TWI406944B - 葡萄糖脫氫酶及使用其測量血糖的方法 - Google Patents
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Description
本發明關於新穎的葡萄糖脫氫酶及其核苷酸序列，特別是關於具有高溫穩定性的葡萄糖脫氫酶，可用於血糖測量。
居家自我檢測血糖含量對於糖尿病或低血糖患者而言是掌控病情的重要指標工具，可預防及減緩病情的發展及併發症的發生。
國內約有26家中小型廠商投入血糖機與試片的生產及製造，目前所採用之技術皆為第一代指尖採血之葡萄糖氧化酶(glucose oxidase；GOD)測定法。然而已知使用GOD的檢測法會受血中氧氣濃度的影響，因此必須以指尖採血之方式以避免個體差異所造成的測量誤差。但是，指尖採血的疼痛感較大，對於兒童與患有心血管疾病的患者較不友善，再者指尖可採血的面積有限，長期連續使用容易造成患者皮膚或末梢神經的感染。
第二代的血糖檢測方法採用葡萄糖脫氫酶-吡咯併喹啉(Glucose Dehydrogenase Pyrroloquinolinone;GDH-PQQ)測定法，可避免指尖採血的缺點。但是美國食品藥物管理局(FDA)於2009年發出聲明指出，GDH-PQQ測定法可能因為受到麥芽糖、半乳糖或口服木糖(d-xylose)而導致假性高血糖的錯誤判斷，並指出使用葡萄糖脫氫酶-菸鹼醯胺腺嘌呤雙核苷酸(glucose dehydrogenase-nicotinamde adenine dinucleotide;GDH-NAD)不會產生此類的干擾。
然而在製造測量血糖的試片中，需要經過高溫烘乾等的步驟，酵素容易因此喪失活性。因此研究具有耐高溫特性的葡萄糖脫氫酶有產業上的需求。美國專利US7,871,805B2揭示一種來自真菌(penicillium
)具有耐高溫性及基質專一性的葡萄糖脫氫酶，該酵素在55℃處理15分鐘後仍可維持95%以上的酵素活性，對於葡萄糖的專一性也高於木糖、麥芽糖等。美國專利US7,939,309B2也揭示一種衍生自細菌(B. subtilis
)的突變GDH-NAD，藉由對野生型GDH-NAD的特定胺基酸殘基位置進行胺基酸的取代，使突變的GDH活性較野生型高1.5倍，熱穩定性提升至50℃維持20分鐘。
本發明人基於上述的產業需求，積極對具有高溫穩定性、酸鹼穩定性及基質專一性之葡萄糖脫氫酶進行研究，進而完成本案發明。
本案一發明方面，提供一種分離的核苷酸，包括序列識別號1所示之核苷酸序列、以及與序列識別號1所示之核苷酸序列具有至少95%同質性(homology)的核苷酸序列，其中該核苷酸編碼的多胜肽具有葡萄糖脫氫酶(GDH)的活性。
本案另一發明方面，提供包含上述核苷酸之重組表現載體及宿主細胞。
本案再一發明方面，提供由上述核苷酸編碼的多胜肽或由上述重組表現載體或宿主細胞表現的多胜肽，此述的多胜肽具有葡萄糖脫氫酶的活性。
本案再一發明方面，提供一種測量血糖含量的方法，包括使測試的血液樣本與上述多胜肽接觸的步驟。
本案更一發明方面，提供一種測量血糖含量的生物感測器，包括含有上述多胜肽的測試元件以及分析血糖含量的顯示元件。
本發明之葡萄糖脫氫酶的作用在於，可催化β-葡萄糖轉變為葡萄糖酸內酯(gluconolactone)，在轉變過程中所放出的電子使輔酶菸鹼醯胺腺嘌呤雙核苷酸(nicotinamde adenine dinucleotide;NAD)還原為NADH(reduced nicotinamde adenine dinucleotide)。
本發明之葡萄糖脫氫酶具有分子量大小約39kDa，與(Jeremy R. Bright,David Byrom,Michael J. Danson,David W. Hough,Paul Towner,”Cloning,sequencing and expression of the gene encoding glucose dehydrogenase from the thermophilic archaeonthermoplasma acidophilum
”European Journal of Biochemistry
,221,549-554.;Maria-Jos Bonete,Carmen pire,Francisco I. Lorca,Monica L. Camacho Glucose dehydrogenase from the halophilic ArchaeonHaloferax mediterranei
: Enzyme purification,characterisation and N-terminal sequence.FEBS Letters
383(1996) 227-229)中純化的葡萄糖脫氫酶相近。此述葡萄糖脫氫酶的最適反應溫度在於75~85℃範圍，具有60%以上的相對活性，特別是在75℃的環境具有最高的反應活性。此述「相對活性」係指一酵素在一種處理條件下所表現的活性，相對於未進行該處理條件時的活性(設定為100%)而言。下述內容除有特別限定外，「相對活性」的定義與此述相同。
