TWI410495B

TWI410495B - 新穎之人類ｔ細胞群

Info

Publication number: TWI410495B
Application number: TW096108806A
Authority: TW
Inventors: Shuji Nakamura; Ryuichi Motoda; Masayoshi Kibata; Kunzo Orita; Fumiyuki Yamasaki
Original assignee: Hayashibara Biochem Lab
Priority date: 2006-03-15
Filing date: 2007-03-14
Publication date: 2013-10-01
Also published as: JP5118624B2; US20090297490A1; EP1997884A1; KR20080111054A; EP1997884B1; US8883495B2; JPWO2007105797A1; WO2007105797A1; EP1997884A4; TW200813226A

Description

新穎之人類T細胞群

本發明是關於一種新穎之人類T細胞群，特別是藉由與基質細胞一起培養而獲得，且具有細胞毒性及免疫抑制性之新穎之人類T細胞群。

T細胞係擔任對抗種種病原體之生理防禦系統之免疫系統中重要角色之細胞群之一。T細胞大致分為CD4陽性之輔助T細胞與CD8陽性之細胞毒性T細胞，前者能促進免疫反應，後者係關於病毒感染細胞及腫瘤細胞之排除。輔助性T細胞又進一步分成促進細胞性免疫之1型輔助性細胞及促進體液性免疫之2型輔助性細胞。如此性質不同之T細胞，巧妙地取得平衡之免疫反應下，能排除病原體與抵抗感染。

通常，在正常的免疫反應下，生物對本身所產生之自體抗原有免疫寬容性，排除機制不會啟動。也就是說，自體反應T細胞係被細胞死亡所誘發或誘發對自體抗原之無反應性。特別是，調控T細胞與那般抑制機制有所關聯。調控T細胞，對於其他T細胞有抑制作用因而被定義，近年來，以具有抑制特定免疫反應之機能的細胞群被研究，發表了在細胞表面標記及產生細胞激素之種類、免疫抑制機轉等不同之種種調控T細胞。

調控T細胞中最被廣泛研究的有，記載於Sakaguchi S.「Naturally arising CD4⁺ regulatory T cells for immunologic self-tolerance and negative control of immune responses.」Annual Review of Immunology,2004,22：531-562.之CD4陽性CD25陽性調控性T細胞(CD4⁺ CD25⁺ T_reg )。於今多量之研究成果中，此細胞顯示出CD4及CD25陽性，所以可推想CD4及CD25為調控性T細胞之標記。又，關於CD4陽性CD25陽性調控性T細胞，Fontenot J D,Gavin M A,Rudensky A Y.「Foxp3 programs the development and function of CD4⁺ CD25⁺ regulatory T cells.」Nat Immunol,2003,4(4)：330-336.中，揭示轉錄因子Forkhead box p3(FOXP3)，而Takahashi T,Tagami T,Yamazaki S,et al.「Immunologic self-tolerance maintained by CD25⁺ CD4⁺ regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic lymphocyte associated antigen 4.」J Exp Med,2000,192(2)：303-309.揭示發現了導致T細胞不反應之細胞毒性T細胞關連抗原-4(CTLA-4)。

Cosmi L,Liotta F,Lazzeri E,Francalanci M,Angeli R,Mazzinghi B,Santarlasci V,Manetti R,Vanini V,Romagnani P,Maggi E,Romagnani S,Annunziato F.「Human CD8⁺ CD25⁺ thymocytes share phenotypic and functional features with CD4⁺ CD25⁺ regulatory thymocytes.」Blood,2003,102(12)：4107-4114.中，揭示了含CD8及CD25陽性標記之具免疫抑制性T細胞。

另外，有細胞毒性之T細胞方面，以上述之CD8陽性細胞毒性T細胞係為人所熟知，該細胞對於標的細胞能發揮特異性高之細胞毒性。特開2005-245430號公報中，揭示了藉由與腫瘤細胞或腫瘤細胞中特徵之蛋白質共同培養，使其發揮對該腫瘤細胞之特異之細胞毒性。

又，在造血幹細胞移植已實用化之現在，為取得足夠之造血幹細胞，期望有ex vivo細胞培養技術。於造血幹細胞的培養上，需要與模擬生理環境之基質細胞共同培養，可長期培養，但有無具充分支持造血功能之人類基質細胞及人類基質細胞會分泌細胞激素使一部份之造血幹細胞分化等問題點被指出。使用人類以外之異種基質細胞株之臍帶血而來之造血幹細胞之培養方法也被研究，如，Ming-jiang Xu,Kohichiro Tsuji,Takahiro Ueda,Yoh-suke Mukouyama,Takahiko Hara,Feng-Chun Yang,Yasuhiro Ebihara,Sahoko Matsuoka,Atsushi Manabe,Akira Kikuchi,Mamoru Ito,Atsushi Miyajima,and Tatsutoshi Nakahata「Stimulation of Mouse and Human Primitive Hematopoiesis by Murine Embryonic Aorta-Gonad-Mesonephros-Derived Stromal Cell Lines.」Blood,1998,92(6)：2032~2040.中，對於人類臍帶血而來之CD34陽性細胞，又於Yoshihiko Nakamura,Kiyoshi Ando,Jamel Chargui,Hiroshi Kawada,Tadayuki Sato,Takashi Tsuji,Tomomitsu Hotta,and Shunichi Kato「Ex Vivo Generation of CD34⁺ Cells From CD34^- Hematopoietic Cells」Blood 1999 94(12)：4053-4059中，嘗試對於來自臍帶血之CD34陰性細胞，藉由與小鼠基質細胞株共培養之增殖培養方法。然而，該增殖方法目的是將去除已分化細胞群之造血幹細胞群，在不分化下使其增殖，又，因為免疫抑制及細胞毒性是分化之造血細胞所有，所以可推測該方法所培養之細胞群無那般活性。

T細胞在免疫系統中扮演重要的角色，但因其不為人明瞭之處很多，尚未能用於醫藥品上。目前期待於研究及醫療用途上能得到新穎之人類T細胞群。

有鑑於此，本發明之課題在於提供新穎之T細胞群及取得其之方法。

本發明者們之研究發現，將由血液採集之單核球細胞，在體外與基質細胞共培養，產生了持續對基質細胞有毒害之增殖人類T細胞群。另外，此人類T細胞群並非只針對為取得其之共培養用基質細胞，對於其他之基質細胞或部分腫瘤細胞株也發揮了細胞毒性，且對於活化之人類T細胞也發揮免疫抑制之作用，進一步，此人類T細胞群係CD3、CD25、CD28及T細胞抗原受器α β(TCR α β)等之細胞膜抗原幾乎在所有的細胞中皆為陽性，CD4陽性CD8陽性之群、CD4陽性CD8弱陽性之群、CD4陰性CD8陽性之群之三群為共存，確認其為無法直接採自生體之新穎人類T細胞群，完成了本發明。

