[go: up one dir, main page]

TWI405851B - 間質肺病毒株及其作為疫苗調配物及作為表現抗原性序列之載體之應用 - Google Patents

間質肺病毒株及其作為疫苗調配物及作為表現抗原性序列之載體之應用 Download PDF

Info

Publication number
TWI405851B
TWI405851B TW098112076A TW98112076A TWI405851B TW I405851 B TWI405851 B TW I405851B TW 098112076 A TW098112076 A TW 098112076A TW 98112076 A TW98112076 A TW 98112076A TW I405851 B TWI405851 B TW I405851B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
protein
mammalian mpv
amino acid
sequence
acid sequence
Prior art date
Application number
TW098112076A
Other languages
English (en)
Other versions
TW200930816A (en
Inventor
Aurelia Haller
Roderick Tang
Ronaldus Adrianus Maria Fouchier
Bernadetta Gerarda Van Den Hoogen
Albertus Dominicus Marcellinus Erasmus Osterhaus
Original Assignee
Medimmune Llc
Vironovative Bv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27766025&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=TWI405851(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Medimmune Llc, Vironovative Bv filed Critical Medimmune Llc
Publication of TW200930816A publication Critical patent/TW200930816A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI405851B publication Critical patent/TWI405851B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1027—Paramyxoviridae, e.g. respiratory syncytial virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2123/00—Preparations for testing in vivo
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/22011—Polyomaviridae, e.g. polyoma, SV40, JC
    • C12N2710/22034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18311—Metapneumovirus, e.g. avian pneumovirus
    • C12N2760/18321—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18311—Metapneumovirus, e.g. avian pneumovirus
    • C12N2760/18322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18311—Metapneumovirus, e.g. avian pneumovirus
    • C12N2760/18334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18311—Metapneumovirus, e.g. avian pneumovirus
    • C12N2760/18341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/18343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18522—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18611—Respirovirus, e.g. Bovine, human parainfluenza 1,3
    • C12N2760/18621—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18611—Respirovirus, e.g. Bovine, human parainfluenza 1,3
    • C12N2760/18622—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18611—Respirovirus, e.g. Bovine, human parainfluenza 1,3
    • C12N2760/18634—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18611—Respirovirus, e.g. Bovine, human parainfluenza 1,3
    • C12N2760/18641—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/18643—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)

