TWI493037B - Sbr及sbt非胚胎幹細胞及製備與使用該細胞之方法 - Google Patents

Description

SBR及SBT非胚胎幹細胞及製備與使用該細胞之方法

本發明係關於非胚胎性來源之新穎幹細胞及其用途。

全能性幹細胞，諸如胚胎性幹細胞(ES cells)，可在活體中分化成所有細胞系，而且，當被引進試管中時，可分化成大部份細胞類型。ES細胞衍生自早期哺乳動物胚胎。由於其之全能性，咸信其在治療退化性或遺傳疾病上具有大的潛力。不過，在倫理及供給方面的考量阻礙人類ES細胞在研究及治療上之使用。非胚胎來源之全能性或多能性幹細胞(例如來自成年或年輕動物之組織)將可迴避此阻礙。雖然一些幹細胞已從此等非胚胎來源得到，此等細胞中之一些具有有限的發育潛能。又，在供給方面，此等細胞難以獲得且此等細胞之量太有限以致不符有意義的臨床或研究用途需要。再者，此等細胞之一些在活體中會發育成畸胎瘤，所以不適合活體使用。因此需要較安全、容易獲得且具有豐富來源之非胚胎性全能性或多能性幹細胞。

本發明至少部份係基於意外發現從非胚胎來源製備之幹細胞群為全能性或多能性，可以極高產率得到，且在活體中不會發育成畸胎瘤。

所以，本發明之一方面之特徵為製造多能性或全能性幹細胞群之方法。該方法包括：取得複數個胚葉細胞-類似性幹細胞(BLSCs，blastomere-like stem cells)，在含有維生素A酸(RA，retinoic acid)或轉形生長因子β(TGF-β ，transforming growth factor beta)之培養基中培養BLSCs，以及鑑定及富 化經培養細胞中之多能性或全能性細胞。該等多能性或全能性細胞表現GAPDH或β-肌動蛋白之mRNA。換言之，GAPDH或β-肌動蛋白之mRNA之量係以下節實施例所述之方式藉由RT-PCR測定法檢測。

該多能性或全能性幹細胞在尺寸上通常為1至15微米，較佳在尺寸上為1至10微米，且更佳在尺寸上為1至5微米。此等尺寸為在懸浮液中或附接之細胞之尺寸(亦即，懸浮的細胞或附接的細胞)。

該術語「幹細胞」係指能分化成許多最終、經分化細胞類型之細胞。幹細胞可為全能性或多能性。全能性幹細胞典型地具有發育成任何細胞類型之能力。全能性幹細胞在來源上可為胚胎性及非胚胎性二者。多能性細胞典型地為能分化成數種不同的最終分化細胞類型之細胞。單能幹細胞只能產生一種細胞類型，但具有自我更新之性質而使其能與非幹細胞區分。此等幹細胞源自各種組織或器官系統，其包括，但非限於，血液、神經、肌肉、皮膚、腸道、骨骼、腎臟、肝臟、胰臟、胸腺等。根據本發明，幹細胞衍生自成人或新生兒組織或器官。BLSC(將於下文中詳述)為在成年或年輕動物中之一群非胚胎幹細胞。此等細胞為全能性且具有與胚胎性幹細胞相似之分化能力。參見WO2007/100845。

將藉由在含RA之培養基中培養BLSCs所得到之細胞中命名為SBR。在一具體實施例中，該培養基含有0.1至20μM RA且可培養該BLSCs共計2至8星期。在另一具體實施例中，該培養基含有1至15μM RA且培養該等BLSCs 2至8星期。在又一具體實施例中，該培養基含有5至12μM RA且培養該等BLSCs 3至4星期。如此製備之多能性或全能性SBR細胞在尺寸上為1至15微米(諸如1至10、1至5、2至5、或3至5微米)且在懸浮液中可形成片狀結構。

將藉由在含有TGF-β之培養基中培養BLSCs所得到之細胞命名為SBT。在一具體實施例中，該培養基含有1至40nM TGF-β且培養該等BLSCs 2至8星期。在另一具體實施例中，該培養基含有2至20nM TGF-β且培養該等BLSCs 2至8星期。在又一具體實施例中，該培養基含有5至12nM TGF-β且培養該等BLSCs 4至6星期。該等多能性或全能性SBT細胞在尺寸上為1至15微米(諸如1至10、1至5、2至5、或3至5微米)、具有圓形形狀且可形成凝聚物。

本發明之另一方面之特徵為組成物，其含有複數個上文提及之經培養細胞，其係(1)為多能性或全能性，(2)在尺寸上為1至15微米，(3)且表現GAPDH或β-肌動蛋白之mRNA。該細胞可藉由上述方法製備。該組成物可進一步含有RA或TGF-β。在一具體實施例中，該等細胞為CD10⁺ 、CD90⁺ 、CD105⁺ 及CXCR4⁺ 。在另一具體實施例中，該等細胞為台盼藍染色陰性。亦即此等細胞展現台盼藍排除。在再一具體實施例中，該等經培養之細胞含有為CD66e⁺ 之第一群細胞以及為CD66e^- 之第二群細胞。

該等細胞實質上為純。術語「實質上為純」，當用於描述幹細胞或衍生自幹細胞之細胞(例如經分化之細胞)時，意指特定細胞構成製劑中之大部分細胞(亦即，超過20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%)。一般而言，經實質純化之細胞群構成製劑中之至少約70%之細胞，通常製劑中之約80%之細胞，尤其是製劑中至少約90%之細胞(例如95%、97%、99%或100%)。如此，本發明之方法提供下述優點：在未被其他細胞類型污染下可得到實質純的特定類型細胞群(例如SBR或SBT細胞)。

上述經培養細胞可用於表現外源性重組多肽。因此，此等經培養之細胞在本發明之範圍內，其各包括重組核酸。該重組核酸可編碼多肽且該細胞可含有編碼多肽之mRNA。

上述經培養之細胞可以遺傳方法處理以致其不會表現β2-微球蛋白基因或不會表現一種或以上由第I類主要組織相容性複合體(MHC，major histocompatibility complex)基因所編 碼之蛋白質，該蛋白質會激發T淋巴球所媒介之抗細胞反應。既然此等細胞不會導致移植片之宿主排斥，因此可作為全適型供給細胞。

一方面，本發明之特徵為治療患者退化性疾病之方法。該方法包括將有效量之上述組成物投與至需要該治療之患者，該組成物含有一種或以上之上述多能性或全能性細胞。在一具體實施例中，此等細胞之至少一者包括重組核酸。該重組核酸可編碼多肽且該細胞可含有編碼多肽之mRNA。退化性疾病之例子包括糖尿病、神經變性疾病、關節炎及癌症。神經變性疾病之例子包括帕金森氏症。

另一方面，本發明之特徵為治療患者自體免疫性疾病之方法。該方法包括將有效量之上述組成物投與至需要該治療之患者。

待治療上述失調之一之患者可由針對特定失調之標準診斷技術鑑定。「治療」係指將組成物(例如細胞組成物)投與至罹患該失調或有發展成該失調之危險之患者，其目的為對於該失調、該失調之症狀、繼發於該失調之疾病狀態或傾向損傷/失調之體質加以治癒、減輕、解除、治療，延遲其發生，預防或緩解。「有效量」係指能在被治療患者中產生醫療上期望結果之組成物之量。該治療方法可單獨進行或與其他藥物或療法併行。

又一方面，本發明之特徵為鑑定用於治療退化性疾病之候選藥。該方法包括：使受試化合物與上述組成物或細胞接觸以及測定在退化性疾病中被下調之多肽之表現量之步驟。於存在受試化合物下之表現量若高於未存在受試化合物下之表現量，則表示該化合物為治療該疾病之候選者。退化性疾病之例子包括糖尿病、神經退化性疾病、關節炎、癌症或自體免疫性疾病。表現量可由mRNA量及蛋白質量之任一者測定。

再一方面，本發明之特徵為在患者中引進異源性核酸之方法。該方法包括下述步驟：取得上述組成物或細胞，其中此等 細胞之至少一個包括異源性核酸；以及將該細胞投與至需要該異源性核酸之患者。該異源性核酸可編碼多肽。該細胞一旦被投與，將在患者中表現多肽。

