TWI492951B - 表現人類凝血因子的基因轉殖非人類動物及其用途 - Google Patents

Description

表現人類凝血因子的基因轉殖非人類動物及其用途

本申請案主張2007年12月31日申請之美國臨時專利申請案第61/017,920號之優先權，該案以引用的方式併入本文中。

本發明大體而言係關於表現人類凝血因子之基因轉殖非人類動物、其產生及用途。

凝血係一複雜過程，其包括一系列組份(尤其血纖維蛋白原、因子II、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII及溫韋伯氏因子(von Willebrand factor)之連續相互作用。此等組份中之一者缺失或其功能受到抑制可引起凝血之趨勢增加或不能凝血，此對於某些患者而言可能危急生命。

因子VIII係一種在血漿中發現之蛋白質，其充當導致凝血之反應級聯中之輔因子。血液中因子VIII活性之量的缺乏會引起凝血病症A型血友病(一種主要影響男性之遺傳性病狀)。目前用來源於人類血漿或使用重組DNA技術製造之因子VIII之治療製劑來治療A型血友病。該等製劑係對出血事件作出反應而投予或以頻繁而規則之間隔投予以預防不受控制之出血(預防性)。

溫韋伯氏因子(vWF)與因子VIII複合，在血漿中循環。與因子VIII複合之vWF使因子VIII蛋白穩定且使其免於蛋白質水解降解。由於vWF在血小板凝集中之功能，其亦直接干預凝血。溫韋伯氏缺乏症(Von Willebrand deficiency，vWD)(亦稱為溫韋伯氏症候群(von Willebrand syndrome))由vWF缺乏或過度表現引起。由於因子VIII缺乏vWF輔因子而快速降解，所以vWF缺乏引起類似於血友病之疾病。

治療A型血友病及溫韋伯氏症候群的習知方法使用自血漿回收或由重組來源產生之因子VIII或vWF，且大量嘗試過用經純化之因子VII、vWF或因子VIII/vWF複合物治療患者。針對所投外源性蛋白之抗體的形成可降低治療功效且對此等患者治療為挑戰。舉例而言，抗FVIII抗體在患有嚴重及中等嚴重血友病之患者中尤其普遍，該等患者以50%之頻率形成抗FVIII抗體(Gilles等人，Blood 82:2452-61,1993；Lacroix-Desmazes等人，J Immunol. 177:1355-63,2006)。

基因轉殖動物技術提供研究非人類動物中人類蛋白特徵之極難得機會。重組DNA及基因工程技術已使在接受動物中引入及表現所需序列或基因成為可能，從而使研究特定分子在活體內之作用及研究結合該分子之藥劑成為可能。一種用於產生基因轉殖小鼠之程序需要自新近交配之雌性小鼠回收受精卵且將所關注之基因之DNA微注射至受精卵之雄原核中。接著將經微注射之受精卵植入1天假孕代孕母鼠之輸卵管中且使之懷孕分娩。參見例如Wagner等人，P.N.A.S. U.S.A. 78:6376-6380(1981),美國專利第4,873,191號及第7,294,755號。另一程序使用經所關注之基因轉染之胚胎幹細胞。接著將經轉染之胚胎幹細胞注射至小鼠囊胚中，在囊胚中該等胚胎幹細胞參與所有組織(包括生殖系)之形成，因此產生基因轉殖後代。此方法與同源重組技術組合使以控制方式改變胚胎幹細胞成為可能且因此使產生具有預定基因組之基因轉殖小鼠成為可能。參見例如：Baribault及Kemler. Embryonic stem cell culture and gene targeting in transgenic mice. Mol Biol Med. 6:481-92,1989；Ledermann B. Embryonic stem cells and gene targeting. Exp Physiol. 85:603-13,2000；Moreadith及Radford. Gene targeting in embryonic stem cells:the new physiology and metabolism. J Mol Med. 75:208-16,1997。

可產生表現或過度表現所關注之蛋白質的基因轉殖小鼠(基因敲入小鼠)或可產生缺失所關注之基因的基因轉殖小鼠(基因剔除小鼠)。表現人類蛋白分子之基因轉殖小鼠允許在活體內研究人類分子。舉例而言，Shi等人(J Clin Invest. 116:1974-82,2006)描述表現經修飾之人類FVIII蛋白(缺乏B-結構域)之基因轉殖小鼠，其經設計以避免抑制重組FVIII活性之FVIII抑制性抗體之問題。

基因轉殖技術之出現亦允許開發在無基因轉殖動物之情況下將不可行之篩檢法。舉例而言，為研究針對外源性蛋白之抗體的形成，具有其中個體對所關注之分子天然耐受的模型是有用的。美國專利5,470,560描述一種用於篩檢多肽之免疫原性之方法，其使用表現所關注之蛋白質且對該蛋白質耐受之基因轉殖小鼠，向該動物投予外源性蛋白，且篩檢對多肽具特異性之抗體。國際專利申請案第WO2006/056769號描述一種用於測試在對天然呈現該哺乳動物抗原之同源MHC II類分子之基因轉殖的動物中哺乳動物抗原之免疫原性的方法。

當使用生物藥物來治療病症時，針對蛋白質治療劑之抗體的形成為頑固問題。此等抗體通常抑制蛋白質治療劑之活性，藉此降低治療功效或需要增加藥物劑量以維持治療水平。因為諸如血友病之血液病症通常為終身病狀，所以對治療性凝血因子具特異性之抗體的出現尤其威脅接受該治療之患者且對治療此等患者之醫師為挑戰。

因此，在技術領域中對開發在不對人類患者進行研究的情況下研究活體內人類凝血因子活性之方法存在需要。此外，在技術領域中對確定向患者投予外源性治療性蛋白質是否將引起在活體內抑制蛋白質活性之抗原特異性抗體產生仍存在需要。

本發明藉由提供一種偵測針對外源性投予之人類凝血多肽、其片段、變異體或類似物之抗體的方法來解決技術領域中關於治療凝血病症之一或多種需要。本發明提供表現人類凝血因子以取代內源性凝血因子之基因轉殖動物及用於偵測針對人類蛋白質之抗體之方法。

在一方面，本發明提供具有包含編碼選自由以下者所組成之群組的人類凝血因子之聚核苷酸序列的基因組之基因轉殖非人類動物：因子VIII(FVIII)、因子VII(FVII)、因子IX(FIX)、及溫韋伯氏因子(vWF)、因子II(FII)、因子V(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、及因子XIII(FXIII)。在一具體態樣中，基因轉殖動物不表現編碼對應於人類轉殖基因之內源性凝血因子之聚核苷酸的全部或部分。在一相關具體態樣中，基因轉殖動物表現編碼對應於人類轉殖基因之內源性凝血因子之聚核苷酸。在一具體態樣中，基因轉殖動物為選自由以下各者所組成之群組之非人類動物：小鼠、大鼠、兔、綿羊、倉鼠、沙鼠、天竺鼠、豬、牛及非人類靈長類動物。在一具體態樣中，非人類基因轉殖動物為小鼠。

在一具體態樣中，基因轉殖動物對人類轉殖基因而言為純合的。在另一具體態樣中，基因轉殖動物對人類轉殖基因而言為雜合的。

在另一具體態樣中，編碼凝血因子之聚核苷酸可操作性連接至啟動子區。思忖在本發明之基因轉殖動物中，啟動子為肝特異性啟動子、肌肉特異性啟動子、胰特異性啟動子、神經特異性啟動子、內皮細胞特異性啟動子、平滑肌細胞特異性啟動子、酪胺酸酶特異性啟動子、凝血因子啟動子、或脂肪組織啟動子或可誘導性啟動子。在一相關具體態樣中，啟動子係選自由以下者所組成之群組：α-胎蛋白啟動子、白蛋白啟動子、CMV啟動子、及內源性凝血因子啟動子。

在另一具體態樣中，編碼凝血因子之聚核苷酸序列進一步包含聚A序列。

在多個方面，本發明提供一種包含編碼選自由以下者所組成之群組的人類凝血因子之聚核苷酸的非人類基因轉殖動物：因子VIII、因子VII、因子IX、溫韋伯氏因子、因子II(FII)、因子V(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)及因子XIII(FXIII)，其中該人類凝血因子保持人類凝血因子之生理活性，其中基因該轉殖哺乳動物已將包含以下者之外源性基因構築體穩定整合至其基因組中：(a)轉錄調節聚核苷酸序列、(b)編碼該人類凝血因子之DNA、及(c)聚腺苷酸化信號，其引起編碼凝血因子之DNA表現，其中(a)、(b)及(c)在外源性基因構築體中可操作性連接以使得基因轉殖動物中產生人類凝血因子。在一具體態樣中，基因轉殖動物不表現對應於人類轉殖基因之內源性凝血因子之全部或部分。在另一具體態樣中，轉錄調節聚核苷酸序列係選自由以下者所組成之群組：5'轉錄調節聚核苷酸序列、3'轉錄調節聚核苷酸序列、內部轉錄調節聚核苷酸序列、及其組合。

在一具體態樣中，外源性基因構築體之5'調節序列為視情況包含增強子區之啟動子。在一相關方面，啟動子為如本文所述之啟動子區。

在另一方面，思忖本文所述之任何非人類基因轉殖動物視情況亦包含編碼人類主要組織相容性(MHC)II類基因以取代基因轉殖非人類動物內源性MHC II類基因的聚核苷酸。在一具體態樣中，人類MHC II類基因為適於在非人類基因轉殖動物中表現之任何HLA基因，包括(但不限於)HLA-DQ、HLA-DR、HLA-DP、HLA-DO、LMP、TAP及TAPBP。在一相關具體態樣中，藉由將表現人類MHC II類基因之基因轉殖小鼠與表現人類凝血因子之本發明之基因轉殖動物交配來使表現人類凝血因子之本發明之基因轉殖動物表現人類MHC II類基因。或者，藉由將編碼MHC II類基因之聚核苷酸序列引入本發明之非人類基因轉殖動物之基因組DNA中來使表現人類凝血因子之本發明之基因轉殖動物表現人類MHC II類基因。思忖轉殖基因的引入係藉由技術領域中已知之任何方法進行。在一具體態樣中，引入係藉由微注射或藉由病毒載體進行。

在另一具體態樣中，引入包含將編碼人類主要組織相容性II類基因之聚核苷酸序列引入非人類動物之基因組DNA中以置換動物的內源性主要組織相容性II類基因的全部或部分。

在一具體態樣中，本發明之非人類基因轉殖動物表現人類vWF基因及人類MHC II類基因，且不表現內源性vWF及MHC II類基因。在一相關具體態樣中，本發明之非人類基因轉殖動物表現人類FVIII基因及人類II類基因，且不表現內源性FVIII及MHC II類基因。在另一具體態樣中，本發明之非人類基因轉殖動物表現人類FVII基因及人類II類基因，且不表現內源性FVII及MHC II類基因。在另一具體態樣中，思忖本發明之非人類基因轉殖動物表現人類FIX基因及人類II類基因，且不表現內源性FIX及MHC II類基因。

本發明進一步思忖一種產生表現選自由以下者所組成之群組之人類凝血因子以取代內源性凝血因子的基因轉殖非人類動物之方法：FVIII、FVII、FIX、vWF、FII、FV、FX、FXI、FXII、及FXIII，該方法包含將編碼人類凝血因子之聚核苷酸序列引入非人類動物之基因組DNA中，其中該基因轉殖非人類動物包含編碼人類凝血因子而非基因轉殖動物的內源性相應凝血因子的聚核苷酸。在一具體態樣中，引入係藉由技術領域中已知之任何方法進行。在各個方面，引入係藉由微注射或藉由病毒載體進行。

在一相關具體態樣中，在產生基因轉殖動物之方法中，核苷酸序列可操作性連接至如本文所述之啟動子區。進一步思忖啟動子係選自由以下者所組成之群組：α-胎蛋白啟動子、白蛋白啟動子、CMV啟動子及內源性凝血因子啟動子。在另一具體態樣中，核苷酸序列包含聚A序列。

在另一方面，本發明提供一種產生表現人類凝血因子之基因轉殖非人類動物之方法，其包含：a)提供編碼選自由FVIII、FVII、FIX、vWF、FII、FV、FX、FXI、FXII及FXIII所組成之群組的人類凝血因子及陽性可選擇性標記物基因之聚核苷酸序列，該標記物基因側接有loxP位點；b)在一定條件下將該聚核苷酸序列引入來自與該非人類動物相同之動物物種之胚胎幹細胞中，該條件使得該聚核苷酸序列同源性重組至該胚胎幹細胞之基因組基因座中，以產生含有編碼選自由FVIII、FVII、FIX、vWF、FII、FV、FX、FXI、FXII及FXIII所組成之群組之人類凝血因子及該可選擇性標記物基因的聚核苷酸之胚胎幹細胞；c)將經同源性重組之胚胎幹細胞注射至非人類動物之囊胚中；d)將經注射之囊胚引入假孕雌性非人類動物中；及e)允許假孕雌性動物分娩一或多個含有同源性重組DNA序列之基因轉殖動物，其中基因轉殖小鼠表現選自由以下者所組成之群組之人類凝血因子：FVIII、FVII、FIX、vWF、FII、FV、FX、FXI、FXII及FXIII。在一具體態樣中，在步驟(b)中，人類基因轉殖聚核苷酸序列同源性重組至胚胎幹細胞之基因組中編碼至少一種天然存在之凝血因子基因之全部或部分的基因組基因座中。

在一具體態樣中，以上方法之編碼凝血因子的聚核苷酸序列進一步包含可操作性連接至人類凝血因子基因之啟動子。在一相關具體態樣中，啟動子係選自由以下者所組成之群組：α-胎蛋白啟動子、白蛋白啟動子、CMV啟動子及內源性凝血因子啟動子。在另一具體態樣中，編碼凝血因子之聚核苷酸序列包含聚A序列。

在多個方面，思忖可選擇性標記物係選自由以下者所組成之群組：綠色螢光蛋白、新黴素(neo )抗性基因、嘌呤黴素(Puro )抗性基因、白喉毒素(diphtheria toxin)抗性基因、潮黴素磷酸轉移酶、黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶、單純性疱疹病毒第1型胸腺嘧啶核苷激酶、腺嘌呤磷酸核糖轉移酶及次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶。在一具體態樣中，可選擇性標記物為新黴素抗性基因，neo 。在另一具體態樣中，可選擇性標記物為白喉毒素。

在一相關具體態樣中，本發明之基因轉殖動物係與Cre 刪除之小鼠品系雜交。

在一相關方面，產生基因轉殖動物之方法進一步包含將編碼人類主要組織相容性(MHC)II類基因之聚核苷酸序列引入非人類動物之基因組DNA中，該編碼人類主要組織相容性II類基因之聚核苷酸序列置換基因轉殖動物的內源性主要組織相容性II類基因之全部或部分，使得基因轉殖動物不表現其內源性主要組織相容性II類基因。在一具體態樣中，引入係藉由技術領域中已知之任何方法進行。在一特定具體態樣中，引入係藉由微注射或藉由病毒載體進行。

