TWI408235B - 用於檢測口腔癌之基因標記及方法 - Google Patents
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Description
本發明係關於一種用於檢測口腔癌之基因標記，以及一種篩檢口腔癌之方法，尤其是關於一種根據基因標記之甲基化狀態篩檢口腔癌之方法。
口腔癌係指口腔及口咽部中任何部位發生癌症，其為台灣男性主要的惡性腫瘤死亡原因之一，致病因子包括菸、酒及檳榔等。由於在台灣嚼食檳榔的人口眾多，故口腔癌在台灣的發生率遠高於其他國家。此外，口腔癌病患的罹病與死亡平均年齡都約在50歲至60歲，正處於人生的黃金時期，因此，口腔癌除了造成個人生命的縮短外，亦衍生家庭與經濟問題，可見其對台灣社會的影響甚鉅。
儘管於癌變初期發現口腔癌，即可及時予以治療，並獲致極高之痊癒率，惟因多數病患並不特別注意口腔內發生的變化，因而無法及時遠離如檳榔、菸及酒等致病因子，故每年仍有許多病患死於口腔癌。因此，若可於發病初期即檢驗出口腔癌，並予以治療，便可有效降低口腔癌的死亡率。
目前口腔癌的檢測方法包括病理切片檢查(excisional biopsy)、漱口式染色劑檢查、以及細胞抹片檢查(exfolivative cytology)。病理切片檢查係對於位置獨立且顯而易見的疑似病灶進行切除及病理切片，並利用顯微鏡觀察，以辨別受測者是否罹患口腔癌。然而，對於口腔黏膜長期浸潤於含有致癌物質的檳榔汁中的高危險群病患而言，由於長期間之口腔黏膜區域性癌化(field cancerization)過程，而造成瀰漫性癌前變化，其導致口腔內並無單一、位置獨立且清楚明確的病灶，因此，利用病理切片方法進行篩檢存在相當程度的困難性。漱口式染色劑檢查係使用如甲苯胺藍(Toluidin Blue)、魯格爾溶液(Lugol Solution)或亞甲基藍(Methylene Blue)等漱口式染色劑來篩檢口腔癌，儘管此等漱口式染色劑易於使用且敏感度佳，惟其容易產生偽陽性，造成檢驗準確率下降與不必要之醫療資源浪費，故仍無法免除配合進行前述病理切片檢查之必要。至於細胞抹片檢查，則係類似於子宮頸癌的抹片檢查，儘管其可適用於子宮頸癌之篩檢，然因偽陰性之比率高，且口腔環境異於子宮頸，於操作時易受唾液分泌干擾，大幅影響應用性與準確性，是故，細胞抹片檢查從未成為有效的口腔癌篩檢方法。因此，就口腔癌之臨床診斷而言，仍亟須一種有效且準確率高的篩檢方法。
本案即係針對上述需求所為之研究，本案發明人發現，人類基因體去氧核糖核酸(genomic DNA)中七個基因內的七個CpG位點，可作為篩檢口腔癌之基因標記，且具有高準確率。
本發明之一目的在於提供一種用於檢測口腔癌之基因標記，其係包含一目標基因之CpG位點且該CpG位點係經甲基化，其中，該目標基因之CpG位點係選自以下群組：FLT4_E206_F、ASCL1_E24_F、KDR_E79_F、TFPI2_P9_F、TERT_E20_F、ADCYAP1_P455_R、MT1A_P49_R、及前述之組合。
本發明之另一目的在於提供一種篩檢口腔癌之方法，包含以下步驟：a)提供一受測檢體；b)檢測該受測檢體之細胞之基因體去氧核糖核酸(genomic DNA)中，至少一選自以下群組之目標基因之CpG位點的甲基化狀態：FLT4_E206_F、ASCL1_E24_F、KDR_E79_F、TFPI2_P9_F、TERT_E20_F、ADCYAP1_P455_R、以及MT1A_P49_R；以及c)根據該目標基因之CpG位點的甲基化狀態，判斷該受測檢體是否具有口腔癌。
本發明之詳細技術及較佳實施態樣，將描述於以下內容中，以供本發明所屬領域具通常知識者據以明瞭本發明之特徵。
除非文中有另外說明，於本說明書中(尤其是在後述專利申請範圍中)所使用之「一」、「該」及類似用語應理解為包含單數及複數形式。
基因體去氧核糖核酸(genomic DNA，下文稱為「基因體DNA」)的編碼係依據A(adenine，腺嘌呤)、T(thymine，胸腺嘧啶)、C(cytosine，胞嘧啶)、及G(guanine，鳥嘌呤)四種鹼基的排列以提供各種遺傳訊息，其中，胞嘧啶的甲基化修飾(5-甲基胞嘧啶，5-methylcytosine)會影響基因表現型(phenotype)。胞嘧啶的甲基化係發生在DNA合成後，經DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase)之作用，自一甲基捐赠者s-腺核苷甲硫胺酸(S-adenosylmethionine，SAM)將一甲基轉移到胞嘧啶之第5號碳的位置上。5-甲基胞嘧啶僅會存在於哺乳類動物細胞內的迴文序列5’-CpG-3’中。CpG島(CpG islands)係指在約200個鹼基對的區域內含有大量的CG雙核苷酸，且CpG島通常位於廣泛表現之基因的啟動子附近，此可參見Gardiner-Gardenet al.