術語「異源性」為一相對用語，當其用於描述核酸之部分時表示該核酸包含二個或以上亞序列，此等亞序列在天然中未發現彼此有相同關係。舉例言之，經由重組產生之核酸典型地具有二個或以上來自不相關基因之序列，此等序列以合成方法被排列成具有新功能的核酸，例如啟動子來自一來源以及編碼區來自另一來源。該二核酸因此在其背景上彼此為異源性。該重組核酸，當加入細胞中時，該重組核酸相對於細胞之內源性基因為異源性。因此，在染色體中，異源核酸引進被整合入染色體之非原生性(非天然產)核酸，或非原生性(非天然產)染色體外核酸。相對照地，在本專利申請案之內容中，染色體之天然位置改變片，當其包含原生的內源性核酸序列時，對於突變細胞而言不被認為係屬異源。相似地，異源蛋白質表示該蛋白質包含二個或以上在天然中未被發現彼此有相同關係的亞序列(例如，「融合蛋白質」，其中二亞序列由單一核酸序列編碼)。該蛋白質可藉由重組技術產生。

術語「重組(recombinant)」當被提及時，如：於一細胞、或核酸、蛋白質、或載體，係指該細胞、核酸、蛋白質或載體已藉由引入一異源性核酸或蛋白或一經改變之天然核酸或蛋白而修飾者，或指該細胞係源自於一細胞經該等修飾者。因此，例如，重組細胞表現之基因，其無法於該原生性(天然產)細胞中被發現的，或表現一第二套之原生性基因，該基因可正常或異常之表達、不足量之表達或完全不表達。

於本發明之範疇內包括一細胞銀行(cell bank)或庫(library)，其具複數個前述組合物，每一組成包含一多能性或全能性之培養細胞群。該細胞可為人類細胞或非人類細胞。該銀行可藉由；從複數個患者收獲細胞以分別得到複數個胚葉細胞-類似性幹細胞群；鑑定該等細胞群，對於各細胞群得到至 少一種預定的特徵；以及按照該至少一種預定的特徵將該等細胞群分類以製備之。於製備該庫時，可進一步擴增細胞群。該特徵之例子包含一患者之姓名、性別、身體狀況(包含遺傳疾病及MHC資訊)。

一患者係指一人類或非人類之動物。非人類之動物的例子包含所有脊椎動物，如：哺乳動物，像是非人類之靈長類(特別係指高等靈長類)、狗、齧齒動物(如小鼠或大鼠)、天竺鼠、貓、農場動物(如馬、牛、羊、或豬)、以及非哺乳類動物，像是鳥類、兩棲動物、爬蟲類等。於一較佳具體實施例中，該患者為一人類。於另一具體實施例中，該患者係為一試驗動物或適用於一疾病模式之動物。

本發明之一或多個具體實施例之細節係闡述於後文中。本發明之其他特徵、目的、以及優點可藉由說明書、圖式及申請專利範圍得以清晰明瞭。

一般認為，ES細胞可用於再生各種不同之細胞類型(諸如腦中的神經元的或神經膠質細胞)並從而治療各種不同的退化性疾病或組織損傷。然而，在倫理及供給方面的考量已阻礙ES細胞之用途。而非胚胎來源之幹細胞，諸如：分娩後的幹細胞(如骨髓衍生之間葉幹細胞(MSCs，mesenchymal stem cells))，係為另一具前景之替代方案。雖然如此，由於供給方面之考量以及增生/分化能力之限制，該替代方法並不總是被接受。

本發明係關於從非胚胎來源中製備之幹細胞群、SBR細胞、或SBT細胞。就如同ES細胞一般，該些細胞亦為全能性或多能性。更重要者，該等細胞可以極高產率得到，且在活體中(in vivo )不會發育成畸胎瘤。該等細胞因而可被用於再生分化出具功能之細胞，以治療各種不同退化性疾病或組織損傷。如下節實施例所示，SBR及SBT細胞可於活體外(in vitro )被輕 易的製造、維持及增殖，以及使用常規技術方法以誘導其分化。此外，將該細胞移植入一動物患者(如：一老鼠)後，並無有絲分裂活化之細胞、畸胎瘤、或惡性生長等現象。基於這些優點，相對於其他幹細胞，該等細胞呈現另一可供選擇之方案。

於本發明之一較佳具體實施例，該些SBR及SBT細胞係從胚葉細胞-類似性幹細胞群(BLSCs)中所製備者。BLSCs為在成年或年輕動物中之一群非胚胎幹細胞。此等細胞為全能性且具有與胚胎幹細胞相似之分化能力。參見WO2007/100845。BLSCs包含正常之整套染色體，且BLSCs為細胞譜系未定(lineage-uncommitted)，且可形成身體之所有體(非生殖)細胞。該等細胞亦可形成生殖配子精子及/或卵子，以及細胞，以及胚胎組織以及胎盤之胎兒部分。該細胞易對於譜系誘導劑、增生劑及分化抑制劑產生反應。另一方面，該等細胞對於發展劑(progression agents)較無反應。相似於外胚層-類似性幹細胞(epiblast-like stem cells)，BLSCs於細胞培養至長滿時並無接觸抑制作用，但當其於一合乎需要之營養供給時，則會形成多層長滿之細胞層。BLSCs沒有表現代表前驅或分化細胞、胚層譜系幹細胞、或外胚層-類似性幹細胞之表型表現標記。相反地，BLSCs表現一般及特定的胚胎性譜系標記，例如：胚胎性幹細胞標記CD66e、HCEA、CEA，以及CEA-CAM-1。BLSCs於成熟組織中常為靜態。然而，當上述組織受到傷害，BLSCs便會活化及分化以修復該受損之組織。

相較於其他幹細胞，BLSCs可從一分娩後之組織中取得相當高之產率。例如，BLSCs可從血液中被取得，其產率超過2x10⁸ /每毫升血液。另一方面，由於BLSCs為靜態且不會表現基因，故該等細胞於研究及治療目的之用途亦受侷限。

出乎預期的，以某種化學物質培養BLSCs可產生全能性或多能性幹細胞，其可表現內生性基因及異源性基因。該兩種全能性或多能性幹細胞群為SBR細胞群及SBT細胞群。將 BLSCs分別培養於含RA及TGF-β之培養基，以取得SBR細胞群及SBT細胞群。

BLSCs可藉由下節實施例所述之方法、或於WO2007/100845所述之方法以製備之。一般而言，該細胞可自成年或年輕動物之多種組織中分離出，包含血液、骨髓及骨骼肌。為了確認所分離之細胞確實為BLSCs，可供檢驗之一些特徵，包含(1)於懸浮液中之細胞尺寸少於1微米；(2)細胞表面標記，如CD66e⁺ ；以及(3)台盼藍染色呈陽性。細胞表面標記之抗體，如CD66e可被使用之。其可以適用標記結合之，如：螢光異硫氰酸鹽(FITC，fluorescein isothiocyanate)、藻紅蛋白(PE，phycoerythrin)、或量子點(quantum dots)。BLSC，其為CD66e⁺ ，可進一步以流式細胞儀富化之(第一圖至第二圖)。

該富化後細胞群接著係以標準技術測試之。為了確認該等細胞之分化潛力，該等細胞可藉由習知技藝方法被誘導以形成，例如：神經元-神經膠質細胞、骨細胞、以及脂肪細胞。例如：該等細胞可被繼代及培養至長滿(confluence)，移轉至一骨生成培養基或一脂肪生成培養基，並培養一段適當時間(如：三週)。骨生成分化能力可藉由鈣累積之礦化作用以評估之，該礦化作用可藉由von Kossa染色法觀察之。藉由油紅O將細胞內油滴染色，並於顯微鏡下觀察以檢測脂肪生成分化情形。對於神經分化方面，該等細胞可於一神經生成培養基中培養一適當時間(如七天)，接著將其以缺乏血清(serum depletion)進行處理，並以β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol)進行培養。經分化後，該等細胞呈現具延伸的似軸突結構之折光細胞體形態(refractile cell body)以構成一網絡。以譜系特異性標記進行免疫細胞化學染色，即可進一步導引確認神經之分化情形。該等標記之例子包含神經元特異性第三類β-微管蛋白(Tuj-1)、神經絲狀結構蛋白(neurofilament)、以及GFAP。