也就是說，藉由本發明提供具有細胞毒性及免疫抑制兩種活性之新穎之人類T細胞群及取得其之方法，解決前述之課題。

藉由本發明可取得具有細胞毒性及免疫抑制兩種活性之人類T細胞群。以此法取得之人類T細胞群係無法由生物體直接取得之新穎細胞群，可用於研究用途。又，含此之醫藥組成物，對於各種癌症、自體免疫疾病及過敏疾病之治療、緩和於移植時之排斥反應及移植體對宿主之反應有用。

[實施發明之最好型態]

本發明之人類T細胞群，係將由人血液採集之單核球細胞，與基質細胞共培養而得，具有以下特徵：(1)CD3、CD25、CD28及TCR α β為陽性、(2)由CD4陽性CD8陽性(CD4⁺ CD8⁺ )之群、CD4陽性CD8弱陽性(CD4⁺ CD8^dim )之群及CD4陰性CD8陽性(CD4^- CD8⁺ )之群三群所成、(3)相對於共同培養之基質細胞，可發揮細胞毒性，以及(4)對於活化之T細胞，發揮免疫抑制之活性。

又，其他方面，本發明之人類T細胞群，在IL-2存在下，會產生介白素-10(IL-10)。

本發明之人類T細胞群係藉由將採自人類血液之單核球細胞與基質細胞一起培養而獲得。人類之血液可使用各種型態之者，如，可利用臍帶血、末稍血或骨髓液，就由同一捐贈者可獲得必要量之觀點來看，以使用臍帶血或末稍血較為有利。臍帶血，因近年來臍帶血移植技術之普及，於告知同意之下變的容易收集。另外，於本發明之人類T細胞群之取得上，並不需要目前臍帶血收集主要目的之CD34陽性細胞群，所以亦可利用採取完CD34陽性細胞後，由殘留之臍帶血而來之單核球細胞。又，於本發明之人類T細胞群中，並不存在有CD34陽性細胞群，可視為其在採集步驟中消失。另一方面，末稍血可在同一捐贈者上重複採取，再者，由患者採集之末稍血用於本發明之人類T細胞群之取得方法，取得本發明之人類細胞群後，可將其再用於同一患者之治療法，也就是有適用於ex vivo療法之優點。本發明之人類T細胞群，雖說可由任何之血液樣本中取得，但是依捐贈者也有無法取得之情形及從以前可取得之患者也有不能取得之情形。

由人血採取單核球細胞之方法方面，適合用Ficoll-Paque等一般之密度梯度離心法等。採集之單核球細胞用血液細胞用之培養基，如，D-MEM培養基、α-MEM培養基、PRMI1640培養基等，以常法培養。依期望，可用補足適宜濃度之牛胎兒血清之培養基。取得本發明之人類T細胞群，將由血液採集之單核球細胞與基質細胞共培養之步驟是重要的，由單核球單獨培養及與基質細胞以外之細胞共培養是困難的。基質細胞，於造血幹細胞之培養系中被視為是必須的細胞，經細胞附著及趨化素的媒介，有使造血幹細胞增殖之能力。基質細胞方面，由取得容易之點來看，使用市售之小鼠基質細胞株，如，ST2細胞、OP9細胞、MC3T3-G2/PA6細胞等，又，依期望亦可使用由小鼠採集之正常基質細胞。另外，也可使用人類基質細胞等之小鼠以外之由哺乳動物而來之基質細胞。基質細胞，於使用前，與適當之培養基先播種於培養皿後，經1日至數日之培養，培養至皿底聚滿之狀態。於此將單核球細胞，以對於基質細胞細胞數之0.2~10倍，而以1~4倍數目播種為佳，在5%CO₂ 雰圍、37℃培養，基質細胞之活細胞逐漸減少。此現象，係因單核球細胞經與基質細胞之細胞接觸被刺激，進行分化之結果，出現具有細胞毒殺活性之細胞群，可推測基質細胞因此被破壞。基質細胞全部被破壞的話，單核球細胞之增殖會被抑制，因此在基質細胞全部被破壞之前，將含單核球細胞之培養基移到附著有新鮮之基質細胞之培養皿是有必要的。遷移完後，浮游之單核球細胞數開始增加後，間隔1日到數日，依序將浮游細胞以吸管等回收，以到別的附著有基質細胞之新鮮培養皿。於原來之培養皿中添加新鮮的培養基繼續培養，進一步回收浮游細胞。此作業持續到原培養皿中之基質細胞全部死亡，可有效率回收單核球細胞。如此，經由持續3~8週，會出現分化至T細胞之細胞群。

本發明之人類T細胞群之取得，於由血液採集之單核球細胞中，存在有依賴IL-2之活化T細胞，為不使彼等增殖，通常，單核球細胞在不添加細胞激素之條件下培養，特別是在無介白素-2(IL-2)存在下培養3~8週。另外，擔心培養基中含IL-2的情況，可藉由使用市售之抗IL-2抗體之EIA套組等，測定培養基中之IL-2量，檢測出IL-2時，於培養基中添加抗IL-2抗體，中和IL-2之活性也是有利於實施的。

如此取得之本發明之人類T細胞群，單獨培養常也只能維持1週，藉由持續與基質細胞共培養，可維持1個月。但是之後的增殖活性漸漸低落，終究會死亡，藉由在IL-2或介白素-15(IL-15)等之細胞激素存在下培養，約可持續2個月之增殖培養。又，本發明之人類T細胞群，經上述之細胞激素作用而增殖者，其特性(細胞毒性、免疫抑制活性、細胞膜抗原)多少都會變異，於上述經細胞激素之增殖培養開始起，通常1個月內，以2週內使用為佳。特別是，由末稍血採集之人類T細胞群中，混有由臍帶血採取所取得之人類T細胞群中沒有的CD4弱陽性CD8弱陽性TCR γ δ陽性之T細胞，其會因IL-2存在下之增殖培養而增加其存在之比例。