在另一方面，本發明思忖一種篩檢在包含表現選自由以下者所組成之群組的人類凝血因子之聚核苷酸轉殖基因的非人類基因轉殖動物中針對人類凝血因子之抗體的方法：FVIII、FVII、FIX、vWF、FII、FV、FX、FXI、FXII及FXIII，該方法包含向該動物投予包含對應於編碼動物中表現之人類凝血因子之人類轉殖基因的人類凝血因子多肽、其片段、類似物或變異體之組合物，及偵測來自基因轉殖動物之測試樣品中對人類凝血因子具特異性之抗體。

在一具體態樣中，偵測步驟係使用放射免疫檢定、酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)、流動式細胞測量術、或磁性珠粒進行。在一特定具體態樣中，偵測係藉由ELISA進行。

在另一具體態樣中，本發明之篩檢方法中所投組合物中的人類凝血因子係由與水溶性聚合物之化學連接而修飾。在一具體態樣中，水溶性聚合物為技術領域中已知之任何水溶性聚合物。在一相關具體態樣中，水溶性聚合物為聚乙二醇部分。此外，化學連接包括(但不限於)糖苷化、PEG化、聚唾液酸化、或添加第二多肽序列以形成融合蛋白。在另一具體態樣中，人類凝血因子包含聚唾液酸部分。在另一特定具體態樣中，組合物中之人類凝血因子為融合蛋白，且在多個方面，融合蛋白包含人類凝血因子及第二治療劑。在其他方面，第二藥劑為選自由以下者所組成之群組之第二人類凝血因子：FVIII、FVII、FIX、vWF、FII、FV、FX、FXI、FXII及FXIII。

本發明提供所思忖之篩檢方法中測試樣品係選自由免疫細胞及血清所組成之群組。在一具體態樣中，樣品為血清。在另一具體態樣中，樣品為自基因轉殖動物分離之免疫細胞。

在另一方面，本發明提供一種篩檢人類凝血因子在包含表現選自由以下者所組成之群組的人類凝血因子之轉殖基因的非人類基因轉殖動物中之免疫原性的方法：FVIII、FVII、FIX、vWF、FII、FV、FX、FXI、FXII及FXIII，該方法包含向該動物投予包含對應於由在動物中表現之轉殖基因表現的人類凝血因子之人類凝血因子之組合物，及偵測在投予人類凝血因子多肽之後動物中之免疫原性事件。

在多個方面，免疫原性事件係與針對人類凝血因子之抗體的產生有關。在一具體態樣中，免疫原性事件係選自由同種抗體產生及過敏反應所組成之群組。

進一步思忖本發明之篩檢方法中所投組合物中的人類凝血因子包含由動物表現之人類凝血因子轉殖基因之片段、類似物或變異體。在另一具體態樣中，組合物進一步包含醫藥學上可接受之載劑。在另一具體態樣中，組合物視情況包含佐劑。

思忖投予步驟係經靜脈內、經皮下、經肌肉內、經口、非經腸或經由吸入來進行。

在另一方面，本發明思忖一種測定測試化合物對人類凝血因子之作用的方法，其包含：向包含表現選自由以下者所組成之群組的人類凝血因子之轉殖基因的非人類基因轉殖動物投予測試化合物：FVIII、FVII、FIX、vWF、FII、FV、FX、FXI、FXII及FXIII，及偵測在該化合物存在下人類凝血因子活性與缺乏該化合物之情況下的活性相比之變化。在多個具體態樣中，人類凝血因子活性係選自由表現凝血因子、凝血活性、及蛋白質結合活性所組成之群組。在一相關具體態樣中，凝血因子為vWF且凝血因子活性為FVIII結合。

在另一方面，本發明提供一種實驗動物模型，其為表現至少一種人類凝血因子之非人類基因轉殖動物，其中當投予(天然)凝血因子時，該動物不產生針對人類凝血因子之顯著抗體力價。然而，若凝血因子攜帶新抗原或若凝血因子係與可活化固有免疫系統之雜質一起注射，則動物模型產生針對凝血因子之抗體。在一具體態樣中，動物易被誘發後天性凝血因子病症。

在一具體態樣中，動物模型為後天性A型血友病之實驗動物模型。後天性A型血友病係藉由注射攜帶新抗原之人類FVIII或藉由將人類FVIII與toll樣受體之配位體一起注射而誘發。在一相關具體態樣中，動物模型為後天性B型血友病之實驗動物模型。

在另一具體態樣中，實驗動物模型包含選自由以下者所組成之群組之人類凝血因子：因子VIII、因子VII、因子IX、溫韋伯氏因子、因子II、因子V、因子X、因子XI、因子XII及因子XIII。

在另一方面，本發明思忖一種鑑別誘發對凝血因子之耐受性的破壞之藥劑(耐受性破壞劑)的方法，其包含：向如本文所述之表現人類凝血因子且缺乏對人類凝血因子之顯著抗凝血因子反應之基因轉殖非人類動物投予候選藥劑，投予動物被基因轉殖之人類凝血因子；及偵測動物中之抗凝血因子反應，其中若投予候選藥劑允許抗凝血因子反應產生，則該候選藥劑為耐受性破壞劑。

在一具體態樣中，抗凝血因子反應為產生抗凝血因子抑制子。在一相關具體態樣中，反應為免疫反應。在另一具體態樣中，免疫反應為產生針對人類凝血因子之抗體。

在某些具體態樣中，候選藥劑係選自由以下者所組成之群組：盤尼西林(penicillin)、氟達拉濱(fludarabine)、干擾素-α、化學治療劑、抗生素、抗精神病劑、toll樣受體之配位體、促發炎性細胞介素及誘發活體內促發炎性細胞介素釋放之任何其他化合物。

在一具體態樣中，凝血因子係選自由以下者所組成之群組：因子VIII、因子VII、因子IX、溫韋伯氏因子、因子II、因子V、因子X、因子XI、因子XII及因子XIII。

本發明解決技術領域中對可用以治療凝血病症之改良組合物以及篩檢可對外源性投予之凝血因子組合物作出反應而產生之抗體之方法的需要。本發明亦提供表現人類凝血因子，在一些情況下取代動物內源性凝血因子及視情況一或多種人類主要組織相容性複合體基因之基因轉殖動物，以分析針對人類凝血因子治療劑之抗體的形成。

定義

除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語具有與一般熟習本發明所屬技術者通常理解之含義相同的含義。以下參考文獻為熟習此項技術者提供本發明中所用之多個術語的通用定義：Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY(1994第2版)；THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walker編，1988)；THE GLOSSARY OF GENETICS，第5版，R. Rieger等人(編)，Springer Verlag(1991)；及Hale及Marham,THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY(1991)。

本文中引用之各公開案、專利申請案、專利及其他參考文獻在其不與本揭示案相矛盾之程度上，以全文引用的方式併入。

此處注意除非上下文另外清楚規定，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所用之單數形式「一」及「該」包括複數指示物。

除非另外指定，否則如本文所用之以下術語具有歸於其之含義。

如本文所用之「編碼序列」或「編碼」表現產物(諸如，RNA、多肽、蛋白質或酶)之序列為在表現時致使該RNA、該多肽、該蛋白質或該酶產生之核苷酸序列，亦即該核苷酸序列編碼該多肽、該蛋白質或該酶之胺基酸序列。蛋白質之編碼序列可包括起始密碼子(通常為ATG)及終止密碼子。

如本文所用之「基因」係指編碼包含一或多種多肽、蛋白質或酶之全部或部分的特定胺基酸序列之DNA序列，且可能包括或可能不包括影響(例如)基因得以表現之條件的內含子及調節DNA序列，諸如啟動子或增強子序列、5'-未轉譯區或3'-未轉譯區。某些不為結構基因之基因可自DNA轉錄為RNA，但不轉譯為胺基酸序列。其他基因可充當結構基因之調節子或DNA轉錄之調節子。

如本文所用之「啟動子」或「啟動子序列」為能夠結合細胞中之RNA聚合酶且開始編碼序列之轉錄的DNA調節區。在一方面，啟動子序列係在其3'末端處由轉錄起始位點結合，且向上游擴展(5'方向)以包括以高於背景之可偵測水平開始轉錄所需之最小數目之鹼基或元件。在一相關方面，在啟動子序列內發現轉錄起始位點(例如藉由以核酸酶S 1定位而便利地確定)以及負責結合RNA聚合酶之蛋白質結合域(一致序列)。啟動子可操作性締合至其他表現控制序列(包括增強子及抑制序列)。

在一方面，用以控制基因表現之啟動子包括(但不限於)細胞巨化病毒(CMV)啟動子(美國專利第5,385,839號及第5,168,062號)、SV40早期啟動子區(Benoist及Chambon,Nature 290:304-3101981)、勞氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)之3'長末端重複序列中所含之啟動子(Yamamoto等人，Cell 22:787-797,1980)、疱疹胸苷激酶啟動子(Wagner等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445,1981)、金屬硫蛋白基因之調節序列(Brinster 等人，Nature 296:39-42,1982)；來自酵母或其他真菌之啟動子元件，諸如Gal 4啟動子、ADC(醇脫氫酶)啟動子、PGK(磷酸甘油激酶)啟動子、鹼性磷酸酶啟動子；及顯示神經元或腦特異性表現之轉錄控制區，諸如在下視丘中具活性的刺激生殖腺釋放激素基因控制區域(Mason等人，Science 234:1372-1378,1986)、在神經元中具活性的Thy1.2「泛神經元(pan-neuronal)」啟動子及突觸蛋白I啟動子(Howland等人，Brain Neurobiol Aging 16:685-699,1995)。亦思忖啟動子為內源性凝血因子啟動子。一般熟習此項技術者將瞭解可使用技術領域中已知之任何啟動子，且將瞭解希望在其中表現之細胞類型可規定特定啟動子之使用。

如本文所用，當RNA聚合酶將編碼序列轉錄成RNA，接著RNA經反式RNA拼接(若其含有內含子)且在mRNA狀況下轉譯成由該編碼序列編碼之蛋白質時，編碼序列「受控於」、「可操作性連接至」或「可操作性締合至」細胞中之轉錄及轉譯控制序列。

如本文所用之術語「表現」係指允許或引起基因或DNA序列中之資訊得以清楚表示，例如藉由活化與相應基因或DNA序列轉錄及轉譯相關的細胞功能來產生蛋白質。DNA序列在細胞中表現或由細胞表現以形成「表現產物」，諸如蛋白質。表現產物自身(例如，所得蛋白質)亦可稱為「得以表現」。在多個方面，表現產物表徵為細胞內、細胞外或分泌。術語「細胞內」意謂在細胞內部。術語「細胞外」意謂在細胞外部，諸如跨膜蛋白。若物質在很大程度上呈現為自細胞上或內部某處至細胞外部，則該物質係由細胞「分泌」。

如本文所用之「轉染」係指外來核酸引入細胞中。術語「轉型」係指「外來」(亦即，外源性、異源、外部或細胞外)基因、DNA或RNA序列引入胚胎幹(ES)細胞或前核中，使得該細胞將表現所引入之基因或序列以在基因轉殖動物中產生所需物質。

如本文所用之術語「載體」、「選殖載體」及「表現載體」係指將DNA或RNA序列(例如，外來基因)引入宿主細胞中以轉型宿主且促進所引入之序列表現(例如，轉錄及轉譯)的載具。術語「載體」在本文中可與術語「質體」互換使用。

如本文所用之「可選擇性標記物」係指編碼某種酶或其他蛋白質之基因，其向使其得以表現之細胞或生物體賦予可鑑別之表型變化，諸如對藥物、抗生素或其他藥劑之抗性，以使得標記物之表現或活性正向選擇(例如但不限於陽性標記物，諸如neo 基因)或逆向選擇(例如但不限於陰性標記物，諸如白喉基因)。異源可選擇性標記物係指已插入其通常不會存在之動物的基因組中之可選擇性標記物基因。

可選擇性標記物之實例包括(但不限於)抗生素抗性基因，諸如新黴素(neo )、嘌呤黴素(Puro )、白喉毒素、磷酸轉移酶、潮黴素磷酸轉移酶、黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶、單純性疱疹病毒第1型胸苷激酶、腺嘌呤磷酸核糖轉移酶及次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶。一般熟習此項技術者將瞭解技術領域中已知之任何可選擇性標記物可用於該方法中。

如本文所用之「異源」係指非天然存在之元件的組合。舉例而言，異源DNA係指非天然位於細胞或細胞之染色體位點中的DNA。思忖異源DNA包括細胞之外來基因。異源表現調節元件為可操作性締合至與其天然可操作性締合之基因不同之基因的元件。

如本文所用之術語「同源」係指具有「共同進化來源」之蛋白質之間的關係，該等蛋白質包括來自超家族(例如，免疫球蛋白超家族)之蛋白質及來自不同物種之同源蛋白質(例如，肌凝蛋白輕鏈等)(Reeck等人，Cell 50:667,1987)。該等蛋白質(及其編碼基因)具有如由其序列類似性反映之序列同源性，無論根據類似性%抑或根據在保守位置處特定殘基或基元之存在。

例如且不限於藉由以下方法來進行序列之最佳比對以進行比較：Smith及Waterman,Adv. Appl. Math. 2:482,1981之局部同源性演算法；Needleman及Wunsch,J. Mol. Biol. 48:443,1970之同源性比對演算法；Pearson及Lipman,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444,1988之類似性搜索法；此等演算法之電腦化實施(GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA,Wisconsin遺傳學套裝軟體，Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI)或目測(一般性參見Ausubel等人，上文)。適於測定序列一致性%及序列類似性之演算法的另一實例為BLAST演算法，其描述於Altschul等人，J. Mol. BioI. 215:403-410,1990中。用於執行BLAST分析之軟體可經由國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)公開獲得。除計算序列一致性%外，BLAST演算法亦執行兩個序列之間的類似性統計分析(參見例如Karlin及Altschul,Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787,1993)。

如本文所用之「內源性」係指在宿主生物體中天然表現或源自細胞、組織或生物體內之多肽或聚核苷酸或其他化合物。「外源性」係指源自細胞、組織或生物體外部之多肽、聚核苷酸或其他化合物。

如本文所用之「多肽」係指由經由肽鍵連接之胺基酸殘基組成的聚合物。在一方面，合成多肽係使用自動多肽合成儀合成。術語「蛋白質」通常係指大型多肽。術語「肽」通常係指短型多肽。

如本文所用之多肽「片段」係指小於全長多肽或蛋白質表現產物之任何多肽部分。片段通常為全長多肽之缺失類似物，其中已自全長多肽之胺基末端及/或羧基末端移除一或多個胺基酸殘基。因此，「片段」為下文所述之缺失類似物的子集。

如本文所用之「類似物」係指與天然存在之分子相比結構大體上類似且具有相同生物活性(雖然在某些情況下水平不同)的多肽。類似物與產生該類似物之天然存在多肽相比的不同之處在於其胺基酸序列之組成，基於涉及以下各者之一或多個突變：(i)在多肽之一或多個末端及/或天然存在之多肽序列的一或多個內部區域，一或多個胺基酸殘基缺失；(ii)在多肽之一或多個末端(通常「添加」類似物)及/或天然存在之多肽序列的一或多個內部區域(通常「插入」類似物)，插入或添加一或多個胺基酸殘基；或(iii)一或多個胺基酸取代天然存在之多肽序列中之其他胺基酸。基於經置換之肽基酸與置換前者之胺基酸的物理化學或功能關聯性，取代為保守性或非保守性取代。