Description

間質肺病毒株及其作為疫苗調配物及作為表現抗原性序列之載體之應用
本發明係關於經過分離的哺乳動物負股RNA病毒，在副黏液病毒科之肺病毒亞科中的間質肺病毒(MPV)。本發明亦關於經過分離的哺乳動物負股RNA病毒，並可在系統發生上，確認與間質肺病毒屬及其組份相符或有關。本發明係關於哺乳動物間質肺病毒之不同分離株的基因組核苷酸序列，特別是人類間質肺病毒。本發明係關於將哺乳動物間質肺病毒之不同分離株的序列資訊，用在診斷和治療的方法上。本發明亦關於編碼間質肺病毒或其一部分之基因組的核苷酸序列，包括哺乳動物和禽間質肺病毒兩者。
本發明進一步包括由該核苷酸序列編碼之嵌合型或重組的病毒。本發明亦關於的嵌合型或重組的哺乳動物MPV，其包括一或多個非-天然或異源的序列。本發明更關於包括哺乳動物或禽間質肺病毒的疫苗調配物，包括該病毒之重組和嵌合型形式。本發明之疫苗製品包括多價的疫苗，包括二價和三價的疫苗製品。
在傳統上，副黏液病毒係擔任疾病之破壞者，成為全世界每年許多動物和人類死亡的原因。副黏液病毒科形成單負股病毒目(Mononegavirales)(反義單股RNA病毒)中的一科，由副黏液病毒亞科和肺病毒亞科所組成。後者目前在分類學上，被分成肺病毒屬和間質肺病毒屬(Pringle,1999,Arch. Virol. 144/2,2065-2070)。人類呼吸道融合細胞病毒(hRSV)，肺病毒屬的物種，在全世界嬰幼兒和較小的兒童期，是唯一最重要的下呼吸道感染的原因(Domachowske,& Rosenberg,1999,Clin. Microbio. Rev. 12(2):298-309)。肺病毒屬的其他成員，包括牛和羊呼吸道融合細胞病毒，以及老鼠的肺炎病毒(PVM)。
在過去10年中，已經確認數個哺乳動物疾病的致病原，特別是呼吸道疾病，尤其是人類的(Evans,In:Viral Infections of Humans,Epidemiology and Control.第3版(編輯Evans,A.S)22-28(Plenum Publishing Corporation,New York,1989))。在哺乳動物中，RTI的古典致病原是呼吸道融合細胞病毒，屬於肺病毒屬，在人類(hRSV)和諸如牛或綿羊之類的反芻動物(bRSV及/或oRSV)中發現。在人類RSV中，使用在倒數交叉中和測定中的差異，在免疫學測定中G蛋白質的反應性，以及G基因之核苷酸序列，來定義兩種hRSV抗原亞群。在亞群中，胺基酸序列顯示出94%(A亞群)或98%(B亞群)同一性，然而在亞群之間僅發現53%胺基酸序列同一性。在亞群內，以單株抗體、RT-PCR測定和RNA酶保護測定為基礎，觀察到額外的變異性。得自兩種亞群之病毒具有世界性的分布，並可在一個季節出現。可在預先-存在之免疫力的存在下發生感染，且不認為抗原變化是再度-感染所嚴格需要的。參見，例如Sullender,2000,Clinical Microbiology Reviews 13(1):1-15;Collins等人Fields Virology，編輯B.N. Knipe,Howley,P.M. 1996,Philadelphia:Lippencott-Raven. 1313-1351;Johnson等人，1987(Proc Natl Acad Sci USA,84(16):5625-9;Collins,在The Paramyxoviruses,D.W. Kingsbury編輯者1991,Plenum Press:New York.第103-153頁中。
其他古典的肺病毒是老鼠肺炎病毒(PVM)，通常僅在實驗老鼠中發現。然而，一部分在哺乳動物中觀察到的疾病，仍不能歸因於已知的病原。
2.1.禽間質肺病毒3
在1970年代末期，首先在南美描述了由禽肺病毒(APV)引起的呼吸道疾病(Buys等人，1980,Turkey 28:36-46)，在那裏它成為毀滅火雞工廠的原因。該疾病在火雞中的特徵為竇炎和鼻炎，並被稱為火雞鼻氣管炎(TRT)。亦已經強烈地暗示，APV的歐洲分離株為雞的頭腫徵候群(SHS)的原因(O'Brien,1985,Vet. Rec. 117:619-620)。最初，該疾病出現在已感染新城雞瘟病毒(NDV)的肉雞群中，並以為是與新城雞瘟(ND)有關的二級問題。在SHS發生後，在被感染的雞中檢測到對抗歐洲APV的抗體(Cook等人，1988,Avian Pathol. 17:403-410)，因此暗示APV為致病原。
禽肺病毒(APV)亦已知為火雞鼻氣管炎病毒(TRTV)，為禽鼻氣管炎、火雞之上呼吸道感染的致病原(Giraud等人，1986,Vet. Res. 119:606-607)，是最近指派為間質肺病毒屬的唯一成員，直到現在為止，說它與感染無關，或更進一步，與哺乳動物的疾病無關。可以G糖蛋白之核苷酸或胺基酸序列，以及使用亦認得G糖蛋白之單株抗體的中和測試為基礎，來辨別APV的血清學亞群。然而，可使用在核苷酸和胺基酸序列上的其他差異，來區別APV的血清學亞群。在A、B和D亞群中，G蛋白質在亞群中顯示出98.5%至99.7%aa序列同一性但在亞群之間僅觀察到31.2-38%aa同一性。參見，例如Collins等人，1993,Avian Pathology,22:第469-479頁；Cook等人，1993,Avian Pathology,22:257-273;Bayon-Auboyer等人，J Gen Virol,81(Pt 11):2723-33;Seal,1998,Virus Res,58(1-2):45-52;Bayon-Auboyer等人，1999,Arch Virol,144(6):91-109;Juhasz等人，1994,J Gen Virol,75(Pt 11):2873-80。
在WO 00/20600中提供了更多的APV血清型，以引用的方式併入本文中，其描述了APV的科羅拉多(Colorado)分離株，並利用在活體外的血清中和測定，將其與已知的APV或TRT品系相比較。首先，針對認得TRT分離株的單專一性多株抗血清，測試科羅拉多分離株。科羅拉多分離株不會被對任何TRT品系的單專一性抗血清中和。然而，它卻被對A亞群品系而升高的過度免疫抗血清中和。該抗血清中和同系的病毒，至1:400之力價，而科羅拉多分離株則至1:80之力價。使用以上的方法，然後針對TRT單株抗體測試科羅拉多分離株。在每個案例中，倒數中和力價均<10。亦對兩個亞群的TRT品系，測試對科羅拉多分離株升高的單專一性抗血清。沒有任何受試的TRT品系被對抗科羅拉多分離株的抗血清中和。
APV之科羅拉多品系不能保護SPF雞對抗A亞群或B亞群品系之TRT病毒的攻毒。這些結果暗示科羅拉多分離株可能是禽肺病毒之更多血清型的第一個實例(參見Bayon-Auboyer等人，2000,J. Gen. Vir. 81:2723-2733)。
禽肺病毒是單股、非-片斷的RNA病毒，屬於副黏液病毒科的肺病毒亞科，間質肺病毒屬(Cavanagh和Barrett,1988,Virus Res. 11:241-256;Ling等人，1992,J. Gen. Virol. 73:1709-1715;Yu等人，1992,J. Gen. Virol. 73:1355-1363)。將副黏液病毒科分成兩個亞-科：副黏液病毒亞科和肺病毒亞科。副黏液病毒亞科包括，但不限於：副黏液病毒屬、路伯拉病毒(Rubulavirus)屬和摩比利病毒(Morbillivirus)屬。最近，以基因順序和序列同種性為基礎，將肺病毒亞科分成兩屬，即肺病毒和間質肺病毒(Naylor等人，1998,J. Gen. Virol.,79:1393-1398;Pringle,1998,Arch. Virol. 143:1449-1159)。肺病毒屬包括，但不限於人類呼吸道融合細胞病毒(hRSV)、牛呼吸道融合細胞病毒(bRSV)、羊呼吸道融合細胞病毒和老鼠肺病毒。間質肺病毒包括，但不限於歐洲禽肺病毒(A和B亞群)，其與肺病毒屬的典型物種hRSV有別(Naylor等人，1998,J. Gen. Virol.,79:1393-1398;Pringle,1998,Arch. Virol. 143:1449-1159)。APV的美國分離株代表在間質肺病毒屬中的第三個亞群(C亞群)，因為已經發現它在抗原性上和遺傳上，與歐洲分離株不同(Seal,1998,Virus Res. 58:45-52;Senne等人，1998,在Proc.第47次WPDC,California,第67-68頁中)。
負染色APV的電子顯微鏡檢查，顯示多晶的，有時球狀的病毒粒子，直徑範圍從80至200毫微米，具有長度範圍從1000至2000毫微米的長絲(Collins和Gough,1998,J. Gen. Virol. 69:909-916)。被膜則由鑲有長度從13至15毫微米之釘子的膜構成。殼包核酸是螺旋狀的，直徑為14毫微米，高度為7毫微米。殼包核酸的直徑比副黏液病毒和摩比利病毒的更小，後者的直徑通常約為18毫微米。
禽肺病毒感染，在美國是正在發生的疾病，不管在家禽中，它的全世界發生已持續數年。在1996年5月，在科羅拉多州出現火雞的高度傳染性呼吸道疾病，接著在Ames,Iowa的國家獸醫服務實驗室(National Veterinary Services Laboratory(NVSL))中分離出APV(Senne等人，1997,Proc.第134次Ann. Mtg.,AVMA,第190頁)。在此之前，已經認為美國和加拿大是沒有禽肺病毒的(Pearson等人，1993,在Newly Emerging and Re-emerging Avian Diseases:Applied Research and Practical Applications for Diagnosis and Control，第78-83頁中；Hecker和Myers,1993,Vet. Rec. 132:172)。在1997年早期，在明尼蘇達州，以血清學之方式在火雞中檢測到APV。在那時，進行第一次證明診斷，而APV感染亦已經散播至許多農場。該疾病與上呼吸道疾病之臨床症狀有關，包括：多泡沫的眼睛，鼻分泌物和竇腫脹。藉由二次感染使其惡化。在被感染鳥類中的發病率可高達100%。死亡率範圍則可從1至90%，而最高的是在6至12週齡的禽類。
禽肺病毒是藉著接觸傳播。鼻分泌物、被感染鳥類的移動、被污染的水、被污染的環境、被污染的飼料卡車和裝入-倒出的活動，都有助於病毒的散播。認為恢復的火雞是帶原者。因為顯示病毒感染產卵火雞的輸卵管上皮，並因為已經在小鳥中檢測到APV，亦認為可經卵傳播。
2.2.PIV感染
副流感病毒的感染，在嬰幼兒和兒童導致嚴重的呼吸道疾病(Tao等人，1999,Vaccine 17:1100-08)。傳染性副流感病毒的感染，佔全世界所有因為呼吸道感染而住院之小兒科患者的大約20%。同上。
PIV是副黏液病毒科之呼吸道病毒(respirovirus)(PIV1、PIV3)或路伯拉病毒(PIV2、PIV4)屬的成員。PIV由兩個結構功能域(module)構成：(1)內部的核糖核蛋白核心或殼包核酸，含有病毒的基因組，和(2)外部粗略為球狀的脂蛋白被膜。其基因組由單股的反義RNA所組成，長度約為15,456個核苷酸，編碼至少8個多肽。這些蛋白質包括，但不限於殼包核酸的結構蛋白質(視屬而為NP、NC或N)、磷蛋白(P)、基質蛋白質(M)、融合糖蛋白(F)、血球凝集素-神經胺糖酸苷酶糖蛋白(HN)、大聚合酶蛋白質(L)，以及未知功能的C和D蛋白質。同上。
副流感殼包核酸蛋白質(NP、NC或N)，在每個蛋白質單元內，由兩個功能部位組成，包括胺基-終端之功能部位，其包括大約分子的三分之二，並直接與RNA產生交互作用，以及羧基-終端功能部位，其位在裝配好之殼包核酸的表面上。認為在這兩個功能部位的接合處存有絞鏈，藉此給與該蛋白質一些彈性(參見Fields等人(編輯)，1991,FUNDAMENTAL VIROLOGY，第2版，Raven Press,New York，將其全文以引用的方式併入本文中)。基質蛋白質(M)顯然涉及病毒的裝配，且其與病毒膜和殼包核酸蛋白質兩者產生交互作用。磷蛋白(P)經歷磷酸化作用，認為其在轉錄作用中扮演調節的角色，亦可能甲基化作用、磷酸化作用和聚腺苷酸化作用。融合糖蛋白(F)與病毒膜產生交互作用，並首先以無活性前驅物之形式產生，然後在轉譯之後被切開，產生兩個二硫連接的多肽。有活性的F蛋白質亦涉及藉著促使病毒被膜與宿主細胞漿膜融合，而使副流感病毒粒子貫穿進入宿主細胞內的作用。同上。糖蛋白，血球凝集素-神經胺糖酸苷酶(HN)從被膜中伸出，並容許病毒含有血球凝集素和神經胺糖酸苷酶活性兩者。HN在其胺基終端是強忌水性的，其功能為將HN蛋白質固定在脂雙層內。同上。最後，大聚合酶蛋白質(L)在轉錄和複製作用兩者中，扮演重要的角色。同上。
2.3.RSV感染
呼吸道融合細胞病毒(RSV)，在嬰幼兒和兒童中，是嚴重下呼吸道疾病的主因(Feigen等人，編輯，1987，在：Textbook of Pediatric Infectious Diseases,WB Saunders,Philadelphia第1653-1675頁中；New Vaccine Development,Establishing Priorities，第1冊，1985,National Academy Press,Washington DC在第397-409頁中；以及Ruuskanen等人，1993,Curr. Probl. Pediatr. 23:50-79)。每年RSV感染的流行性質顯然是世界性的，但RSV疾病在特定季節的發生率和嚴重性，隨著區域而有所改變(Hall,1993,Contemp. Pediatr. 10:92-110)。在北半球的溫帶地區，它通常開始於晚秋，並結束於晚春。主要的RSV感染最常發生在6週至2歲大的兒童，較不常出現在生命的前4週，在病院流行期間(Hall等人，1979,New Engl. J. Med. 300:393-396)。有增加感染RSV之危險的兒童，包括但不限於足月前(preterm)嬰兒(Hall等人，1979,New Engl. J. Med. 300:393-396)，以及患有支氣管肺臟發育不良(Groothuis等人，1988,Pediatrics 82:199-203)、先天性心臟病(MacDonald等人，New Engl. J. Med. 307:397-400)、先天或後天免疫缺陷(Ogra等人，1988,Pediatr. Infect. Dis. J. 7:246-249；和Pohl等人，1992,J. Infect. Dis. 165:166-169)，和胰囊性纖維變性(Abman等人，1988,J. Pediatr. 113:826-830)的兒童。在患有心臟和肺臟疾病並因為RSV感染而住院的嬰幼兒中，死亡率為3%-4%(Navas等人，1992,J. Pediatr. 121:348-354)。
RSV感染成人和嬰幼兒與兒童。在健康的成人中，RSV主要引起上呼吸道疾病。最近，顯然有些成人，尤其是老年人，罹患有症狀之RSV感染比先前報告的更頻繁(Evans,A.S.編輯，1989,Viral Infections of Humans. Epidemiology and Control,第3版,Plenum Medical Book,New York在第525-544頁)。亦已經在療養院患者和住院的青少人中，報告了數個流行病(Falsey,A.R.,1991,Infect. Control Hosp. Epidemiol. 12:602-608；和Garvie等人，1980,Br. Med. J. 281:1253-1254)。最後，RSV可能在免疫抑制的人中，引起嚴重的疾病，特別是骨髓移植的患者(Hertz等人，1989,Medicine 68:269-281)。
已確立之RSV疾病的治療選擇是有限的。下呼吸道的嚴重RSV疾病，經常需要相當大的支持照顧，包括投予濕潤的氧氣和呼吸協助(Fields等人，編輯，1990,Fields Virology，第2版，第1冊,Raven Press,New York第1045-1072頁)。
雖然疫苗可能預防RSV感染，及/或與RSV有關的疾病，但對於該適應症，尚未有獲得許可的疫苗。疫苗發展的主要障礙是安全性。以福馬林-失活的疫苗，雖具有免疫原性，但在經過免疫的嬰幼兒中，意外地引起比在以類似方式製備之三價副流感疫苗免疫的嬰幼兒中，更高和更嚴重的由於RSV引起之下呼吸道疾病的發生率(Kim等人，1969,Am. J. Epidemiol. 89:422-434；以及Kapikian等人，1969,Am. J. Epidemiol. 89:405-421)。已經放棄數個候選的RSV疫苗，而其他的正在發展中(Murphy等人，1994,Virus Res. 32:13-36)，但即使解決了安全性的問題，亦必須改善疫苗效力。許多問題尚待解決。在新生兒時期，立刻需要免疫接種，因為下呼吸道疾病的高峰發生率，出現在2-5個月大時。可預期新生兒不成熟的免疫反應，連同高力價的獲自母體之RSV抗體，將在新生兒時期降低疫苗的免疫原性(Murphy等人，1988,J. Virol. 62:3907-3910；和Murphy等人，1991,Vaccine 9:185-189)。最後，初次的RSV感染和疾病，不能完全保護對抗後續的RSV疾病(Henderson等人，1979,New Engl. J. Med. 300:530-534)。
目前，唯一批准的預防RSV疾病之方法，是被動免疫。最初的證據暗示IgG的保護角色，獲自在雪貂(Prince,G.A.,Ph.D. diss.,University of California,Los Angeles,1975)和人類中(Lambrecht等人，1976,J. Infect. Dis. 134:211-217;和Glezen等人，1981,J. Pediatr. 98:708-715)，涉及母體抗體的觀察。Hemming等人(Morell等人，編輯，1986,Clinical Use of Intravenous Immunoglobulins,Academic Press,London在第285-294頁)，在涉及在懷疑患有新生兒敗血症之新生兒中，靜脈內免疫球蛋白(IVIG)之藥物動力學的研究期間，承認RSV抗體在治療或預防RSV感染上可能的利用性。在該研究中，注意到一個嬰兒，它的呼吸分泌物產生RSV，在IVIG輸液後迅速恢復。後續大批的IVIG分析，顯示不尋常高力價的RSV中和抗體。然後，同一組研究員檢查高度免疫血清或免疫球蛋白，增強RSV中和抗體、保護棉鼠和靈長類對抗RSV感染的能力(Prince等人，1985,Virus Res. 3:193-206;Prince等人，1990,J. Virol. 64:3091-3092;Hemming等人，1985,J. Infect. Dis. 152:1083-1087;Prince 等人，1983,Infect. Immun. 42:81-87;和Prince等人，1985,J. Virol. 55:517-520)。這些研究的結果表示，除了治療或預防與RSV有關的病症之外，亦可使用IVIG預防RSV感染。
目前的臨床研究已經證實，該被動投予之RSV高度免疫球蛋白(RSV IVIG)，保護在危險下之兒童，免於由RSV引起之嚴重下呼吸道感染的能力(Groothius等人，1993,New Engl. J. Med. 329:1524-1530；和The PREVENT Study Group,1997,Pediatrics 99:93-99)。這是在預防RSV感染上的主要進步，該處理在其廣泛的用途中，提出某些限制。第一，RSV IVIG必須在數小時內以靜脈內輸液，達到有效的劑量。其次，在高度免疫球蛋白中活性物質的濃度，不足以治療在危險下的成人，或大多數患有心肺功能不全的兒童。第三，靜脈內輸液必須在RSV季節每個月到醫院就診。最後，可能證明不易選擇充分的捐贈者產生RSV的高度免疫球蛋白，而遭遇該產物的需求。目前，僅有大約8%的正常捐贈者具有高得足以有資格產製高度免疫球蛋白的RSV中和抗體力價。
一種改善免疫球蛋白之比活性的方法，將發展出一或多個高潛力的RSV中和單株抗體(MAbs)。這類MAbs應該是人類或人類化的，以便保留有利的藥物動力學，並避免產生人類抗-老鼠的抗體反應，因為在整個RSV季節中將需要重覆給藥。已經顯示在RSV之表面上兩個糖蛋白F和G，是中和抗體的標靶(Fields等人，1990，在前；以及Murphy等人，1994，在前)。
批准針對在RSV之F蛋白質的A抗原位置中之抗原決定位的人類化抗體，在整個RSV季節中(在北半球是從11月至4月)，以15毫克/公斤體重的建議每月劑量，肌肉內投予小兒科患者，用來預防RSV引起的嚴重呼吸道疾病。人類(95%)和老鼠(5%)抗體序列的混合物。參Johnson等人，1997,J. Infect. Diseases 176:1215-1224和美國專利第5,824,307號，將其完整內容以引用的方式併入本文中。人類重鏈序列係衍生自人類IgG的恆定功能部位，以及Cor(Press等人，1970,Biochem. J. 117:641-660)和Cess(Takashi等人，1984,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:194-198)的VH基因之可變架構區。人類輕鏈序列係衍生自Ce 之恆定功能部位，以及帶有Je -4之VL基因K104的可變架構區(Bentley等人，1980,Nature 288:5194-5198)。老鼠序列係衍生自老鼠單株抗體，Mab1129(Beeler等人，1989,J. Virology 63:2941-2950)，以涉及將老鼠互補性決定區移植人類抗體架構內的方法。
大部分的人類呼吸道疾病是由病毒亞科副黏液病毒亞科和肺病毒亞科引起的。在本文中第一次描述感染人類的其他哺乳動物肺病毒亞科的身份。
不應將在本文中引述或討論的參考文獻解釋為承認這類參考文獻為本發明之先前技藝。
本發明係關於經過分離的哺乳動物負股RNA病毒，在副黏液病毒科之肺病毒亞科中的肺間質肺病毒(MPV)。本發明亦關於經過分離的哺乳動物負股RNA病毒，並可在系統發生上，確認與間質肺病毒屬及其組份相符或有關。特定而言，本發明係關於哺乳動物MPV，在系統發生上，其與以I-2614之名存放在CNCM,Paris之病毒分離株的關係，比其與C型APV的關係更密切。在更特定的具體實施例中，哺乳動物MPV可以是哺乳動物MPV的變種A1、A2、B1或B2。然而，本發明之哺乳動物MPV可包括尚待確認的額外變種，且不限於變種A1、A2或B1或B2。
本發明係關於哺乳動物間質肺病毒之不同分離株的基因組核苷酸序列，特別是人類間質肺病毒。本發明係關於將哺乳動物間質肺病毒之不同分離株的序列資訊，用在診斷和治療的方法上。本發明係關於在不同間質肺病毒-分離株中的基因組核苷酸序列之差異，以及其在本發明之診斷和治療方法上的用途。在特定的具體實施例中，可使用編碼N、M、F、L、P、M2-1、M2-2、SH或GORFs的哺乳動物MPV之核苷酸序列，來確認本發明之病毒。在另一個特定的具體實施例中，可使用編碼N、M、F、L、P、M2-1、M2-2、SH或G ORFs的哺乳動物MPV之核苷酸序列，將哺乳動物MPV歸類為變種A1、A2、B1或B2，在特定的具體實施例中，本發明係關於為了診斷目的，在不同的間質肺病毒分離株中，使用單一核苷酸多形性(SNPs)。
本發明係關於衍生自哺乳動物MPV或禽肺病毒(APV)的重組或嵌合型病毒。根據本發明，重組的病毒是衍生自哺乳動物MPV或APV的病毒，其由內源或天然基因組序列，或非-天然之基因組序列編碼。根據本發明，非-天然序列是因為一或多個突變，包括但不限於點突變、重排、插入、刪除等等，而與天然或內源的基因組序列不同的序列，對基因組序列而言，可能或可能沒有導致表現型上的改變。根據本發明，本發明之嵌合型病毒是重組的MPV或APV，其更包括異源的核苷酸序列。根據本發明，該嵌合型病毒可由其中已經將異源核苷酸序列加至基因組內的核苷酸序列，或其中已經利用異源核苷酸序列置換內源或天然核苷酸序列的核苷酸序列編碼。在某些具體實施例中，本發明之嵌合型病毒係衍生自MPV或APV，其中藉著得自間質肺病毒之其他品系的同種ORF，置換一或多個ORFs。在代表性的具體實施例中，藉著APV之F基因的ORF置換哺乳動物MPV之F基因的ORF。在某些其他的具體實施例中，本發明之嵌合型病毒係衍生自APV，其中藉著哺乳動物MPV的同種ORF置換一或多個ORFs。
本發明係關於編碼間質肺病毒(包括哺乳動物和禽品系)之基因組的核苷酸序列，或其一部分。本發明係關於編碼間質肺病毒之基因產物的核苷酸序列。特定而言，本發明係關於，但不限於編碼MPV之F蛋白質、G蛋白質、M蛋白質、SH蛋白質、N蛋白質、P蛋白質、M2蛋白質或L蛋白質的核苷酸序列。本發明特別關於編碼哺乳動物MPV之變種的F蛋白質、G蛋白質、M蛋白質、SH蛋白質、N蛋白質、P蛋白質、M2蛋白質或L蛋白質的核苷酸序列，像是但不限於MPV的變種A1、A2、B1或B2。本發明進一步更關於編碼間質肺病毒之基因組或其一部分的cDNA或RNA，包括哺乳動物和禽間質肺病毒，除了對該病毒基因組而言為異源或非-天然的核苷酸序列之外。本發明更包括由該cDNA或RNA編碼之嵌合型或重組的病毒。
本發明進一步更關於哺乳動物MPV和哺乳動物MPV之不同變種的F蛋白質、G蛋白質、M蛋白質、SH蛋白質、N蛋白質、P蛋白質、M2蛋白質或L蛋白質之多肽和胺基酸序列。本發明進一步更關於對抗哺乳動物MPV和哺乳動物MPV之不同變種的F蛋白質、G蛋白質、M蛋白質、SH蛋白質、N蛋白質、P蛋白質、M2蛋白質或L蛋白質的抗體。該抗體可用於診斷和治療方法。在某些較特定的具體實施例中，該抗體對哺乳動物MPV是專一的。在某些具體實施例中，該抗體對哺乳動物MPV之變種是專一的。本發明進一步更關於包括一或多個下列蛋白質的疫苗調配物和免疫原組合物：哺乳動物MPV之F蛋白質、G蛋白質、M蛋白質、SH蛋白質、N蛋白質、P蛋白質、M2蛋白質，及/或L蛋白質。
本發明進一步更關於包括哺乳動物或禽間質肺病毒的疫苗調配物和免疫原組合物，包括該病毒之重組和嵌合形式。特定而言，本發明包括疫苗製品，其包括MPV及/或APV之重組或嵌合形式。本發明進一步更關於包括嵌合型MPV的疫苗，其中該嵌合型MPV編碼一或多個APV蛋白質，且其中該嵌合型MPV可視需要額外地表現一或多個異源或非-天然的序列。本發明亦關於包括嵌合型APV的疫苗，其中該嵌合型APV編碼一或多個hMPV蛋白質，且其中該嵌合型APV可視需要額外地表現一或多個異源或非-天然的序列。本發明亦關於多價疫苗，包括二價和三價疫苗。特定而言，本發明之多價疫苗包括二或多個由相同或不同肺病毒載體表現的抗原性多肽。多價疫苗之抗原性多肽，包括但不限於MPV、APV、PIV、RSV、流感或其他負股RNA病毒、摩比利病毒的抗原性多肽。
本發明進一步更關於在個體中治療呼吸道感染的方法。在某些具體實施例中，本發明係關於藉著對該個體投予包括哺乳動物MPV的疫苗調配物，在個體中治療呼吸道感染。在特定的具體實施例中，在個體中治療呼吸道感染的方法，包括對該個體投予包括重組或嵌合型哺乳動物MPV或APV的疫苗調配物或免疫原組合物。在更特定的具體實施例中，該重組或嵌合型哺乳動物MPV是經過減毒的。在特定的具體實施例中，本發明係關於在人類患者中治療呼吸道感染，包括對該人類患者投予包括重組或嵌合型APV，或編碼APV之F蛋白質、G蛋白質、M蛋白質、SH蛋白質、N蛋白質、P蛋白質、M2蛋白質或L蛋白質之核苷酸序列的疫苗調配物。
[一旦完成申請專利範圍，可能擴充本章節] 3.1.慣例和縮寫
cDNA　互補DNA
L　大蛋白質
M　基質蛋白質(被膜的線內)
F　融合糖蛋白
HN　血球凝集素-神經胺糖酸苷酶糖蛋白
N、NP或NC　核蛋白(與RNA有關，並為聚合酶活性所必需的)
P　磷蛋白
MOI　傳染的多重性
NA　神經胺糖酸苷酶(被膜糖蛋白)
PIV　副流感病毒
hPIV　人類副流感病毒
hPIV3　人類副流感病毒第3型
APV/hMPV　帶有hMPV序列的重組APV
hMPV/APV　帶有APV序列的重組hMPV
哺乳動物MPV　哺乳動物間質肺病毒
nt　核苷酸
RNP　核糖核蛋白
rRNP　重組的RNP
vRNA　基因組病毒RNA
cRNA　反基因組的病毒RNA
hMPV　人類間質肺病毒
APV　禽肺病毒
MVA　經過修改的疫苗病毒安卡拉(Ankara)
FACS　螢光激活之細胞分類器
CPE　致細胞病變作用
位置1　欲轉錄之病毒基因組的第一個基因位置
位置2　在天然病毒基因組之第一和第二個開放編閱架構之間的位置，或者是欲轉錄之病毒基因組的第二個基因位置。
位置3　在天然病毒基因組之第二和第三個開放編閱架構之間的位置，或者是欲轉錄之病毒基因組的第三個基因位置。
位置4　在天然病毒基因組之第三和第四個開放編閱架構之間的位置，或者是欲轉錄之病毒基因組的第四個基因位置。
位置5　在天然病毒基因組之第四和第五個開放編閱架構之間的位置，或者是欲轉錄之病毒基因組的第五個基因位置。
位置6　在天然病毒基因組之第五和第六個開放編閱架構之間的位置，或者是欲轉錄之病毒基因組的第六個基因位置。
本發明係關於經過分離的哺乳動物負股RNA病毒，在副黏液病毒科之肺病毒亞科中的間資肺病毒(MPV)及其變種。本發明亦關於經過分離的哺乳動物負股RNA病毒，可在系統發生上，確認其與間質肺病毒屬及其組份相符或有關。本發明之哺乳動物MPV，可以是哺乳動物MPV的變種A1、A2、B1或B2。然而，本發明之哺乳動物MPV可包括尚未確認的MPV之額外變種，並不限於變種A1、A2、B1或B2。
本發明係關於哺乳動物間質肺病毒(MPV)之分離株的不同變種的基因組核苷酸序列，特別是人類間質肺病毒，包括變種A1、A2、B1和B2的分離株。本發明係關於將哺乳動物間質肺病毒之不同分離株的序列資訊，用在診斷和治療的方法上。本發明係關於在不同間質肺病毒-分離株中，基因組核苷酸序列的差異，及其在本發明之診斷和治療方法中的用途。特定而言，本發明係關於在診斷和治療方法中，使用在不同間質肺病毒分離株中的單一核苷酸多形現象(SNPs)。本發明亦關於在診斷和治療方法中，單獨或與不同分離株的序列資訊一起，使用哺乳動物間質肺病毒之不同分離株的血清學特徵。
本發明係關於編碼間質肺病毒或其一部分之基因組的核苷酸序列，包括哺乳動物和禽類的間質肺病毒(APV)兩者。本發明係關於編碼間質肺病毒之基因產物的核苷酸序列，包括哺乳動物和禽類的間質肺病毒兩者。本發明進一步更關於核酸，包括DNA與RNA，其編碼間質肺病毒之基因組或其一部分，包括哺乳動物和禽類兩者的，除了對該病毒基因組而言，為異源或非-天然的核苷酸序列。本發明進一步更包括由該核苷酸序列編碼的重組或嵌合型病毒。
根據本發明，重組的病毒是衍生自哺乳動物MPV或APV的病毒，其由內源或天然基因組序列，或非-天然之基因組序列編碼。根據本發明，非-天然序列是因為一或多個突變，包括但不限於點突變、重排、插入、刪除等等，而與天然或內源的基因組序列不同的序列，對基因組序列而言，可能或可能沒有導致表現型上的改變。根據本發明，嵌合型病毒是重組的MPV或APV，其更包括異源的核苷酸序列。根據本發明，該嵌合型病毒可由其中已經將異源核苷酸序列加至基因組內的核苷酸序列，或其中已經利用異源核苷酸序列置換內源或天然核苷酸序列的核苷酸序列編碼。
本發明進一步更關於包括哺乳動物或禽間質肺病毒之疫苗調配物，包括該病毒之重組形式。特定而言，本發明包括疫苗製品，其包括MPV或APV之重組或嵌合形式，其表現抗原糖蛋白，包括MPV或APV之糖蛋白，及/或非-天然的MPV或APV糖蛋白。本發明亦包括疫苗製品，其包括MPV或APV之重組形式，其編碼其他負股RNA病毒的抗原序列，包括PIV或RSV，或間質肺病毒之其他物種或品系的異源糖蛋白。本發明進一步更關於包括嵌合型hMPV的疫苗，其中該嵌合型hMPV編碼一或多個APV蛋白質，且其中該嵌合型hMPV可視需要額外地表現一或多個異源或非-天然的序列。本發明亦關於包括嵌合型APV的疫苗，其中該嵌合型APV編碼一或多個hMPV蛋白質，且其中該嵌合型APV可視需要額外地表現一或多個異源或非-天然的序列。本發明亦關於多價疫苗，包括二價和三價疫苗。特定而言，本發明之二價和三價疫苗，包括二或多個由相同或不同肺病毒載體編碼的抗原多肽，其編碼MPV、APV、PIV、RSV、流感或其他負股RNA病毒，或摩比利病毒的抗原蛋白質。
4.1.哺乳動物間質肺病毒 哺乳動物間質肺病毒的結構特徵
本發明提供哺乳動物MPV。哺乳動物MPV是反義單股的RNA病毒，屬於副黏液病毒科的肺病毒亞科。此外，可在系統發生上，確認哺乳動物MPV與間質肺病毒屬相符，其中該哺乳動物MPV，在系統發生上與以I-2614之名存放在CNCM，Paris之病毒分離株(序列識別19號[00-1的基因組序列])的關係，比其與火雞鼻氣管炎病毒的關係更密切，後者為禽鼻氣管炎的致病原。可藉著例如獲得病毒之核酸序列資訊，並在系統發生分析上進行測試，在系統發生上，確認該病毒與間質肺病毒屬相符。可使用熟諳此藝者已知的任何技術，判定在病毒品系之間的系統發生關係。關於代表性的方法，參見4.7.15節。在以WO 02/057302發表之國際專利申請案PCT/NL02/00040中，揭示了其他技術，全部以引用的方式併入本文中。特定而言，PCT/NL02/00040在第12頁第27行至第19頁第29行中，揭示了適用於系統發生分析的核酸序列。可以序列類似性為基礎，按照在下文中更詳細的說明，進一步確認該病毒為哺乳動物MPV。
除了在本文中揭示之病毒對哺乳動物MPV的系統發生關係和序列類似性之外，亦可使用在本文中揭示的病毒之基因組組織化對哺乳動物MPV之基因組組織化的類似性，來確認該病毒為哺乳動物MPV。關於代表性的哺乳動物MPV之基因組組織化，參見圖27。在某些具體實施例中，哺乳動物MPV之基因組組織化，與在副黏液病毒科之肺病毒亞料中之肺病毒的基因組組織化有所不同。間質肺病毒屬和肺病毒屬兩者的分類，主要是以其基因構象為基礎；間質肺病毒通常缺乏諸如NS1或NS2之類的非-結構蛋白質亦參見Randhawa等人，1997,J. Virol. 71:9849-9854)，且基因順序與肺病毒的不同(RSV:'3-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5'，APV:'3-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5')(Lung等人，1992,J. Gen. Virol. 73:1709-1715;Yu等人，1992,Virology 186:426-434;Randhawa等人，1997,J. Virol. 71:9849-9854)。
此外，可藉著其免疫學特性，來確認本發明的哺乳動物MPV。在某些具體實施例中，可對抗哺乳動物MPV而升高的專一抗-血清，可中和哺乳動物MPV。可對抗MPV而升高的單株和多株抗體，亦可中和哺乳動物MPV。
進一步藉著其感染哺乳動物宿主，即哺乳動物之培養細胞或哺乳動物的能力，定出本發明之哺乳動物MPV的特徵。不像APV，哺乳動物MPV不能在雞或火雞中複製，或僅能以低程度複製。然而，哺乳動物MPV在諸如獼猴之類的哺乳動物宿主中複製。在某些較特定的具體實施例中，進一步藉著其在哺乳動物宿主中複製的能力，定出該哺乳動物MPV的特徵。在某些更特定的具體實施例中，進一步藉著其引起哺乳動物宿主表現由該哺乳動物MPV之基因組編碼之蛋白質的能力，定出該哺乳動物MPV的特徵。在更特定的具體實施例中，將由該哺乳動物MPV表現的病毒蛋白質，插入哺乳動物宿主的細胞質膜內。在某些具體實施例中，本發明之哺乳動物MPV可感染哺乳動物宿主，並引起該哺乳動物宿主產生該哺乳動物MPV之新的有傳染性的病毒顆粒。關於本發明之哺乳動物MPV之功能特徵更詳細的說明，參見4.1.2節。
在某些具體實施例中，可使用病毒在電子顯微鏡中的外觀，或其對氯仿的敏感性，確認該病毒為哺乳動物MPV。本發明之哺乳動物MPV，在電子顯微靜下看來像副黏液病毒的顆粒。哺乳動物MPV，不變地對利用氯仿處理是敏感的；哺乳動物MPV最適合在tMK細胞，或在功能上與其相當的細胞中培養，且它在大多數的細胞培養中，基本上是色胺酸-依賴性的。此外，哺乳動物MPV具有典型的致細胞病變作用(CPE)，並對紅血球細胞之物種，缺乏血球凝集活性。由MPV分離株誘發的CPE，類似由hRSV誘發的CPE，其特徵在於形成融合細胞，接著細胞快速從內部瓦解，然後從培養盤中脫離。雖然大多數的副黏液病毒具有血球凝集活性，但大多數的肺病毒沒有(Pringle,C.R.在：The Paramyxoviruses中(編輯D.W. Kingsbury)1-39(Plenum Press,New York,1991))。哺乳動物MPV在編碼M2蛋白質的核酸片段中，含有第二個重疊的ORF(M2-2)。該第二個重疊ORF的發生，出現在其他肺病毒中，如同在Ahmadian等人，1999,J. Gen. Vir. 80:2011-2016中所示。在某些具體實施例中，本發明提供確認病毒分離株為哺乳動物MPV的方法。可從例如動物或人類中，獲得測試試樣。然後針對肺病毒亞科之病毒的存在，來測試該試樣。
若出現肺病毒亞科的病毒，便可針對在本文中討論的哺乳動物MPV之任何特徵，測試該病毒，像是但不限於與哺乳動物MPV的系統發生關係、對哺乳動物MPV之核苷酸序列的核苷酸序列同一性、對哺乳動物MPV之胺基酸序列的胺基酸序列同一性/同種性，以及基因組組織化。此外，可藉著使用得自MPV分離株之核酸序列的交叉-雜交實驗，使用對哺乳動物MPV專一之引子的RT-PCR，或以使用針對哺乳動物MPV分離株之抗體的典型交叉-血清學實驗，確認該病毒為哺乳動物MPV。在某些其他的具體實施例中，可利用其藉著與動物抗血清之定量中和作用判定的免疫學辨別性為基礎，來確認哺乳動物MPV。該抗血清可獲自例如以哺乳動物MPV感染的雪貂、豬或獼猴(參見，例如實例8)。
在某些具體實施例中，血清型不與哺乳動物MPV以外的病毒產生交叉-反應。在其他的具體實施例中，血清型在兩種方向中，顯示同種-對-異種力價比例>16。若中和作用顯示在任一或兩種方向中，在兩種病毒之間有若干程度的交叉-反應(8或16的同種-對-異種力價比例)，便評估血清學的辨別性，是否出現DNA序列的實質生理/生化差異。若中和作用顯示在任一或兩種方向中，在兩種病毒之間有不同程度交叉-反應(小於8的同種-對-異種力價比例)，便評估正在研究中之分離株的血清學同一性。可使用分離株I-2614，在本文中亦稱為MPV分離株00-1作為原型。
在某些具體實施例中，可將在本文中揭示之病毒分離株的胺基酸或核苷酸序列，與序列或存放物相比較，藉著病毒蛋白質或核酸的序列同種性/同一性，來確認病毒為哺乳動物MPV。特定而言，當病毒之基因組所含有的核酸序列，對以I-2614之名存放在CNCM,Paris的病毒分離株所具有之核酸同一性百分比，比在本文中對編碼L蛋白質、M蛋白質、N蛋白質、P蛋白質或F蛋白質之核酸所確認的百分比更高時，便確認該病毒是哺乳動物MPV，如同在下文中，與APV-C相比較所確認的(參見表1)。並未與理論結合，通常已知病毒物種，尤其是RNA病毒物種，經常構成準-物種，其中一群病毒的成員，展現出序列異源性。因此，預期每個個別的分離株，當與APV-C相比較時，可能多少都具有不同的序列百分比。
迄今，在MPV蛋白質與同科之任何已知的其他病毒之間，最高的胺基酸序列同一性是在APV-C和人類MPV之間的同一性。在人類MPV和APV-C之間，當比較在圖30中提供的序列時，可推衍出基質蛋白質的胺基酸序列同一性是87%，核蛋白為88%，磷蛋白為68%，融合蛋白質為81%，且一部分聚合酶蛋白質為56-64%，亦可參見表1。認為含有編碼具較高同種性、可與這些最大值相比擬之蛋白質的ORFs的病毒分離株，是哺乳動物MPV。應瞭解，與其他病毒類似，可在哺乳動物MPVs的不同分離株之間，找到某種程度的改變。
3.其他：人類副流感病毒第2和3型，仙臺病毒、麻疹病毒百立(nipah)病毒、佛賽熱病(phocine distemper)病毒和新城雞瘟病毒。
4.在病毒基因組中缺乏ORF。
在某些具體實施例中，本發明提供哺乳動物MPV，其中該哺乳動物MPV之N蛋白質的胺基酸序列，對序列識別366號00-1之N蛋白質的胺基酸序列，是至少90%、至少95%或至少98%相同的。包括在胺基酸序列上，對序列識別366號00-1之N蛋白質為至少90%相同的N蛋白質之經過分離的反義單股RNA間質肺病毒，能夠感染哺乳動物宿主。在某些具體實施例中，包括在胺基酸序列上，對序列識別366號00-1之N蛋白質為至少90%相同的N蛋白質之經過分離的反義單股RNA間質肺病毒，能夠在哺乳動物宿主中複製。以N蛋白質的整個長度，來計算胺基酸同一性。在某些具體實施例中，哺乳動物MPV含有編碼對序列識別366號00-1之N蛋白質的胺基酸序列，至少90%、至少95%，或至少98%相同之N蛋白質的核苷酸序列。
本發明更提供哺乳動物MPV，其中該哺乳動物MPV之P蛋白質的胺基酸序列，對序列識別374號00-1之P蛋白質的胺基酸序列，是至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%相同的。包括在胺基酸序列上，對序列識別374號00-1之P蛋白質為至少70%相同的P蛋白質之哺乳動物MPV，能夠感染哺乳動物宿主。在某些具體實施例中，包括在胺基酸序列上，對序列識別374號00-1之P蛋白質為至少70%相同的P蛋白質之哺乳動物MPV，能夠在哺乳動物宿主中複製。以P蛋白質的整個長度，來計算胺基酸同一性。在某些具體實施例中，哺乳動物MPV含有編碼對序列識別374號00-1之P蛋白質的胺基酸序列，至少70%、至少80%、至少90%、至少95%，或至少98%相同之P蛋白質的核苷酸序列。
本發明更提供哺乳動物MPV，其中該哺乳動物MPV之M蛋白質的胺基酸序列，對序列識別358號00-1之M蛋白質的胺基酸序列，是至少90%、至少95%或至少98%相同的。包括在胺基酸序列上，對序列識別358號00-1之M蛋白質為至少90%相同的M蛋白質之哺乳動物MPV，能夠感染哺乳動物宿主。在某些具體實施例中，包括在胺基酸序列上，對序列識別358號00-1之M蛋白質為至少90%相同的M蛋白質之經過分離的反義單股RNA間質肺病毒，能夠在哺乳動物宿主中複製。以M蛋白質的整個長度，來計算胺基酸同一性。在某些具體實施例中，哺乳動物MPV含有編碼對序列識別358號00-1之M蛋白質的胺基酸序列，至少90%、至少95%，或至少98%相同之M蛋白質的核苷酸序列。
本發明更提供哺乳動物MPV，其中該哺乳動物MPV之F蛋白質的胺基酸序列，對序列識別314號00-1之F蛋白質的胺基酸序列，是至少85%、至少90%、至少95%或至少98%相同的。包括在胺基酸序列上，對序列識別314號00-1之F蛋白質為至少85%相同的F蛋白質之哺乳動物MPV，能夠感染哺乳動物宿主。在某些具體實施例中，包括在胺基酸序列上，對序列識別314號00-1之F蛋白質為至少85%相同的F蛋白質之經過分離的反義單股RNA間質肺病毒，能夠在哺乳動物宿主中複製。以F蛋白質的整個長度，來計算胺基酸同一性。在某些具體實施例中，哺乳動物MPV含有編碼對序列識別314號00-1之F蛋白質的胺基酸序列，至少85%、至少90%、至少95%，或至少98%相同之F蛋白質的核苷酸序列。
本發明更提供哺乳動物MPV，其中該哺乳動物MPV之M2-1蛋白質的胺基酸序列，對序列識別338號00-1之M2-1蛋白質的胺基酸序列，是至少85%、至少90%、至少95%或至少98%相同的。包括在胺基酸序列上，對序列識別338號00-1之M2-1蛋白質為至少85%相同的M2-1蛋白質之哺乳動物MPV，能夠感染哺乳動物宿主。在某些具體實施例中，包括在胺基酸序列上，對序列識別338號00-1之M2-1蛋白質為至少85%相同的M2-1蛋白質之經過分離的反義單股RNA間質肺病毒，能夠在哺乳動物宿主中複製。以M2-1蛋白質的整個長度，來計算胺基酸同一性。在某些具體實施例中，哺乳動物MPV含有編碼對序列識別338號00-1之M2-1蛋白質的胺基酸序列，至少85%、至少90%、至少95%，或至少98%相同之M2-1蛋白質的核苷酸序列。
本發明更提供哺乳動物MPV，其中該哺乳動物MPV之M2-2蛋白質的胺基酸序列，對序列識別346號00-1之M2-2蛋白質的胺基酸序列，是至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%相同的。包括在胺基酸序列上，對序列識別346號00-1之M2-2蛋白質為至少60%相同的M2-2蛋白質之經過分離的哺乳動物MPV，能夠感染哺乳動物宿主。在某些具體實施例中，包括在胺基酸序列上，對序列識別346號00-1之M2-2蛋白質為至少60%相同的M2-2蛋白質之經過分離的反義單股RNA間質肺病毒，能夠在哺乳動物宿主中複製。以M2-2蛋白質的整個長度，來計算胺基酸同一性。在某些具體實施例中，哺乳動物MPV含有編碼對序列識別346號00-1之M2-2蛋白質的胺基酸序列，至少至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%，或至少98%相同之M2-2蛋白質的核苷酸序列。
在某些具體實施例中，本發明提供哺乳動物MPV，其中該反義單股RNA間質肺病毒，編碼至少2個蛋白質、至少3個蛋白質、至少4個蛋白質、至少5個蛋白質，或至少6個蛋白質，選自由下列所組成之群：(i)與序列識別366號00-1之N蛋白質，具有至少90%胺基酸序列同一性的N蛋白質；(ii)與序列識別374號00-1之P蛋白質，具有至少70%胺基酸序列同一性的P蛋白質；(iii)與序列識別358號00-1之M蛋白質，具有至少90%胺基酸序列同一性的M蛋白質；(iv)與序列識別314號00-1之F蛋白質，具有至少85%胺基酸序列同一性的F蛋白質；(v)與序列識別338號00-1之M2-1蛋白質，具有至少85%胺基酸序列同一性的M2-1蛋白質；以及(vi)與序列識別346號00-1之M2-2蛋白質，具有至少60%胺基酸序列同一性的M2-2蛋白質。
本發明提供哺乳動物MPV的兩種亞群，A亞群和B亞群。本發明亦提供四種變種A1、A2、B1和B2。若其在系統發生上，與分離株00-1(序列識別19號)的關係比與分離株99-1(序列識別18號)的更密切，則可確認該哺乳動物MPV為A亞群。若其在系統發生上，與分離株99-1(序列識別18號)的關係比與分離株00-1(序列識別19號)的更密切，則可確認該哺乳動物MPV為B亞群。在其他的具體實施例中，可使用個別ORFs的核苷酸或胺基酸序列同種性，分類哺乳動物MPV屬於A或B亞群。
可將哺乳動物MPV的不同分離株分成四個不同的變種，變種A1、變種A2、變種B1和變種B2(參見圖21和22)。分離株00-1(序列識別19號)是哺乳動物MPV之變種A1的實例。分離株99-1(序列識別18號)是哺乳動物MPV之變種B1的實例。可使用系統發生分析，將哺乳動物MPV分類在四個變種之一中。因此，若其在系統發生上，與某變種之已知成員的關係比其在系統發生上，與哺乳動物MPV之其他變種之成員的關係更密切，則該哺乳動物MPV屬於特定的變種。可使用任何ORF之序列和編碼多肽，定出該MPV分離株是屬於那個特定的亞群或變種，包括N、P、L、M、SH、G、M2或F多肽。在特定的具體實施例中，將哺乳動物MPV分類為變種，是以G蛋白質之序列為基礎。未與理論結合，G蛋白質非常適合進行系統發生分析，因為在哺乳動物MPV之不同變種中的G蛋白質中，有高度的變化。
在本發明的某些具體實施例中，可藉著兩個序列在某種條件下雜交的能力，來判定序列同種性，如同下文陳述的。在本發明方法中，可使用與哺乳動物MPV之核酸，或與其相反互補物，或與其互補物雜交的核酸，判定其序列同種性，並確認彼此。在某些具體實施例中，使核酸在高嚴格度的條件下進行雜交。
雜交條件為熟諳此藝者已熟知的，像是但不限於溫度、鹽濃度、pH值、甲醯胺濃度(參見，例如Sambrook等人，1989,第9至11章,Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)。在某些具體實施例中，在含水溶液中進行雜交，並將該溶液之離子濃度維持恆定，而雜交溫度則視在待雜交之序列之間的序列同種性程度而改變。對DNA序列而言，彼此是100%相同的，且比200個鹼基對更長，便在比完美雜交之解鏈溫度(Tm)低大約15至25℃的溫度下進行雜交。可使用下列的等式計算解鏈溫度(Bolton和McCarthy,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:1390(1962))：
Tm=81.5℃-16.6(log10[Na+])+(%G+C)-0.63(%甲醯胺)-(600/1)
其中(Tm)為解鏈溫度，[Na+]是鈉濃度，G+C是鳥嘌呤和胞嘧啶內含量，而1是以鹼基對計之雜化物的長度。可使用Bonner等人(Bonner等人，1973,J. Mol. Biol. 81:123-135)的等式，計算在序列之間誤配的影響：在雜化物中，每1%的鹼基誤配，降低解鏈溫度1-1.5℃。
因此，藉著判定彼此具有某種同種性百分比的兩個序列之雜化物的雜交溫度，並將所判定之雜交溫度與形成兩個序列之完美雜化物的溫度相比較，容許評估在這兩個序列之間的序列差異。
舉例來說，但不限於使用這類高嚴格度條件的程序如下。在65℃下，在由6X SSC,50mM Tris-HCl(pH 7.5),1mM EDTA,0.02%PVP,0.02%Ficoll,0.02%BSA和500微克/毫升變性之鮭精DNA所組成之緩衝溶液中，進行含有DNA之濾紙的預先雜交作用8小時至過夜。在65℃下，使濾紙在含有100微克/毫升變性之鮭精DNA和5-20X 106cpm 32P-標示之探針的預先雜交混合物中，雜交48小時。在37℃下，以含有2X SSC,0.01%PVP,0.01%Ficoll和0.01%BSA的溶液沖洗濾紙1小時。接著在50℃下，以0.1X SSC沖洗45分鐘，之後進行放射自顯術。其他可使用之高嚴格度的條件，為此項技藝中已熟知的。在本發明其他的具體實施例中，在中等或低嚴格度的條件下，進行雜交作用，這類條件為熟諳此藝者已熟知的(參見，例如Sambrook等人，1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York；亦參見Ausubel等人，編輯，在Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals中，1987-1997 Current Protocols,1994-1997 John Wiley and Sons,Inc.)。藉著下列的緩衝溶液系統，提供解釋性的低嚴格條件：在40℃下，在包括35%甲醯胺，5X SSC,50mM Tris-HCl(pH 7.5),5mM EDTA,0.02%PVP，0.02% Ficoll,0.2%BSA，100微克/毫升變性之鮭精DNA，和10%(重量/體積)硫酸葡聚醣的緩衝溶液中雜交18-20小時，在55℃下，以由2X SSC,25mM Tris-HC1(pH7.4),5mM EDTA,和0.1%SDS所組成的緩衝溶液沖洗1.5小時，並在60℃下，以由2X SSC,25mM Tris-HC1(pH7.4),5mM EDTA,和0.1%SDS所組成之緩衝溶液沖洗1.5小時。
在某些具體實施例中，可使用對哺乳動物MPV之特定變種專一的探針，將哺乳動物MPV分類成變種之一。這類探針包括RT-PCR引子和抗體。在下文4.9節中，描述了確認哺乳動物MPV為特定變種之成員的解釋性方法。
在本發明的某些具體實施例中，可藉著不同病毒蛋白質之胺基酸序列，互相區別哺乳動物MPV的不同變種(參見，例如圖42b)。在其他的具體實施例中，可藉著由病毒基因組編碼之不同ORFs的核苷酸序列，互相區別哺乳動物MPV的不同變種(參見，例如圖42b)。哺乳動物MPV的變種，可以是但不限於A1、A2、B1或B2。然而，本發明亦注視屬於其他變種之成員的哺乳動物MPV之分離株。本發明亦注視具有一或多個與一變種之關係較密切的ORF，以及一或多個在系統發生上,與另一變種之關係較密切的ORFs的病毒。將這類病毒分類至在系統發生上，與其大多數ORFs之關係較密切的變種內。亦可使用非-密碼序列，來判定系統發生的關係。
若其在系統發生上,與病毒分離株NL/1/99(序列識別18號)的關係，比其與任何下列其他的病毒分離株之關係更密切：NL/1/00(序列識別19號)、NL/17/00(序列識別20號)和NL/1/94(序列識別21號)，便將該哺乳動物MPV之分離株分類為變種B1。可使用哺乳動物MPV的一或多個ORFs，來分類哺乳動物MPV的變種。若其G蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/1/99(序列識別324號)代表之哺乳動物MPV B1變種的G蛋白質，是至少66%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%，或至少99.5%相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPV B1變種；若其N蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/1/99(序列識別368號)代表之哺乳動物MPV B1變種的N蛋白質，是至少98.5%或至少99%，或至少99.5%相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPV B1變種；若其P蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/1/99(序列識別376號)代表之哺乳動物MPV B1變種的P蛋白質，是至少96%、至少98%或至少99%，或至少99.5%相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPV B1變種；若其M蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/1/99(序列識別360號)代表之哺乳動物MPV B1變種的M蛋白質是相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPV B1變種；若其F蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/1/99(序列識別316號)代表之哺乳動物MPV B1變種的F蛋白質，是至少99%相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPV B1變種；若其M2-1蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/1/99(序列識別340號)代表之哺乳動物MPV B1變種的M2-1蛋白質是至少98%或至少99%，或至少99.5%相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPV B1變種；若其M2-2蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/1/99(序列識別348號)代表之哺乳動物MPV B1變種的M2-2蛋白質是至少99%，或至少99.5%相同的、便將該哺乳動物MPV分類為MPV B1變種；若其SH蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/1/99(序列識別384號)代表之哺乳動物MPV B1變種的SH蛋白質是至少83%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%，或至少99%，或至少99.5%相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPV B1變種；及/或若其L蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/1/99(序列識別332號)代表之哺乳動物MPV B1變種的L蛋白質是至少99%，或至少99.5%相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPV B1變種。
若其在系統發生上，與病毒分離株NL/1/00(序列識別19號)的關係，比其與任何下列其他的病毒分離株之關係更密切：NL/1/99(序列識別18號)、NL/17/00(序列識別20號)和NL/1/94(序列識別21號)，便將該哺乳動物MPV之分離株分類為變種A1。可使用哺乳動物MPV的一或多個ORFs，來分類哺乳動物MPV的變種。若其G蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/1/00(序列識別322號)代表之哺乳動物MPV A1變種的G蛋白質，是至少66%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%，或至少99.5%相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPV A1變種；若其N蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/1/00(序列識別366號)代表之哺乳動物MPV A1變種的N蛋白質，是至少99.5%相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPV A1變種；若其P蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/1/00(序列識別374號)代表之哺乳動物MPV A1變種的P蛋白質，是至少96%、至少98%或至少99%，或至少99.5%相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPVA1變種；若其M蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/1/00(序列識別358號)代表之哺乳動物MPV A1變種的M蛋白質，是至少99%或至少99.5%相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPVA1變種；若其F蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/1/00(序列識別314號)代表之哺乳動物MPVA1變種的F蛋白質，是至少98%或至少99%，或至少99.5%相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPVA1變種；若其M2-1蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/1/00(序列識別338號)代表之哺乳動物MPVA1變種的M2-1蛋白質，是至少99%或至少99.5%相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPVA1變種；若其M2-2蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/1/00(序列識別346號)代表之哺乳動物MPV A1變種的M2-2蛋白質，是至少96%或至少99%，或至少99.5%相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPVA1變種；若其SH蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/1/00(序列識別382號)代表之哺乳動物MPV A1變種的SH蛋白質，是至少84%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%，或至少99.5%相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPVA1變種；及/或若其L蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/1/00(序列識別330號)代表之哺乳動物MPVA1變種的L蛋白質，是至少99%或至少99.5%相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPVA1變種。
若其在系統發生上，與病毒分離株NL/17/00(序列識別20號)的關係，比其與任何下列其他的病毒分離株之關係更密切：NL/1/99(序列識別18號)、NL/1/00(序列識別19號)和NL/1/94(序列識別21號)，便將該哺乳動物MPV之分離株分類為變種A2。可使用哺乳動物MPV的一或多個ORFs，來分類哺乳動物MPV的變種。若其G蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/17/00(序列識別332號)代表之哺乳動物MPV A2變種的G蛋白質，是至少66%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%，或至少99.5%相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPVA2變種；若其N蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/17/00(序列識別367號)代表之哺乳動物MPV A2變種的N蛋白質，是至少99.5%相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPV A2變種；若其P蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/17/00(序列識別375號)代表之哺乳動物MPV A2變種的P蛋白質，是至少96%、至少98%或至少99%，或至少99.5%相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPV A2變種；若其M蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/17/00(序列識別359號)代表之哺乳動物MPV A2變種的M蛋白質，是至少99%或至少99.5%相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPV A2變種；若其F蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/17/00(序列識別315號)代表之哺乳動物MPV A2變種的F蛋白質，是至少98%、至少99%或至少99.5%相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPV A2變種；若其M2-1蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/17/00(序列識別339號)代表之哺乳動物MPV A2變種的M2-1蛋白質，是至少99%或至少99.5%相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPVA2變種；若其M2-2蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/17/00(序列識別347號)代表之哺乳動物MPV A2變種的M2-2蛋白質，是至少96%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPV A2變種；若其SH蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/17/00(序列識別383號)代表之哺乳動物MPVA2變種的SH蛋白質，是至少84%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPV A2變種；及/或若其L蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/17/00(序列識別331號)代表之哺乳動物MPV A2變種的L蛋白質，是至少99%或至少99.5%相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPV A2變種。
若其在系統發生上，與病毒分離株NL/1/94(序列識別21號)的關係，比其與任何下列其他的病毒分離株之關係更密切：NL/1/99(序列識別18號)、NL/1/00(序列識別19號)和NL/17/00(序列識別20號)，便將該哺乳動物MPV之分離株分類為變種B2。可使用哺乳動物MPV的一或多個ORFs，來分類哺乳動物MPV的變種。若其G蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/1/94(序列識別325號)代表之哺乳動物MPV B2變種的G蛋白質，是至少66%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%，或至少99.5%相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPV B2變種；若其N蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/1/94(序列識別369號)代表之哺乳動物MPV B2變種的N蛋白質，是至少99.5%相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPV B2變種；若其P蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/1/94(序列識別377號)代表之哺乳動物MPV B2變種的P蛋白質，是至少96%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPV B2變種；若其M蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/1/94(序列識別361號)代表之哺乳動物MPV B2變種的M蛋白質是相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPV B2變種；若其F蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/1/94(序列識別317號)代表之哺乳動物MPV B2變種的F蛋白質，是至少99%或至少99.5%相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPV B2變種；若其M2-1蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/1/94(序列識別341號)代表之哺乳動物MPV B2變種的M2-1蛋白質，是至少98%或至少99%，或至少99.5%相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPV B2變種；若其M2-2蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/1/94(序列識別349號)代表之哺乳動物MPV B2變種的M2-2蛋白質，是至少99%或至少99.5%相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPV B2變種；若其SH蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/1/94(序列識別385號)代表之哺乳動物MPV B2變種的SH蛋白質，是至少84%，至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%，或至少99.5%相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPV B2變種；及/或若其L蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/1/94(序列識別333號)代表之哺乳動物MPV B2變種的L蛋白質，是至少99%或至少99.5%相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPV B2變種。