本發明之人類T細胞群，CD3、CD25、CD28及TCR α β等之T細胞特徵之細胞膜抗原，因幾乎在全部細胞皆為陽性，可推測幾乎係完全之T細胞群。又，此人類T細胞群，如不與基質細胞共培養則無法得到、無病毒感染、細胞抹片機影像顯示為正常之淋巴球型態、染色體之核型無異常等點，認為是正常之T細胞所成之細胞群。

本發明之人類T細胞群，本質上由CD4陽性CD8陰性之A群、CD4陽性CD8弱陽性之B群及CD4陰性CD8陽性之C群所成，此等三群之合計佔全體之90%以上，而以93%以上為佳。該三群之比例，藉由使用抗CD4抗體及抗CD8抗體併用之流式細胞技術法測定，A群為7.9~51.6%、B群為1.1~71.7%、C群為11.8~79.4%之範圍內存在。又，培養期間愈長，有B群比例減少、C群比例增加之傾向。各群之分別採集法，可依必要，藉由使用抗CD4抗體及抗CD8抗體之一般細胞篩法選進行。

本發明之人類T細胞群，對為取得其而用於共培養之基質細胞發揮細胞毒性。細胞毒殺活性係用後述實施例4之方法測定。作為效果細胞(E)之本發明之人類T細胞群與作為標靶細胞(T)之基質細胞之比例(E/T)為1/1以上，幾乎所有用於取得之基質細胞會死亡。又，使用小鼠基質細胞作為基質細胞的情況，對與用於取得本發明之人類T細胞群之小鼠基質細胞株相異之基質細胞也能發揮細胞毒殺活性。另外，對於小鼠及人類之腫瘤細胞株而言，也可能發揮細胞毒殺活性。又，如後述實施例之記載，使用抗CD4抗體及抗CD8抗體之細胞篩選法分別採集之三群，對於為取得而用之小鼠基質細胞株ST2細胞發揮細胞毒殺活性。細胞毒殺性T細胞，通常為CD8陽性，於本發明之人類T細胞群中CD4陰性CD8陽性之C群，可視為對應群。另一方面，本發明之人類T細胞群中之CD4陽性CD8陽性之A群及CD4陽性CD8弱陽性之B群，並非對應之CD8陽性之細胞毒殺性T細胞，是新穎之T細胞群之可能性很高。

本發明之人類T細胞群，對於活化之人類T細胞發揮免疫抑制活性。免疫抑制活性，如，後述實施例8中，於CD4陽性CD25陽性控制性T細胞中利用於測定免疫抑制活性之同種混和淋巴球反應法測得。藉由此法，關於本發明之人類T細胞群與含於其中之A群及C群，測定出高免疫活性，所以本發明之人類T細胞群，係與CD4陽性CD25陽性控制性T細胞具有同樣之免疫抑制活性。另外，於該末稍血所取得之人類T細胞群中所取得之CD4弱陽性CD8弱陽性(CD4^dim CD8^dim )之群(D群)與其他群比較，有在細胞毒殺活性上較強、免疫抑制活性較弱之特徵，另外，因顯示有TCR γ δ陽性，所以可認為是傳統之細胞毒殺性T細胞。關於此D群，藉由使用抗TCR γ δ抗體之磁氣分離法，可分離、除去。

接著，如後述實施例9，本發明之人類T細胞群，雖表現出CD4陽性CD25陽性控制性T細胞中之特徵性轉錄因子FOXP3，其表現量偏少。又，本發明之人類T細胞群，藉由抗CD3/CD28抗體處理使細胞不增殖，FOXP3之表現量也幾乎不增加。又，文獻上，為取得CD4陽性CD25陽性控制性T細胞，以抗CD3/CD28抗體處理是必須的。於取得本發明之人類T細胞群步驟中，因無抗CD3/CD28抗體處理步驟，可推測傳統之CD4陽性CD25陽性控制性T細胞在本發明之T細胞群取得步驟中未增殖或死亡，而不含於本發明之人類T細胞群。

在細胞篩選法中分別採集之三群，在任一群皆有FOXP3之表現，不僅在可能含該CD4陽性CD25陽性控制性T細胞之CD4陽性CD8弱陽性之B群，在CD4陽性CD8陽性之A群及CD4陰性CD8陽性之C群中也有微弱之表現。因此，可認為本發明之人類T細胞群中，有與傳統之CD4陽性CD25陽性控制性T細胞不同之控制性T細胞。

另外，本發明之人類T細胞群，係如同後實施例，會產生IL-10。通常，IL-10為2型輔助性T細胞及控制性T細胞所產生，以抑制1型輔助T細胞及巨噬細胞之活性為人熟知。然而，本發明之人類T細胞群中免疫活性之部分，可推測為經由IL-10而發揮。

由以上可知，本發明之人類T細胞群，係具有細胞毒殺性及免疫抑制活性兩者之人類T細胞群。CD4陽性CD8陽性之T細胞，以往被認知為年幼之人類T細胞群，完全不知其具有以上之活性。至少，CD4陽性CD8陽性之A群可說為新穎之人類T細胞群。本發明之人類T細胞群，可用於解析免疫機構為目的之研究用材料。又，本發明之人類T細胞群，因具有免疫抑制活性，可用於因誘導免疫寬容而可治療之疾病，如，類風濕性關節炎、I型糖尿病、庫隆氏病等之自體免疫疾病；食物過敏、花粉症、異位性皮膚炎等之過敏性疾病；及移植時之排斥反應及移植體對宿主之反應等之醫藥組成物，另外，因其細胞毒殺活性，可作為各種癌症之治療、各種病毒疾病之治療之醫藥組成物。該組成物中本發明之人類T細胞群之含有量及該組成物之投用量，考量適用疾患之種類、症狀、投與途徑、劑型而決定。另外，可與由細胞激素、趨化素、賀爾蒙等之生理活性物質、抗體、免疫抑制劑、抗癌劑、抗過敏劑等選出之該疾病治療藥及使本發明之人類T細胞群作用效果提高之物質合併使用。

於製造含本發明之人類T細胞群之醫藥組成物時，可依治療目的及投與途徑等選擇適當的劑型。但是，因希望於醫藥組成物中之人類T細胞群是活著狀態下投與，通常，人類T細胞群與適當之添加劑，懸浮於液體、包埋於膠體、直接使用，或進一步依期望，封入微膠囊及微脂粒，藉注射等非經口地投與。再者，可使其浮游於含二甲基亞碼及甘油之培養基與生理食鹽水中，凍結保存，使用前再熔解使用。

