對豬隻PBMC無毒害的作用，具有促進其他動物之免疫活性的效果，但此效果並無隨著CpG模組數目的增加而有相對應的差異。

需補充的是，本發明雖以特定的質體、表現系統、反應條件、受免疫動物、分析方法、誘導條件或特定儀器作為例示，說明本發明之水禽及家畜疫苗用之DNA佐劑，惟本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者可知，本發明並不限於此，在不脫離本發明之精神和範圍內，本發明之水禽及家畜疫苗用之DNA佐劑可使用其他質體、表現系統、反應條件、受免疫動物、分析方法、誘導條件或儀器進行。

其次，本發明之水禽及家畜疫苗用之DNA佐劑，除了可有效誘發鴨隻PBMC之細胞增生之外，亦可有效誘發牛隻PBMC與豬隻PBMC之細胞增生，又無細胞毒害的作用，具有應用於水禽及家畜疫苗用之DNA佐劑的潛力。

再者，由實施例二之細胞模式實驗結果可知，本發明之DNA佐劑所含之CpG模組的數目，與其對於疫苗之免疫促進活性的程度，二者之間並不呈現比例上的關係，同時亦無隨著CpG模組數目的增加而有相對應的差異。

此外，另需補充的是，本發明雖以特定的質體、含特定套數CpG模組的免疫刺激性寡核苷酸、特定的宿主細胞、水禽類試驗動物、細胞種類或疫苗種類作為例示，說明本發明之水禽及家畜疫苗用之DNA佐劑，惟本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者可知，本發明並不限於此，在不脫離本發明之精神和範圍內，本發明之水禽及家畜用疫苗之DNA佐劑可使用其他質體、宿主細胞、重組質體、轉型株、其他試驗動物、細胞種類或疫苗種類進行。

舉例而言，可使用含6、12、24套以外之偶數套數之水禽類專一性CpG模組之重組質體，於宿主細胞中產生其他套數(例如8、10、14、16、18、20、22套)水禽類專一性CpG模組的免疫刺激性寡核苷酸，作為水禽及家畜疫苗用之DNA佐劑。另外，在不脫離本發明之精神和範圍內，亦可將本發明所得之DNA佐劑，例如含多套水禽類專一性CpG模組之免疫刺激性寡核苷酸、含此免疫刺激性寡核苷酸之重組質體、轉型株、或上述之任意組合，應用至其他動物(例如哺乳類動物)或其他動物用疫苗種類，以提升疫苗對於其他動物之免疫刺激效果。值得一提的是，本發明之水禽及家畜疫苗用之DNA佐劑可引起至少一受免疫動物(例如水禽類、牛或豬)體內的抗體力價維持至少5個月。

由上述本發明實施例可知，本發明之水禽及家畜用之DNA佐劑，其優點在於此DNA佐劑為含多套水禽類專一性免疫刺激性寡核苷酸或含此之重組質體，且不必經磷硫化處理，可免去習知DNA佐劑必須利用化學修飾之繁瑣步驟。當含有此DNA佐劑與抗原之疫苗組成物施用於至少一受免疫動物(例如水禽類、牛或豬)時，不僅可促進動物體內之周邊免疫細胞增生，降低習知佐劑的使用量及成本，又可增進抗原免疫性較為不足之疫苗的效力。

雖然本發明已以數個實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，在本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

<110>　國立屏東科技大學

<120>　水禽及家畜疫苗用之DNA佐劑

<130>　無

<160>　6

<210>　1

<211>　56

<212>　DNA

<213>　人工序列

<400>　1

<210>　2

<211>　112

<212>　DNA

<213>　人工序列

<400>　2

<210>　3

<211>　224

<212>　DNA

<213>　人工序列

<400>　3

<210>　4

<211>　28

<212>　DNA

<213>　人工序列

<400>　4

<210>　5

<211>　27

<212>　DNA

<213>　人工序列

<400>　5

<210>　6

<211>　32

<212>　DNA

<213>　人工序列

<400>　6

P1‧‧‧含三套水禽類專一性CpG模組的重組質體

P2‧‧‧含六套水禽類專一性CpG模組之重組質體

P3‧‧‧含十二套水禽類專一性CpG模組之重組質體

P4‧‧‧含廿四套水禽類專一性CpG模組之重組質體

為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之詳細說明如下：

第1A圖至第1C圖係繪示根據本發明一實施例之DNA佐劑之製造方法的部分流程圖。

第2圖係繪示免疫本發明一實施例之DNA佐劑於鴨隻之細胞性免疫反應試驗結果圖。

第3圖係繪示免疫本發明一實施例之DNA佐劑於牛隻之細胞性免疫反應試驗結果圖。

第4圖係繪示免疫本發明一實施例之DNA佐劑於豬隻之細胞性免疫反應試驗結果圖。

第5圖至第8圖係顯示根據本發明一實施例之含多套(n=6、12、24)水禽類專一性CpG模組之免疫刺激性寡核苷酸的DNA定序圖。

P3．．．含十二套水禽類專一性CpG模組之重組質體

P4．．．含廿四套水禽類專一性CpG模組之重組質體

Claims

一種水禽及家畜疫苗用之DNA佐劑，其特徵在於該DNA佐劑為未經磷硫化處理且為含水禽類專一性免疫刺激性寡核苷酸之一重組質體，該水禽類免疫刺激性寡核苷酸係選自於如序列辨識編號1所示序列之一第一聚核苷酸、如序列辨識編號2所示序列之一第二聚核苷酸以及如序列辨識編號3所示序列之一第三聚核苷酸所組成之一族群。
根據申請專利範圍第1項所述之水禽及家畜疫苗用之DNA佐劑，其中該DNA佐劑施用於至少一受免疫動物時，該至少一受免疫動物為水禽類、牛或豬，且該DNA佐劑係促進該至少一受免疫動物之周邊免疫細胞增生。
一種疫苗組成物，包含：一抗原；以及如申請專利範圍第1項之DNA佐劑，且其中該疫苗組成物施用於至少一受免疫動物，以促進該至少一受免疫動物之周邊免疫細胞增生，其中該至少一受免疫動物為水禽類、牛或豬。
根據申請專利範圍第3項所述之疫苗組成物，其中該抗原為一重組蛋白、一活毒疫苗或一不活化疫苗。