在某些具體實施例中，序列同一性的百分比係以全長蛋白質之排列為基礎。在其他的具體實施例中，序列同一性的百分比係以蛋白質之相鄰胺基酸序列的排列為基礎，其中該胺基酸序列的長度可以是25個胺基酸、50個胺基酸、75個胺基酸、100個胺基酸、125個胺基酸、150個胺基酸、175個胺基酸、200個胺基酸、225個胺基酸、250個胺基酸、275個胺基酸、300個胺基酸、325個胺基酸、350個胺基酸、375個胺基酸、400個胺基酸、425個胺基酸、450個胺基酸、475個胺基酸、500個胺基酸、750個胺基酸、1000個胺基酸、1250個胺基酸、1500個胺基酸、1750個胺基酸、2000個胺基酸或2250個胺基酸。
4.2.哺乳動物MPV之功能特徵
除了哺乳動物MPV之結構定義之外，亦可藉著其功能特徵來確認哺乳動物MPV。在某些具體實施例中，本發明之哺乳動物MPV能夠感染哺乳動物宿主。哺乳動物宿主可以是哺乳動物細胞、組織、器官或哺乳動物。在特定的具體實施例中，哺乳動物宿主是人類或人類細胞、組織或器官。可使用熟諳此藝者已知的任何方法，測試哺乳動物宿主是否已被哺乳動物MPV感染。在某些具體實施例中，測試病毒與哺乳動物細胞附接的能力。在某些其他的具體實施例中，測試病毒運送其基因組至哺乳動物細胞內的能力。在解釋性的具體實施例中，以可檢測之方式標示病毒的基因組，例如以放射性標示。然後將病毒與哺乳動物細胞一起培養至少1分鐘、至少5分鐘、至少15分鐘、至少30分鐘、至少1小時、至少2小時、至少5小時、至少12小時，或至少1天。接著沖洗細胞，從細胞中移除任何病毒顆粒，然後藉著可檢測標記，針對病毒基因組的存在，來測試細胞。在另一個具體實施例中，使用RT-PCR，使用哺乳動物MPV專一的引子，檢測在細胞中之病毒基因組的存在。
在某些具體實施例中，哺乳動物病毒能夠感染哺乳動物宿主，但不使哺乳動物MPV之蛋白質插入哺乳動物宿主的細胞質膜內。哺乳動物宿主可以是培養的哺乳動物細胞、器官、組織或哺乳動物。在解釋性的具體實施例中，將哺乳動物細胞與哺乳動物病毒一起培養。接著在從細胞表面移除病毒的條件下，沖洗細胞。可使用任何熟諳此藝者已知的技術，檢測插入哺乳動物細胞之細胞質膜中的新近表現之病毒蛋白質。例如，在將細胞與病毒一起培養之後，將細胞維持在包括以可檢測方式標示之胺基酸的培養基中。接著收獲細胞，溶解並從膜溶離份中分離出細胞質溶離份。然後增溶膜溶離份的蛋白質，並使其接受免疫沉澱，使用對哺乳動物MPV之蛋白質專一的抗體，像是但不限於F蛋白質或G蛋白質。然後使經過免疫沉澱的蛋白質接受SDS PAGE。然後藉著放射自顯術，檢測病毒蛋白質的百分比。在另一個具體實施例中，可藉著免疫細胞化學法，使用一或多個對哺乳動物MPV專一的抗體，來檢測在宿主細胞之細胞質膜中的病毒蛋白質之百分比。
在其他的具體實施例中，本發明之哺乳動物MPV能夠感染哺乳動物宿主，並能夠在哺乳動物宿主中複製。哺乳動物宿主可以是培養的哺乳動物細胞、器官、組織或哺乳動物。可使用任何熟諳此藝者已知的技術，檢測病毒是否能夠感染哺乳動物細胞，並在哺乳動物宿主中複製。在特定的具體實施例中，以病毒感染哺乳動物細胞。然後維持該哺乳動物細胞至少30分鐘、至少1小時、至少2小時、至少5小時、至少12小時、至少1天或至少2天。可使用北方墨點分析、RT-PCR或就地雜交作用，使用對該病毒基因組專一的探針，監視在細胞中病毒基因組RNA的含量。病毒基因組RNA的增加，證實該病毒能夠感染哺乳動物細胞，並可在哺乳動物細胞內複製。
在其他的具體實施例中，本發明之哺乳動物MPV能夠感染哺乳動物宿主，其中該感染使哺乳動物宿主產生新的有傳染性的哺乳動物MPV。哺乳動物宿主可以是培養的哺乳動物細胞或哺乳動物。可使用任何熟諳此藝者已知的技術，檢測病毒是否能夠感染哺乳動物細胞，並使哺乳動物宿主產生新的有傳染性的病毒顆粒。在解釋性的實例中，以哺乳動物病毒感染哺乳動物細胞。接著沖洗該細胞，並培養至少30分鐘、至少1小時、至少2小時、至少5小時、至少12小時、至少1天、至少2天、至少1週或至少12天。可藉著熟諳此藝者已知的任何方法，監視病毒的力價。關於代表性的方法，參見4.8節。
在某些特定的具體實施例中，哺乳動物MPV為人類MPV。在本節中描述的測試，亦可利用人類MPV進行。在某些具體實施例中，人類MPV能夠感染哺乳動物宿主，像是哺乳動物或哺乳動物的培養細胞。
在某些具體實施例中，人類MPV能夠感染哺乳動物宿主，並使該人類MPV之蛋白質插入哺乳動物宿主的細胞質膜內。
在其他的具體實施例中，本發明之人類MPV能夠感染哺乳動物宿主，並在哺乳動物宿主中複製。
在其他的具體實施例中，本發明之人類MPV能夠感染哺乳動物宿主，其中該感染使哺乳動物宿主產生新的有傳染性的人類MPV。
在某些具體實施例中，哺乳動物MPV，即使它能夠感染哺乳動物宿主，亦能夠感染禽類宿主，像是鳥類或禽類的培養細胞。在某些具體實施例中，哺乳動物MPV能夠感染禽類宿主，並使該哺乳動物MPV之蛋白質插入該禽類宿主的細胞質膜內。在其他的具體實施例中，本發明之哺乳動物MPV能夠感染禽類宿主，並在禽類宿主中複製。在其他的具體實施例中，本發明之哺乳動物MPV能夠感染禽類宿主，其中該感染使禽類宿主產生新的有傳染性的哺乳動物MPV。
4.3.重組和嵌合型的間質肺病毒
本發明提供由衍生自間質肺病毒，包括哺乳動物和禽類變種之基因組的病毒載體編碼之重組或嵌合型病毒。根據本發明，重組病毒是衍生自哺乳動物MPV或APV的病毒，其由內源或天然的基因組序列，或非-天然的基因組序列編碼。根據本發明，非-天然的序列是因為一或多個突變，包括但不限於點突變、重排、插入、刪除等等，而與天然或內源的基因組序列不同的序列，對基因組序列而言，可能或可能沒有導致表現型上的改變。本發明之重組病毒包括由衍生自間質肺病毒，包括哺乳動物和鳥類變種之基因組的病毒載體編碼的那些病毒，並可以或可以不包括對病毒基因組而言，為非-天然的核酸。根據本發明，衍生自間質肺病毒之基因組的病毒載體，是含有編碼一個哺乳動物間質肺病毒的ORF之至少一部分的核酸序列的病毒載體，其中由該ORF編碼之多肽具有在上文4.1節和表1中陳述的胺基酸序列同一性。
根據本發明，本發明之病毒載體係衍生自哺乳動物間質肺病毒(MPV)之基因組，特別是人類間質肺病毒。在本發明特定的具體實施例中，該病毒載體係衍生自間質肺病毒A1、A2、B1或B2變種的基因組。根據本發明，這些病毒載體可以或可以不包括對病毒基因組而言，為非-天然的核酸。
根據本發明，本發明之病毒載體係衍生自禽肺病毒(APV)之基因組，亦稱為火雞鼻氣管炎病毒(TRTV)。在本發明特定的具體實施例中，該病毒載體係衍生自APVA、B、C或D亞群之基因組。在較佳的具體實施例中，病毒載體衍生自APVC亞群之基因組。根據本發明，這些病毒載體可以或可以不包括對病毒基因組而言，為非-天然的核酸。
在本發明另一個較佳的具體實施例中，衍生自APV之基因組的病毒載體，是含有編碼APVC亞群之F-ORF的核酸序列的病毒載體。在某些具體實施例中，衍生自APV之基因組的病毒載體，是含有編碼至少APV之N-ORF、P-ORF、M-ORF、F-ORF、M2-1-ORF、M2-2-ORF或L-ORF之核酸序列的病毒載體。
根據本發明，嵌合型病毒是重組的MPV或APV，其進一步更包括異源核苷酸序列。根據本發明，該嵌合型病毒可由其中已經將異源核苷酸序列加至基因組內的核苷酸序列，或其中已經利用異源核苷酸序列置換內源或天然核苷酸序列的核苷酸序列編碼。
根據本發明，由本發明之病毒載體編碼的嵌合型病毒，進一步更包括異源核苷酸序列。根據本發明，該嵌合型病毒可由病毒載體編碼，其可以或可以不包括對病毒基因組而言，為非-天然的核酸。根據本發明，該嵌合型病毒係由其中已經加入、插入異源核苷酸序列，或以其置換天然或非-天然序列的病毒載體編碼。根據本發明，該嵌合型病毒可由衍生自不同品系之哺乳動物MPV的核苷酸序列編碼。特定而言，該嵌合型病毒係由編碼衍生自不同品系之MPV的抗原多肽的核苷酸序列編碼。
根據本發明，該嵌合型病毒可由衍生自APV之基因組的病毒載體編碼，特別是C亞群，其額外地編碼異源序列，其編碼衍生自MPV之一或多個品系的抗原多肽。
嵌合型病毒在產製重組疫苗，保護對抗二或多種病毒時，可能是特別有用的(Tao等人，J. Virol. 72,2955-2961;Durbin等人，2000,J. Virol. 74,6821-6831;Skiadopoulos等人，1998,J. Virol. 72,1762-1768(1998);Teng等人，2000,J. Virol. 74,9317-9321)。例如，可想像表現一或多個其他負股RNA病毒，例如RSV之蛋白質的MPV或APV病毒載體，或表現一或多個MPV之蛋白質的RSV載體，將可保護接種這類疫苗的個體，對抗兩種病毒感染。可對PIV或其他副黏液病毒，想像類似的方法。減毒和複製缺陷的病毒，可用在利用活疫苗來接種疫苗之目的上，如同已經就其他病毒討論過的(參見PCT WO 02/057302，在第6和23頁，以引用的方式併入本文中)。
根據本發明，欲併入編碼本發明之重組或嵌合型病毒之病毒載體內的異源序列，包括獲自或衍生自不同品系之間質肺病毒、禽肺病毒之品系，以及其他負股RNA病毒，包括但不限於RSV、PIV和流感病毒，以及其他病毒，包括摩比利病毒的序列。
在本發明的某些具體實施例中，本發明之嵌合型或重組病毒係由衍生自病毒基因組之病毒載體編碼，其中該病毒基因組已經以異源或非-天然的序列，取代一或多個序列、基因間區域、終端序列，或一部分或全部的ORF。在本發明的某些具體實施例中，本發明之嵌合型病毒係由衍生自病毒基因組之病毒載體編碼，其中已經在該載體中加入一或多個異源序列。
在某些具體實施例中，本發明之病毒含有異源核酸。在較佳的具體實施例中，將該異源核苷酸序列插入或加至病毒基因組的位置1中。在另一個較佳的具體實施例中，將該異源核苷酸序列插入或加至病毒基因組的位置2中。在另一個較佳的具體實施例中，將該異源核苷酸序列插入或加至病毒基因組的位置3中。在病毒基因組之較低-編號的位置處插入或加入核酸序列，與在較高-編號的位置處插入相比較，產生較強或較高程度之異源核苷酸序列的表現，歸因於跨越病毒基因組的轉錄梯度。因此，若想要異源核苷酸序列的高程度表現，在較低-編號之位置處插入或加入異源核苷酸序列是本發明較佳的具體實施例。
未與理論結合，插入或加入異源序列的位置，影響重組或嵌合型病毒的複製速率。若將異源序列插入或加至病毒基因組的位置2或位置1處，可達到較高的複製速率。若將異源序列插入或加至位置3、位置4、位置5或位置6處，便降低複製的速率。
未與理論結合，在病毒基因和異源序列之間的基因間區域之尺寸，進一步決定該病毒的複製速率，以及該異源序列的表現程度。
在某些具體實施例中，本發明之病毒載體含有二或多個異源核苷酸序列。在較佳的具體實施例中，一個異源核苷酸序列是在病毒基因組的位置1，而第2個異源核苷酸序列是在位置2。在另一個較佳的具體實施例中，一個異源核苷酸序列是在病毒基因組的位置1，而第二個異源核苷酸序列是在位置3。在另一個較佳的具體實施例中，一個異源核苷酸序列是在病毒基因組的位置2，而第二個異源核苷酸序列是在位置3。在某些其他的具體實施例中，將異源核苷酸序列插入病毒基因組的另一個、較高-編號的位置內。根據本發明，異源序列的位置意指從病毒基因組中轉錄該序列的順序，例如在位置1處的異源序列，是欲從基因組中轉錄的第一個基因序列。
病毒載體的選擇，可依據欲治療或防止免於病毒感染之個體的物種而定。若該個體是人類，此時可使用減毒的哺乳動物間質肺病毒或禽肺病毒，提供抗原序列。
根據本發明，可設計病毒載體，提供賦與對抗間質肺病毒感染之保護的抗原序列，包括衍生自哺乳動物間質肺病毒、人類間質肺病毒、MPV變種A1、A2、B1或B2的序列，衍生自禽肺病毒的序列，包括APVA、B、C或D亞組，雖然C是較佳的。可設計病毒載體，提供賦與對抗由其他病毒引起之感染或疾病之保護的抗原序列，包括負股RNA病毒，包括流感、RSV或PIV，包括PIV3。可設計病毒載體，提供一、二、三或更多的抗原序列。根據本發明，該抗原序列可衍生自相同的病毒、相同類型病毒的不同品系或變種，或不同的病毒。
在本發明的某些具體實施例中，待插入本發明之病毒基因組內的異源核苷酸序列，係衍生自間質肺病毒。在本發明某些特定的具體實施例中，該異源核苷酸序列係衍生自人類間質肺病毒。在另一個特定的具體實施例中，該異源核苷酸序列係衍生自禽肺病毒。更特定而言，本發明之異源核苷酸序列係編碼人類間質肺病毒之F基因。更特定而言，本發明之異源核苷酸序列係編碼人類間質肺病毒之G基因。更特定而言，本發明之異源核苷酸序列係編碼禽肺病毒之F基因。更特定而言，本發明之異源核苷酸序列係編碼禽肺病毒之G基因。在特定的具體實施例中，異源核苷酸序列可以是序列識別1號至序列識別5號、序列識別14號和序列識別15號中的任一個。在某些特定的具體實施例中，核苷酸序列編碼序列識別6號至序列識別13號、序列識別16號和序列識別17號中任一個的蛋白質。
在本發明特定的具體實施例中，該異源核苷酸序列係編碼嵌合型F蛋白質。在解釋性的具體實施例中，嵌合型F蛋白質之外功能部位(ectodomain)是人類MPV之外功能部位，而穿透膜功能部位和魯米那功能部位則衍生自禽間質肺病毒的F-蛋白質。未與理論結合，編碼由人類外功能部位和禽魯米那/穿透膜功能部位所組成之嵌合型F-蛋白質的嵌合型人類MPV，因為F-蛋白質之禽類部分而為減毒的，亦因為人類外功能部位，而對hMPV是具高度免疫原性的。
在某些具體實施例中，可將兩個不同的異源核苷酸序列插入或加至本發明的病毒載體中，該異源核苷酸序列係衍生自間質肺病毒基因組，包括哺乳動物和禽類。例如，衍生自人類間質肺病毒、禽肺病毒、RSV、PIV或流感的異源核苷酸序列。在較佳的具體實施例中，該異源序列分別編碼人類間質肺病毒、禽肺病毒、RSV或PIV的F-蛋白質。在另一個具體實施例中，該異源序列係編碼流感的HA蛋白質。
在某些具體實施例中，本發明之病毒載體含有兩個不同的異源核苷酸序列，其中第一個異源核苷酸序列衍生自間質肺病毒，像是人類間質肺病毒或禽肺病毒，而第二個核苷酸序列則衍生自呼吸道融合細胞病毒(參見表2)。在特定的具體實施例中，該衍生自呼吸道融合細胞病毒的異源核苷酸序列，是呼吸道融合細胞病毒的F基因。在其他特定的具體實施例中，該衍生自呼吸道融合細胞病毒的異源核苷酸序列，是呼吸道融合細胞病毒的G基因。在特定的具體實施例中，將衍生自間質肺病毒之異源核苷酸序列插入比衍生自呼吸道融合細胞病毒之異源核苷酸序列更低-編號的位置處。在其他特定的具體實施例中，將衍生自間質肺病毒之異源核苷酸序列插入比衍生自呼吸道融合細胞病毒之異源核苷酸序列更高-編號的位置處。
在某些具體實施例中，本發明之病毒含有兩個不同的異源核苷酸序列，其中第一個異源核苷酸序列係衍生自間質肺病毒，像是人類間質肺病毒或禽肺病毒，而第二個核苷酸序列則衍生自副流感病毒，像是但不限於PIV3(參見表2)。在特定的具體實施例中，衍生自PIV之異源核苷酸序列是PIV的F基因。在另一個特定的具體實施例中，衍生自PIV之異源核苷酸序列是PIV的G基因。在特定的具體實施例中，將衍生自間質肺病毒之異源核苷酸序列插入比衍生自PIV之異源核苷酸序列更低-編號的位置處。在另一個特定的具體實施例中，將衍生自間質肺病毒之異源核苷酸序列插入比衍生自PIV之異源核苷酸序列更高-編號的位置處。
可在疫苗調配物中，有利地使用根據本發明獲得的表現產物及/或重組或嵌合型病毒粒子。可設計本發明之表現產物和嵌合型病毒粒子，創造對抗各種病原的疫苗，包括病毒和細菌抗原、腫瘤抗原、過敏抗原和涉及自體免疫病症的自體抗原。特定而言，可設計本發明之嵌合型病毒粒子，創造保護個體免於PIV、RSV及/或間質肺病毒感染的疫苗。
在另一個具體實施例中，可設計本發明之嵌合型病毒粒子，創造抗-HIV疫苗，其中在糖蛋白HN蛋白質內設計得自gp160，及/或HIV之內部蛋白質的免疫原多肽，建構能夠誘發脊椎動物體液和細胞-調解之免疫反應的疫苗。在另一個具體實施例中，本發明係關於重組的間質肺病毒載體和病毒，將其設計成編碼突變種抗原。突變種抗原相對於從其中衍生出之野外型病毒的蛋白質，具有至少一個胺基酸取代、刪除或添加。
在某些具體實施例中，本發明係關於包括本發明之重組或嵌合型病毒的三價疫苗。在特定的具體實施例中，用來作為三價疫苗之主鏈的病毒，是嵌合型禽-人類間質肺病毒，或嵌合型人類-禽間質肺病毒，含有衍生自RSV的第一個異源核苷酸序列，和衍生自PIV的第二個異源核苷酸序列。在代表性的具體實施例中，這類三價疫苗將是對下列專一的：(a)人類間質肺病毒或禽肺病毒各自的F基因及/或G基因之基因產物，依據是否使用嵌合型禽-人類或嵌合型人類-禽間質肺病毒；(b)由衍生自RSV之異源核苷酸序列編碼的蛋白質；以及(c)由衍生自PIV之異源核苷酸序列編碼的蛋白質。在特定的具體實施例中，第一個異源核苷酸序列是呼吸道融合細胞病毒的F基因，並將其插入位置1中，而第二個異源核苷酸序列是PIV的F基因，並將其插入位置3中。本發明包括多更多的組合，並在表2中舉例出示一些。此外，亦可使用編碼嵌合型F蛋白質的核苷酸序列(參見前文)。在一些較差的具體實施例中，可將異源核苷酸序列插入病毒基因組之較高編號的位置中。
在某些具體實施例中，可設計本發明之表現產物和重組或嵌合型病毒粒子，創造對抗各種病原的疫苗，包括病毒抗原、腫瘤抗原和涉及自體免疫病症的自體抗原。一種達成該目的的方法，涉及修改現存的間質肺病毒基因，在其各別的外部功能部位中，含有外來的序列。在異源序列是抗原決定位或病原的抗原之處，可使用這些嵌合型病毒，誘導保護性免疫反應，對抗從其中衍生這些決定位的致病原。
因此，本發明係關於使用病毒載體和重組或嵌合型病毒，來調配對抗各種病毒及/或抗原的疫苗。可使用本發明之病毒載體和嵌合型病毒，藉著刺激體液免疫反應、細胞免疫反應，或藉著刺激對抗原之容忍性，來調節個體的免疫系統。當在本文中使用時，個體意指：人類、靈長類、馬、牛、綿羊、豬、山羊、狗、貓、禽類和囓齒類。
僅為了說明的目的，可將本發明分成下列的階段，但不限於：(a)建構重組的cDNA和RNA模板；(b)使用重組的c DNA和RNA模板，表現異源基因產物；(c)在重組的病毒顆粒中，解救異源的基因；並(d)產製和使用包括本發明之重組病毒顆粒的疫苗。
4.4.建構重組的cDNA和RNA
在某些具體實施例中，該病毒載體係衍生自本發明之人類或哺乳動物間質肺病毒的基因組。在其他的具體實施例中，該病毒載體係衍生自禽肺病毒之基因組。在某些具體實施例中，病毒載體含有衍生自哺乳動物MPV和APV的序列，而得以由該病毒載體編碼嵌合型人類MPV/APV病毒。在代表性的具體實施例中，已經利用禽肺病毒之F-基因及/或G-基因代替人類間質肺病毒之F-基因及/或G-基因，建構嵌合型hMPV/APV病毒。在其他的具體實施例中，病毒載體含有衍生自APV和哺乳動物MPV的序列，而得以由該病毒載體編碼嵌合型APV/hMPV病毒。在更具代表性的具體實施例中，已經利用人類間質肺病毒之F-基因及/或G-基因代替禽肺病毒之F-基因及/或G-基因，建構嵌合型APV/hMPV病毒。
本發明亦包括重組病毒，其包括衍生自哺乳動物MPV或APV基因組之病毒載體，其含有結果使該病毒具有更適用於疫苗調配物之表現型的序列，例如減毒的表現型或增強的抗原性。突變和修改可位在病毒之密碼區中、基因間區域中，以及前導和拖尾序列中。
在某些具體實施例中，本發明之病毒載體包括衍生自hMPV、APV、hMPV/APV或APV/hMPV的核苷酸序列，其中已經利用異源序列取代天然的核苷酸序列，或其中已經將異源序列加至天然的間質肺病毒序列中。
在更特定的具體實施例中，該嵌合型病毒包括衍生自MPV、APV、APV/hMPV或hMPV/APV的病毒載體，其中已經加入衍生自PIV的異源序列。在更特定的具體實施例中，該重組病毒包括衍生自MPV、APV、APV/hMPV或hMPV/APV的病毒載體，其中已經利用衍生自PIV的異源序列置換該序列。在其他特定的具體實施例中，該嵌合型病毒包括衍生自MPV、APV、APV/hMPV或hMPV/APV的病毒載體，其中已經加入衍生自RSV的異源序列。在更特定的具體實施例中，該嵌合型病毒包括衍生自MPV、APV、APV/hMPV或hMPV/APV的病毒載體，其中已經利用衍生自RSV之異源序列置換該序列。
可使用此項技藝中已知的技術，建構位在病毒聚合酶結合位置/啟動基因之互補物，例如本發明之3'-hMPV病毒終端的互補物，或3'-和5'-hMPV病毒兩端之互補物側面的異源基因密碼序列。在更特定的具體實施例中，本發明之重組病毒含有hMPV或APV之前導和拖尾序列。在某些具體實施例中，從hMPV或APV中獲得基因間區域。所得的RNA模板可能具有負-極性，並可含有適當的終端序列，使病毒RNA-合成裝置能夠認出該模板。或者，亦可使用正-極性的RNA模板，其含有適當的終端序列，使病毒RNA-合成裝置能夠認出該模板。可選殖含有這些雜種序列的重組DNA分子，並藉著DNA-指揮之RNA聚合酶，像是噬菌體T7聚合酶、T3聚合酶、SP6聚合酶，或真核生物聚合酶，像是聚合酶I及其類似物轉錄，以便在活體外或在活體內產製具有適當之病毒序列，並給予病毒聚合酶認知和活性的重組RNA模板。在更特定的具體實施例中，該RNA聚合酶為禽痘病毒T7RNA聚合酶，或MVAT7RNA聚合酶。
一種建構這類雜種分子的解釋性方法，是將異源核苷酸序列插入hMPV、APV、APV/hMPV或hMPV/APV基因組的DNA互補物內，使得該異源序列位在病毒聚合酶活性所需之病毒序列，即病毒聚合酶結合位置/啟動基因，在後文中稱為病毒聚合酶結合位置和聚腺苷酸化作用位置的側面。在較佳的具體實施例中，該異源密碼序列位在包括5'和3'終端之複製啟動基因，基因開始和基因結束序列，以及在5'及/或3'終端發現之包裝信號的病毒序列的側面。在另一種方法中，將編碼病毒聚合酶結合位置之寡核苷酸，例如病毒基因組斷片之3'-終端或兩端的互補物，與異源密碼序列連接，建構雜種分子。在標靶序列中放置外來基因或外來基因的斷片，從前是藉著在標靶序列中出現之適當限制酵素位置來指揮。然而，最近在分子生物學上的進步， 已經大大地減少了該問題。可經由使用指定位置之突變生成作用(例如，參見，例如由Kunkel,1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:488描述的技術)，迅速地將限制酵素位置放在標靶序列中的任何地方。在下文中描述之在聚合酶連鎖反應(PCR)技術上的改變，亦容許序列(即限制酵素位置)的指定插入，並容許輕易地建構雜種分子。或者，可使用PCR反應，製備重組的模板，而不需要選殖。例如，可使用PCR反應，製備含有DNA-指揮之RNA聚合酶啟動基因(例如噬菌體T3、T7或SP6)的雙股DNA分子，以及含有異源基因和PIV聚合酶結合位置的雜種序列。然後可從該重組DNA中，直接轉錄RNA模板。在另一個具體實施例中，可藉著使用RNA連接酶，使指出異源基因之負極性的RNAs與病毒聚合酶結合位置連接，來製備重組的RNA模板。
此外，可在未轉譯區域中，加入一或多個核苷酸，與"六的規則"附接，該"六的規則"在獲得病毒解救時，可能是很重要的。"六的規則"適用於許多副黏液病毒，且RNA基因組之核苷酸的狀態，必須可被6整除，才是有功能的。可藉著此項技藝中已知的技術，像是使用市售的突變生成套組，像QuikChange突變生成套組(Stratagene)，完成核苷酸的加入。在加入適當數目的核苷酸之後，然後可藉著以適當的限制酵素消化，並以凝膠純化，分離出正確的DNA片段。可根據在後文之子章節中描述的本發明，使用病毒聚合酶活性所需之序列和構築體。
未與理論結合，數個參數影響重組病毒的複製速率，以及異源序列的表現程度。特定而言，在hMPV、APV、hMPV/APV或APV/hMPV中異源序列的位置，以及位在異源序列側面之基因間區域的長度，決定異源序列的複製速率和表現程度。
在某些具體實施例中，相對於野外型病毒修改病毒的前導及/或拖尾序列。在某些較特定的具體實施例中，改變前導及/或拖尾序列的長度。在其他的具體實施例中，相對於野外型病毒，使前導及/或拖尾之序列(們)突變。關於更多的細節，參見第4.7節。
本發明之重組病毒的產製，依賴反義病毒RNA(vRNA)基因組之部分或全長副本，或其互補副本(cRNA)的複製。可從有傳染性的病毒中分離該vRNA或cRNA，以在活體外的轉錄作用產製，或在細胞中以核酸之轉移感染作用來產製。其次，重組負股病毒的產製依賴有功能的聚合酶複合物。肺病毒之聚合酶複合物通常由N、P、L蛋白質，可能還有M2本發明所組成，但不一定僅限於此。
可從病毒顆粒中分離，從表現一或多種組份的細胞中中分離，或以特定表現載體之轉移感染作用來產製聚合酶複合物或其組份。
當藉著上文提及之聚合酶複合物16複製上文提及之vRNA、cRNA，或表現這些RNAs的載體時，可獲得有傳染性的MPV副本(Schnell等人，1994，EMBO J 13:4195-4203;Collins等人，1995,PNAS 92:11563-11567；Hoffmann等人，2000,PNAS 97:6108-6113;Bridgen等人，1996,PNAS 93:15400-15404;Palese等人，1996,PNAS 93:11354-11358;Peeters等人，1999,J. Virol. 73:5001-5009;Durbin等人，1997,Virology 235:323-332)。
本發明提供包括根據本發明之核酸或載體的宿主細胞。在原核生物細胞中，產製含有MPV之聚合酶組份(或許是N、P、L和M2，但不一定僅限於此)的質體或病毒載體，以便在相關之細胞類型(細菌、昆蟲細胞、真核生物細胞)中表現該組份。將在原核生物細胞中產製含有MPV基因組之全長或部分副本的質體或病毒載體，以便在活體外或在活體內表現病毒的核酸。後者的載體可含有其他的病毒序列，以便產製嵌合型病毒或嵌合型病毒蛋白質，可缺乏一部分的病毒基因組，以便產製複製缺陷的病毒，並可含有突變、刪除或插入，以便產製減毒的病毒。
當根據上述應用已有之最高技術，共同-表現聚合酶組份時，可獲得有傳染性的MPV副本(為野外型、減毒的、複製缺陷的或嵌合型的)。
此外，可使用暫時或穩定地表現一或多個全長或一部分MPV蛋白質的真核生物細胞。可藉著轉移感染(蛋白質或核酸載體)、感染(病毒載體)或轉導作用(病毒載體)，製造這類細胞，並可用來補償所提及之野外型、減毒的、複製缺陷或嵌合型病毒。
4.4.1.欲插入之異源基因序列
根據本發明，可進一步設計本發明之病毒載體，表現異源序列。在本發明之具體實施例中，該異源序列係衍生自病毒載體以外的來源。舉例來說，但不限於編碼屬於與從其中衍生該病毒載體之間質肺病毒的物種、亞組或變種不同的物種、亞組或變種之病毒的抗原蛋白質、多肽或肽的異源序列。舉例來說，但不限於編碼間質肺病毒以外之病毒的抗原蛋白質、多肽或肽的異源序列。舉例來說，但不限於不是起源病毒的異源序列。根據該具體實施例，該異源序列可編碼具有想要之生物特性或活性的部分、肽、多肽或蛋白質。這類異源序列可編碼標籤或標記。這類異源序列可編碼生物反應修改物，其實例包括淋巴細胞活素、介白素、粒性細胞巨噬細胞菌落刺激因子和粒性細胞菌落刺激因子。
在某些具體實施例中，欲插入之異源核苷酸序列係衍生自間質肺病毒。更特定而言，欲插入之異源核苷酸序列係衍生自人類間質肺病毒及/或禽肺病毒。
在某些具體實施例中，該異源序列編碼PIV殼包核酸磷蛋白、PIV L蛋白質、PIV基質蛋白質、PIV HN蛋白質、PIV RNA-依賴性RNA聚合酶、PIV Y1蛋白質、PIV D蛋白質、PIV C蛋白質、PIV F蛋白質或PIV P蛋白質。在某些具體實施例中，該異源核苷酸序列編碼與PIV殼包核酸磷蛋白、PIVL蛋白質、PIV基質蛋白質、PIV HN蛋白質、PIV RNA-依賴性RNA聚合酶、PIV Y1蛋白質、PIV D蛋白質、PIV C蛋白質、PIV F蛋白質或PIV P蛋白質至少90%、至少95%、至少98%，或至少99%同種的蛋白質。可從PIV第1型、PIV第2型或PIV第3型中獲得該異源序列。在更特定的具體實施例中，從人類PIV第1型、PIV第2型或PIV第3型中獲得該異源序列。在其他的具體實施例中，該異源序列編碼RSV核蛋白、RSV磷蛋白、RSV基質蛋白質、RSV小忌水性蛋白質、RSV RNA-依賴性RNA聚合酶、RSV F蛋白質、RSV G蛋白質或RSV M2-1或M2-2蛋白質。在某些具體實施例中，該異源序列編碼與RSV核蛋白、RSV磷蛋白、RSV基質蛋白質、RSV小忌水性蛋白質、RSV RNA-依賴性RNA聚合酶、RSV F蛋白質或RSV G蛋白質至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同種的蛋白質。可從RSV A亞型和RSV B亞型中獲得該異源序列。在更特定的具體實施例中，從人類RSV A亞型和RSV B亞型中獲得該異源序列。在其他的具體實施例中，該異源序列編碼APV核蛋白、APV磷蛋白、APV基質蛋白質、APV小忌水性蛋白質、APV RNA-依賴性RNA聚合酶、APV F蛋白質、APV G蛋白質或APV M2-1或M2-2蛋白質。在某些具體實施例中，該異源序列編碼與APV核蛋白、APV磷蛋白、APV基質蛋白質、APV小忌水性蛋白質、APVRNA-依賴性RNA聚合酶、APVF蛋白質或APVG蛋白質至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同種的蛋白質。禽肺病毒可以是APV A亞組、APV B亞組或APV C亞組。在其他的具體實施例中，該異源序列編碼hMPV核蛋白、hMPV磷蛋白、hMPV基質蛋白質、hMPV小忌水性蛋白質、hMPVRNA-依賴性RNA聚合酶、hMPV F蛋白質、hMPV G蛋白質或hMP VM2-1或M2-2蛋白質。在某些具體實施例中，該異源序列編碼與hMPV核蛋白、hMPV磷蛋白、hMPV基質蛋白質、hMPV小忌水性蛋白質、hMPV RNA-依賴性RNA聚合酶、hMPV F蛋白質或hMPV G蛋白質至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同種的蛋白質。人類間質肺病毒可以是hMPV A1變種、hMPV A2變種、hMPV B1變種或hMPV B2變種。
在某些具體實施例中，可將得自PIV、RSV、人類間質肺病毒或禽肺病毒之不同異源序列的任何組合，插入本發明之病毒內。
在本發明某些較佳的具體實施例中，欲插入之異源核苷酸序列係衍生自得自RSV、PIV、APV或hMPV的F基因。
在某些具體實施例中，該異源核苷酸序列編碼嵌合型蛋白質。在更特定的具體實施例中，該異源核苷酸序列編碼RSV、PIV、APV或hMPV之嵌合型F蛋白質。嵌合型F蛋白質可包括得自不同病毒的部分F蛋白質，像是人類間質肺病毒、禽肺病毒、呼吸道融合細胞病毒和副流感病毒。在某些其他的具體實施例中，該異源序列編碼嵌合型G蛋白質。嵌合型G蛋白質包括得自不同病毒的部分G蛋白質，像是人類間質肺病毒、禽肺病毒、呼吸道融合細胞病毒和副流感病毒。在特定的具體實施例中，該F蛋白質包括間質肺病毒之F蛋白質的外功能部位、副流感病毒之F蛋白質的穿透膜功能部位，以及副流感病毒之F蛋白質的魯米那功能部位。在某些特定的具體實施例中，本發明之異源核苷酸序列是序列識別1號至序列識別5號、序列識別14號和序列識別15號中的任一個。在某些特定的具體實施例中，該核苷酸序列編碼序列識別6號至序列識別13號、序列識別16號和序列識別17號中任一個的蛋白質。
至於衍生自呼吸道融合細胞病毒的異源核苷酸序列，參見，例如PCT/US98/20230，將其全文以引用的方式併入本文中。
在較佳的具體實施例中，可在本發明之重組病毒中表現的異源基因序列，包括但不限於抗原性的抗原決定位，以及導致呼吸道疾病的病毒糖蛋白，像是流感糖蛋白，特別是血球凝集素H5、H7、呼吸道融合細胞病毒之抗原決定位、新城雞瘟病毒之抗原決定位、仙臺病毒和傳染性喉氣管炎病毒。在較佳的具體實施例中，該異源核苷酸序列係衍生自RSV或PIV。在本發明另一個具體實施例中，可設計成在本發明之嵌合型病毒內的異源基因序列，包括但不限於病毒抗原決定位和病毒糖蛋白，像是B型肝炎病毒表面抗原、愛氏頓病毒之A或C型肝炎病毒表面糖蛋白、人類乳頭狀瘤病毒、猿病毒5或流行性腮腺炎病毒、西尼羅河病毒(West Nile virus)、登革病毒(Dengue virus)之糖蛋白、疱疹病毒之糖蛋白、骨髓灰白質炎病毒之VPI，以及衍生自慢病毒(lentivirus)的序列，最好，但不限於人類免疫缺陷病毒(HIV)第1型或第2型。在另一個具體實施例中，可設計成在本發明之嵌合型病毒內的異源基因序列，包括但不限於馬立克氏(Marek's)病病毒(MDV)之抗原決定位、傳染性華氏囊炎病毒(IBDV)之抗原決定位、雞貧血病毒、傳染性喉氣管炎病毒(ILV)、禽流感病毒(AIV)、狂犬病、貓白血病病毒、犬瘟熱病毒、水疱性口炎病毒和豬痘病毒之抗原決定位(參見Fields等人(編輯)，1991,FUNDAMENTAL VIROLOGY，第2版，Raven Press,New York,將其全文以引用的方式併入本文中)。
本發明其他的異源序列，包括為自體免疫疾病所特有的抗原。這些抗原通常將衍生自哺乳動物組織的細胞表面、細胞質、核、粒線體及其類似物，包括糖尿病、多發性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、風濕性關節炎、惡性貧血、愛迪森氏(Addison's)病、硬皮病、自體免疫萎縮性胃炎、青少年糖尿病和盤狀紅斑性狼瘡所特有的抗原。
為過敏原之抗原通常包括蛋白質或糖蛋白，包括衍生自花粉、塵埃、黴、孢子、皮屑、昆蟲和食物的抗原。此外，為腫瘤抗原所特有的抗原，通常將衍生自腫瘤組織細胞的細胞表面、細胞質、核、胞器及其類似物。實例包括腫瘤蛋白質所特有的抗原，包括由突變之致癌基因編碼的蛋白質；與腫瘤有關之病毒蛋白質；以及糖蛋白。腫瘤包括，但不限於從下列類型之癌症衍生的那些：唇、鼻咽、咽和口腔、食道、胃、結腸、直腸、肝臟、膽囊、胰臟、喉、肺臟和支氣管、皮膚之黑色素瘤、乳房、子宮頸、卵巢、膀胱、腎臟、子宮、腦和神經系統的其他部分、甲狀腺、前列腺、睪丸、霍奇金氏(Hodgkin's)症、非-霍奇金氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤和白血病。
在本發明一個特定的具體實施例中，該異源序列係衍生自人類免疫缺陷病毒(HIV)，最好是人類免疫缺陷病毒-1或人類免疫缺陷病毒-2的基因組。在本發明其他的具體實施例中，可將該異源密碼序列插入病毒主鏈之基因密碼序列中，而得以表現在間質肺病毒蛋白質中，含有該異源肽序列的嵌合型基因產物。在本發明的這類具體實施例中，該異源序列亦可衍生自人類免疫缺陷病毒，最好是人類免疫缺陷病毒-1或人類免疫缺陷病毒-2的基因組。
在異源序列為HIV-衍生的案例中，這類序列可包括，但不限於衍生自env基因(即編碼全部或部分gp160、gp120及/或gp41之序列)、pol基因(即編碼全部或部分逆轉錄酶、核酸內切酶、蛋白酶及/或接合酶之序列)、gag基因(即編碼全部或部分p7、p6、p55、p17/18、p24/25之序列)、tat、rev、nef、vif、vpu、vpr及/或vpx的序列。
在其他的具體實施例中，可設計成在嵌合型病毒內的異源基因序列，包括編碼具有免疫強化活性之蛋白質的那些。免疫強化蛋白質的實例，包括但不限於細胞激動素、干擾素第1型、γ干擾素、菌落刺激因子和介白素-1、-2、-4、-5、-6、-12。
此外，其他可設計成在嵌合型病毒內的異源基因序列，包括衍生自細菌的抗原，像是細菌表面糖蛋白、衍生自真菌的抗原，以及衍生自各種其他病原和寄生蟲的抗原。衍生自細菌病原之異源基因序列的實例，包括但不限於衍生自下列屬之物種的抗原：沙門氏桿菌屬(Salmonella)、志賀桿菌屬(Shigella)、衣原體屬(Chlamydia)、螺桿菌屬(Helicobacter)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、博德氏菌屬(Bordatella)、假單孢菌屬(Pseudomonas)、奈瑟菌屬(Neisseria)、弧菌屬(Vibrio)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、黴漿菌屬(Mycoplasma)、鏈黴菌屬(Streptomyces)、密螺旋體屬(Treponema)、柯克斯體屬(Coxiella)、艾利希體屬(Ehrlichia)、布氏桿菌屬(Brucella)、鏈桿菌屬(Streptobacillus)、梭菌螺旋體屬(Fusospirocheta)、螺菌屬(Spirillum)、脲原體屬(Ureaplasma)、螺旋體屬(Spirochaeta)、黴漿菌屬、放線菌屬(Actinomycetes)、疏螺旋體屬(Borrelia)、類桿菌屬(Bacteroides)、奇可莫拉菌屬(Trichomoras)、布藍漢氏菌屬(Branhamella)、巴斯德菌屬(Pasteurella)、梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、李士德菌屬(Listeria)、桿菌屬(Bacillus)、丹毒絲菌屬(Erysipelothrix)、紅球菌屬(Rhodococcus)、埃希桿菌屬(Escherichia)、克雷伯氏桿菌屬(Klebsiella)、假單孢菌屬、腸桿菌屬(Enterobacter)、沙雷菌屬(Serratia)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、軍團菌屬(Legionella)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、變形桿菌屬(Proteus)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、腸球菌屬(Enterococcus)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、摩根菌屬(Morganella)、莫拉菌屬(Moraxella)、檸檬酸細菌屬(Citrobacter)、立克次體屬(Rickettsia)、羅查利馬氏體屬(Rochlimeae)，以及細菌物種，像是綠膿桿菌(P. aeruginosa)、大腸桿菌、蔥頭假單胞菌(P. cepacia)、表皮葡萄球菌(S. epidermis)、糞腸球菌(E. faecalis)、肺炎鏈球菌(S. pneumonias)、金黃色葡萄球菌(S. aureus)、腦膜炎奈瑟菌(N. meningitidis)、釀膿鏈球菌(S. pyogenes)、敗血性巴斯德桿菌(Pasteurella multocida)、梅毒螺旋體(Treponema pallidum)和奇異變形菌(P. mirabilis)。衍生自病原性真菌之異源基因序列的實例，包括但不限於衍生自下列真菌的抗原，像是：新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)；皮炎芽生黴菌(Blastomyces dermatitidis)；皮炎艾洛黴菌(Aiellomyces dermatitidis)；莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)；粗球黴菌(Coccidioides immitis)；念珠菌屬(Candida)物種，包括白色念珠菌(C. albicans)、熱帶念珠菌(C. tropicalis)、近平滑念珠菌(C. parapsilosis)、吉利蒙念珠菌(C. guilliermondii)和克魯斯念珠菌(C. krusei)，麴菌屬(Aspergillus)物種，包括煙麴菌(A. fumigatus)、黃麴菌(A. flavus)和黑麴菌(A. niger)，根黴菌屬(Rhizopus)物種；根毛黴菌屬(Rhizomucor)物種；克銀漢黴屬(Cunninghammella)物種；囊托黴菌屬(Apophysomyces)物種，包括沙氏囊托黴菌(A. saksenaea)、毛黴菌(A. mucor)和棘子鬚黴菌(A. absidia)；申克氏孢子絲菌(Sporothrix schenckii)、巴西副球黴菌(Paracoccidioides brasilie nsis)；波迪假黴樣真菌(Pseudallescheria boydii)、光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)；毛癬菌屬(Trichophyton)物種、小芽孢菌屬(Microsporum)物種和皮癬菌屬(Dermatophyres)物種，以及任何目前已知或稍後確認為病原性的其他酵母菌或真菌。
最後，衍生自寄生蟲之異源基因序列的實例，包括但不限於衍生自頂複動物門(Apicomplexa)之成員的抗原，像是例如焦蟲屬(Babesia)、弓漿蟲屬(Toxoplasma)、瘧原蟲屬(Plasmodium)、艾美球蟲屬(Eimeria)、等孢球蟲屬(Isospora)、阿托索漿蟲屬(Atoxoplasma)、囊等孢球蟲屬(Cystoisospora)、哈蒙蟲屬(Hammondia)、貝諾蟲屬(Besniotia)、肉孢子蟲屬(Sarcocystis)、福瑞克蟲屬(Frenkelia)、血變形蟲屬(Haemoproteus)、白血球孢子蟲屬(Leucocytozoon)、賽利爾梨漿蟲屬(Theileria)、普金蟲屬(Perkinsus)和孢子蟲屬(Gregarina spp.)；卡氏肺孢子蟲(Pneumocystis carinii)；微孢子門(Microspora)的成員，像是例如小孢子蟲屬(Nosema)、腸微孢子蟲屬(Enterocytozoon)、腦炎微孢子蟲屬(Encephalitozoon)、賽普塔塔蟲屬(Septata)、馬拉辛凱蟲屬(Mrazekia)、鈍孢子蟲屬(Amblyospora)、阿美森蟲屬(Ameson)、格留蟲屬(Glugea)、普孢子蟲屬(Pleistophora)和微孢子屬(Microsporidium spp.)；以及奇異孢子蟲門(Ascetospora)的成員，像是例如單孢子蟲屬(Haplosporidium spp.)，以及包括下列的物種：惡性瘧原蟲(Plasmodium falcipa-rum)、間日瘧原蟲(P.vivax)、卵形瘧原蟲(P.ovale)、三日瘧原蟲(P.malaria)；鼠弓漿蟲(Toxoplasma gondii)；墨西哥利什曼原蟲(Leishmania mexicana)、熱帶利什曼原蟲(L. tropica)、碩大利什曼原蟲(L. major)、埃塞俄比亞利什曼原蟲(L. aethiopica)、杜氏利什曼原蟲(L. donovani)、克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)、布氏錐蟲(T. brucei)、曼氏住血吸蟲(Schistosoma mansoni)、埃及住血吸蟲(S. haematobium)、日本住血吸蟲(S. japonium)；旋毛蟲(Trichinella spiralis)；班氏吳策絲蟲(Wuchereria bancrofti)；馬來布魯線蟲(Brugia malayli)；溶組織內阿米巴(Entamoeba histolytica)；蟯蟲(Enterobius vermiculoarus)；有鈎絛蟲(Taenia solium)、無鈎絛蟲(T. saginata)；陰道滴蟲(Trichomonas vaginatis)、人滴蟲(T. hominis)、口腔毛滴蟲(T. tenax)；腸梨形蟲(Giardia lamblia)；短小隱孢子蟲(Cryptosporidium parvum)；卡氏肺孢子蟲、牛焦蟲(Babesia bovis)、分歧焦蟲(B. divergens)、田鼠焦蟲(B. microti)、貝氏等孢球蟲(Isospora belli)、人焦蟲(L. Hominis)；脆弱雙核阿米巴(Dientamoeba fragilis)；人盤尾絲蟲(Onchocerca volvulus)；人蛔蟲(Ascaris lumbricoides)；美洲鈎蟲(Necator americanis)；十二指腸鈎蟲(Ancylostoma duodenale)；糞類圓線蟲(Strongyloidesster-coralis)；菲律賓毛細線蟲(Capillaria philippinensis)；廣東血管圓線蟲(Angiostrongylus cantonensis)；短小包膜絛蟲(Hymenolepis nana)；闊節裂頭絛蟲(Diphy-llobothriumlatum)；細粒棘球絛蟲(Echinococcus granulosus)、多房型棘球絛蟲(E. multilocularis)；衛氏并殖吸蟲(Paragonimuswestermani)、卡列并殖吸蟲(P. caliensis)；中華後睪吸蟲(Clonorchis sinensis)；貓後睪吸蟲(Opisthorchis felineas)、維氏囊腹雙口吸蟲(G. viverini)、肝蛭(Fasciola hepatica)、疥癬蟲(Sarcoptes scabiei)、人蝨(Pediculus humanus)；陰蝨(Phthirlus pubis)和人膚蠅(Dermatobia hominis)，以及任何目前已知或稍後確認為病原性的其他寄生蟲。
4.4.2.異源基因序列的插入
可藉著以異源序列完全置換病毒之密碼區，或藉著部分置換，或藉著將異源核苷酸序列加至病毒基因組中，完成將外來基因序列插入本發明之病毒載體內的作用。完全置換可能最好是經由使用PCR-指定之突變生成作用來完成。簡言之，PCR-引子A，從5'至3'端，將含有：獨特的限制酵素位置，像是第IIS級的限制酵素位置(即"轉移者(shifter)"酵素；它認得特定的序列，但切開在該序列上游或下游的DNA)；一片與待置換之基因區互補的核苷酸；以及一片與異源序列之羧基- 端密碼部分互補的核苷酸。PCR-引子B，從5'至3'端，將含有：獨特的限制酵素位置；一片與待置換之基因互補的核苷酸；以及一片與異源或非-天然基因之5'密碼部分互補的核苷酸。在使用這些引子與異源或非-天然基因之選殖副本的PCR反應之後，可切除產物，並使用獨特的限制位置選殖。以第IIS級的酵素消化，並利用經過純化之噬菌體聚合酶轉錄，將產生含有病毒基因之正確未轉譯末端，其現在帶有異源或非-天然基因的插入。在另一個具體實施例中，可使用PCR-誘發的反應，來製備含有噬菌體啟動基因序列和雜種基因序列的雙股DNA，而得以直接轉錄模板，不需選殖。
可將異源核苷酸序列加入或插入本發明之病毒的各種位置。在一個具體實施例中，將異源核苷酸序列加入或插入位置1。在另一個具體實施例中，將異源核苷酸序列加入或插入位置2。在另一個具體實施例中，將異源核苷酸序列加入或插入位置3。在另一個具體實施例中，將異源核苷酸序列加入或插入位置4。在另一個具體實施例中，將異源核苷酸序列加入或插入位置5。在另一個具體實施例中，將異源核苷酸序列加入或插入位置6。當在本文中使用"位置"一詞時，意指在該異源核苷酸序列在待轉錄之病毒基因組上的位置，例如，位置1意指它是第一個待轉錄的基因，而位置2意指它是第二個待轉錄之基因。在病毒之較低-編號位置處插入異源核苷酸序列，與在較高-編號位置處的插入相比較，通常產生較強的異源核苷酸序列表現，是因為跨越病毒基因組存在的轉錄梯度。然而，轉錄梯度亦產生特定比例的病毒mRNAs。外來基因的插入將擾亂這些比例，並導致不同量之病毒蛋白質的合成，其可能影響病毒的複製。因此，在選擇插入位置時，必須考量轉錄梯度和複製動力學。若想要異源核苷酸序列的強表現，在較低-編號的位置處插入異源核苷酸序列，是本發明較佳的具體實施例。在較佳的具體實施例中，在位置1、2或3處加入或插入異源序列。
當將異源核苷酸序列插入本發明之病毒內時，可改變在異源基因之密碼序列末端與下游基因之密碼序列起點之間的基因間區域，而達到想要的效果。當在本文中使用"基因間區域"一詞時，意指在一個基因之中止信號與下一個下游開放編閱架構之密碼序列的起始密碼子(例如AUG)之間的核苷酸序列。基因間區域可包括基因的非-密碼區，即是在轉錄開始位置與基因之密碼序列的起點(AUG)之間。該非-密碼區天然存在於一些病毒基因中。
在各種具體實施例中，可彼此獨立地設計在異源核苷酸序列與下游基因之間的基因間區域，使其長度為至少10個核苷酸、至少20個核苷酸、至少30個核苷酸、至少50個核苷酸、至少75個核苷酸、至少100個核苷酸、至少125個核苷酸、至少150個核苷酸、至少175個核苷酸或至少200個核苷酸。在某些具體實施例中，可彼此獨立地設計在異源核苷酸序列與下游基因之間的基因間區域，使其長度為最多10個核苷酸、最多20個核苷酸、最多30個核苷酸、最多50個核苷酸、最多75個核苷酸、最多100個核苷酸、最多125個核苷酸、最多150個核苷酸、最多175個核苷酸或最多200個核苷酸。在各種具體實施例中，亦可彼此獨立地設計在病毒基因組中想要基因的非-密碼區，使其長度為至少10個核苷酸、至少20個核苷酸、至少30個核苷酸、至少50個核苷酸、至少75個核苷酸、至少100個核苷酸、至少125個核苷酸、至少150個核苷酸、至少175個核苷酸或至少200個核苷酸。在某些具體實施例中，亦可彼此獨立地設計在病毒基因組中想要基因的非-密碼區，使其長度為最多10個核苷酸、最多20個核苷酸、最多30個核苷酸、最多50個核苷酸、最多75個核苷酸、最多100個核苷酸、最多125個核苷酸、最多150個核苷酸、最多175個核苷酸或最多200個核苷酸。
當插入異源核苷酸序列時，可合併使用位置的影響和基因間區域的操縱，以便達到想要的效果。例如，可在選自由位置1、2、3、4、5和6處所組成之群的位置，加入或插入異源核苷酸序列，並可改變在異源核苷酸序列與下一個下游基因之間的基因間區域(參見表3)。藉著在表3中的舉例說明，出示本發明所包括的一些組合。
依據插入異源核苷酸序列之目的(例如具有強的免疫原性)，可藉著各種指標來判定插入的位置和所插入之異源核苷酸序列的基因間區域之長度，包括但不限於複製動力學，以及藉著下列非-限制性的測定實例，測量到的蛋白質或mRNA表現程度：溶菌斑測定、螢光-焦點測定、感染中心測定、轉化測定、終點稀釋測定、電鍍效力、電子顯微鏡、血球凝集作用、病毒酵素活性的測量、病毒中和作用、血球凝集抑制作用、補體固定、免疫染色、免疫沉澱和免疫墨點、酵素連接之免疫吸附測定、核酸檢測(例如南方墨點分析、北方墨點分析、西方墨點分析)、生長曲線、報告者基因的使用(例如使用報告者基因，像是綠螢光蛋白質(GFP)或增強的綠螢光蛋白質(eGFP)，整合到病毒基因組，以與感興趣之異源基因相同的方式，觀察蛋白質表現)，或其組合。進行這些測定的程序，為此項技藝中已熟知的(參見，例如Flint等人，PRINCIPLES OF VIROLOGY,MOLECULAR BIOLOGY,PATHOGENESIS,ANDCONTROL,2000,ASM Press第25-56頁，將全文以引用的方式併入本文中)，並在下文的實例章節中，提供非-限制性的實例。
例如，可藉著以本發明之病毒感染培養的細胞，並接著藉著例如西方墨點分析或ELISA，使用對該異源序列之基因產物專一的抗體，測量蛋白質的表現程度，或藉著北方墨點分析，使用對該異源序列專一的探針，測量RNA的表現程度，來判定表現程度。同樣地，可藉著感染動物模式，並在該動物模式中，測量來自本發明之重組病毒的異源序列的蛋白質表現程度，來判定該異源序列的表現程度。可藉著從被感染的動物中獲得組織試樣，然後使該組織試樣接受西方墨點分析或ELISA，使用對該異源序列之基因產物專一的抗體，來測量蛋白質的含量。此外，若使用動物模式，便可藉著任何熟諳此藝者已知的技術，包括但不限於ELISA，來判定該動物對異源序列之基因產物所產生之抗體的力價。
因為異源序列可以是與在病毒之基因組中的核苷酸序列同種的，故應小心地採用確實對該異源序列或其基因產物專一的探針和抗體。
在某些特定的具體實施例中，可藉著熟諳此藝者已知的任何技術，判定來自嵌合型禽-人類間質肺病毒之hMPV的F-蛋白質之表現程度。可藉著以本發明之嵌合型病毒，感染培養的細胞，並藉著例如西方墨點分析或ELISA，使用對hMPV之F-蛋白質及/或G-蛋白質專一的抗體，測量蛋白質的表現程度，或藉著例如北方墨點分析，使用對人類間質肺病毒之F-基因及/或G-基因專一的探針，測量RNA的表現程度，來判定F-蛋白質的表現程度。同樣地，可使用動物模式，藉著感染動物，並在該動物模式中，測量F-蛋白質及/或G-蛋白質的含量，來判定該異源序列的表現程度。可藉著從被感染的動物中獲得組織試樣，然後使該組織試樣接受西方墨點分析或ELISA，使用對該異源序列之F-蛋白質及/或G-蛋白質專一的抗體，來測量蛋白質的含量。此外，若使用動物模式，便可藉著任何熟諳此藝者已知的技術，包括但不限於ELISA，來判定該動物對F-蛋白質及/或G-蛋白質所產生之抗體的力價。
可藉著熟諳此藝者已知的任何技術，判定本發明之重組病毒的複製速率。
在某些具體實施例中，欲更容易地確認異源序列在病毒基因組中的最佳位置，以及基因間區域的最佳長度，可使該異源序列編碼報告者基因。一旦決定最佳的參數，便由編碼所選出之抗原的異源核苷酸序列代替該報告者基因。在本發明之方法中，可使用任何熟諳此藝者已知的報告者基因。關於更多的細節，參見4.7.13節。
可藉著任何熟諳此藝者已知的標準技術，判定重組病毒的複製速率。可以病毒的生長速率表示複製速率，並可藉著將病毒力價對感染後的時間作圖，來判定之。可藉著任何熟諳此藝者已知的技術，測量病毒力價。在某些具體實施例中，將含有病毒的懸浮液與易被該病毒感染的細胞一起培養。可在本發明之方法中使用的細胞類型，包括但不限於Vero細胞、LLC-MK-2細胞、Hep-2細胞、LF1043(HEL)細胞、MRC-5細胞、WI-38細胞、tMK細胞、293細胞、QT6細胞、QT 35細胞或雞胚纖維母細胞(CEF)。在將病毒與細胞一起培養之後，判定被感染細胞的數目。在某些特定的具體實施例中，病毒包括報告者基因。因此，表現報告者基因之細胞的數目，代表被感染細胞的數目。在特定的具體實施例中，病毒包括編碼eGFP的異源核苷酸序列，並使用FACS判定表現eGFP之細胞的數目，即被該病毒感染之細胞的數目。
在某些具體實施例中，本發明之重組病毒的複製速率，最多是在相同條件下，從其中衍生該重組病毒之野外型病毒的複製速率的20%。相同的條件意指相同的開始病毒力價、相同的細胞品系、相同的培養溫度、生長培養基、細胞數目，以及其他可能影響複製速率的試驗條件。例如，在位置1處帶有PIV之F基因的APV/hMPV的複製速率，最多是APV之複製速率的20%。
在某些具體實施例中，本發明之重組病毒的複製速率，最多是在相同條件下，從其中衍生該重組病毒之野外型病毒的複製速率的5%、最多10%、最多20%、最多30%、最多40%、最多50%、最多75%、最多80%、最多90%。在某些具體實施例中，本發明之重組病毒的複製速率，至少是在相同條件下，從其中衍生該重組病毒之野外型病毒的複製速率的5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少75%、至少80%、至少90%。在某些具體實施例中，本發明之重組病毒的複製速率，是在相同條件下，從其中衍生該重組病毒之野外型病毒的複製速率的5%到20%之間、10%到40%之間、25%到50%之間、40%到75%之間、50%到80%之間，或75%到80%之間。
在某些具體實施例中，在本發明之重組病毒中的異源序列的表現程度，最多是在相同條件下，從其中衍生該重組病毒之野外型病毒的F-蛋白質之表現程度的20%。相同的條件意指相同的開始病毒力價、相同的細胞品系、相同的培養溫度、生長培養基、細胞數目，以及其他可能影響複製速率的試驗條件。例如，在hMPV之位置1處，PIV3之F-蛋白質的異源序列的表現程度，最多是hMVP之F-蛋白質的表現程度的20%。
在某些具體實施例中，在本發明之重組病毒中的異源序列的表現程度，最多是在相同條件下，從其中衍生該重組病毒之野外型病毒的F-蛋白質之表現程度的5%、最多10%、最多20%、最多30%、最多40%、最多50%、最多75%、最多80%、最多90%。在某些具體實施例中，在本發明之重組病毒中的異源序列的表現程度，至少是在相同條件下，從其中衍生該重組病毒之野外型病毒的F-蛋白質之表現程度的5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少75%、至少80%、至少90%。在某些具體實施例中，在本發明之重組病毒中的異源序列的表現程度，是在相同條件下，從其中衍生該重組病毒之野外型病毒的F-蛋白質之表現程度的5%到20%之間、10%到40%之間、25%到50%之間、40%到75%之間、50%到80%之間，或75%到90%之間。
4.4.3.將異源基因序列插入G基因內
G蛋白質是間質肺病毒的穿透膜蛋白質。在特定的具體實施例中，將該異源序列插入編碼外功能部位之G-ORF的區域內，而得以在病毒被膜的表面上表現它。在一種方法中，可將異源序列插入抗原位置內，不刪除任何病毒的序列。在另一種方法中，以異源序列置換G-ORF之序列。這類構築體的表現產物，可用在對抗外來抗原的疫苗中，且確實可規避重組病毒在接種疫苗之宿主中繁殖的問題。僅在抗原位置發生取代的完整G分子，仍可給予G功能，並因此容許建構可存活的病毒。因此，該病毒不需添加額外的協助者功能便可生長。亦可以其他方式將該病毒減毒，以避免任何意外逃脫的危險。
可進行其他的雜種建構，在細胞表面表現蛋白質，或得以從細胞中釋放它們。
4.4.4.二順反子之RNA的建構
可建構二順反子的mRNA，容許從內部開始病毒序列的轉譯，並容許從正常的終端開始位置，表現外來蛋白質之密碼序列。或者，可建構二順反子的mRNA序列，其中從正常終端的開放編閱架構，轉譯病毒序列，而從內部位置開始外來序列。可使用某些內部的核糖體進入位置(IRES)序列。應選擇短得足以避免干擾MPV之包裝限制的IRES序列。因此，為這類二順反子方法所選出的IRES，長度最好不超過500個核苷酸。在特定的具體實施例中，該IRES係衍生自細小核糖核酸病毒，且不包括任何額外的細小核糖核酸病毒之序列。較佳的IRES元件包括，但不限於哺乳動物BiP IRES和C型肝炎病毒IRES。
或者，可從新的內部轉錄單位來表現外來蛋白質，其中該轉錄單位具有開始位置和聚腺苷酸化作用位置。在另一個具體實施例中，將外來基因插入MPV基因內，使得所得的表現蛋白質為融合蛋白質。
4.5.使用重組的cDNA和RNA模板，表現異源基因產物
可使用按照上述製備的病毒載體和重組模板，以各種方式在適當的宿主細胞中，表現異源基因產物，或創造表現該異源基因產物的嵌合型病毒。在一個具體實施例中，可使用重組的cDNA，轉移感染適當的宿主細胞，而所得的RNA可以高程度指揮該異源基因產物的表現。提供高程度表現之宿主細胞系統，包括供應病毒功能的連續細胞株，像是分別以APV或MPV重複感染的細胞株、設計補足APV或MPV功能的細胞株等等。
在本發明另一個具體實施例中，可使用重組模板，轉移感染表現病毒聚合酶蛋白質的細胞株，以便達成該異源基因產物的表現。為了這個目的，可利用表現聚合酶蛋白質，像是L蛋白質的轉化細胞株，作為適當的宿主細胞。可以類似的方式設計宿主細胞，提供其他的病毒功能，或額外的功能，像是G或N。
在其他的具體實施例中，協助者病毒可提供由細胞利用的RNA聚合酶蛋白質，以便達成該異源基因產物的表現。在另一個具體實施例中，可利用編碼病毒蛋白質，像是N、P、L和M2-1蛋白質的載體，轉移感染細胞。
4.6.解救重組的病毒顆粒
為了製備本發明之嵌合型和重組病毒，可使用編碼本發明之重組或嵌合型病毒之基因組的cDNA，以+或-義轉移感染提供複製和解救所需之病毒蛋白質和功能的細胞。或者，可在藉著編碼本發明之重組病毒的DNA或RNA分子轉移感染之前、期間或之後，以協助者病毒轉移感染細胞。可藉著幾個熟諳此藝者已知的技術，按照在1992年11月24日發證之美國專利第5,166,057號；在1998年12月29日發證之美國專利第5,854,037號；在1996年2月20日發表之歐洲專利公開案EP 0702085A1；在美國專利申請案第09/152,845號；在1997年4月3日發表之國際專利公開案PCT WO 97/12032；在1996年11月7日發表之WO 96/34625；在歐洲專利公開案EP-A 780475；在1999年1月21日發表之WO 99/02657；在1998年11月26日發表之WO 98/53078；在1998年1月22日發表之WO 98/02530；在1999年4月1日發表之WO 99/15672；在1998年4月2日發表之WO 98/13501；在1997年2月20日發表之WO 97/06270；以及在1997年6月25日發表之EPO 780 47SA1中的描述，分別將其全文以引用的方式併入本文中，在傳染性病毒顆粒內複製並解救本發明之合成的重組質體DNAs和RNAs。
在本發明的一個具體實施例中，可製備合成的重組病毒RNAs，其含有由病毒聚合酶認出，以及產製成熟病毒粒子所需之包裝信號所必要的負股病毒RNA之非密碼區。可使用許多不同的方法，將逆向遺傳法應用在解救負股RNA病毒上。首先，從重組的DNA模板中合成重組的RNAs，並在活體外利用經過純化的病毒聚合酶複合物重建，形成重組的核糖核蛋白(RNPs)，可用它來轉移感染細胞。在另一種方法中，若在活體外或在活體內，在合成RNAs的轉錄期間出現病毒的聚合酶蛋白質，則達成更有效的轉移感染。利用該方法，可從cDNA質體轉錄合成的RNAs，其在活體外與編碼聚合酶蛋白質之cDNA質體共同-轉錄，或在活體內，在聚合酶蛋白質的存在下轉錄，即在暫時性或在組成上表現聚合酶蛋白質的細胞中。
在本文描述的其他方法中，可在表現間質肺病毒聚合酶蛋白質的宿主細胞系統中(例如，在病毒/宿主細胞表現系統中；設計成表現聚合酶蛋白質之經過轉化的細胞株，等等)，重複有傳染性之嵌合型病毒的產製，而得以解救有傳染性之嵌合型或重組病毒。在該例子中，不需使用協助者病毒，因為藉著所表現之病毒聚合酶蛋白質，提供該功能。
根據本發明，可使用任何熟諳此藝者已知的技術，達成重組和嵌合型病毒的複製和解救。一種方法涉及在轉移感染宿主細胞之前，在活體外供應複製所需的病毒蛋白質和功能。在這類的具體實施例中，可以野外型病毒、協助者病毒、經過純化之病毒蛋白質，或以重組表現之病毒蛋白質的形式，提供病毒蛋白質。可在編碼嵌合型病毒之合成cDNAs或RNAs的轉錄之前、期間或之後，提供病毒蛋白質。可使用整個混合物來轉移感染宿主細胞。在另一種方法中，可在編碼嵌合型病毒之合成cDNAs或RNAs的轉錄之前或期間，提供複製所需之病毒蛋白質和功能。在這類的具體實施例中，可以野外型病毒、協助者病毒、病毒萃取物、合成之cDNAs或RNAs，其經由感染或轉移感染導入宿主細胞內，來表現病毒蛋白質的形式，提供病毒蛋白質。該感染/轉移感染，係在導入編碼嵌合型病毒之合成cDNAs或RNAs之前，或與其同時發生。
在特別想要的方法中，設計細胞使其表現本發明之嵌合型或重組病毒的所有基因，即APV、MPV、MPV/APV或APV/MPV，結果可能產生有傳染性的病毒，其含有想要的基因型；因此排除了對選擇系統的需求。在理論上，可利用外來序列代替編碼MPV之結構蛋白質的任一個OPFs，或任一個ORFs的一部分。然而，該等式的必要部分為繁殖有缺陷之病毒的能力(因為漏掉或改變正常的病毒基因產物而變成有缺陷的)。可利用許多可能的方法，規避該問題。在一種方法中，可使具有突變蛋白質的病毒生長在細胞株中，將該細胞株建構成，或使其在組成上表現相同蛋白質之野外型版本。以此方式，使該細胞株補足了病毒中的突變。可使用類似的技術，建構經過轉化的細胞株，使其在組成上表現任何的MPV基因。可使用這些能夠表現病毒蛋白質的細胞株，補足在嵌合型或重組病毒中的缺陷，並藉此繁殖它。或者，可利用某些天然的宿主排列系統，來繁殖嵌合型或重組病毒。
在另一個具體實施例中，可以合成的cDNAs或RNAs之形式，作為遺傳材料，來供應複製所需之病毒蛋白質和功能，使其與編碼嵌合型病毒的合成cDNA或RNAs共同-轉錄。在特別想要的方法中，將表現嵌合型病毒和病毒聚合酶，及/或其他病毒功能的質體，共同-轉移感染到宿主細胞內。例如，可將編碼基因組或反基因組之APV、MPV、MPV/APV或APV/MPVRNA，有或無一或多個異源序列的質體，與編碼間質肺病毒聚合酶蛋白質N、P、L或M2-1的質體，共同-轉移感染到宿主細胞內。或者，可藉著使用編碼T7 RNA聚合酶之經過修改的疫苗病毒安卡拉(Modified Vaccinia Virus Ankara)(MVA)，或MVA與編碼聚合酶蛋白質(N、P和L)之質體的組合，達成本發明之重組病毒的解救。例如，可將MVA-T7或禽痘-T7感染到Vero細胞、LLC-MK-2細胞、Hep-2細胞、LF 1043(HEL)細胞、tMK細胞、LLC-MK2細胞、HUT 292、FRHL-2(恆河猴)、FCL-1(綠猴)、WI-38(人類)、MRC-5(人類)細胞、293 T細胞、QT 6細胞、QT 35細胞和CEF細胞內。在以MVA-T7或禽痘-T7感染之後，可將編碼本發明之重組病毒的全長反基因組cDNA與編碼N、P、L和M2-1之表現質體，一起轉移感染到細胞內。或者，可藉著質體轉移作用，提供聚合酶。接著可收獲細胞和細胞上清液，並接受單次的冷凍-融解。然後可使用所得的細胞溶胞產物，在1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶(ara C)，一種疫苗病毒之複製抑制劑的存在下，感染新鮮的HeLa或Vero細胞單層，產生病毒母液。然後從這些培養盤中收獲上清液和細胞，冷凍-融解一次，並藉著病毒溶菌斑的免疫染色，使用對特定病毒專一的抗血清，測定本發明之重組病毒顆粒的存在。
其他繁殖嵌合型或重組病毒的方法，可能涉及與野外型病毒共同-培養。這可藉著簡單地取得重組的病毒，並以該病毒和其他野外型病毒共同-感染細胞來進行。野外型病毒應該補足有缺陷的病毒基因產物，並容許野外型和重組病毒兩者生長。或者，可使用協助者病毒，供應重組病毒的繁殖。