另外，可藉由BLSC不具接觸抑制作用之特點，以確認該等分離細胞之身份。為此，可將該分離細胞培養至長滿。於此條件下，BLSCs可形成球形之細胞凝聚物、細胞均佈之多層結構(multiple confluent layers)、或網孔(mesh-net)結構。相反的，CD42⁺ 細胞無法形成前述結構，如細胞凝聚物。

經該等確認後之BLSCs可進一步於一非分化性之培養基中以超過10、20、50、或100代以上之細胞倍增率(population doubling)培養增殖之，且其中無自發性分化、老化、形態變化、生長速度增加、或改變為具能力分化為神經元之跡象。該等細胞可於使用前以標準方法保存之。

為了製備SBR細胞，可將該BLSCs於含有0.1至20 μM RA之環境中培養2至8週。於一較佳具體實施例中，該BLSCs於含有1至15 μM RA之環境中培養2至8週，或更佳者為，於含有5至12μM RA之環境中培養3至4週。藉此製備之多能性或全能性細胞群之尺寸為1至15微米，且可於懸浮液中形成片狀結構。任何市售可得之適用於細胞培養之RA皆可被使用。

為了製備SBT細胞，可將該BLSCs於含有1至40 nM TGF-β之環境中培養2至8週。於一較佳具體實施例中，該BLSCs於含有2至20 nM TGF-β之環境中培養2至8週，或更佳者為，於含有5至12 nM TGF-β之環境中培養4至6週。該多能性或全能性細胞群之尺寸為1至15微米，具一圓形之形狀，且可形成凝聚物。雖然任何類型之TGF-β皆可使用，高純度之TGF-β仍為較佳者。TGF-β之例子包含哺乳動物之TGF-β(如：人類TGF-β)、或與哺乳動物之TGF-β具實質上相同生物活性之TGF-β。天然產的TGF-β及基因工程改造之TGF-β皆可被使用。藉由DNA重組技術所取得之TGF-β可能與天然產的TGF-β具有相同之胺基酸序列、或一與其功能等同者。一「功能等同者」係指一天然產之TGF-β的多肽衍生物，如一蛋白具有一或多個點突變、插入、刪除、截斷(truncation)、融合蛋白、或其組合。術語「TGF-β」亦涵蓋化學修飾後之TGF-β。化學修飾後之TGF-β的例子包含結構改變之TGF-β、增加或刪除其醣鏈、以及被一化合物，如聚乙二醇(polyethylene glycol)，所結合之TGF-β。

該SBR細胞及SBT細胞可基於其尺寸、接觸抑制作用、台盼藍染色排斥(如：台盼藍染色陰性)以與BLSCs區別及確認之。BLSCs較SBR細胞及SBT細胞小(小於1微米)，且缺乏接觸抑制作用、或為盼藍染色排斥。該SBR細胞及SBT細胞亦可根據相關之細胞標記，如CD10⁺ 、CD90⁺ 、以及CXCR4⁺ 以流式細胞分析，或其他標準分析方法，如RT-PCR，以確認之。

如此製備之SBR細胞及SBT細胞可進一步與前述測試BLSCs之相同方式、或其他習知技藝之標準技術，以測試其全能性及多能性。於適當之誘導條件下，該等細胞可於活體外分化為，如：脂肪細胞、軟骨細胞、以及骨生成譜系之細胞群。此外，於前述誘導條件下，該等細胞具有能力去分化為神經膠質細胞。

全能性及多能性可於活體測試之。例如，當腦部缺血之大鼠接受大腦內SBR細胞或SBT細胞之腦內移植後，相較於以安慰劑(vehicle)處理之對照組大鼠，其神經功能明顯被改善。此結果指出，於腦內投與之SBR細胞或SBT細胞可進入腦部、存活、遷移、以及改善中風後之功能恢復率。事實上，該些移植細胞於缺血性腦部中可分化為神經膠質細胞(GFAP+)、神經元(Nestin+、MAP-2+、以及Neu-N+)、以及血管內皮細胞(vWF+)，以增強神經可塑性(neuroplastic)之效用。大腦皮質的神經元活性可藉由氫質子磁振頻譜(¹ H-MRS，Proton MR spectroscopy)評估之，相較於對照組，於移植組之大腦皮質的神經元活性亦較大幅地增加。此外，於移植組之缺血性大腦半球中亦可發現神經滋養因子(neurotrophic factor)之調控表現顯著性地增加。

經此確認後之SBR細胞及SBT細胞可進一步於一非分化性培養基中以10、20、50、或100代以上之細胞倍增率(population doubling)培養繁殖之，且其中無自發性分化、老化、形態變化、生長速度增加、或改變為具能力分化為神經元之跡象。該等細胞可於使用前以標準方法保存之。

術語「增生」及「擴增」於此可交替用於與細胞相關，係指藉由分裂以使同種類之細胞數增加。術語「分化」係指於細胞發育過程中為一特定功能轉變特化之，例如，細胞獲得一或多個與初始細胞類型不同之形態特徵及/或功能。術語「分化」包含譜系決定(lineage commitment)及終末分化過程(terminal differentiation processes)。分化是可被評估的，例如：藉由使用免疫組織化學法或該領域技藝者所知之其他步驟，以監測譜系標記之出現與否。自先驅細胞衍生之後代分化細胞可能，但非必然，與該幹細胞來源組織為相同胚層或組織。例如，神經先驅細胞及肌肉前驅細胞可分化為造血的細胞譜系。

術語「譜系決定」及「特化」於此交替使用，係指一幹細胞發展為一前驅細胞之過程，該前驅細胞決定所形成特定限制範圍之細胞分化類型。已定向之前驅細胞通常具有自我更新或細胞分裂之能力。

術語「終末分化」係指一細胞最終分化為一成熟、完全分化之細胞。例如，神經前驅細胞及肌肉前驅細胞可分化為造血細胞譜系，其終末分化為一屬於特定細胞類型之成熟血球。通常，終末分化與中斷細胞週期及停止增生有關。術語「前驅細胞(progenitor cell)」於此提及，係指一細胞已決定成為一特定細胞譜系，且其藉由一連串細胞分裂以發展成該譜系之細胞群。一前驅細胞之例子可為一肌母細胞，其僅可分化為單一類型之細胞，但其本身並不完全成熟或完全分化。

1.一般之用途

本發明之SBR細胞及SBT細胞可應用於許多層面。可用於治療退化性或遺傳性疾病且能免除操作人類胚胎的道德考量。

基於此目的，可自病患(如缺乏組織或器官正常發育所需重要之功能性基因)體內分離BLSCs。自BLSC中生產出SBR細胞和SBT細胞之後，可將一能夠編碼一功能性基因的核酸載體轉入細胞內。該載體可藉由許多方式轉入細胞內，包含磷酸鈣共沈澱法、DEAE葡聚醣媒介轉染法、脂小體轉染法、電穿孔法、顯微注射法、或病毒媒介之技術。以不影響該細胞多能性之方法為較佳。該等技術之詳述可見於美國專利號7,422,736及5,591,625，及美國專利申請號20020127715。於將功能性基因遞送入細胞內後，繼之以習知技藝方法將該等細胞移植至該病患體內。由於該細胞係生產自該病人，因此，此治療方法並不會引起免疫排斥現象。

另外，可利用來自一健康個體所製備之SBR細胞和SBT細胞製造通用捐贈者細胞。用以製備通用捐贈者細胞之方法係為習知技藝，該等製備通用SBR細胞及SBT細胞之方法將於下詳述之。

於適當之條件下，該等移植之SBR細胞及SBT細胞可發育成一功能性組織或器官。為促進其發育，可投予該病患誘導細胞發育之因子。該等因子可為小分子化合物、胜肽、及核酸。其例包含，但不限於，轉型生長因子β、骨形態發生蛋白及神經生長因子。

該等SBR細胞及SBT細胞對於譜系發育及分化之發育或分化機制之研究亦具其助益。使用該等細胞為一模式系統以鑑定誘導全能性多能性幹細胞成為一特定組織或器官之條件。此外，可使用習知之差異性cDNA基因篩檢方法以分離於發育過程中有參與之基因。參閱，如：Shen M. et al.,Development,124:429-42,1997。可利用該等細胞，其已被誘導發育為一特定譜系，如前述之神經膠質細胞系，以製備一cDNA庫。此庫可用於分離及研究具差異性表現之基因。該等分離之基因可進一步用於研究其於各自階段之角色。相關之技術皆為習知技藝。參閱，如：美國專利號7,422,736及美國專利申請號20060035373。該等SBR細胞及SBT細胞亦可使用習知方法用於發欲為一器官或複製動物。參閱，如Campbell K. et al.,Nature,380: 64-66,1996。因此，該等細胞對於寵物及畜牧產業極具價值，且可用於保存瀕臨絕種之動物。