本發明之葡萄糖脫氫酶的最適反應酸鹼度在pH7~9範圍，具有50%以上的相對活性，特別是在pH7.97具有最高的反應活性。
本發明之葡萄糖脫氫酶更具有溫度穩定性，可在70~80℃維持15分鐘的條件下具有40%以上的相對活性，特別是在75℃、15分鐘的條件下仍具有80%以上的相對活性。相較於習知酵素在高溫環境受到破壞及在低溫環境活性降低的性質，本發明之葡萄糖脫氫酶於高溫環境下較習知酵素穩定，因此更適合應用於需要經過高溫步驟的製程，例如血糖機的試片的製造。
本發明之葡萄糖脫氫酶更具有酸鹼穩定性，可在4℃、pH3.97~11的環境下維持16小時仍具有80%以上的相對活性，可提高長期儲存時的穩定性。再者，本發明之葡萄糖脫氫酶呈現葡萄糖的基質專一性，對於其他可能添加於食品、靜脈注射液或腹膜透析液中的雙糖類(例如麥芽糖、乳糖或蔗糖)或糖醇類(例如山梨糖醇(Sorbitol)或甘露醇(Mannitol))的反應性低。因此，當使用本發明之葡萄糖脫氫酶檢測血糖含量時，可大幅降低因日常飲食或治療過程中可能攝入的糖類所造成的干擾值或假性高血糖的誤判機率。
編碼此述葡萄糖脫氫酶的核苷酸序列，包括序列識別號1所示之核苷酸序列及與序列識別號1所示之核苷酸序列具有至少95%同質性的核苷酸序列。此述「同質性」(homology)係指在序列識別號1所示之核苷酸序列上因增加、插入、減少或取代1個以上的鹼基(base)所形成的核苷酸序列，但所形成的核苷酸序列編碼的多胜肽具有上述葡萄糖脫氫酶活性。
核苷酸序列的同質性可藉由例如BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)、FASTA(http://www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta/)等公知軟體比對兩種以上的核苷酸序列而得知。本發明之核苷酸序列較佳具有與序列識別號1所示之核苷酸序列至少95%的同質性，更佳為具有96%、97%、98%或99%的同質性者。例如，可有1~50個鹼基經增加、插入、減少或取代，較佳有1~20個鹼基經增加、插入、減少或取代，更佳為1~10個鹼基，但前提為編碼的多胜肽仍維持上述葡萄糖脫氫酶的活性。
此述之序列識別號1所示之核苷酸序列係分離自台東溫泉水中可存活於75℃的嗜熱菌LJ01(Sulfolobus
sp. LJ01)，為野生型的多核苷酸。為了使此核苷酸序列表現而大量生產所編碼的葡萄糖脫氫酶，可透過此技術領域中熟知的基因重組法形成重組載體，於宿主細胞中表現。
此述之基因重組法沒有特別限定，可根據此技術領域習知方法選用適當載體進行。本案一實施例中，使分離自嗜熱菌LJ01的染色體以聚合酶連鎖反應(PCR)擴增後，與pET-30b質體(Novagen)經限制酶切割而使該分離的染色體操作性連接於上述質體的啟動子，形成重組質體pGD75(如第1圖)。此述「操作性連接」(operably linked)，表示一序列連接於可調控其表現之調控序列的狀態，藉由該調控序列使所連接的基因表現或活性化。
進行PCR的引子設計及條件可視欲擴增的核苷酸序列來決定，例如可透過已知的引子設計軟體如Vector軟體(Invitrogen)來設計。表現載體的選擇沒有特別限制，熟知此技術領域之人士可根據欲進行重組的核苷酸序列及宿主細胞予以選擇。在上述實施例中，以大腸桿菌(E
.coli
)作為宿主細胞，以習知的轉形(transformation)方法使上述重組質體進入宿主細胞。蛋白質的表現可根據重組質體與宿主細胞的特性，依此技術領域習知方法進行蛋白質表現的誘導及純化。在上述實施例中，以異丙基-硫代-β-半乳糖苷(isopropyl-thio-β-galactoside；IPTG)誘導宿主細胞表現，產生融合蛋白後，使用金屬螯和層析法(immobilized metal ion affinity chromatography;IMAC)，以含有咪唑的緩衝液洗提(elute)，由於質體pGD75含有一段6個組胺酸(6x His)的片段，其所表現的融合蛋白會專一地與鎳離子結合，因此可分離出本發明所述的葡萄糖脫氫酶。
此述分離的葡萄糖脫氫酶可經由此技術領域習知之電泳法、免疫分析法等分析其體積或性質。可使用的電泳法例如洋菜膠電泳法或聚丙烯醯胺膠體(SDS-PAGE)電泳法等，免疫分析法例如西方點漬法(Western blotting)等。
此述的葡萄糖脫氫酶可透過下列兩種機制進行活性分析：
(1)測量基質葡萄糖、NADP及上述葡萄糖脫氫酶經催化反應後的OD340
吸光度(Danson,M. J.,Archaebacteria: the comparative enzymology of their central metabolic pathways.Adv. Microb. Physiol.