在另一種方法中，可在以表現間質肺病毒聚合酶蛋白質之重組病毒共同-感染的細胞中，複製合成的模板。事實上，可使用該方法，根據本發明來解救重組有傳染性的病毒。為了這個目的，可在任何表現載體/宿主細胞系統，包括但不限於病毒表現載體(例如疫苗病毒、腺病毒、桿狀病毒等等)，或表現聚合酶蛋白質的細胞株中，表現間質肺病毒聚合酶蛋白質(參見，例如Krystal等人，1986,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2709-2713)。再者，表現所有間質肺病毒蛋白質之宿主細胞的感染，可能導致有傳染性之嵌合型病毒顆粒的產生。請注意有可能建構不改變病毒存活力的重組病毒。這些經過改變的病毒將能夠生長，且不需協助者的功能便可複製。
轉移感染的程序為熟諳此藝者已熟知的，包括但不限於DEAE-葡聚醣-調解、磷酸鈣-調解、電穿透作用和微脂粒-調解的轉移感染。
可從數個較小的PCR片段，裝配全長的病毒基因組。在圖28中出示hMPV之不同分離株的限制輿圖。可使用該限制位置裝配全長的構築體。在某些具體實施例中，設計PCR引子，使得由PCR反應所產生之片段具有接近其5'端的限制位置，以及接近其3'端的限制位置。然後可利用個別的限制酵素消化該PCR產物，接著連接相鄰的PCR片段。
4.7.重組病毒的減毒
可進一步以遺傳方式設計本發明的重組病毒，以便表現出減毒的表現型。特別是在對其投予作為疫苗之病毒的個體中，本發明之重組病毒表現出減毒的表現型。可藉著任何熟諳此藝者已知的方法，完成減毒作用。未與理論結合，例如，可藉著在預定之宿主中，使用天生不能完美複製的病毒(例如在人類中使用APV)，或藉著相對於該病毒之野外型品系，降低基因組的複製、降低病毒感染宿主細胞的能力，或降低病毒蛋白質裝配成有傳染性之病毒顆粒的能力，而引起重組病毒的減毒表現型。可使用迷你基因組(minigenome)測定(參見4.5.1節)，測試病毒某些序列，像是前導和拖尾序列的存活力。
可藉著任何熟諳此藝者已知的方法(參見，例如4.8節)，來測試本發明之重組病毒的減毒表現型。例如，可針對其感染宿主的能力，或在細胞培養系統中複製的速率，來測試候選病毒。在某些具體實施例中，當被改變之基因為N、P、L、M2、F、G、M2-1、M2-2或其組合時，使用迷你基因組系統，測試減毒的病毒。在某些具體實施例中，使用在不同溫度下的生長曲線，測試減毒的病毒。例如，減毒的病毒能夠在35℃下生長，但不能在39或40℃下生長。在某些具體實施例中，可使用不同的細胞株，評估病毒的減毒表現型。例如，減毒的病毒僅能在猴子細胞株中生長，但不能在人類細胞株中生長，或對減毒之病毒而言，在不同細胞株中可獲得的病毒力價是不同的。在某些具體實施例中，使用在小動物模式的呼吸道中複製的病毒，包括但不限於倉屬鼠、棉鼠、老鼠和天竺鼠，來評估病毒的減毒表現型。在其他的具體實施例中，使用由該病毒引起的免疫反應，包括但不限於抗體力價(例如，藉著溶菌斑降低中和測定或ELISA來測定)，評估病毒的減毒表現型。在特定的具體實施例中，以低劑量進行溶菌斑降低中和測定或ELISA。在某些具體實施例中，可測試重組病毒在動物模式中誘發病理學徵候的能力。病毒在動物模式中降低誘發病理學徵候的能力，代表它的減毒表現型。在特定的具體實施例中，在猴子模式中對鼻感染測試候選的病毒，並藉著黏液的產生表示。
可將本發明之病毒減毒，而使得病毒的一或多個功能特徵受損。在某些具體實施例中，與從其中衍生該減毒病毒的病毒之野外型品系相比較，來測量減毒作用。在其他的具體實施例中，藉著比較減毒病毒在不同宿主系統中的生長，來判定減毒作用。因此，關於非-限制性的實例，與APV在禽類宿主中的生長相比較，若降低了APV在人類宿主中的生長，便將在人類宿主中生長的APV稱為減毒的。
在某些具體實施例中，本發明之減毒病毒能夠感染宿主，能夠在宿主中複製，而得以產生有傳染性的病毒顆粒。然而，與野外型品系相比較，減毒的品系生長至較低的力價，或生長得更慢。可使用任何熟諳此藝者已知的技術，判定減毒病毒的生長曲線，並將其與野外型病毒的生長曲線相比較。關於代表性的方法，參見下文的實例章節。在特定的具體實施例中，減毒的病毒在按照實例22中描述的條件下，在Vero細胞中，生長至低於105 pfu/毫升、低於104 pfu/毫升、低於103 pfu/毫升，或低於102 pfu/毫升的力價。
在某些具體實施例中，本發明之減毒病毒(例如嵌合型哺乳動物MPV)在人類細胞中，不能像野外型病毒(例如野外型哺乳動物MPV)一樣好地複製。然而，減毒的病毒能夠在缺乏干擾素功能的細胞株，像是Vero細胞中良好地複製。
在其他的具體實施例中，本發明之減毒病毒能夠感染宿主、在宿主中複製，並使本發明之病毒的蛋白質插入細胞質膜內，但減毒病毒不能使宿主產生新的有傳染性的病毒顆粒。在某些具體實施例中，減毒病毒以與野外型哺乳動物病毒相同的效力，感染宿主、在宿主中複製，並使病毒蛋白質插入宿主的細胞質膜內。在其他的具體實施例中，與野外型病毒相比較，減毒病毒降低了使待插入細胞質膜內之病毒蛋白質進入宿主細胞內的能力。在某些具體實施例中，與野外型病毒相比較，減毒的哺乳動物病毒降低了在宿主中複製的能力。可使用任何熟諳此藝者已知的技術，判定病毒是否能夠感染哺乳動物細胞、在宿主內複製，並使病毒蛋白質插入宿主的細胞質膜內。關於解釋性的方法，參見4.8節。
在某些具體實施例中，本發明之減毒病毒能夠感染宿主。然而，與野外型哺乳動物MPV相反，減毒的哺乳動物MPV不能在宿主中複製。在特定的具體實施例中，減毒的哺乳動物病毒可感染宿主，並可使宿主將病毒蛋白質插入其細胞質膜內，但減毒病毒不能在宿主中複製。可使用任何熟諳此藝者已知的方法，測試減毒的哺乳動物MPV是否感染宿主細胞，並使宿主將病毒蛋白質插入其細胞質膜內。
在某些具體實施例中，與野外型病毒感染相同宿主的能力相比較，減毒的哺乳動物病毒降低了感染宿主的能力。可使用任何熟諳此藝者已知的技術，判定病毒是否能夠感染宿主。關於解釋性的方法，參見4.8節。
在某些具體實施例中，將突變(例如錯義突變)導入病毒的基因組內，產生具有減毒表現型的病毒。可將突變(例如錯義突變)導入重組病毒的N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因或L-基因內。突變可以是添加、取代、刪除或其組合。在特定的具體實施例中，導入N、P、L、F、G、M2-1、M2-2或M2蛋白質的單一胺基酸刪除突變，可在迷你-基因組測定系統中，就官能度來篩選之，並在病毒中評估預期的官能度。在更特定的具體實施例中，錯義突變是感冷性的突變。在其他的具體實施例中，錯義突變是感熱性的突變。在一個具體實施例中，移除病毒之P蛋白質的主要磷酸化作用位置。在另一個具體實施例中，將突變或突變們導入病毒的L基因內，產生感溫性的品系。在另一個具體實施例中，以不發生切開，或以極低之效率發生切開的方式，使F基因之切開位置產生突變。
在其他的具體實施例中，在重組病毒的基因組中導入刪除。在更特定的具體實施例中，可將刪除導入重組病毒的N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因或L-基因內。在特定的具體實施例中，該刪除是在本發明之重組病毒的M2-基因中。在其他特定的具體實施例中，該刪除是在本發明之重組病毒的SH-基因中。在另一個特定的具體實施例中，刪除M2-基因和SH-基因兩者。
在某些具體實施例中，修改重組病毒的基因間區域。在一個具體實施例中，改變基因間區域的長度。在另一個具體實施例中，從病毒基因組的5'至3'，將基因間區域洗牌。
在其他的具體實施例中，改變重組病毒之基因或基因們的基因組位置。在一個具體實施例中，將F或G基因移至基因組的3'端。在另一個具體實施例中，將N基因移至基因組的5'端。
在某些具體實施例中，藉著以不同物種、不同亞組或不同變種之病毒的基因，代替野外型病毒的基因，達成病毒的減毒作用。在解釋性的具體實施例中，可利用APV的N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因或L-基因，分別代替MPV的N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因或L-基因。在其他解釋性的具體實施例中，可利用哺乳動物MPV的N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因或L-基因，分別代替APV的N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因或L-基因。在較佳的具體實施例中，藉著以不同物種之病毒的基因，代替一或多個與聚合酶有關之基因(例如N、P、L或M2)，達成病毒的減毒作用。
在某些具體實施例中，藉著以衍生自不同物種之病毒之相對應蛋白質的功能部位，代替一或多個野外型病毒之蛋白質的特定功能部位，達成病毒的減毒作用。在解釋性的具體實施例中，以哺乳動物MPV之F蛋白質的外功能部位，代替APV之F蛋白質的外功能部位。在較佳的具體實施例中，以衍生自不同物種之病毒之相對應蛋白質的功能部位，代替一或多個L、N或P蛋白質的特定功能部位。在某些其他的具體實施例中，藉著刪除一或多個野外型病毒之蛋白質的特定功能部位，達成病毒的減毒作用。在特定的具體實施例中，刪除F-蛋白質的穿透膜功能部位。
在本發明的某些具體實施例中，可修改本發明之重組病毒的前導及/或拖尾序列，獲得減毒的表現型。在某些較特定的具體實施例中，相對於野外型病毒，減少前導及/或拖尾序列的長度至少1個核苷酸、至少2個核苷酸、至少3個核苷酸、至少4個核苷酸、至少5個核苷酸，或至少6個核苷酸。在某些其他更特定的具體實施例中，使重組病毒之前導及/或拖尾的序列發生突變。在特定的具體實施例中，前導和拖尾序列是彼此100%互補的。在其他的具體實施例中，前導和拖尾序列中有1個核苷酸、2個核苷酸、3個核苷酸、4個核苷酸、5個核苷酸、6個核苷酸、7個核苷酸、8個核苷酸、9個核苷酸或10個核苷酸不是彼此互補的，但剩下的核苷酸是彼此互補的。在某些具體實施例中，非-互補的核苷酸是彼此相同的。在某些其他的具體實施例中，非-互補的核苷酸是彼此不同的。在其他的具體實施例中，若在拖尾中的非-互補核苷酸是嘌呤，則在前導序列中相對應的核苷酸亦是嘌呤。在其他的具體實施例中，若在拖尾中的非-互補核苷酸是嘧啶，則在前導序列中相對應的核苷酸亦是嘌呤。
當使用活減毒疫苗時，亦必須考慮它的安全性。該疫苗必須不引起疾病。在本發明中，可使用任何使疫苗安全之此項技藝中已知的技術。除了減毒的技術之外，可使用其他技術。一個非-限制性的實例是使用可溶性異源基因，不能將其併入病毒粒子膜內。例如，可使用可溶性RSVF基因的單一副本、缺乏穿透膜和胞液功能部位的RSV基因版本。因為不能將其併入病毒粒子膜內，故不預期改變該病毒的向性。
可使用各種測定來測試疫苗的安全性。參見下文4.8節。特定而言，可使用蔗糖梯度和中和測定來測試安全性。可使用蔗糖梯度測定，判定是否將異源蛋白質插入病毒粒子中。若將異源蛋白質插入病毒粒子中，便應測試該病毒粒子引起徵候的能力，即使親代品系不引起徵候。未與理論結合，若將異源蛋白質併入病毒粒子中，該病毒便可獲得新的、可能為病理學上的特性。
4.8.本發明所使用的測定
根據本發明，可使用許多測定，以便判定嵌合型或重組病毒在細胞培養系統、動物模式系統或在個體中的生長速率。根據本發明，亦可使用許多測定，以便判定嵌合型和重組病毒達成病毒粒子之感染、複製和包裝的需求。
可使用在本文中描述的測定，測定一段時間內的病毒力價，判定該病毒的生長特徵。在特定的具體實施例中，藉著從被感染之細胞中或被感染的個體中獲得試樣，製備試樣的連續稀釋，並以容許顯露出單一溶菌斑的病毒稀釋度，感染易感受該病毒感染的單層細胞。然後可計算溶菌斑，並以每毫升試樣的溶菌斑形成單位來表示病毒力價。在本發明特定的具體實施例中，藉著在個體中對抗病毒之抗體的力價，來評估本發明之病毒在該個體中的生長速率。未與理論結合，在個體中的抗體力價，不僅反映在該個體中的病毒力價，亦反映抗原性。若病毒的抗原性是不變的，則可使用在個體中抗體力價的增加，來判定病毒在該個體中的生長曲線。在較佳的具體實施例中，最好藉著在感染後的多個時間點採取宿主的生物體液試樣，並測量病毒力價，來測試該病毒在動物或人類中的生長速率。
可藉著任何熟諳此藝者已知的技術，來判定異源基因序列在細胞培養系統或在個體中的表現。在某些具體實施例中，藉著定量轉錄本的含量，來測量異源基因的表現。可藉著北方墨點分析，或藉著RT-PCR，分別使用對轉錄本專一的探針或引子，來測量轉錄本的含量。可區別轉錄本和病毒之基因組，因為病毒為反義之方位，而轉錄本則是有意義的方位。在某些具體實施例中，藉著定量異源基因之蛋白質產物的量，來測量異源基因的表現。可藉著西方墨點分析，使用對該蛋白質專一的抗體，來測量蛋白質的含量。
在特定的具體實施例中，將肽標籤附貼在異源基因上。可使用對抗該肽標籤的抗體來檢測肽標籤。所檢測到之肽標籤的含量，代表從異源基因中表現之蛋白質的含量。或者，可藉著肽標籤來分離從異源基因中表現之蛋白質。經過純化之蛋白質的含量，與異源基因的表現程度有關。這類肽標籤，以及分離與這類肽標籤融合之蛋白質的方法為此項技藝中已熟知的。可使用此項技藝中已知的各種肽標籤來修改異源基因，包括但不限於免疫球蛋白恆定區、聚組胺酸序列(Petty,1996,金屬-螯合親和力層析法(Metal-chelate affinity chromatography),在Current Protocols in Molecular Biology,第1-3冊(1994-1998)中。由Ausubel,F.M.,Brent,R.,Kunston,R.E.,Moore,D.D.,Seidman,J.G.,Smith,J.A.和Struhl,K.編輯，由John Wiley and Sons,Inc.,USA,Greene Publish,Assoc. & Wiley Interscience出版)，穀胱甘肽S-轉移酶(GST;Smith,1993,Methods Mol. Cell Bio. 4:220-229)、大腸桿菌甘露糖結合蛋白質(Guan等人，1987,Gene 67：21-30)、各種纖維素結合功能部位(美國專利第5,496,934號；5,202,247號；5,137,819號；Tomme等人，1994,Protein Eng.7：117-123)，以及FLAG抗原決定位(Short Protocols in Molecular Biology, 1999，編輯Ausubel等人，John Wiley &Sons, Inc., 單元10.11)等等。其他的肽標籤可被專一的結合夥伴認出，並因此有助於藉著對結合夥伴的親和力結合作用分離，最好是將該結合夥伴固定及/或放在固體支撐物上。如同熟諳此藝者所知曉的，可使用許多方法獲得上文-提及之肽標籤的密碼區，包括但不限於DNA選殖、DNA擴大和合成方法。一些肽標籤和用來檢測及分離它們的試劑是可購得的。
可藉著任何熟諳此藝者已知的方法，獲得來自個體的試樣。在某些具體實施例中，該試樣包括鼻抽吸物、咽喉抹拭物、痰或支氣管-肺泡灌洗液。
4.8.1.迷你複製子構築體
可產製迷你複製子構築體，含有反義報告者基因。本發明可使用任何熟諳此藝者已知的報告者基因(參見下文4.7.13節)。在特定的具體實施例中，報告者基因為CAT。在某些具體實施例中，報告者基因可位在反-義hMPV或APV前導序列的側面，與肝炎δ核酶(Hep-d Ribo)和T7聚合酶終止(T-T7)信號連接，而hMPV或APV拖尾序列則在T7RNA聚合酶啟動基因之前。
在某些具體實施例中，將編碼迷你複製子的質體轉移感染到宿主細胞內。該宿主細胞表現T7RNA聚合酶、N基因、P基因、L基因和M2-1基因。在某些具體實施例中，以編碼T7 RNA聚合酶、N基因、P基因、L基因和M2-1基因的質體，轉移感染宿主細胞。在其他的具體實施例中，將編碼迷你複製子之質體轉移感染到宿主細胞內，並以協助者病毒感染該宿主細胞。
可藉著任何熟諳此藝者已知的方法，測定報告者基因之表現程度及/或其活性，像是，但不限於在4.7.13節中描述的方法。
在某些更特定的具體實施例中，迷你複製子包括下列的元件，按順序列舉：T7 RNA聚合酶或RNA聚合酶I、前導序列、基因起點、GFP、拖尾序列、肝炎δ核酶序列或RNA聚合酶I終止序列。若使用T7作為RNA聚合酶，則應使用肝炎δ核酶序列作為終止序列。若使用RNA聚合酶I，則可使用RNA聚合酶I終止序列作為終止信號。依據解救系統，迷你複製子的序列可以有意義或反義的方位。在某些具體實施例中，可相對於hMPV之野外型前導序列，修改前導序列。前導序列可視需要在AC之前。T7聚合酶序列可帶有或沒有G-二聯體或三聯體，在此處G-二聯體或三聯體提供了增加的轉錄。
在特定的具體實施例中，在T0時以hMPV感染細胞。在24小時之後，T24時，以迷你複製子構築體轉移感染該細胞。在T0之後48小時，和在T0之後72小時，針對報告者基因的表現測試細胞。若使用螢光報告者基因產物(例如GFP)，則可使用FACS測試報告者基因的表現。
在另一個具體實施例中，在T=0小時時，以六個質體轉移感染細胞。然後在T=40小時和T=60小時時收獲細胞，並分析CAT或GFP的表現(參見圖25)。
在另一個特定的具體實施例中，在T0時以MVA-T7感染細胞。在1小時之後，T1時，以迷你複製子構築體轉移感染該細胞。在T0之後24小時，以hMPV感染該細胞。在T0之後72小時，針對報告者基因的表現測試細胞。若使用螢光報告者基因產物(例如GFP)，則可使用FACS測試報告者基因的表現。
4.8.2.報告者基因
在某些具體實施例中，本發明之方法可使用在組織培養或在動物模式中，測量報告者基因表現的測定。將報告者基因的核苷酸序列選殖到病毒內，像是APV、hMPV、hMPV/APV或APV/hMPV，其中(i)改變報告者基因的位置，並(ii)變更位在報告者基因側面之基因間區域的長度。測試不同的組合，判定報告者基因表現的最佳速率，以及包括該報告者基因之病毒的最佳複製速率。
在某些具體實施例中，產生包含報告者基因的迷你複製子構築體。在4.7.2節中描述了迷你複製子構築體的建構。
可藉著任何熟諳此藝者已知的技術，判定報告者基因產物的豐富性。這類技術包括，但不限於北方墨點分析或西方墨點分析，分別使用對該報告者基因專一的探針或抗體。
在某些具體實施例中，可在FACS中檢測發出螢光信號的報告者基因。可使用FACS來檢測在其中表現該報告者基因的細胞。
將使用實行本發明之特定觀點的技術，除非另行指定，由熟諳此藝者例行地實行傳統的分子生物學、微生物學和重組DNA操縱及產製技術。參見，例如Sambrook,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第2版；第1-3冊(Cold Spring Harbor Laboratory,1989),A Laboratory Manual,第2版；DNA Cloning,第I和II冊(Glover編輯，1985)；以及Transcription and Translation(Hames & Higgins編輯，1984)。
報告者基因產物的生化活性，代表報告者基因的表現程度。報告者基因活性的總量，亦依據本發明之重組病毒的複製速率。因此，欲判定得自重組病毒之報告者基因的真實表現程度，應將總表現程度除以在細胞培養或動物模式中之重組病毒的力價。
本發明之方法可使用的報告者基因，包括但不限於在下文表3中列舉的基因：
特別可藉著西方墨點分析或北方墨點分析，或任何用來定量核苷酸序列之轉錄、其mRNA或其蛋白質之豐富性的其他技術，測量報告者基因的豐富性(參見Short Protocols in Molecular Biology,Ausubel等人(編輯)，John Wiley ＆ Sons,Inc.,第4版,1999)。在某些具體實施例中，以得自重組病毒之報告者基因表現的讀出，來測量報告者基因的活性。為了定量報告者基因產物的活性，可使用報告者基因產物的生化特徵(參見表3)。測量報告者基因產物之生化活性的方法，為熟諳此藝者已熟知的。在下文中陳述本發明之方法可使用之解釋性報告者基因的更詳細說明。
4.8.3.測量感染速率的發生率
可藉著任何此項技藝中已熟知的方法，判定感染的發生率，例如，但不限於可藉著免疫螢光測定(IFA)，分別使用抗-APV-抗原抗體、抗-hMPV-抗原抗體、抗-APV-抗原抗體，及/或對異源核苷酸序列之基因產物專一的抗體，針對本發明之病毒的存在，測試臨床試樣(例如鼻抹拭物)。
在某些具體實施例中，可直接處理含有完整細胞的試樣，而沒有完整細胞的分離物應先在許可的細胞株(例如HEp-2細胞)上培養。在解釋性的具體實施例中，應藉著在室溫下，以例如300xg離心5分鐘，使培養的細胞上清液澄清，接著在相同的條件下以PBS,pH 7.4(不含Ca++ 和Mg++ )沖洗。將細胞小球再懸浮於少量體積的PBS中，以供分析。將含有完整細胞的原始臨床分離物與PBS混合，並在室溫下以300xg離心5分鐘。利用無菌的吸移管尖端，從界面中移除黏液，並在相同的條件下，以PBS沖洗細胞小球一次以上。然後將小球再懸浮於少量體積的PBS中，以供分析。將細胞懸浮液各5-10微升，點在以丙酮沖洗過之12-孔HTC超級矯正的(supercured)玻片上每個5毫米的孔中，並容許風乾。在冰冷的(-20℃)丙酮中固定玻片10分鐘。藉著在每孔中加入PBS-1%BSA，接著在室溫下培養10分鐘，阻斷該反應。以PBS-0.1%吐溫-20沖洗玻片三次，並風乾。將各10微升之以阻斷緩衝溶液稀釋至250毫微克/毫升的初級抗體試劑，點在每孔中，並在潮濕的37℃環境下培養該反應30分鐘。然後以PBS-0.1%吐溫-20廣泛地沖洗玻片，更換三次，並風乾。將10微升之以阻斷緩衝溶液稀釋至250毫微克/毫升的適當二級共軛抗體試劑，點在每個個別的孔中，並在潮濕的37℃環境下培養該反應額外的30分鐘。然後以PBS-0.1%吐溫-20沖洗玻片，並更換三次。將5微升PBS-50%甘油-10mM Tris pH 8.0-1mM EDTA點在每個反應孔中，並在玻片上覆上蓋玻片。接著藉螢光顯微鏡，以200X功率，使用B-2A濾光鏡(EX 450-490毫微米)，分析每個反應孔。對獲自未染色細胞，或僅以二級試劑染色之細胞的自動螢光背景，給陽性反應評分。藉著在被感染細胞之細胞質中，由小包涵物點出的明亮螢光，來定出陽性反應的特徵。
4.8.4.測量血清力價
可藉著任何此項技藝中已熟知的方法，判定抗體的血清力價，例如，但不限於，可藉著三明治ELISA來定量抗體或抗體片段在血清試樣中的含量。簡言之，ELISA包括利用認得在血清中之抗體或抗體片段的抗體塗覆微量滴定盤，並在4℃下過夜。然後在室溫下，以PBS-吐溫-0.5% BSA阻斷該培養盤大約30分鐘。使用以PBS-吐溫-BSA稀釋之經過純化的抗體或抗體片段，建構標準曲線，並以PBS-BSA稀釋試樣。以一式兩份，將試樣和標準物加至測定培養盤的孔中，並在室溫下培養大約1小時。接著，以PBS-吐溫沖洗掉未-結合的抗體，並在室溫下利用經過標示的二級抗體(例如與辣根過氧化酶共軛的山羊-抗-人類IgG)處理已結合的抗體大約1小時。藉著加入對該標示專一的色原受質，並測量該受質的周轉率，例如藉著分光光度計，來檢測已標示之抗體的結合作用。藉著在某個稀釋度下，比較試樣之受質周轉率與標準曲線之受質周轉率，來判定抗體或抗體片段在血清中的濃度。
4.8.5.血清學測試
在本發明的某些具體實施例中，檢測與哺乳動物MPV之組份結合的抗體的存在。特定而言，可在個體中檢測針對哺乳動物MPV之蛋白質的抗體的存在，以便在個體中診斷哺乳動物MPV的存在。可使用任何熟諳此藝者已知的方法，檢測針對哺乳動物MPV之組份的抗體的存在。
在解釋性的具體實施例中，將哺乳動物MPV之組份與固體支撐物連接。在特定的具體實施例中，該哺乳動物MPV之組份可以是，但不限於F蛋白質或G蛋白質。接著，將欲測試針對哺乳動物MPV之抗體存在的物質，在有助於該抗體與哺乳動物MPV組份結合的條件下，與該固體支撐物一起培養。接著，在移除任何未專一結合之抗體的條件下，沖洗該固體支撐物。在沖洗步驟之後，可使用任何熟諳此藝者已知的技術，檢測已結合之抗體的存在。在特定的具體實施例中，將哺乳動物MPV蛋白質-抗體複合物與以可檢測方式標示的抗體，在有助於以可檢測方式標示之抗體與可與哺乳動物MPV組份結合之抗體結合的條件下一起培養，後者認得由該個體之物種所產生的抗體，例如，若該個體是棉鼠，則以可檢測方式標示的抗體即針對大鼠抗體。在特定的具體實施例中，以可檢測方式標示的抗體是與酵素活性共軛。在另一個具體實施例中，以可檢測方式標示的抗體是以放射性標示的。然後沖洗哺乳動物MPV蛋白質-抗體-以可檢測方式標式之抗體的混合物，接著藉任何熟諳此藝者已知的技術，定量以可檢測方式標示之抗體的存在，其中所使用之技術將視以可檢測方式標示之抗體的標記類型而定。
4.8.6.Biacore測定
可藉著例如，在已經於其上固定抗原的感應器晶片表面上，注射250微升，在含有0.05%吐溫-20之HBS緩衝溶液中各種濃度的單株抗體("mAb")，來判定抗體結合的動力學參數。抗原可以是哺乳動物MPV的任何組份。在特定的具體實施例中，該抗體可以是，但不限於哺乳動物MPV的F蛋白質或G蛋白質。將流速不變地維持在75微升/分鐘下。收集解離資料15分鐘，或按照需要更久。在每個注射/解離回合之後，使用簡短的、稀酸的1分鐘脈衝，通常是10-100mMHCl，雖然亦使用其他的再生劑作為環境保證物，從抗原表面移除已結合的mAb。
更特定而言，關於締合速率kon 和解離速率koff 的測量，經由使用標準胺偶聯化學法，即EDC/NHS法(EDC=N-二乙胺基丙基)-碳化二亞胺)，將抗原直接固定在感應器晶片的表面上。簡言之，製備在10mM NaOAc,pH4或pH5中，5-100nM的抗原溶液，並通過EDC/NHS-激活表面，直到固定大約30-50RU's(Biacore共振單位)的抗原值為止。之後，以注射1M Et-NH2使未反應之活性酯達到高潮。為了參考的目的，在相同的固定條件下，製備不含抗原的空白表面。一旦已經製備出適當的表面，便以HBS/吐溫-20製備每一種抗體試劑的適當連續稀釋，並通過連續連接的抗原和參考細胞表面。所製備之抗體濃度的範圍，依據估計之平衡結合常數KD 而改變。如同上述，在每個注射/解離回合之後，使用適當的再生劑移除已結合的抗體。
一旦收集到全部的資料，便使用由儀器製造者BIAcore,Inc.(Piscataway,NJ)提供的演算法，整體地套入所得的結合曲線。將所有資料套入1:1 Langmuir結合模式。這些演算法計算kon 和koff 兩者，以兩個速率常數之比例(即koff /kon )，從其中推衍出明顯的平衡結合常數KD 。可在BIA評估軟體手冊中，找到如何衍生個別的速率常數之更詳細的處理。
4.8.7.微量中和測定
可藉著微量中和測定，判定抗體或其抗原-結合片段中和病毒感染力的能力。該微量中和測定是由Anderson等人描述之程序(1985，J. Clin. Microbiol. 22:1050-1052，將其揭示內容全部以引用的方式併入本文中)的修改。亦在Johnson等人，1999,J. Infectious Diseases 180：35-40中描述該程序，將其揭示內容全部以引用的方式併入本文中。
使用96-孔培養盤，以一式三份進行抗體稀釋。在37℃下，在96-孔培養盤的孔中，將106 TCID50 的哺乳動物MPV與連續稀釋的待測試之抗體或其抗原-結合片段一起培養2小時。然後在每孔中加入易受哺乳動物MPV感染的細胞，像是但不限於Vero細胞(2.5x104 )，並在37℃下，在5%CO2 中培養5天。在5天之後，吸出培養基，並以80%甲醇和20%PBS沖洗細胞，並固定在培養盤上。然後藉著病毒抗原，像是F蛋白質的表現，來判定病毒複製。將經過固定的細胞與生物素-共軛之抗-病毒抗原，像是抗-F蛋白質單株抗體(例如泛F蛋白質，C-位置-專一的MAb 133-1H)一起培養，沖洗並在孔中加入辣根過氧化酶共軛的抗生物素蛋白。再度沖洗各孔，並在450毫微米處測量受質TMB(硫代硝基苯甲酸)的周轉率。以對在450毫微米(OD450 )處得自僅有病毒之對照組細胞的吸收度，引起至少50%降低的抗體濃度來表示中和力價。
在本文中描述的微量中和測定僅是一個實例。或者，可使用標準中和測定來判定病毒如何顯著地受到抗體的影響。
4.8.8.病毒融合抑制測定
本測定在原則上是與微量中和測定相同的，除了在加入抗體之前4小時，以個別的病毒感染細胞，並自細胞融合的存在或缺乏之觀點讀出(Taylor等人，1992,J. Gen. Virol. 73:2217-2223)。
4.8.9.等溫滴定熱量測定法
從對抗體與其個自抗原之交互作用的等溫滴定熱量測定(ITC)測量，來判定熱動力學結合親和力和焓。
以透析液稀釋抗體，並藉著UV分光鏡的吸收度測量，利用Perkin-Elmer λ4B分光光度計，使用217,000M-1 公分-1 之消光係數，在280毫微米之高峰最大值處，判定濃度。從原始試樣之質量對經過稀釋之試樣的比例，計算經過稀釋之哺乳動物MPV-抗原濃度，因為其消光係數太低而不能判定精確的濃度，故不使用並喪失大量的試樣。
ITC測量
從ITC測量，使用Microcal,Inc. VP滴定熱量計，判定抗體的結合熱動力學。VP滴定熱量計由一對相配的試樣和參考試管(1.409毫升)所組成，以絕熱外罩將試管封入，並旋轉攪拌器-注射筒，以便將配體溶液滴定至試樣試管內。該ITC測量係在25℃和35℃下進行。試樣試管含有在磷酸緩衝溶液中的抗體，而參考試管僅含有緩衝溶液。該磷酸緩衝溶液為得自HyClone,Inc，pH 7.4的生理鹽水和67mM PO4 。將5或10微升等份的0.05或0.1mM RSV-抗原、PIV-抗原及/或hMPV-抗原溶液，在3至4分鐘分開滴定至抗體試樣溶液中，直到藉著缺乏熱交換信號，證實結合作用已達飽和為止。
使用得自Microcal. Inc.,Origin 5.0的非-線性、最小二乘方最小化軟體程式，根據下列的等式(I)，套入總熱Qt 對總滴定劑濃度Xt 之第i次滴定的增加熱(AQ(i))，
Qt =nCt AHb V{1+Xt /nCt +1/nKb Ct -[(1+Xt /nCt +1/nKb Ct )2 -4Xt /nCt ]1/2 }/2　(1a)
AQ(i)=Q(i)+dVi/2V{Q(i)+Q(i-1)}-Q(i-1)(1b)
其中Ct 為在試樣試管中的最初抗體濃度，V為試樣試管之體積，且n為結合反應的化學計算法，產生Kb 、AHb 和n之值。判定Kb 之最佳試樣濃度範圍，將視K之值b 而定，並藉著下列關係來定義。
Ct Kb n‧500　(2)
以致於在1μM下，可判定最大的Kb 小於2.5X108 M-1 。若第一次加入滴定劑不符合結合等溫，則在最後的分析中忽略它，因為它可能反映在注射筒開口-溶液界面處的氣泡釋放。
4.8.10.免疫測定
免疫沉澱草案通常包括在溶解緩衝溶液，像是補充有蛋白質磷酸酶及/或蛋白酶抑制劑(例如EDTA、PMSF、159抑肽酶(aprotinin)、釩酸鈉)之RIPA緩衝溶液(1%NP-40或三通X-100、1%脫氧膽酸鈉、0.1%SDS、0.15M NaCl、0.01M磷酸鈉，在pH7.2下，1%崔絲醇(trasylol))中，使細胞族群溶解，將感興趣的抗體加至細胞溶胞產物中，在4℃下培養一段時間，將蛋白質A及/或蛋白質G瓊脂糖小珠加至細胞溶胞產物中，在4℃下培養大約1小時或更久，以溶解緩衝溶液沖洗小珠，並將小珠再懸浮於SDS/試樣緩衝溶液中。可藉著例如西方墨點分析，評估感興趣之抗體使特定抗原免疫沉澱的能力。熟諳此藝者將很清楚可加以修改，以便增加抗體對抗原之結合，並降低背景(例如，預先利用瓊脂糖小珠使細胞溶胞產物澄清)的參數。關於免疫沉澱草案的進一步討論，參見，例如Ausubel等人，編輯，1994,Current Protocols in Molecular Biology，第1冊，John Wiley & Sons,Inc.,New York在第10.16.1頁。
西方墨點測定通常包括製備蛋白質試樣，在聚丙烯醯胺凝膠上進行蛋白質試樣的電泳(例如8%-20% SDS-PAGE，視抗原的分子量而定)，從聚丙烯醯胺凝膠中將蛋白質試樣移至諸如硝基纖維素、PVDF或尼龍之類的膜，以阻斷緩衝溶液(例如帶有3%BSA或無脂牛奶的PBS)阻斷該膜，以沖洗緩衝溶液(例如PBS吐溫20)沖洗該膜，將該膜與以阻斷緩衝溶液稀釋的初級抗體(感興趣之抗體)一起培養，以沖洗緩衝溶液沖洗該膜，將該膜與以阻斷緩衝溶液稀釋，並與酵素受質(例如辣根過氧化酶或鹼性磷酸酶)或放射性分子(例如12 P或121 I)共軛的二級抗體(其認得初級抗體，例如抗-人類抗體)一起培養，以沖洗緩衝溶液沖洗該膜，並檢測抗原的存在。熟諳此藝者將很清楚可加以修改，以便增加檢測信號，並降低背景噪音的參數。關於西方墨點草案的進一步討論，參見，例如Ausubel等人，編輯，1994,GinTent Protocols in Molecular Biology，第1冊，John Wiley & Sons,Inc.,New York在第10.8.1頁。
ELISAs包括製備抗體，以抗原塗覆96-孔微量滴定盤，洗掉未與孔結合的抗原，在孔中加入與可檢測化合物，像是酵素受質(例如辣根過氧化酶或鹼性磷酸酶)共軛的感興趣之抗體，並培養一段時間，洗掉未結合的抗體或非-專一結合的抗體，並檢測與塗覆在孔中之抗原專一結合的抗體的存在。在ELISAs中，不使感興趣的抗體與可檢測化合物共軛；可改而在孔中加入與可檢測化合物共軛的第二個抗體(其認得感興趣之抗體)。此外，亦可以抗體塗覆該孔，代替以抗原塗覆該孔。在該情況下，可檢測分子可以是與可檢測化合物，像是酵素受質(例如辣根過氧化酶或鹼性磷酸酶)共軛的抗原。可加以修改，以便增加信號檢測的參數，以及ELISAs的其他變化，均為熟諳此藝者已熟知的。關於ELISAs的進一步討論，參見，例如Ausubel等人，編輯，1994,Current Protocols in Molecular Biology，第1冊，John Wiley & Sons,Inc.,New York在第11.2.1頁。可藉著競爭性結合測定，判定抗體(包括scFv或其他分子，包括或另外由抗體片段或其變體所組成)對抗原之結合親和力，以及抗體-抗原交互作用的關閉-速率。競爭性結合測定是放射免疫測定，包括將已標示之抗原(例如3 H或121 I)與感興趣之抗體，在逐漸增加未標示抗原之含量的存在下一起培養，並檢測與已標示抗原結合的抗體。
4.8.11.蔗糖梯度測定
可藉著使用任何熟諳此藝者已知的生化測定，進一步調查異源蛋白質是否被併入病毒粒子內的問題。在特定的具體實施例中，使用蔗糖梯度測定，判定異源蛋白質是否被併入病毒粒子內。
可在20-60%的蔗糖梯度中，分級分離被感染細胞的溶胞產物，收集各種溶離份，並藉著例如西方墨點分析，分析異源蛋白質和載體蛋白質的存在與分布。亦可藉著溶菌斑測定，就高峰病毒力價，測定溶離份和病毒蛋白質。若異源蛋白質與病毒粒子一起移動，該異源蛋白質便是與病毒粒子結合。
4.9.確認MPV之新分離株的方法
本發明係關於哺乳動物MPV，特別是hMPV。而本發明提供兩種MPV之血清學亞組，A和B的特徵，以及MPA四個變種A1、A2、B1和B2的特徵，本發明不限於這些亞組和變種。本發明包括任何尚待確認的MPV之分離株，包括具有屬於在本文中描述的亞組和變種，或屬於尚待確認的亞組或變種之特徵的那些。
可使用免疫測定以便定出出現在特定試樣中之蛋白質組份的特徵。免疫測定是使用病毒之肽組份，比較病毒分離株而加以確認的有效方法。例如，本發明在本文中提供進一步確認在本文中提供之MPV分離株的方法，該方法包括以原型分離株I-2614或相關分離株接種基本上不感染MPV或無特定病原的天竺鼠或雪貂(在詳細說明中，以鼻內接種動物，但其他的接種方式，像是肌肉內或皮內接種，以及使用其他的實驗動物，亦是可行的)。在第0天、接種後兩週和三週，從動物中收集血清。以專一之方式對動物進行血清改變(seroconvert)，在病毒中和(VN)測定(關於VN測定的實例，參見實例16)和間接IFA(關於IFA之實例，參見實例11或14)中對個別的分離株I-2614進行測量，並在該進一步分離株的免疫學檢測中，使用得自該血清改變之動物的血清。例如，本發明提供在副黏液病毒科中之新成員，人類間質肺病毒或類間質肺病毒之病毒(因為其最後的分類學，尚待病毒分類學委員會討論，例如在本文中的MPV，當在分類學上說明時，與APV一致)(MPV)的特徵，其可在人類中引起嚴重的RTI。由MPV引起之疾病的臨床症狀，基本上與由hRSV引起的那些類似，像是咳嗽、肌痛、嘔吐、發燒、支氣管炎或肺炎，可能有結膜炎或其組合。當看到hRSV感染兒童時，特別是極年幼的兒童，可能需要住院。例如，於2001年1月19日，以I-2614之名將MPV存放在CNCM,Institute Pasteur,Paris，或在系統發生上與藉此提供的相符之病毒分離株。於是，本發明提供包括在系統發生上，與序列識別19號之核酸序列一致，或在結構上與其相符之核酸或功能片段的病毒。特定而言，本發明提供一病毒，在系統發生樹狀圖分析中測試它之後，定出其特徵，其中使用100次靴環法和3組亂數，產生最大蓋氏法的樹狀圖，發現它在系統發生上，比其與禽肺病毒(APV)，亦稱為火雞鼻氣管炎病毒(TRTV)，禽鼻氣管炎的病原之關係，更密切地與以I-2614之名存放在CNCM,Paris的病毒分離株一致。在該系統發生樹狀圖分析中，使用AVP-C病毒作為外群是特別有用的，它是最密切相關的，縱使基本上是非-哺乳動物病毒。
4.9.1.序列的生物資訊排列
可藉著BLAST(Altschul,S.F.等人，1990,J. Mol. Biol. 215:403-410)比較二或多個胺基酸序列，判定彼此的序列同種性和序列同一性。可藉著BLAST(Altschul,S. F.等人，1990,J. Mol. Biol. 215:403-410)比較二或多個核苷酸序列，判定彼此的序列同種性和序列同一性。可使用Clustal W法(Mac Vector(tm))進行BLAST比較。在某些特定的具體實施例中，由電腦程式排列二或多個序列，可接著由手動再-調整。
可使用數學演算法完成兩個序列之間同一性百分比的判定。用來比較兩個序列之數學演算法的較佳、非限制性實例，是Karlin和Altschul的演算法,1990,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268，按照在Karlin和Altschul,1993,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877中的加以修改。將這類演算法併入Altschul等人，1990,J. Mol. Biol. 215:403-410的NBLAST和XBLAST程式中。可利用NBLAST程式進行BLAST核苷酸比較。可利用XBLAST程式進行BLAST胺基酸序列比較。欲為了比較之目的獲得加了間隙的排列，可利用間隙BLAST，按照在Altschul等人，1997,Nucleic Acids Res. 25:3389-3402中的描述。或者，可使用PSI-Blast，進行反覆的搜尋，其檢測分子之間的疏遠關係(Altschul等人，1997,在前)。當使用BLAST、間隙BLAST和PSI-Blast程式時，可使用個別程式(例如XBLAST和NBLAST)的預設參數(參見http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)。其他用來比較序列之數學演算法的較佳、非限制性實例，是Myers和Miller的演算法，1988,CABIOS 4:11-17。將這類演算法併入ALIGN程式(第2.0版)中，其為GCG序列排列套裝軟體的一部分。當使用ALIGN程式來比較胺基酸序列時，可使用PAM120重量殘基表。可由熟諳此藝者設定間隙長度罰點。可使用類似上述那些的技術，容許或不容許間隙，通常僅計算精確的相配，來判定在兩個序列之間的同一性百分比。
4.9.2.雜交條件
在本發明之方法中，可使用與哺乳動物MPV之核酸，或與其逆互補物，或與其互補物雜交的核酸，來判定彼此的序列同種性和同一性。在某些具體實施例中，核酸係在高度嚴格的條件下雜交。例如但不限於，使用這類高度嚴格條件的程序如下。在65℃下，在包括6X SSC、50mMTris-HCl(pH 7.5)、1mM EDTA、0.02%PVP、0.02%Ficoll、0.02%BSA和500微克/毫升之變性鮭精DNA的緩衝溶液中，進行含有DNA之濾紙的預先雜交作用。在65℃下，使濾紙在含有100微克/毫升之變性鮭精DNA和5-20X 106cpm之32P-標示之探針的預先雜交混合物中，雜交48小時。在37℃下，以含有2X SSC、0.01%PVP、0.01%Ficoll和0.01%BSA的溶液沖洗濾紙1小時。接著在放射自顯術之前，在50℃下以0.1X SSC沖洗45分鐘。其他可使用之高度嚴格的條件為此項技藝中已熟知的。在本發明其他的具體實施例中，在中等或低嚴格的條件下進行雜交作用，這類條件為熟諳此藝者已熟知的(參見，例如Sambrook等人，1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York；亦參見Ausubel等人，編輯，在Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals,1987-1997 Current Protoools,1994-1997 John Wiley and Sons,Inc.中)。
4.9.3.系統發生分析
本發明係關於推論在哺乳動物MPV之分離株之間的系統發生關係。可利用許多方法或途徑，分析系統發生的關係；這些包括歐氏距離、最大蓋氏法，和最大簡約法(Swofford,DL.，等人，Phylogenetic Inference。在Molecular Systematics.中，編輯Hillis,DM,Mortiz,C，和Mable,BK. 1996. Sinauer Associates:Massachusetts,USA。第407-514頁；Felsenstein,J.,1981,J. Mol. Evol. 17:368-376)。此外，靴環技術是製備和檢查結果之系統發生樹狀圖的信賴區間的有效方法(Felsenstein,J.,1985,Evolution. 29:783-791)。可使用任何使用核苷酸或肽序列資訊來比較哺乳動物MPV之分離株的方法或途徑，建立系統發生的關係，包括但不限於歐氏距離、最大蓋氏法，和最大簡約方法或途徑。可使用任何此項技藝中已知的方法，分析系統發生資料的品質，包括但不限於靴環法。可供在系統發生途徑中使用的核苷酸或肽序列之排列，包括但不限於手工排列、電腦逐對排列和電腦多重排列。以所需之資訊和所許可的時間為基礎，熟諳此藝者將熟悉欲使用之較佳的排列方法或系統發生的途徑。
在一個具體實施例中，使用DNA最大蓋氏法，來推論在hMPV分離株之間的關係。在另一個具體實施例中，使用靴環技術，來判定使用該系統發生途徑之一所創造的系統發生資料的確實性。在另一個具體實施例中，在輸入資料之前，將亂數技術應用在系統發生途徑上，以便將序列進入系統發生分析之順序的影響減至最少。在一個特定的具體實施例中，使用DNA最大蓋氏法與靴環法。在另一個特定的具體實施例中，使用DNA最大蓋氏法，以及靴環法和亂數。在其他更特定的具體實施例中，使用DNA最大蓋氏法，以及50次靴環法。在另一個特定的具體實施例中，使用DNA最大蓋氏法，以及50次靴環法和3組亂數。在另一個特定的具體實施例中，使用DNA最大蓋氏法，以及100次靴環法和3組亂數。
在一個具體實施例中，將得自hMPV之分離株的核酸或肽序列資訊，與其他hMPV分離株的序列相比較或排成一直線。該胺基酸序列可以是L蛋白質、M蛋白質、N蛋白質、P蛋白質或F蛋白質的胺基酸序列。在另一個具體實施例中，將得自hMPV分離株或hMPV分離株之成員的核酸或肽序列資訊，與其他病毒的序列相比較或排成一直線。在另一個具體實施例中，將系統發生之途徑應用在序列排列資料上，而得以推論系統發生的關係，及/或建立系統發生樹狀圖。可使用任何使用核苷酸或肽序列資訊，來比較hMPV分離株的方法和途徑，推論該系統發生的關係，包括但不限於歐氏距離、最大蓋氏法和最大簡約方法或途徑。
在以WO 02/057302發表的國際專利申請案PCT/NL02/00040中，揭示了系統發生分析的其他方法，將其全文以引用的方式併入本文中。特定而言，PCT/NL02/00040在第12頁27行至第19頁29行，揭示了適用於系統發生分析的核酸序列，以引用的方式併入本文中。
關於系統發生分析，它在獲得作為外群之非-MPV的核酸序列上是最有用的，利用該核酸序列與病毒相比較，可從禽肺病毒血清型C(APV-C)獲得極有用的外群分離株。參見，例如圖16。
許多方法和程式為此項技藝中已知的，並可用來推論系統發生的關係，包括但不限於BioEdit、ClustalW、TreeVieW和NJPlot。將用來排列序列，並產生系統發生樹狀圖或關係的方法，將需要輸入待比較之序列資訊。許多方法和格式為此項技藝中已知的，並可用來輸入序列資訊，包括但不限於FASTA、NBRF、EMBL/SWISS、GDE蛋白質、GDE核苷酸、CLUSTAL和GCG/MSF。將用來排列序列並產生系統發生樹狀圖或關係的方法，將需要結果的輸出。可使用許多方法和格式輸出資訊或結果，包括但不限於CLUSTAL、NBRF/PIR、MSF、PHYLIP和GDE。在一個具體實施例中，使用ClustalW，連同DNA最大蓋氏法，以及100次靴環法和3組亂數，以便產生系統發生關係。
4.10.抗體的產製
本發明亦關於對抗由哺乳動物MPV編碼之蛋白質的抗體的產製。特定而言，本發明係關於對抗所有哺乳動物MPV抗原，包括哺乳動物MPV的F蛋白質、N蛋白質、M2-1蛋白質、M2-1蛋白質、G蛋白質或P蛋白質之抗體的產製。根據本發明，可使用任何由哺乳動物MPV編碼之蛋白質、其衍生物、類似物或片段，作為免疫原，產製可以免疫專一之方式與這類免疫原結合的抗體。本發明之抗體包括，但不限於多株、單株、多重專一性、人類、人類化或嵌合型抗體，單鏈抗體、Fab片段、F(ab')片段、由Fab表現庫產製的片段、抗-遺傳性型(抗-Id)抗體(包括例如對抗本發明之抗體的抗-Id抗體)，以及抗原決定位-結合片段。"抗體"一詞，當在本文中使用時，意指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子之具有免疫活性的部分，即含有以免疫專一之方式與抗原結合的抗原結合位置的分子。本發明之免疫球蛋白分子可以是任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、種類(例如IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 和IgA2 )，或亞類的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白分子之具有免疫活性部分的實例，包括F(ab)和F(ab)'2片段，其可藉著以諸如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶之類的酵素處理抗體來產製。在特定的具體實施例中，產製對抗由人類MPV編碼之蛋白質的抗體。在另一個具體實施例中，產製對抗由人類MPV編碼之蛋白質的功能部位的抗體。
可使用此項技藝中已知的各種程序，產製對抗由哺乳動物MPV編碼之蛋白質的多株抗體、其衍生物、類似物或片段。關於抗體的產製，可藉著注射天然的蛋白質，或合成版本，或其衍生物(例如片段)，來免疫各種宿主動物，包括但不限於兔子、老鼠、大鼠等等。可依據宿主的物種，使用各種佐劑，來增加免疫學的反應，包括但不限於福瑞德氏(完全和不完全)、礦物凝膠，像是氫氧化鋁、表面活性物質，像是溶血卵磷脂、普魯尼克(pluronic)多元醇、聚陰離子、肽、油乳劑、鎖孔血藍蛋白、二硝基酚，以及可能有用的人類佐劑，像是BCG(卡介苗)和短小棒狀桿菌(corynebacterium parvum)。
關於製備針對由哺乳動物MPV、其衍生物、類似物或片段編碼之蛋白質的單株抗體，可使用任何藉著培養中之連續細胞株，提供抗體分子之產製的技術。例如，最初由Kohler和Milstein發展的融合瘤技術(1975,Nature 256:495-497)，還有三融合瘤(trioma)技術、人類B-細胞融合瘤技術(Kozbor等人，1983,Immunology Today 4:72)，以及產製人類單株抗體的EBv-融合瘤技術(Cole等人，1985，在Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,第77-96頁)。在本發明額外的具體實施例中，可在無菌的(germ-free)動物中，利用最新的技術(PCT/US90/02545)，產製單株抗體。根據本發明，可使用人類抗體， 並可藉著使用人類融合瘤(Cote等人，1983,Proc. Natl.Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030)，或藉著在活體外以EBV病毒轉化人類B細胞(Cole等人，1985，在Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R. Liss，第77-96頁中)而獲得。事實上，根據本發明，可使用為了產製"嵌合型抗體"而發展的技術(Morrison等人，1984，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851-6855;Neuberger等人，1984,Nature 312:604-608;Takeda等人，1985,Nature 314:452-454)，其係藉著將得自對由哺乳動物MPV、其衍生物、類似物或片段編碼之蛋白質專一的老鼠抗體分子的基因，與得自具有適當生物活性之人類抗體分子的基因接合在一起；這類抗體是在本發明的範圍內。
根據本發明，可改編對於產製單鏈抗體所描述的技術(美國專利第4,946,778號)，產生專一的單鏈抗體。本發明額外的具體實施例係使用對於建構Fab表現庫所描述的技術(Huse等人，1989,Science 246:1275-1281)，容許快速且容易地確認對由哺乳動物MPV、其衍生物、類似物或片段編碼的蛋白質，具有想要之專一性的單株Fab片段。
可藉著已知的技術，產製含有分子之遺傳性型的抗體片段。例如，這類片段包括，但不限於：F(ab')2片段，其可藉著抗體分子的胃蛋白酶消化作用來產製；Fab'片段，其可藉著減少F(ab')2片段的二硫橋來產製；Fab片段，其可藉著以木瓜蛋白酶和還原劑處理該抗體分子來產製，以及Fv片段。
在抗體的產製中，可藉著此項技藝中已知的技術，例如ELISA(酵素-連結之免疫吸附測定)，完成想要抗體的篩選。例如，欲選擇認得由哺乳動物MPV編碼之蛋白質的特定功能部位的抗體，可針對與由含有這類功能部位之哺乳動物MPV編碼的蛋白質之片段結合的產物，測定所產製的融合瘤。
可使用本發明提供的抗體，來檢測MPV，並可供治療MPV感染的治療方法使用。
可藉著任何熟諳此藝者已知的技術，測試由本發明方法產製之抗體的專一性和結合親和力。在某些具體實施例中，可按照在第4.8.5、4.8.6、4.8.7、4.8.8或4.8.9節中的描述，來測試藉著本發明方法產製之抗體的專一性和結合親和力。
4.11.確認抗病毒劑的篩選測定
本發明提供確認可抑制哺乳動物MPV感染宿主或宿主細胞之能力的化合物的方法。在某些具體實施例中，本發明提供確認可降低哺乳動物MPV在宿主或宿主細胞中複製之能力的化合物的方法。可使用任何熟諳此藝者已熟知的技術，來篩選將廢止或降低哺乳動物MPV感染宿主，及/或在宿主或宿主細胞中複製之能力的化合物。在特定的具體實施例中，該哺乳動物MPV是人類MPV。
在某些具體實施例中，本發明提供確認可抑制哺乳動物MPV在哺乳動物或哺乳動物細胞中複製之能力的化合物的方法。更特定而言，本發明提供確認可抑制哺乳動物MPV感染哺乳動物或哺乳動物細胞之能力的化合物的方法。在某些具體實施例中，本發明提供確認可抑制哺乳動物MPV在哺乳動物細胞中複製之能力化合物的方法。在特定的具體實施例中，該哺乳動物細胞是人類細胞。關於可用來判定病毒力價之測定的詳細說明，參見第4.7節。
在某些具體實施例中，使細胞與受試化合物接觸，並以哺乳動物MPV感染該細胞。在某些具體實施例中，在缺乏受試化合物之下，以哺乳動物MPV感染對照組培養物。可在以哺乳動物MPV感染之前、同時或之後，使細胞與受試化合物接觸。在特定的具體實施例中，該細胞為哺乳動物細胞。在更特定的具體實施例中，該細胞為人類細胞。在某些具體實施例中，將細胞與受試化合物一起培養至少1分鐘、至少5分鐘、至少15分鐘、至少30分鐘、至少1小時、至少2小時、至少5小時、至少12小時或至少1天。可在測定期間的任何時間，測量病毒的力價。在某些具體實施例中，判定病毒在培養物中生長的時間過程。若在受試化合物的存在下，病毒的生長受到抑制或降低，則確認該受試化合物可有效地抑制或降低哺乳動物MPV的生長或感染。在特定的具體實施例中，測試抑制或降低哺乳動物MPV生長之化合物，其抑制或降低其他病毒之生長速率的能力，以便測試其對哺乳動物MPV的專一性。
在某些具體實施例中，將受試化合物投予模式動物，並以哺乳動物MPV感染該模式動物。在某些具體實施例中，以哺乳動物病毒感染對照組模式動物，但不投予受試化合物。可在以哺乳動物MPV感染之前、同時或之後，投予該受試化合物。在特定的具體實施例中，該模式動物為哺乳動物。在更特定的具體實施例中，該模式動物可以是，但不限於棉鼠、老鼠或猴子。可在測定期間的任何時間，測量在模式動物中的病毒力價。在某些具體實施例中，判定病毒在培養物中生長的時間過程。若在受試化合物的存在下，病毒的生長受到抑制或降低，則確認該受試化合物可有效地抑制或降低哺乳動物MPV的生長或感染。在特定的具體實施例中，測試抑制或降低哺乳動物MPV在模式動物中生長的化合物，其抑制或降低其他病毒之生長速率的能力，以便測試其對哺乳動物MPV的專一性。
4.12.疫苗、抗體和抗病毒劑之調配物
在較佳的具體實施例中，本發明提供由根據本發明之核酸編碼的蛋白質分子，或間質肺病毒-專一之病毒蛋白質，或其功能片段。有用的蛋白質分子，例如係衍生自根據本發明之病毒的任何基因，或衍生自根據本發明之病毒的基因組片段。這類分子或其抗原片段，如同在本文中提供的，例如可用在診斷方法或套組中，以及在諸如次-單元疫苗之類的醫藥組合物中。特別有用的是F、SH及/或G蛋白質，或其包括抗原或次單元免疫原的抗原片段，但亦可使用失活的完整病毒。特別有用的還有由已藉系統發生分析確認之重組核酸片段編碼的那些蛋白質物質，當然較佳的是在可用於系統發生測定中之ORFs的較佳範圍和境界內的那些，特別是為了誘發MPV專一抗體或T細胞反應，無論是在活體內(例如為了保護之目的，或為了提供診斷用的抗體)，或是在活體外(例如藉著溶菌斑展示技術，或其他可用來產製合成抗體的技術)。
在本文中亦提供抗體，它是天然多株或單株的，或合成的(例如(噬菌體)庫-衍生之結合分子)抗體，其專一地與包括根據本發明之蛋白質分子，或其MPV-專一之功能片段的抗原產生反應。這類抗體可用在確認病毒分離株為MPV的方法中，包括使該病毒分離株或其組份與在本文中提供之抗體產生反應。這可藉著例如，使用經純化或未-經純化之MPV，或其部分(蛋白質、肽)，使用ELISA、RIA或不同格式的抗原檢測測定(Current Protocols In Immunology)，來完成之。或者，可使用被感染之細胞或細胞培養物，使用古典的免疫螢光或免疫組織化學技術，來確認病毒抗原。
可在治療或預防MPV感染，及/或呼吸道疾病的方法中，使用包括例如根據本發明之病毒、核酸、蛋白質分子或其片段、抗原及/或抗體的醫藥組合物，包括提供個體根據本發明之醫藥組合物。當該個體包括人類時，這是最有用的，特別是在該人類小於5歲時，因為這類嬰幼兒最容易被人類MPV感染，如同在本文中提供的。通常，在急性期患者將受上呼吸道徵候所苦，易染患其他的呼吸道和其他疾病。亦可能發生下呼吸道疾病，易染患更多和其他的嚴重病況。可使用本發明之組合物治療免疫-妥協的個體，包括癌症患者、移植接受者和老年人。
本發明亦提供獲得可用於治療呼吸道疾病之抗病毒劑的方法，包括建立包括根據本發明之病毒的細胞培養物或實驗動物，以候選的抗病毒劑處理該培養物或動物，並判定該製劑對該病毒或其感染該培養物或動物的效力。這類抗病毒劑的實例，包括MPV-中和抗體，或其有功能的組份，如同在本文中提供的，但亦獲得具有其他性質的抗病毒劑。本發明亦提供使用抗病毒劑，根據本發明來製備醫藥組合物，特別是製備用來治療呼吸道疾病，尤其是在由MPV感染或相關疾病引起之呼吸道疾病時的醫藥組合物，並提供包括根據本發明之抗病毒劑的醫藥組合物，可用在治療或預防MPV感染或呼吸道疾病的方法中，該方法包括提供個體這類醫藥組合物。
在本發明的某些具體實施例中，本發明之疫苗包括如同在本文中定義的哺乳動物間質肺病毒。在某些更特定的具體實施例中，該哺乳動物間質肺病毒是人類間質肺病毒。在較佳的具體實施例中，欲在疫苗調配物中使用的哺乳動物間質肺病毒，具有減毒的表現型。關於獲得減毒表現型的方法，參見第4.6節。
本發明提供預防和治療PIV、RSV、APV及/或hMPV感染的疫苗調配物。在某些具體實施例中，本發明之疫苗包括本發明之重組和嵌合型病毒。在某些具體實施例中，該病毒是減毒的。
在特定的具體實施例中，該疫苗包括APV，並在人類中使用該疫苗來預防和治療hMPV感染。未與理論結合，因為APV之F蛋白質與hMPV之F蛋白質的高度同種性，以APV感染，結果將在宿主中產生抗體，其將與hMPV產生交互-作用，並保護宿主免於被hMPV感染及相關疾病。
在其他特定的具體實施例中，該疫苗包括hMPV，並在鳥類中使用該疫苗來預防和治療APV感染。未與理論結合，因為APV之F蛋白質與hMPV之F蛋白質的高度同種性，以hMPV感染，結果將在宿主中產生抗體，其將與APV產生交互-作用，並保護宿主免於被APV感染及相關疾病。
在特定的具體實施例中，本發明包括使用重組和嵌合型APV/hMPV病毒，已經在疫苗調配物中加以修改，賦與對抗APV及/或hMPV的保護。在某些具體實施例中，在欲投予鳥類的疫苗中使用APV/hMPV，保護鳥類免於被APV感染。未與理論結合，以hMPV基因或核苷酸序列置換APV基因或核苷酸序列，結果產生減毒的表現型，其容許使用嵌合型病毒作為疫苗。在其他的具體實施例中，將APV/hMPV嵌合型病毒投予人類。未與理論結合，APV病毒載體在人類中提供了減毒表現型，並表現hMPV序列，誘發hMPV專一的免疫反應。
在特定的具體實施例中，本發明包括使用重組和嵌合型hMPV/APV病毒，已經在疫苗調配物中加以修改，賦與對抗APV及/或hMPV的保護。在某些具體實施例中，在欲投予人類的疫苗中使用hMPV/APV，保護人類免於被hMPV感染。未與理論結合，以APV基因或核苷酸序列置換hMPV基因或核苷酸序列，結果產生減毒的表現型，其容許使用嵌合型病毒作為疫苗。在其他的具體實施例中，將hMPV/APV嵌合型病毒投予鳥類。未與理論結合，hMPV主鏈在鳥類中提供了減毒表現型，並表現APV序列，誘發APV專一的免疫反應。
在某些較佳的具體實施例中，使用本發明之疫苗調配物，保護對抗由間質肺病毒和相關疾病引起的感染。更特定而言，使用本發明之疫苗調配物，保護對抗由人類間質肺病毒及/或禽肺病毒引起的感染，及相關的疾病。在某些具體實施例中，使用本發明之疫苗調配物，保護對抗由(a)人類間質肺病毒和呼吸道融合細胞病毒；及/或(b)禽肺病毒和呼吸道融合細胞病毒引起的感染。
在某些具體實施例中，使用本發明之疫苗調配物，保護對抗由(a)人類間質肺病毒和人類副流感病毒；及/或(b)禽肺病毒和人類副流感病毒引起的感染，及相關的疾病。
在某些具體實施例中，使用本發明之疫苗調配物，保護對抗由(a)人類間質肺病毒、呼吸道融合細胞病毒和人類副流感病毒；及/或(b)禽肺病毒、呼吸道融合細胞病毒和人類副流感病毒引起的感染，及相關的疾病。
在某些具體實施例中，使用本發明之疫苗調配物，保護對抗由人類間質肺病毒、呼吸道融合細胞病毒和人類副流感病毒引起的感染，及相關的疾病。在某些其他的具體實施例中，使用本發明之疫苗調配物，保護對抗由禽肺病毒、呼吸道融合細胞病毒和人類副流感病毒引起的感染，及相關的疾病。
因為在不同病毒物種之F蛋白質中的高度同種性，關於代表性的胺基酸序列比較，參見圖9，故可使用本發明之疫苗調配物，保護免於與從其中衍生編碼F蛋白質之異源核苷酸序列的病毒不同的病毒。在特定的代表性具體實施例中，該疫苗調配物含有包括衍生自禽肺病毒A型之異源核苷酸序列的病毒，並使用該疫苗調配物，保護免於禽肺病毒A型和禽肺病毒B型的感染。本發明包括待投予人類和動物的疫苗調配物，其可用來保護對抗APV，包括APv-C和APV-D、hMPV、PIV、流感、RSV、仙臺病毒、腮腺炎、喉氣管炎病毒、猿病毒5、人類乳頭狀瘤病毒、麻疹、腮腺炎，以及其他病毒和病原，及相關的疾病。本發明更進一步包括待投予人類和動物的疫苗調配物，其可用來保護對抗人類間質肺病毒感染和禽肺病毒感染，及相關的疾病。
在一個具體實施例中，本發明包括可用來對抗家畜致病原，包括狂犬病病毒、貓白血病病毒(FLV)和犬瘟熱病毒的疫苗調配物。在另一個具體實施例中，本發明包括可用來保護家畜對抗水疱性口炎病毒、狂犬病病毒、牛瘟病毒、豬痘病毒，並進一步保護野生動物對抗狂犬病病毒的疫苗調配物。
在本文中描述之疫苗和醫藥組合物中，可使用藉著逆向遺傳方法產製的減毒病毒。亦可使用逆向遺傳技術，為其他對產生疫苗很重要的病毒基因，設計額外的突變--即可將有用的疫苗品系變種之抗原決定位，設計到減毒的病毒中。或者，可將完全的外來抗原決定位，包括衍生自其他病毒或非-病毒病原之抗原，設計到減毒品系內。例如可將無關病毒的抗原，像是HIV(gp160、gp120、gp41)、寄生蟲抗原(例如瘧疾)、細菌或真菌抗原，或腫瘤抗原，設計到減毒品系內。或者，可將在活體內改變病毒之向性的抗原決定位，設計到本發明之嵌合型減毒病毒內。
幾乎可將任何的異源基因序列建構至本發明之嵌合型病毒內，以便在疫苗中使用。最好是擔任生物反應修改者的部分和肽。較佳的是，對任何各種的病原誘導保護性免疫反應的抗原決定位，或與中和抗體結合，可由嵌合型病毒表現，或為其一部分的抗原。例如，可建構至本發明之嵌合型病毒內的異源基因序列，包括但不限於流感和副流感血球凝集素-神經胺糖酸苷酶，以及融合糖蛋白，像是人類PIV3的HN和F基因。在另一個具體實施例中，可設計在嵌合型病毒內的異源基因序列，包括編碼具有免疫強化活性之蛋白質的那些。免疫強化蛋白質的實例包括，但不限於細胞激動素、干擾素第1型、γ干擾素、菌落刺激因子、介白素-1、-2、-4、-5、-6、-12，和這些製劑的拮抗劑。
此外，可被建構至本發明之嵌合型病毒內，並在疫苗中使用的異源基因序列，包括但不限於衍生自人類免疫缺陷病毒(HIV)，最好是第1或第2型的序列。在較佳的具體實施例中，免疫原性之HIV-衍生肽，可以是建構至嵌合型PIV內之抗原的來源，然後用它來誘發脊椎動物的免疫反應。這類HIV-衍生之肽，可包括但不限於衍生自env基因(即編碼全部或部分gp160、gp120及/或gp41的序列)、pol基因(即編碼全部或部分逆轉錄酶、核酸內切酶、蛋白酶及/或接合酶的序列)、gag基因(即編碼全部或部分p7、p6、p55、p17/18、p24/25的序列)、tat、rev、nef、vif、vpu、vpr及/或vpx的序列。
其他的異源序列可衍生自B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)；A或C型肝炎病毒表面抗原、愛氏頓病毒的糖蛋白；人類乳頭狀瘤病毒的糖蛋白；呼吸道融合細胞病毒、副流感病毒、仙臺病毒、猿病毒5或腮腺炎病毒的糖蛋白；流感病毒的糖蛋白；疱疹病毒的糖蛋白；骨髓灰白質炎病毒的VP1；諸如細菌和寄生蟲之類非-病毒性病原的抗原決定位，此外還有很多。在另一個具體實施例中，可表現全部或部分的免疫球蛋白基因。例如，可將模仿這類抗原決定位的抗-遺傳性型之免疫球蛋白的可變區建構至本發明之嵌合型病毒內。
其他的異源序列可衍生自腫瘤抗原，並可使用所得的嵌合型病毒產生對抗該腫瘤細胞的免疫反應，導致腫瘤在活體內退化。為了治療腫瘤，這些疫苗可與其他治療攝生法併用，包括但不限於化學治療、輻射治療、手術、骨髓移植等等。根據本發明，可設計重組病毒，表現與腫瘤有關的抗原(TAAs)，包括但不限於由T細胞認出的人類腫瘤抗原(Robbins和Kawakami,1996,Curr. Opin. Immunol. 8:628-636，將其全文以引用的方式併入本文中)、黑色素細胞系統的蛋白質，包括gp100、MART-1/MelanA、TRP-1(gp75)、酪胺酸酶；腫瘤專一的廣泛共享之抗原，MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-1、N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶-V、p15；腫瘤專一的突變抗原，a-凱特寧(a-catenin)、MUM-1、CDK4；乳房、卵巢、子宮頸和胰臟癌的非黑色素瘤抗原、HER-2/neu、人類乳頭狀瘤病毒-E6、-E7、MUC-1。
在其他的具體實施例中，異源核苷酸序列係衍生自間質肺病毒，像是人類間質肺病毒及/或禽肺病毒。在另外的具體實施例中，本發明之病毒含有兩個不同的異源核苷酸序列，其中一個衍生自間質肺病毒，像是人類間質肺病毒及/或禽肺病毒，而另一個衍生自呼吸道融合細胞病毒。異源核苷酸序列編碼個別病毒的F蛋白質或G蛋白質。在特定的具體實施例中，異源核苷酸序列編碼嵌合型F蛋白質，其中該嵌合型F蛋白質含有間質肺病毒之F蛋白質的外功能部位，以及副流感病毒之F蛋白質的穿透膜功能部位和魯米那功能部位。
可調配活的重組病毒疫苗或失活的重組病毒疫苗。活疫苗可能是較佳的，因為在宿主中增殖，導致與在自然感染時所發生之刺激類似種類和大小的延長刺激，並因此賦與實質上長期-持續的免疫力。可使用涉及在細胞培養物或在雞胚之尿囊中繁殖病毒的傳統方法，接著純化，完成這類活重組病毒疫苗調配物的產製。
在特定的具體實施例中，重組病毒對於所投予之個體而言，是非-病原性的。關於這一點，為了疫苗而使用遺傳設計的病毒，可能希望在這些品系中，有減毒特徵的存在。將適當的突變(例如刪除)導入用來轉移感染的模板中，可提供具有減毒特徵的新穎病毒。例如，可將與感溫性或冷適應性有關的特定誤義突變，做成刪除突變。這些突變應該比與感冷或感溫性突變種有關的點突變更穩定，且逆轉的頻率應該很低。
或者，亦可建構具有"自殺"特徵的嵌合型病毒。這類病毒在宿主內將僅完成一次，或數次複製。當用來作為疫苗時，重組的病毒將完成有限回合的複製，並引起足夠程度的免疫反應，但它將不會在人類宿主中進一步運轉，並引起疾病。分別缺乏一或多個野外型APV和hMPV之基因，或持有突變基因的重組病毒，將不能經歷成功的連續複製。可在永久表現這類基因(們)的細胞株中，產製有缺陷的病毒。缺乏必要基因(們)的病毒將在這些細胞中複製，然而，當投予人類宿主時，它們將不能完成一回合的複製。這類製品可轉錄和轉譯--在該不成熟的回合中--足夠數目的基因，而誘導免疫反應。或者，可投予較大量的品系，使這些製品得以作為失活的(死的)病毒疫苗。關於失活的疫苗，最好是以病毒組份之形式來表現異源基因產物，使基因產物得以與病毒粒子結合。這類製品的優點是它們含有天然蛋白質，且未經歷藉著福馬林或其他用來製造死毒疫苗之製劑處理的失活作用。或者，可將由cDNA製造的本發明之重組病毒高度減毒，使其僅可複製數回合。