2.篩檢方法

前述之幹細胞可被應用於篩檢試驗中，可鑑定以特定方法影響一特定細胞類型之藥物，亦即該藥物即可用於治療與該細胞類型相關之疾病。

因此，本發明一方面係關於一鑑定一製劑之方法，可藉由將測試試劑與細胞進行接觸，以找出可改變未分化SBR細胞及SBT細胞之功能的試劑。相較於未存在該測試製劑時之功能；若於存在該測試試劑時，該等細胞之功能或基因表現改變時，則該測試製劑係為可改變該等細胞之功能或基因表現之試劑。術語「測試製劑」係指被用於檢測其具有改變細胞功能或基因表現能力之任何分子。雖然該方法係做為一篩檢方方法，一般被用以鑑定出一先前未知但具有一預期活性的分子，然而，本發明之篩檢方法亦可用於確認某已知擁有特定活性之製劑。

該功能可為基因之表現，其一般係指於細胞中表現(或不表現)，以及該製劑可藉由增加或減少一表現基因(如：降低CD66e之表現量)之表現量、或藉由開啟一未表現基因(如：誘導特定譜系之抗原的表現)於細胞中之表現，以改變該功能。

於一具體實施例中，此能影響細胞功能之製劑係為一能誘導細胞分化且產生出已分化細胞之製劑。此等已分化之細胞可為多能性人類幹細胞(如：造血幹細胞)、或可為最終分化的細胞(如：肌肉細胞、神經細胞、血球細胞、結締組織、或上皮細胞)。此方法就其本身而言，可用於鑑定一製劑，其可誘導分化SBR細胞及SBT細胞成為最終分化之細胞，如：胰島β細胞、肝細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞或任何其他細胞類型。該此法所鑑定之製劑或化合物可被用於治療退化性疾病、癌症或是免疫疾病。

該表現量可藉由mRNA表現量或是蛋白質表現量來決定。量測一樣本之mRNA表現量的方法係為習知技藝。為量測mRNA表現量，細胞可被溶解，且存在於細胞溶解物中之mRNA量，無論純化與否，皆可藉由，如：雜交試驗(使用可探測之標定特定基因的DNA或RNA探針)，以及量化或半量化RT-PCR(使用適合的特定基因引子對)量測之。另外，量化或半量化之原位雜交試驗可用於組織切片、或未溶解之細胞懸浮液，可使用一可探測之(如：螢光或酵素)標定DNA或RNA探針。其他mRNA定量方法包含該RNA保護試驗(RPA)方法，以及基因表現序列分析方法(SAGE)，以及以陣列為基礎之技術。

量測一樣本中蛋白質表現量的方法係為習知技藝。其中部分使用抗體(如：單株抗體或多株抗體)，其可特異性地結合至一目標蛋白。於此等試驗中，該抗體本身或結合其之第二抗體皆被標記為可供探測者。另外，該抗體可以與生物素結合。其存在能藉由可探測標定之卵白素(一胜肽係結合於生物素)以量測之。此等方法之搭配組合(包含「多層夾心結構」試驗)可用於增強該方法之靈敏度。一些蛋白質量測試驗(如：ELISA或西方墨點法)可被應用於體液或細胞溶解物、或其他(如：免疫組織方法或螢光流式細胞儀)可應用於組織切片或是未溶解之細胞懸浮液之方法。適當的標定包括放射性核種(如：¹²⁵ 碘、¹³¹ 碘、³⁵ 硫、³ 氚或³² 磷)、酵素(如：鹼性磷酸酶、辣根過氧化氫酶、冷光酵素、或β-半乳醣苷酶)、螢光/冷光劑(如：螢光素、鹽基桃紅精、藻紅素、GFP、BFP、以及由Quantum Dot Corporation,Palo Alto,CA所供應之Qdot^TM 奈米粒子)。其他可應用之方法包含定量免疫沈澱分析、或補體結合試驗。

一測試製劑可以是任何類型之分子，例如，一聚核苷酸、一胜肽、一擬胜肽、擬肽可為乙烯化之擬肽(vinylogous peptoids)、一小型有機分子或其相似物，且可藉各種方式以改變SBR細胞及SBT細胞之功能。例如，該測試製劑可藉由在細胞外結合至一表現於細胞表面之受器，藉此改變一功能，該功能係由一通常結合並作用於該受器之配體所媒介。另外，該測試製劑可被動地或由主動運輸機制以穿過細胞膜，並作用於細胞內而改變一功能。

胜肽測試製劑可為任何胺基酸或胺基酸類似物之聚合物，且其可為三至四個殘基，至幾百或幾千個殘基之不同變化。胜肽測試製劑可藉由化學合成、或使用蛋白質純化、續以蛋白水解作用之方法製備，若有需求，可進一步利用層析法或電泳法進一步純化，或可藉由編碼多核苷酸以表現。一胜肽測試製劑可為一已知胜肽，如：一天然產之胜肽，但亦可與該天然產之序列不同，例如：包含一個或多個胺基酸類似物。

一多核苷酸製劑可為二個或多個去氧核醣核酸或核醣核酸之序列，其藉由一磷酸雙酯鍵以互相連結。可為RNA或DNA，其可為一基因或其蛋白，一cDNA、一RNAi試劑、一合成之多去氧核醣核酸序列、或其相似物，及其亦可為單股或雙股，亦可為一DNA/RNA雜合體。可為一自細胞中分離之天然產之核酸分子，亦可為一合成分子，其係藉由如化學合成法或酵素法(如聚合酶鏈鎖反應(PCR，polymerase chain reaction))以製得。於多種具體實施例中，本發明之多核苷酸可包含核苷或核苷酸類似物，或一非磷酸雙酯鍵之骨架鍵結。此等核苷酸類似物係為習知技藝且市售可得，而包含此類核苷酸類似物之多核苷酸亦同(Lin et al.,Nucl. Acids Res. 22:5220-5234,1994;Jellinek et al.,Biochemistry 34:11363-11372,1995;Pagratis et al.,Nature Biotechnol. 15:68-73,1997)。

一多核苷酸測試製劑可與SBR細胞及SBT細胞接觸、或藉由文中所述之方法或習知技藝，將之轉入SBR細胞及SBT細胞。一般而言，而非必然，該多核苷酸被轉入細胞內時，其可直接影響其功能，或影響其轉錄或轉譯、或兩者之功能。例如，該多核苷酸可編碼一胜肽測試製劑，其可於細胞內表現，並影響該細胞之功能。一多核苷酸劑亦可為，或編碼出，一反股分子、一核醣酵素、或一三股合成試劑，其可被設計來標靶一或多個特定目標核酸分子。

欲篩選之候選製劑或化合物(如：蛋白、胜肽、擬胜肽、擬肽、抗體、小分子、或其他藥物)可藉由本技術已知之組合庫法中之多種途徑之任一種得到。此等庫包含：胜肽庫、擬肽庫(具有胜肽功能，但具有可抵抗酵素降解之新穎、非胜肽骨架之分子之庫)；空間可尋址平行固相或溶液相庫(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries)；藉由解旋法或親和性層析法篩選獲得之合成分子庫；以及該「單一珠粒單一化合物」分子庫。參閱，如：Zuckermannet al . 1994,J. Med. Chem. 37:2678-2685；及Lam,1997,Anticancer Drug Des. 12:145。分子庫之合成方法範例可見於，例如：DeWittet al .,1993,PNAS USA 90:6909;Erbet al .,1994,PNAS USA 91:11422;Zuckermannet al .,1994,J. Med. Chem. 37:2678;Choet al .,1993,Science 261:1303;Carrellet al .,1994,Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059;Carellet al .,1994,Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061；以及Gallopet al .,1994 J. Med. Chem. 37:1233。分子庫之化合物可呈現於液體中(如：Houghten,1992,Biotechniques 13:412-421)，或珠粒上(Lam,1991,Nature 354:82-84)、晶片(Fodor,1993,Nature 364:555-556)、細菌(美國專利號5,223,409)、孢子(美國專利號5,223,409)、質體(Cullet al .,1992,PNAS USA 89:1865-1869)、或噬菌體(Scott及Smith 1990,Science 249:386-390;Devlin,1990,Science 249:404-406;Cwirlaet al .,1990,PNAS USA 87:6378-6382;Felici 1991,J. Mol. Biol. 222:301-310；以及美國專利號5,223,409)。