如本文所用之「對偶基因變異體」係指佔據相同基因座的兩種或兩種以上多態形式基因中之任一者。對偶基因變異經由突變天然產生，且可引起種群內之表型多態現象。在某些方面，基因突變為靜默的(經編碼之多肽無變化)或可編碼具有變異胺基酸序列之多肽。「對偶基因變異體」亦係指來源於遺傳對偶基因變異體之mRNA轉錄物的cDNA以及由其編碼之蛋白質。

如本文所用之「變異體」係指經修飾以包含通常並非分子之部分的另外化學部分之多肽、蛋白質或其類似物。在多個方面，該等部分調節分子溶解性、吸收及/或生物半衰期。或者，在多個其他方面，該等部分降低分子之毒性且消除或減弱分子之任何不良副作用等。能夠介導該等作用之部分揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences(1980)中。使該等部分與分子偶合之程序在技術領域中熟知。舉例而言，變異體可為具有向蛋白質賦予較長活體內半衰期之化學修飾的凝血因子。在一具體態樣中，多肽係藉由添加技術領域中已知之水溶性聚合物而修飾。在一相關具體態樣中，多肽係藉由糖苷化、PEG化及/或聚唾液酸化而修飾。

如本文所用之「耐受性」係指缺乏抗原-接受者免疫反應，否則該等抗原-接受者免疫反應將(例如)對非自身MHC抗原引入接受者中作出反應而發生。在多個方面，耐受性涉及體液反應、細胞反應或體液與細胞兩者之反應。如本文所用之耐受性不僅係指對抗原或化合物之完全免疫耐受性，亦即無免疫反應，且亦係指部分免疫耐受性，亦即未完全消除、抑制或以其他方式扼制對化合物之反應的有限免疫反應。舉例而言，在某些方面，耐受個體顯示可偵測之對化合物之免疫反應，但其與非耐受個體暴露於同一化合物時之免疫反應相比，顯著較小或減小。

如本文所用之「破壞耐受性」係指對接受者天然耐受或經由生物方式誘發而耐受之抗原的耐受性後天性缺乏。耐受性已被破壞之個體對接受者先前耐受之抗原或化合物之存在作出反應，且在耐受性被破壞之個體中可偵測到針對該抗原或化合物之反應。在一方面，接受者之反應為免疫反應。

「耐受性破壞劑」為在向接受者投予時允許對接受者先前天然耐受或經由生物方式誘發而耐受之抗原之反應產生的藥劑。針對特定抗原之耐受性破壞劑包括在接受者反應中允許(例如)負性或不利反應之彼等耐受性破壞劑，該反應包括(但不限於)在耐受性被破壞後向個體投予該抗原時產生抗原抑制劑及/或對抗抗原之免疫反應，包括產生抗體，且個體先前耐受該抗原且在耐受性破壞之前未顯示顯著反應。

候選耐受性破壞劑為測試允許誘發對抗抗原之反應(例如，產生抑制劑及/或對抗抗原之抗體)之能力的任何藥劑。候選藥劑天然存在或合成。在多個方面，候選藥劑係選自化學物質文庫、天然產物文庫或組合文庫。化學物質文庫由已知化合物之結構類似物組成。天然產物文庫為用以產生供篩檢候選藥劑用之混合物的微生物、動物、植物或海洋生物或自其分離之蛋白質或小分子之集合。組合文庫包含大量肽、寡核苷酸或有機化合物。製備或合成化學物質文庫、天然產物文庫或組合文庫之方法在技術領域中已知。另外，化學物質文庫及組合文庫可購得。在某些具體態樣中，候選藥劑係選自由以下者所組成之群組：化學治療劑、抗生素、抗精神病劑、盤尼西林、氟達拉濱、干擾素-α、toll樣受體之配位體、促發炎性細胞介素及誘發活體內促發炎性細胞介素之任何其他化合物。然而，若凝血因子攜帶新抗原，則動物模型產生針對該凝血因子之抗體。

如本文所用之「可偵測部分」或「標記」係指可藉由光譜學、光化學、生物化學、免疫化學、化學或其他方式偵測之組合物。舉例而言，適用標記包括³² P、³⁵ S、螢光染料、電子密集試劑、酶(例如，如ELISA中常用之酶)、生物素-抗生蛋白鏈菌素、地高辛(digoxigenin)、抗血清或單株抗體有效針對之半抗原及蛋白質，或具有與標靶互補之序列的核酸分子。可偵測部分通常產生用以測定樣品中結合之可偵測部分之量的可量測信號，諸如放射性、顯色或螢光信號。

凝血因子

因子VIII(FVIII)為在哺乳動物之肝臟中產生之具有約260kDa分子質量的血漿醣蛋白。其為導致凝血之一系列凝固反應級聯的關鍵組份。因子IXa聯合FVIII將因子X轉化為活化形式因子Xa的步驟在此級聯內。在此步驟中，FVIII充當輔因子，為因子IXa活性之鈣離子及磷脂所需。兩種最常見之血友病係由功能性FVIII缺乏(A型血友病，所有病例之約80%)或功能性因子IXa缺乏(B型血友病或克氏因子疾病(Christmas Factor disease))引起。

直至最近，A型血友病之標準治療涉及頻繁輸注來源於人類供體血漿之FVIII濃縮物製劑。雖然此取代療法一般有效，但該治療將患者置於病毒傳播性疾病(諸如，肝炎及AIDS)的風險之中。雖然此風險已藉由使用單株抗體進行免疫純化來自血漿進一步純化FVIII且藉由用有機溶劑或熱處理使病毒失活而降低，但該等製劑極大地增加治療成本且並非無風險。為此，患者經階段性而非預防性治療。另一併發症為約15%患者形成針對血漿衍生之FVIII的抑制性抗體。

A型血友病治療之重大進步為分離編碼人類FVIII之完整2,351胺基酸序列之cDNA純系(參見Wood等人，Nature,312:330(1984)及美國專利第4,757,006號,1988年7月12日)及提供人類FVIII基因DNA序列及用於產生該序列之重組方法。然而，接受重組FVIII之患者仍可能形成干擾疾病治療之FVIII特異性抗體。用於治療血友病之因子VIII產品包括(但不限於)：ADVATE(抗血友病因子(重組)，不含血漿/白蛋白之方法，rAHF-PFM)、重組抗血友病因子(BIOCLATE^TM 、GENARC、HELIXATE FS、KOATE、KOGENATE FS、RECOMBINATE)：MONOCLATE-P(因子VIII:C之純化製劑)、抗血友病因子/溫韋伯氏因子複合物(人類)HUMATE-P及ALPHANATE(抗血友病因子/溫韋伯氏因子複合物(人類))；及HYATE C(經純化之豬因子VIII)。

溫韋伯氏因子以一系列分子量為1×10⁶ 至20×10⁶ 道爾頓(Dalton)之多聚體形式存在於血漿中。vWF為主要在哺乳動物之內皮細胞中形成且接著分泌至循環中之醣蛋白。就此而論，自具有約220kD之分子量的多肽鏈開始，藉由形成若干硫鍵，在細胞中產生具有550kD之分子量的vWF二聚體。分子量增加多達20×10⁶ 道爾頓之vWF的其他聚合物係由vWF二聚體藉由連接而形成。認為尤其高分子vWF多聚體在凝血中具有不可缺少的重要性。

當存在vWF產生不足或過度產生時，在臨床上顯現vWF症候群。vWF過度產生引起血栓增加(在血管內部形成凝血或血栓，阻礙血液流動)，而高分子形式之vWF含量降低或缺乏由於抑制血小板凝集及傷口癒合而引起出血增加及出血時間延長。

因為vWF為功能因子VIII之基本組份，所以vWF缺乏亦可引起表型A型血友病。在此等情況下，因子VIII之半衰期減短以使其在凝血級聯中之功能削弱。罹患溫韋伯氏疾病(vWD)或vWF症候群之患者通常顯示因子VIII缺乏。在此等患者中，因子VIII活性降低並非X染色體基因缺陷之結果，而為血漿中vWF量變及質變之間接結果。藉由量測vWF抗原或藉由測定利托菌素(ristocetin)輔因子活性來區分A型血友病與vWD。在大部分vWD患者中vWF抗原含量與利托菌素輔因子活性均降低，而其在A型血友病患者為正常的。用於治療vWF症候群之vWF產品包括(但不限於)：HUMATE-P及IMMUNATE、INNOBRAND及8Y，該等療法包含來自血漿之FVIII/VWF濃縮物。

因子VII(前轉變素)(絲胺酸蛋白酶)為凝血級聯中之關鍵蛋白質之一。因子VII(FVII)之主要作用係聯合組織因子(TF)開始凝血過程。在血管損傷後，TF暴露於血液及循環因子VII。一旦結合TF，FVII即由不同蛋白酶活化成FVIIa，該等蛋白酶為凝血酶(因子IIa)、活化因子X及FVIIa-TF複合物自身。已引入重組人類因子VIIa(NOVOSEVEN)用於已形成對抗置換凝血因子之抑制劑的血友病患者中不可控制之出血。表現人類因子VII之基因轉殖生物體已由Hwang等人(Mar Biotechnol 6:485-92,2004)培育，其描述表現人類FVII之基因轉殖魚。

因子IX(FIX，克氏因子)為絲胺酸蛋白酶，除非經因子XIa或因子VIIa(組織因子路徑)活化，否則其不具有活性。當活化為因子IXa時，其藉由水解因子X中之精胺酸-異白胺酸鍵而起作用以形成因子Xa。因子VIII為FIX蛋白酶活性之必需輔因子(Lowe GD,Br. J. Haematol. 115:507-13,2002)。因子IX缺乏引起B型血友病或克氏病。已揭示表現人類因子IX之基因轉殖動物。參見例如Schnieke等人(Science 278:2130-33,1997)，其揭示在綿羊乳汁中表現人類因子IX之基因轉殖綿羊，及Alexander等人，(Hum Mol Genet. 4:993-9,1995)，其揭示人類FIX在基因轉殖小鼠中之表現。Bigger等人(Gene Ther. 2006 13(2):117-26,2006)亦揭示在B型血友病之小鼠模型中投予表現人類因子IX之造血幹細胞，此在某些動物中誘發對該蛋白質之耐受性長達1年。Waddington等人(Blood. 2003 101:1359-66)揭示向小鼠子宮內投予表現人類FIX之腺病毒載體以誘發接受動物中對人類蛋白質之耐受性。

可用於本發明之方法中的其他血液因子包括(但不限於)：因子II(技術領域中亦稱為凝血酶)(Genbank寄存編號NP_000497)，缺乏該因子會引起血栓症及異常凝血酶原血症(dysprothrombinemia)；因子V(Genbank寄存編號NP_000121)，缺乏該因子會引起出血素質或某種形式之血栓形成傾向，其稱為活化蛋白質C抗性；因子XI(Genbank寄存編號NP_000119)，缺乏該因子會引起羅森塔爾氏症候群(Rosenthal's syndrome)(血友病C)；及因子XIII次單元A(Genbank寄存編號NP_000120)及次單元B(Genbank寄存編號NP_001985)，缺乏該等因子表徵為I型缺乏(A次單元與B次單元均缺乏)及II型缺乏(僅A次單元缺乏)，兩者均可引起終身出血趨勢、缺陷性傷口癒合及習慣性流產；因子XII(Genbank寄存編號NP_000496)；蛋白質C(Genbank寄存編號NP_000303)；抗凝血酶III(Genbank寄存編號NP_000479)及其活化形式。

人類凝血因子之片段、變異體及類似物

為評估人類凝血因子蛋白質在凝血病症治療中之治療功效，向本文所述之基因轉殖小鼠投予人類凝血因子多肽或其片段、變異體或類似物。

用於製備多肽片段、變異體或類似物之方法在技術領域中為熟知的。使用包括(但不限於)酶促裂解(例如，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶)以及使用產生具有特定胺基酸序列之多肽片段的重組方法來製備多肽片段。使用編碼所需片段之聚核苷酸，可產生包含具有特定活性之蛋白質區域(諸如，配位體結合域、受體結合域、二聚或多聚域或技術領域中已知之任何其他可鑑別域)的多肽片段。

製備多肽類似物之方法亦為熟知。多肽之胺基酸序列類似物為取代、插入或缺失變異體。缺失類似物(包括多肽片段)缺乏天然蛋白質中對功能或免疫原性活性而言並非不可缺少的一或多個殘基。插入類似物涉及在多肽中之非末端位點添加物質。此可包括插入免疫活性抗原決定基或僅單一殘基。

類似物可與使其產生或本文所述之凝血因子大體上同源或大體上一致。所涵蓋之類似物為保持野生型多肽之至少一些生物活性(例如，凝血活性)的彼等類似物。

取代類似物通常在蛋白質內的一或多個位點將野生型之一胺基酸換成另一胺基酸，且可經設計以在不喪失其他功能或性質之情況下調節如本文所述之多肽之一或多種性質。在一方面，取代為保守取代。「保守胺基酸取代」意謂以含有具類似化學特徵之側鏈的胺基酸取代胺基酸。用於進行保守取代之類似胺基酸包括：具有酸性側鏈之彼等胺基酸(麩胺酸、天冬胺酸)；具有鹼性側鏈之彼等胺基酸(精胺酸、離胺酸、組胺酸)；具有極性醯胺側鏈之彼等胺基酸(麩醯胺酸、天冬醯胺酸)；具有疏水性脂族側鏈之彼等胺基酸(白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、丙胺酸、甘胺酸)；具有芳族側鏈之彼等胺基酸(苯丙胺酸、色胺酸、酪胺酸)；具有小側鏈之彼等胺基酸(甘胺酸、丙胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、甲硫胺酸)；或具有脂族羥基側鏈之彼等胺基酸(絲胺酸、蘇胺酸)。

編碼片段及類似物之聚核苷酸可易於由技術人員產生以編碼天然存在之分子之具有與其相同或類似生物活性的具有生物學活性之片段、變異體或類似物。此可藉由PCR技術、DNA編碼分子消化及其類似方法進行。因此，熟習此項技術者將能夠在DNA鏈中產生單一鹼基變化，從而引起變異密碼子及誤義突變。

例示性凝血因子類似物描述於(例如)以引用的方式併入本文中之美國專利6,346,513、美國專利6,316,226、美國專利6,156,888、美國專利6,130,203及美國專利6,958,322中。

所涵蓋之人類凝血因子變異體包括藉由諸如以下各者之技術化學上修飾之多肽：泛素化、糖苷化、與治療或診斷劑接合、標記(例如，以放射性核素或各種酶標記)、共價聚合物連接(諸如，PEG化(以聚乙二醇衍生))、引入不可水解之鍵，及藉由化學合成通常不存在於人類蛋白質中之胺基酸(諸如，鳥肽酸)來插入或取代。變異體保持本發明之未修飾分子之結合性質。