在某些具體實施例中，本發明之疫苗包括減毒的哺乳動物MPV。未與理論結合，減毒病毒可有效地作為疫苗，即使該減毒病毒不能使細胞產生新的有傳染性的病毒顆粒，因為將病毒蛋白質插入宿主的細胞質膜內，因此刺激了免疫反應。
在本發明該項觀點的其他具體實施例中，可使用傳統技術來"殺死"嵌合型病毒，製備失活的疫苗調配物。失活的疫苗是" 死的" ，在意義上來說，已經破壞了它的傳染性。確實，破壞病毒的傳染性，但不影響其免疫原性。為了製備失活的疫苗，可使嵌合型病毒生長在細胞培養物中，或在雞胚的尿囊中，藉著區域超離心作用純化，藉著甲醛或a-丙醇酸內酯失活，並收集之。所得的疫苗通常以肌肉內接種。
可利用適當的佐劑調配失活的病毒，以便提高免疫反應。這類佐劑可包括，但不限於礦物凝膠，例如氫氧化鋁；表面活性物質，像是溶血卵磷脂、普魯尼克多元醇、聚陰離子、肽；油乳劑；以及可能有用的人類佐劑，像是BCG、短小棒狀桿菌、ISCOMS和病毒體(virosomes)。
可使用許多方法，導入上述的疫苗調配物，這些包括但不限於口服、皮內、肌肉內、腹腔內、靜脈內、皮下、經皮和鼻內及吸入的路徑。較佳的是經由用來設計疫苗之病原的天然感染路徑，導入嵌合型病毒疫苗調配物。
在某些具體實施例中，本發明係關於免疫原組合物。該免疫原組合物包括哺乳動物MPV。在特定的具體實施例中，該免疫原組合物包括人類MPV。在某些具體實施例中，該免疫原組合物包括減毒的哺乳動物MPV，或減毒的人類MPV。在某些具體實施例中，該免疫原組合物進一步更包括在藥學上可接受的載劑。
4.13.劑量攝生法、投藥和調配物
本發明提供包括MPV和APV的疫苗和免疫原製品，包括表現一或多個異源或非-天然抗原序列的病毒之減毒形式、MPV和APV之重組形式，以及嵌合型MPV和APV。本發明之疫苗或免疫原製品，包括單一或多價的疫苗，包括二價和三價的疫苗。本發明之疫苗或免疫原調配物，可用來提供對抗各種病毒感染的保護。特定而言，本發明之疫苗或免疫原調配物提供宿主對抗呼吸道感染的保護。
可單獨或與其他疫苗一起投予本發明之重組病毒及/或疫苗或免疫原調配物。較佳的是，與其他提供對抗呼吸道疾病之保護的疫苗或免疫原調配物，一起投予本發明之疫苗或免疫原調配物，像是但不限於呼吸道融合細胞病毒疫苗、流感疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、風疹疫苗、肺炎球菌疫苗、立克次體疫苗、葡萄球菌疫苗、百日咳疫苗或對抗呼吸道癌症的疫苗。在較佳的具體實施例中，本發明之病毒及/或疫苗可與在相符年齡建議之小兒科疫苗同時投予。例如，在2、4或6個月齡時，本發明之病毒及/或疫苗可與DtaP(IM)、Hib(IM)、骨髓灰白質炎(IPV 或 OPV)和B型肝炎(IM)同時投予。在12或15個月齡時，本發明之病毒及/或疫苗可與Hib(IM)、骨髓灰白質炎(IPV或OPV)、MMRII(SubQ)；Varivax(SubQ)和B型肝炎(IM)同時投予。在各種出版物中回顧可與本發明之方法一起使用的疫苗，例如The Jordan Report 2000,DiVision of Microbiology and Infectious Diseases,National Institute of Allergy and Infectious Diseases,National Institutes of Health,United States，將其全文以引用的方式併入本文中。
可將本發明之疫苗或免疫原調配物本身投予個體，或以醫藥或治療組合物之形式投予。包括佐劑和本發明之免疫原抗原(例如病毒、嵌合型病毒、突變病毒)的醫藥組合物，可藉著傳統的混合、溶解、粒化、製造糖衣錠、研磨、乳化、包膠、陷入或冷凍乾燥加工的方法來製造。可使用一或多種在生理學上可接受的載劑、稀釋劑、賦形劑或輔助劑，以傳統的方式調配醫藥組合物，其有助於將本發明之免疫原抗原加工成可在藥學上使用的製品。其中，適當的調配物將視所選擇的投藥途徑而定。
當本發明之疫苗或免疫原組合物包括佐劑，或與一或多種佐劑一起投予時，可使用的佐劑包括，但不限於無機鹽佐劑或無機鹽凝膠佐劑、顆粒佐劑、微顆粒佐劑、黏液的佐劑和免疫刺激性的佐劑。佐劑之實例包括，但不限於氫氧化鋁、磷酸鋁凝膠、福瑞德氏完全佐劑、福瑞德氏不完全佐劑、角鯊烯或角鯊烷水包油佐劑調配物、生物可降解和生物可相容的聚酯類、聚合的微脂粒、三萜系糖苷或皂角苷(例如QuilA和QS-21，亦以商標STIMULON、ISCOPREP販售)、N-乙醯基-胞壁醯基-L-蘇胺醯基-D-異穀胺醯胺(蘇胺醯基-MDP，亦以商標TERMURTIDE販售)、LPS、單磷醯基脂質A(3D-MLA，亦以商標MPL販售)。
投予本發明之疫苗或免疫原組合物的個體較好是哺乳動物，最好是人類，但亦可以是非-人類的動物，包括但不限於靈長類、牛、馬、綿羊、豬、禽類(例如雞、火雞)、山羊、貓、狗、倉鼠、老鼠和大鼠。
可使用許多方法，導入本發明之疫苗或免疫原組合物，包括但不限於口服、皮內、肌肉內、腹腔內、靜脈內、皮下、皮內、鼻內和吸入的路徑，並經由劃痕法(經由皮膚的上層劃痕，例如使用分叉的針頭)。
關於局部投藥，可將本發明之疫苗或免疫原製品調配成此項技藝中已熟知的溶液、凝膠、軟膏、乳霜、懸浮液等等。
至於鼻內或藉著吸入投藥，可以從加壓包裝或霧化器提供之氣溶膠噴霧的形式，便利地遞送根據本發明使用之製品，並使用適當的推進劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他適當的氣體。在加壓氣溶膠的案例中，可藉著提供活門，遞送計量過的含量，來判定劑量單位。可調配在吸入器或吹藥器中使用，例如明膠的膠囊和藥筒，使其含有化合物之散劑混合物，以及適當的散劑基底，像是乳糖或澱粉。
關於注射，可在含水溶液中，最好是在生理學上可相容的緩衝溶液，像是漢克氏液、林格氏液或生理鹽水緩衝溶液中，調配疫苗或免疫原製品。該溶液可含有調配劑，像是懸浮、穩定及/或分散劑。或者，該蛋白質為散劑形式，在使用之前，利用適當的媒劑，例如無菌無熱原的水重建。
熟諳此藝者有能力判定投藥用的疫苗或免疫原調配物的有效含量，特別是根據在本文中提供的詳細揭示內容。
一開始可從在活體外的測定，估計有效劑量。例如，可使用此項技藝中已熟知的技術，調配在動物模式中達到誘導免疫反應的劑量。熟諳此藝者可以在本文中描述的結果為基礎，輕易地充分運用對所有動物物種的投藥。可個別地調整劑量含量和間隔。例如，當用來作為免疫原組合物時，適當的劑量是當按照上述投藥時，能夠誘發抗體反應的組合物量。當用來作為疫苗時，可在1-36週的期間，以大約1至3個劑量，投予本發明之疫苗或免疫原調配物。較佳的是以大約2週至大約4個月的間隔，投予1或2個劑量，之後定期給予補強的疫苗接種。交替的草案可能適合個別的動物。適當的劑量是當按照上述投藥時，能夠使在被免疫動物中的免疫反應升高，足以保護該動物免於感染至少4至12個月的疫苗調配物量。一般而言，出現在劑量中之抗原的量，範圍是從每公斤宿主大約1微微克到大約100毫克，通常是從大約10微微克到大約1毫克，而較佳的是從大約100微微克到大約1微克。適當的劑量範圍，將視注射路徑和患者的尺寸而改變，但通常範圍是從大約0.1毫升到大約5毫升。
在特定的具體實施例中，以至少103 TCID50 、至少104 TCID50 、至少105 TCID50 、至少106 TCID50 之開始單一劑量，投予本發明之病毒及/或疫苗(我們應該有上限嗎？)。在另一個特定的具體實施例中，以多個劑量投予本發明之病毒及/或疫苗。在較佳的具體實施例中，使用在2、4和6個月齡時的最初給藥攝生法，以及在生命第二年開始時的補強給藥。更佳的是，以多次給藥攝生法，給予至少105 TCID50 或至少106 TCID50 的每個劑量。
4.13.1.攻毒研究
使用該測定來判定本發明之重組病毒和本發明之疫苗，在動物模式系統，像是但不限於棉鼠或倉鼠中，預防下呼吸道病毒感染的能力。可藉著靜脈內(IV)路徑、藉著肌肉內(IM)路徑，或藉著鼻內路徑(IN)，投予該重組病毒及/或疫苗。可藉著任何熟諳此藝者已熟知的技術，投予該重組病毒及/或疫苗。亦使用該測定，使抗體之血清濃度與降低與該抗體結合之病毒的肺臟力價發生關連。
在第0天，藉著肌肉內注射、藉著靜脈內注射，或藉著鼻內之路徑，對棉鼠(棉鼠(Sigmodon hispidis)，平均重100克)和獼猴(Cynomolgous macacques)(平均重2.0公斤)，投予重組或嵌合型病毒，或感興趣之疫苗，或BSA。在投予本發明的重組病毒或疫苗之前、同時或之後，以野外型病毒感染動物，其中該野外型病毒是針對其產製疫苗的病毒。在某些具體實施例中，在投予本發明之重組病毒及/或疫苗之後至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、1週或1或多個月，以野外型病毒感染動物。
在感染之後，犧牲棉鼠，並收獲牠們的肺臟組織，再藉著溶菌斑滴定，判定肺臟的病毒力價。使用牛血清白蛋白(BSA)10毫克/公斤作為陰性對照組。使用三明治ELISA，判定在攻毒時，在血清中的抗體濃度。在獼猴中，同樣地測定在鼻和肺臟灌洗液中的病毒力價。
4.13.2.標靶族群
在本發明的某些具體實施例中，由年齡定義本發明之治療和診斷方法的標靶族群。在某些具體實施例中，本發明之治療及/或診斷方法的標靶族群，其特徵在於除了呼吸道感染以外的疾病或病症。
在特定的具體實施例中，標靶族群包括2歲以下的幼兒。在更特定的具體實施例中，2歲以下的兒童不受呼吸道感染以外的疾病所苦。
在其他的具體實施例中，標靶族群包括5歲以上的患者。在更特定的具體實施例中，5歲以上的患者受額外之疾病或病症所苦，包括胰囊性纖維變性、白血病和非-霍奇金氏淋巴瘤，或最近接受骨髓或腎臟移植。
在本發明特定的具體實施例中，標靶族群包括其中hMPV感染與宿主之免疫抑制結合的患者。在特定的具體實施例中，該個體是免疫減弱的個體。
在某些具體實施例中，本發明方法的標靶族群包括老年人。
在特定的具體實施例中，欲利用本發明之方法治療或診斷的個體，是在冬季的月份被hMPV感染。
4.13.3.臨床試驗
可進一步在正常健康的成年志願者組別中，就其安全性、耐受性、免疫原性、傳染性和藥物動力學，評估已在活體外測定和動物模式中測試過的本發明之疫苗或其片段。以肌肉內、靜脈內之方式，或藉著肺臟遞送系統，將單一劑量的本發明之重組病毒及/或本發明之疫苗投予志願者。在接受單一劑量的本發明之重組病毒及/或本發明之疫苗之前至少24小時，監視每個志願者，並在臨床處接受投藥之後，將監視每個志願者至少48小時。然後在投藥後第3、7、14、21、28、35、42、49和56天，以門診病患之方式監視志願者。
以下列之間隔：(1)在投與本發明之重組病毒及/或本發明之疫苗的給藥之前；(2)在投與本發明之重組病毒及/或本發明之疫苗的給藥期間；(3)在投與本發明之重組病毒及/或本發明之疫苗的給藥之後5分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、30分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、12小時、24小時和48小時；以及(4)在投與本發明之重組病毒及/或本發明之疫苗的給藥之後3天、7天、14天、21天、28天、35天、42天、49天和56天，經由留置套管或直接靜脈穿刺，使用10毫升紅蓋的真空採血管，收集血液試樣。容許試樣在室溫下凝固，並將在離心之後收集血清。
可藉著ELISA定量在得自患者之試樣中，對抗本發明之重組病毒及/或本發明之疫苗所產生的抗體含量。亦可監視在PBMC和肺臟及鼻灌洗液中的T-細胞免疫力(細胞毒性和協助者反應)。
藉著從在投予本發明之重組病毒及/或本發明之疫苗的給藥之後，在每個收集間隔處的血清含量，減去給藥前的血清含量(背景含量)，修正在志願者血清中之抗體含量的濃度。對每個志願者，根據模式-獨立性方法(Gibaldi等人，編輯，1982,Pharmacokinetics，第2版，Marcel Dekker,NewYork)，從經過修正的血清抗體或抗體片段濃度，計算藥物動力學參數。
4.14.檢測和診斷哺乳動物MPV的方法
本發明提供診斷及/或檢測MPV的裝置和方法，使用該裝置和方法來檢測MPV、其組份及及轉錄、轉譯、表現、繁殖和代謝過程的產物。更特定而言，本發明提供在動物和人類中診斷MPV感染的裝置和方法，該裝置和方法包括，但不限於檢測MPV之組份、MPV生活史之產物，以及宿主對MPV暴露或感染之反應的產物。
在一個具體實施例中，本發明提供診斷和檢測MPV的裝置和方法，該裝置和方法包括，但不限於檢測基因組物質，以及其他與MPV有關或互補的核酸，檢測MPV的轉錄和轉譯產物，該產物是經過加工或未經加工的，並檢測宿主對MPV暴露或感染之反應的組份。
在一個具體實施例中，本發明係關於經由與出現在MPV之基因組內的核酸序列互補之寡核苷酸，以及核酸序列之轉錄產物的製備和使用，來檢測MPV。此外，本發明亦關於使用該寡核苷酸作為引子，複寫或擴大MPV基因組的特定區域及其轉錄本，來檢測出現在MPV之基因組中的核酸或其序列，及其轉錄產物。可複寫或擴大的MPV基因組之區域及其轉錄本，包括但不限於一或多片完整或不完整的下列基因：N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因和L-基因。在特定的具體實施例中，為了確認之目的，使用寡核苷酸作為引子，連同複寫或擴大MPV之N-基因或其轉錄本的方法。該方法包括，但不限於RT-PCR測定，引子延伸或執行測定，以及其他使用MPV之遺傳物質或其轉錄本和互補物作為模板，從該寡核苷酸中延伸核酸序列的方法。
在其他的具體實施例中，本發明係關於經由與出現在MPV之基因組內的核酸序列互補之寡核苷酸，以及核酸序列之轉錄產物的製備和使用，來檢測MPV。此外，本發明亦關於使用該寡核苷酸序列作為探針，與在MPV基因組中或與其互補之特定區域及其轉錄本雜交並檢測它，來檢測出現在MPV之基因組及其轉錄產物中，或與其互補的核酸或其序列。可使用雜交探針檢測之MPV基因組的區域及其轉錄本，包括但不限於一或多片完整或不完整的下列基因：N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因和L-基因。在特定的具體實施例中，為了確認之目的，使用寡核苷酸作為探針，連同檢測、黏接或與MPV之N-基因或其轉錄本雜交的方法。該方法包括，但不限於北方墨點、南方墨點，以及其他使用MPV之遺傳物質或其轉錄本和互補物作為標靶，與在MPV基因組中，或與其互補之序列或序列片雜交、黏接或檢測的方法。
可在本發明之方法中，使用可與哺乳動物MPV之核酸，或其逆向互補物，或其互補物雜交的核酸，來檢測哺乳動物MPV的存在。在某些具體實施例中，該核酸在高嚴格度的條件下雜交。舉例來說，但不限於使用這類高嚴格度條件的過程如下。在65℃下，在由6X SSC、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM EDTA、0.02%PVP、0.02%Ficoll、0.02%BSA和500微克/毫升之變性鮭精DNA所組成的緩衝溶液中，進行含有DNA之濾紙的預先雜交8小時至過夜。在65℃下，在含有100微克/毫升之變性鮭精DNA和5-20 X 106cpm 32P-標示之探針的預先雜交混合物中，使濾紙雜交48小時。在37℃下，以含有2X SSC、0.01%PVP、0.01%Ficoll和0.01%BSA的溶液沖洗濾紙1小時。接著在50℃下，在放射自顯術之前，以0.1X SSC沖洗45分鐘。其他可使用之高嚴格度的條件，為此項技藝中已熟知的。在本發明其他的具體實施例中，在中等或低嚴格度的條件下進行雜交，這類條件為熟諳此藝者已熟知的(參見，例如Sambrook等人，1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York；亦參見Ausubel等人，編輯，在the Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals中,1987-1997 Current Protocols,1994-1997 John Wiley and Sons,Inc.)。
在其他的具體實施例中，本發明係關於經由抗體的製備和使用，例如單株抗體(MAbs)，其對MPV特有的肽或核酸，或其基因產物是專一的，並可認出它們，在動物或人類宿主中檢測MPV的感染。可被該MAbs認出之抗原決定位或抗原決定位，包括但不限於在生命週期和涉及MPV繁殖之代謝過程期間合成的蛋白質和核酸產物。可用來作為抗原決定位，產製適當抗體的蛋白質或核酸產物，包括但不限於一或多個下列MPV組份的完整或不完整轉錄和表現產物：N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因和L-基因。在一個特定的具體實施例中，使用對G-基因之蛋白質產物或其部分升高的MAbs，連同其他在生物試樣，例如體液中，檢測或證實表現G肽之MPV的存在的方法。該方法包括但不限於ELISA、放射性-免疫或競爭測定、免疫-沉澱和其他使用MPV之轉錄或表現基因產物作為標靶，以便藉對該標靶或其部分和關係物升高的MAbs來檢測的方法。
在其他的具體實施例中，本發明係關於與宿主對MPV暴露或感染之免疫反應有關，並為其特徵的因子。當暴露或被MPV感染時，宿主的免疫系統誘發對該暴露或感染的反應，其涉及針對排除或減弱病毒的影響及/或繁殖，由宿主產生抗體。本發明提供經由檢測可能因MPV暴露或感染宿主之結果而產生的該抗體，診斷與MPV有關之疾病的裝置和方法。由該抗體認出之抗原決定位，包括但不限於肽及其暴露表面，其可供宿主的免疫反應利用，並可在由宿主對病毒產生反應反應時，作為抗原決定位。可由宿主免疫反應用來當作產製抗體之抗原決定位的一些蛋白質和核物質，包括但不限於一或多個下列MPV組份的產物：N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因和L-基因。在一個具體實施例中，在宿主試樣中檢測對編碼MPV之肽的N-基因的部分或全部可利用部分的抗體。在特定的具體實施例中，使用G-基因或其一部分的蛋白質產物，連同其他在生物試樣，例如體液中，檢測宿主衍生之抗體的存在的方法。該方法包括但不限於ELISA、放射性-免疫或競爭測定，及其他使用MPV之轉錄或表現基因產物作為標靶，以便藉著認得該產物的宿主抗體來檢測，並在生物試樣中找到該宿主抗體的方法。
本發明亦提供診斷測定或測試套組的裝置和方法，以及從各種來源，包括但不限於生物試樣，例如體液中，檢測MPV之感染原的方法。在一個具體實施例中，本發明係關於適用於確認MPV核酸或其互補物的測定、套組、草案和程序。在其他的具體實施例中，本發明係關於適用於確認MPV表現肽或其一部分的測定、套組、草案和程序。在另一個具體實施例中，本發明係關於適用於確認宿主對MPV暴露或感染之免疫學反應之組份的測定、套組、草案和程序。
除了宿主感染MPV的診斷證明之外，本發明亦提供將MPV之分離株歸類至不同系統發生組或亞組中的裝置和方法。在一個具體實施例中，可有利地使用該特徵，區別MPV的不同變種，變種A1、A2、B1和B2，以便設計更有效和亞組專一的療法。可以一或多個下列基因之核苷酸或胺基酸序列為基礎：N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因和L-基因，區別MPV的變種。在特定的具體實施例中，可使用G基因或糖蛋白的核苷酸或胺基酸序列，以及使用亦認得G糖蛋白之單株抗體的中和測試，將MPV區分成特定的亞組。
在一個具體實施例中，使用任何熟諳此藝者已熟知的技術，例如免疫測定，在人類中進行MPV感染的診斷。可用來分析免疫專一之結合作用和交叉-反應性的免疫測定，包括但不限於競爭性和非-競爭性的測定系統，其使用諸如西方墨點、放射性免疫測定、ELISA(酵素連結之免疫吸附測定)、三明治免疫測定、免疫沉澱測定、沉澱素反應、凝膠擴散沉澱反應、免疫擴散測定、血球凝集測定、補體-結合測定和螢光免疫測定之類的技術，其他還有很多。這類測定是例行的，並為此項技藝中已熟知的(參見，例如Ausubel等人，編輯，1994,Current Protocols in Molecular Biology，第l冊，John Wiley&Sons,Inc.,New York，將其全文以引用的方式併入本文中)，並在第4.7.10節中，說明免疫測定的非限制性實例。
在一個具體實施例中，本發明係關於使用寡核苷酸，連同PCR或引子延伸方法，複寫或擴大MPV基因組之區域，該區域包括但不限於基因或基因的部分，例如N、M、F、G、L、M、P和M2基因，來檢測MPV感染。在特定的具體實施例中，使用寡核苷酸，連同RT-PCT方法。在更進一步的具體實施例中，可利用與在各種hMPV品系之間受到保留，或在各種hMPV品系中是不同的特定序列互補的寡核苷酸，來探測擴大產物及/或遺傳物質。後面的寡核苷酸組將容許確認造成感染宿主之hMPV的特定品系。
本發明提供在hMPV的不同亞組和變種之間，區別能夠感染宿主之hMPV的方法。在一個特定的具體實施例中，將造成宿主感染之hMPV歸類為特定的亞組，例如亞組A或亞組B。在另一個特定的具體實施例中，將造成宿主感染之hMPV歸類為亞組的特定變種，例如變種A1、A2、B1或B2。在另一個具體實施例中，本發明提供將造成宿主感染之hMPV歸類為新亞組及/或新或現存亞組之新變種的裝置和方法。能夠區分hMPV品系為亞組及/或變種組的方法，將是熟諳此藝者已知的。在一個具體實施例中使用多株抗體來確認感染的病原為hMPV之品系，並使用二級抗體區別該品系是否具有hMPV之新的或已知亞組及/或新的或已知變種的特徵。在一個具體實施例中，使用對hMPV有選擇性的抗體，連同免疫反應性測定，例如ELISA或RIA，在生物試樣中確認hMPV暴露或感染的存在。在更進一步的具體實施例中，使用對在hMPV蛋白質之肽序列中，特定抗原決定位有選擇性的二級抗體，進一步將該經過確認之hMPV感染的病原歸類為亞組或變種。在一個特定的具體實施例中，使用對在所有hMPV亞組之間共享之肽抗原決定位升高的抗體，確認該感染之病原為hMPV。在更特定的具體實施例中，使用對hMPV之不同亞組及/或變種特有的肽抗原決定位升高的抗體，將造成宿主感染之hMPV歸類為已知或新的亞組及/或變種。在一個特定的具體實施例中，該抗體能夠區別不同的hMPV之亞組及/或變種，認出亞組或變種特有之hMPV肽的斷片，該肽包括但不限於由N、M、F、G、L、M、P和M2基因編碼的那些。可使用在各種hMPV蛋白質之已知肽序列中的差異，連同親水性計畫，判定在診斷測定中預期它將與溶劑接觸或可使用的適當肽斷片，來選擇可用來產製能夠區別不同的hMPV亞組或變種之抗體的肽或肽斷片。在一個具體實施例中，能夠區別hMPV之不同亞組的抗體，認得hMPV之不同亞組所特有之F蛋白質中的差異，例如在全長F蛋白質之位置286、296、312、348和404處的胺基酸。在其他特定的具體實施例中，能夠區別hMPV之不同亞組及/或變種的抗體，認得特定亞組或變種所特有之hMPVG蛋白質的斷片，例如可使用符合序列識別119號之胺基酸50至60的G肽序列，來區別亞組A和B，以及變種A1、A2、B1和B2。在本發明的另一個具體實施例中，使用hMPV分離株的核苷酸序列，來區別hMPV的不同亞組及/或不同變種。在一個具體實施例中，使用與在hMPV基因組中之序列互補的寡核苷酸序列、引子及/或探針，連同熟諳此藝者已知的方法，將hMPV感染之病原歸類為亞組及/或變種，例如RT-PCR、PCR、引子執行測定和各種墨點技術。在一個特定的具體實施例中，使用RT-PCR，使用生物試樣來複寫或擴大hMPV基因組的特定斷片。在更進一步的具體實施例中，獲得該斷片的序列，並與hMPV的已知序列相比較，並使用該比較將hMPV品系歸類為不同的亞組或變種，或將hMPV品系歸類為新的亞組或變種。在另一個具體實施例中，本發明係關於可用來區別hMPV之不同亞組及/或變種的診斷套組。
在較佳的具體實施例中，利用對引起該感染之特定病毒最專一的試劑，進行特定病毒感染的診斷及/或治療。在該情況下，係利用對MPV最專一之試劑，進行該診斷及/或治療MPV的較佳方法。然而，這並非意指排除了較不專一的可能性，但使用例如具有充分交叉反應性的試劑代替，因為它們是較易獲得的，並足以完成手邊的工作。例如，在此處舉例提供利用衍生自APV之試劑，特別是衍生自APV-C的試劑，在哺乳動物中，進行MPV感染之病毒學及/或血清學診斷，在本文中的詳細說明中，例如，顯示可藉著使用特別為了檢測鳥類之APV抗體設計的ELISA，完成哺乳動物之MPV感染的充分可靠之血清學診斷。為了該目的而特別有用的測試，是為了檢測APV抗體(例如在血清或卵黃中)所設計的ELISA測試，已知其一市售版本是APV-Ab係由SVANOVA Biotech AB,Uppsal Science Park Glunten SE-751 83 Uppsala Sweden製造。逆向的狀況亦是例證，在此處舉例提供利用衍生自MPV之試劑，在哺乳動物中，進行APV感染之病毒學及/或血清學診斷，在本文中的詳細說明中，例如，顯示在哺乳動物中，可藉著使用為了檢測MPV抗體設計的ELISA，完成鳥類之APV感染的充分可靠之血清學診斷。考量抗原和抗體具有鎖與鑰匙的關係，可藉著選擇具有充分交叉-反應性的適當抗體，完成各種抗原的檢測。當然，為了依賴這類交叉-反應性，最好是在存在於各種病毒之各種(糖)蛋白之間的胺基酸同種性的指導之下選擇試劑(像是抗原或抗體)，藉此使欲在依賴該交叉-反應性之測試中使用，與最具同種性之蛋白質有關的試劑，將是最有用的。
至於核酸檢測，甚至是更直接地，改而以各種病毒之異種核酸序列為基礎來設計引子或探針，並因此檢測本質上在哺乳動物或禽類間質肺病毒之間的差異，它滿足以那些顯示出高同種性的病毒專一之核酸序列片為基礎，設計或選擇引子或探針。通常，對核酸序列而言，90%或更高，保證足夠的交叉反應性，將依賴在診斷測定中，所使用的雜交嚴格條件。
本發明舉例提供以血清學之方式診斷動物之MPV感染的方法，特別是哺乳動物，更特定而言是人類，包括在該動物之試樣中，藉著使該試樣與根據本發明之MPV的特定核酸或抗體反應，判定病毒分離株或其組份的存在，且該以血清學之方式診斷哺乳動物之MPV感染的方法，包括在該哺乳動物之試樣中，藉著使該試樣與MPV-專一之蛋白質分子或其片段，或根據本發明之抗原反應，判定專一地針對MPV或其組份之抗體的存在。本發明亦提供診斷MPV感染，包括MPV、MPV-專一之核酸、其蛋白質分子或片段、根據本發明之抗原及/或抗體的診斷套組，且更佳的是檢測該MPV、MPV-專一之核酸、其蛋白質分子或片段，抗原及/或抗體的裝置，該裝置包括例如可刺激之基團，像是在此項技藝中使用的螢光團或酵素檢測系統(適當之診斷套組格式的實例，包括IF、ELISA、中和測定、RT-PCR測定)。欲判定一尚未確認之病毒組份或其合成類似物，像是核酸、其蛋白質分子或片段是否為MPV-專一的，其足以分析該組份之核酸或胺基酸序列，例如對一片該核酸或胺基酸而言，較佳的是至少10個，更佳的是至少25個，再更佳的是至少40個核苷酸或胺基酸(分別)，藉著序列同種性比較，按照在本文中提供的，使用例如系統發生分析，與已知的MPV序列比較，並與已知的非-MPV序列比較(最好使用APV-C)。依據與該MPV或非-MPV序列之關係的程度，可確認組份或合成類似物。
本發明亦提供以病毒學之方式診斷哺乳動物之MPV感染的方法，包括在該哺乳動物之試樣中，藉著使該試樣與衍生自APV(最好是血清型C)之交叉反應性的核酸，或與該APV起反應之交叉-反應性抗體反應，來判定病毒分離株或其組份的存在，且該以血清學之方式診斷哺乳動物之MPV感染的方法，包括在該哺乳動物之試樣中，藉著使該試樣與蛋白質分子或其片段，或衍生自APV之抗原反應，來判定亦針對APV或其組份之交叉反應性抗體的存在。此外，本發明亦提供最初為了APV或APV-抗體檢測而設計之診斷套組的用途，以便用來檢測MPV感染，特別是在人類中檢測該MPV感染。
本發明亦提供在鳥類中，以病毒學之方式診斷APV感染的方法，包括在該鳥類之試樣中，藉著使該試樣與衍生自MPV之交叉-反應性核酸，或與該MPV有反應之交叉反應性的抗體反應，來判定病毒分離株或其組份的存在，且該以血清學之方式診斷鳥類APV感染的方法，包括在該鳥類的試樣中，藉著使該試樣與衍生自MPV之蛋白質分子，或其片段或抗體反應，來判定亦針對MPV或其組份之交叉-反應性抗體的存在。此外，本發明亦提供最初為了MPV或MPV-抗體檢測而設計之診斷套組的用途，以便用來檢測APV感染，特別是在諸如雞、鴨或火雞之類的禽類中，檢測該APV感染。
至於可供治療用的診斷，可使用在不同哺乳動物MPVs中，以及在MPV與其他病毒之間的高度同種性，像是例如APV，特別是當手邊的情況使用較具同種性，較不直接的途徑時。當不能獲得較具同種性的MPV疫苗時，例如，可利用衍生自APV(最好是C型)分離株的疫苗製品，進行不能等的疫苗接種，像是對MPV感染之緊急疫苗接種，且反之亦然，可預期利用衍生自MPV的疫苗製品，進行對抗APV感染的疫苗接種。再者，逆向遺傳技術使其可能產生嵌合型APV-MPV病毒構築體，其可用來作用疫苗，且與每個欲減毒至想要程度之個別品系的田野分離株是充分不同的。對我們而言，在疫苗製備上，類似的逆向遺傳技術，將使其可能產生嵌合型副黏液病毒-間質肺病毒構築體，像是RSV-MPV或P13-MPV構築體。這類構築體在作為對抗呼吸道疾病之混合疫苗上是特別有用的。
因為MPV CPE幾乎不能與在tMK或其他細胞培養物中，由hRSV或hPIv-1引起的區別，故未曾充分地注意到MPV，直到現在為止。tMK(三級猴腎細胞，即在細胞培養中第三次繼代的MK細胞)是最偏好使用的，因為與原始或二級培養物相比較，它是較低成本的。CPE之特徵為形成融合細胞，像某些典型的副黏液病毒一樣，隨後細胞顯示出迅速的內部瓦解，接著細胞從單層中脫離。細胞通常(但並非總是)在病毒從最初之材料三次繼代之後，在接種後10至14天，展現出CPE，比由諸如hRSV或hPIV-1之類的其他病毒略晚一些。
例如，本發明提供不是先前確認的副黏液病毒，其得自28個罹患嚴重RTI之兒童的鼻咽抽吸試樣。這些兒童的臨床症狀相當類似由hRSV引起的症狀。27個患者是小於5歲的兒童，而其中的一半是在1到12個月大之間。另一個患者是18歲。所有的個體均受上RTI之苦，症狀範圍從咳嗽、肌痛、嘔吐和發燒到支氣管炎和嚴重的肺炎。這些患者大部分都住院1至2週。
得自這些患者的病毒分離株，在負對比電子顯微鏡中，具有副黏液病毒之形態學，但不與對抗已知之人類和動物副黏液病毒的專一抗血清反應。藉著間接免疫螢光測定(IFA)，利用對分離株中的兩個升高的血清，判定它們互相都是密切相關的。這些分離株中九個的序列分析，顯示該病毒多少與APV有關。以病毒學資料、序列同一性和基因組的組織化為基礎，我們提出該病毒是間質肺病毒屬的成員。血清學的調查顯示該病毒是相對上較普遍的病原，因為在荷蘭的血清流行，5歲的人接近100%。此外，在1958年中收集自人類的血清中，發現血清流行是同樣地高，表示該病毒已經流傳在人類族群中，超過40年。所提出之間質肺病毒屬新成員的確認，現在亦提供診斷測定或測試套組之裝置和方法，以及病毒性呼吸道感染之疫苗或血清或抗體組合物，以及測試或篩選可用來治療MPV感染之抗病毒劑之方法的發展。
在本文中提供之方法和裝置，在診斷MPV感染之診斷套組中是特別有用的，不管其藉著病毒學或血清學的診斷。例如，這類套組或測定可包括病毒、核酸、蛋白質分子或其片段、根據本發明之抗原及/或抗體。病毒、核酸、蛋白質分子或其片段、根據本發明之抗原及/或抗體的使用，亦可供產製醫藥組合物，例如用來治療或預防MPV感染及/或治療或預防呼吸道疾病，特別是在人類。可藉著建立為了該目的而發展的方法，達成病毒的減毒，包括但不限於使用其他物種的相關病毒、經由實驗室動物及/或組織/細胞培養的連續繼代、分子選殖的指定位置之突變生成作用，以及在相關的病毒之間交換基因或基因片段。
5.病毒分離及定出特徵
5.1.實例1：樣本收集、病毒分離，定出病毒之特徵
從宿主中獲得鼻咽抽吸物的試樣，測定病毒的存在，並亦定出那些已確認者的特徵。從受呼吸道感染(RTI)之苦的兒童中收集鼻咽抽吸物。為了判定致病者的身份，藉著直接免疫螢光測定(DIF)測試所有的鼻咽抽吸物(參見在實例9中的方法)，使用對抗流感病毒A和B型、hRSV，和人類副流感病毒(hPIV)第1、2和3型之螢光標示的抗體。亦使用快速殼瓶(rapid shell vial)技術(Rothbarth等人，1999,J of Virol. Methods 78:163-169)，在各種細胞株上，從鼻咽抽吸物中分離病毒，包括VERO細胞、三級獼猴腎臟(tMK)細胞、人類內皮肺臟(HEL)細胞和馬彬達克(marbin dock)腎臟(MDCK)細胞。藉著間接免疫螢光測定(IFA)(參見在實例11中的方法)，測試在2至3次繼代之後顯示出致細胞病變作用，並在DIF測定中為陰性的試樣，使用對抗流感病毒A、B和C、hRSV A和B型、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人類副流感病毒(hPIV)第1至4型、仙臺病毒、猿病毒第5型和新城雞瘟病毒的病毒專一性抗體。雖然對許多案例而言，可能確認出致病原，但有些試樣對所有受試的病毒是陰性的。
這28個未確認之病毒分離株，在tMK細胞中緩慢生長，在VERO細胞和A549細胞中生長不佳，而在MDCK細或雞胚纖維母細胞中幾乎不生長。大多數的病毒分離株，在第10至14天之間，在tMK細胞上引起CPE。這比由其他病毒，像是hRSV或hPIV引起的CPE略晚一些。該CPE幾乎不能與hRSV或hPIV在tMK或其他細胞培養物中引起的CPE區別，且其特徵為融合細胞的形成。一些在細胞上觀察到的影響，包括快速的內部瓦解，接著細胞從單層中脫離。
使用被感染之tMK細胞的上清液，進行電子顯微鏡(EM)分析，而其顯示直徑範圍從150至600毫微米之類-副黏液病毒的病毒顆粒的存在，具有範圍從13至17毫微米的短被膜突起。與有被膜病毒，像是副黏液病毒科之病毒的生化特性一致，標準氯仿和醚處理(Osterhaus等人，1985,Arch. of Virol. 86:239-25)，結果在tMK細胞的感染性上，產生超過104 TCID50 的降低。被病毒感染之tMK細胞培養物的上清液，對火雞、雞和天竺鼠的紅血球，並未顯示出血球凝集活性。在培養期間，病毒複製似乎是胰蛋白酶依賴性的。這些綜合的病毒學資料，證實新確認的病毒是副黏液病毒科分類學上的成員。
從利用15個未經確認之病毒分離株感染的tMK細胞中萃取出RNA，用來進行逆轉錄和聚合酶連鎖反應(RT-PCR)分析，使用對副黏液病毒專一的引子組(K.B. Chua等人，2000,Science 288:1432-1435)，像是：hPIV1-4、仙臺病毒、猿病毒第5型、新城雞瘟病毒、hRSV、摩比利、腮腺炎、立百、亨德拉(Hendra)、塔派亞(Tupaia)和瑪普拉(Mapuera)病毒。在低嚴格度的條件下進行RT-PCT測定，以便檢測可能有關的病毒。使用從同種病毒母液中分離出的RNA，作為對照組。可獲得之對照組與個別病毒-專一的引子有陽性的反應，但新確認之病毒分離株不與任何引子組反應，表示該病毒與受試病毒並不是密切相關的。
使用病毒-感染之tMK細胞培養物上清液中的兩個，以鼻內接種天竺鼠和雪貂。在接種後第0天、2週和3週，從這些動物中收集血清試樣。動物們並未出現臨床症狀，然而，在病毒中和(VN)(參見在實例16中的方法)測定，以及對抗同種病毒之間接IFA中，檢測並測量到所有動物的血清轉變。在間接IFA中，血清並未與任何上述已知的副黏液病毒，或與老鼠的肺病毒(PVM)反應。篩選到目前為止尚未確認的病毒分離株，使用天竺鼠和雪貂感染-前和後的血清。藉著間接IFA，其中28個對感染-後的血清是明顯陽性的，因此暗示尚未確認之病毒分離株是密切相關或相同的。
為了進一步定出病毒的特徵，在細胞株上檢查病毒感染的表現型影響。簡言之，以補充有10%胎牛血清(Bio-Whittaker,Vervier,Belgium)的下述培養基，在含有玻片(Costar,Cambridge,UK)的24孔培養盤中培養tMK細胞。在接種之前，以PBS沖洗培養盤，並補充帶有漢克氏(Hank's)鹽的鷹氏(Eagle's)MEM(ICN,Costa mesa,CA)，其中每0.5毫升補充0.26克NaHCO3 、0.025M Hepes(Biowhittaker)、2mM L-穀胺醯胺(Biowhittaker)、100單位青黴素、100微克鏈黴素(Biowhittaker)、0.5克乳清蛋白(Sig ma-Aldrich,Zwijndrecht,The Netherlands)、1.0克D-葡萄糖(Merck,Amsterdam,The Netherlands)、5.0克腖(Oxoid,Harrlem,The Netherlands)和0.02%胰蛋白酶(Life Technologies,Bethesda,MD)。以鼻咽抽吸試樣的上清液接種培養盤(每孔0.2毫升，一式三份)，接著以840xg離心1小時。在接種之後，在37℃下培養該盤最多14天，並每週更換培養基一次，並每天就CPE檢查培養物。在14天之後，從第二次繼代中刮下細胞，並培養14天。重覆該步驟至第三次繼代。使用玻片，藉著按照下述的間接IFA，證實病毒的存在。
通常在第三次繼代之後，在第8至14天之間，視分離株而定，觀察到CPE。該CPE幾乎不能與由hRSV或hPIV在tMK或其他細胞培養物中引起的CPE區別，除了hRSV在大約第4天引起CPE之外。CPE之特徵為融合細胞的形成，隨後細胞顯示迅速的內部瓦解，接著細胞從單層中脫離。至於有些分離株，不易觀察到CPE，而在這些培養物中使用IFA證實病毒的存在。CPE不能與其他病毒之CPE區別的觀察，表示不能從臨床症狀的肉眼檢查來進行診斷。
5.2.實例2：在人類族群中的血清流行
欲研究該病毒在人類族群中的血清流行，藉著間接IFA，使用以未確認病毒分離株之一感染的tMK細胞，分析得自不同年齡群之人類的血清。研究顯示可在25%的6至12個月齡的兒童中，檢測到對該病毒之抗體。此外，5歲兒童中，將近100%是血清陽性的。藉著間接IFA和藉著VN測定，總共檢查了56個血清試樣。其中51個或91%的試樣，VN測定的結果，即力價大於8，與間接IFA所獲得的結果，即力價大於32的符合。發現4個試樣在IFA中為陽性，在NV測定中為陰性，即力價小於8，而一個試樣在IFA中為陰性，即力價小於32，但在VN測定中為陽性，即力價為16(圖2)。
對72個於1958年獲自人類的血清試樣進行IFA，其中年齡範圍是從8-99歲，顯示100%的血清流行率，表示該病毒已經流傳在人類族群中，超過40年。此外，許多在VN測定中使用的這些血清試樣，證實了IFA資料(圖2)。血清流行資料表示，該病毒已經是許多年來感染人類族群的重要來源。
從得自罹患嚴重RTI之兒童的臨床試樣中重覆分離出該病毒，指出MPV在臨床和經濟上的影響可能很高。以病毒檢測和血清學為基礎的新穎診斷測定，將產生發生率，還有該病毒性病原在臨床和經濟上之影響的更詳細分析。
在IFA和VN結果之間的輕微差異(5個試樣)，已經可歸因於在IFA中，只檢測IgG血清抗體，而VN測定則檢測抗體之種類和亞類兩者的事實。或者，差異可歸因於在兩種測定之間，在敏感性上的差異。關於IFA，使用16之閾值，對VN而言，則使用8之值。
在IFA和VN測定結果之間的差異，亦可表示在該新近確認之病毒的血清型之間的可能差異。因為MPV似乎與APV的關係最密切，推測該人類病毒可能是起源於鳥類。在1958年取自人類之血清試樣的分析，顯示MPV已廣泛分布在人類族群中，超過40年，代表該假設的動物傳染病事件，已早在1958年的很久以前發生。
5.3.實例3：hMPV分離株00-1的基因組序列
為了獲得未知病毒分離株的序列資訊，使用已知為RAP-PCR的擴大策略(Welsh等人，1992,NAR 20:4965-4970)(參見實例19)。簡言之，以一種病毒分離株(分離株00-1)，和作為陽性對照組的hPIV-1感染tMK細胞。在兩個培養物展現出類似程度的CPE之後，在連續的20-60%蔗糖梯度上，純化在培養物上清液中的病毒。藉著EM，就類似病毒之顆粒，來檢查梯度溶離份，並從其中觀察到核包核酸，含有大約50%蔗糖的溶離份中，分離RNA。使用從兩種病毒溶離份中分離出的等量RNA，進行RAP-PCR，隨後在3%NuSieve瓊脂糖凝膠上，使試樣並排地跑。接著從凝膠中純化對未確認病毒專一的20個差別呈現的譜帶，選殖到質體pCR2.1(Invitrogen)內，並利用載體-專一之引子定序(參見實例20)。使用經由National Library of Medicine獲得的BLAST程式，對在Genebank資料庫中的序列搜尋同種性，在20個片段中找出10個對APV/TRTV序列展現出類似性。
這10個片段係位在編碼核蛋白(N；片段1和2)、基質蛋白質(M；片段3)、融合蛋白質(F；片段4、5、6、7)和聚合酶蛋白質(L；片段8、9、10)的基因中(圖3)。以RAP PCR片段和已公開之肺病毒亞科的前導和拖尾序列(Randhawa等人,1997,J. Virol. 71:9894-9854)為基礎，設計PCR引子，使病毒基因組之3'末端的序列資訊完整。擴大3個片段，其中片段A跨越N開放編閱架構(ORF)的最3'末端，片段B跨越磷蛋白(F)ORF，而片段C靠近在M和F PRF之間的間隙(圖16)。這三個片段的序列分析，顯示在病毒基因組的最3'端，缺少NS1和NS2 ORFs，且將FORF配置在緊鄰M ORF之處。該基因組的組織化，類似間質肺病毒APV的組織化，其亦與序列同種性相符。可藉著比較圖4的胺基酸序列，與其他病毒個別的N蛋白質之胺基酸序列，來推論在不同病毒之間的關係。N、P、M和F ORFs的轉譯序列，整體上對肺病毒屬的成員，顯示出平均30-33%的同種性，並對間質肺病毒屬的成員，顯示出66-68%的同種性。至於SH和G ORFs，與任一屬之成員，沒有發現可辨別的同種性。對於N ORF之胺基酸序列所發現的胺基酸同種性，顯示與hRSV有大約40%的同種性，而與在遺傳上關係最密切的APV-C則有88%。P ORF之胺基酸序列，顯示與hRSV有大約25%的同種性，而與APV-C則有大約66-68%，M ORF顯示與hRSV有大約36-39%的同種性，而與APV-C則有大約87-89%，F ORF顯示與hRSV有大約40%的同種性，而與APV-C則有大約81%，M2-1 ORF顯示與肺病毒有大約34-36%的同種性，而與APV-C則有84-86%，M2-2 ORF顯示與肺病毒有15-17%的同種性，而與APV-C則有56%，而獲自LORF之片段顯示與肺病毒有平均44%的同種性，而與APV-C則有64%。
N、M、P和F基因的遺傳分析，顯示MPV對最近提出之間質肺病毒亞科，與肺病毒亞科相比較，有較高的序列同種性，並因此證實基因組之組織化，類似並與APV/TRTV的組織化相似。與 RSVs('3-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5')的組織化相反，間質肺病毒缺乏NS1和NS2基因，且亦具有不同的基因組組織化，特別是在M和L('3-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5')基因之間。在本發明之病毒分離株中，缺乏在M和F基因之間的ORFs，缺乏與N相鄰的NS1和NS2，並在APV中發現高度的胺基酸同種性，引導建議將分離自人類的MPV歸類為哺乳動物，更特定而言為人類之間質肺病毒屬的第一個成員。
系統發生分析顯示，從其中獲得序列資訊的九個MPV分離株，是密切相關的。雖然序列資訊是有限的，但它們彼此之間的關係，似乎比對任何禽間質肺病毒的關係更密切。已經描述了APV的四種血清型，血清型C似乎與MPV的關係最密切。該結論係以N、P、M和F基因的核苷酸序列類似性為基礎。然而，請注意，對血清型D而言，只能從Genebank中獲得F基因的部分序列，對血清型B而言，只能獲得M、N和F序列。在系統發生樹狀圖中，我們的MPV分離株形成兩叢。對hRSV和APV兩者而言，已經描述了不同的遺傳和血清學亞型。MPV分離株的兩個遺傳叢，是否代表在功能上亦有差異之血清學亞組，目前仍是未知的。我們的血清學調查顯示，MPV是普遍的人類病原。
5.4.實例4：進一步定出相關基因的特徵
MPV之核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質蛋白質(M)和融合蛋白質(F)基因的序列分析，顯示與在美國主要在鳥類中發現的禽肺病毒，APV血清型C，有最高程度的序列同種性。這些分析亦顯示在病毒基因組的3'端，缺乏非-結構性蛋白質NS1和NS2，並將融合蛋白質配置在緊鄰基質蛋白質之處。確認出22K(M2)基因、小忌水性(SH)基因、附接(G)基因、聚合酶(L)基因、基因間區域和拖尾序列。與先前描述的序列組合，在此處提供之序列，使MPV之基因組序列完整，除了基因組終端的最終12-15個核苷酸之外，並建立MPV的基因組組織化。並排地比較MPV基因組之序列與APV亞型A、B和C，RSV亞型A和B，PVM和其他副黏液病毒的那些，提供了將MPV歸類為間質肺病毒屬強有力的證據。
編碼核蛋白(N)的基因：如同上文所示，在MPV之基因組輿圖中的第一個基因，係編碼394個胺基酸(aa)蛋白質，並對其他肺病毒之N蛋白質顯示出廣泛的同種性。NORF的長度與APV-C之NORF的長度相同(表4)，但比其他副黏液病毒的那些更小(Barr等人，1991,J Gen Virol72:677-85)。胺基酸序列的分析，顯示與APV-C有最高的同種性(88%)，與其他副黏液病毒僅有7-11%(表5)。
確認出在屬於單負股病毒目之病毒之間三個區域的類似性：A、B和C(圖22)(Barr等人，1991,J Gen Virol 72:677-85)。雖然在病毒科中的類似性是最高的，但在所觀察的病毒科之間，這些區域是高度保留的。在所有的三個區域中，MPV對APV-C顯示出97%aa的序列同一性，與APV-B顯示出89%aa的序列同一性，與APV-A顯示出92%aa的序列同一性，並與RSV和PVM顯示出66-73%aa的序列同一性。在aa殘基160至340之間的區域，似乎在間質肺病毒中是高度保留的，並比肺病毒亞科略小(Miyahara等人，1991,Arch Viral 124:255-68；Li等人，1996,Virus Res 41:185-91；Barr,1991,J Gen Virol 72:677-85)。
編碼磷蛋白(P)的基因：在基因組輿圖中的第二個ORF，編碼294aa的蛋白質，其與APV-C的P蛋白質共享68%aa之序列同一性，但與RSV之P蛋白質僅有22-26%aa的序列同一性(表6)。MPV之P基因含有一個實質的ORF，就那一點來說，與得自許多其他副黏液病毒的P基因類似(在Lamb等人，Fields virology(B.K. Knipe,Hawley,P.M.,編輯.,LippencottRaven),Philadelphia,1996;Sedlmeier等人，1998,Adv Virus Res 50:101-39中回顧)。
與APVA和B，以及PVM相反，但與RSV和APV-C類似，MPVPORF缺乏半胱胺酸殘基。在所有肺病毒之間高度類似的區域(胺基酸185-241)，在RNA合成過程，或維持殼包核酸複合物之結構完整上，扮演某種角色(Ling等人，1995,Virus Res 36:247-57)。該高度類似的區域，亦出現在MPV中(圖6)，特別是在考慮保留性置換時，對APYC顯示出100%的類似性，對APV-A和B為93%，而對RSV約為81%。MPV P蛋白質之C-終端富含穀胺酸殘基，如同已經對APVs描述的(Ling等人，1995,Virus Res 36:247-57)。
編碼基質(M)蛋白質的基因：MPV基因組的第三個ORF編碼254aa的蛋白質，其與其他肺病毒的MORFs類似。MPV之MORF具有剛好與其他間質肺病毒之MORFs完全相同的尺寸，並對APV之基質蛋白質顯示出高的aa序列同種性(78-87%)，而對iRSV和PVM的那些顯示出較低的同種性(37-38%)，且對其他副黏液病毒的那些，顯示出10%或更低的同種性(表5)。
比較所有肺病毒的基質蛋白質之序列，並發現在殘基14至19處受到保留的七肽，在MPV中亦受到保留(圖7)(Easton等人，1997,Virus Res,48:27-33)。至於RSV、PVM和APV，已經確認在M之主要ORF中，或與其重疊之小的二級ORFs(在bRSV中為52aa和51aa，在RSV中為75aa，在PVM中為46aa，而在APV中為51aa)(Yu等人，1992，Viro1ogy 186:426-34;Easton等人，1997,Virus Res 48:27-33;Samal等人，1991,J Gen Virol 72:715-20;Satake等人，1995,J Virol 50:92-9)。在主要的M ORF中發現一個小的ORF，具有54 aa殘基(片段1，圖8)，始於核苷酸2281，以及與M之主要ORF重疊的一個小的ORF，具有33aa殘基，始於核苷酸2893(片段2，圖8)。與RSV和APV的二級ORFs類似， 在這些二級ORFs與其他肺病毒的二級ORFs之間，沒有顯著的同種性，且明顯缺乏開始或中止信號。此外，尚未有任何發生自這些二級ORFs之蛋白質合成的報告。
編碼融合蛋白質的基因：MPV之F ORF的位置與M ORF相鄰，這是間質肺病毒屬之成員特有的特徵。MPV之F基因編碼539aa的蛋白質，它比APV-C的F更長2個aa殘基。aa序列的分析，顯示與APV-C有81%同種性，與APV-A和B有67%，與肺病毒F蛋白質有33-39%，而與其他副黏液病毒僅有10-18%(表5)。在副黏液病毒之F蛋白質中，有一個保留的特徵，亦在MPV中看到，就是半胱胺酸殘基的分布(Morrison等人，1988,Virus Res 10:113-35;Yu等人，1991,J Gen Viro 172:75-81)。間質肺病毒在E1共享12個半胱胺酸殘基(7個被保留在所有的副黏液病毒中)，並在E2中共享2個(1個被保留在所有的副黏液病毒中)。在出現在MPV之FORF中3個可能的N-連接之糖基化作用位置中，沒有任何一個與RSV共享，而有2個(位置74和389)與APV共享。MPV之第三個獨特的、可能的N-連接之糖基化作用位置係位在位置206處(圖9)。
不管與其他副黏液病毒的低序列同種性，MPV之F蛋白質顯示出典型的融合蛋白質特徵，與針對其他副黏液病毒科成員之F蛋白質所作的那些描述相符(Morrison等人，1988,Virus Res 10:113-35)。副黏液病毒科成員的F蛋白質，是以失活前驅物(F0)的形式合成，由宿主細胞蛋白酶將其切開，產生胺基終端的E2次單元和大的羧基終端之F1亞單元。提出之切開位置(Collins等人，Fields virology,(B.N. Knipe,Howley,P.M.,編輯，Lippencott-Raven)，Philadelphia,1996)，被保留在副黏液病毒科的所有成員中。MPV之切開位置含有殘基RQSR。兩個精胺酸(R)殘基與APV和RSV共享，但穀胺醯胺(Q)和絲胺酸(S)殘基與其他的副黏液病毒共享，像是人類副流感病毒第1型、仙臺病毒和摩比利病毒。
認為在F1之胺基終端的忌水性區域，具有像膜融合功能部位一樣的功能，並在副黏液病毒和摩比利病毒中顯示出高序列類似性，但對肺病毒的程度較低(Morrison等人，1988,Virus Res 10:113-35)。在MPV與APV-C之間，保留了這26個殘基(位置137-163，圖9)，其與在間質肺病毒中高度保留的該區域一致(Naylor等人，1998,J Gen Virol 79:1393-1398;Seal等人，2000,Virus Res 66:139-47)。
如同在APV和其他副黏液病毒之F2次單元中看到的，與RSV相比較，顯示MPV刪除了22aa殘基(位置107-128，圖9)。此外，對RSV和APV而言，發現在亞型中保留了信號肽和固定功能部位，並在亞型之間展現出高度的變異性(Plows等人，1995,Virus Genesll:37-45;Naylor等人，1998,J Gen Virol 79:1393-1398)。在F2之胺基終端的MPV信號肽(aa 10-35，圖9)，對APV-C顯露出一些序列類似性(26aa殘基中有18個是類似的)，但對其他的APVs或RSV則較少保留。在E1之羧基終端的膜固定功能部位中，在亞型之間看到多很多的變異性，雖然仍對APV-C有一些同種性。
編碼M2蛋白質的基因：M2基因是肺病毒亞科所特有的，並在所有的肺病毒中觀察到2個重疊的ORFs。第一個主要ORF代表M2-1蛋白質，其提高病毒聚合酶的加工性(processivity)(Collins等人，1995,Proc Natl Acad Sci USA 92:11563-7;Collins等人，Fields virology(B.N. Knipe,Howley,P.M.,編輯，Lippencott-Raven)，Philadelphia,1996)，及其基因間區域的通讀(readthrough)(Hardy等人，1998，J Virol 72:520-6;Fearns等人，1999,J Virol 73:5852-64)。MPV的M2-1基因與F基因相鄰，編碼187aa之蛋白質，並對APv-C的M2-1顯示出最高的同種性(84%)。比較所有的肺病毒M2-1蛋白質，顯示在蛋白質胺基終端的那一半中，有最高的保留(Collins等人，1990,J Gen Virol 71:3015-20;Zamora等人，1992,J Gen Virol 73:737-41;Ahmadian等人，1999,J Gen Virol 80:2011-6)，其與在該蛋白質前80個aa殘基中，對APV-C展現出100%類似性之MPV的觀察(圖10)一致。MPV M2-1蛋白質含有3個半胱胺酸殘基，位在前30個aa殘基內，其被保留在所有的肺病毒中。經常在含鋅的蛋白質中，發現這類半胱胺酸的濃縮(Cuesta等人，2000,Gen Virol 74:9858-67)。
與肺病毒之M2-1 ORFs重疊的二級ORFs(M2-2)，被保留在某處，但不是在序列中，並認為涉及在病毒RNA複製與轉錄之間轉換的控制(Collins等人，1985,J Virol 54:65-71;Elango等人，1985,J Virol 55:101-10;Baybutt等人，1987,J Gen Virol 68:2789-96;Collins等人，1990,J Gen Virol 71:3015-21;Ling等人，1992,J Gen Virol 73:1709-15;Zamora等人，1992,J Gen Virol 73:737-41;Alansari等人，1994,J Gen Virol 75:401-404;Ahmadian等人，1999,J Gen Virol 80:2011-6)。對MPV而言，M2-2 ORF始於在M2-1 ORF中的核苷酸512處(圖8)，其剛好與APV-C的開始位置相同。M2-2 ORFs的長度與APV-C和MPV一樣，71 aa殘基。M2-2 ORF的序列比較(圖10)，在MPV和APV-C之間，顯示有64% aa序列同種性，而在MPV與APV-A和B之間，僅有44-48% aa序列同種性。
小忌水性(SH)基因ORF：該基因與hMPV之M2相鄰，或許編碼183 aa之SH蛋白質(圖8)。在該ORF與其他RNA病毒基因或基因產物之間，沒有可區別的序列同一性。這並不令人驚訝，因為在肺病毒SH蛋白質之間的序列類似性通常很低。SH ORF之aa組成，相對上較類似APV、RSV和PVM的組成，具有高百分比的蘇胺酸和絲胺酸殘基(hMPV、APV、RSV A、RSV B、bRSV和PVM分別為22%、18%、19%、20.0%、21%和28%)。hMPV之SH ORF含有10個半胱胺酸殘基，而APV SH含有16個半胱胺酸殘基。hMPV之SH ORF含有2個可能的N-連接之糖基化作用位置(aa 76和121)，而APV有1個，RSV有2或3個，且PVM有4個。
假定之hMPV SH蛋白質和APV與RSV之SH的親水性輪廓，顯露出類似的特徵(圖11B)。APV和hMPV之SH ORFs具有親水性的N-終端，中央的忌水性功能部位，其可作為可能的膜跨越功能部位(hMPV之aa30-53)，第二個忌水性功能部位(aa 155-170)，以及親水性的C-終端。相反的，RSVSH似乎缺少APV和hMPV ORFs的C-終端部份。在所有的肺病毒SH蛋白質中，忌水性功能部位均位在鹼性aa殘基的側面，這亦在hMPV之SH ORF中發現(aa 29和54)。
編碼附接蛋白質(G)的基因：hMPV之假定的G ORF與假定的SH基因相鄰，並編碼236aa之蛋白質(nt 6262-6972，圖8)。在該ORF之後，立刻找到二級的小ORF，可能編碼68 aa殘基(nt 6973-7179)，但缺少起始密碼子。第三個可能的ORF在第二個編閱架構中，具有194 aa殘基，與這些ORFs的兩者重疊，但亦缺少起始密碼子(nt 6416-7000)。在該ORF之後，是可能的第四個ORF，具有65 aa殘基，在相同的編閱架構中(nt 7001-7198)，再度缺少起始密碼子。最後，在第三個編閱架構中找到可能的ORF(nt 6444-6737，圖8)，具有97 aa殘基(但缺少起始密碼子)。不像第一個ORF，其他的ORFs沒有明顯的基因開始或基因結束序列(參見下文)。雖然236 aa之GORF或許代表至少一部分的hMPV附接蛋白質，它可能未排除以不同蛋白質來表現，或經由一些RNA編輯事件，以附接蛋白質之一部分來表現的額外密碼序列。應注意對APV和RSV而言，已經確認在主要的G ORF之後，沒有二級ORFs，但APV和RSV兩者，在G之主要ORF中均具有二級ORFs。然而，缺乏表現這些ORFs的證據，且在不同病毒的預測aa序列之間，沒有序列同一性(Ling等人，1992,JGen Virol 73:1709-15)。在hMPV G中的二級ORFs，未顯露出其他G蛋白質的特徵，且是否表現額外的ORFs，尚需進一步的調查。
利用所有ORFs的BLAST分析，顯示在核苷酸與aa序列層面上，與其他已知的病毒基因或基因產物，沒有可區別的序列同一性。這與對其他G蛋白質，像是hRSV A和B(53%)(Johnson等人，1987，J Virol 61:163-6)和APV A和B(38%)(Juhasz和Easton,1994,J Gen Viro175:2873-80)的那些所發現之低百分比序列同一性一致。
大多數的hMPV ORFs，在長度和序列兩方面，與APV的那些相似，假定的hMPV之GORF具有236 aa殘基，比APV之GORF小很多(表4)。aa序列顯示絲胺酸和蘇胺酸內含量為34%，甚至比RSV的32%和APV的24%更高。假定的GORF亦含有8.5%的脯胺酸殘基，比RSV的8%和APV的7%更高。在APV、RSV和hMPV之G蛋白質中，脯胺酸殘基的不尋常富含量，亦已經在為蛋白質三次元結構之主要決定位的糖蛋白中觀察到(Collins和Wertz,1983,PNAS80:3208-12;Wertz等人，1985,PNAS 82:4075-9;Jentoft,1990,Trends Biochem Sci 15:291-4)。hMPV之GORF含有5個可能的N-連接之糖基化作用位置，而hRSV有7個，bRSV有5個，且APV有3至5個。
hMPVG之預測的親水性輪廓顯露出類似其他肺病毒的特徵。N-終端含有親水性區域，接著是短的忌水性區(hMPV之aa33-53)，和主要的親水性C-終端(圖12B)。整體的組織化與在APV和RSV之G蛋白質中的區域完全一致。假定的hMPV之GORF僅含有1個半胱胺酸殘基，與RSV和APV(分別為5和20個)相反。注意到在G基因中的4個二級ORFs中，只有2個含有1個額外的半胱胺酸殘基，而這4個可能的ORFs顯示12-20%的絲胺酸和蘇胺酸，以及6-11%的脯胺酸殘基。
聚合酶基因(L)：與其他負股病毒類似，MPV基因組的最後一個ORF是複製和轉錄複合物的RNA-依賴性RNA聚合酶組份。MPV之L基因編碼2005 aa之蛋白質，其比APV-A蛋白質的長1個殘基(表4)。MPV之L蛋白質與APV-A共享64%同種性，與RSV共享42-44%，並與其他副黏液病毒共享大約13%(表5)。確認在非-斷片之負股RNA病毒的L蛋白質中，6個保留的功能部位；發現功能部位3含有四個核心聚合酶基序，認為它對聚合酶功能是不可或缺的(Poch等人，1990,J Gen Virol 71:1153-62;Poch等人，1989,EMBO J 8:3867-74)。這些基序(A、B、C和D)在MPVL蛋白質中是完全保留的:在基序A、B和C中:MPV與所有的肺病毒共享100%類似性，而在基序D中，MPV與APV共享100%類似性，並與RSV共享92%。至於全部的功能部位III(在LORF中的aa 627-903)，MPV與APV共享77%同一性，與RSV共享61-62%，並與其他的副黏液病毒共享23-27%(圖13)。除了聚合酶基序之外，肺病毒L蛋白質還含有符合一致ATP結合基序K(X)21 GEGAGN(X)20 K的序列(Stec等人，1991，Virology 183:273-87)。MPV L ORF含有像APV一樣的基序，其中中間殘基的間隔有一個殘基的改變:K(X)22 GEGAGN(X)19 K。
5.5.實例5：hMPV分離株1-99的基因組序列
亦確認並定序hMPV的其他分離株(1-99)。為了這樣做，精確地按照之前的描述(van den Hoogen等人，2001,Nature Medicine 7(6):719-724)，在三級猴腎細胞上繁殖hMPV分離株1-99。使用MagnaPure LC分離系統(Roche Applied Science)，以及總核酸套組草案，分離病毒RNA。使用標準草案，將RNA轉變為cDNA，利用隨機的六聚體(Progema Inc. Leiden)作為引子。將該cDNA保持在-20℃下或更低，直到用來進行序列分析為止。在整個計畫中所使用的引子，係以可獲自原型hMPV1-00品系的序列，或在使用hMPV品系1-99的序列分析之後所獲得的序列為基礎。
所製造之PCR片段，尺寸範圍高達1600個鹼基對，產生重疊的片段。對該PCR片段進行序列分析，使用標準技術和ABI 3100毛細管序列儀器(Applied Biosystems,Nieuwerkerk Issel)。一開始將所產生之核苷酸序列與原型hMPV品系1-00相比較。使用Blast軟體，與在GenBank資料庫中的相關序列做比較。關於進一步的序列分析，使用DNASTAR軟體(DNASTAR Inc.，Madison WI，U.S.A.)，至於系統發生分析，則使用ClustalW軟體程式。
最初，使用以得自1-00分離株之序列資訊為基礎來設計的引子，獲得1-99分離株的序列。然而，因為以得自1-00分離株的資訊為基礎，不能定序某些部分的基因組，故使用以得自1-99分離株之序列資訊，以及從經由定序1-00分離株之3'和5'端而獲得之資訊為基礎的新引子。
hMPV分離株1-99的原型序列，含有13,223個鹼基對，在總共227個，平均長度為404個鹼基對的個別序列中定序。該序列為序列識別18號。
在表6中，以絕對尺寸和胺基酸同一性百分比兩者，出示hMPV1-99和其他副黏液病毒的開放編閱架構的長度。在編碼N蛋白質(95.2%)、M(97.3%)、F(93.7%)、L(94.1%)和M2-1(94.1%)之基因中，觀察在1-99和1-00品系之間的最大同一性，具有超過90%的同種性百分比。發現在兩種品系之間，P和M2-2基因的同種性分別為86.1和88.9%。再者，分離株與禽間質肺病毒之C亞型的關係最密切，在N蛋白質(88.6%)、M蛋白質(87.1%)和M2-1蛋白質(84.3%)中具有胺基酸同一性。P和M2-2蛋白質之同一性較低，分別為67.8%和56.9%。
原型1-00和1-99品系的基因，在基因組輿圖上是相同的，就N、P、M、F、M21和M2-2蛋白質而言，具有相同數目的胺基酸。假定的SH基因短6個胺基酸，G蛋白質短12個胺基酸，但1-00和1-99品系的L基因是相同尺寸的。
最後，已經在表7中概述在基因組輿圖上的基因起點，以及位在基因之間的非-密碼序列。
總括而言，人類間質肺病毒之1-99品系的序列資訊，清楚地證實1-99與原型品系1-00的遺傳關係，從相同的基因組輿圖組織化開始。觀察到與APV之C亞型，有較少的系統發生關係。
5.6.實例6：系統發生的關係
可使用系統發生法，以便確認在病毒組別中，即在MPV與其他病毒之間的關係。此外，可對相同類型之病毒的不同分離株，判定系統發生的關係。判定系統發生樹狀圖，以便判定在MPV與其他病毒之間的關係，亦可判定在hMPV的不同分離株之間的關係。例如，可使用核苷酸或蛋白質序列資料，產生系統發生樹狀圖，以便解釋在MPV與不同病毒之間的關係。或者，可使用核苷酸或蛋白質序列資料，產生系統發生樹狀圖，以便解釋在hMPV的各種分離株之間的關係。
在hMPV與不同病毒之間的系統發生關係：雖然使用獲自未確認之病毒分離株之核苷酸序列的BLAST搜尋，顯示主要是與肺病毒亞科之成員有同種性，但該同種性係以對其他副黏液病毒顯露出某些類似性的蛋白質序列為基礎。如同在新近確認之病毒分離株與肺病毒亞科的成員之間的關係所示，以這些病毒的N、P、M和FORFs為基礎，建構系統發生樹狀圖。在所有4個系統發生樹狀圖中，新近確認之病毒分離株與APV的關係最密切(圖14)。從已經描述的APV之4個血清型中(Bayon-Auboyer等人，2000,J Gen. Virol 81:2723-2733)，APV血清型C，主要在美國的鳥類中找到的間質肺病毒，對新近確認的病毒顯示出最密切的類似性。然而，應注意僅可獲得APV血清型D的部分序列資訊。
關於所有的系統發生樹狀圖，使用ClustalW套裝軟體將DNA序列排成一直線，並使用DNA-ML套裝軟體的Phylip3.5程式，使用50或100次靴環法和3組亂數，產生最大蓋氏樹狀圖(Brandenburg等人，1997,J Med Viro 152:97-104)。為了產生系統發生樹狀圖所使用之先前公開的序列，係以下列之登錄編號獲自Genbank：關於所有的ORFs:hRSV:NC001781；bRSV:NC001989；至於F ORF:PYM,D11128；MV-A,D00850；MV-B,Y14292；MV-C,AF187152；至於N ORF:PVM,D10331；Mv-A,U39295；MV-B,U39296；MV-C,M176590；至於MORF:PMV,U66893；MV-A,X58639；MV-B，U37586；Mv-C,AE262571；至於PORF:PVM,09649；Mv-A,U22110；MV-C,AF176591。