3.退化性疾病之治療

於本發明範疇內，係為一治療退化性疾病、舒緩該疾病症狀、或延緩該疾病於一患者中發作的方法。可藉由標準技術診斷患者情況或疾病以鑑定出需治療者。該治療方法需投與一亟需其治療之患者一有效量之前述SBR細胞或SBT細胞。

一退化性疾病係指一疾病，其中感染組織或器官之功能或結構隨著時間逐漸惡化，無論係歸因於遺傳缺陷、受傷、缺乏適當細胞分化(如於細胞增生之疾病)、身體上正常磨損、或生活方式的選擇。退化性疾病之例子包含神經性退化疾病(如：阿滋海默症、帕金森氏病、亨丁頓舞蹈症、多發性硬化症、以及肌萎縮性側索硬化症(ALS，amyotrophic lateral sclerosis))、其他神經系統疾病(包含橫貫性脊髓炎、腦部或脊髓神經創傷後產生之神經脫鞘、急性腦部受損、頭部創傷、脊髓受損、周邊神經受損、缺血性腦部受損、中樞神經系統之遺傳性髓磷脂失調、癲癇、周產期窒息、窒息、缺氧症、癲癇重積狀態、Shy-Drager氏症、自閉症及中風)、癌症或相關癌症療法產生的情況(如：化學療法)；代謝疾病(如糖尿病、尼曼匹克症)；自體免疫或發炎相關疾病(如：紅斑、發炎性腸道疾病(IBD，iinflammatory bowel disease)、前列腺炎、骨關節炎、骨質疏鬆症、類風濕性關節炎、狼瘡、糖尿病、及氣喘)、眼疾(如：青光眼、色素性視網膜炎、諾里氏症、及黃斑部病變)；心臟或循環系統疾病(如：動脈粥狀硬化、心臟衰竭、心肌梗塞、及心血管疾病)；血液疾病，如：Wiscott Aldrich氏症候群；肌肉萎縮症；腸胃疾病；腎臟疾病；肝臟疾病；肺臟疾病、腎臟疾病(如愛迪生氏症)、燒燙傷或中風造成的損傷所導致的情況，包含：受損組織(如：肌肉損傷、老化受損細胞及老化受損組織)、和老化相關之情況(如：落髮、雄性禿及圓形禿)、病毒情況(如：C型肝炎病毒感染、及後天性免疫缺乏症候群)、以及其他可藉由器官移植或幹細胞修復、重生或改善其症狀及/或與該疾病相關之症狀。本發明之方法可被用以治療勃起障礙、及整形外科、或女性之乳房植入。

4.治療帕金森氏症和其他神經退化性疾病

於本發明之範疇內，係為一治療腦部或中樞神經系統組織受損或減輕一患者體內疾病症狀之方法。此方法包括鑑定出遭受或存在發展為腦部組織受損之潛在風險的患者。此患者可為人類、或非人類之哺乳類動物，如：貓、狗、或馬。腦部組織受損之例子包含由大腦局部缺血(如：慢性中風)、或神經退化性疾病(如：帕金森氏症、阿茲海默症、脊髓小腦症、或亨丁頓舞蹈症)所造成之損傷。可藉由標準技術診斷患者情況或疾病以鑑定出需治療者。該治療方法須投與一亟需其治療之患者一有效量之前述之SBR細胞或SBT細胞、或一活性成分/化合物。

此細胞之療效可藉由標準方法以測之。例如，欲確認其促進腦血管新生之功用，可分別於治療前後藉由標準腦部影像技術診察一患者，例如：電腦斷層掃描(CT，computed tomography)、都卜勒超音波影像技術(DUI，Doppler ultrasound imaging)、磁振造影(MRI，magnetic resonance imaging)、以及氫質子磁振頻譜(¹ H-MRS)。例如，氫質子磁振頻譜(¹ H-MRS)代表一非侵入性方法，其可獲取和腦部代謝活動相關之生化資訊(Lu et al.,1997,Magn. Reson. Med. 37,18-23)。此技術可用於評估幹細胞移植前後和大腦局部缺血有關之代謝變化。例如，可用於研究腦內N-乙醯天門東胺酸(NAA，N-acetylasparate)之濃度，其為腦部神經元完整性之指標。雖然神經元碎片中之NAA重新分布和截留係限制了其可作為一定量用神經標記之用途，然而，大腦局部缺血時之腦部NAA濃度下降仍可被作為神經元喪失或功能異常之指標(Demougeot et al.,2004,J. Neurochem. 90,776-83)。因此，藉由氫質子磁振頻譜(¹ H-MRS)測得之NAA濃度可作為一有效指標以追蹤大腦局部缺血後經幹細胞移植後之效用。

5.癌症

前述之SBR細胞或SBT細胞亦可被用於治療癌症及其他細胞增生之疾病。一細胞增生疾病其特徵係指一未受控制、自發性細胞生長之疾病(包含惡性及非惡性之生長)。術語「癌症」係指該類疾病，其特徵在於無法控制之細胞生長、侵入和有時候會轉移。癌細胞具自發性生長之能力，例如：一不正常之快速增生細胞生長之狀態或狀況。該術語意欲包含所有類型之癌化生長、或致癌過程、轉移組織或惡性轉型細胞、組織、或器官、無關乎其為何組織病理類型、或侵入階段。癌症之範例包含，但不限於，癌及肉瘤，如：白血病、肉瘤、骨肉瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、神經膠質瘤、嗜鉻性細胞瘤、肝癌、卵巢瘤、皮膚癌、睪丸癌、胃癌、胰臟癌、腎癌、乳癌、前列腺癌、大腸癌、頭部或頸部癌、腦癌、食道癌、膀胱癌、腎臟皮質癌、肺癌、支氣管癌、子宮內膜癌、鼻咽癌、子宮頸癌或肝癌、及其他原發部位不明之癌症。

6.基因療法

前述細胞及方法可被用於各種不同之習知基因治療方法中。基因療法包含活體外(ex vivo )及活體內(in vivo )技術。尤其是，前述幹細胞可於活體外以一寡核苷酸調節子或一核酸分子編碼該調節子進行基因工程改造，將該等工程改造後細胞提供給一被治療之病患。細胞培養物可被調配以投與一病患，例如，藉由分離該細胞(如：藉由機械式分離)，並將該細胞與一醫藥上可接受載劑(如：磷酸鹽緩衝液)混合均勻。或者，細胞可被培養於一適用之生物相容性載體(support)，並將之植入一病患。該等經工程改造之細胞一般係為自體衍生的，以便於避免同種異體或異種異體排斥。該等活體外(ex vivo )方法皆為習知技藝。

該等細胞可藉由習知技術投與寡核苷酸或核酸分子以進行工程改造。例如，寡核苷酸及其他核酸分子可藉由直接注射一「裸露(naked)」核酸分子來投與(Felgner及Rhodes,(1991) Nature 349:351-352;U.S. Pat. No. 5,679,647)，或一核酸分子可被配製於一含有一或多個可促進核酸分子被細胞吸收之成分的組合物中，該成分可為皂苷(saponins)(例如請參閱美國專利號5,739,118)，或陽離子聚胺(例如請參閱美國專利號5,837,533)；或藉由微粒子轟炸(例如；透過使用一「基因槍」；杜邦(Dupont)製藥之基因槍(Biolistic))；或藉由將該核酸分子以脂質、細胞表面受體、或轉染劑塗覆之；或將該核酸分子包覆於一微脂體、微粒、或微膠囊中；或藉由投與一與胜肽鏈結之核酸分子，該胜肽已知可進入細胞核；或藉由投與一與配體鏈結之核酸分子，該配體易被受體媒介之胞飲作用所影響，其可用以標定出可專一性表現該類受體之細胞類型。