,CpG Islands in vertebrate genomes.Journal of Molecular Biology.
July 1987;196(2): 261-282，該文獻全文倂於此處以供參考。於CpG島中之胞嘧啶的甲基化會造成基因默化(gene silencing)，而使基因不表現，進而導致癌症生成。
儘管已知CpG島中之胞嘧啶的甲基化修飾與癌症有關，然因遺傳及環境作用等特性，使各癌症患者之甲基化程度不同，且不同的癌症也會產生不同的甲基化表現型。此外，過去針對胞嘧啶甲基化之研究多侷限於單一或少數基因，並不足以提供充分資訊作為診斷之依據，況且口腔癌的甲基化表現型以及哪些CpG位點的甲基化係與口腔癌有關迄今未明，因此，若欲利用胞嘧啶的甲基化作為篩檢口腔癌之生物指標(biomarker)，則須自全基因體DNA中找出與口腔癌高度相關之CpG位點。
本案發明人發現，於全基因體DNA中存在七個與口腔癌高度相關之CpG位點，其可作為檢測口腔癌之生物指標。該七個CpG位點係分別來自七個基因(下文稱為「目標基因」)：FLT4、ASCL1、KDR、TFPI2、TERT、ADCYAP1、以及MT1A，其名稱、編號、位置及功能如下表1所示。
因此，本發明提供一種用於檢測口腔癌之基因標記(gene marker)，其係包含一目標基因之CpG位點且該CpG位點係經甲基化，該目標基因之CpG位點係選自以下群組：FLT4_E206_F、ASCL1_E24_F、KDR_E79_F、TFPI2_P9_F、TERT_E20_F、ADCYAP1_P455_R、MT1A_P49_R、及前述之組合。其中，該CpG位點於全基因體DNA中之位置係如表2所示。於此，若目標基因之CpG位點係經甲基化，則可初步判定受測檢體具有口腔癌。較佳地，本發明基因標記係包含選自以下群組之目標基因之CpG位點且該CpG位點係經甲基化：FLT4_E206_F、ASCL1_E24_F、KDR_E79_F、TFPI2_P9_F、TERT_E20_F、及前述之組合。
於本發明之一實施態樣中，係以一至三個位點之組合方式，將七個CpG位點予以排列組合，並用於篩檢口腔癌，可提升檢測之準確率。較佳地，本發明基因標記係包含選自以下群組之目標基因之CpG位點且該CpG位點係經甲基化：
(1) FLT4_E206_F及ASCL1_E24_F；
(2) FLT4_E206_F、ASCL1_E24_F及KDR_E79_F；
(3) TFPI2_P9_F、ASCL1_E24_F及KDR_E79_F；
(4) FLT4_E206_F、TFPI2_P9_F及ASCL1_E24_F；
(5) FLT4_E206_F及KDR_E79_F；
(6) TFPI2_P9_F及ASCL1_E24_F；
(7) FLT4_E206_F、TFPI2_P9_F及KDR_E79_F；
(8) FLT4_E206_F及TFPI2_P9_F；
(9) FLT4_E206_F、ASCL1_E24_F及TERT_E20_F；
(10) FLT4_E206_F；
(11) TFPI2_P9_F及KDR_E79_F；
(12) TFPI2_P9_F；
(13) ASCL1_E24_F；
(14) ADCYAP1_P455_R；以及
(15) MT1A_P49_R。
於上述(1)至(15)之任一CpG位點組合中，若受測者之其中一CpG位點係經甲基化(例如，排名第(1)之FLT4_E206_F與ASCL1_E24_F之CpG位點組合中，「FLT4_E206_F的CpG位點」與「ASCL1_E24_F的CpG位點」二者中之任一為經甲基化的情形)，即可初步判定其罹患口腔癌。更佳地，該基因標記係包含選自以下群組之目標基因之CpG位點且該CpG位點係經甲基化：
(1) FLT4_E206_F及ASCL1_E24_F；
(2) FLT4_E206_F、ASCL1_E24_F及KDR_E79_F；
(3) TFPI2_P9_F、ASCL1_E24_F及KDR_E79_F；
(4) FLT4_E206_F、TFPI2_P9_F及ASCL1_E24_F；