1988;29: 165-231.)；或
(2)測量基質葡萄糖、NADP、PMS(phenazine methosulfate)、NBT(Nitroblue tetrazolium)及上述葡萄糖脫氫酶經催化反應後的OD550
吸光度。
由於此述葡萄糖脫氫酶可催化葡萄糖的轉變及放出電子或使NADP還原而呈色，因此可藉由使此述葡萄糖脫氫酶與血液樣本接觸，透過電化學轉換或顯色程度來檢測血液樣本中的葡萄糖含量。因此，本發明更包含一種測量血糖含量的方法，包括使測試的血液樣本與上述葡萄糖脫氫酶接觸的步驟。此述血液樣本可來自哺乳動物，例如小鼠、大鼠、兔、羊、牛、豬、猴、猿、人等，特別是人類。可採血的部位包括指尖、手掌、手臂、大腿外側等部位，採血量可為約0.3~1.0μL。
本發明更包含一種測量血糖含量的生物感測器，包括一含有上述葡萄糖脫氫酶的測試元件，以及一可分析血糖含量的顯示元件。此述的測試元件可包含一採血用的刺針以及一固定有上述葡萄糖脫氫酶的試片，藉由刺針採集血液樣本而與葡萄糖脫氫酶接觸，催化血液樣本中的葡萄糖轉變。此述的顯示元件可包含一電極、一電流檢測器及一顯示器，使葡萄糖脫氫酶的催化反應所形成的電流轉換為血糖濃度而顯示。為了易於操作，此述的生物感測器可更包含一使用說明，教導使用者使用步驟、採血時間、檢測值的誤差範圍或就醫建議等事項。具體而言，本發明之測量血糖含量的生物感測器包括血糖機。
本發明之具體實施詳細說明如下，然而以下的實施例僅用於進一步揭露本發明之技術內容，不應藉以限制本案的發明範疇。
[實施例1]表現質體的構築及轉殖宿主細胞
篩選嗜熱菌LJ01(
Sulfolobus
sp. LJ01)
採集100 mL台東知本溫泉的水樣本，以LB固態培養基於75℃培養36小時。將培養的菌株移至含有0.1M葡萄糖、0.1mM NAD+
的LB固態培養基繼續培養24小時，隨後以30μM PMS及30μM NBT篩選呈現藍紫色的菌株，移至4ml的LB液態培養基中。此菌液留待後續步驟使用。
分離嗜熱菌LJ01的染色體DNA
取實施例1所得含有嗜熱菌LJ01的菌液1ml，置於微量離心管中，進行離心(13000 rpm、4℃、5分鐘)，移除上清液。重複此步驟數次，直到完全去除培養液。
之後加入400 μL之TE緩衝液(50 mM Tris-base;100 mM EDTA;10%蔗糖)，經過3次的完全冰凍-解凍後離心，再於37℃反應約30~60分鐘。之後，再加入40 μL 1% SDS(sodium dodecyl sulfate)、20 μL蛋白酶(proteinase)，於37℃反應約60分鐘。反應後再加入460μL體積1:1的苯酚-氯仿溶液。離心後取上清液，再加入等體積的99.5%酒精。之後加入1/10體積的3 M醋酸鈉，離心後移除上清液。再加入500 μL的70%酒精清洗，離心移除上清液。容器內殘餘的液體自然風乾後，加入50 μL Elution buffer(50 mM Na2
HPO4
、0.3 M NaCl、250 mM Imidazole(pH 8.0)，去離子水定量至100mL)。之後以電泳確認分離的染色體長度並定序，結果獲得如序列識別號1所示之核苷酸序列。
以
PCR擴增分離的DNA
使用Vector軟體(Invitrogen)設計引子對(序列識別號：2、3)。
將1μL上述分離的DNA、1μL引子對、1μL dNTP、5μL 10X DNA聚合酶反應緩衝液、1μL DNA聚合酶酵素及40μL無菌水，形成總體積50μl的反應溶液。以95℃、5分鐘、1次循環；95℃、0.5分鐘、30次循環；57℃、0.5分鐘、30次循環；72℃、1.5分鐘、30次循環；及72℃、10分鐘、1次循環，進行PCR擴增。所得PCR產物，以電泳分析其DNA大小是否與上述分離的嗜熱菌LJ01的DNA相近。之後以QIAquick PCR純化套組(QIAGEN)純化上述PCR產物，重複以電泳確認擴增後的DNA大小。所得PCR產物留待後續步驟使用。