製備PEG化凝血因子類似物一般將包含以下步驟：(a)在一定條件下使多肽與聚乙二醇(諸如，PEG之反應性酯或醛衍生物)反應，藉此結合構築體多肽連接至一或多個PEG基團；及(b)獲得反應產物。一般而言，醯化反應之最佳反應條件將基於已知參數及所需結果而定。舉例而言，PEG：蛋白質之比率愈大，PEG化產物之百分比愈大。在一些具體態樣中，結合構築體將在N末端處具有單一PEG部分。

聚乙二醇(PEG)可連接至凝血因子以提供較長體內半衰期。PEG基團可具有任何適宜分子量，且可為直鏈或分支鏈的。PEG平均分子量在約2千道爾頓(「kD」)至約100kDa、約5kDa至約50kDa或約5kDa至約10kDa之範圍內。經由醯化或還原烷基化，經由PEG部分上之天然或工程化反應性基團(例如，醛基、胺基、硫醇基或酯基)至凝血因子上之反應性基團(例如，醛基、胺基或酯基)或藉由技術領域中已知之任何其他技術，使PEG基團連接至凝血因子。

可用於本發明之方法中的多肽變異體包括包含聚唾液酸酯(PSA)部分之多肽。用於製備聚唾液酸化多肽之方法描述於美國專利公開案20060160948及Saenko等人，Haemophilia 12:42-51,2006中。

進一步思忖用於本發明之方法中的人類凝血因子可為與作為多肽之第二藥劑融合的融合蛋白。在一具體態樣中，作為多肽之第二藥劑為(但不限於)酶、生長因子、細胞介素、趨化因子、細胞表面受體、細胞表面受體之胞外域、細胞黏著分子或上述蛋白質之片段或活性域。在一相關具體態樣中，第二藥劑為凝血因子，諸如因子VIII、因子VII、因子IX及溫韋伯氏因子。所涵蓋之融合蛋白係藉由技術領域中熟知之化學或重組技術製備。

用於投藥之凝血因子組合物

為投予本文所述之凝血因子多肽(包括片段、類似物或變異體)以測試個體，凝血因子多肽係調配於包含一或多種醫藥學上可接受之載劑之組合物中。短語「醫藥學上或藥理學上可接受」係指當使用如下文所述之技術領域中熟知之途徑投予時不產生過敏或其他有害反應的分子實體及組合物。「醫藥學上可接受之載劑」包括任何及所有臨床上適用之溶劑、分散介質、塗層、抗菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似物。

此外，化合物可與水或常用有機溶劑形成溶劑合物。亦涵蓋該等溶劑合物。

凝血因子組合物可經口、局部、經皮、非經腸、藉由吸入噴霧、經陰道、經直腸或藉由顱內注射投予。如本文所用之術語非經腸包括皮下注射、靜脈內、肌肉內、腦池內注射或輸液技術。亦涵蓋藉由靜脈內、皮內、肌肉內、乳房內、腹膜內、鞘內、眼球後、肺內注射及/或特定位點處外科手術植入投予。一般而言，組合物基本上不含熱原質以及對接受者可能有害之其他雜質。

醫藥組合物之調配將根據所選投藥途徑而變化(例如，溶液、乳液)。包含待投予之組合物的合適組合物係在生理學上可接受之媒劑或載劑中製備。對於溶液或乳液而言，合適之載劑包括(例如)水性或醇/水性溶液、乳液或懸浮液，包括生理食鹽水及緩衝介質。非經腸媒劑可包括氯化鈉溶液、林格氏右旋糖(Ringer's dextrose)、右旋糖及氯化鈉、乳酸化林格氏或不揮發性油。靜脈內媒劑可包括各種添加劑、防腐劑或流體、養分或電解質補充劑。

視投藥途徑而定，可用於本發明之方法中的含有凝血因子作為活性成份之醫藥組合物可含有醫藥學上可接受之載劑或添加劑。該等載劑或添加劑之實例包括水、醫藥學上可接受之有機溶劑、膠原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、羧乙烯共聚物、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、褐藻酸鈉、水溶性葡聚糖、羧甲基澱粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、三仙膠、阿拉伯膠(gum Arabic)、酪蛋白、明膠、瓊脂、雙甘油、甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林(Vaseline)、石蠟、硬脂醇、硬脂酸、人類血清白蛋白(HSA)、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、醫藥學上可接受之界面活性劑及其類似物。適當時，視本發明之劑型而定，所用添加劑係選自(但不限於)以上各物或其組合。

多種水性載劑(例如，水、緩衝水、0.4%生理食鹽水、0.3%甘胺酸)或水性懸浮液可含有活性化合物與適於製備水性懸浮液之賦形劑的混合物。該等賦形劑為懸浮劑，例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、褐藻酸鈉、聚乙烯吡咯啶酮、黃蓍膠及阿拉伯膠；分散劑或濕潤劑可為天然存在之磷脂(例如，卵磷酯)或氧化烯與脂肪酸之縮合產物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)或氧化乙烯與長鏈脂族醇(例如，十七伸乙基氧基十六醇)之縮合產物或氧化乙烯與衍生自脂肪酸及己糖醇之偏酯的縮合產物(諸如，聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯)或氧化乙烯與衍生自脂肪酸及己糖醇酐之偏酯的縮合產物(例如，聚乙烯山梨糖醇酐單油酸酯)。水性懸浮液亦可含有一或多種防腐劑，例如對羥基苯甲酸乙酯或對羥基苯甲酸乙酯。

在一些具體態樣中，凝血因子組合物經凍乾以便儲存且在使用之前在合適載劑中復水。已展示此技術對於習知免疫球蛋白有效。採用技術領域中已知之任何合適之凍乾及復水技術。熟習此項技術者應瞭解凍乾及復水導致不同程度的抗體活性損失且用量可能必須調整以作補償。

適於藉由添加水來製備水性懸浮液之可分散性粉末及粒子提供活性化合物與分散劑或潤濕劑、懸浮劑及一或多種防腐劑之混合物。合適之分散劑或潤濕劑及懸浮劑係由已在上文提及之彼等分散劑或潤濕劑及懸浮劑來例示。

在某些具體態樣中，此等調配物中凝血因子之濃度廣泛變化，例如自小於約0.5wt%、通常為約1wt%或至少約1wt%至多達15wt%或20wt%，且將主要基於流體體積、黏度等，根據所選特定投藥模式來選擇。因此，例如且不限於，用於非經腸注射之典型醫藥組合物係補足至含有1ml無菌緩衝水及50mg凝血因子。用於靜脈內輸液之典型組合物可補足至含有250ml無菌林格氏溶液及150mg凝血因子。用於製備可非經腸投予之組合物之實際方法為熟習此項技術者已知或顯而易見且更詳細地描述於(例如)Remington's Pharmaceutical Science,第15版,Mack Publishing Company,Easton,Pa.(1980)中。雙特異性抗體之有效劑量在每次投藥每公斤體重0.01mg至1000mg之範圍內。

在多個方面，醫藥組合物係呈無菌可注射水性、油性懸浮液、分散液或用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液的無菌粉末之形式。懸浮液可根據已知之技術使用已在上文提及之彼等合適分散劑或濕潤劑及懸浮劑調配。無菌可注射製劑亦可為於無毒非經腸可接受之稀釋劑或溶劑中之無菌可注射溶液或懸浮液，例如呈於1,3-丁二醇中之溶液形式。在一些具體態樣中，載劑為含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及其類似物)、其合適混合物、植物油、林格氏溶液及等張氯化鈉溶液之溶劑或分散介質。此外，通常採用無菌不揮發性油作為溶劑或懸浮介質。為達成此目的，可採用任何溫和之不揮發性油，包括合成單甘油酯或二甘油酯。此外，諸如油酸之脂肪酸可用於製備注射劑。

在所有狀況下，形式必須無菌且必須為流體以便易於注射。適當流動性(例如)藉由使用諸如卵磷脂之塗層來維持，在分散液之狀況下藉由維持所需粒徑來維持及藉由使用界面活性劑來維持。其在製備及儲存之條件下必須穩定且必須加以保護以對抗諸如細菌及真菌之微生物的污染作用。由各種抗菌劑及抗真菌劑(例如，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞及其類似物)來達成微生物作用之預防。在多種狀況下，需要包括等張劑，例如糖或氯化鈉。在某些方面，藉由在組合物中使用延遲吸收之試劑(例如，單硬脂酸鋁及明膠)來延長可注射組合物之吸收。

可用於投藥之組合物可與攝取或吸收增強劑一起調配以增強其功效。該等增強劑包括(例如)水楊酸酯、甘膽酸酯/亞油酸酯、甘膽酸酯、抑蛋白酶肽(aprotinin)、桿菌肽、SDS、癸酸酯及其類似物。參見例如Fix(J. Pharm. Sci.,85：1282-1285,1996)及Oliyai及Stella(Ann.Rev. Pharmacol. Toxicol., 32：521-544,1993)。

此外，思忖用於本發明之方法中的組合物之親水性及疏水性得以良好平衡，藉此增強其在試管內及尤其活體內使用之實用性，而缺乏該平衡之其他組合物所具有的實用性小得多。特定言之，思忖用於本發明之組合物具有合適之於水性介質中之溶解度，此允許在體內之吸收及生物可用性，同時亦具有在脂質中之溶解度，此允許化合物越過細胞膜至假定作用位點。

基因轉殖動物之製備

一般而言，本發明之基因轉殖動物包括除人類之外的任何可轉型物種。尤其關注哺乳動物，包括已知之可轉型物種，諸如小鼠、大鼠、兔、綿羊、倉鼠、沙鼠、豚鼠及豬及其他物種，隨著轉型方法的開發，包括牛及非人類靈長類動物。

本發明之基因轉殖動物為經基因改造之動物，其中至少一個外來基因已插入基因組中。此等動物允許細胞層級上之調節過程以其他測試系統不可實現之系統且特定之方式檢查及改變。所述類型之基因轉殖動物可用於分析投予包括(但不限於)以下者之治療性凝血因子的活體內作用：因子VIII(FVIII)、因子VII(FVII)、因子IX(FIX)、溫韋伯氏因子(vWF)、因子II(FII)、因子V(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)及因子XIII(FXIII)。基因轉殖動物用作評估化合物(亦即，經純化之凝血蛋白質或其變異體)對引起抗自身抗體在假定耐受性宿主免疫系統之背景下形成的作用之優良模型。該認識對用於治療包括(但不限於)血友病、溫韋伯氏症候群及其類似病症之凝血病症的藥劑之設計及測試而言為至關重要的。

進一步思忖在某些方面表現人類凝血因子之基因轉殖動物亦表現人類主要組織相容性複合體(MHC)基因。MHC基因與在細胞表面上表現外來抗原及向CD8+(MHC I類)或CD4+(MHC II類)T細胞呈遞抗原有關。人類MHC I類基因轉殖小鼠(Escobar等人，Clin Exp Immunol. 116:214-9,1999)與人類MHC II類基因轉殖小鼠(WO 2006/056769及Fugger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91,6151-6155,1994)均已描述於技術領域中，其揭示內容以引用的方式併入本文中。

人類MHC II類基因包括適於在非人類基因轉殖動物中表現之任何人類白細胞抗原(HLA)基因，包括(但不限於)HLA-DQ、HLA-DR、HLA-DP、HLA-DO、LMP、TAP及TAPBP(the MHC Consortium,Nature 401:921-923,1999,以引用的方式併入本文中)。

本文中之轉殖基因包含人類凝血因子或人類MHC II類基因蛋白質之編碼序列(例如，cDNA、合成編碼序列或基因組DNA)，其側接有天然調節(表現控制)序列或締合有異源序列，包括啟動子、內部核糖體入口位點(IRES)及其他核糖體結合位點序列、增強子、反應元件、抑制子、信號序列、聚腺苷酸化序列、內含子、5'-及3'-非編碼區及其類似物。編碼序列亦可藉由技術領域中已知之多種方式修飾。該等修飾之非限制性實例包括甲基化、「封端」、以類似物取代一或多個天然存在之核苷酸及核苷酸間修飾，諸如用不帶電連接(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、磷醯胺酸酯、胺基甲酸酯等)修飾及用帶電連接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)修飾。在某些方面，聚核苷酸含有另外一或多個共價連接之部分，諸如蛋白質(例如，核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚L-離胺酸等)、嵌入劑(例如，吖啶、補骨脂素等)、螯合劑(例如，金屬、放射性金屬、鐵、氧化金屬等)及烷基化劑。聚核苷酸可藉由形成甲基或乙基磷酸三酯或烷基胺基磷酸酯連接而衍生。此外，在一些具體態樣中，用能夠直接或間接提供可偵測信號之標記修飾本文中之聚核苷酸。例示性標記包括放射性同位素、螢光分子、生物素及其類似物。

藉由技術領域中熟知之多種方式實現對基因表現之控制。轉殖基因之表現為原構性的，或調節成可藉由已知之方式，通常藉由選擇對給定之條件組(例如，存在給定之化合物或指定物質，或諸如組織類型或溫度之環境條件變化)起反應之啟動子來誘導或抑制。術語「可誘導性表現」擴展為使基因表現在規定條件下發生之任何方式，方式及條件之選擇係基於對宿主生物體之便利性及適當性來選擇。

視生物體、生物體細胞及其生物學之特徵而定，藉由多種已知之技術進行轉型。穩定轉型涉及DNA進入細胞及進入細胞核中。對於自單一細胞再生之生物體(其包括某些哺乳動物)而言，轉型係在試管內培養物中進行，接著選擇轉型物且再生轉型物。通常用於將DNA或RNA轉移至細胞中之方法包括微注射、粒子槍轟擊、與陽離子脂質、脂質體或其他載運物質形成DNA或RNA複合物、電穿孔及將轉型DNA或RNA併入病毒載體中。其他技術在技術領域中已知。DNA轉移至細胞核中藉由細胞過程發生，且有時可藉助於選擇合適載體，包括細胞內轉座酶(transposase)或重組酶起作用所針對之整合位點序列(參見例如[Craig,Ann. Rev. Genet. 1988,22:77；Cox. Genetic Recombination(R. Kucherlapati及G. R. Smith編)1988,American Society for Microbiology,Washington,D.C.,第429-493頁；Hoess. Nucleic Acid and Molecular Biology(F. Eckstein及D. M. J. Lilley編)第4卷，1990,Springer-Verlag,Berlin，第99-109頁]。

產生各種ES細胞之小鼠品系之遺傳背景在技術領域中已知，包括來源於小鼠品系129之ES細胞：R1細胞來源於來自亞品系129/Sv與129/Sv-CP之間的雜交後代之小鼠囊胚(Nagy等人，Proc Natl Acad Sci U S A. 90:8424-8,1993)；GS1細胞來源於129/Sv/Ev。D3-細胞(Doetschman等人，Nature 330:576-8,1987)及J1細胞來源於129/Sv或129/terSv。亦產生ES小鼠之TT2細胞來源於F1雜交品系(C57BL/6×CBA)(Yagi等人，Anal Biochem. 14:70-6,1993)。