(5) FLT4_E206_F及KDR_E79_F；
(6) TFPI2_P9_F及ASCL1_E24_F；
(7) FLT4_E206_F、TFPI2_P9_F及KDR_E79_F；
(8) FLT4_E206_F及TFPI2_P9_F；以及
(9) FLT4_E206_F、ASCL1_E24_F及TERT_E20_F。
如後附實施例所示，利用本發明基因標記檢測口腔癌時，可達八成、甚至九成以上之準確率，因此，其可作為有效之供口腔癌篩檢用之生物指標。
由於本發明基因標記可包含僅一至三個CpG位點，即，可包括單一CpG位點、二個CpG位點之組合、或三個CpG位點之組合，故於操作上具有優異之靈活度。使用者可依據受測者之生理特性與需求，選擇適宜之基因標記進行篩選，甚至可利用CpG位點之各種組合，以進行全面性篩檢。
本發明基因標記可用於建立供檢測口腔癌用之生物晶片(biochip)，例如感測型晶片、微處理型晶片、或微陣列型晶片(microarray biochip)等。舉例言之，可依據本發明基因標記以設計一種DNA探針(DNA probe)，並將其配置於一生物晶片中，僅須將受測者經亞硫酸鹽處理後之檢體置於該生物晶片中與該探針進行雜合(hybridization)，即可立即獲知該受測者是否罹患口腔癌等相關資訊，藉此提升篩檢效率。
本發明亦提供一種篩檢口腔癌之方法，包含以下步驟：a)提供一受測檢體；b)檢測該受測檢體之細胞之基因體去氧核糖核酸(genomic DNA)中，至少一選自以下群組之目標基因之CpG位點的甲基化狀態：FLT4_E206_F、ASCL1_E24_F、KDR_E79_F、TFPI2_P9_F、TERT_E20_F、ADCYAP1_P455_R、以及MT1A_P49_R；以及c)根據該目標基因之CpG位點的甲基化狀態，判斷該受測檢體是否具有口腔癌。
於步驟a)中，係自受測者口腔內取得一受測檢體，以進行篩檢，其中，該受測檢體可為口腔黏膜細胞、口腔組織切片、唾液、血液、或前述之組合。較佳地，該受測檢體係來自疑似病灶部分之口腔黏膜細胞、口腔組織切片、唾液、血液、或前述之組合。
於步驟b)中，取出受測檢體內之基因體DNA，以檢測至少一個CpG位點的甲基化狀態。可以任何合宜的方式取出基因體DNA，舉例言之，可使用市售之DNA純化套組(DNA isolation kit)或DNA萃取套組(DNA extraction kit)來進行。
於取得基因體DNA後，可以任何合宜方式來分析其CpG位點的甲基化狀態，以作為口腔癌診斷之依據，例如，可利用選自以下群組之方法進行分析：甲基化特異性聚合酶連鎖反應(methylation-specific PCR，MSP)、定量甲基化特異性聚合酶連鎖反應(quantitative methylation-specific PCR，QMSP)、亞硫酸鹽定序(bisulfite sequencing，BS)、微陣列(microarray)分析、質譜儀(mass spectrometer)分析、變性高效能液相色譜(denaturing high-performance liquid chromatography，DHPLC)分析、焦磷酸定序(pyrosequencing)、及前述之組合。於本發明之一實施態樣中，係先以亞硫酸鹽進行基因體DNA之甲基化修飾，再利用微陣列分析其甲基化狀態。
較佳地，係於本發明方法步驟b)中，檢測至少一選自以下群組之目標基因之CpG位點的甲基化狀態：FLT4_E206_F、ASCL1_E24_F、KDR_E79_F、TFPI2_P9_F、以及TERT_E20_F。如上所述，本發明可以一至三個位點之組合方式，將七個CpG位點予以排列組合，以提升檢測準確率。因此，更佳係於步驟b)檢測選自以下群組之目標基因之CpG位點的甲基化狀態：
(1) FLT4_E206_F及ASCL1_E24_F；
(2) FLT4_E206_F、ASCL1_E24_F及KDR_E79_F；
(3) TFPI2_P9_F、ASCL1_E24_F及KDR_E79_F；