以下，藉由實施例詳細說明本發明。

實施例1

由臍帶血取得人類T細胞群

由分娩時切除被告知後同意之孕婦7位(U1~U7)之臍帶，採集血液，將其各自以PRMI1640培養基稀釋約為2倍容積，依常法置於Ficoll-Paque上，離心分離，採取含單核球之層，以生理食鹽水洗淨，採得單核球細胞。用「CD34 isolation kit」(Miltenyi Biotec所販售)，除去 CD34陽性單核球細胞，採集CD34陰性單核球細胞。將採取之CD34陰性單核球細胞浮游於補足10%(V/V)牛胎兒血清之RPMI1640培養基，事先培養小鼠基質細胞株ST2細胞(RCB0224，RIKEN BioResource Center)使其附著於市售6孔微培養皿皿底(每孔之小鼠基質細胞數為1~2×10⁶ 個)，播種3×10⁶ 個。於培養1~2週後，與培養基一起回收浮游細胞，移到附著有新鮮之基質細胞之6孔微培養皿，繼續培養。重複適當之回數後，合計培養3週以上，使表現均一之淋巴球型態之增殖性母細胞出現，更以與上述同方法，培養1~2週後，為純化母細胞化之細胞，依照常法，採取Ficoll-Paque之Ficoll層與培養液層之界線附近聚集之細胞，得到人類T細胞群U1~U7。

實施例2

細胞膜抗原之分析

以使用人類淋巴球相關抗細胞膜抗原之抗體之流式細胞技術法，分析實施例1取得之人類T細胞群。以下表1之抗原的抗體，也就是，小鼠抗CD3抗體(Nichirei biosciences股份有限公司販賣)、小鼠抗CD4抗體(Nichirei biosciences股份有限公司販賣)、小鼠抗CD8 α抗體(Beckmancoulter公司製)、小鼠抗CD25抗體(Beckmancoulter公司製)、小鼠抗CD45RA抗體(Beckmancoulter公司製)、小鼠抗CD45RO抗體(Nichirei biosciences股份有限公司販賣)、小鼠抗CD28 抗體(Nichirei biosciences股份有限公司販賣)、小鼠抗CD56抗體(Beckmancoulter公司製)、小鼠抗HLA-DR抗體(Nichirei biosciences股份有限公司販賣)、小鼠抗TCR α β抗體(日本Becton,Dickinson and Company製造)、小鼠抗糖皮質素誘發性腫瘤壞死因子受器(GITR)抗體(R & D system公司製)、小鼠抗CD152抗體(Beckmancoulter公司製)、小鼠抗CD16抗體(日本Becton,Dickinson and Company製造)、小鼠抗CD57抗體(日本Becton,Dickinson and Company製造)，或作為陰性對照之MOPC-21小鼠骨髓瘤IgG抗體(ICN Corporation)處理被試驗細胞(U1~U7)30分鐘，遵循常法，以結合螢光素異硫氰酸鹽(FITC)或藻紅蛋白(PE)之二次抗體(山羊抗小鼠IgG)處理30分鐘。被試驗細胞以流式細胞儀分析(商品名『EPICS XL』，Beckmancoulter公司製)。結果如表1所示。又，表中之「MFI」表示螢光強度之平均值，「%」表示陽性率(被試驗細胞中，以陰性對照為基準，閥值以上螢光強度之細胞數之比例)，「-」表示未試驗。

由表1之結果可知，取得之細胞群，因CD3及TCR α β約有97~100%之陽性率，所以本質上為T細胞所成之細胞群，CD25約93~99%，CD28約75~99%，HLA-DR約59~94%之陽性率，推定幾乎全部之T細胞被活化。又，自然殺手T細胞中，特徵的細胞膜抗原CD16約0.7~1.2%、CD56為1.1~3.5%、CD57約0.7~1.8%之陽性率，因實質上為陰性，故推測本發明之人類T細胞群中，無以往之自然殺手T細胞存在。又，GITR約有47~80%之陽性率，具有控制性T細胞之特徵。另外，CD152(CTLA-4)雖然實質上係陰性之結果，但於細胞內，確認到其表現(表中未表示)。

實施例3

使用抗CD4抗體及抗CD8抗體之雙重染色分析

遵循常法，將使用藻紅蛋白標記之小鼠抗CD4抗體及螢光素異硫氰酸鹽標記之小鼠抗CD8抗體(日本Becton,Dickinson and Company製造)於實施例1取得之7種本發明之人類T細胞群(U1~U7)進行雙重染色，藉由與實施例2相同之方法，進行流式細胞技術分析。又，U1、U2、U3及U5在第1次測定後之1~2週後再度測定。其結果如表2所示。又，上段為第1次之測定值、下段為第2次之測定值。另外，代表例方面，人類T細胞群U3(第1次)之流式細胞技術分析之圖如圖1所示。

由表2之結果，於試驗之人類T細胞群中，CD4陽性CD8陽性之群(A群)為7.9~51.6%、CD4陽性CD8弱陽性(B群)為1.1~71.7%、CD4陰性CD8陽性(C群)為11.8~59.2%，此等之合計為96%以上。又，發現 CD4陰性CD8陰性之細胞幾乎不存在。另外，就算同樣之人類T細胞群，在1~2週之培養，3群之比例多少也會有變化。

實施例4

對小鼠基質細胞之細胞毒殺性

遵循常法，將由胎齡13~16日之CD-1小鼠之胎兒組織採取之正常小鼠胎兒基質細胞作為標的細胞，或市售之小鼠基質細胞株ST2(RCB0224，RIKEN BioResource Center)、OP9(RCB1124，RIKEN BioResource Center)、MC3T3-G2/PA6(RCB1127，RIKEN BioResource Center)中任一者以4×10⁴ 個分別播種於48孔微量盤，培養一夜後，於此中添加實施例1取得之作為效果細胞之人類T細胞群U3，各自為4×10⁴ 個(E/T比=1/1)、8×10⁴ 個(E/T比=2/1)、1.6×10⁵ 個(E/T比=4/1)播種，於含100U/ml之IL-2、補足10%(v/v)牛胎兒血清之RPMI1640培養基共同培養24小時，此作為被試驗孔。將各被試驗孔之培養上清液除去，用上述之培養基清洗2次，除去該孔中之人類T細胞群與剝離之骨髓基質死細胞。於各孔中添加該培養基0.4ml，再添加「AlamarBlue」(和光純藥工業股份有限公司販賣)30μl，培養18小時。將培養上清液0.2ml移至96孔之平底微量盤，以螢光分析儀測定代謝活性(激發波長544nm，檢定波長590nm)。又，對照孔方面，除僅培養標的細胞之各基質細胞外，準備同樣處理之孔。將細胞毒殺性以下述公式算出。結果如表3所示。