限制酶切割
根據上述序列識別號1所示之核苷酸序列，於NEB Inc.網站(http://www.neb.com/nebecomm/)查詢最佳酵素緩衝液與添加量。取兩個微量離心管，分別添加1μL的NdeI
(New England Biolabs)、1μL的XhoI
(New England Biolabs)、5μL的緩衝液(New England Biolabs)及13μL的無菌水。之後各管加入30μL的上述PCR產物或pET-30b(+)(Novagen)，於37℃反應約6小時。
反應完成後，各管加入8 μL DNA SYBR Green螢光染劑，並進行1%洋菜膠電泳。於紫外燈照射下，切取相對應的DNA部份，以QIAquick Gel Extration kit(QIAGEN)純化。所得的經限制酶切割的DNA片段與上述經純化的PCR產物同時進行電泳，確認純化的結果。
接合反應(ligation)
分別取上述經限制酶切割的PCR產物7.5μL、上述經限制酶切割的pET-30b 2.5μL，使用市售接合套組(roche rapid DNA dephos & ligation kit)所含的接合酶1μL、及10μL接合緩衝液，添加於微量離心管，於24℃反應15~20分鐘。形成帶有嗜熱菌LJ01染色體DNA的質體pGD75，留待後續步驟使用。
質體的轉殖
選取細胞濃度1×107
cells/ml的宿主細胞E. coli
Eco 10B(Yeastern Biotech)(Geno type: F-
endA1 recA1 galE15 galK16 nupG rpsL ΔlacX74 φ80lacZΔM15 araD139 Δ(ara,leu)7697 mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)λ-
)與E
.coli
. BL21(DE3
)(Geno type: F-
ompT hsdSβ
(rβ
-mβ
-)dcm gal λ-
(DE3
))，分別加入試管中。將該試管放置於冰上，加入0.5~1μL上述所得的質體pGD75混合，置於冰水浴5分鐘。將上述試管移到42℃的恆溫槽內1.5分鐘，再移至冰水浴5分鐘。
之後將此菌液加至0.5mL的LB液態培養基，在37℃、170rpm條件下，培養1小時。將培養後的菌液100μL均勻塗佈於含有30 μg/mL抗生素Ranamycin的LB固態培養基上，37℃恆溫培養12小時。
將轉殖後長出之菌株加以編號，分別以牙籤鉤至另一LB固態培養基，於37℃培養2~4小時，待菌體長出。再以此菌株當模版進行同上述條件的PCR反應。之後進行電泳分析，觀察於紫外燈照射下螢光亮度最高者，根據編號選取該菌株，保存於另一新的固態培養基並另外進行液態培養(添加抗生素Kanamycin 30 μg/mL)約12小時。最後培養完之液態菌種以Mini Plus Plasmid DNA Extraction System(Viogene)抽取質體。經定序(Mission Biotech Inc.,Taiwan)確定完成pGD75的構築。
[實施例2]蛋白質的誘導作用
搖瓶培養
選擇含有上述帶有質體pGD75的宿主細胞E
.coli
. BL21(DE3
)的菌液1mL，加至含有LB液態培養液的錐形瓶中。在170 rpm、37℃條件下，擴增培養至OD600
約1.5，培養基的加入量為錐形瓶體積的約1/5。之後加入0.1mM IPTG，於30℃下誘導6小時。
發酵槽的培養
選擇含有上述帶有質體pGD75的宿主細胞E. coli.