在某些方面，用以表現凝血因子之表現載體及核酸亦含有組織特異性啟動子。該等啟動子在技術領域中已知且包括(但不限於)肝特異性啟動子(例如，白蛋白；Miyatake等人，J Virol. 1:5124-32,1997；α-胎蛋白)、肌肉特異性啟動子(例如，肌凝蛋白輕鏈1(Shi等人，Hum Gene Ther. 8:403-10,1997,α-肌動蛋白))、胰腺特異性啟動子(例如，胰島素或升糖素啟動子)、神經特異性啟動子(例如，酪胺酸羥化酶啟動子或神經元特異性烯醇酶啟動子)、內皮細胞特異性啟動子(例如，溫韋伯氏因子；OZaki等人，Hum Gene Ther. 7:1483-90,1996)及平滑肌細胞特異性啟動子(例如，22a；Kim等人，J Clin Invest. 100:1006-14,1997)。其他組織特異性啟動子包括亦用於開發癌症療法之啟動子，包括酪胺酸酶特異性啟動子(Diaz等人，J Virol. 72:789-95,1998)、來源於人類芳香酶細胞色素p450(p450arom)之脂肪組織啟動子(參見美國專利第5,446,143號；Mahendroo等人，J. Biol. Chem. 268:19463 19470,1993；及Simpson等人，Clin. Chem. 39:317 324,1993)。進一步思忖啟動子為內源性凝血因子啟動子。可用於本發明之方法中的載體及其他核酸分子亦可包括限制轉殖基因暫時表現之序列。舉例而言，轉殖基因係由藥物可誘導性啟動子，藉由(例如)在啟動子中包括cAMP反應元件增強子及用cAMP調節藥物處理經轉染或受感染細胞控制(Suzuki等人，Hum Gene Ther. 7:1883-93,1996)。或者，抑制元件可防止藥物存在下的轉錄(Hu等人，Cancer Res 57:3339-43,1997)。亦藉由使用電離輻射(放射性療法)聯合ergl基因啟動子來實現表現之空間控制(Seung等人，Cancer Res 55:5561-5,1995)。

編碼人類凝血因子或人類MHC類基因之重組核酸構築體可插入任何合適之質體、噬菌體或病毒載體中以進行擴增，且藉此可使用技術領域中已知之方法，諸如Molecular Cloning A Laboratory Manual,第2版,Sambrook,Fritsch及Maniatis編(Cold Spring Harbor Laboratory Press:1989)中所述之彼等方法繁殖。在一具體態樣中，使用與真核細胞(諸如，脊椎動物細胞)相容之表現載體。真核細胞表現載體在技術領域中熟知且可自商業來源獲得。所涵蓋之表現載體含有原核序列(促進細菌中載體之繁殖)與一或多個在豬細胞中具有功能性之真核轉錄單元。通常，該等載體提供供插入所需重組DNA分子用之適宜限制位點。pcDNAI、pSV2、pSVK、pMSG、pSVL、pPVV-1/PML2d及pTDT1(ATCC編號31255)衍生之載體為適於轉染非人類細胞之哺乳動物表現載體之實例。此等載體中之一些經來自細菌質體(諸如，pBR322)之序列修飾，以便於原核細胞與真核細胞中複製及抗藥性之選擇。或者，諸如牛乳頭瘤病毒(BPV-1)或埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)(pHEBo、pREP衍生及p205)之病毒衍生物用於在豬細胞中表現蛋白質。質體製備及宿主細胞轉型中所採用之各種方法在技術領域中熟知。關於可用於本發明之其他合適表現系統以及通用重組程序參見Molecular Cloning A Laboratory Manual,第2版,Sambrook,Fritsch及Maniatis 編(Cold Spring Harbor Laboratory Press:1989)。

用於產生基因轉殖動物、尤其小鼠或大鼠之技術為人所熟知(Gordon,International Review of Cytology 115:171-229,1989)。可利用各種引入轉殖基因之方法，包括將核酸微注射至細胞中、逆轉錄病毒載體法及基因轉移至胚胎幹(ES)細胞中。若使用受精卵母細胞來產生基因轉殖動物，則將所需外來DNA或轉殖基因併入卵母細胞中。轉殖基因併入卵母細胞中係藉由若干方法(諸如，經由合適之逆轉錄病毒載體或藉由微注射)進行。技術領域中通常藉由將DNA微注射至自懷孕小鼠分離之囊胚中來產生基因轉殖小鼠，如頒予Leder等人之美國專利第4,736,866號中所述且如B. Hogan等人之標題為「Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual」，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.,U.S.A.(1986)所提供。亦參見例如Haren等人，Annu. Rev. Microbiol. 53:245-281，1999；Reznikoff等人，Biochem. Biophys. Res. Commun.,266(3):729-734，1999；Ivics等人，Methods Cell Bid.,60:99-131,1999；Hall等人，FEMS Microbiol. Rev. 21:157-1781997。美國專利6,492,575描述一種製備基因轉殖小鼠之方法，其藉由轉型ES細胞且將經轉型之細胞注射至四倍體囊胚中。藉由使雜合同胞異種交配來獲得帶有所需基因之純合動物。

此外，Capecchi等人描述一種將轉殖基因併入胚胎、胎兒或成人多能幹細胞中之方法(Science 244:1288-1292,1991)。在此方法中，胚胎幹細胞係自試管內培養之囊胚分離。使此等胚胎幹細胞在培養物中保持穩定，歷經多代細胞而不分化。接著藉由電穿孔或其他轉型方法將轉殖基因併入胚胎幹細胞中。選擇帶有轉殖基因之幹細胞且將其注射至囊胚之內細胞群中。接著將囊胚植入假孕雌性動物中。因為囊胚之內細胞群中並非所有細胞皆帶有轉殖基因，所以動物對於轉殖基因而言為嵌合的。嵌合動物之異種交配允許產生帶有轉殖基因之動物。該方法之概述係由Capecchi,Trendsin Genetics 1989,5:70-76提供。

轉殖基因之傳遞可藉由逆轉錄病毒傳遞系統實現，參見例如Eglitis等人，Adv. Exp. Med Biol. 241:19,1988。在一方面，逆轉錄病毒構築體為其中病毒之結構基因經單一基因置換，接著單一基因在病毒長末端重複序列(LTR)中所含之調節元件控制下轉錄的構築體。已使用多種單一基因載體骨架，包括莫洛尼鼠科白血病病毒(Moloney murine leukemia virus，MoMuLV)。在一具體態樣中，允許在內部啟動子控制下多次插入不同基因(諸如，可選擇性標記物之基因及所關注之第二基因)的逆轉錄病毒載體係來源於此類型骨架，參見例如Gilboa,Adv. Exp. Med Biol.241:29,1988。

構築用於表現蛋白質產物之載體的元件為熟習此項技術者所知。Chang等人，Int. J. CellCloning 7:264,1989中評述，當使用「強」啟動子(諸如，SV 40啟動子或LTR啟動子)來控制轉錄時，觀測到自逆轉錄病毒載體之有效表現。此等啟動子為原構性的且一般不允許組織特異性表現。本文中討論其他合適之啟動子。

使用封裝細胞系可增加所產生之重組病毒粒子之效能及感染性，參見Miller,1990,Human Gene Therapy 1:5。鼠科逆轉錄病毒載體可用於將基因有效轉移至鼠科胚胎中，參見例如Wagner等人，1985,EMBO J. 4:663；Griedley等人，Trends Genet. 3:162,1987，及轉移至造血幹細胞中，參見例如Lemischka等人，Cell 45:917-927,1986；Dick等人，Trends in Genetics 2:165-170,1986。

允許獲得比先前可能獲得的病毒力價高得多之病毒力價的另一逆轉錄病毒技術涉及藉由在親嗜性與兼嗜性封裝細胞系之間連續轉移(所謂「乒乓」方法)而擴增，參見例如Kozak等人，J. Virol. 64:3500-3508,1990；Bodine等人，Prog. Clin. Biol. Res. 319:589-600,1989。此外，用於增加病毒力價之技術允許使用含有病毒之上清液，而非用產生病毒之細胞系直接培育，以實現有效轉導，參見例如Bodine等人，Prog. Clin. Biol. Res. 319:589-600,1989。因為細胞DNA複製為逆轉錄病毒載體整合至宿主基因組中所需，所以可能需要增加標靶幹細胞積極循環之頻率，例如藉由用生長因子試管內處理來誘發標靶細胞分裂，參見例如Lemischka等人，Cell 45:917-927,1986；Bodine等人，Proc. Natl. Acad. Sci. 86:8897-8901,1989，或將接受者暴露於5-氟尿嘧啶，參見例如Mori等人，Jpn. J. Clin. Oncol. 14增刊1:457-463,1984。

在一些具體態樣中，思忖在將轉殖基因引入動物中期間，將轉殖基因插入內源性基因中，藉此剔除內源性基因之功能。在其他具體態樣中，將外源性基因插入動物基因組中之某一位置中，使得內源性基因之表現得以保護。因此，基因轉殖動物可表現對應於插入動物中之人類轉殖基因聚核苷酸之內源性聚核苷酸的全部或部分。

偵測免疫原性事件之方法

美國專利5,470,560及5,670,134描述一種偵測蛋白質免疫原性之方法，其使用含有編碼所關注之多肽之DNA序列的基因轉殖哺乳動物，所關注之多肽對於基因轉殖哺乳動物而言為異源的，且動物對其耐受，因為其被感知為內源性基因。向耐受性動物投予包含與所表現之轉殖基因類似或一致之多肽的製劑且使用放射免疫檢定或ELISA系統測定對多肽具特異性之抗體的形成。在一些具體態樣中，不同於5,470,560及5,670,134中所述之系統，本文所述之基因轉殖動物表現人類蛋白質以取代內源性基因。

思忖可用於鑑別對人類凝血因子轉殖基因具特異性之抗體的基因轉殖動物以類似於對照動物中內源性蛋白正常表現之水平表現人類凝血因子，且對由該人類轉殖基因編碼之蛋白質具有耐受性，亦即，當外源性投予該蛋白質時不會對蛋白質作出強烈免疫反應。

使對異源多肽具有耐受性之基因轉殖動物與包含有待於以任何方式分析旨在於無耐受性動物中誘發免疫反應之人類凝血因子之製劑接觸。在一具體態樣中，使用與製劑在其針對人類患者之活體內治療或診斷配置中之思忖投藥途徑、載劑及投藥頻率相同的投藥途徑、載劑及投藥頻率來使宿主動物與異源多肽接觸。若用於患者之注射液及緩衝液之劑量、途徑及時程尚未確立，則此等參數由臨床前動物研究或試管內實驗推導。在治療性蛋白質或多肽之狀況下，此可藉由在藥理學上可接受之等張載劑(諸如，生理食鹽水、5%右旋糖或磷酸鹽緩衝液)中非經腸、肌肉內或皮下投予。製劑中視情況包括免疫刺激劑或佐劑或新抗原。亦評估治療或診斷劑量之多次投予。在一具體態樣中，製劑含有由轉殖基因編碼之異源多肽。在另一具體態樣中，製劑含有由人類轉殖基因編碼之異源凝血因子多肽的片段、變異體或類似物。

在一種情況下，可能需要測定具有諸如更大溶解性或穩定性、對酶消化之抗性、改良生物半衰期及熟習此項技術者已知之其他特徵之所需特徵的多肽片段、變異體或類似物之免疫原性。在此狀況下，用於轉染以產生基因轉殖動物之DNA編碼異源多肽之天然主要胺基酸序列，而測試製劑含有具有作為天然異源多肽之片段、類似物或變異體之結構的異源多肽。

在另一具體態樣中，製劑含有可望在活體內與由人類轉殖基因編碼之異源多肽相互作用以在動物體內產生免疫原性或毒性反應的治療或診斷藥劑。舉例而言，用於投藥之製劑可包含與另一治療劑融合之異源蛋白質，其中該藥劑可為多肽、化學部分或技術領域中已知之其他治療劑。

視情況將測試製劑之免疫原性與該製劑中存在之任何天然及/或變性形式之蛋白質的免疫原性相比。此等形式之蛋白質分別為陰性及陽性對照。對於陽性對照，藉由熟習此項技術者已知之各種程序，諸如在100℃下加熱1-2分鐘或用變性劑(諸如，十二烷基硫酸鈉、7M氯化胍或8M脲)處理來使蛋白質變性。陽性對照將確定基因轉殖動物是否具有對所處理之蛋白質作出反應之免疫譜系以確保其在構形上為非天然的。另一免疫原性陽性對照係藉由將天然測試蛋白質與佐劑組合以增強基因轉殖宿主中之免疫反應來執行。另一陽性對照係使用來自第三來源(例如，牛生長激素、中國倉鼠tPA或豬因子VIII)之多肽。在某些具體態樣中，佐劑為已知增強尤其測試蛋白質之免疫原性或一般用以增強蛋白質之免疫原性的任何佐劑。兩種常用技術為使蛋白質在具有等體積弗氏完全(Freund's complete，FA)(針對第一次注射)或不完全佐劑(針對隨後之注射)之水性緩衝液中乳化或使用礬使蛋白質自溶液中共沈澱。接著將佐劑與蛋白質之混合物皮下或肌肉內注射至基因轉殖動物中。雖然注射時程可變化，但通常使用2週間隔之兩次注射來測試蛋白質之免疫原性。所測試之劑量可在每次注射1至1000μg之範圍內，包括每次注射1、2、5、10、15、20、50、100、150、200、250、300、50、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950及1000μg。

免疫檢定中之偵測劑可連接至可偵測部分或標記。可偵測部分或標記係指可藉由光譜學、光化學、生物化學、免疫化學或化學方式偵測之組合物。可偵測部分通常產生用以測定樣品中結合之可偵測部分之量的可量測信號，諸如放射性、顯色或螢光信號。在一些具體態樣中，可偵測部分係經由共價鍵或經由離子鍵、凡得瓦爾力(van der Waals)或氫鍵併入或連接至引子或探針，例如併有放射性核苷酸或由抗生蛋白鏈菌素識別之生物素標記核苷酸。可偵測部分可直接或間接偵測。間接偵測可涉及第二直接或間接可偵測部分與該可偵測部分結合。舉例而言(但不限於)，可偵測部分為結合搭配物(諸如生物素，其為抗生蛋白鏈菌素之結合搭配物；或核苷酸序列，其為其可特異性雜交之互補序列之結合搭配物)之配位體。結合搭配物自身可直接偵測，例如抗體自身可經螢光分子標記。在相關具體態樣中，結合搭配物亦可間接偵測，例如具有互補核苷酸序列之核酸為分支DNA分子之部分，分支DNA分子又可經由與其他經標記之核酸分子雜交來偵測。(參見例如PD. Fahrlander及A. Klausner,Bio/Technology 6:1165,1988)。藉由(例如)閃爍計數、光密度測定法或流動式細胞測量術來實現信號定量。