公式1 細胞毒殺活性(%)={1-(被試驗孔之測定值)/(對照孔之測定值)}×100

由表3之結果可知，本發明之人類T細胞群，相對於ST2細胞，於E/T比為1/1時發揮細胞毒殺活性，對於其他之小鼠基質細胞也於E/T比為4/1時發揮細胞毒殺活性。由此結果，本發明之人類T細胞群對於為取得其而用於共培養之小鼠基質細胞發揮強的細胞毒殺活性，但因其對於其他之小鼠基質細胞也發揮細胞毒殺活性，所以其係具有細胞特異性低之胞毒殺活性。

實施例5

對於其他細胞之胞毒殺活性

為調查本發明之人類T細胞群，對於小鼠基質細胞以外之細胞，能否發揮細胞毒殺活性，進行以下實驗。也就是說，將標的細胞之小鼠膀胱癌細胞MBT-2(RCB0544，RIKEN BioResource Center)、小鼠黑色素瘤細胞B16細胞(RCB1283，RIKEN BioResource Center)、正常人類皮膚纖維芽細胞NHDF細胞(倉敷紡績股份有限公司販賣)、人類子宮頸癌惡性瘤HeLa細胞(RCB0007，RIKEN BioResource Center)、人類表皮惡性瘤A431細胞(RCB0202，RIKEN BioResource Center)、人類皮膚惡性黑色素瘤G361細胞(ATCC CRL-1424)、人類大腸癌之WiDr細胞(JRCB0224，Human Science Research Resources Bank)之任一者，使浮游於補足10%(v/v)牛胎兒血清之RPMI1640培養基，將此於96孔平底微培養皿中，於每1孔播種4×10⁴ 個。於此用與實施例4同樣之方法，於各自之標的細胞中將實施例1取得之人類T細胞群U3以E/T比為1/1~4/1播種，與實施例4同樣方法，測定細胞毒殺活性。結果如表4所示。

由表4之結果可知，本發明之人類T細胞群，對於任何標的細胞，E/T比=2/1時，只能發揮17%以下之細胞毒殺活性，而對於小鼠癌細胞MBT-2細胞及人類癌細胞WiDr細胞、G361細胞及A431細胞，E/T比=4/1時可發揮22~92%之細胞毒殺活性。另外，對於小鼠癌細胞B16細胞及人類癌細胞HeLa細胞及人類正常細胞NHDF，E/T比=4/1時，僅發揮11%以下之細胞毒殺活性。由實施例4與5之結果，可知本發明之人類T細胞群，具有低的細胞特異性之細胞毒殺活性。

實施例6

以CD4及CD8為指標之分群

為討論以往所知之CD4陽性CD25陽性控制性T細胞及CD8陽性細胞毒殺性T細胞與本發明之人類T細胞群之相異點，藉由以CD4及CD8為指標之細胞分別法，進行族群分離。也就是說，將實施例1取得之人類T細胞群U3於IL-2存在下與ST2細胞共同培養2週，使其增殖後，依常法以Ficoll-Paque純化，使細胞於含2mM乙撐二胺四醋酸及0.5%(w/v)牛胎兒血清白蛋白之磷酸緩衝液(pH7.4)中，使以細胞濃度6.7×10⁷ 個/ml浮游。遵常法，添加等量但相對於該細胞懸浮液中細胞為過量之藻紅蛋白標記抗CD4抗體與螢光素異硫氰酸鹽標記抗CD8抗體，再於冰上靜置30分鐘。於此中，更添加20倍量之該磷酸緩衝液，藉離心分離多餘之抗體，再度添加該磷酸緩衝液，調製成細胞懸浮濃度為2.0×10⁷ 個/ml之細胞懸浮液。此中，依常法，將7.4×10⁷ 個細胞以細胞分選儀『FACSAria』(日本Becton,Dickinson and Company製造)來分選細胞時，分別採選出，CD4陽性CD8陽性之A群為0.7×10⁷ 個(純度97.9%)、CD4陽性CD8弱陽性之B群為1.1×10⁷ 個(純度99.4%)、CD4陰性CD8陽性之C群為1.9×10⁷ 個(純度99.6%)。又CD4陰性CD8陰性之細胞比例極少，無法分別採取。

實施例7

於各群之細胞毒殺活性

於實施例1所得之人類T細胞群U3作為效果細胞，或將於實施例6分別採取之3群，使用ST2細胞為標的細胞以外，與實施例4相同方法進行實驗，求得細胞毒殺活性(%)。結果如表5所示。

由表5之結果可知，任一群皆對ST2細胞發揮細胞毒殺活性。特別是A與C群之細胞毒殺活性高，B群則稍微偏低。一般，細胞毒殺活性為CD4陰性CD8陽性T細胞的特徵之一，但此結果，於本發明之人類T細胞群中之細胞毒殺活性，顯示並非全來自以CD8陽性細胞毒殺性T細胞為首之CD4陰性CD8陽性之T細胞。

實施例8

免疫抑制活性的測定

藉由常法之同種混和淋巴球反應法，測定由實施例1取得之人類T細胞群U3、或實施例6中分別採集之3群的免疫抑制活性。

CD4陽性CD25陰性T細胞之反應細胞以下述之方法採集。由常法之Ficoll-Paque法採取人末梢血而來之單核球細胞，於此，用與抗CD25單株抗體結合之Magnetic Micro beads(Miltenyi Biotec公司販賣)除去CD25陽性細胞，採得CD25陰性細胞，進一步以結合抗CD4單株抗體結合之Magnetic Micro beads(Miltenyi Biotec公司販賣)由該CD25陰性細胞，採得CD4陽性細胞。

以下述方法採取刺激細胞之樹狀細胞。由臍帶血，以結合抗CD14單株抗體之Magnetic Micro beads(Miltenyi Biotec公司販賣)採集CD14陽性細胞，在顆粒球巨噬細胞聚落刺激因子(GM-CSF)及介白素-4(IL-4)之存在下，培養1~2週後，採取樹狀細胞，將其於脂多糖下培養2日，於使用同種混和淋巴球反應法之前，依常法以Mitomycin C處理。

將該反應細胞以1×10⁵ 個及刺激細胞以5×10³ 個，分別播種於微培養皿之孔中，於此將實施例1取得之人類T細胞群或實施例6中分別採集之3群各自以1×10⁵ 個播種，培養7日。培養結束之16小時前，於培養基中添加適量³ H-Thymidine，作為被試驗孔。依常法測定³ H-Thymidine之攝取量，依下述式2，求得免疫抑制活性。又，準備對照孔，其除了不添加人類T細胞群，其餘做相同處理。結果如表6所示。