BL21(DE3
)的菌液1mL，加至含有LB液態培養液的錐形瓶中。在170 rpm、37℃條件下，擴增培養至OD600
約1.5，培養基的加入量為錐形瓶體積的約1/5。
另一方面，將3mL抗生素及0.9mL消泡劑加入含有3 L培養基的發酵槽中。
將上述菌液加入該發酵槽中，於37℃、250 rpm、pH7、通氣量1vvm的條件下培養4~6小時。之後再加入誘導劑0.2 mM IPTG，於25℃、225 rpm、pH7、通氣量1vvm之條件下誘導6~8小時。回收發酵槽內的菌液，一次取50 mL菌液離心(13000 rpm、4℃、5分鐘)，移除上清液。重複此步驟，直到完全去除培養液。
[實施例3]蛋白質的IMAC純化
將實施例2所得的pellet，依菌量加入1~10 mL之起始緩衝液(50 mM Na2
HPO4
,0.3 M NaCl,30mM Imidazole,pH=8.0)，與pellet混合均勻。接著使用超音波震盪破菌(10 W，每震10 sec停止30 sec，重複10次)，直至菌液由乳白色轉變成透明為止。之後，將上述菌液分裝於1 mL微量離心管，於4℃離心13000 rpm、10 min。收集各微量離心管的上清液(可溶蛋白)，進行純化。其餘在管中的pellet，為不可溶蛋白，再加入8 M尿素至其完全溶解。
之後將上述可溶蛋白進行金屬螯和層析法(IMAC)純化。首先在層析管柱內加入均勻混合之樹脂5 mL，以去離子水沖洗樹脂內之酒精殘留。接著加入0.1 M NiSO4
‧6H2
O，使樹脂成淡藍綠色，並以去離子水洗掉雜質。加入上述的起始緩衝液，平衡管柱內鎳離子濃度。加入上述可溶蛋白，再以上述起始緩衝液洗掉多餘雜質蛋白。加入Elution Buffer(50 mM Na2
HPO4
,0.3 M NaCl,250 mM Imidazole,pH=8.0)，收集目標酵素。收集的液體先以去離子水沖洗，再以1M EDTA洗去鎳離子。最後以大量DI水沖掉樹脂上的殘餘物，再加入少許去離子水保存。所得的經IMAC純化的蛋白質留待後續步驟使用。
[實施例4]蛋白質電泳分析及酵素免疫分析
將實施例3所得的可溶蛋白(第1欄)、不可溶蛋白(第2欄)及經IMAC純化的蛋白質(第3欄，箭頭處)，以12%SDS-PAGE進行電泳，結果顯示經IMAC純化後的蛋白質的分子量約39kDa(第2a圖)。
另一方面，進行西方點墨法(Western Blotting)。將上述進行電泳後的SDS-PAGE膠，通電24V、0.5~1小時，使SDS-PAGE膠上的蛋白質轉漬至PVDF膜(Hybond-P,Amersham Bioscience,USA)。該PVDF膜於4℃浸泡於blocking buffer(1.4 mM KH2
PO4
,8 mM Na2
HPO4
,140 mM NaCl,2.7 mM KCl,5%脫脂奶粉，pH 7.3)過夜。再以washing buffer(1.4 mM KH2
PO4
,8 mM Na2
HPO4
,140 mM NaCl,2.7 mM KCl,0.05% Tween-20,pH 7.3)沖洗數次。之後，將該PVDF膜浸泡於含有anti-His抗體(Penta-His Antibody；QIAGEN)的blocking buffer一小時，再以washing buffer清洗。接著以含有含有AP標示的小鼠抗兔子血清的抗血清(Goat anti-Mouse IgG,Alkaline Phosphatase conjugate；Millipore Corporation)的blocking buffer一小時，再以washing buffer清洗。之後使用染色緩衝液(0.1 M Tris-HCl,0.1 M NaCl,0.05 M MgCl)浸潤，使PVDF膜平衡於pH 9.5。接著以200 μL NBT/BCIP(Roche Diagnostics GmbH)染色。至呈色完成後，以TE Buffer(50 mM Tris-HCl,10 mM EDTA)終止反應(第2b圖)。
[實施例5]酵素活性分析
取1 mL微量離心管，分別加入970 μL緩衝液、10 μL的30mM葡萄糖、10 μL的30mM NADP，於反應前加入10 μL上述經IMAC純化且透析後的蛋白質。均勻混合後，檢測25℃反應60秒的OD340