(4) FLT4_E206_F、TFPI2_P9_F及ASCL1_E24_F；
(5) FLT4_E206_F及KDR_E79_F；
(6) TFPI2_P9_F及ASCL1_E24_F；
(7) FLT4_E206_F、TFPI2_P9_F及KDR_E79_F；
(8) FLT4_E206_F及TFPI2_P9_F；
(9) FLT4_E206_F、ASCL1_E24_F及TERT_E20_F；
(10) FLT4_E206_F；
(11) TFPI2_P9_F及KDR_E79_F；
(12) TFPI2_P9_F；
(13) ASCL1_E24_F；
(14) ADCYAP1_P455_R；以及
(15) MT1A_P49_R。
最佳地，係檢測選自以下群組之目標基因之CpG位點的甲基化狀態：
(1) FLT4_E206_F及ASCL1_E24_F；
(2) FLT4_E206_F、ASCL1_E24_F及KDR_E79_F；
(3) TFPI2_P9_F、ASCL1_E24_F及KDR_E79_F；
(4) FLT4_E206_F、TFPI2_P9_F及ASCL1_E24_F；
(5) FLT4_E206_F及KDR_E79_F；
(6) TFPI2_P9_F及ASCL1_E24_F；
(7) FLT4_E206_F、TFPI2_P9_F及KDR_E79_F；
(8) FLT4_E206_F及TFPI2_P9_F；以及
(9) FLT4_E206_F、ASCL1_E24_F及TERT_E20_F。
最後，於步驟c)中，根據所選擇之CpG位點的甲基化狀態，若所選擇之CpG位點係經甲基化，則初步判定受測者罹患口腔癌。
本發明方法可視需要與習知之口腔癌檢測方法結合，以提升運用靈活度，舉例言之，可於取得受測者之口腔組織切片後，同時進行本發明篩檢方法與病理切片檢查，以進一步提升篩檢準確率。
茲以下列具體實施態樣以進一步例示說明本發明。其中該些實施態樣僅提供作為說明，而非用以限制本發明之範疇。
[實施例1] 收集樣本
實驗A、收集測試樣本
收集測試樣本以進行基因標記之甲基化分析，樣本來源為中國醫藥大學附設醫院的組織庫。首先，收集男性個體之口腔組織，並分為實驗組(病例組)與對照組(正常組)，其中，實驗組為對口腔癌病患之腫瘤病灶組織進行手術切除所取得之組織，共40個組織樣本；對照組共15個組織樣本，為口腔癌病患之口腔內部之鄰近病灶的正常組織(10個組織樣本)，以及自接受扁桃腺切除手術之病患取得之口腔內部的正常組織(5個組織樣本)。
受測男性個體之基本人口學特徵係如表3所示，實驗組之受測對象為口腔癌男性病患共40位，對照組之受測對象共15位。實驗組受測對象的年齡中位數為53歲(四分位距(interquatile range，IQR)為15.5歲)，略高於對照組(年齡中位數為48歲，四分位距為25歲)。實驗組之受測對象皆為口腔黏膜癌之患者，根據口腔癌之臨床分期TNM系統(如表4所示)：原發腫瘤大小(T Stage)以T2比例為最高(40%)，其次為T4/T4a(37.5%)；在頸部淋巴結轉移情形(N Stage)中，N0比例最高(65%)；在遠端轉移情形(M Stage)中，實驗組皆為M0。另外，根據口腔癌TNM系統定義之臨床分期，第IV/Iva期所佔比例最高(45%)，其次為第II期(30%)。
本試驗業經中國醫藥大學公共衛生學院研究倫理委員會，以及中國醫藥大學附設醫院之人體試驗委員會同意後執行。
實驗B、萃取DNA
以實驗A中取得之口腔組織樣本作為基因體DNA樣本的來源，並進行DNA抽取。使用Gentra DNA isolation kit(Minneapolis，明尼蘇達州)抽取基因體DNA，再使用Zymo EZ DNA Methylation kit(Alameda，加州)進行亞硫酸氫鈉(sodium bisulfite)修飾處理。於此，DNA經由亞硫酸氫鈉修飾處理後，胞嘧啶(cytosine，C)會被轉變成尿嘧啶(uracil，U)；但若為經甲基化之胞嘧啶(5-methylcytosine，m5