式2 免疫抑制活性(%)=(1-(被試驗孔之³ H-Thymidine之攝取量(cpm)/(對照孔之³ H-Thymidine之攝取量(cpm))×100

如表6之結果可明白，本發明之人類T細胞群及3群全部具有免疫抑制活性。此結果，不僅已知之CD4陽性CD25陽性控制性T細胞與細胞膜抗原相同之B群，連細胞膜抗原不同之A及C群也具有免疫抑制活性。本發明之人類T細胞中之免疫抑制活性，顯示其全部並非皆為CD4陽性CD25陽性控制性T細胞為首之CD4陽性CD8弱陽性之T細胞而來。

實施例9

FOXP3之表現解析

轉錄因子FOXP3以CD4陽性CD25陽性控制性T細胞中特徵性之轉錄因子為人熟知。以下實驗係比較本發明之人類T細胞群與CD4陽性CD25陽性控制性T細胞中FOXP3之表現狀況。

CD4陽性CD25陽性控制性T細胞之準備

以Godfrey等方法(『Blood』、105卷、750~758 頁，2005年)，準備CD4陽性CD25陽性控制性T細胞。也就是，將實施例1採集之由臍帶血來之CD34陰性單核球細胞，使浮游於10%(v/v)補足牛胎兒血清之RPMI1640培養基，將其先放入預先附著有抗CD3/CD28抗體之微培養皿(每孔以100μl之5μg/ml抗CD3抗體及抗CD28抗體處理孔)，培養3日。進一步，添加50U/ml之IL-2培養1~2週，依常法，使用抗CD4抗體及抗CD25抗體，用雙重染色以流式細胞儀分析，顯示約95%之細胞為CD4陽性CD25陽性。將此作為CD4陽性CD25陽性控制性T細胞式樣，供給至以下實驗。

RT-PCR法分析FOXP3之表現

比較上述調製成之CD4陽性CD25陽性控制性T細胞式樣與實施例1取得之人類T細胞群中之FOXP3的表現量。也就是，由此等細胞，各自使用『Rneasy Kit』(QIAGEN製造)調製全RNA，再以其為模版，經反轉錄酶合成第1模版cDNA。將所得之cDNAlng為模版，使用序列表中具有序列編號1及2之寡核苷酸序列之寡核苷酸序列引子以常法之PCR法進行特異性增幅。得到之PCR產物以常法，經膠體電泳分離，以Ethidium bromide染色處理，調查FOXP3之特性性增幅片段(409bp、304bp)之色帶。結果如圖2所示。又FOXP3具有剪接不同之2種蛋白質(Genbank NM_014009及DQ010327)，本例中，出現409bp及304bp之增幅斷片2個片段。又，關於CD4 陽性CD25陽性控制性T細胞，培養於附著抗CD3抗體及抗CD28抗體之微培養皿中亦顯示如此。

如圖2所示之各行片段濃淡，可比較FOXP3mRNA之表現量。『1』之行為CD4陽性CD25陽性控制性T細胞中，FOXP3mRNA之表現量，如上述Godfrey等之文獻記載，以抗CD3/28抗體處理可進一步增加表現量(『2』之行)。另外，本發明之人類T細胞群(『3』之行)，中FOXP3mRNA之表現量比CD4陽性CD25陽性控制性T細胞少，而雖無表示出數據，本發明之人類T細胞群以抗CD3/28抗體處理，FOXP3之表現量幾乎無增加。此結果顯示，本發明之人類T細胞群係與CD4陽性CD25陽性控制性T細胞同樣有FOXP3之表現，但表現量較少。

由西方轉印法分析FOXP3之表現

由實施例1取得之人類T細胞群U3、或實施例6分別取得之3群中，分別取用同數目之細胞，於此分別以含有4.6%(w/v)硫酸十二酯鈉(SDS)、125mM tri-HCl(pH6.8)、20%(w/v)甘油、1.4M β-氫硫基乙醇之水溶液處理，作為細胞抽出物，將此供給至常法之10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。依常法，將電泳後之膠體，轉印至硝化纖維素膜，再將所得之硝化纖維素膜以羊之抗人類FOXP3抗體(Abcam plc.)處理，再以2次抗體之過氧化酶標示抗羊抗體(DACOR公司製造)處理。將所得之經抗體處理之硝化纖維素膜以化學發光檢出試藥組(商品名『SuperSignal West Pico』PIERCE公司製造)，藉由化學冷光之化學發光，將FOXP3之片段染色。結果如圖3所示。

圖3中，『4』之行係人類T細胞群U3、『5』之行係該A群、『6』之行係該B群、『7』之行係該C群之西方轉印法結果。此結果可明白知FOXP3，不僅在與CD4陽性CD25陽性控制性T細胞有相同細胞膜抗原之B群，在細胞膜抗原相異之A與C群亦有表現。此結果支持實施例8之結果，本發明之人類T細胞群之免疫抑制活性與CD4陰性CD25陽性控制性T細胞同樣地，係與FOXP3之表現高度相關，顯示出在A與C群中亦有CD4陽性CD25陽性控制性T細胞般之細胞。

實施例10

因細胞激素或絲裂原之增生性

本發明之人類T細胞群在單獨培養時無增殖性。於此，經抗CD3/CD28抗體處理，為調查於各種細胞激素或絲裂原處理之增殖性，做以下之實驗。將實施例1取得之人類T細胞群U3、或實施例9所調製之CD4陽性CD25陽性控制性T細胞樣品，各自以每孔4×10⁴ 個播種於96孔微量培養皿之孔中，於此，各自添加抗CD3/CD28抗體、IL-2、IL15、IL-4、IL-7、植物血凝素(PHA)、美洲商陸(PWM)、刀豆素A(ConA)後，培養5日。對照孔方面，準備有將人類T細胞群單獨培養之孔。依常法，測定各孔之³ H-Thymidine之攝取量。細胞增殖評估方法，係以對照中³ H-Thymidine之攝取量(cpm)表示。結果如表7所示。