值最大斜率(Initial rates)。
[實施例6]酵素穩定性分析
pH值最適化條件分析
與實施例5相同調配反應混合液，但是根據下表的緩衝液組成改變反應混合液的pH值。
結果為，上述經IMAC純化且透析後的蛋白質在pH 7.97的環境呈現最佳活性。
溫度最適化條件分析
根據上述的pH值最適化條件，進一步分析溫度最適化條件。取數個1 mL微量離心管，皆加入10 μL的30mM葡萄糖、10 μL的30mM NADP、及970 μL緩衝液(pH 7.97)，分別置於25℃、35℃、45℃、55℃、65℃、75℃及85℃的不同溫度下，恆溫約10分鐘。最後放入10 μL上述經IMAC純化且透析後的蛋白質，混合均勻後測定OD340
值。
結果如第3圖所示，隨著溫度升高，酵素的活性也隨之升高。這個現象推測是由於此酵素來自於溫泉菌株，所以可耐受的溫度較一般菌株來得高。因此預期此酵素在經過高溫噴霧乾燥後還可能有80%以上的活性。
pH值穩定性分析
首先將100μL上述經IMAC純化且透析後的蛋白質置於不同pH值的緩衝液100μL中，在4℃反應16～24小時。另一方面，取1 mL微量離心管，分別加入10μL的30mM葡萄糖、10μL的30mM NADP及970μL緩衝液(pH 7.97)。之後放入上述經不同pH緩衝液處理的蛋白質溶液10μL，混合均勻後，測定OD340
值。
結果如第4圖所示，上述蛋白質於4℃下、pH=3.97~11的範圍內，其酵素活性可維持80%以上。由此結果可得知，此酵素在pH=3.97~11範圍下的解離速度緩慢，在長時間儲存下仍呈現穩定性。
溫度穩定性分析
首先將50μL上述經IMAC純化且透析後的蛋白質置於pH 7.97之緩衝液50 μL中，於不同溫度下反應15分鐘。之後，取1 mL微量離心管，分別加入10μL的30mM葡萄糖、10μL的30mM NADP及970μL緩衝液(pH 7.97)，之後放入上述經不同溫度處理的蛋白質溶液10 μL，混合均勻後，測定OD340
值。
結果如第5圖所示，在溫度超過37℃後，上述蛋白質的酵素活性有略微爬升的趨勢，並且於溫度75℃下有最佳的反應速率。然而當溫度超過75℃後，酵素活性呈現快速下降的現象。於78℃環境下酵素活性快速下降至約65%的相對活性，於80℃的環境只有40%的相對活性。反觀大多數的酵素容易於高溫破壞活性、在低溫環境下活性降低，此述蛋白質於高溫環境下較一般酵素穩定，在溫度穩定度上表現優異。由於在血糖機試片的製作過程中，酵素需暴露在一定的溫度下約15分鐘，以進行酵素烘乾作業。因此，相較於習知的葡萄糖脫氫酶，此述蛋白質在血糖機試片的製作過程(例如烘乾)具有較佳的穩定性。而且，比較第4、5圖可知，與不同pH值的環境相比，酵素失活速率受到溫度的影響較大。
基質濃度活性分析
在1 mL微量離心管中，加入10μL的30mM NADP於pH 7.97之緩衝液970μL中。接著加入1M至接近0M的不同濃度的葡萄糖，最後放入10μL上述蛋白質，混合均勻後測定在60秒間OD340
值的最大斜率，為反應初速(initial velocity)。
根據Michaelis-Menten(M-M)酵素動力學公式，將上述基質濃度與測定的反應初速繪製如第6圖所示，並計算出最大反應速度(Vmax)為0.845023，基質與酵素的親和力係數(Km)為0.013774。
基質分析
為了證明上述經IMAC純化的蛋白質對於葡萄糖具有高度專一性，進行基質的分析。在數個1 mL微量離心管中，加入10μL上述蛋白質、10μL的30mM NADP及pH 7.97之緩衝液970μL。之後各管分別加入30 mM D-(+)-葡萄糖、30 mM D-(+)-麥芽糖、30mM D-山梨糖醇(Sorbitol)、30mM蔗糖、30mM D-(+)-乳糖、30mM甘露醇(Mannitol)各10μL，混合均勻後測定OD340
值。結果如第7圖所示，顯見上述蛋白質對於葡萄糖具有高度專一性。
雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟悉此項技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