C)，則經亞硫酸氫鈉處理後，鹼基的型態並不會發生改變，仍保持胞嘧啶的型式。因此，可利用核苷酸定序方式，確認DNA序列中經甲基化之胞嘧啶的位置。
實驗C、甲基化鑑定
於此試驗中，係使用Array of Illumina GoldenGate Methylation Cancer Panel II平台(San Diego，加州)進行甲基化之分析，鑑定於實驗B中取得之基因體DNA中807個癌症相關基因之1505個CpG位點的甲基化程度，並使用普遍引子1(universal primer 1)作為Cy3標記來擴大無甲基化的模板DNA，以及使用普遍引子2(universal primer 2)作為Cy5標記來擴大甲基化的模板DNA。
接著，利用甲基化分析演算法計算基因體DNA樣本的每個CpG位點之甲基化程度，甲基化程度係以β值來表示。β值的範圍介於0到1，計算方式如下：
其中，Max係指取基因體DNA樣本之一特定CpG位點之甲基化程度的最大值，且若Cy5,0或Cy3,0出現負值則以0取代。上述甲基化鑑定方式及β值計算方式可參見Bibikovet al
,(2006) High-throughput DNA methylation profiling using universal bead arrays.Genome Res.
16: 383-393，該文獻全文倂於此處以供參考。
實驗D、對照組樣本分析
由於對照組樣本係來自兩種不同組織來源(即，口腔癌病患之口腔內部之鄰近病灶的正常組織，以及經進行扁桃腺切除手術之病患之口腔內部的正常組織)，故利用實驗C所得到之β值進行集群分析(hierarchical cluster analysis)，以確認該兩種不同組織來源是否可合併成一對照組(正常組)。於此，將測試樣本分成三組，包括口腔癌組織(OSCC，oral squamous cell carcinoma)、口腔癌之鄰近正常組織(AN)、以及完全正常組織(N)，分別將三組組織之1505個CpG位點的β值取平均值，再進行集群分析。分析結果係如第1圖所示，口腔癌之鄰近正常組織與完全正常組織可分至同一集群中，顯示將該兩種組織來源合併定義為對照組係適宜的。
[實施例2] 篩選基因標記
實驗E、建立CpG位點集群
首先，保留可能成為供篩選用之CpG位點群組(下文稱為「CpG位點集群(cluster)」)，再透過篩選方式去蕪存菁找到最佳之CpG位點基因標記。建立CpG位點集群分為兩階段，如第2圖所示，第一階段進行1505個CpG位點之初步篩選，保留下的CpG位點則屬於CpG位點集群，篩選條件如下：
i) 以二分類法定義甲基化程度(或甲基化之有無)，若β值≧0.15則定義為有甲基化，若β值<0.15則定義為無甲基化。於此，若所有實驗組(病例組)樣本在某一個CpG位點之β值全部小於0.15(即，全無甲基化，無法作為有效之基因標記)則刪除；相反地，若所有對照組(正常組)樣本在某一個CpG位點之β值全部大於0.15(即，全部甲基化，屬於正常之甲基化)，則刪除；
ii) 若所有對照組樣本在某一個CpG位點之β值的中位數大於0.15(即，一半以上有甲基化，屬於正常之甲基化)，則刪除；以及
iii) 若實驗組及對照組在某一個CpG位點之β值的中位數差距若小於0.2(即，實驗組及對照組之甲基化程度差異過小，無法作為有效之基因標記)，則刪除。
經利用以上三個條件進行篩選移除所保留下來的CpG位點為CpG位點集群。其中，條件i)可自1505個CpG位點中篩選出730個CpG位點；條件ii)可自730個CpG位點中篩選出604個CpG位點；以及條件iii)可自604個CpG位點中篩選出64個CpG位點，此64個CpG位點即為CpG位點集群，共涵蓋了47個基因(64個CpG位點來自47個不同基因)，其中DCC、HS3ST2、HTR1B及NPY基因各有3個CpG位點被保留於CpG位點集群中。
實驗F、篩選與評估CpG位點集群
將實驗E中所篩選出之CpG位點集群(64個CpG位點)，再經由以下程序進行進一步之篩選，以找出更佳之CpG位點，並評估其可行性與準確率。