由表7結果可知，本發明之人類T細胞群，以抗CD3/CD28抗體處理並無增殖。因此，可推測與已知之控制性T細胞同樣地對抗原刺激不反應(免疫不反應)狀態。然而，本發明之人類T細胞群與已知之控制性T細胞相異，於IL-2或IL-15處理下增殖，於抗CD3/CD28抗體及IL-2之處理下有明顯增殖性。此結果，顯示本發明之人類T細胞群，係具有與已知之控制性T細胞不同性質之細胞群。進一步，本發明之人類T細胞群，不因T細胞增殖因子，IL-4、IL-7等之細胞激素、絲裂原等而增殖，具有與一般T細胞相異之特性。

實施例11

IL-10之產生

將實施例1所取得之本發明之人類T細胞群U3調至為細胞濃度2×10⁵ 個/ml，添加100U/ml之IL-2，各自播種1ml於24孔微量培養皿或抗CD3/CD28抗體結合之24孔微量培養皿之孔中，培養16小時。又，將本發明之人類T細胞群U3調至為細胞濃度3×10⁵ 個/ml，添加100U/ml之IL-2，再將此各自2ml送入已培養成滿佈狀態之ST2細胞之6孔微量培養皿，培養40小時。將此等藉由離心分離，採取上清液，以使用抗IL-10抗體之分析套組(eBioscience.Inc.)測定IL-10之濃度。結果如表8所示。

由表8結果可知，本發明之人類T細胞群，在IL-2存在下產生IL-10，另外藉由與基質細胞共培養，IL-10之產量明顯增加。又，就算於單獨培養系中，IL-2存在下，藉由抗CD3/CD28抗體刺激，IL-10之產量明顯增加。IL-10主要為擔任免疫抑制之細胞激素，於T細胞中第2型輔助T細胞所產生，可抑制1型輔助T細胞產生IFN-γ等細胞激素、或抑制巨噬細胞產生IL-1等炎性細胞激素。而本發明之人類T細胞群，可發揮藉由IL-10之產生所媒介之免疫抑制活性。

實施例12

由末梢血取得人類T細胞群

將由18名健康人取得之末梢血各自以無FCS之RPMI培養基2倍稀釋，以常法之Ficoll-Paque法採集單核球細胞。將此於該培養基中調製成細胞濃度1×10⁶ 個/ml，如同實施例1，以每孔3ml播種於小鼠基質細胞ST2滿佈培養之6孔微培養皿中，同實施例1般共培養4~5週。將出現母細胞化之細胞以Ficoll-Paque法純化，成功的由4名健康者之末梢血取得人類T細胞群P1~P5。又，P2及P3為來自同一人之血液的人類T細胞群。

實施例13

細胞膜抗原之分析

以實施例2相同方法，分析實施例12中取得之人類T細胞群P1~P5之細胞膜抗原。又，所使用之小鼠抗TCR γ δ抗體係為T cell Science公司製造。結果如表9所示。括號內數值表示IL-2存在下與ST2細胞共培養9~ 14日增殖培養後測定之數值(P3未在IL-2存在下培養)，『-』表示未進行測定。

由表9結果知，本發明之人類T細胞群P1~P5，因CD3及TCR α β之陽性率在90%以上，本質上為T細胞所組成之細胞群，因其CD25、CD28、HLA-DR之陽性率相對較高，認為所含之T細胞幾乎全部活化。又，自然殺手T細胞之特徵細胞膜抗原CD16、CD56及CD57方面幾乎為陰性，所以認為此細胞群中，不含有傳統之自然殺手T細胞。又，具有GITR陽性率約50%以上之控制性T細胞之特徵。另外，表中雖未表示，發現於細胞中有CD152(CTLA-4)之表現。由以上結果與實施例2之表2的結果，可推論由末梢血取得之人類T細胞群與臍帶血取得之人類T細胞群，在細胞膜抗原方面有相同之特徵。

另外，末梢血取得之人類T細胞群，如在IL-2存在下繼續培養，CD25之陽性率有變低之傾向。CD25為IL-2受體，藉由與IL-2結合與負調控有關。又，IL-2存在下培養，人類T細胞群P1~P4之TCR γ δ之陽性率有變高之傾向。

實施例14

以抗CD4抗體及抗CD8抗體做雙重染色分析

如同實施例3，將實施例12取得之人類T細胞群P1~P5進行雙重染色。結果如表10所示。又，P1及P4方面，係為測定日不同之2次測定值。又，括號內數值表示IL-2存在下與ST2細胞共培養9~14日增殖培養後測定之數值(P3未在IL-2存在下培養)。

如表10之結果，於試驗之人類T細胞群P1~P5中，A群佔10.3~21.2%、B群佔6.6~46.1%、C群佔36.7~ 79.4%，此等之合計在93.5%以上。又，P1及P4中，與臍帶血取得之人類T細胞群相異，混有CD4弱陽性CD8弱陽性之細胞群，該細胞群於IL-2存在下培養，有增加之傾向。典型的例子方面，關於P1之細胞流式分析圖如圖4所示。經CD4、CD8及TCR γ δ之三重染色法的細胞流式分析圖如圖5所示，由其結果可知，該顯示CD4弱陽性CD8弱陽性之細胞群係為顯示TCR γ δ陽性之細胞群。

實施例15

細胞毒殺活性

關於本發明之人類T細胞群P1，使用商品名『抗TCR γ/δ Microbead Kit』(Miltenyi Biotec販賣)將D群之細胞群除去後，與實施例4及實施例5同樣，分析對於小鼠基質細胞、人正常細胞、人癌細胞，於E/T比為4/1或8/1時是否發揮細胞毒殺活性。細胞株方面，使用ST2細胞、NHDF細胞、ZR-75-1細胞(人類乳癌細胞來源：RCB1906，RIKEN BioResource Center)、MKN45細胞(人類胃癌細胞來源：RCB1001，RIKEN BioResource Center)、G361細胞、LoVo細胞(人類大腸癌來源細胞：RCB1639，RIKEN BioResource Center)、COLO 320DM細胞(人類大腸癌：ATCC CCL-220)、及WiDr細胞。結果如表11所示。又，表11中『-』表示未測定。

由表11可知，人類T細胞群P1於E/T比4/1或8/1時，顯示對小鼠基質細胞及人類癌細胞有細胞毒殺活性，對於人類正常細胞NHDF細胞，就算於E/T比為8/1也無細胞毒殺活性。由此結果，明白由末梢血取得之人類T細胞群與由臍帶血取得之人類T細胞群同樣地，對正常細胞無細胞毒殺活性，對癌細胞具有特異性低之細胞毒殺活性。