一核酸-配體複合物可被形成，其中該配體包含一融合病毒胜肽以瓦解內體，可使得該核酸免於被溶酶體降解；或該核酸分子可作為細胞專一性吸收之目標，以及藉由一特定受體為目標以於活體內(in vivo)表現。此外，一引入、表現及累積反股寡核苷酸之有效率的方法已於美國專利號6,265,167中被描述，其可使得該反股寡核苷酸與一正股mRNA於細胞核中雜合，亦可避免反股寡核苷酸被加工處理或運輸至細胞質。本發明亦考量於細胞內引入該核酸分子，以及隨之藉由習知同源性重組技術於宿主細胞DNA進行嵌合以表現之。

該多核苷酸亦可被嵌入於一適用表現載體。一些眾所皆知之適用於基因療法應用之載體(參閱，例如：Viral Vectors: Basic Science and Gene Therapy,Eaton Publishing Co.(2000))。

該表現載體可為一質體載體。生成及純化質體DNA之方法快速且簡易。此外，當發生消除分立實體之基因毒性事件(discrete entity eliminating genotoxicity issues)而可能引起染色體整合時，質體DNA一般不會整合入宿主細胞之基因組，而係維持於游離基因位置(episomal location)。現今已有各種不同市售可得之載體，以及包含該等源自大腸桿菌及枯草桿菌的質體，其中多被特別設計為可用於哺乳動物系統中。於本發明中可能被使用之質體之例子包含，但不限於，真核表現載體pRc/CMV(Invitrogen)、pCR2.1(Invitrogen)、pAd/CMV以及pAd/TR5/GFPq(Massie et al.,(1998) Cytotechnology 28:53-64)。一示範具體實施例中，該質體係為pRc/CMV、pRc/CMV2(Invitrogen)、pAdCMV5(IRB-NRC)、pcDNA3(Invitrogen)、pAdMLP5(IRB-NRC)、或PVAX(Invitrogen)。

該表現載體可為一病毒載體。病毒載體之例子包含，但不限於，該等源自無法自我複製之反轉錄病毒、慢病毒、腺病毒以及腺病毒相關病毒之病毒載體。反轉錄病毒載體，以及腺病毒相關病毒載體係為目前重組基因遞送系統中之首選，其可供活體內(in vivo)傳遞外源性寡核苷酸、或基因，特別是可傳入人體。該等載體使得基因可有效率地進入細胞，以及使該傳遞後之核酸可穩定的與宿主之染色體DNA整合。一取決使用反轉錄病毒之主要先決條件為該等病毒使用時之安全性，尤其需注意野生型病毒於細胞群中蔓延的可能性。反轉錄病毒載體可源自之反轉錄病毒，包含，但不限於，莫洛尼鼠類白血病病毒、胰臟壞死病毒、反轉錄病毒(像是勞斯肉瘤病毒、哈維氏鼠類肉瘤病毒、禽白血病病毒、長臂猿白血病病毒、人類免疫缺乏病毒、腺病毒、骨髓增生肉瘤病毒、以及乳腺腫瘤病毒。特定的反轉錄病毒包含pLJ、pZIP、pWE以及pEM，該等對於習知技藝係屬眾所皆知者。

7.細胞庫

本發明之一特徵在於一幹細胞銀行或庫，其可便利的及有系統的存取不同幹細胞系。該銀行或庫中之幹細胞，係源自前述BLSC、SBR細胞、或SBT細胞，其可來自於健康之個體、或具有已知疾病狀態之患者或該症狀對於使用者(如：研究人員)來說係屬重要珍貴者。具有從前述幹細胞分化之細胞之細胞銀行或庫亦在本發明之範疇中。該等自幹細胞所分化之細胞例子包含腦細胞、神經元細胞、星狀膠質細胞、神經膠質細胞、T細胞、B細胞、軟骨細胞、骨細胞、胰島細胞、脂肪細胞、心臟細胞、肝細胞、腎細胞、肺細胞、肌肉細胞、以及眼細胞。該患者可為人類或非人類之脊椎動物。該幹細胞可源自任何哺乳動物物種，例如人類、老鼠、兔、牛、豬等。

於銀行或庫內之細胞係根據預定特徵以分類之，該特徵包含表型資訊、形態特徵、分化形態、血型、主要組織相容性複合體、捐贈者之疾病狀態、或基因型資訊(如：單一核苷酸多型性(SNP，single nucleated polymorphisms)之一特定核酸序列與一基因、基因體或粒線體DNA相關)。該等細胞係於一適當環境中(一般係藉由冷凍)被保存，以維持該幹細胞存活並仍具功能。分類可包括建立各細胞群特徵之集中紀錄，例如，但不限於，彙集的書面記錄(assembled written record)、或輸入有資訊之電腦資料庫(database)。本質上，此具體實施例涉及一幹細胞銀行之製備。該幹細胞銀行可幫助使用者從許多樣本中篩選出適用於使用者需要之特定幹細胞樣本。此外，於本發明之另一具體實施例涉及一幹細胞銀行，其包含來自於各別來源之許多幹細胞樣本，且該等樣本係基於至少一預定特徵以特徵化及分類。於另一具體實施例係涉及一建立幹細胞銀行之方法，包含從許多來源收集之幹樣本(stem samples)；根據至少一預定特徵以分類該等樣本，及於特定條件下保存該等細胞，使其存活。

於本發明之範疇，係指包含許多幹細胞群的一幹細胞銀行系統係於特定條件下置於個別容器中，使該幹細胞群得以存活；一電腦資料庫包含至少一處理模組、一顯示器及一包含對於每一幹細胞群之至少一特徵資訊的儲存媒體；以及至少一程式碼模組，當使用者下達指令後，可藉由該程式碼模組使產生之資訊可於該顯示器上被瀏覽。於一特定的具體實施例中，本發明其特徵之一在於該幹細胞銀行系統之幹細胞群係來自於一患有疾病狀況之患者的幹細胞。該疾病狀況可包含前述之退化性疾病。自患有不同疾病之患者所收集之幹細胞，皆被特徵化。該等特徵係被輸入於一電腦資料庫中。此外，亦或是，該等細胞係基於一特定表現型但並非必然與一疾病狀況有關來特徵化。例如，肝細胞可基於其可代謝某類化合物來特徵化，如：咖啡因、酒精、藥物製劑等化合物，以研究此等不同代謝能力之遺傳本質，或與其相關之基礎生理機能。其他細胞類型係可依據其功能性及/或形態表現型來特徵化。

於一些具體實施例中，自SBR細胞或SBT細胞分化的細胞，可藉由引入一工程改造之載體、或其他遺傳物質，而使其可能易受影響分化或排斥分化之狀況所影響。排斥分化包含操控一細胞使其具有一較不會分化細胞之特性。

本發明之幹細胞庫可藉由前述方式以篩選出可用以治療退化性疾病、癌症或免疫疾病之製劑或化合物。該庫可適用於高速篩選系統，及可幫助鑑定出對於一特定患者特別有效之製劑。對於一高速篩選系統，該等幹細胞可被導入於一多孔盤之孔中或於一載玻片或微晶片，並與測試製劑接觸。一般而言，該等細胞於一陣列中係為有組織化的，尤其係指一可尋址的陣列，這樣即可便於以機器人操作該等細胞及溶液，及監測該等細胞，該等操作特別與被檢測之功能有關。使用一高產率形式之優點在於可同時進行檢驗許多測試試劑，以及，視需要，對照組之反應可與測試條件完全相同之條件下進行反應。因此，本發明之篩選方法提供一工具從一個、一些或大量的測試製劑中篩選以鑑定出一可改變幹細胞功能之製劑，例如，該製劑包含：可使該細胞分化為一所欲之細胞類型、或可避免自發性分化者，例如：可維持高量表現之調控分子。

8.通用捐贈者細胞

前述之幹細胞可藉基因工程方法改造以產生組織抗原相容之捐贈者細胞或組織以作為移植之用。移植及細胞治療之目標係以具功能性之捐贈者組織或器官將衰竭之組織或器官成功地取代。然而，為求成功移植，需克服兩道屏障：適合之捐贈者組織或器官之取得，以及免疫排斥現象。取代衰竭之組織或器官以及免疫排斥之治療，係受限於可接受的捐贈者之數量有限，以及於長期免疫抑制治療方法中需同時投與具毒性之免疫抑制藥物。當前及實驗性移植之方法主要倚賴親屬捐贈者、和其他極為少量之同種異體或異種異體捐贈者。前述基因工程改造之幹細胞可用來克服該等限制。