如第3圖所示，將CpG位點分別依連續變項及類別變項進行檢驗。首先，將β值視為連續變項，依Wilcoxon等級和檢定(Wilcoxon rank-sum test)尋找甲基化程度與口腔癌之有無有統計上之差異性的CpG位點(有關Wilcoxon等級和檢定可參見如Wilcoxon,(1945). Individual comparisons by ranking methods.Biometrics Bulletin
,1,80-83，該文獻全文倂於此處以供參考)。
接著，將甲基化程度轉為二分類法之類別變項(即，β值≧0.15定義為有甲基化，β值<0.15則定義為無甲基化)，以進行費雪精確檢定(Fisher’s exact test)，據此尋找甲基化狀態與口腔癌之間有關聯性的CpG位點(有關費雪精確檢定可參見如Fisher,(1922),On the interpretation of χ2
from contingency tables,and the calculation of P.Journal of the Royal Statistical Society
,85
(1): 87-94，該文獻全文倂於此處以供參考)。Wilcoxon檢定法與費雪檢定法之P值達統計上顯著者(即，P<0.05)予以保留，反之，則予以刪除。
於實驗E中所篩選出之CpG位點集群(64個CpG位點)中，實驗組與對照組之CpG位點集群之甲基化程度(β值)的分布與Wilcoxon等級和檢定的結果係如表5所示，其中，實驗組與對照組中所有CpG位點集群之β值的分布都是差異顯著的(p<0.05(統計的顯著水準定為p=0.05))，且約86%(55/64)之CpG位點集群之β值的分布係差異極為顯著的(p<0.0001)。此外，於進行費雪精確檢定後，僅有PALM2_AKAP2_P420_R之CpG位點與口腔癌之關係不顯著，故予以排除。實驗組與對照組之CpG位點集群之甲基化程度與口腔癌之相關性係如表6所示。
最後，計算CpG位點的敏感度(sensitivity)及特異度(specificity)。於此，以二分類法定義甲基化程度(即，β值≧0.15定義為有甲基化，β值<0.15定義為無甲基化)，依此定義來預測受檢者是否患有口腔癌，藉此計算各CpG位點的敏感度及特異度，敏感度及特異度均達0.7以上之CpG位點予以保留，反之，則予以刪除。
經上述步驟之篩選，可得到共34個CpG位點，其敏感度及特異度均≧0.7。該34個CpG位點係來自29個基因，彼等基因之功能可大致分為十一類：訊息傳遞、腫瘤抑制、分化、代謝、血液凝固、細胞週期進行、DNA修復、印痕作用(imprinting)、細胞附著、細胞發育、以及造血。該34個CpG位點的集群分析係如第4圖所示，顯示測試樣本可分成三個集群，左右兩側的集群主要是口腔癌組織(OSCC)，而中間的集群主要是口腔癌之鄰近正常組織(AN)及完全正常組織(N)。
實驗G、CpG位點之組合、比較與交叉驗證
利用SAS統計軟體(Statistical Analysis System software，9.2版)計算接收操作特徵曲線(Receiver Operator Characteristic(ROC)curve)之曲線下面積(area under curve，AUC)來評估準確率，其中AUC值愈大，表示準確率愈高。利用AUC值的大小排序實驗F中所得到之敏感度及特異度均達0.7以上的34個CpG位點，其中，取前十名之CpG位點進行組合，包含一個、二個或三個CpG位點之組合。排列組合後，再次計算各組合預測口腔癌的敏感度及特異度(只要各組合中的任一CpG位點有甲基化則判定為口腔癌)，並進行交叉驗證來檢驗準確度(包括平均正確分類率及標準誤差)，以挑選最佳之CpG位點組合。
實驗D至實驗G之統計分析係以SAS統計軟體進行，使用R package軟體(2.8.1版)作為heat maps(第1圖及第4圖)之繪圖工具，並使用Clint Moore所寫的SAS macro CVLR軟體進行重複5000次之5-疊交叉驗證，以計算各CpG位點組合之平均正確分類率及標準誤差。