適用於本發明之免疫原性檢定方法中之標記的實例包括放射性標記(例如，³² P、³⁵ S)螢光團(例如，螢光素)、電子密集試劑、酶(例如，如ELISA中常用之酶)、生物素、地高辛或(例如)藉由將放射性標記併入半抗原或肽中而變得可偵測或用以偵測與半抗原或肽特異性反應之抗體的半抗原以及蛋白質。亦涵蓋抗血清或單株抗體有效針對之蛋白質或具有與標靶互補之序列的核酸分子、奈米標籤(nanotag)、分子質量珠粒、磁性劑、含有螢光染料之奈米或微米珠粒、量子點、量子珠粒、螢光蛋白、具有螢光標記之樹枝狀聚合物、微轉發器、供電子分子或分子結構或反光粒子。

思忖供本發明使用的其他標記包括(但不限於)螢光染料(例如，異硫氰酸酯螢光素、得克薩斯紅(Texas red)、若丹明(rhodamine)及其類似物)、放射性標記(例如，³ H、¹²⁵ I、³⁵ S、¹⁴ C或³² P)、酶(例如，辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶及ELISA中常用之其他酶)及比色標記(諸如，膠體金、有色玻璃或塑膠珠粒(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠等))及發光或化學發光標記(例如，銪(Eu)、MSD硫代標籤)。

根據技術領域中熟知之方法，標記可與檢定之所需組份直接或間接偶合。在一具體態樣中，使用異氰酸酯或N-羥基琥珀醯亞胺酯試劑來使標記共價結合組份以便接合可用於本發明之活性劑。在本發明之一方面，使用雙官能異氰酸酯試劑將標記接合至生物聚合物以形成未連接活性劑之標記生物聚合物接合物。標記生物聚合物接合物可用作合成本發明之經標記接合物的中間物或可用以偵測生物聚合物接合物。如上所指示，使用多種標記，其中標記視所需靈敏性、與檢定之所需組份接合的簡易性、穩定性要求、可用測試設備及配置規定來選擇。非放射性標記通常藉由間接方式連接。一般而言，配位體分子(例如，生物素)共價結合分子。接著配位體結合另一分子(例如，抗生蛋白鏈菌素)，該分子原本就可偵測或共價結合信號系統，諸如可偵測酶、螢光化合物或化學發光化合物。

在某些方面，可用於本發明之方法中的化合物(例如)藉由與酶或螢光團接合，直接接合至產生信號之化合物。適用作標記之酶包括(但不限於)水解酶、尤其磷酸酶、酯酶及糖苷酶或氧化酶、尤其過氧化酶。適用作標記之螢光化合物包括(但不限於)上文所列之彼等螢光化合物以及螢光素衍生物、若丹明及其衍生物、丹醯、繖酮、伊紅(eosin)、TRITC-胺、奎寧(quinine)、螢光素W、吖啶黃、麗絲胺羅丹明(lissamine rhodamine)、B磺醯氯紅素(B sulfonyl chloride erythroscein)、釕(參，聯吡錠)、銪、得克薩斯紅、煙醯胺腺嘌呤二核苷酸、黃素腺嘌呤二核苷酸等。適用作標記之化學發光化合物包括(但不限於)MSD sulfa-TAG、銪(Eu)、釤(Sm)、螢光素及2,3-二氫酞二酮，例如魯米諾(luminol)。關於可用於本發明之方法中的各種標記或信號產生系統的評述，參見美國專利第4,391,904號。

用於偵測標記之方式為熟習此項技術者所熟知。因此，舉例而言，在標記為放射性標記之情況下，偵測方式包括閃爍計數器(例如，放射免疫檢定、閃爍接近檢定)(Pitas等人，Drug Metab Dispos. 34:906-12,2006)或如自動放射線攝影術中之照相用膠片。在標記為螢光標記之情況下，其可藉由用合適波長之光激發螢光染料且偵測所得螢光(例如，ELISA、流動式細胞測量術或技術領域中已知之其他方法)來偵測。可藉由使用電子偵測器，諸如電荷耦合裝置(CCD)或光電倍增管及其類似物來視覺上偵測螢光。類似地，酶標記可藉由向酶提供合適受質且偵測所得反應產物來偵測。比色或化學發光標記可簡單地藉由觀測與標記有關之顏色來偵測。適用於本發明之方法中的其他標記及偵測系統將為一般熟習此項技術者顯而易見。該等經標記之調節劑及配位體係用於診斷疾病或健康狀況。

在一具體態樣中，可用於本發明之方法中的經標記組合物係連接至固體支撐物，包括(但不限於)過濾器、板或膜。進一步思忖經標記化合物可在溶液中標記且相互作用。舉例而言，捕捉抗體可經螢光共振能量傳遞(FRET)供體分子標記且標靶分子經FRET受體分子標記，使得當發生結合時該等分子接近。或者，標靶分子可經FRET供體標記且抗體分子經FRET受體標記。另一可能性為當標靶與抗體雜交時分離均存在於抗體或標靶上之淬滅與螢光分子。若標靶分子與試劑相互作用，則其僅足夠接近其標記而發射。此產生一系統，其中分子僅在其與試劑相互作用時發射(直接監測)。使用窄帶通過濾器來阻斷除分子標記波長外之所有波長。FRET分子對在技術領域中可購得(例如，自Invitrogen,Carlsbad,CA)，且可根據製造商之方案使用。使用光學成像技術，諸如CCD攝影機來偵測FRET發射。

偵測抗體-抗原相互作用之另一方法係用電子供體對其加以標記。此供體標記將向試劑結合之電接觸給與電子。參見例如Ghindilis,A. (Biochem Soc Trans. 28:84-9,2000)及Dai等人(Cancer Detect Prev. 29:233-40,2005)，其描述可用於電免疫檢定之酶及方法。接著藉由A/D(類比/數位)轉換器讀出電接觸且定量。電子數愈高，相互作用發生愈多。

如以引用的方式併入本文中之Schultz等人，Proc. Nat'l Acad. Sci .,97:996-1001(2000)所述，能夠進行單一分子偵測之標記的一具體態樣係使用電漿共振粒子(PRP)作為光學報導體。PRP為通常直徑為40-100nm之金屬奈米粒子，其因為金屬中之傳導電子發生集體共振(亦即，表面電漿共振)而以顯著效率彈性地散射光。與奈米粒子有關之電漿共振的程度、峰波長及譜帶寬度視粒子尺寸、形狀及材料組成以及局部環境而定。藉由在製備期間改變此等參數，形成在光譜可見區之任何地方具有散射峰之PRP。對於球形PRP，在較大半徑下峰散射波長與散射效率兩者均增加，提供一種產生不同顏色標記之方式。舉例而言，藉由調整製備期間球形之最終半徑，可再生地製備峰散射波長在目標波長數奈米範圍內之銀球體群。因為PRP明亮但具奈米尺寸，所以其用作單一分子偵測之指示物；亦即，視場中存在結合之PRP可指示單一結合事件。

在另一例示性具體態樣中，裝置為用於快速偵測凝血因子之測試條帶，使用免疫檢定方法，其中流動樣品中之凝血因子與固定凝血因子競爭結合有限的經標記之抗體結合位點。在該檢定程序中，體液樣品與經標記之抗體-染料接合物混合且沿多孔膜移動。當凝血因子濃度低於測試之偵測極限時，未結合之抗體-染料接合物結合固定在膜上之凝血因子受體接合物，在「陰性」測試區中產生色帶。反之，當凝血因子含量處於偵測極限或高於偵測極限時，游離凝血因子藉由結合抗體-染料接合物而與膜上之固定凝血因子接合物競爭，形成抗原-抗體複合物，且因此預防色帶形成。無論樣品中凝血因子含量如何，各對照區中均產生色帶，其用作證實試劑具有化學活性之品質控制量度。

亦使用奈米粒子衍生之技術偵測抗原-抗體複合物。參見例如Ao等人(Anal Chem. 78:1104-6,2006)其描述金奈米粒子淬滅，Chen等人(Biomaterials 27:2313-21,2006)，其描述抗體偵測中之SiO(2)/Au奈米粒子表面，及Lieu等人(J Immunol Methods. 307:34-40,2005)，其描述用於固體受質-室溫磷光免疫檢定(SS-RTP-IA)之含有二溴螢光素之二氧化矽奈米粒子。

對於本發明之方法而言，抗體或凝血因子可結合多種固體支撐物，包括(但不限於)過濾器、PVC膜、PDVF膜、PVC板及結合蛋白質之其他板、微載體、大固相珠粒、磁性珠粒(例如，由聚苯乙烯製成)、奈米粒子(諸如，雙金屬銀-金奈米粒子(Yan Cui等人，J. Phys. Chem. B,110:4002-06,2006))及聚醯胺膜(PAM)薄片(Sun等人，Analytical Letters 34:1627-37,2001)。

舉例而言，具有多重螢光分子填充物、不同材料、表面紋理、表面圖案等之微球用作鑑別標籤。思忖捕捉抗體或溶酶體酶均與珠粒共價結合且對抗相反結合搭配物以檢定血清中溶酶體酶特異性抗體之量。參見例如Current Protocols in Immunology,單元6.11)。目前螢光填充之微球可獲自Molecular Probes,Inc.及其他公司。目前可利用小至20nm直徑聚苯乙烯珠粒之微球。

使用技術領域中之標準方案，(例如)如支撐物之製造商所述，或使用技術領域中已知之標準化學交聯技術，將凝血因子或抗體連接至固體支撐物。參見例如Pierce Biotechnology,Inc.(Rockford,IL)交聯套組。

候選藥劑

可用於本發明之方法中鑑別耐受性破壞劑之候選藥劑在技術領域中可獲得。思忖可用於本發明之候選藥劑為任何有機或無機分子、錯合物或物質。例示性候選藥劑係自化學物質文庫、天然物質文庫或組合文庫獲得。

在一具體態樣中，藥劑係使用技術領域中已知之包括以下各者之組合文庫方法中多種方法中之任何方法獲得：生物文庫；空間可定位平行固相或溶液相文庫；需要解回旋之合成文庫方法；「一珠粒一化合物」文庫方法；及使用親和層析選擇之合成文庫方法。生物文庫方法限於多肽文庫，而其他四種方法可應用於多肽、非肽寡聚物或小分子化合物文庫(Anticancer Drug Des.,12:145,1997)。該等文庫可藉由熟習此項技術者製備(參見例如美國專利第4,528,266號及第4,359,535號及專利合作條約公開案第WO 92/15679號、第WO 92/15677號、第WO 90/07862號、第WO 90/02809號)或購自市售來源(例如，New England Biolabs Ph.D..TM.噬菌體呈現肽文庫套組)。

在本發明之一具體態樣中，有機分子係選自化學物質文庫，其中化學物質經個別檢定；或選自組合化學物質文庫，其中多種化合物同時檢定，接著解回旋以確定及分離最具活性之化合物。

許多化學物質文庫於技術領域中例如作為醫藥公司之專屬文庫存在，且該等文庫中之化合物為合適之候選藥劑。該等組合化學物質文庫之代表性實例包括由以下文獻所述之彼等文庫：Agrafiotis等人，「System and method of automatically generating chemical compounds with desired properties,」美國專利第5,463,564號；Armstrong,R. W. ,「Synthesis of combinatorial arrays of organic compounds through the use of multiple component combinatorial array syntheses,」WO 95/02566;Baldwin,J. J.等人，「Sulfonamide derivatives and their use,」WO 95/24186;Baldwin,J. J.等人，「Combinatorial dihydrobenzopyran library,」WO 95130642;Brenner,S.,「New kit for preparing combinatorial libraries,」WO 95/16918;Chenera,B.等人，「Preparation of library of resin-bound aromatic carbocyclic compounds,」WO 95/16712;Ellman,J. A.,「Solid phase and combinatorial synthesis of benzodiazepine compounds on a solid support,」美國專利第5,288,514號;Felder,E.等人，「Novel combinatorial compound libraries,」WO 95/16209;Lerner,R.等人，「Encoded combinatorial chemical libraries,」WO 93/20242;Pavia,M. R等人，「A method for preparing and selecting pharmaceutically useful non-peptide compounds from a structurally diverse universal library,」WO 95/04277;Summerton,J. E.及D. D. Weller,「Morpholino-subunit combinatorial library and method,」美國專利第5,506,337號;Holmes,C.,「Methods for the Solid Phase Synthesis of Thiazolidinones,Metathiaza ones,and Derivatives thereof,」WO 96/00148;Phillips,G. B.及G. P. Wei,「Solid-phase Synthesis of Benzimidazoles,」Tet. Letters 37:4887 90,1996;Ruhland,B.等人，「Solid-supported Combinatorial Synthesis of Structurally Diverse .beta.-Lactams,」J. Amer. Chem. Soc. 111:253 4,1996；Look,G. C.等人，「The Identification of Cyclooxygenase-1 Inhibitors from 4-Thiazolidinone Combinatorial Libraries,」Bioorg and Med Chem. Letters 6:707 12,1996。

本發明之候選藥劑包括融合蛋白、多肽、肽模擬物、前藥、受體、結合劑、核糖酶、小分子、肽、抗體或針對調節對凝血因子蛋白質之耐受性之能力進行篩檢的其他藥物。例示性候選藥劑包括(但不限於)盤尼西林、氟達拉濱、干擾素-α、化學治療劑、抗生素、抗精神病劑、toll樣受體之配位體、促發炎性細胞介素及誘發促發炎性細胞介素在活體內釋放之任何其他化合物。

toll樣受體之配位體描述於(例如)Jin等人，Immunity 29:182-91,2008及Wales等人，Expert Rev Vaccines. 6:971-80,2007中。

若在向基因轉殖動物投予人類凝血因子後，使用如上所述之任何免疫檢定或其他抑制劑檢定(諸如，Bethesda Unit量表檢定)偵測到抗凝血因子抑制子之存在，則將候選藥劑視為耐受性破壞劑。

套組

套組亦涵蓋在本發明之範疇內。典型套組可包含特異性結合人類凝血因子之視情況連接至可偵測標記的第一抗體及含有已知量之凝血因子的凝血因子標準物。其他組份視情況可包括用於進行免疫檢定之試劑，諸如連接至結合凝血因子或第一抗體之可偵測標記之第二抗體；若該標記為酶，則套組亦可包括該酶自其釋放可偵測信號之受質。

本發明之其他方面及詳情將自以下實施例顯而易見，該等實施例意欲為說明性而非限制性。

實施例 實施例1人類因子VIII敲入基因轉殖小鼠

為研究因子VIII(FVIII)之抑制劑對FVIII活性的活體內作用，培育表現人類FVIII[Genbank寄存編號NM_000132(同功異型a前驅體)、NM_019863(同功異型b前驅體)]以取代鼠科基因之小鼠。

對於FVIII敲入小鼠而言，使用pB1ue-FVIII載體(#307，圖1A)產生含有人類FVIII之全長cDNA之質體。經由Xho1/Not1限制酶自pB1ue-FVIII #307質體切割FVIII cDNA(7.2kB)，使其變性，且使用製造商之方案使用基因提取套組(Qiagen,Valencia,CA)純化FVIII插入物。接著將FVIII插入物插入pCMV-Sport6載體(Gibco BRL)(圖1)或肝特異性表現載體pBS-A1b/aFeto(Ke1lendonk等人，Genesis 126:151-53,2000)中。