更特定而言，本文所述之幹細胞可利用基因工程操作改造，使其不於細胞表面表現第二類主要組織相容性複合體分子(class II MHC molecules)。較佳地，該等細胞藉由工程改造以使其不表現大體上所有細胞表面上之第一類及第二類主要組織相容性複合體分子。如本文所用，術語「不表現」係指由於細胞表面上不足量之表現，故無法引起反應，或是，所表現之蛋白質有所缺陷而無法引起一反應。

該主要組織相容性複合體分子係指HLA分子，專指第一類HLAA、B及C，以及第二類HLA DP、DQ、及DR、以及其次分類。此術語常解釋為專指人類主要組織相容性複合體，然於本文可衍生包含來自其他捐贈者物種之等效主要組織相容性複合體基因，例如：若該細胞來源為豬，則術語HLA係指豬之主要組織相容性複合體分子，無論係指第一類或第二類主要組織相容性複合體。當第二類主要組織相容性複合體分子被移除時，CD4+ T細胞即無法辨認被基因工程改造之內皮細胞；當第一類及第二類主要組織相容性複合體分子皆被移除，則無論CD4+或CD8+細胞皆無法辨認經修飾之細胞。

較佳之幹細胞基因修飾包含1)破壞內生性非變異胜肽鏈(invariant chain)基因，其作用於第二類MHC分子之組裝和運送至細胞表面，以及抗原性胜肽之裝載；以及2)破壞內生性β₂ -微球蛋白基因(β₂ M gene)，其編碼所有第一類MHC分子表現於細胞表面時所需之蛋白質。另外，僅非變異胜肽鏈(invariant chain)基因被破壞。非變異胜肽鏈(invariant chain)被認為於抗原性胜肽片段嵌入第二類MHC分子時所需。總結之，抗原性胜肽和主要組織相容性複合體為T細胞所辨識。於抗原胜肽不存在時，T細胞辨識即無法正常達成，第二類MHC分子亦無法正確折疊。因此，在缺乏非變異胜肽鏈(invariant chain)之細胞中，胜肽之呈現將受阻礙，縱使另存在極少量之細胞表面MHC，其仍缺少胜肽因而無法引起免疫反應。

該等基因之破壞可藉由同源重組基因標靶技術以達成。該等技術係為習知技藝。參閱美國專利號6916654及6986887,Zijlstra et al.,1989,Nature 342:435438；以及Koller et al.,1990 Science 248:1227-1230。

9.組合物

本發明提供一醫藥組合物，包含前述細胞或活性成分/化合物。醫藥組合物可藉由混合一治療有效量之該等細胞或活性製劑/化合物，及視需要包含其他活性物質，及一醫藥可接受之載劑以製備。該載劑可為不同形式，視投與之路徑決定之。其他活性物質之例子包含已知之活性化合物或藉由前述篩選方法所鑑定者。

前述醫藥組合物可藉由常規的醫藥賦形劑及製備方法來製備。所有賦形劑皆可與崩解劑、溶劑、粒化劑、保濕劑及黏合劑進行混合。於本文所述之術語「有效量」或「治療有效量」係指一可使得特定疾病之至少一症狀或參數得以顯著地改善之數量。前述細胞之治療有效量可由習知方法決定。用以治療一疾病之有效量係可藉由該領域具有通常技藝者以習知試驗方法來容易地決定。而用以投與一病患時之確切數量將依照該疾病之情況及嚴重度，以及該病患之生理情況而有所不同。任何症狀或參數之顯著地改善係可由熟諳該技藝者或由醫師對於該病患之報告來決定。將被明瞭的是，前述疾病之任何症狀或參數具任何臨床上或統計上顯著減弱或改善者皆隸屬本發明之範疇內。臨床顯著地減弱或改善意指對於該病患及/或於一醫師係為顯而易見的。

詞組「醫藥可接受的」係指當投與一人類時，該等組合物中之分子個體及其他成分係為生理上可接受的，且一般不會產生不欲之反應。較佳地，術語「醫藥可接受的」意指係受聯邦監管機關、或一州政府、或列於美國藥典、或於其他一般公認藥典所公認可用於哺乳動物，特別係指人類。醫藥可接受鹽類、酯類、醯胺，以及前驅藥，係指該些鹽類(如：羧酸鹽、胺基酸添加鹽)、酯類、醯胺，以及前驅藥，於可靠的醫療判斷範疇內，其可適合使用於與病患組織接觸，且無過渡毒性、刺激性、過敏反應等；且需考量該等用途之合理的利益/風險比及有效性。

一可應用於前述醫藥組合物之載劑係指一稀釋劑、賦形劑、或一載體，其可被投與一化合物。該等醫藥載劑可為無菌的液體，例如水及油。較佳者係以水或水溶液、鹽液、及液態葡萄糖及甘油溶液作為一載劑，特別可作為注射溶液。適用之醫藥載劑係已於由E. W. Martin所撰之"Remington's Pharmaceutical Sciences"第18版中描述。

該等前述細胞可透過注入或注射(例如：靜脈注射、鞘內注射、肌肉注射、腔內、氣管內、腹腔或皮下)、口服、皮膚穿透、或其他習知方法，以投與一個體。投與可能每兩週一次、一週一次、或更頻繁，但當該疾病或失調於一穩定階段時，其投與頻率則可能會減少。

異源的及自體的細胞皆可被使用。於前者情況，HLA之吻合將可避免或降低宿主之反應。於後者情況，自體的細胞係從一患者中被富化及純化後，進行保存以備用。該細胞可活體外培養於一含有宿主、或移植T細胞之環境中，並重新被送回該宿主。此舉可使該等細胞於該宿主內被視為自體的細胞，並較可降低T細胞活性。

劑量和投與頻率將取決於臨床症狀，其經確認緩解階段之維持，或於急性期之至少一個或多個，較佳為多於一個之該領域熟諳技藝人士所知之臨床症狀被減少或消失。更普遍者，劑量和投與頻率部分將取決於一疾病狀況或失調之病理症狀及臨床和亞臨床症狀經前述組合物治療後的削弱情形。於病患或被治療之哺乳患者、及醫師之診斷，其劑量和投與方案可根據年齡、性別、身體狀況的管理，以及共軛利益和副作用來調整，該等技藝皆為熟諳技藝者所知悉者。於所有前述方法中，該等細胞以每次1x10⁴ 至1x10¹⁰ 之量投予一患者。

以下特定之實施例僅供示例說明，非用以限制未於本發明揭示者。無需進一步詳細闡述，咸信該領域熟諳技藝者可基於本文之說明，將本發明發揮至淋漓盡致。

SBR及SBT細胞之製備

將BLSCs活化、純化及擴增之方法，係已於WO/2007/100845中被描述。於此實施例中，BLSCs係從人類患者之血液中以兩種方法純化。該等分離細胞係以流式細胞儀分析。結果顯示於圖1A至1C及圖2A至2C。結果發現，該兩種方法分別可獲得200x10⁶ 及230x10⁶ BLSC/毫升血液。

該純化後之BLSCs可於StemBios-001中進行培養。為了產生SBR及SBT細胞，BLSCs可於StemBios-002培養基中培養兩週。接著，該等BLSCs遂於一含有0.1至20 μM RA、或1至40 nM TGF-β之StemBios-003培養基中培養超過二至六週。可觀察到該等培養細胞其形態及尺寸逐漸地變化(圖6至12圖)。該等細胞分別命名為SBR及SBT細胞。

該SBR及SBT細胞係以標準方法測試其發育及分化能力。可發現該等細胞可分化為源自三種胚層之細胞，例如：外胚層、中胚層，及內胚層。亦可觀察到該等所有或大部分細胞皆為CD10⁺ 、CD90⁺ 、CD105⁺ 、及CXCR4⁺ 。

SBR、SBT及BLSCs的RT-PCR結果

SBR細胞、SBT細胞及BLSCs之基因表現係可被檢測的。係以一Qiagen RNA萃取套組(Qiagen,CA)、Paris kit(Ambion)、或RNAzol kit(InvitroGen)，從SBR培養細胞或SBT培養細胞(每一種皆超過六百萬個)分離出總RNA。依操作手冊(Qiagen)可使用0.25ng寡-(dT)12-18及反轉錄酶(Qiagen)將2.0μg RNA製備為cDNA。然而，從超過1億個BLSCs中係無法取得可偵測之RNA。