利用各CpG位點組合篩檢口腔癌的準確性係如表7所示，其中，表中的排名係依照AUC值最大，再依包含最少CpG位點，以及交叉驗證所計算出之平均正確分類率來排序。由於排列組合數眾多，表7中僅列出前十五名(包括單一CpG位點、二個CpG位點之組合、以及三個CpG位點之組合中排序前五名者)，其共包含七個CpG位點：FLT4_E206_F、ASCL1_E24_F、KDR_E79_F、TFPI2_P9_F、ADCYAP1_P455_R、MT1A_P49_R、以及TERT_E20_F。
表4顯示，利用本發明之基因標記可提供高達八成五、甚至九成以上的篩檢準確率，故可作為有效之檢測口腔癌之生物指標。
上述實施例僅係用以例示說明本發明之原理及功效，而非用於限制本發明。任何熟於此項技藝之人士均可在不違背本發明之技術原理及精神的情況下，對上述實施例進行修改及變化。因此，本發明之權利保護範圍應如後述之申請專利範圍所列者。
第1圖係依據1505個CpG位點之甲基化程度(β值)對口腔癌組織(OSCC)、口腔癌之鄰近正常組織(AN)、以及完全正常組織(N)進行分析之集群分析圖；
第2圖及第3圖所示為本發明之基因標記的篩選流程圖；以及
第4圖係依據34個CpG位點之甲基化程度(β值)對口腔癌組織(OSCC)、口腔癌之鄰近正常組織(AN)、以及完全正常組織(N)進行分析之集群分析圖。
Claims (4)
- 一種用於檢測口腔癌之基因標記，其係由一目標基因之CpG位點所組成且該CpG位點係經甲基化，其中，該目標基因之CpG位點係選自以下群組：(1)FLT4_E206_F及ASCL1_E24_F；(2)FLT4_E206_F、ASCL1_E24_F及KDR_E79_F；(3)FLT4_E206_F、TFPI2_P9_F及ASCL1_E24_F；(4)FLT4_E206_F及KDR_E79_F；(5)FLT4_E206_F、TFPI2_P9_F及KDR_E79_F；(6)FLT4_E206_F及TFPI2_P9_F；以及(7)FLT4_E206_F、ASCL1_E24_F及TERT_E20_F。
- 一種篩檢口腔癌之方法，包含以下步驟：a)提供一受測檢體；b)檢測該受測檢體之細胞之基因體去氧核糖核酸(genomic DNA)中，選自以下群組之目標基因之CpG位點的甲基化狀態：(1)FLT4_E206_F及ASCL1_E24_F；(2)FLT4_E206_F、ASCL1_E24_F及KDR_E79_F；(3)FLT4_E206_F、TFPI2_P9_F及ASCL1_E24_F；(4)FLT4_E206_F及KDR_E79_F；(5)FLT4_E206_F、TFPI2_P9_F及KDR_E79_F；(6)FLT4_E206_F及TFPI2_P9_F；以及(7)FLT4_E206_F、ASCL1_E24_F及TERT_E20_F；以及c)根據該目標基因之CpG位點的甲基化狀態，判斷該受測檢 體是否具有口腔癌。
- 如請求項2之方法，其中該步驟a)之受測檢體係選自以下群組：口腔黏膜細胞、口腔組織切片、唾液、血液、或前述之組合。
- 如請求項2之方法，其中係於步驟b)進行選自以下群組之分析：甲基化特異性聚合酶連鎖反應(methylation-specific PCR，MSP)、定量甲基化特異性聚合酶連鎖反應(quantitative methylation-specific PCR，QMSP)、亞硫酸鹽定序(bisulfite sequencing，BS)、微陣列(microarray)分析、質譜儀(mass spectrometer)分析、變性高效能液相色譜(denaturing high-performance liquid chromatography，DHPLC)分析、焦磷酸定序(pyrosequencing)、及前述之組合。
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