如同在MPV與肺病毒亞科的成員之間的關係所示，先前以N、P、M和FORFs為基礎，建構系統發生樹狀圖(Van den Hoogen等人，2001,Nat Med7(6):19-24)，並顯示在MPV與APV-C之間的密切關係。因為MPVSH和G基因與其他副黏液病毒的那些基因的低同種性，不能為這些基因建構可靠的系統發生樹狀圖。此外，在肺病毒與間質肺病毒之間，不同的基因組組織化，亦使其不可能以整個基因組的序列為基礎，產生系統發生樹狀圖。除了先前公開的那些之外，亦建構M2和L基因的樹狀圖。這兩個樹狀圖均證實，在肺病毒亞科中之APV與MPV之間的密切關係(圖15)。
欲建構系統發生樹狀圖，使用ClustalW套裝軟體，將DNA序列排成一直線，並使用DNA-ML套裝軟體的Phylip 3.5程式，使用100次靴環法和3組亂數，產生最大蓋氏樹狀圖。對利用PHYLIP一致套裝軟體創造的一致樹狀圖，計算靴環值。
以到目前為止所獲得之hMPV之不同分離株的系統發生分析為基礎，已經確認兩個主要的基因型，病毒分離株00-1是基因型A的原型，而分離株99-1是基因型B的原性。
假設基因型與亞型有關連，且在預先-存在之免疫力的存在下，發生得自兩個亞組之病毒的再度-感染，而抗原變化可能不是容許再度-感染所嚴格需要的。此外，hMPV似乎與禽肺病毒，一種主要在禽類中發現的病毒，是密切相關的。兩種病毒的核苷酸序列，顯示高百分比的同種性，除了SH和G蛋白質之外。在主要以核蛋白和基質蛋白質為基礎的測試中，病毒似乎產生交叉-反應，然而，它們在以附接蛋白質為基礎的測試中，以不同的方式反應。在病毒中和力價上的差異，進一步證明兩種hMPV的基因型是一個病毒的兩種不同的血清型，而APV則是不同的病毒。
在不同的hMPV分離株之間的系統發生關係：亦可使用系統發生法，以便確認在MPV之不同分離株中的關係。例如，可使用MPV之核苷酸或蛋白質序列資料，產生系統發生樹狀圖，以便解釋在許多獲自不同個體的MPV分離株之間的關係。該方法亦可用來瞭解出現在MPV病毒之族群中的差異。
欲判定我們新近確認的各種病毒分離株的關係，以獲自8至9個分離株(對F為8個，對N、M和L為9個)的序列資訊為基礎，建構系統發生樹狀圖。使用RT-PCR，利用為了擴大在N、M、F、P、SH和L ORFs中之短片段而設計的引子，接著直接將其定序。亦發現先前從血清學之觀點(參見上文)發現有關連的9個病毒分離株，在遺傳上是密切相關的。事實上，所有的9個分離株彼此的關係比與APV之關係更密切。雖然這些系統發生樹狀圖所使用的序列資訊是有限的，似乎可將這9個分離株分成兩組，將分離株94-1、99-1和99-2聚集成一組，而其他6個分離株(94-2、93-1、93-2、93-3、93-4、00-1)為另一組(圖16)。
在圖17中出示hMPV之所有4個變種，變種A1、A2、B1或B2的不同分離株之F基因的排列。
在圖18中出示hMPV之所有4個變種，變種A1、A2、B1或B2的不同分離株之F蛋白質的排列。
在圖19中出示hMPV之所有4個變種，變種A1、A2、B1或B2的不同分離株之G基因的排列。
在圖20中出示hMPV之所有4個變種，變種A1、A2、B1或B2的不同分離株之G蛋白質的排列。
以F基因序列為基礎的系統發生樹狀圖，顯示不同的hMPV分離株的系統發生關係，並在圖21中出示其與hMPV之個別變種的關連。此外，以G基因序列為基礎的系統發生樹狀圖，顯示不同的hMPV分離株的系統發生關係，並在圖22中出示其與hMPV之個別變種的關連。使用DNA最大蓋氏法，以50次靴環法和3組亂數，計算系統發生樹狀圖。
在表8中列舉在hMPV分離株00-1之不同基因與hMPV分離株99-1、APV血清型C，以及APV血清型A之間的序列同一性。
最初，僅對9個不同的分離株推論系統發生關係。藉著在病毒分離株之N、M、F和LORFs中，部分核苷酸序列的分析，來確認兩個可能的遺傳群。在群中觀察到90-100%的核苷酸同一性，並在兩群之間觀察到81-88%同一性。對更多病毒分離株獲得的序列資訊，證實了兩種基因型的存在。病毒分離株00-1，為A群的原型，而病毒分離株99-1，為B群的原型，已經將其用在交叉中和測定中，測試基因型是否與不同的血清型或亞組有關。
使用RT-PCR測定，利用位在聚合酶基因中的引子，從鼻咽抽吸試樣中確認出30個額外的病毒分離株。使用這些新分離株的部份基質和聚合酶基因之序列資訊，連同先前9個分離株的那些，來建構系統發生樹狀圖(圖15)。這些樹狀圖的分析，證實兩種遺傳群的存在，病毒分離株00-1為在A群中的原型病毒，而病毒分離株99-1為在B群中的原型病毒。在群中的核苷酸同一性超過92%，而在兩群之間的同一性為81-85%。
5.7.實例7：人類間質肺病毒(hMPV)NL/1/00基因組RNA的前導序列
雖然定出大多數的基因組組合，但缺乏在兩端處可靠的終端序列。使用聚腺苷酸化作用和3'RACE法的組合，定出可靠的核苷酸序列(圖54)。此外，亦確認在hMPV NL/1/00之3'前導終端處的外核苷酸。
在本研究中，使用生長在Vero上的hMPV NL/1/00病毒。包括作為對照組的有關之反義RNA病毒，呼吸道融合細胞病毒(RSV)A2，它具有類似的基因組尺寸，以及已經確認的終端序列。使用QIAamp病毒RNA迷你套組(Qiagen)，依據製造者的指示，分離病毒的RNA。
藉著在37℃下，將病毒之RNA與聚(A)聚合酶(Ambion)一起培養1小時，將病毒的RNA聚腺苷酸化，接著使用Nuc-Away自旋管柱(Ambion)淨化。然後使用與互補聚(A)尾區的引子，以及逆轉錄酶，Superscript I(Invitrogen)，逆轉錄病毒的RNA。使用hMPV專一的引子，與終端並排，進行PCR和巢式PCR反應，擴大想要的產物，其具有定序分析預期的尺寸。使用TA選殖套組(Invitrogen)，進一步將PCR產物選殖到pCRII載體內。欲揭露終端的可靠核苷酸序列，進行PCR DNA和選殖之PCR產物的直接定序。
在圖55中僅出示hMPV資料。使用RSV-A2 RNA的對照組實驗，指出RSV-A2之前導序列仍維持完整，並可利用相同的方法檢測。直接對PCR產物(圖55)和對PCR純種系進行的定序分析，兩者均指出hMPV之前導區，在前導序列中最接近3'的20個核苷酸是由5'ACG CGA AAA AAA CGC GTA TA所組成(以正義cDNA方位來表示)。在圖101中，將兩個新近確認的核苷酸加下標線。
5.8.實例8：定出MPV分離株的血清型和亞組
使用病毒中和測定(參見，例如實例16)，判定hMPV之病毒分離株是否可藉著血清型或基因型來區別。使用病毒分離株00-1和99-1接種雪貂，以便使病毒-專一之抗血清升高。關於00-1分離株，藉著實驗性鼻內感染飼養在個別的加壓手套箱中、兩隻無特定病原的雪貂和兩隻天竺鼠，產生雪貂和天竺鼠對該病毒的專一抗血清。在2至3週之後，藉著心臟穿刺，採取所有動物的血液，並使用其血清作為參考血清。按照下述，針對所有先前描述的病毒，以間接IFA測試該血清。在利用兩種病毒的病毒中和測定中，使用這些抗血清，連同使用99-1分離株製備的抗血清(表9)。
此外，以任一病毒，即00-1和99-1接種6隻天竺鼠。對鼻咽抽吸試樣的RT-PCR測定，顯示病毒複製從感染後第2天到第10天。在感染後第70天，以同種或異種病毒攻毒天竺鼠，注意到所有4種病毒的複製。
在第一次攻毒之後，進行抗血清的病毒中和測定，顯示本質上與利用雪貂進行之VN測定中相同的結果(在VN力價中>16-倍的差異)。
在本實例中提供的結果，證實兩種基因型的存在，與MPV的兩種血清型相符合，並顯示以異種和同種病毒重覆感染的可能性。
6.診斷測定/檢測方法 6.1.實例9：直接免疫螢光測定(DIF)法
按照描述，藉著DIF分析得自罹患RTI之患者的鼻咽抽吸試樣(Rothbarth等人，1999,J. of Virol. Methods 78:163-169)。將試樣儲存在-70℃下。簡言之，以5毫升杜貝可氏(Dulbecco)MEM(BioWhittaker,Walkersville,MD)稀釋鼻咽抽吸物，並在旋轉混合器上徹底混合1分鐘。以840xg離心懸浮液10分鐘。將沉降物塗抹在多點玻片(Nutacon,Leimuiden.The Netherlands)上，並使用上清液進行病毒分離。在乾燥之後，在室溫下以丙酮固定細胞1分鐘。在沖洗玻片之後，在37℃下，將其與對諸如流感A和B、hRSV和hPIV1至3(Dako,Glostrup,Denmark)之類的病毒專一的市售FITC-標示之抗-血清，一起培養15分鐘。在以PBS沖洗3次，並以自來水沖洗1次之後，將玻片浸入甘油/PBS溶液(Citifluor,UKO,Canterburg,UK)中，並加蓋。然後使用Axioscop螢光顯微鏡，分析玻片。
6.2.實例10：MPV的病毒培養
檢測在得自宿主之培養試樣中的病毒，直接指出該宿主目前及/或過去曾暴露或感染該病毒。
使用在第一次繼代後展現CPE的試樣，接種在24-孔培養盤中，在培養基中之匯合不足(sub-confluent)的單層tMK細胞。每天針對CPE檢查培養物，並一週更換培養基一次。因為每個分離物的CPE不同，故在第12和14天時，以IFA測試所有的培養基，利用對抗新病毒分離株的雪貂抗體。將陽性的培養物冷凍-融解3次，隨後藉著低速離心使上清液澄清，等分並冷凍儲存在-70℃下。按照描述判定在培養物上清液中的病毒50%組織培養感染劑量(TCID50 )(Lennette,D.A.等人，在DIAGNOSTIC PROCEDURES FOR VIRAL,RICKETTSIAL,AND CHLAMYDIAL INFECTIONS,第7版(編輯Lennette,E.H.MLennetteMD.A. ＆ Lennette,E.T.)3-25;37-138;431-463;481-494;539-563(American public health association,Washington,1995)中)。
6.3.實例11：藉著間接免疫螢光測定(IFA)檢測抗原
可使用抗體，看到在被感染細胞或組織中的病毒蛋白質。間接免疫螢光測定(IFA)是一種敏感性的方法，其中二級抗體與認得在病毒-專一之抗體上的普通抗原決定位的螢光指示劑偶聯。IFA比DIF更有利，因為它較高程度的敏感性。
為了進行間接IFA，以5毫升杜貝可氏MEM培養基(BioWhittaker,WalkersVille,MD)稀釋所收集之樣本，並在旋轉混合器上徹底混合1分鐘。然後以840xg離心懸浮液10分鐘。將沉降物塗抹在多點玻片上。在乾燥之後，在室溫下以丙酮固定細胞1分鐘。或者，在含有玻璃片的24孔玻片上，在tMK細胞上培養病毒。以PBS沖洗這些玻璃片，並在室溫下以丙酮固定1分鐘。
進行兩個間接IFAs。在第一個間接IFA中，以PBS沖洗含有被感染tMK細胞的玻片，然後在37℃下，與病毒專一的抗血清一起培養30分鐘。使用抗流感A、B和C、hPIV第1至3型和hRSV的單株抗體。至於hPIV第4型、腮腺炎病毒、麻疹病毒、仙臺病毒、猿病毒第5型和新城雞瘟病毒，則使用多株抗體(RIVM)，以及雪貂和天竺鼠參考血清。在以PBS沖洗3次，並以自來水沖洗1次之後，利用對抗在第一次培養時使用之血清的二級抗體，將玻片染色。多株抗血清的二級抗體是山羊-抗-雪貂(KPL,Guilford,UK,40倍稀釋)、老鼠-抗-兔(Dako,Glostrup,Denmark,20倍稀釋)、兔-抗-雞(KPL,20倍稀釋)和老鼠-抗-天竺鼠(Dako,20倍稀釋)。
在第二個IFA中，在以PBS沖洗之後，在37℃下，將玻片與在PBS中稀釋1:50至1:100的20個多株抗體一起培養30分鐘。使用經過免疫的雪貂和天竺鼠，獲得多株抗體，但這些抗體可在各種動物中升高，並可為了每次免疫改變多株抗體的工作稀釋度。在以PBS沖洗3次，並以自來水沖洗1次之後，在37℃下，將玻片與FITC標示之山羊-抗-雪貂抗體(KPL,Guilford,UK,40倍稀釋)一起培養30分鐘。在以PBS沖洗3次，並以自來水沖洗1次之後，在甘油/PBS溶液(Citifluor,UKO,Canterbury,UK)中培養玻片，並加蓋。使用Axioscop螢光顯微鏡(Carl Zeiss B.V.,Weesp,the Netherlands)，分析玻片。
6.4.實例12：血球凝集測定、氯仿敏感性測試和電子顯微鏡
可利用病毒的不同特徵來檢測病毒。例如，許多病毒含有可與紅血球結合的蛋白質，結果產生晶格。將該特性稱為血球凝集作用，並可在檢測病毒的血球凝集測定中使用。在電子顯微鏡(EM)下，亦可看見病毒，或可藉著PCR技術檢測之。
按照描述進行血球凝集測定和氯仿敏感性測試(Osterhaus等人，1985,Arch. of Virol 86:239-25;Rothbarth等人，J of Virol Methods 78:163-169)。
至於EM分析，在4℃下，以17000xg微量離心從被感染細胞培養物上清液中濃縮的病毒，隨後將小球再懸浮於PBS中，並藉著負對比EM檢查。
6.5.實例13：檢測IgG、IgA和IgM種類的hMPV/AVP抗體
在感染/生病的期間，對抗病毒之特定抗體升高。因此，在宿主中檢測病毒-專一的抗體，是宿主目前及/或過去被該病毒感染的指標。
使用間接酵素免疫測定(EIA)，檢測IgG種類的hMPV抗體。在微量滴定盤中進行該測定，基本上按照先前的描述(Rothbarth等人，1999,J. of Vir. Methods 78:163-169)。簡言之，藉著以1%三通X-100處理，促使濃縮的hMPV溶解。在藉著棋盤方格滴定，判定最佳的工作稀釋度之後，在室溫下將其塗覆在微量滴定盤中的PBS內。接著，在孔中加入100微升體積，以EIA緩衝溶液1:100稀釋的人類血清試樣，並在37℃下培養1小時。藉著加入山羊-抗-人類IgG過氧化酶共軛物(Biosource,USA)，加入作為受質的TMB，展開培養盤，並在450毫微米處測量光密度(OD)，檢測人類IgG的結合作用。以OD的S(信號)/N(陰性)比例來表示結果。若S/N比例超出陰性對照組加三倍標準值，便認為該血清是IgG陽性的。
藉著捕捉EIA，基本上按照先前的描述(Rothbarth等人，1999，J Vir Methods 78:163-169)，在血清中檢測IgM和IgA種類的hMPV抗體。為了檢測IgA和IgM，使用塗覆有抗人類IgM或IgA專一單株抗體之市售的微量滴定盤。血清按1:100稀釋。在37℃下培養1小時之後，在37℃下培養1小時之前，將最佳工作稀釋度的hMPV加至每個孔中(100微升)。在沖洗之後，加入以過氧化酶標示的多株抗-hMPV抗體，並在37℃下培養該盤1小時。加入作為受質的TMB，展開該盤，並在450毫微米處測量OD。以OD的S(信號)/N(陰性)比例來表示結果。當S/N比例超出陰性對照組加三倍標準值時，便代表IgG的陽性結果。
在APV抑制測定中，檢測APV抗體。APV抑制測試的草案，包括在由SVANOVA Biotech AB,Uppsala Science Park Glunten SE-751 83 Uppsala Sweden製造的APV-Ab SVANOVIR捉 簿嬪K疫測定中。以OD的S(信號)/N(陰性)比例來表示結果。若S/N比例超出陰性對照組加三倍標準值，便認為該血清是IgG陽性的。
6.6.實例14：藉著間接IFA，在人類、哺乳動物、反芻動物或其他動物中檢測抗體
為了檢測病毒專一的抗體，在蓋玻片上利用丙酮，將以MPV感染的tMK細胞固定(按照上述)，以PBS沖洗，並在37℃下與按1至16稀釋的血清試樣一起培養30分鐘。在以PBS沖洗兩次，並以自來水沖洗1次之後，在37℃下，將玻片與FITC-標示之專用的二級抗體(Dako)一起培養30分鐘。按照上述處理玻片。
可直接利用螢光染料標示抗體，這將產生直接的免疫螢光測定。可以任何螢光染料來置換FITC。
6.7.實例15：藉著ELISA，在人類、哺乳動物、反芻動物或其他動物中檢測抗體
在副黏液病毒科中，N蛋白質是最豐富的蛋白質，並在感染早期發生對該蛋白質的免疫反應。為了這些理由，最好是使用重組來源的N蛋白質，發展檢測對MPV之抗體的ELISA測定。適用於抗體檢測的抗原，包括任何MPV蛋白質，將其與任何暴露或感染MPV病毒之患者的MPV-專一性抗體混合。本發明較佳的抗原包括在暴露於MPV病毒下的患者中，優先產生免疫反應的那些，因此，通常最容易被患者的抗體認出。特佳的抗原包括MPV的N、F、M和G蛋白質。可供免疫學技術使用的抗原，可以是天然的抗原，或可以是其經過修改的版本。可使用已熟知的分子生物學技術，改變MPV抗原的胺基酸序列，產生可在免疫學技術中使用的抗原之修改版。
選殖基因、操縱基因並形成表現載體，以及在異種宿主中表現由該基因編碼之蛋白質的方法是已熟知的，並可使用這些技術，提供表現載體、宿主細胞，並在宿主中表現編碼抗原的選殖基因，產生可供在診斷測定中使用的重組抗原。參見，例如MOLECULAR CLONING,A LABORATORY MANUAL AND CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY。
可使用各種表現系統來產製MPV抗原。例如，已經描述了適合在大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌、昆蟲細胞和哺乳動物細胞中產製蛋白質的各種表現載體，可使用其中的任何一種來產製適合在已暴露的患者中，檢測抗-MPV抗體的MPV抗原。
桿狀病毒表現系統具有提供蛋白質之必要加工的優點，並因此是較佳的。該系統使用多面素(polyhedrin)啟動基因，指揮MPV抗原的表現(Matsuura等人，1987,J. Gen. Virol. 68:1233-1250)。
可在各種免疫學測定中使用由重組桿狀-病毒產製的抗原，在患者中檢測抗-MPV抗體。已完全確立實際上在任何檢測病毒專一之抗體的免疫學測定中，可使用重組的抗原來代替天然的病毒。該測定包括直接和間接測定、三明治測定、固相測定，像是其中使用培養盤或小珠的那些，以及液相測定。適合的測定包括使用初級和二級抗體的那些，以及使用諸如蛋白質A之類抗體結合試劑的那些。再者，在本發明中可使用任何檢測方法，包括比色、螢光、磷光、化學發光、發光和放射性法。
例如，可進行使用重組N蛋白質(在昆蟲(Sf9)細胞中利用重組的桿狀病毒產製)作為抗原的間接IgG EIA。關於抗原製備，以重組的桿狀病毒感染Sf9細胞，並在感染後3-7天收獲。以PBS，pH7.2沖洗細胞懸浮液2次，調整細胞密度為5.0X106 個細胞/毫升，並冷凍-融解3次。藉著低速離心(500xg 15分鐘)使大的細胞碎屑形成小球，並收集上清液，並儲存在-70℃下直到使用為止。以同樣的方式處理未感染的細胞，作為陰性對照組抗原。
一旦製備好抗原，使用100微升冷凍-融解的溶胞產物，以範圍從1:50至1:1000之稀釋度，塗覆微量滴定盤。以一式兩孔，執行未感染細胞的溶胞產物，並作為陰性對照組。在培養過夜之後，以PBS/0.05%吐溫沖洗培養盤2次。以ELISA緩衝溶液(PBS，補充有2%正常山羊血清和0.5%牛血清白蛋白，以及0.1%牛乳)，按1:50至1:200，稀釋受試的血清，接著在37℃下培養各孔1小時。
以PBS/0.05%吐溫沖洗培養盤2次。在孔中加入按照1:3000至1:5000，以ELISA緩衝溶液稀釋之辣根過氧化酶標示的山羊抗-人類(或對抗其他物種)IgG，並在37℃下培養1小時。然後以PBS/0.05%吐溫沖洗培養盤2次，並以自來水沖洗一次，在室溫下與酵素受質TMB，像是獲自Sigma的3,3',5,5'-四甲基聯苯胺一起培養15分鐘，並以100微升2M磷酸使該反應中止。在450毫微米處，使用自動微量滴定盤讀取器，測量比色的讀數。
6.8.實例16：病毒中和測定
當個體被病毒感染時，產生對抗該病毒的軍隊。這些抗體中有些與病毒顆粒結合，並中和其傳染性。通常藉著將稀釋的血清或單株抗體與病毒混合，培養它們，並測定對培養細胞、雞胚或動物剩下的傳染性，來進行病毒中和測定(VN)。可使用中和抗體來定義在病毒顆粒上特定抗原的類型，例如，可使用中和抗體定義病毒的血清型。此外，亦可能存有各種中和抗體。
利用從8-倍稀釋開始，連續2-倍稀釋的人類和動物血清，來進行VN測定。在接種生長在96孔培養盤中的tMK細胞之前，先將經過稀釋之血清與100 TCID50 的病毒一起培養1小時，隨後以840xg離心該培養盤。在3和6天後更換培養基，並在接種後8天，以FTIC-標示之抗MPV的雪貂抗體進行IFA。按照結果為陰性IFA，並在細胞培養中抑制CPE之血清試樣的最低稀釋，定義VN力價。
6.9.實例17：RNA分離
亦可藉著在得自宿主之試樣中，檢測病毒的核酸，來診斷病毒出現在宿主中(參見，例如在實例18中的RT-PCR，以及在實例19中的RAP-PCR)。
使用High Pure RNA分離套組，根據製造者的指示(Roche Diagnostics,Ahnere,The Netherlands)，從被感染的細胞培養物，或蔗糖梯度溶離份中分離RNA。亦可依據此項技藝中已知的其他程序分離RNA(參見，例如CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,第1-3冊(1994-1998)，編輯Ausubel,F.M.等人，由John Wiley and Sons,Inc.,USA出版)。
6.10.實例18：以RT-PCR來檢測/診斷MPV
可使用複寫或擴大病毒之基因組物質的方法，在生物試樣中檢測病毒。在本實例中，在下文中描述對已知的副黏液病毒，進行病毒-專一之寡核苷酸序列的RT-PCR測定。在50微升含有50mM Tris.HCl pH 8.5、50mM NaCl、4mM MgCl2 、2mM二硫蘇糖醇、dNTP各200μM、10單位重組的RNA素(RNAsin)(Promega,Leiden,The Netherlands)、10單位AMV RT(Promega,Leiden,The Netherlands)、5單位Amplitaq Gold DNA聚合酶(PE Biosystems,Nieuwerkerk aan de Ijssel,The Netherlands)和5微升RNA的反應中，進行單一-步驟的RT-PCR。循環條件為42℃ 45分鐘和95℃ 7分鐘一次，95℃ 1分鐘、42℃ 2分鐘和72℃ 3分鐘重覆40次，以及72℃ 10分鐘一次。在序列一覽表中提供引子序列。更特定而言，核蛋白基因所使用的引子為N3和N4，分別有與序列識別28和29號一致的核苷酸序列，並用來擴大151個核苷酸的片段。基質蛋白質基因所使用的引子為M3和M4，分別有與序列識別30和31號一致的核苷酸序列，並用來擴大252個核苷酸的片段。聚合酶蛋白質基因所使用的引子為L6和L7，分別與序列識別34和35號一致，並用來擴大173個核苷酸的片段。F蛋白質基因所使用的引子為F7和F8，分別與序列識別32和33號一致，並用來擴大221個核苷酸的片段。
此外，亦使用探針來證實hMPV基因組序列的存在。用來檢測M基因的探針，具有與序列識別36號一致的核苷酸序列。用來檢測N基因的探針，具有與序列識別37號一致的核苷酸序列。用來檢測L基因的探針，具有與序列識別38號一致的核苷酸序列。
在另一個實例中，可以已知或經由定序獲得的MPV序列為基礎來設計引子和探針。同樣地，為了特殊目的而使用不同序列的引子，以及不同的緩衝溶液和測定條件，將是熟諳此藝者已知的。
為了檢測已知的副黏液病毒，使用RT-PCR也一樣好。在屋子裏發展hPIV1-4、腮腺炎、麻疹、塔派亞、瑪普拉和亨德拉的引子，並以可獲得之序列的排列為基礎。從Seal,J.,J.等人，Clin. Microb.,2624-2630,1995中取得新城雞瘟病毒的引子。從Chua等人，2000,Science,288中取得百立和普通副黏液病毒-PCR的引子。用來檢測其他已知之副黏液病毒的引子如下：以與序列識別58和59號之序列一致的引子，分別為前進和逆向引子，來檢測hPIV-1，以與序列識別60和61號之序列一致的引子，分別為前進和逆向引子，來檢測hPIV-2，以與序列識別62和63號之序列一致的引子，分別為前進和逆向引子，來檢測hPIV-3，以與序列識別64和65號之序列一致的引子，分別為前進和逆向引子，來檢測hPIV-4，以與序列識別66和67號之序列一致的引子，分別為前進和逆向引子，來檢測腮腺炎，以與序列識別68和69號之序列一致的引子，分別為前進和逆向引子，來檢測NDV，以與序列識別70和71號之序列一致的引子，分別為前進和逆向引子，來檢測塔派亞，以與序列識別72和73號之序列一致的引子，分別為前進和逆向引子，來檢測瑪普拉，以與序列識別74和75號之序列一致的引子，分別為前進和逆向引子，來檢測亨德拉，以與序列識別76和77號之序列一致的引子，分別為前進和逆向引子，來檢測立百，以與序列識別78和79號之序列一致的引子，分別為前進和逆向引子，來檢測hRSV，以與序列識別80和81號之序列一致的引子，分別為前進和逆向引子，來檢測麻疹，以與序列識別82和83號之序列一致的引子，分別為前進和逆向引子，來檢測普通副黏液病毒科的病毒。
6.11.實例19：RAP-PCR
可使用與在基因組中之區域雜交，並以特定方向延伸，而得以擴大該遺傳物質的引子，檢測或擴大MPV或其他病毒的遺傳物質。當不能獲得特定的序列資訊，或在試樣中進行遺傳物質的初步擴大作用時，這類技術是有用的。一種這類的技術稱為RAP-PCR。
基本上按照描述(Welsh等人，1992,NAR 20:4965-4970)進行RAP-PCR。關於RT反應，在10微升含有10毫微克/微升寡核苷酸、10mM二硫蘇糖醇、dNTP各500μM、25mM Tris-HCl pH 8.3、75mM KCl和3mM MgCl2 的反應中，使用2微升RNA。在70℃下培養該反應混合物5分鐘，並在37℃下5分鐘，隨後加入200單位的Superscipt RT酵素(LifeTechnologies)。繼續在37℃下培養55分鐘，並藉著在72℃下培養5分鐘中止該反應。稀釋RT混合物，得到50微升含有8毫微克/微升寡核苷酸、dNTP各300微升、15mM Tris-HCl pH 8.3、65mM KCl、3.0 mM MgCl2 和5單位TaqDNA聚合酶(FE Biosystems)的PCR反應。循環條件為95℃ 5分鐘、40℃ 5分鐘和72℃ 1分鐘一次，接著是94℃ 1分鐘、56℃ 2分鐘和72℃ 1分鐘重覆40次，以及72℃ 5分鐘一次。
RAP-PCR所使用的引子為：引子ZF1具有與序列識別46號一致的核苷酸序列，引子ZF4具有與序列識別47號一致的核苷酸序列，引子ZF7具有與序列識別48號一致的核苷酸序列，引子ZF10具有與序列識別49號一致的核苷酸序列，引子ZF13具有與序列識別50號一致的核苷酸序列，引子ZF16具有與序列識別51號一致的核苷酸序列，引子CS1具有與序列識別52號一致的核苷酸序列，引子CS4具有與序列識別53號一致的核苷酸序列，引子CS7具有與序列識別54號一致的核苷酸序列，引子CS10具有與序列識別55號一致的核苷酸序列，引子CS13具有與序列識別56號一致的核苷酸序列，而引子CS16具有與序列識別57號一致的核苷酸序列。在3%NuSieve瓊脂糖凝膠(FMC BioProducts,Heerhugowaard,The Netherlands)上，並排地跑產物。利用Qiaquick凝膠萃取套組(Qiagen,Leusden,The Netherlands)，從凝膠中純化對MPV專一之以不同方式展現的片段，並根據得自製造者的指示，選殖到pCR2.1載體(Invitrogen,Groningen,The Netherlands)內。成功地純化並定序20個片段。在10個片段中，發現對APV的序列同種性，即使用ZF7引子分離的片段1，產生335個鹼基對的片段，對N基因有同種性，使用ZF10引子分離的片段2，產生235個鹼基對的片段，對N基因有同種性，使用ZF10引子分離的片段3，產生800個鹼基對的片段，對M基因有同種性，使用CS1引子分離的片段4，產生1250個鹼基對的片段，對F基因有同種性，使用CS10引子分離的片段5，產生400個鹼基對的片段，對F基因有同種性，使用CS13引子分離的片段6，產生1450個鹼基對的片段，對F基因有同種性，使用CS13引子分離的片段7，產生750個鹼基對的片段，對F基因有同種性，使用ZF4引子分離的片段8，產生780個鹼基對的片段，對L基因有同種性，使用ZF10引子分離的片段9，產生330個鹼基對的片段，對L基因(蛋白質層面)有同種性，以及使用ZF10引子分離的片段10，產生250個鹼基對的片段，對L基因(蛋白質層面)有同種性。
可使用TaqMan測定，測量基因表現的程度。改編Taq-Man測定，以便檢查L-基因和N-基因的表現。然而。在這些測定中使用的引子，不需要對hMPV組任一個是專一的，在下文中出示實例。在50微升總反應體積中，利用500nM濃度的前進引子、250nM濃度的逆向引子、250nM濃度的寡核苷酸探針、25微升萬能的PCR主要混合物(獲自ABI)，和5微升cDNA進行反應。在ABI 7000序列檢測系統上，循環條件為：95℃ 10分鐘的第一個步驟，接著是由95℃ 30秒和60℃60秒組成的45次第二個步驟。
欲在TaqMan測定中使用之hMPV N基因的引子的其他實例如下：對於分離株NL/1/00、BI/1/01、FI/4/01、NL/8/01和FI/2/01，均為亞組A1，可使用具有序列識別39號之核苷酸序列的引子。至於分離株NL/30/01，為亞組A1，可使用具有序列識別40號之核苷酸序列的引子。至於分離株NL/22/01和NL/23/01，為亞組A2，可使用具有序列識別41號之核苷酸序列的引子。至於分離株NL/17/01，為亞組A2，可使用具有序列識別42號之核苷酸序列的引子。至於分離株NL/17/00，為亞組A2，可使用具有序列識別43號之核苷酸序列的引子。至於分離株NL/1/99、NL/5/01、NL/21/01和NL/9/01，為亞組B1，可使用具有序列識別44號之核苷酸序列的引子。至於分離株FI/1/01和FI/10/01，為亞組B1，可使用具有序列識別45號之核苷酸序列的引子。
可供A1亞組使用的可能探針，與序列識別390號一致，可供B1亞組使用的探針，與序列識別391號一致，而可供B2亞組使用的探針，與序列識別392號一致。
6.12.實例20：RAP-PCR產物的序列分析
在使用RAP-PCR擴大斷片之後，可在經過擴大的斷片上獲得序列資訊。為了這樣做，將所產生的片段選殖到之前定序的載體中是有利的。
將RAP-PCR產物選殖到利用M13-專一之寡核苷酸定序的pCR2.1載體(Invitrogen)內。從瓊脂糖凝膠中，使用Qiaquick凝膠萃取套組(Qiagen,Leusden,The Netherlands)，純化藉著RT-PCR獲得的DNA片段，並利用與PCR所用相同的寡核苷酸直接定序。使用Dyenamic ET終止序列定序套組(Amersham Pharmacia Biotech,Roosendaal,The Netherlands)，和ABI 373自動DNA定序器(PE Biosystem)，進行序列分析。所有的技術均根據製造者的指示進行。
6.13.實例21：藉著RT-PCR產製基因組片段
RAP-PCR方法可在序列中留下不被擴大或複寫的間隙。為了獲得完整的序列，可使用RT-PCR獲得間隙的序列資訊。
欲產製跨越在RAP-PCR片段之間間隙A、B和C的PCR片段(圖3)，按照先前的描述，對分離自病毒分離株00-1的RAN試樣，使用RT-PCR測定。
使用下列的引子來產製片段A：在前導序列中設計TR1’與序列識別22號之核苷酸序列一致，並在以N獲得之RAP-PCR片段的3'端處設計N1，且與序列識別23號之核苷酸序列一致。使用下列的引子來產製片段B：在以N獲得之RAP-PCR片段的5'端處設計N2，且與序列識別24號之核苷酸序列一致，並在以M獲得之RAP-PCR片段的3'端處設計M1，且與序列識別25號之核苷酸序列一致。使用下列的引子來產製片段C：在以M獲得之RAP-PCR片段的5'端處設計M2，且與序列識別26號之核苷酸序列一致，並在以F獲得之RAP-PCR片段的3'端處設計F1，且與序列識別27號之核苷酸序列一致。
在凝膠電泳之後純化片段，並按照先前的描述選殖和定序。
6.14.實例25：使用重組的核蛋白，捕捉抗-MPV IgM EIA
為了檢測hMPV病毒，免疫學測定可在各種宿主中檢測抗體的存在。在一個實例中，使用對抗N蛋白質的抗體，因為它是所產生之蛋白質中最豐富的。該特徵歸因於跨越病毒之基因組發生的轉錄梯度。
可藉著修改先前由Erdman等人，1990,J. Clin. Microb. 29:1466-1471描述的測定，進行使用重組核苷酸或任何其他之重組蛋白質作為抗原的捕捉IgM EIA。
將以親和力純化的抗-人類IgM捕捉抗體(或對抗其他的物種)，像是獲自Dako的，以在0.1M碳酸鹽緩衝溶液pH 9.6中，每孔250毫微克之濃度，加至微量滴定盤的孔中。在室溫下過夜培養之後，以PBS/0.05%吐溫沖洗培養盤兩次。將100微升，以ELISA緩衝溶液稀釋成1:200至1:1000的受試血清，加至一式三份的孔中，並在37℃下培養1小時。然後以PBS/0.05%吐溫沖洗兩次。
將以ELISA緩衝溶液稀釋成1:100至1:500的冷凍-融解(以重組病毒感染之)Sf21細胞的溶胞產物，加至孔中，並在37℃下培養2小時。未感染細胞的溶胞產物係作為陰性對照組，並以一式兩孔執行。然後以PBS/0.05%吐溫沖洗三次，並在37℃下，與100微升以ELISA緩衝溶液最適切地稀釋的抗MPV之多株抗體一起培養1小時。在以PBS/0.05%吐溫沖洗兩次之後，將培養盤與辣根過氧化酶標示之二級抗體(像是兔子抗雪貂)一起培養，並在37℃下培養該盤20分鐘。
然後以PBS/0.05%吐溫沖洗培養盤5次，在室溫下與酵素受質TMB，像是例如獲自"Sigma"的3,3,5,5-四甲基聯苯胺，一起培養15分鐘，並以100微升2M磷酸使該反應中止。在450毫微米處，使用自動微量滴定盤讀取器，測量比色的讀數。
使用得自有臨床MPV病毒感染之人的急性期和恢復期血清對，來比較使用重組核蛋白質(或其他重組蛋白質)和完整MPV病毒之捕捉IgM EIAs的敏感性。藉著測試得自健康的人和感染其他副黏液病毒的人之血清樣本，判定重組核蛋白捕捉EIA的專一性。
EIAs可能使用藉著桿狀病毒表現所產製之重組的MPV融合蛋白質和糖蛋白。
糖蛋白G和F是MPV病毒粒子的兩個穿透膜被膜糖蛋白，並代表主要的中和和保護抗原。這些糖蛋白在諸如桿狀病毒系統之類的載體病毒系統中表現，提供了可用在檢測MPV專一抗體之測定中的重組抗原的來源。此外，其與核蛋白併用，例如，在對抗MPV之抗體的檢測中，進一步提高了酵素免疫測定的敏感性。
可使用各種其他的免疫學測定(Current Protocols in Immunology,第1-3冊。由Coligan,J.E.,Kruisbeek,A.M.,Margulies,D.H.,Shevach,E.M.和Strobe,W.編輯，由John Wiley and Sons,Inc.,USA出版)，作為那些在本文中描述之方法的其他選擇。
為了發現病毒分離株，可檢查最好是得自，但不限於人類、食肉動物(狗、貓、海豹等等)、馬、反芻動物(牛、綿羊、山羊等等)、豬、兔子、鳥類(禽類、駝鳥等等)的鼻咽抽吸物、喉和鼻抹拭物、支氣管肺泡灌洗液和喉抹拭物。可檢查得自鳥類的泄殖腔和腸抹拭物，鳥糞也一樣好。對所有的試樣而言，為了檢測病毒，可進行血清學(抗體和抗原檢測等等)、病毒分離和核酸檢測技術。可藉著以經過純化的MPV或其部分(蛋白質、肽)免疫老鼠(或其他動物)，並接著使用已確立的融合瘤技術(Current Protocols in Immunology，由John Wiley and Sons,Inc.,USA出版)，來產製單株抗體。或者，可為了該目的，使用噬菌體展示技術(Current Protocols in Immunology,由John Wileyand Sons,Inc.,USA出版)。同樣地，可從被感染的人類或動物中，或從免疫的人類或動物中，獲得多株抗體(Current Protocols in Immunology，由John Wiley and Sons,Inc.,USA出版)。
可使用西方墨點法、IFA、免疫沉澱技術，使用各種抗體製品，進行NS1和NS2蛋白質之存在或缺乏的檢測。可使用PCR，利用以已知NS1及/或NS2基因為基礎設計的引子組，並利用各種核酸雜交技術，在病毒分離株中，進行NS1和NS2基因或其同系物之存在或缺乏的檢測。
欲判定NS1和NS2基因是否出現在病毒基因組的3'端，可進行PCR，利用對該基因組之3'端專一的引子。在我們的情況下，我們使用對病毒基因組之3'未轉譯區域專一的引子，以及在NORF中的引子。可為了相同的目的，設計其他的引子。藉著PCR產物的長度及/或核苷酸序列，顯示缺乏NS1/NS2基因。對NS1及/或NS2基因專一的引子，可與對病毒基因組之3'端的其他部分(像是未轉譯區域或N、M或FORFs )專一的引子併用，容許明確地確認NS1或NS2基因的存在。除了PCR之外，可為了相同的目的，使用諸如分子選殖、核酸雜交之類的各種技術。
7.MPV之細胞培養系統和動物模式，以及MPV的重組設計 7.1.實例22：hMPV在不同細胞株中的生長
可在不同的細胞株中培養病毒分離株，以便檢查每個病毒的特徵。例如，可以在培養時測量到的力價含量為基礎，定出不同病毒分離株之傳染性的特徵，並區別之。或者，可在培養時使用細胞來繁殖或擴大病毒的品系，以供進一步的分析。
在一個實例中，使用三級猴腎細胞擴大hMPV。然而，三級猴腎細胞是衍生自初級細胞，其僅可繼代有限的次數，並已經在活體內繼代3次。不知道那一類的永存不死細胞株將支持hMPV病毒生長至高力價。測試許多猴子細胞株，像是Vero、LLC-MK2、HEp-2和肺纖維母細胞(LF1043)細胞，看看它們是否可支持hMPV病毒複製(表11)。所使用之胰蛋白酶，是濃度為0.001毫克/毫升的TPCK-胰蛋白酶(Worthington)。亦在已受精之10日齡雞蛋中，測試該病毒的生長。在AF收獲之前，在37℃下培養已感染之蛋2和3天。藉著被感染細胞之溶胞產物，在無胰蛋白酶之Vero細胞上的溶菌斑測定，在35℃下培養10天，並使用天竺鼠hMPV抗血清進行免疫染色，來判定病毒力價。結果顯示，Vero細胞和LLC-MK2細胞，是最適合hMPV病毒複製的細胞受質，結果產生106 -107 pfu/毫升的病毒母液力價。這些力價類似從tMK細胞中獲得的那些。以0.01毫克/毫升之濃度添加胰蛋白酶，不會以可察知的程度增加病毒力價(表11)。
為了研究生長在Vero細胞中之hMPV病毒的病毒動力學，使用0.1之MOI，完成生長曲線(圖23)。每隔24小時收獲細胞和細胞上清液，並為了病毒力價的定量，藉著溶菌斑測定分析之。結果顯示，在第5天觀察到接近高峰的hMPV力價。在第8天達到5.4 log10 pfu/毫升的絕對高峰力價。病毒力價是極穩定的，高達第10天。在相同時間，僅利用細胞上清液進行的生長曲線，只顯示出極低的病毒力價。該資料證實在所使用的條件(0.1之MOI)下，hMPV複製在感染後第8天時達到高峰，且hMPV主要是與細胞結合的RNA病毒。
293細胞的轉移感染：每隔3-4天，使293細胞(人類腎臟上皮細胞)在補充有FCS(10%)、L-穀胺醯胺(1:100)和青黴素/鏈黴素(1:100)的DMEM中繼代，並以1:10分配。小心不要讓細胞生長至匯合，以便提高可轉移感染的能力。細胞不是極黏附的；在胰蛋白酶-EDTA中簡短地培養(2分鐘或更少)，通常便足以將其從塑膠表面釋放。在以胰蛋白酶-處理之後，立刻以培養基稀釋細胞。
在轉移感染前一天，分配細胞。在轉移感染時，細胞的匯合度約為50-75%。使用膠凝的塑膠，預防細胞在轉移感染過程之間分開。以0.1%明膠(以1:20稀釋2%之母液)，覆蓋培養盤或燒瓶10分鐘，並以PBS沖洗一次。欲獲得正確的細胞密度，以每個T75燒瓶或100毫米培養盤(在10毫升中)1x107 個細胞，或6-孔培養盤(在2毫升中)每孔1x106 個細胞的濃度使用細胞。
轉移感染最少持續7小時，然而，最好是容許轉移感染過夜發生。接著在無菌的試管中，混合：30毫克DNA與62毫升2M CaCl2 ，並加H2 O至500毫升(T75)，或3毫克DNA與6.2毫升2M Ca Cl2 ，並加H2 O至50毫升(6-孔培養盤)；簡單地混合。逐滴加入500或50毫升的2xHBS，並容許該溶液混合5分鐘，直到形成沉澱為止。小心照顧，即不加以旋轉。以新鮮預熱的培養基置換舊的培養基(每個T75燒瓶10毫升，或6-孔培養盤每孔1毫升)。藉著以Gilson吸移管將氣泡吹過試管，小心地混合DNA，並將沉澱物逐滴加至培養基中，覆蓋細胞。在37℃，CO2 氣壓下培養細胞。
細胞似乎被少量微粒(沉澱物)覆蓋。從細胞中移出轉移感染培養基，並以PBS小心地沖洗細胞，然後以新鮮的培養基置換。
在37℃CO2 氣壓下培養細胞，直到需要為止，通常在8-24小時之間。
以8.18%Na Cl、5.94%Hepes和0.2%Na2 HPO4 (均為重量/體積)製備HBS的10x母液。將該溶液過濾滅菌，並儲存在4℃下。藉著以H2 O稀釋10x母液，並以1M NaOH將pH值調整到7.12，製備2x溶液。將該溶液等分，並儲存在-20℃下。小心精確地滴定該溶液之pH值。在使用該溶液進行轉移感染程序之前，才調整pH值。
7.2.實例23：MPV的迷你複製子構築體
可產製含有反義報告者基因的迷你複製子構築體。在圖24中出示迷你複製子的實例，CAT-hMPV。在圖26中出示用來產製迷你複製子構築體的前導和拖尾序列。為了比較，亦在圖26中出示APV、RSV和PIV3前導和拖尾序列的排列。
測試兩種版本的迷你複製子構築體：一個在前導末端帶有終端AC殘基(Le+AC)，而一個在前導末端沒有終端AC殘基(Le-AC)。兩個構築體在測定中均是有功能的(圖25)。可在圖25中看到，在48小時之後發生的CAT表現，比在24小時之後的高很多。在48小時之後，觀察到每500,000個轉移感染的細胞約有14毫微克的CAT。該實驗完全由質體驅動：迷你複製子與T7聚合酶質體共同轉移感染，並從pCITE-2a/3a(pCite質體，具有T7聚合酶，接著是衍生自腦心肌炎病毒(EMCV)的IRES元件)中表現N、P、L、M2-1基因。當排除L、P和M2-1時，完全廢除了CAT表現。當從載體中排除N表現時，明顯地降低了CAT表現。
亦可藉著以hMPV聚合酶組份(NL/1/00和NL/1/99)或得自APV-A、APV-C、RSV或PIV的聚合酶組份，超感染迷你複製子-轉移感染的細胞，來測試迷你複製子系統的專一性(歸因於異源病毒)和前導之終端殘基的影響(歸因於同種病毒)。亦可測試6個質體各自的差異量，以便判定最佳條件。
可使用其他的報告者基因來代替CAT。在其他的實例中，可將GFP插入迷你複製子構築體內，來代替CAT。
7.3.實例24：產製全長有傳染性的cDNA
可建構表現hMPV之基因的全長cDNA，而得以產生有傳染性的病毒。例如，可建構編碼hMPV之所有基因，或所有必要基因的cDNA；然後可表現基因組，產生有傳染性的病毒。
為了以遺傳之方式操縱hMPV，選殖該RNA病毒的基因組。關於hMPV的00-1分離株，產生8個PCR片段，長度上的變化是從1至3kb(圖27)。定出PCR片段之序列，並藉著與存放在Genbank中的hMPV序列比較，分析序列的錯誤。兩個無聲突變(在SH基因中核苷酸5780 ile:ile，在L基因中核苷酸12219 cys:cys)未被修正。不改變另一個在L基因中，在核苷酸8352(trp:leu)處的改變，因為在兩個獨立產生的PCR片段(C和H)中，以及在hMPV99-1序列中觀察到該突變。同樣地，不修正在F-M2基因間區域中核苷酸4715處的5個核苷酸插入。這兩個改變可能反映hMPV的野外型序列。相反的，在核苷酸1242處在N-P基因間區域移除單一的A殘基；在核苷酸3367處，在F基因中修正ser:pro；在核苷酸6296處，在G基因中改變asp:val；並在核苷酸7332處，在L基因中將中止密碼子改為glu。在圖28中出示hMPV之不同分離株的限制輿圖。可使用限制位置來裝配全長的構築體。
然後依順序裝配8個經過修正的PCR片段，利用獨特的限制酵素位置(圖29)。將遺傳標記導入核苷酸75處，產生AflII限制酵素位置，但不改變胺基酸序列。在hMPV序列的3'端加入獨特的限制酵素位致XhoI。在hMPV序列的3'端加入嗜菌體T7聚合酶啟動基因，接著加入兩個G殘基。在hMPV基因組的5'端，加入肝炎δ核酶序列和BssHII限制酵素位置。
亦產製在pCITE質體中，編碼hMPV L、N、P和M2-1基因的協助者質體。一旦產生全長的hMPV cDNA，便在Vero細胞中，使用禽痘T7或MVA-T7作為T7聚合酶的來源，進行藉著逆向遺傳法回收病毒的工作。
7.4.實例26：以hMPV之亞型感染動物宿主
可感染動物宿主，以便定出MPV品系的毒力特徵。例如，可使用不同的宿主，以便判定每種品系在生物中如何感染。
尚未確認hMPV的小動物模式。使用1.3x106 pfu/動物之劑量，以hMPV感染Balb/c老鼠、棉鼠和敘利亞黃金倉鼠。以0.1毫升之體積，利用1.3x106 pfu的hMPV，鼻內接種動物。藉著溶菌斑測定，在第9天以hMPV天竺鼠抗血清免疫染色，來定量組織試樣。在感染後4天，犧牲動物，分離鼻甲骨和肺臟，並藉著免疫染色的溶菌斑測定，定量hMPV力價。
結果顯示hMPV在敘利亞黃金倉鼠中複製達高力價。在鼻甲骨和肺臟中，分別獲得5.3和2.3 log10 pfu/克組織的力價。hMPV不能在棉鼠的呼吸道中，複製至任何可察知的力價含量。老鼠在上和下呼吸道中，分別顯示2.7和2.2 1og10 pfu/克組織的力價。這些結果暗示敘利亞黃金倉鼠應該是研究hMPV複製和免疫原性，以及評估hMPV疫苗候選者的適當小動物模式。
天竺鼠的感染。使用兩種病毒分離株，00-1(A亞型)和99-1(B亞型)，每種亞型各接種6隻天竺鼠(氣管內、鼻和眼睛)。以hMPV00-1(10e6,5TCID50 )感染6隻天竺鼠。以hMPV 99-1(10e4,1TCID50 )感染6隻天竺鼠。容許最初的感染進行54天，此時以同種或異種的亞型(10e4 TCID50 /毫升)接種天竺鼠，即兩隻天竺鼠最初以00-1感染，並以99-1二次感染，以便達到異種感染，3隻天竺鼠最初以00-1感染，並以00-1二次感染，以便達到同種感染，2隻天竺鼠最初以99-1感染，並以00-1二次感染，以便達到異種感染，而3隻天竺鼠最初以99-1感染，並以99-1二次感染，以便達到同種感染。
在感染後12天(最初的感染)或8天(二次感染)收集喉和鼻抹拭物，並藉著RT-PCR測定，測試病毒的存在。RT-PCR測定的結果(圖32)，顯示以病毒分離株00-1接種的天竺鼠，在感染後第1至10天，顯示出上呼吸道的感染。以病毒分離株99-1接種的天竺鼠，在感染後第1至5天，顯示出上呼吸道的感染。感染99-1的天竺鼠，似乎比利用00-1的感染更不嚴重。按照上文建議，以異種病毒二次接種天竺鼠，結果在4隻天竺鼠中有3隻再度-感染。同樣的，在同種病毒的案例中，在6隻天竺鼠中有2隻發生再度-感染。在這些二次感染的動物中，注意到較少或沒有臨床症狀，且在受到對抗再度-感染之保護的那些動物中，沒有看到臨床症狀，證實即使利用野外型病毒，亦可能出現歸因於第一次感染的保護效果。這亦顯示可使用異種和同種分離株作為疫苗。
兩種hMPV亞型均可感染天竺鼠，雖然利用亞型B(99-1)的感染似乎較不嚴重，即病毒出現在鼻和喉中的期間比利用亞型A(00-1)的感染更短。這可能歸因於給予較高劑量的亞型A，或因為亞型B的毒力較低。雖然預先-存在之免疫力的存在，不能完全保護對抗利用同種和異種病毒兩者的再度-感染，但感染似乎是較不顯著的，注意到病毒存在的期間較短，且不是所有的動物均成為病毒陽性的。
檢查以hMPV兩種亞型感染之天竺鼠的血清學。在第0、52、70、80、90、110、126和160天，從天竺鼠中收集血清，並以1:100之稀釋度，在完整病毒ELISA中，對00-1和99-1抗原進行測試。(參見圖33A和B，顯示每個個別天竺鼠對抗00-1和99-1的IgG反應。亦參見圖34，顯示00-1和99-1 ELISA的專一性，但注意到只有使用得自同種再度感染之天竺鼠的資料。亦參見圖35，顯示三隻同種，即00-1和00-1，兩隻同種，即99-1和99-1，兩隻異種，即99-1和00-1，以及兩隻異種，即00-1和99-1感染之天竺鼠對抗00-1和99-1 ELISA的平均IgG反應)。
在兩個不同ELISAs中僅觀察到最小的差異。不可使用完整病毒ELISA對抗00-1或99-1來區別兩個亞型。
檢查在天竺鼠中對hMPV升高之血清對APV抗原的反應性。從被感染的天竺鼠中收集血清，並利用APV抑制ELISA測試之。(參見圖36，顯示hMPV感染天竺鼠之APV抑制作用的平均百分比)。以類似其在hMPV IgG ELISA's中反應的方式，使在天竺鼠中對hMPV升高之血清，在APV抑制測試中進行反應。對99-1升高的血清，在APV抑制ELISA中，顯示出比對00-1升高之血清更低的抑制百分比。被99-1感染的天竺鼠，可能具有比在hMPV ELISAs中所見更低的力價。或者，99-1與APV之交叉-反應，可能比與00-1的更低。儘管如此，可使用APVAb抑制ELISA，來檢測在天竺鼠中的hMPV抗體。
利用在天竺鼠中對hMPV升高之血清，進行病毒中和測定。在感染後第0天、52天、70天和80天收集血清，並用在利用00-1、99-1和APV-C的病毒交叉-中和測定中。所使用的開始稀釋度為每孔1至10和100 TCID50 個病毒。在中和作用之後，使病毒與tMK細胞(15毫米)接觸，並以3500 RPM離心，隨後更新培養基。使APV培養物生長4天，並使hMPV培養物生長7天。以80%丙酮固定細胞，並利用已標示之猴-抗hMPV，進行IFAs。將染色時為陰性的孔，定義為中和力價。對於每種病毒，包括病毒母液的10-log滴定和工作溶液的2倍滴定。(參見圖37，顯示00-1和99-1感染之天竺鼠對00-1、99-1和APV-C的病毒中和力價)。
獼猴的感染。使用病毒分離株00-1(A亞型)和99-1(B亞型)(1e5 TCID50 )，每種亞型接種2隻獼猴(氣管內、鼻和眼睛)。在最初感染之後6個月，第二次以00-1接種獼猴。在感染後第14天(最初的感染)或第8天(二次感染)，收集喉抹拭物，並藉著RT-PCR測定測試病毒的存在(圖38)。
以病毒分離株00-1接種的獼猴，在感染後1至10天，顯示上呼吸道的感染。臨床症狀包括化膿性鼻炎。以同種病毒二次接種的獼猴，由PCR證實產生再度-感染，然而，沒有看到臨床症狀。
在最初感染之後6個月的期間內，從接受00-1的獼猴中收集血清(對猴子3，在第240天發生再度-感染，且對猴子6則在第239天發生)。使用該血清測試對抗00-1或APV之IgG(圖39B)抗體的存在，以及對抗00-1之IgA和IgM的存在(圖39A)。
成功地以00-1感染2隻獼猴，並在對抗00-1之抗體的存在下，以同種病毒再度感染。對IgA和IgM抗體的反應，顯示在第一次感染之後，IgM抗體升高，但在再度感染之後缺乏它。僅在再度-感染之後檢測到IgA抗體，顯示在第一次感染之後直接的免疫反應。在APV抑制ELISA中，測試在獼猴中對hMPV升高的血清，顯示出類似hMPV IgG ELISA的反應。
以APV抑制ELISA測試在獼猴中對抗hMPV的抗體，使用像在hMPV ELISA中所用的類似的敏感性，因此APV抑制EIA適合用來針對hMPV抗體的存在，測試人類試樣。
在收集自hMPV感染獼猴的血清上，進行病毒交叉-中和測定。在最初感染之後第0天至第229天取得血清，並顯示僅有低的抗00-1病毒中和力價(0-80)，在二次感染之後取得血清，則顯示高的抗00-1中和力價，即大於1280。只有在二次感染之後取得的血清，顯示出抗99-1的中和力價(80-640)，且沒有血清能夠中和APVC病毒。在病毒交叉-中和測定中，在APV-C與hMPV之間沒有交叉反應，然而，在抗體反應的補強之後，在00-1與99-1之間有交叉反應。
人類的感染。先前使用IFA和對抗00-1的病毒中和測定，測試年齡範圍在6個月以下或20歲以上之患者的血清。在對抗00-1的ELISA中，針對IgG、IgM 和IgA抗體的存在，來測試這些血清。亦就其在APV ELISA中的抑制能力，測試這些試樣。為了在人類血清中檢測IgG抗體，比較hMPV ELISA和APV抑制ELISA的用途，並注意到在IgG hMPV測試與APV-Ab測試之間強有力的關連，因此APv-Ab測試基本上能夠在人類中檢測對抗hMPV的IgG抗體(圖40)。
禽類的感染。針對對抗APV之IgG抗體的存在，使用APV抑制ELISA和00-1ELISA來測試雞。hMPV ELISA和APV抑制ELISA兩者均可檢測出對抗APV的抗體。
7.5.實例27：APV在人類中作為疫苗
可在人類中使用APV作為疫苗，預防被人類MPV感染，或降低人類MPV在人類宿主中的感染力。該疫苗可以是完整的APV，或嵌合型或重組版本，或其衍生物，它除了APV的序列之外，還包括其他間質肺病毒的異源序列。可使用APV的基因組作為主鏈，創造重組的病毒疫苗。例如，可製造其中以人類MPV之F-基因或G-基因取代APV之F-基因及/或G-基因的疫苗。或者，可製造包括取代APV主鏈之序列，或加至其中的得自PIV之序列的疫苗。關於在建構重組/嵌合型疫苗上的更多資訊，參見，例如重組cDNA和RNA的建構。可藉著熟諳此藝者已熟知的各種方法，將疫苗投予志願者(參見前文第4.13節)，包括但不限於皮下注射、鼻內投藥或吸入。以至少在103 TCID50 至106 TCID50 之間的開始劑量，投與本發明之病毒及/或疫苗。以單一或多次給藥，投與病毒及/或疫苗，例如可投予最初的給藥，並在宿主的生命中，按一定的時間間隔，投予一或多次的後續或補強給藥。在臨床試驗中，可使用病毒的複製速率作為調整疫苗劑量的指標，而得以判定有效劑量攝生法。可在病毒在研究族群中的複製速率與已知有效的預定速率之間進行比較。
7.6.實例28：MPV在鳥類中作為疫苗
可在鳥類中使用人類MPV作為疫苗，預防被APV感染，或降低APV在鳥類宿主中的感染力。該疫苗可以是完整的MPV，或嵌合型或重組版本，或其衍生物，它除了MPV的序列之外，還包括其他間質肺病毒的異源序列。可使用人類MPV的基因組作為主鏈，創造重組的病毒疫苗。例如，可製造其中以APV之F-基因或G-基因取代人類MPV之F-基因及/或G-基因的疫苗。關於在建構重組/嵌合型疫苗上的更多資訊，參見，例如重組cDNA和RNA的建構。
可藉著各種方法，將疫苗投予志願者，包括但不限於皮下注射、鼻內投藥或吸入。以至少在103 TCID50 至106 TCID50 之間的開始劑量，投與本發明之病毒及/或疫苗。以單一或多次給藥，投與病毒及/或疫苗，例如可投予最初的給藥，並在宿主的生命中，按一定的時間間隔，投予一或多次的後續或補強給藥。在臨床試驗中，可使用病毒的複製速率作為調整疫苗劑量的指標，而得以判定有效劑量攝生法。可在病毒在研究族群中的複製速率與已知有效的預定速率之間進行比較。
圖1：在分離株00-1和肺病毒亞科之其他成員的胺基酸序列之間，發現的同種性百分比。給予N、P、M、F和L中的兩個RAP-PCR片段(8和9/10)胺基酸序列百分比(x100)。
圖2：在藉著年齡群分類的人類中，MPV的血清患病率，使用免疫螢光和病毒中和測定。
圖3：的APV之基因組的圖解表示，帶有在病毒分離株00-1(A1)上，利用RAP-PCR和RT-PCR獲得之片段的位置和尺寸。利用在RAP-PCR片段1和2中之引子，以及以APV和RSV之前導和拖尾序列的排列為基礎所設計的引子，獲得片段A(Randhawa等人，1997,J. Virol. 71:9849-9854)。使用在RAP-PCR片段1和2，以及RAP-PCR片段3中設計的引子，獲得片段B。使用在RAP-PCR片段3，以及在RAP-PCR片段4、5、6和7中設計的引子，獲得片段C。
圖4：比較肺病毒亞科之成員和病毒分離株00-1(A1)的N、P、M和F ORFs。排列顯示病毒分離株00-1(A1)之完整N、F、M和P蛋白質，以及部分L蛋白質的胺基酸序列。顯示在分離株00-1(A1)和其他病毒之間不同的胺基酸，藉著句點代表相同的胺基酸。以破折號表示間隙。號碼與在蛋白質中的胺基酸位置一致。縮寫如下：APV-A、B或C：A、B或C型禽肺病毒；hRSV：牛或人類呼吸道融合細胞病毒；PVM：老鼠的肺炎病毒。L8：利用位在L中的RAP-PCR獲得的片段8；L9/10：利用位在L中之RAP-PCR獲得的片段9和10之構築體。關於L的排列，僅獲得bRSV、hRSV和APV-A序列。
圖5：MPV之核蛋白的預測胺基酸序列，與其他肺病毒的那些的排列。藉著盒子表示保留區，並標示A、B和C。以灰色並加陰影，顯示在肺病毒中的保留區。以破折號表示間隙，句點代表與MPV相比較，相同胺基酸殘基的位置。
圖6：MPV之磷蛋白與其他肺病毒的那些的胺基酸序列比較。框起高類似性的區域，灰色並加陰影的是富含穀胺酸之區域。以破折號表示間隙。句點代表與MPV相比較，相同胺基酸殘基的位置。
圖7：比較MPV之基質蛋白質的推衍胺基酸序列，與其他肺病毒的那些。保留的六肽序列是灰色並加陰影的。以破折號表示間隙。句點代表相對於MPV，相同胺基酸殘基的位置。
圖8：MPV分離株00-1(A1)的基因組作圖。在每個ORF下，指出開始和中止密碼子的核苷酸位置。跨越LORF的雙線表示L基因的縮短表示。在圖下的三個編閱架構表示主要的GORF(nt 6262-6972)和有可能重疊的二級ORFs。
圖9：MPV之融合蛋白質的推衍胺基酸序列，與其他肺病毒的那些的排列。框起保留的半胱胺酸殘基。將N-連接的糖基化作用位置加下標線。F0之切開位置則加雙線的下標線；以灰色並加陰影，來顯示融合肽，信號肽和膜固定功能部位。以破折號表示間隙，且句點代表相對於MPV，相同胺基酸殘基的位置。
圖10：比較MPV之M2 ORFs的胺基酸序列，與其他肺病毒的那些。三個保留的半胱胺酸殘基以粗體字印刷，並藉#表示。在方格B中顯示M2-2 ORFs的排列。以破折號表示間隙，且句點代表相對於MPV，相同胺基酸殘基的位置。
圖11：MPV之SH ORF的胺基酸序列分析。(A)MPV之SHORF的胺基酸序列，其中絲胺酸和蘇胺酸殘基是灰色並加陰影的，半胱胺酸是粗體的，且忌水性區域加雙線的下標線。可能的N-連接之糖基化作用位置加單線的下標線。箭頭指出位在忌水性功能部位側面之鹼性胺基酸的位置。(B)MPV、APV-A和hRSV-B之SH蛋白質的忌水性作圖之排列。使用17個胺基酸的窗口。箭頭指出強忌水性功能部位。在X-軸上提供ORF中的位置。
圖12：MPV之GORF的胺基酸序列分析。(A)MPV之GORF的胺基酸序列，其中絲胺酸、蘇胺酸和脯胺酸殘基是灰色並加陰影的。半胱胺酸是粗體的，且忌水性區域加雙線的下標線。可能的N-連接之糖基化作用位置加單線的下標線。(B)MPV、APV-A和hRSV-B之G蛋白質的忌水性作圖之排列。使用17個胺基酸的窗口。箭頭指出忌水性功能部位，並在X-軸提供ORF中的位置。
圖13：比較MPV和其他副黏液病毒之聚合酶基因的保留功能部位之胺基酸序列。在功能部位III中，框起以四個保留的聚合酶基序(motif)(A、B、C、D)顯示的功能部位III(Poch等人，1989 EMBO J 8:3867-74;Poch等人，1990 J. Gen. Virol 71:1153-62)。以破折號表示間隙，且句點代表相對於MPV，相同胺基酸殘基的位置。使用的縮寫如下：hPIV-3：人類副流感病毒第3型；SV：仙臺病毒(Sendai virus)；hPIV-2：人類副流感病毒第2型；NDV：新城雞瘟病毒；MV：麻疹病毒；nipah：百立(Nipah)病毒。
圖14：肺病毒屬之成員和病毒分離株00-1(Al)之N、F、M和PORFs的系統發生分析。在得自下列基因的病毒序列上，進行系統發生分析：F(方格A)、N(方格B)、M(方格C)，和P(方格D)。系統發生樹狀圖是以最大蓋氏分析為基礎，使用100次靴環法和3組亂數。刻度代表每個樹狀圖顯示之核苷酸改變的數目。
圖15：MPV和所選出之副黏液病毒的M2-1和LORFs的系統發生分析。將M2-1 ORF與肺病毒亞科(A)之其他成員的M2-1 ORFs排成一直線，並將LORF與肺病毒屬之成員，以及所選出之其他副黏液病毒的LORFs排成一直線，按照在圖13之說明中的描述。藉著最大蓋氏分析產生系統發生樹狀圖，使用100次靴環法和3組亂數。刻度代表每個樹狀圖顯示之核苷酸改變的數目。樹狀圖上的數目代表以一致之樹狀圖為基礎的靴環值。
圖16：九個帶有APV-C之原始MPV分離株的一部分F(方格A)、N(方格B)、M(方格C)20和L(方格D)ORFs的系統發生關係，其在遺傳上是密切相關的。系統發生樹狀圖是以最大蓋氏分析為基礎。刻度代表每個樹狀圖顯示之核苷酸改變的數目。APV-C之登錄編號：方格A：D00850；方格B：U39295；方格C：X58639；和方格D：U65312。
圖17：所有四個變種，變種A1、A2、B1或B2之hMPV的不同分離株之F基因的排列。
圖18：所有四個變種，變種A1、A2、B1或B2之hMPV的不同分離株之F蛋白質的排列。
圖19：所有四個變種，變種A1、A2、B1或B2之hMPV的不同分離株之G基因的排列。
圖20：所有四個變種，變種A1、A2、B1或B2之hMPV的不同分離株之G蛋白質的排列。
圖21：以F基因序列為基礎的系統發生樹狀圖，顯示帶有個別變種之hMPV的不同hMPV分離株的系統發生關係。
圖22：以G基因序列為基礎的系統發生樹狀圖，顯示帶有在圖13中所示之個別變種之hMPV的不同hMPV分離株的系統發生關係。
圖23：hMPV分離株00-1(A1)在Vero細胞中的生長曲線。以0.1之MOI感染Vero細胞。
圖24：CAT-hMPV迷你複製子構築體的序列。在序列下方指出由該序列之斷片編碼的功能。
圖25：從CAT-hMPV迷你複製子中表現CAT。在x-軸指出用來轉移感染的不同構築體；在y-軸指出CAT的表現量。圖片顯示在感染後24小時的CAT表現，以及在感染後48小時的CAT表現。標準物為CAT蛋白質之稀釋物。
圖26：前導和拖尾序列的比較：按照指示顯示不同變種之前導和拖尾序列的排列。
圖27：hMPV基因組分析：顯示hMPV基因組序列之PCR片段，與hMPV基因組之組織化有關。在代表PCR片段的直柱下方，顯示突變的位置。
圖28：hMPV分離株00-1(A1)和hMPV分離株99-1(B1)的限制輿圖。在顯示hMPV之基因組組織化的圖式下方，指出個別分離株中的限制位置。在圖式上方的刻度代表在hMPV基因組中的位置，按kb計。
圖29A和29B：hMPV cDNA的裝配。圖式上方顯示hMPV的基因組組織化，下方的長條柱代表裝配產生編碼該病毒之全長cDNA的RCR片段(參見圖27)。在長條柱上方的號碼，代表PCR片段，指出在病毒基因組中的位置，按鹼基對計。
圖30：得自MPV分離株00-1(A1)之基因組3'端的核苷酸和胺基酸序列資訊。提供ORFs。N：核蛋白的ORF；P：磷蛋白的ORF；M：基質蛋白質的ORF；F：融合蛋白質的ORF；GE：基因末端；GS：基因起點。
圖31A和B：得自在MPV分離株00-1(A1)之聚合酶基因(L)中獲得之片段的核苷酸和胺基酸序列資訊。在L中的片段定位，是以與APV-A(登錄編號U65312)之蛋白質同種性為基礎。轉譯片段8(圖31A)係位在APV-A L ORF之胺基酸第8至243號，而一致的片段9和10(圖31B)係位在胺基酸第1358至1464號。
圖32：對12隻接種ned/00/01(A1)及/或ned/99/01(B1)之天竺鼠的咽喉和鼻抹拭物之RT-PCR測定的結果。
圖33A：以ned/00/01(A1)感染，並以ned/00/01(A1)(G P4、5和6)，或ned/99/01(B1)(GP1和3)再度-感染的天竺鼠，對抗ned/00/01(A1)和ned/99/01(B1)的IgG反應。
圖33B：以ned/99/01感染，並以ned/00/01(A1)(GP's8和9)，或以ned/99/01(B1)(GP's10、11和12)再度-感染的天竺鼠，對抗ned/00/01(A1)和ned/99/01(B1)的IgG反應。
圖34：ned/00/01(A1)和ned/99/01(B1)ELISA，對取自以ned/00/01(A1)或ned/99/01(B1)感染之天竺鼠的血清的專一性。
圖35：對抗ned/00/01(A1)和ned/99/01(B1)ELISA之3同種(00-1/00-1)、2同種(99-1/99-1)、2異種(99-1/00-1)和2異種(00-1/99-1)感染之天竺鼠的平均IgG反應。
圖36：hMPV感染天竺鼠之APV抑制作用的平均百分比。
圖37：ned/00/01(A1)和ned/99/01(B1)感染之天竺鼠，對抗ned/00/01(A1)、ned/99/01(B1)和APV-C的病毒中和力價。
圖38：以ned/00/01(A1)接種(兩次)之獼猴的咽喉抹拭物之RT-PCR測定的結果。
圖39A(上方兩格)：以ned/00/01(A1)(再度)感染之2隻獼猴，對抗ned/00/01(A1)之IgA、IgM和IgG反應。
圖39B(下方的方格)：以ned/00/01(A1)感染之2隻獼猴，對抗APV之IgG反應。
圖40：比較在人類血清中，使用hMPV ELISA和APV抑制ELISA來檢測IgG抗體。
圖41：比較兩種原型的hMPV分離株，與APV-A和APV-C；編碼各種病毒蛋白質之核酸的DNA類似性矩陣。
圖42：比較兩種原型的hMPV分離株，與APV-A和APV-C；各種病毒蛋白質的蛋白質類似性矩陣。
圖43：兩種原型hMPV分離株之核蛋白的胺基酸排列。
圖44：兩種原型hMPV分離株之磷蛋白的胺基酸排列。
圖45：兩種原型hMPV分離株之基質蛋白質的胺基酸排列。
圖46：兩種原型hMPV分離株之融合蛋白質的胺基酸排列。
圖47：兩種原型hMPV分離株之M2-1蛋白質的胺基酸排列。
圖48：兩種原型hMPV分離株之M2-2蛋白質的胺基酸排列。
圖49：兩種原型hMPV分離株之短忌水性蛋白質的胺基酸排列。
圖50：兩種原型hMPV分離株之附接糖蛋白的胺基酸排列。
圖51：兩種原型hMPV分離株之聚合酶蛋白質之N-終端的胺基酸排列。
圖52：hMPV分離株00-1(A1)的非密碼序列。(A)以正義顯示在ORFs之間，和在基因組終端的非密碼序列。從左至右，顯示指定之ORFs之中止密碼子，接著是非密碼序列，指定之後續ORFs的開始信號和開始密碼子。號碼表示在hMPV輿圖中開始和中止密碼子的第一個位置。將對公開之基因末端信號展現出類似性的序列加下標線，並以在序列上方的線，表示對UAAAAAU/A/C展現出類似性的序列。(B)hMPV之基因組終端的核苷酸序列。將hMPV之基因組終端彼此排成一直線，並與APV的那些排成一直線。加下標線的區域代表在RT-PCR測定中使用的引子序列，其係以APV和RSV的3'和5'末端序列為基礎。粗斜體的核苷酸為N基因之基因開始信號的一部分。Le：前導，Tr：拖尾。
圖53：hMPV分離株00-1(A1)與hMPV分離株99-1(B1)之基因組序列的序列比較。
圖54：使用聚腺苷酸化作用和3'RACE法的組合，判定人類間質肺病毒(hMPV)NL/1/00(A1)基因組RNA的前導序列。
圖55：直接對PCR產物，以及對PCR純種系兩者的定序分析，指出hMPV之前導區，在前導序列中最靠近3'端的20個核苷酸，係由5'ACG CGA AAA AAA CGC GTA TA所組成(以正義cDNA方位表示)。將兩個新近確認的核苷酸加下標線。
(無元件符號說明)