<110> 簡良榮
<120> 葡萄糖脫氫酶及使用其測量血糖的方法
<160> 3
<210> 1
<211> 1128
<212> DNA
<213> Sulfolobus sp
.LJ01
<220>
<223>
<400> 1
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的引子
<400> 2
<210> 3
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的引子
<400> 3
第1圖為建構質體pGD-75的流程圖，其中「PT7lac
」表示T7啟動子，「MCS」表示多重選殖位，「TT」表示T7終止子基因，「Ori」表示複製起始點，「KanR
」表示抗生素基因，「lac
I」表示lac
I基因，及「GDH」表示編碼葡萄糖脫氫酶的基因；
第2a圖顯示經IMAC純化前後的蛋白質的SDS-PAGE電泳結果，第M欄表示Marker，第1欄表示未IMAC純化的可溶蛋白，第2欄表示不可溶蛋白，第3欄表示經IMAC純化的蛋白質，箭頭標示目標蛋白質葡萄糖脫氫酶；
第2b圖顯示經IMAC純化前後的蛋白質的免疫分析結果，各欄分析的物質與第2a圖相同；
第3圖顯示本案葡萄糖脫氫酶在pH7.97的不同溫度條件下的酵素活性變化；
第4圖顯示本案葡萄糖脫氫酶在不同pH環境下的酵素活性變化；
第5圖顯示本案葡萄糖脫氫酶在不同溫度保存後，酵素活性的變化；以及
第6圖顯示本案葡萄糖脫氫酶對基質葡萄糖濃度的活性變化；
第7圖顯示本案葡萄糖脫氫酶對不同基質的酵素活性變化。
Claims (15)
- 一種分離的核苷酸，其係由序列識別號1所示之核苷酸序列所組成，其中該核苷酸編碼的多胜肽具有葡萄糖脫氫酶的活性。
- 如申請專利範圍第1項所述之核苷酸，其中該多胜肽在70~80℃維持15分鐘的條件下具有40%以上的葡萄糖脫氫酶活性。
- 如申請專利範圍第1項所述之核苷酸，其中該多胜肽在4℃、pH3.97~11的環境下維持16小時後，具有80%以上的葡萄糖脫氫酶活性。
- 如申請專利範圍第1項所述之核苷酸，其中該多胜肽的葡萄糖脫氫酶活性具有基質專一性。
- 如申請專利範圍第4項所述之核苷酸，其中該基質為葡萄糖。
- 如申請專利範圍第1項所述之核苷酸，其係衍生自嗜熱菌LJ01(Sulfolobus sp.LJ01)。
- 一種重組的表現載體，包括申請專利範圍第1-6項任一項所述之核苷酸操作性連接於啟動子。
- 一種宿主細胞，包括申請專利範圍第1-6項任一項所述之核苷酸或申請專利範圍第7項所述之重組的表現載體。
- 如申請專利範圍第8項所述之宿主細胞，其為大腸桿菌(E.coli )。
- 一種分離的多胜肽，其係由序列識別號1所示之核苷酸序列所編碼，具有葡萄糖脫氫酶的活性。
- 一種分離的多胜肽，其係由申請專利範圍第7項所述之重組的表現載體或申請專利範圍第8-9項所述之宿主細胞表現所產生。
- 一種測量血糖含量的方法，包括使測試的血液樣本與申請專利範圍第1-6項任一項所述之核苷酸編碼的多胜肽或申請專利範圍第10或11項所述之多胜肽接觸的步驟。
- 如申請專利範圍第12項所述之測量血糖含量的方法，其中該血液樣本來自人類。
- 一種測量血糖含量的生物感測器，包括一測試元件，含有申請專利範圍第1-6項任一項所述之核苷酸編碼的多胜肽或申請專利範圍第10或11項所述之多胜肽；以及一分析血糖含量的顯示元件。
- 如申請專利範圍第14項所述之測量血糖含量的生物感測器，其為血糖機。
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| US20110111471A1 (en) * | 2004-05-13 | 2011-05-12 | Kim Seonghun | Noven thermostable gluconate dehydratase and use thereof |
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