RT-PCR係以94℃(15秒)、55℃(15秒)、72℃(20秒)之條件進行30個循環。β-肌動蛋白之引子對為：正向5’-ACAAAACCTAACTTGCGCAG-3’；反向5’-TCCTGTAACAACGCATCTCA-3’。GAPDH之引子對為：正向5’-AGCCACATCGCTCAGACACC-3’；反向5’-GTACTCAGCGGCCAGCATCG-3’。該等結果顯示於圖13。可發現β-肌動蛋白及GAPDH可表現於SBR細胞及SBT細胞，而於BLSCs則無表現。

其他具體實施例

所有於本說明書所揭露之特徵係可以任何組合方式組合。於本說明書中所揭露之每一特徵可藉由另一相同、等效、或相似目的之可替換特徵來置換。因此，除非明確聲明，否則每一揭露之特徵僅為各種等效或相似特徵的一般系列之示例。

於前述說明中，該領域熟請技藝者可輕易確認本發明之必要技術特徵，在無脫離其精神及範圍下，可對本發明進行各種不同改變及修改以使其適用於各種不同之用途及情況。因此，其他之具體實施例亦在以下申請專利範圍之範疇內。

圖1A至1C顯示經溶血(hemolysis)以取得胚葉細胞-類似性幹細胞群(BLSCs)之流式細胞分析直方圖(flow cytometry histograms)之結果(數量200×10⁶ 個細胞/毫升)。

圖2A至圖2C顯示自血漿區段(plasma fractions)中取得胚葉細胞-類似性幹細胞群(BLSCs)流式細胞分析直方圖之結果(數量239×10⁶ 個細胞/毫升)。

第三A圖至第三C圖係為一照片，其顯示培養之胚葉細胞-類似性幹細胞群(BLSCs)形成多層、網孔狀(mesh net)結構(200x)。

圖4係一照片，其顯示培養之胚葉細胞-類似性幹細胞群(BLSCs)形成凝聚物。

圖5係一照片，其顯示培養之胚葉細胞-類似性幹細胞群(BLSCs)形成球狀細胞凝聚物。

圖6至8為顯示從含有維生素A酸(retinoic acid)之胚葉細胞-類似性幹細胞群(BLSCs)培養中製備出SBR細胞之照片。

圖9至12為顯示從含有轉形生長因子β(TGF-β)之胚葉細胞-類似性幹細胞群(BLSCs)培養中製備出SBT細胞之照片。

圖13為RT-PCR結果之照片，係顯示GAPDH或β-肌動蛋白於SBR及SBT細胞之表現情形，以及不表現於BLSC中。第一道：1Kb標記。第二道：100bp標記。第三道：對於β肌動蛋白引子之SBR RNA。第四道：對於β肌動蛋白引子之SBT RNA。第五道：對於β肌動蛋白引子之胚葉細胞-類似性幹細胞(BLSC)RNA。第六道：無RNA，僅有β肌動蛋白引子。第七道：對於GAPDH引子之SBR RNA。第八道：對於GAPDH引子之SBT RNA。第九道：對於GAPDH引子之胚葉細胞-類似性幹細胞(BLSC)RNA。第十道：無RNA，僅有GAPDH引子。

Claims (32)

1. 一種製造多能性或全能性細胞群體之方法，其包含：取得複數個胚葉細胞-類似性幹細胞(BLSCs)，在含有維生素A酸(RA)或轉形生長因子β(TGF-β)之培養基中培養BLSCs，以及鑑定及富化經培養細胞中之多能性或全能性細胞；其中該等多能性或全能性細胞表現GAPDH或β-肌動蛋白之mRNA。
2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該等多能性或全能性細胞在尺寸上為1至15微米。
3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該培養基含有0.1至20μM RA且培養該等BLSCs 2至8星期。
4. 如申請專利範圍第3項之方法，其中該培養基含有1至15μM RA且培養該等BLSCs 2至8星期。
5. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該培養基含有5至12μM RA且培養該等BLSCs 3至4星期。
6. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該等多能性或全能性細胞在尺寸上為1至15微米且在懸浮液中形成片狀構造。
7. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該培養基含有1至40nM TGF-β且培養該等BLSCs 2至8星期。
8. 如申請專利範圍第7項之方法，其中該培養基含有2至20nM TGF-β且培養該等BLSCs 2至8星期。
9. 如申請專利範圍第8項之方法，其中該培養基含有5至12nM TGF-β且培養該等BLSCs 4至6星期。
10. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該等多能性或全能性細胞在尺寸上為1至15微米、具有圓形形狀且形成凝聚物。
11. 一種組合物，其包含複數個經培養之細胞，該等經培養之細胞(1)為多能性或全能性，(2)在尺寸上為1至15微米， 且(3)表現GAPDH或β-肌動蛋白之mRNA，其中該等經培養之細胞由以下方法製備：取得複數個胚葉細胞-類似性幹細胞(BLSCs)，在含有維生素A酸(RA)或轉形生長因子β(TGF-β)之培養基中培養BLSCs，以及鑑定及富化經培養之BLSC細胞中之具有(1)、(2)及(3)特徵之細胞。
12. 如申請專利範圍第11項之組合物，其中該組合物進一步包含維生素A酸(RA)或轉形生長因子β(TGF-β)。
13. 如申請專利範圍第11項之組合物，其中該等細胞之第一群為CD66e⁺ 。
14. 如申請專利範圍第11項之組合物，其中該等細胞包括重組核酸。
15. 如申請專利範圍第14項之組合物，其中該重組核酸編碼多肽且該等細胞含有編碼多肽之mRNA。
16. 如申請專利範圍第11項之組合物，其中該等細胞之第二群為CD66e^- 。
17. 如申請專利範圍第11項之組合物，其中該等細胞不會表現β2-微球蛋白基因。
18. 如申請專利範圍第11項之組合物，其中該等細胞不會表現一種或以上由第I類主要組織相容性複合體(MHC)基因所編碼之蛋白質，該蛋白質會激發T淋巴球所媒介之抗細胞反應。
19. 如申請專利範圍第11項之組合物，其中該等細胞為CD10⁺ 、CD90⁺ 、CD105⁺ 及CXCR4⁺ 。
20. 如申請專利範圍第11項之組合物，其中該等細胞為台盼藍(trypan blue)染色陰性。
21. 一種如申請專利範圍第11項之組合物在製備治療患者退化性疾病之藥物之用途。
22. 如申請專利範圍第21項之用途，其中在該組合物中之各細胞包括重組核酸。
23. 如申請專利範圍第22項之用途，其中該重組核酸編碼多肽且該細胞含有編碼多肽之mRNA。
24. 如申請專利範圍第23項之用途，其中該退化疾病為糖尿病、神經退化性疾病、關節炎或癌症。
25. 如申請專利範圍第24項之用途，其中該神經退化性疾病為帕金森氏症。
26. 一種如申請專利範圍第11項之組合物在製備治療患者自體免疫性疾病之藥物之用途。
27. 一種鑑定用於治療退化性疾病之候選藥之方法，該方法包含：使受試化合物與如申請專利範圍第11項之組合物接觸以及測定在退化性疾病中被下調之多肽之表現量，其中於存在該受試化合物下之表現量若高於不存在該受試化合物下之表現量，則表示該化合物為治療該疾病之候選藥。
28. 如申請專利範圍第27項之方法，其中該退化性疾病為糖尿病、神經退化性疾病、關節炎、癌症或自體免疫性疾病。
29. 一種細胞銀行，其包含複數種如申請專利範圍第11項之組合物。
30. 如申請專利範圍第29項之細胞銀行，其中該等細胞為人類細胞。
31. 一種製造如申請專利範圍第29項之細胞銀行之方法，其包含：從複數個患者收獲細胞以分別得到複數個胚葉細胞-類似性幹細胞群；鑑定該等細胞群，對於各細胞群得到至少一種預定的 特徵；以及按照該至少一種預定的特徵將該等細胞群之各個分類。
32. 如申請專利範圍第31項之方法，其中該方法進一步包含擴增細胞群。