Claims (10)

  1. 一種在試樣中檢測變種B1哺乳動物MPV的方法，其中該方法包括使該試樣與經過分離的核酸接觸，該經過分離的核酸在高嚴格度的條件下與編碼包括下列蛋白質之核酸雜交：(i)與哺乳動物MPV變種B1之G蛋白質(序列識別324號)至少66%相同的胺基酸序列；(ii)與哺乳動物MPV變種B1之N蛋白質(序列識別368號)至少98.5%相同的胺基酸序列；(iii)與哺乳動物MPV變種B1之P蛋白質(序列識別376號)至少96%相同的胺基酸序列；(iv)與哺乳動物MPV變種B1之M蛋白質(序列識別360號)相同的胺基酸序列；(v)與哺乳動物MPV變種B1之F蛋白質(序列識別316號)至少99%相同的胺基酸序列；(vi)與哺乳動物MPV變種B1之M2-1蛋白質(序列識別340號)至少98%相同的胺基酸序列；(vii)與哺乳動物MPV變種B1之M2-2蛋白質(序列識別348號)至少99%相同的胺基酸序列；(viii)與哺乳動物MPV變種B1之SH蛋白質(序列識別384號)至少83%相同的胺基酸序列；或(ix)與哺乳動物MPV變種B1之L蛋白質(序列識別332號)至少99%相同的胺基酸序列。
  2. 一種在試樣中檢測變種B1哺乳動物MPV的方法，其中該 方法包括使該試樣與抗體接觸，其中該抗體專一地與由下列組成之蛋白質結合：(i)與哺乳動物MPV變種B1之G蛋白質(序列識別324號)至少66%相同的胺基酸序列；(ii)與哺乳動物MPV變種B1之N蛋白質(序列識別368號)至少98.5%相同的胺基酸序列；(iii)與哺乳動物MPV變種B1之P蛋白質(序列識別376號)至少96%相同的胺基酸序列；(iv)與哺乳動物MPV變種B1之M蛋白質(序列識別360號)相同的胺基酸序列；(v)與哺乳動物MPV變種B1之F蛋白質(序列識別316號)至少99%相同的胺基酸序列；(vi)與哺乳動物MPV變種B1之M2-1蛋白質(序列識別340號)至少98%相同的胺基酸序列；(vii)與哺乳動物MPV變種B1之M2-2蛋白質(序列識別348號)至少99%相同的胺基酸序列；(viii)與哺乳動物MPV變種B1之SH蛋白質(序列識別384號)至少83%相同的胺基酸序列；或(ix)與哺乳動物MPV變種B1之L蛋白質(序列識別332號)至少99%相同的胺基酸序列。
  3. 一種確認病毒分離株為哺乳動物MPV的方法，其中該方法包括使該分離株或其組份與抗體接觸，其中該抗體專一地與由下列組成之蛋白質結合：(i)與哺乳動物MPV變種B1之G蛋白質(序列識別324 號)至少66%相同的胺基酸序列；(ii)與哺乳動物MPV變種B1之N蛋白質(序列識別368號)至少98.5%相同的胺基酸序列；(iii)與哺乳動物MPV變種B1之P蛋白質(序列識別376號)至少96%相同的胺基酸序列；(iv)與哺乳動物MPV變種B1之M蛋白質(序列識別360號)相同的胺基酸序列；(v)與哺乳動物MPV變種B1之F蛋白質(序列識別316號)至少99%相同的胺基酸序列；(vi)與哺乳動物MPV變種B1之M2-1蛋白質(序列識別340號)至少98%相同的胺基酸序列；(vii)與哺乳動物MPV變種B1之M2-2蛋白質(序列識別348號)至少99%相同的胺基酸序列；(viii)與哺乳動物MPV變種B1之SH蛋白質(序列識別384號)至少83%相同的胺基酸序列；或(ix)與哺乳動物MPV變種B1之L蛋白質(序列識別332號)至少99%相同的胺基酸序列。
  4. 一種於活體外以病毒學診斷哺乳動物之MPV感染的方法，其包括利用使試樣與抗體接觸以判定該哺乳動物之試樣中病毒分離株或其組份的存在，其中該抗體專一地與由下列組成蛋白質結合：(i)與哺乳動物MPV變種B1之G蛋白質(序列識別324號)至少66%相同的胺基酸序列；(ii)與哺乳動物MPV變種B1之N蛋白質(序列識別368 號)至少98.5%相同的胺基酸序列；(iii)與哺乳動物MPV變種B1之P蛋白質(序列識別376號)至少96%相同的胺基酸序列；(iv)與哺乳動物MPV變種B1之M蛋白質(序列識別360號)相同的胺基酸序列；(v)與哺乳動物MPV變種B1之F蛋白質(序列識別316號)至少99%相同的胺基酸序列；(vi)與哺乳動物MPV變種B1之M2-1蛋白質(序列識別340號)至少98%相同的胺基酸序列；(vii)與哺乳動物MPV變種B1之M2-2蛋白質(序列識別348號)至少99%相同的胺基酸序列；(viii)與哺乳動物MPV變種B1之SH蛋白質(序列識別384號)至少83%相同的胺基酸序列；或(ix)與哺乳動物MPV變種B1之L蛋白質(序列識別332號)至少99%相同的胺基酸序列。
  5. 一種於活體外以病毒學診斷感染哺乳動物MPV之個體的方法，其中該方法包括：(a)從該個體中獲得試樣；(b)使該試樣與與抗體接觸，其中該抗體專一地與由下列組成之蛋白質結合：(i)與哺乳動物MPV變種B1之G蛋白質(序列識別324號)至少66%相同的胺基酸序列；(ii)與哺乳動物MPV變種B1之N蛋白質(序列識別368號)至少98.5%相同的胺基酸序列； (iii)與哺乳動物MPV變種B1之P蛋白質(序列識別376號)至少96%相同的胺基酸序列；(iv)與哺乳動物MPV變種B1之M蛋白質(序列識別360號)相同的胺基酸序列；(v)與哺乳動物MPV變種B1之F蛋白質(序列識別316號)至少99%相同的胺基酸序列；(vi)與哺乳動物MPV變種B1之M2-1蛋白質(序列識別340號)至少98%相同的胺基酸序列；(vii)與哺乳動物MPV變種B1之M2-2蛋白質(序列識別348號)至少99%相同的胺基酸序列；(viii)與哺乳動物MPV變種B1之SH蛋白質(序列識別384號)至少83%相同的胺基酸序列；或(ix)與哺乳動物MPV變種B1之L蛋白質(序列識別332號)至少99%相同的胺基酸序列，其中若該抗體與該試樣結合，則該個體被哺乳動物MPV感染。
  6. 一種於活體外診斷動物之哺乳動物MPV變種B1感染的方法，其中該方法包括在該動物之試樣中，藉著使該試樣與可與禽肺病毒之組份產生反應的核酸或抗體反應，該核酸或抗體對MPV之組份具有交叉-反應性，來判定病毒分離株或其組份的存在。
  7. 一種於活體外以血清學診斷動物之哺乳動物MPV感染的方法，其中該方法包括使得自該動物之試樣與包括下列之蛋白質接觸： (i)與哺乳動物MPV變種B1之G蛋白質(序列識別324號)至少66%相同的胺基酸序列；(ii)與哺乳動物MPV變種B1之N蛋白質(序列識別368號)至少98.5%相同的胺基酸序列；(iii)與哺乳動物MPV變種B1之P蛋白質(序列識別376號)至少96%相同的胺基酸序列；(iv)與哺乳動物MPV變種B1之M蛋白質(序列識別360號)相同的胺基酸序列；(v)與哺乳動物MPV變種B1之F蛋白質(序列識別316號)至少99%相同的胺基酸序列；(vi)與哺乳動物MPV變種B1之M2-1蛋白質(序列識別340號)至少98%相同的胺基酸序列；(vii)與哺乳動物MPV變種B1之M2-2蛋白質(序列識別348號)至少99%相同的胺基酸序列；(viii)與哺乳動物MPV變種B1之SH蛋白質(序列識別384號)至少83%相同的胺基酸序列；或(ix)與哺乳動物MPV變種B1之L蛋白質(序列識別332號)至少99%相同的胺基酸序列。
  8. 一種於活體外以血清學診斷動物之哺乳動物MPV變種B1感染的方法，其中該方法包括使得自該動物之試樣與APV之蛋白質接觸。
  9. 一種於活體外診斷鳥類之APV感染的方法，其包括使得自該動物之試樣與包括下列之蛋白質接觸：(i)與哺乳動物MPV變種B1之G蛋白質(序列識別324 號)至少66%相同的胺基酸序列；(ii)與哺乳動物MPV變種B1之N蛋白質(序列識別368號)至少98.5%相同的胺基酸序列；(iii)與哺乳動物MPV變種B1之P蛋白質(序列識別376號)至少96%相同的胺基酸序列；(iv)與哺乳動物MPV變種B1之M蛋白質(序列識別360號)相同的胺基酸序列；(v)與哺乳動物MPV變種B1之F蛋白質(序列識別316號)至少99%相同的胺基酸序列；(vi)與哺乳動物MPV變種B1之M2-1蛋白質(序列識別340號)至少98%相同的胺基酸序列；(vii)與哺乳動物MPV變種B1之M2-2蛋白質(序列識別348號)至少99%相同的胺基酸序列；(viii)與哺乳動物MPV變種B1之SH蛋白質(序列識別384號)至少83%相同的胺基酸序列；或(ix)與哺乳動物MPV變種B1之L蛋白質(序列識別332號)至少99%相同的胺基酸序列。
  10. 根據申請專利範圍第9項之方法，其中該APV是APV-C。
TW098112076A 2002-02-21 2003-02-21 間質肺病毒株及其作為疫苗調配物及作為表現抗原性序列之載體之應用 TWI405851B (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US35893402P 2002-02-21 2002-02-21