為選殖至pCMV-Sport6載體中，使用限制酶Sal1/Not1切割載體，使用APEX^TM (熱不穩定性鹼性磷酸酶，得自Epicentre,Madison,WI)使其脫去磷酸且變性，接著進行瓊脂糖凝膠電泳。獲得4.4kb及21bp之片段。使用凝膠提取套組(Qiagen)清洗載體片段。使用LIGATE-IT^TM 接合套組(USB,Cleveland,OH)將所製備之FVIII插入物接合至pCMV-Sport6載體中，且將質體轉型至OMNIMAX2^TM -T1r細菌細胞(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。使純系於LB培養基中生長且藉由miniprep(Qiagen)分離質體。接著藉由使用Xho1或Kpn1限制酶進行酶消化，接著進行瓊脂糖凝膠電泳來分析10個純系。接著使用midipreps(Qiagen)分離恰當純系。使用Sal1/Xho1/pvu1酶自所產生之有義pCMV-Sport6-FVIII(11.6kb)切割插入物。獲得7.2kb及4.4kb之片段。自瓊脂糖凝膠提取7.2kb片段(FVIII插入物)且使用凝膠提取套組(Qiagen)清洗。

使用T4接合酶(Fermentas,Ontario,Canada)將自pCMV-Sport6-FVIII載體清洗之FVIII插入物接合至所製備之標靶載體pBS-A1b/aFeto(圖1B)中。將該物質轉型至OMNIMAX2^TM -T1R細菌細胞(Invitrogen)中。使純系於LB培養基中生長且進行minipreps以分離質體。藉由以Xho1及SacII/Xba1、Not1、Pvu1及SexA1酶限制，接著進行瓊脂糖凝膠電泳來檢查純系。獲得有義及反義純系(20.1kb)。接著，使pBS-A1b/aFeto-FVIII有義質體之一純系於LB培養基中生長且接著使用Gigaprep方案(Qiagen)分離。藉由以Xba1、SacII/Xba1、Not1及BglII酶消化，接著進行瓊脂糖凝膠電泳來檢查質體。藉由VBC Biotech Service GmbH(Austria)執行序列分析。

為產生基因轉殖小鼠，將以上質體用Xho1限制酶線性化且於Tris緩衝液(50mM Tris-HCl(pH 8.5)、10mM MgCl₂ 、50mM NaCl)中傳遞。將質體微注射至自E17血友病小鼠(C57BL/6J背景上E17ko缺失)或自等人(Exp Physiol 85:589-601,2000)之野生型C57BL/6J小鼠獲得的受精卵母細胞之雄原核中。

選擇陽性純系注射至囊胚中且產生嵌合細胞。自懷孕之C57BL/6J雌性小鼠分離囊胚。將含有人類FVIII之陽性ES純系注射至囊胚中，且將經注射之囊胚再植入OF1假孕雌性小鼠中。最初使用塗色標記物評估ES細胞之存在。接著將嵌合體與C57B1/6品系交配以繁殖F1子代。

實施例2人類vWF敲入基因轉殖動物

溫韋伯氏因子(vWF)[Genbank寄存編號NM_000552]為血小板正常黏著至內皮下膜以進行初期止血所需，且與使因子VIII穩定有關。vWF在內皮細胞中合成為前原vWF且經細胞間隙加工成前肽及成熟vWF。vWF疾病為一種常見遺傳性出血病症，其具有大量亞型，該等亞型具有一共同特徵：均涉及原vWF缺乏。已使用剔除策略(Denis等人，Proc Natl Acad Sci. USA 95:9524-29,1998)產生vWF疾病之小鼠模型，其模擬嚴重人類vWF疾病(III型)。將重組人類vWF注射於vwf剔除小鼠中使FVIII穩定，表明人類蛋白質在鼠科宿主中可正常地發揮作用。為產生對人類vWF蛋白耐受之動物模型(其允許評估向人類患者投予之vWF化合物)，培育出vWF之人類化小鼠模型，其中鼠科vWF由人類vWF置換。

小鼠vWF基因係位於染色體6上且擴展長度為154.1kB。該基因包含57個由56個內含子分隔之外顯子。為插入人類基因，決定將人類基因插入小鼠基因之第一編碼區中的外顯子6及7上。為開始該方案，首先需要選殖在小鼠中將作為人類基因之插入點之同源序列(圖3)。產生三個獨立純系：(1)含有介於外顯子4與5之間的5'序列，用以產生標靶載體之5'長同源臂之遠端部分的約3.6kb片段LAdi；(2)含有外顯子5及相鄰內含子序列，用以產生5'長同源臂之近端部分的約4.7kb片段LApr；(3)位於外顯子6下游且用以產生標靶載體之3'短同源臂的約3.8kb片段SAmax，且用於陽性對照載體。圖2A及2B展示用於將人類vWF基因選殖至基因轉殖動物中之代表性載體。

為產生vwf純系，在以下條件下使用表1中之引子，對基因組129/Sv Pas ES細胞DNA執行DNA擴增：94℃下2min，1次循環，及94℃下30秒，65℃下30秒及68℃下7分鐘，15-20次循環。經由TA選殖將PCR產物次選殖至pCR4-TOPO載體(Invitrogen)中。TA選殖利用DNA聚合酶之末端轉移酶活性(Taq)且將單一3'-A懸垂物添加至PCR產物之各末端。此可將此PCR產物直接選殖至具有單一3'-T懸垂物之線性化選殖載體中。所得質體表示為TOPO-LAdi、TOPO-LApr(或TOPOP-LApr-mod)及TOPO-SA-T1。

產生含有人類vwf 基因之標靶載體(1-HR)，其包含：與129 SV/PAS ES細胞系基因組同基因之同源區；以人類vwf 基因置換小鼠vwf 之編碼區；側接有LoxP 重組位點之陽性選擇新黴素基因；及白喉毒素(DTA)陰性可選擇性標記物。對於人類化vwf 載體而言，藉由將標靶載體轉染至表現Cre 之細菌中來切除選擇卡匣。

為產生標靶載體，首先產生含有來自KpnI-MluI-HpaI-Mfel限制以及242-bp Tg 3'部分合成(除去EcoR'V至EcoRI)之人類vWF序列及BstBI-EcoRI-Sacl限制位點的合成片段script-Tg連接子[script-Tg連接子，GGTACCGGACGCGTGTTAACCAATTGCCGATATCCACTACTGCCAGGGCAAATGTGCCAGCAAAGCCATGTACTCCATTGACATCAACGATGTGCAGGACCAGTGCTCCTGCTGCTCTCCGACACGGACGGAGCCCATGCAGGTGGCCCTGCACTGCACCAATGGCTCTGTTGTGTACCATGAGGTTCTCAATGCCATGGAGTGCAAATGCTCCCCCAGGAAGTGCAGCAAGTGAGGCTGCTGCAGCTGCATGGGTGCCTGCTGCTGCCGGCTTCGAATCGAATTCTGGAGCTC-(SEQ ID NO:7)]。

此等位點允許後續選殖步驟僅使用內聚接合執行，因此保證構築步驟之效率及速度。所引入之位點亦便於使用南方墨點分析來驗證同源重組及重組酶切除事件且為標靶載體提供獨特線性化位點。

接著形成較大連接子片段GA1-連接子，其包含Pac1-PmeI-HpaI限制位點以及EcoRI至NheI之LAdi 3'合成、NsiI至內含子5之LA 3'部分合成3'末端及M1u1-Mfe1-BsiW1-SnaB1-Avr11-Nru1-Asc1限制位點，其產生906 bp GA1連接子片段[GA1連接子，ATTAATTAAGTTTAAACGAGTTAACTAGAATTCTGGCTTTATTAATCTCTGTTCTTCACATTCTTCCATGCACTTTTGTCTGAAGTCTGACAAATACGAGAACCTTAAAATACTCTGCGATTGTCACTGCCCTTTGTGCCTACTGTCTAGTTCTCTGGCTCCACCTTGTTCTCCTTTTTACGTCTTTTTCTTGAAACCGTACCGTAAGCATTGCCCATCTTCCTGCCTCAGCCCCCTGTTTATTTATTACTTTAACTTTTTAATTTCTCACTATTACTGTTATTGTCTTATGAAGTCACTGCCTGTTCACATTTACCTCATAACTACCAAATTCTCTGTTGATTTTTTTTTTTTTTTTTGAGACAGGGTTTCTCTGTGTAGCCCTGGCTGTCCTGGAACTCACTCTGTAGACCAGGCTGGCCTCAAACTCAGAGATCCGCCTGCCTCTGCCTCCCGAGTGCTGGGATTAAAGGCATGCGCCACCACTGCCAGGCCTCTCTGTTGCTTTTTATTTCTAGCATTTTCTCTCTGGGTTTAACTTCCTTCTTCCTGAAGAACCTTCTTTAGCAGTCCATTCAGCAAGGCAGGGGATGGCAAGCTCATCTTTTTCTGGCAAGAGAAGATGGCCCTAACTCTGAATGATGACTTAGTTCTGGGAACTAGTTACTACGCCCTCTTCCACAGCACTCAGACCTAACTCATCTGAGACCGATCTCTGTGACTATGTGCAGGCTGTTGAGTGGCTAAGGAAACAGTCCTGGCTAGCACATGCATTGATGGTAGCTTGTCCTTGCCACCTCTCTGGACGGTGAGAACCAGCTCATTTCCTTTTTATTTTATTTTATTTTGCAGACGCGTTGCAATTGCGTACGCTTACGTAGTCCTAGGAATCGCGATTGGCGCGCC(SEQ ID NO:8)]。接著將包含小鼠vwf 之SwaI、Eco4711及Bsu361限制位點之序列插入含有新選擇卡匣之G2載體(GenOway,Lyon,FR)中。此載體稱為G2-mod載體。

為產生陽性對照載體，將自TOPOLadi-T4質體分離之2306bp HpaI/EcoRI LAdi片段接合至GA1載體中，產生LAdi載體(6061bp)。為插入轉殖基因，使用MfeI/EcoRV將自1-cDNA質體分離之8268bp EcoRI/EcoRV片段接合至script-Tg載體中(該質體稱為1-Tg載體)。將聚A序列(自G136分離之632bp C1aI/EcoRI)插入1-Tg載體中之BstI/EcoRI位點上(1-TG-pA載體)。

接著將來自TOPO-LApr質體之4255bp NheI/NsiI片段接合至LAdi載體中(1-LA載體)。為插入新短臂片段，將來自SA-C+質體之3672bp SmaI/NheI片段接合至1-LA載體中(1-SA載體)。為插入轉殖基因，將來自1-Tg-pA質體之9155bp MluI/EcoRI片段插入1-LA載體中，產生1-LA-C+載體。為將長同源臂插入標靶載體中，將自LA-C+載體分離之15314bp PmeI/BsiWI片段插入1-SA載體。此為最終標靶載體之一種型式，稱為1-LSA載體。為插入白喉毒素陰性可選擇性標記物，將自1-LSA載體分離之19013 AscI/PmeI片段插入G141質體(GenOway)中，產生最終標靶載體1-HR。

藉由將自TOPO-SA-T1質體分離之3258bp Bsu361/DraI片段接合至使用Bsu361/Eco47III切割之G2-mod載體中來產生上文提及之SA-C+載體作為短同源臂陽性對照。

PCR篩檢及南方墨點分析證實切除事件以及ES細胞中陽性選殖的鑑別。使用以下條件執行南方墨點法：在4×SSC、1% SDS、0.5%脫脂乳、20mM EDTA中65℃下雜交18小時；洗滌2次，在3×SSC、1% SDS中65℃下洗滌15分鐘，接著在2×0.5×SSC、1% SDS中65℃下洗滌1分鐘。

為插入ES細胞中，由Nru1將1-HR載體線性化且藉由苯酚/氯仿萃取及乙醇沈澱將其純化。藉由電穿孔將129 Sv/PAS ES細胞以線性化1-HR載體轉染(5×10⁶ 個ES細胞，40μg線性化質體，260V，500μF)且於G418選擇培養基(200μg/ml G418)中生長。將G418抗性純系分離且在96孔板中擴增。藉由PCR(94℃下2分鐘，1次循環；94℃下30秒，65℃下30秒，68℃下5分鐘，35次循環；68℃下8分鐘，1次循環)使用引子GX1406 5’-CTACTTCCATTTGTCACGTCCTGCACG-3’(SEQ ID NO:9)及GX6310 5’-CAGCTCCTGCCTTGTTACTGTGACCC-3’(SEQ ID NO:10)針對重組事件篩檢陽性純系，產生2872bp之片段。

使用5'同源重組策略之另外南方墨點分析偵測到陽性純系中存在恰當野生型(6865bp)及重組事件(14897bp)。使用3'同源重組策略之南方墨點分析產生9470bp之野生型片段及11080bp之重組事件片段。雜交亦證實ES細胞不帶有其他無規整合之DNA副本。

選擇四個陽性純系注射至囊胚中且產生嵌合細胞。自懷孕之C57BL/6J雌性小鼠分離囊胚。將含有人類vwf 之陽性ES純系注射至囊胚中，且將經注射之囊胚再植入OF1假孕雌性小鼠中。最初使用塗色標記物評估ES細胞之存在。產生在50%至80%之範圍下的嵌合體。接著將嵌合體與C57B1/6及Cre 刪除品系交配以繁殖F1子代。

活體內重組事件可如上藉由南方墨點分析監測。為誘發活體內重組事件及產生人類化vwf 等位基因，將帶有轉殖基因之目標動物與表現Cre重組酶之「刪除」小鼠交配(參見例如Tang等人，Genesis 32:199-202,2002；Jorgez等人，Genesis 44:183-8,2006)。

實施例3人類因子VII敲入基因轉殖動物

因子VII[Genbank 寄存編號NM_000131(同功異型a前驅體)、NM_019616(同功異型b前驅體)]為凝血級聯中之重要分子，且缺乏因子VII引起出血病症及刺激凝血路徑之能力下降(Osterud B.,Blood Coagul Fibrinolysis 1:175-81,1990)。先天性缺乏FVII已用血漿衍生及重組FVII來治療(Bauer K.,Haemostasis 26增刊1:155-8,1996)。

為產生表現人類因子VII基因之人類化基因轉殖小鼠，由EcoRI消化含有因子VII cDNA之pB4-FVII載體以提取該cDNA。將FVII cDNA接合至含有白蛋白特異性啟動子之pBS-A1b/αFeto載體中。首先藉由XhoI限制消化製備pBS-A1b/αFeto載體且接著使用小牛腸磷酸酶(CIP)處理脫去磷酸。克倫諾(Klenow)處理後，使用Quick接合酶(Ozyme,France)將FVII cDNA接合至pBS-Alb/αFeto載體中。藉由限制消化及瓊脂糖凝膠分析來驗證重組純系。

藉由NotI消化pBS-A1b/αFeto載體以提取FVII轉殖基因以插入GATEWAYpENTRY載體中。首先用DraI及EcoRV消化含有白蛋白啟動子、聚A序列及α胎蛋白增強子之pENTRY載體且如上用CIP處理脫去磷酸。克倫諾處理後，使用Quick接合酶將FVII cDNA接合至pENTRY載體中且使用PCR及凝膠分析確證純系插入。