實施例16

以CD4及CD8為指標分群之各群之細胞毒殺活性

將實施例12取得之人類T細胞群P1，於IL-2之存在下與ST2細胞共培養2週，使其增殖後，與實施例6同樣地進行分群時，由6.5×10⁷ 個細胞中分別採集了A群3.0×10⁶ 個(純度97.1%)、B群4.6×10⁶ 個(純度94.6%)、C群1.7×10⁷ 個(純度99.3%)、D群(CD4弱陽性CD8弱陽性)6.1×10⁶ 個(純度91.2%)之四群。關於此等，與實施例7同樣地，求得細胞毒殺活性(%)。結果如表12所示。

由表12結果可知，本發明之人類T細胞群P1，與含於其中之全部群，對於ST2細胞發揮了細胞毒殺活性，特別是A群與C群之細胞毒殺活性很強。此結果，藉由臍帶血取得之人類T細胞群與實施例7之表5結果可說是幾乎相同。又，由末梢血取得P1中，特有之D群之細胞群的細胞毒殺活性較其他群強，因TCR γ δ為陽性，可推論為傳統之細胞毒殺活性T細胞。

實施例17

免疫抑制活性之測定

與實施例8相同地，測定人類T細胞群P1或實施例16中所分別採集之4群的免疫抑制活性。又，人類T細胞群P1，係使用於IL-2存在下與ST2細胞共培養2週增殖後之細胞。結果如表13所示。

由表13之結果可知，由末梢血取得之人類T細胞群P1比臍帶血所取得之人類T細胞群，其免疫抑制活性稍低，特別是B群有免疫抑制活性弱之傾向。B群之細胞群，易在藉由細胞分選法分選細胞中受到傷害，可推論為因此而活性低。考量此，可說由末梢血取得之人類T細胞群與臍帶血所取得之人類T細胞群，顯示具有幾乎相同之免疫抑制活性。又，P1中所特有之D群，其免疫抑制活性為各群中最弱者，係為傳統之細胞毒殺性T細胞，與實施例16之結果一致。

實施例18

藉由細胞激素之增殖

與實施例10相同方式進行，關於由末梢血取得之人類T細胞群P1，藉由抗CD3/CD28抗體及/或各種細胞激素處理是否顯示細胞增殖，以³ H-Thymidine之攝取量(cpm)測定。又，人類T細胞群P1，係使用於IL-2存在下與ST2細胞共培養2週增殖後之細胞。結果如表14所示。

由表14結果可知，由末梢血取得之人類T細胞群P1，藉由IL-2、IL-15、或抗CD3/CD28抗體與IL-2之處理，顯示顯著之增殖性，與臍帶血取得之人類T細胞群(實施例10之表7)有同樣之特性。然而，與由臍帶血取得之人類T細胞群不同的是，藉抗CD3/CD28抗體處理而增殖，其含有未完全成為不反應狀況之細胞及經T細胞增殖因子IL-4或IL-7而增殖之細胞。

實施例19

經RT-PCR分析FOXP3之表現

與實施例9同樣地，調製由末梢血取得之人類T細胞群P1~P5之mRNA，調查FOXP3之mRNA之表現狀況。結果，本發明之人類T細胞群P1~P5雖表現FOXP3，但比臍帶血取得之人類T細胞群表現之FOXP3量少。此結果，支持由末梢血取得之人類T細胞群比臍帶血取得之人類T細胞群之免疫抑制活性弱。

實施例20

IL-10之產生

與實施例11同樣地，關於由末梢血取得之人類T細胞群P1方面，測定於各種培養條件下IL-10之產生量。又，人類T細胞群P1，係使用於IL-2存在下與ST2細胞共培養2週增殖後之細胞。結果如表15所示。

由表15可知，本發明之人類T細胞群P1，於IL-2存在下產生IL-10時，更藉由與基質細胞共培養，顯著增加IL-10之產生量。又，就算於單獨培養系中，IL-2存在下經抗CD3/CD28抗體刺激，IL-10之產生量顯著增加。此結果與實施例11之表8之結果比較，由末梢血取得之人類T細胞群與臍帶血取得之人類T細胞群相較，其IL-10之產生能力稍微差。

[產業上的利用性]

如上所述，本發明之人類T細胞群，係為具有細胞毒殺活性與免疫抑制活性兩者之新穎之人類T細胞群，藉由免疫抑制活性，於自體免疫疾病、過敏性疾病等之治療、移植治療，或藉由細胞毒殺活性，在癌症治療領域上係有用的。

1‧‧‧CD4陽性CD25陽性控制性T細胞

2‧‧‧經抗CD3/CD28抗體處理之CD4陽性CD25陽性控制性T細胞

3‧‧‧人類T細胞群U3

4‧‧‧人類T細胞群U3

5‧‧‧人類T細胞群U3中之A群

6‧‧‧人類T細胞群U3中之B群

7‧‧‧人類T細胞群U3中之C群

圖1：本發明之人類T細胞群U3之CD4及CD8之表現分佈之流式細胞儀分析圖。

圖2：本發明之人類T細胞群U3與CD4陽性CD25陽性T細胞中FOXP3之RT-PCR分析結果圖。

圖3：本發明之人類T細胞群U3與各群中FOXP3之西方轉印分析結果圖。

圖4：本發明之人類T細胞群P1之CD4及CD8之表現分佈之流式細胞儀分析圖。

圖5：本發明之人類T細胞群P1之TCR γ δ之表現分佈之流式細胞儀分析圖。

<110> Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo

<120> Novel human T cell group

<130> WO1136

<160> 2

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PCR primer for human FOXP3 mRNA(Genbank Code NM_014009 or DQ010327)

<400> 1

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PCR primer for human FOXP3 mRNA(Genbank Code NM_014009 or DQ010327)

<400> 2

Claims

一種人類T細胞群，藉由將採自人類血液之單核球細胞與基質細胞(stromal cell)一起培養而獲得，且具有下述之特徵：(1)CD3、CD25、CD28及T細胞抗原受體α β為陽性、(2)本質上由CD4陽性CD8陽性T細胞、CD4陽性CD8弱陽性T細胞及CD4陰性CD8陽性T細胞之三群所成、(3)相對於共同培養之基質細胞，發揮細胞毒性，以及(4)對於活化之T細胞，發揮免疫抑制之活性。
如申請專利範圍第1項之人類T細胞群，其可產生介白素-10。
如申請專利範圍第1項或第2項之人類T細胞群，其中人類血液為臍帶血或末稍血。
如申請專利範圍第1項或第2項之人類T細胞群，其中基質細胞為小鼠基質細胞。
一種醫藥組成物，其特徵係含有如申請專利範圍第1項或第2項之人類T細胞群。