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW200930816A TW200930816A (en) 2009-07-16
TWI405851B true TWI405851B (zh) 2013-08-21

Family

ID=27766025

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW092103641A TWI344991B (en) 2002-02-21 2003-02-21 Metapneumovirus strains as vaccine formulations and as vectors for expression of heterologous antigenic sequences
TW098112076A TWI405851B (zh) 2002-02-21 2003-02-21 間質肺病毒株及其作為疫苗調配物及作為表現抗原性序列之載體之應用
TW098137418A TWI356848B (en) 2002-02-21 2003-02-21 Recombinant parainflulenza virus expression system
TW092103642A TWI359868B (en) 2002-02-21 2003-02-21 Recombinant parainflulenza virus expression system

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW092103641A TWI344991B (en) 2002-02-21 2003-02-21 Metapneumovirus strains as vaccine formulations and as vectors for expression of heterologous antigenic sequences

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW098137418A TWI356848B (en) 2002-02-21 2003-02-21 Recombinant parainflulenza virus expression system
TW092103642A TWI359868B (en) 2002-02-21 2003-02-21 Recombinant parainflulenza virus expression system

Country Status (12)

Country Link
US (11) US7449324B2 (zh)
EP (3) EP1485468A4 (zh)
JP (4) JP4553589B2 (zh)
KR (2) KR101151822B1 (zh)
CN (2) CN1646684B (zh)
AR (4) AR038596A1 (zh)
AU (2) AU2003219837B2 (zh)
CA (3) CA2477234C (zh)
IL (2) IL163646A0 (zh)
MX (1) MXPA04008088A (zh)
TW (4) TWI344991B (zh)
WO (2) WO2003072719A2 (zh)

Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060094105A1 (en) 1998-04-24 2006-05-04 University Hospitals Of Cleveland Mixed cell diagnostic systems for detection of respiratory, herpes and enteric viruses
US6764685B1 (en) * 2000-03-21 2004-07-20 Medimmune Vaccines, Inc. Recombinant parainfluenza virus expression systems and vaccines
DK1351981T3 (da) * 2001-01-19 2012-11-26 Vironovative Bv Et virus, der forårsager luftvejssygdom hos modtagelige pattedyr
US20030232061A1 (en) * 2001-10-18 2003-12-18 Fouchier Ronaldus Adrianus Maria Recombinant parainfluenza virus expression systems and vaccines comprising heterologous antigens derived from metapneumovirus
US8715922B2 (en) * 2001-01-19 2014-05-06 ViroNovative Virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals
JP4553589B2 (ja) 2002-02-21 2010-09-29 メディミューン，エルエルシー 組換えパラインフルエンザウイルス発現系とメタニューモウイルスから得られる異種抗原を含むワクチン
CA2494485A1 (en) * 2002-07-25 2004-02-05 Medimmune, Inc. Methods of treating and preventing rsv, hmpv, and piv using anti-rsv, anti-hmpv, and anti-piv antibodies
AU2003297602A1 (en) * 2002-12-02 2004-06-23 University Of Maryland, College Park Avian pneumovirus genes, recombinant avian pneumoviruses and methods of making
US7704491B2 (en) * 2003-02-28 2010-04-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant human metapneumovirus and its use
US7704720B2 (en) * 2003-04-25 2010-04-27 Medimmune, Llc Metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and as vectors for expression of antigenic sequences and methods for propagating virus
JP2006524511A (ja) 2003-04-25 2006-11-02 メッドイミューン バクシーンズ，インコーポレイティド メタニューモウイルス由来の異種抗原を含む組換えパラインフルエンザウイルス発現系およびワクチン
WO2005080417A2 (en) * 2003-12-10 2005-09-01 The Uab Research Foundation Recombinant viruses with heterologous envelope proteins
BRPI0518568A2 (pt) * 2004-12-24 2008-11-25 Solvay Pharm Bv mÉtodo para produzir uma partÍcula do vÍrus da influenza replicativo sem o uso de vÍrus auxiliar, partÍcula de vÍrus da influenza replicativo, cÉlula, composiÇço, uso de uma composiÇço, mÉtodo para gerar proteÇço imunolàgica contra infecÇço de um indivÍduo com um vÍrus da influenza, e, Ácido nuclÉico
AU2006223138B2 (en) * 2005-03-10 2012-04-05 Medimmune, Llc Metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and as vectors for expression of antigenic sequences and methods for propagating virus
JP4976376B2 (ja) * 2005-04-08 2012-07-18 メディミューン，エルエルシー 哺乳動物メタニューモウイルスに対する抗体
US7682619B2 (en) 2006-04-06 2010-03-23 Cornell Research Foundation, Inc. Canine influenza virus
US8492097B2 (en) 2006-04-24 2013-07-23 Diagnostic Hybrids, Inc. Compositions and methods for human metapneumovirus monoclonal antibodies
US20080213749A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-04 Melanie Feola Compositions and methods for detecting human metapneumovirus
EP2069485A4 (en) * 2007-07-13 2011-05-25 Medimmune Llc PREPARATION OF NEGATIVE STRAND RNA VIRUSES BY ELECTROPORATION
JP2010539093A (ja) * 2007-09-10 2010-12-16 インターベツト・インターナシヨナル・ベー・ベー イヌ、ネコ及びウマにおけるインフルエンザ感染を予防するための組成物及び方法
US20090186050A1 (en) * 2007-11-16 2009-07-23 Fouchier Ron A M Live attenuated metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and chimeric metapneumovirus strains
US20090165049A1 (en) * 2007-12-19 2009-06-25 United Video Properties, Inc. Methods and devices for presenting and interactive media guidance application
EP4218799A1 (en) 2009-07-15 2023-08-02 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Rsv f protein compositions and methods for making same
KR101346197B1 (ko) * 2009-07-17 2014-02-06 한림대학교 산학협력단 리포좀에 포집된 올리고뉴클레오타이드 및 에피토프를 포함하는 면역증강용 조성물
KR101073991B1 (ko) * 2009-10-27 2011-10-21 대한민국 국내사육 닭에서 유행하는 신규한 ｂ형 조류메타뉴모바이러스 ｓｃ1509주 및 이의 용도
US20130085133A1 (en) * 2010-02-08 2013-04-04 Sourthern Research Institute Office of Commercialization and Intellectual Prop. Anti-viral treatment and assay to screenfor anti-viral agent
NZ609952A (en) * 2010-11-10 2015-05-29 Leti Sl Lab Adjuvant fragments from leishmania species
WO2012089231A1 (en) * 2010-12-30 2012-07-05 Okairòs Ag Paramyxovirus vaccines
WO2012108195A1 (ja) * 2011-02-08 2012-08-16 国立大学法人三重大学 遺伝子導入用ウイルスベクターの製造方法
WO2012116715A1 (en) * 2011-03-02 2012-09-07 Curevac Gmbh Vaccination in newborns and infants
WO2012116714A1 (en) 2011-03-02 2012-09-07 Curevac Gmbh Vaccination in elderly patients
WO2012158613A1 (en) 2011-05-13 2012-11-22 Novartis Ag Pre-fusion rsv f antigens
CN102676701B (zh) * 2012-06-11 2013-08-14 广东温氏食品集团股份有限公司 禽肺病毒通用型rt-pcr检测引物及检测方法
WO2014115893A1 (ja) 2013-01-28 2014-07-31 株式会社イーベック ヒト・メタニューモウイルスに特異的なヒト抗体もしくはその抗原結合性断片
WO2014160463A1 (en) 2013-03-13 2014-10-02 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Prefusion rsv f proteins and their use
US10023626B2 (en) 2013-09-30 2018-07-17 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
CL2013002829A1 (es) * 2013-10-01 2014-04-04 Univ Pontificia Catolica Chile Formulacion inmunogenica que contiene bcg vivas recombinantes que expresan antigenos de metapneumovirus (hmpv) en una suspension que se prepara a partir de un liofilizado sin la necesidad de adjuvante; su uso farmaceutico; vacuna contra hmpv.
EP2873728A1 (en) * 2013-11-18 2015-05-20 Institut Pasteur A subunit vaccine platform based on multimeric ribonucleoproteins comprising nucleoproteins of a non-segmented negative-strand RNA virus as carriers of heterologous polypeptides
KR101577397B1 (ko) * 2014-01-15 2015-12-28 경북대학교 산학협력단 신규한 돼지 파라인플루엔자 바이러스 5(pPIV5), 이를 포함하는 백신 조성물 및 이를 이용한 돼지 파라인플루엔자 바이러스 검정 키트
JP6617935B2 (ja) * 2014-04-10 2019-12-11 国立研究開発法人理化学研究所 Ｔｈ１７細胞の誘導のための組成物及び方法
CN107406835A (zh) 2015-01-20 2017-11-28 美利坚合众国,由健康及人类服务部部长代表 表达嵌合rsv/bpiv3f蛋白的重组人/牛副流感病毒3(b/hpiv3)及其用途
US20180339038A1 (en) * 2015-06-12 2018-11-29 Mie University Human parainfluenza virus type 2 vector and vaccine
CL2015002152A1 (es) * 2015-07-31 2016-06-03 Pontificia Universidad Católica De Chile Anticuerpos monoclonales específicos para el antígeno p del virus respiratorio sincicial humano (vrsh), producidos y secretados por hibridomas celulares, útiles para la detección y el diagnostico de la infección causada por vrsh
EP4349405A3 (en) 2015-10-22 2024-06-19 ModernaTX, Inc. Respiratory virus vaccines
US11174292B2 (en) 2016-03-29 2021-11-16 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Substitutions-modified prefusion RSV F proteins and their use
CN106282407A (zh) * 2016-08-11 2017-01-04 青岛易邦生物工程有限公司 一种b亚群禽肺病毒疫苗的效检方法
MA50335A (fr) 2016-12-08 2020-08-19 Modernatx Inc Vaccins à acide nucléique contre des virus respiratoires
EP3554538A2 (en) 2016-12-16 2019-10-23 Institute for Research in Biomedicine Novel recombinant prefusion rsv f proteins and uses thereof
JOP20190256A1 (ar) 2017-05-12 2019-10-28 Icahn School Med Mount Sinai فيروسات داء نيوكاسل واستخداماتها
EP3630173A1 (en) 2017-05-29 2020-04-08 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Recombinant chimeric bovine/human parainfluenza virus 3 expressing rsv g and its use
KR20200096904A (ko) * 2017-09-15 2020-08-14 오하이오 스테이트 이노베이션 파운데이션 호흡기 세포융합 바이러스(rsv) 감염의 예방을 위한 백신 및 백신의 제조 및 사용 방법
FR3084079A1 (fr) 2018-07-23 2020-01-24 Universite Claude Bernard Lyon 1 Nouvelle souche virale attenuee et son utilisation en tant que vaccin
WO2020037215A1 (en) 2018-08-17 2020-02-20 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Recombinant newcastle disease viruses and uses thereof for the prevention of rsv disease or human metapneumovirus disease
FR3089789B1 (fr) 2018-12-14 2022-05-27 Univ Claude Bernard Lyon Production de vaccins viraux sur une lignee cellulaire aviaire
US20220125909A1 (en) * 2019-02-11 2022-04-28 Emory University Chimeric rsv and hmpv f proteins, immunogenic compositions, and methods of use
US11351242B1 (en) 2019-02-12 2022-06-07 Modernatx, Inc. HMPV/hPIV3 mRNA vaccine composition
CN109851678A (zh) * 2019-03-07 2019-06-07 苏州宇之波生物科技有限公司 一种改良的亚稳定态牛呼吸道合胞病毒融合前体f蛋白质及编码的dna分子和其应用
CN116615235A (zh) 2020-10-09 2023-08-18 得克萨斯州大学系统董事会 融合前稳定的hmpv f蛋白
CA3216466A1 (en) 2021-04-27 2022-11-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Recombinant chimeric bovine/human parainfluenza virus 3 expressing sars-cov-2 spike protein and its use
US20240279610A1 (en) 2021-06-09 2024-08-22 Universität Duisburg-Essen Method for immortalising vesicle-secreting cells
MX2024006506A (es) 2021-11-30 2024-08-14 Sanofi Pasteur Inc Vacunas basadas en vectores virales de metapneumovirus humano.

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002057302A2 (en) * 2001-01-19 2002-07-25 Vironovative B.V. A virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals

Family Cites Families (75)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5149650A (en) * 1986-01-14 1992-09-22 University Of North Carolina At Chapel Hill Vaccines for human respiratory virus
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
WO1989010405A1 (en) 1988-04-22 1989-11-02 The Upjohn Company Chimeric glycoproteins containig immunogenic segments of human parainfluenza virus type 3
US5137819A (en) 1988-07-08 1992-08-11 University Of British Columbia Cellulose binding fusion proteins for immobilization and purification of polypeptides
US5854037A (en) 1989-08-28 1998-12-29 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines
US5166057A (en) 1989-08-28 1992-11-24 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand rna virus expression-systems
US5229285A (en) 1991-06-27 1993-07-20 Kikkoman Corporation Thermostable luciferase of firefly, thermostable luciferase gene of firefly, novel recombinant dna, and process for the preparation of thermostable luciferase of firefly
US5824307A (en) 1991-12-23 1998-10-20 Medimmune, Inc. Human-murine chimeric antibodies against respiratory syncytial virus
GB9200117D0 (en) 1992-01-06 1992-02-26 Connaught Lab Production of recombinant chimeric proteins for vaccine use
US5496934A (en) 1993-04-14 1996-03-05 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Nucleic acids encoding a cellulose binding domain
DE4407489A1 (de) * 1994-03-07 1995-09-14 Bayer Ag Vakzine zur Prävention von Respirations- und Reproduktionserkrankungen des Schweines
GB9501170D0 (en) 1994-03-23 1995-03-08 Secr Defence Luciferases
ES2129199T3 (es) 1994-04-19 1999-06-01 Sanquin Bloedvoorziening Procedimientos de discriminacion entre las variantes del virus de la inmunodeficiencia humana que inducen el sincitio y los que no inducen el sincitio y cebadores para la utilizacion en los procedimientos.
PT702085E (pt) * 1994-07-18 2004-04-30 Karl Klaus Conzelmann Virus de arn de cadeia negativa nao segmentada infeccioso recombinante
US5625048A (en) 1994-11-10 1997-04-29 The Regents Of The University Of California Modified green fluorescent proteins
US7153510B1 (en) 1995-05-04 2006-12-26 Yale University Recombinant vesiculoviruses and their uses
DE69510207T3 (de) 1995-08-09 2007-02-15 Schweiz. Serum- & Impfinstitut Bern Verfahren zur Herstellung von infektiösen minussträngigen RNA-Viren
WO1997008342A1 (en) 1995-08-30 1997-03-06 Gentest Corporation Cytochrome p450 reporter gene
CA2230033C (en) 1995-09-27 2010-01-26 Peter L. Collins Production of infectious respiratory syncytial virus from cloned nucleotide sequences
US5869036A (en) * 1995-12-08 1999-02-09 St. Louis University Live attenuated vaccines based on CP45 HPIV-3 strain and method to ensure attenuation in such vaccine
ES2109189B1 (es) 1996-03-14 1998-05-16 Iberica Cyanamid Vectores basados en genomas virales defectivos recombinantes y su empleo en la formulacion de vacunas.
US5849036A (en) * 1996-03-29 1998-12-15 Zarate; Alfredo R. Vascular graft prosthesis
US6180398B1 (en) * 1996-07-12 2001-01-30 Virogeneitics Corporation Two-step immunization procedure against the pyramyxoviridae family of viruses using recombinant virus and subunit protein preparation
BR9710363A (pt) 1996-07-15 2000-01-11 Us Gov Health & Human Serv "vìrus sincicial respirátorio recombinante infeccioso isolado, partìcula do mesmo, processos para estimular o sistema imunológico de um indivìduo para induzir proteção contra o vìrus sincicial respiratório e para produzir uma partìcula de vìrus sincicial respiratório recombinante, vacina para induzir proteção contra o vìrus sincicial respiratório recombinante composição e ceta de vìrus sincicial respiratório recombinante"
EP0932684A2 (en) 1996-09-27 1999-08-04 American Cyanamid Company 3' genomic promoter region and polymerase gene mutations responsible for attenuation in viruses of the order designated mononegavirales
GB9707486D0 (en) 1997-04-11 1997-05-28 Secr Defence Enzyme assays
US6136585A (en) * 1997-05-02 2000-10-24 Uab Research Foundation Attenuation of negative stranded RNA viruses by rearrangement of genes and uses thereof
DE69838097T2 (de) * 1997-05-07 2008-04-10 The Cleveland Clinic Foundation, Cleveland Infektiöser klon für menschlichen parainfluenzavirus-typ
US7192593B2 (en) * 1997-05-23 2007-03-20 The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Use of recombinant parainfluenza viruses (PIVs) as vectors to protect against infection and disease caused by PIV and other human pathogens
US20030082209A1 (en) * 2000-07-05 2003-05-01 Skiadopoulos Mario H. Attenuated human-bovine chimeric parainfluenza virus (PIV) vaccines
KR100702523B1 (ko) * 1997-05-23 2007-04-04 더 가번먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카, 에즈 레프리젠티드 바이 더 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비시즈 클로닝된 뉴클레오타이드 서열로부터 약독화된파라인플루엔자 바이러스를 제조하는 방법
JP4434478B2 (ja) 1997-07-11 2010-03-17 イエール ユニバーシティー リエンジニアリングされた外被を有するラブドウイルス
CA2302867A1 (en) 1997-09-19 1999-04-01 American Cyanamid Company Attenuated respiratory syncytial viruses
US6280940B1 (en) 1998-08-05 2001-08-28 Agouron Pharmaceuticals, Inc. Reporter gene system for use in cell-based assessment of inhibitors of the Hepatitis C virus protease
US6146642A (en) * 1998-09-14 2000-11-14 Mount Sinai School Of Medicine, Of The City University Of New York Recombinant new castle disease virus RNA expression systems and vaccines
AU6200399A (en) 1998-10-05 2000-04-26 Akzo Nobel N.V. Avian pneumovirus vaccine and diagnostic agent
EP1186667B1 (en) 1999-05-18 2007-07-18 Dnavec Research Inc. Envelope gene-deficient virus vector of paramyxoviridae
CN101392239A (zh) 1999-07-09 2009-03-25 美国政府健康及人类服务部 减毒的人-牛嵌合副流感病毒(piv)疫苗
CZ296735B6 (cs) 1999-07-29 2006-06-14 Hatebur Umformmaschinen Ag Zarízení k vytvárení zvedacího a spoustecího pohybu
FR2801607B1 (fr) 1999-11-26 2001-12-28 Merial Sas Pneumovirus du canard et vaccins correspondants
EP1103610A1 (en) 1999-11-26 2001-05-30 Introgene B.V. Production of vaccines from immortalised mammalian cell lines
CN102766605A (zh) 1999-12-10 2012-11-07 由卫生与公众服务部代表的美利坚合众国政府 重组副流感病毒(piv)作为载体提供保护对抗piv及其他人类病原体引起的感染和疾病的用途
US6764685B1 (en) 2000-03-21 2004-07-20 Medimmune Vaccines, Inc. Recombinant parainfluenza virus expression systems and vaccines
US6387586B1 (en) 2000-11-06 2002-05-14 Eastman Kodak Company High contrast visually adaptive radiographic film and imaging assembly for thoracic imaging
CA2430115C (en) 2000-11-28 2013-02-26 Aviron, Inc. Recombinant rsv virus expression systems and vaccines
US6632459B2 (en) 2000-12-11 2003-10-14 Nutricia N.V. Chlorogenic acid and an analog thereof for immune system stimulation
US20030232061A1 (en) 2001-10-18 2003-12-18 Fouchier Ronaldus Adrianus Maria Recombinant parainfluenza virus expression systems and vaccines comprising heterologous antigens derived from metapneumovirus
US8715922B2 (en) * 2001-01-19 2014-05-06 ViroNovative Virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals
US7704509B2 (en) * 2001-11-21 2010-04-27 United States Of America Recovery of recombinant human parainfluenza virus type 1 (HPIV1) from cDNA and use of recombinant HPIV1 in immunogenic compositions and as vectors to elicit immune responses against PIV and other human pathogens
JP4553589B2 (ja) * 2002-02-21 2010-09-29 メディミューン，エルエルシー 組換えパラインフルエンザウイルス発現系とメタニューモウイルスから得られる異種抗原を含むワクチン
US7292593B1 (en) 2002-03-28 2007-11-06 Advanced Micro Devices, Inc. Arrangement in a channel adapter for segregating transmit packet data in transmit buffers based on respective virtual lanes
DE10221836A1 (de) 2002-05-16 2003-12-04 Lohmann Animal Health Gmbh Attenuierung von Metapneumovirus
CA2494485A1 (en) 2002-07-25 2004-02-05 Medimmune, Inc. Methods of treating and preventing rsv, hmpv, and piv using anti-rsv, anti-hmpv, and anti-piv antibodies
AU2003294533A1 (en) 2002-12-19 2004-07-14 Universite Laval Molecular methods and compositions for detecting and quantifying respiratory viruses
US7704491B2 (en) * 2003-02-28 2010-04-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant human metapneumovirus and its use
EP1602103A1 (en) 2003-03-05 2005-12-07 Koninklijke Philips Electronics N.V. Apparatus and method of determining a power parameter for writing/erasing information on an optical medium.
US7440195B2 (en) 2003-03-31 2008-10-21 Konica Minolta Camera, Inc. Zoom lens system and imaging device having the same
EP1613650A2 (en) 2003-04-08 2006-01-11 CoroNovative B.V. Severe acute respiratory syndrome (sars) causing coronavirus
US7704720B2 (en) 2003-04-25 2010-04-27 Medimmune, Llc Metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and as vectors for expression of antigenic sequences and methods for propagating virus
JP2006524511A (ja) 2003-04-25 2006-11-02 メッドイミューン バクシーンズ，インコーポレイティド メタニューモウイルス由来の異種抗原を含む組換えパラインフルエンザウイルス発現系およびワクチン
US20040229219A1 (en) * 2003-04-30 2004-11-18 Gallaher William R. Method of inhibiting human metapneumovirus and human coronavirus in the prevention and treatment of severe acute respiratory syndrome (SARS)
EP1533370A1 (en) 2003-11-18 2005-05-25 ViroNovative B.V. Novel atypical pneumonia-causing virus
EP1548748A1 (en) 2003-12-17 2005-06-29 Interuniversitaire Microelectronica Centrum vzw ( IMEC) A method for making probes for atomic force microscopy
WO2005080991A1 (en) 2004-02-20 2005-09-01 Erasmus Universiteit Rotterdam Method to detect antigen-specific cytolytic activity
US8318423B2 (en) 2004-07-06 2012-11-27 Focus Diagnostics, Inc. Methods and compositions for detecting rhinoviruses
WO2006051069A2 (en) 2004-11-11 2006-05-18 Solvay Pharmaceuticals B.V. Defective influenza virus particles
BRPI0518568A2 (pt) 2004-12-24 2008-11-25 Solvay Pharm Bv mÉtodo para produzir uma partÍcula do vÍrus da influenza replicativo sem o uso de vÍrus auxiliar, partÍcula de vÍrus da influenza replicativo, cÉlula, composiÇço, uso de uma composiÇço, mÉtodo para gerar proteÇço imunolàgica contra infecÇço de um indivÍduo com um vÍrus da influenza, e, Ácido nuclÉico
AU2006223138B2 (en) 2005-03-10 2012-04-05 Medimmune, Llc Metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and as vectors for expression of antigenic sequences and methods for propagating virus
JP4976376B2 (ja) 2005-04-08 2012-07-18 メディミューン，エルエルシー 哺乳動物メタニューモウイルスに対する抗体
EP1748447B1 (en) 2005-07-28 2008-10-22 Interuniversitair Microelektronica Centrum ( Imec) Dual tip atomic force microscopy probe and method for producing such a probe
EP1925318A1 (en) 2006-11-20 2008-05-28 Paul-Ehrlich-Institut Recombinant modified vaccinia virus Ankara (MVA)-based vaccine for the avian flu
US20090186050A1 (en) 2007-11-16 2009-07-23 Fouchier Ron A M Live attenuated metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and chimeric metapneumovirus strains
US10485863B2 (en) 2010-07-23 2019-11-26 Novavax AB Influenza vaccine
JP5923723B2 (ja) 2011-06-02 2016-05-25 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 人物属性推定システム、人物属性推定装置、及び人物属性推定方法
WO2014045254A2 (en) 2012-09-23 2014-03-27 Erasmus University Medical Center Rotterdam Human betacoronavirus lineage c and identification of n-terminal dipeptidyl peptidase as its virus receptor

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002057302A2 (en) * 2001-01-19 2002-07-25 Vironovative B.V. A virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE NCBI NIH; Van Den Hoogen B G et al., AF371337, Human metapneumovirus isolate 00-1. 2002/4/15, http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF371337 *
DATABASE NCBI NIH; Van Den Hoogen B G et al., AF371361、 AF371352、AF371344、AF371335，Human metapneumovirus isolate 99-1. 2002/4/15 *
Van Den Hoogen B G et al., Analysis of the Genomic Sequence of a Human Metapneumovirus. VIROLOGY, vol. 295, no. 1, (2002-03-30), p. 119-132 . http://repub.eur.nl/res/pub/ 3864/12033771.pdf *

Also Published As

Publication number Publication date
US11220718B2 (en) 2022-01-11
WO2003072720A3 (en) 2004-08-19
TW200405908A (en) 2004-04-16
US20180057894A1 (en) 2018-03-01
EP1576090A4 (en) 2008-07-16
EP2327418A1 (en) 2011-06-01
US20180216200A1 (en) 2018-08-02
JP2005518208A (ja) 2005-06-23
TWI356848B (en) 2012-01-21
EP1485468A2 (en) 2004-12-15
IL163646A0 (en) 2005-12-18
KR101151822B1 (ko) 2012-06-01
US20140370497A1 (en) 2014-12-18
CA2477235A1 (en) 2003-09-04
CA2477234A1 (en) 2003-09-04
US7449324B2 (en) 2008-11-11
CA2477234C (en) 2014-12-30
US20040005545A1 (en) 2004-01-08
KR20050005412A (ko) 2005-01-13
IL212138A0 (en) 2011-06-30
KR20110026528A (ko) 2011-03-15
JP4982514B2 (ja) 2012-07-25
JP4553588B2 (ja) 2010-09-29
AU2003219837A1 (en) 2003-09-09
WO2003072720A2 (en) 2003-09-04
AU2003219839B2 (en) 2008-02-21
TW200930816A (en) 2009-07-16
AR082426A2 (es) 2012-12-05
EP1485468A4 (en) 2007-01-03
WO2003072719A2 (en) 2003-09-04
JP4553589B2 (ja) 2010-09-29
CN1646684B (zh) 2010-10-06
US10287640B2 (en) 2019-05-14
US20170137899A1 (en) 2017-05-18
MXPA04008088A (es) 2005-09-30
US9567653B2 (en) 2017-02-14
US20200399718A1 (en) 2020-12-24
EP1576090A2 (en) 2005-09-21
AR038596A1 (es) 2005-01-19
WO2003072719A3 (en) 2007-09-13
US9944997B2 (en) 2018-04-17
TWI359868B (en) 2012-03-11
CN1646684A (zh) 2005-07-27
TW200400266A (en) 2004-01-01
TWI344991B (en) 2011-07-11
AR082427A2 (es) 2012-12-05
US20080096263A1 (en) 2008-04-24
US20200024672A1 (en) 2020-01-23
JP2006500907A (ja) 2006-01-12
US8841433B2 (en) 2014-09-23
JP2009114204A (ja) 2009-05-28
AU2003219839A1 (en) 2003-09-09
US20090263883A1 (en) 2009-10-22
JP2012105661A (ja) 2012-06-07
US20030232326A1 (en) 2003-12-18
US9834824B2 (en) 2017-12-05
CN101098958A (zh) 2008-01-02
AU2003219837B2 (en) 2009-10-29
US20090246855A1 (en) 2009-10-01
TW201009079A (en) 2010-03-01
AR038595A1 (es) 2005-01-19
KR101076102B1 (ko) 2011-10-21
CA2743750A1 (en) 2003-09-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI405851B (zh) 間質肺病毒株及其作為疫苗調配物及作為表現抗原性序列之載體之應用
US9376726B2 (en) Metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and as vectors for expression of antigenic sequences
US7704720B2 (en) Metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and as vectors for expression of antigenic sequences and methods for propagating virus
US20100167270A1 (en) Metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and as vectors for expression of antigenic sequences and methods for propagating virus
US20100297730A1 (en) Recombinant parainfluenza virus expression systems and vaccines comprising heterologous antigens derived from metapneumovirus
US20090186050A1 (en) Live attenuated metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and chimeric metapneumovirus strains
AU2008202252A1 (en) Recombinant parainfluenza virus expression systems and vaccines comprising heterologous antigens derived from metapneumovirus
AU2012201535A1 (en) Metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and as vectors for expression of antigenic sequences and methods for propagating virus

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Expiration of patent term of an invention patent