接著將FVII cDNA自pENTRY載體移除且插入含有人類HPRT基因之部分的GATEWAYpDEST^TM 載體(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。藉由pENTRY及pDEST質體(圖4)上attR1與attR2重組位點之間的同源重組來將轉殖基因插入。藉由限制分析來分析重組事件及純系插入。將所得載體由PvuI線性化，苯酚/氯仿萃取，且電穿孔至ES細胞中。

所用ES細胞為顯示基於鼠科C57B1/6及129基因組之雜交背景的BPES細胞。將FVII轉殖基因插在ES細胞之hprt對接位點上。接著將仍表現功能hprt基因之陽性純系在HAT(次黃嘌呤、胺基喋呤、胸苷)培養基中選擇。HPRT表現之喪失致使細胞對在HAT培養基中生長敏感。接著如上所述將陽性純系微注射至囊胚中。

實施例4表現人類凝血因子及人類MHC基因之雙重基因轉殖小鼠

雖然表現人類蛋白質之基因轉殖小鼠可用以測定人類蛋白質在作為治療劑向耐受性動物投予時之潛在免疫原性，但量測外源性投予之蛋白質之免疫原性的另一方法係評估蛋白質在人類免疫系統之背景下之免疫原性。為刺激自體抗體之產生，外源性肽必須在天然MHC蛋白質之背景下呈遞給T細胞。在典型免疫反應期間，外原性抗原被表現MHC I類或II類分子之抗原呈遞細胞吸收，該抗原在細胞質中加工成其抗原性抗原決定基片段，且肽抗原決定基呈遞於抗原呈遞細胞之表面上MHC I類或II類分子之袋中。T細胞表面上之同源T細胞受體與MHCII-抗原複合物結合使可能導致抗體產生之事件級聯活化。

為確定人類凝血因子之哪些肽在人類環境之背景下具有抗原性，可將表現人類凝血因子之基因轉殖非人類哺乳動物修飾以表現人類MHC基因。通常，在所投外源性蛋白質並非微生物蛋白質的狀況下，該蛋白質將由MHC II類蛋白質吸收及呈遞。因此，為測定人類凝血因子在人類免疫系統之背景下之免疫原性，將上述Tg動物進一步修飾以表現人類MHC II類基因以取代天然II類基因。

缺乏內源性II類蛋白質之基因轉殖小鼠在技術領域中已知。參見例如Madsen等人，Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:10338-343,1999，其描述使用靶向破壞內源性基因來產生缺乏所有內源性MHC II基因之Tg小鼠。此外，表現人類MHC II類基因之小鼠在技術領域中已知。參見例如Fugger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91,6151-6155,1994，其描述表現人類DR4基因及人類CD4蛋白質之小鼠；及Cheng等人，Journal of Autoimmunity 21:195-199,2003，及Madsen等人，Nature Genetics 23:343-47,1999，兩者均描述表現人類MHC II DR及DQ蛋白質之Tg小鼠。

在第一種方法中，使表現人類凝血因子之基因轉殖動物與表現人類主要組織相容性(MHC)基因之同一物種之基因轉殖非人類哺乳動物雜交。藉由使表現人類凝血因子之基因轉殖動物與表現人類MHC II類基因之第二動物雜交來製備雙重基因轉殖動物，使得後代將表現兩種轉殖基因。舉例而言，使基因轉殖人類vWF小鼠(Tg-hu vWF)、Tg-hu FVIII、Tg-hu FVII、Tg-hu FIX小鼠或表現不同人類凝血因子之小鼠與表現所關注之人類MHC II類基因(包括(但不限於)人類DR2、DR4或DQ基因)之Tg小鼠雜交。參見例如WO2006/056769；Madsen等人，Nature Genetics,上文；及Cheng等人，上文。接著使用技術領域中已知之技術，諸如轉殖基因序列插入之PCR確證來將小鼠基因分型，以鑑別具有雙重基因轉殖基因組之個體。

使用一替代方法，將來自表現人類凝血因子之Tg動物的胚胎進一步修飾以表現編碼人類MHC II類基因之第二轉殖基因。舉例而言，將胚胎自如先前實施例中所述之懷孕Tg雜合或純合Tg-hu vWF、Tg-hu FVIII、Tg-hu FVII或Tg-hu FIX小鼠分離，且接著以編碼人類MHC II類基因之表現匣(諸如WO2006/056769；Madsen等人，Nature Genetics,上文；及Cheng等人，上文中所述之彼等)轉型。接著將雙重基因轉殖胚胎植入假孕小鼠中且如上所述培育雙重基因轉殖小鼠。藉由使用技術領域中已知之技術，諸如轉殖基因序列插入之PCR確證，進行基因分型，將小鼠正性確定為雙重基因轉殖。

表現人類凝血因子基因與人類MHCII基因兩者之小鼠將對人類凝血因子具有耐受性，且在外源性蛋白質引起抗原特異性抗體產生之情況下，其亦將在人類免疫系統之背景下呈遞抗原。使用人類MHC基因允許呈遞天然抗原決定基，且因此測定在人類患者中具有免疫原性之外源性投予之蛋白質(諸如，凝血因子)之部分。鑑別抗原決定基有助於開發用於患有凝血及凝固障礙之患者的改良療法。

實施例5篩檢對人類蛋白質具有耐受性之動物中針對外源性投予之蛋白質之抗體

表現人類因子VIII、人類vWF、人類因子IX或人類因子VII轉殖基因及視情況亦表現人類MHC II類之人類化小鼠應在外源性投予相關人類蛋白質時對該蛋白質具有耐受性。人類化動物可篩檢針對所關注蛋白質之抗體的自發形成，且檢定在向人類化動物投予外源性蛋白質或其變異體後抗自身抗體之形成。

為測試任何內源性抗自身抗體之產生，藉由ELISA或放射免疫檢定使用對凝血因子具特異性之單株抗體重測人類化小鼠中對血液因子具特異性之抗體的含量。舉例而言，在人類化vWF小鼠中，自表現人類vWF蛋白質之動物獲得血清樣品，且藉由ELISA檢定抗vWF特異性抗體之基線含量(參見例如Soff等人，J Lab Clin Med. 121:424-30,1993；及Mohri等人，Blood 91:3623-9,1998)。簡言之，在22℃下將來自個體之血清樣品以增加之濃度添加至塗有vWF之96孔聚苯乙烯板之孔中，歷時1小時。在以PBS、0.05% Tween 20洗滌後,將辣根過氧化酶(HRP)接合之同型特異性Ig添加至各孔中。接著添加過氧化酶受質(鄰苯二胺；Zymed)且使用2mol/L H₂ SO₄ 使反應停止。接著將偵測到之抗體之量與標準曲線相比較且確定抗vWF抗體含量。

接著向動物投予可用於治療之經純化之人類vWF或人類vWF蛋白之片段、類似物或變異體，且在指定時間點評估抗vWF血清含量。在不同時間點取血清樣品，包括(但不限於)投予治療性蛋白質後第4小時、第12小時、第24小時、第48小時及第72小時。當治療性蛋白質經多次給藥或在隨後數週中給與時，在向宿主動物再次投予治療性蛋白質後重複取血清樣品，以確定抗原特異性抗體的形成是否得以延遲。如上所述，藉由ELISA檢定血清樣品。

上述抗原特異性抗體檢定或類似檢定亦可使用FVII或FVIII人類化動物進行。參見例如Lindgren等人，Haemophilia 8:644-8,2002及Sahud等人，Haemophilia 13:317-22,2007，其描述偵測抗FVIII抗體之ELISA檢定。簡言之，使用技術領域中已知之方案及技術，將經純化之FVIII塗在受質(通常為聚苯乙烯板)上，接著在洗滌及阻斷步驟後，將推斷含有抗FVIII抗體之血清樣品用塗有FVIII之板培育。將板洗滌以移除過量抗體及血清且使用熟知之偵測方法偵測經結合之抗體，例如使用同源偵測試劑偵測接合偵測酶(例如，鹼性磷酸酶或辣根過氧化酶)之抗同型抗體。

類似檢定可用於偵測針對FVII之抗體。使用標準ELISA方案將人類FVII塗至96孔板。將自人類化FVII動物分離之血清塗覆至塗有FVII之孔。接著如上所述偵測FVII特異性抗體。

實施例6基因轉殖動物中FVII及FVIII RNA之表現

為確定人類因子VII(huFVII)在huFVII基因轉殖小鼠中之基因表現模式，使用定量聚合酶鏈式反應(QPCR)；分析九種器官之轉殖基因表現：肝、淋巴結、肺、脾、腎臟、心臟、骨髓、大腿肌肉及腦。

採集器官且將其立即置放於RNA穩定試劑(RNAlater,Qiagen,Germantown,MD)中以便儲存及運輸。根據RNeasy Mini套組(Qiagen,目錄號74104)之方案分離器官之RNA。測定經分離之RNA的濃度且相應稀釋。使用gDNA清除緩衝液(QuantiTect逆轉錄套組之部分,Qiagen)自RNA製劑中移除剩餘量之污染性基因組DNA。根據QuantiTect逆轉錄套組之方案自RNA樣品合成逆轉錄cDNA。

使用以下設置進行器官組中huFVII基因表現之定量(4隻雄性huFVII基因轉殖小鼠)。

引子：huFVII MS2，正向，5'GAA TGG AGC TCA GTT GTG 3'(SEQ ID NO:11)；huFVII MS2，反向，ATC AGG TTC CTC CAG TTC 3'(SEQ ID NO:12)。

使用PerfeCTa SYBR Green PCR MasterMix,Quanta Biosciences(Gaithersburg,MD)及Applied Biosystems 7500快速即時PCR系統及7000即時PCR系統(Foster City,CA)使用以下參數建立PCR：活化，95℃下10min：DNA變性，95℃下15秒，40次循環；黏接/伸長：58℃下1min。

表2中所示之結果(由Ct值分等級(n.d.=未可偵測))指示在所研究之所有動物之肝中發現最高人類FVII RNA表現。

為確定人類因子VIII(huFVIII)在人類因子VIII基因轉殖小鼠中的基因表現模式，使用定量聚合酶鏈式反應(QPCR)。研究huFVIII小鼠之三個不同亞系，且研究huFVIII在以下8種器官中之表現：肝、淋巴結、肺、脾、腎、心臟、大腿肌肉及新生胸腺。

採集器官且將其立即置放於RNA穩定試劑中以便儲存及運輸，且如上所述製備RNA。

如下所述進行器官組中huFVIII基因表現之定量。

為確證不存在污染gDNA且檢查cDNA完整性，使用內源性對照[小鼠ACTB(肌動蛋白，β)、VIC/MGB探針(Applied Biosystems目錄號4352341E)]。

使用以下探針及引子將人類FVIII RNA擴增：探針：huFVIII-FAM：CCAAAGCTGGAATTTGGCGGGTG-BHQ(SEQ ID NO:13)(包含螢光團/淬滅劑對FAM/黑洞淬滅劑(BHQ)染料)；正向引子huFVIII：GGCACTGTACAATCTCTATCCAGGT(SEQ ID NO:14)；反向引子huFVIII：GATGCTCGCCAATAAGGCAT(SEQ ID NO:15)使用Taqman Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems)在Applied Biosystems之7500快速即時PCR系統及Applied Biosystems之7000即時PCR系統上使用以下參數進行PCR：活化，95℃下10min，40次循環：DNA變性，95℃下15秒；黏接/伸長：60℃下1min。

結果指示在亞系E及I之肝中發現最高huFVIII RNA表現。3個亞系每一者之2隻雌性及2隻雄性小鼠的Ct值展示於表3-8中。

表3展示在huFVIII基因轉殖小鼠亞系E之2隻雌性小鼠及2隻雄性小鼠的肝、腎、心臟、肺、淋巴結、肌肉、脾中的huFVIII表現(n.d.=未可偵測)。

表4展示huFVIII基因轉殖小鼠亞系E之2隻雌性小鼠及2隻雄性小鼠之新生胸腺中的huFVIII表現。

表5展示huFVIII基因轉殖小鼠亞系G之2隻雌性小鼠及2隻雄性小鼠的肝、腎、肺、淋巴結、肌肉及脾中的huFVIII表現(n.d.=未可偵測)。

表6展示huFVIII基因轉殖小鼠亞系G之2隻雌性小鼠及2隻雄性小鼠之新生胸腺中的huFVIII表現。

表7展示huFVIII基因轉殖小鼠亞系I之2隻雌性小鼠及2隻雄性小鼠的肝、腎、肺、淋巴結、肌肉及脾中的huFVIII表現(n.d.=未可偵測)。

表8展示huFVIII基因轉殖小鼠亞系I之2隻雌性小鼠及2隻雄性小鼠之新生胸腺中的huFVIII表現。

RNA分析證明轉殖基因在所產生之所有三個基因轉殖小鼠亞系的肝及新生胸腺中表現。此等器官在動物免疫系統產生期間高度相關，且新生胸腺中之表現通常會引起對免疫系統發育期間胸腺中表現之蛋白質的耐受性。

實施例7基因轉殖小鼠對外源性天然人類FVIII或FVIIa具有耐受性

為確定表現人類血液因子之基因轉殖小鼠對後續投予人類天然蛋白質是否具有耐受性，使血友病小鼠(FVIII剔除)與如上所述之表現人類FVIII之小鼠(亞系E、G及I)雜交。向小鼠投予人類FVIII且隨後量測抗FVIII抗體反應。

以每週間隔向基因轉殖小鼠之三個亞系(亞系E、G及I)靜脈內投予huFVIII之劑量，每一劑量為於200μL體積中之200ng huFVIII(ADVATE,Baxter Healthcare SA,Vienna,Austria)。在4次或8次每週一次給藥後取血清樣品且使用標準ELISA方案量測抗FVIII抗體力價。

結果證明當進行4次或8次每週一次給藥(圖5A及5B)時，亞系G中之小鼠產生抗FVIII抗體。亞系E及I中之小鼠在任一給藥攝生法中均不產生抗FVIII抗體。此等研究展示3個基因轉殖亞系中之兩者對人類FVIII具有耐受性。此外，分析特異性IgG亞類及IgA之抗體力價。

結果證明當給與8次每週一次FVIII給藥時亞系G之小鼠產生IgG亞類IgG1、IgG2a、IgG2b及IgG2c之抗FVIII抗體，但未產生IgA抗體(圖6A、6B及6C)。當給與8次每週一次FVIII給藥時，亞系E之小鼠不產生任何抗FVIII抗體。當給與8次每週一次FVIII給藥時，亞系I之4隻小鼠中有1隻產生IgG亞類IgG1、IgG2a及IgG2b之抗FVIII抗體。此等結果證明亞系E之小鼠對人類FVIII完全耐受，亞系I之小鼠對人類FVIII部分耐受，且亞系G之小鼠對人類FVIII不耐受。

為確定表現人類FVIIa之基因轉殖小鼠對外源性蛋白質是否具有耐受性，在投予外源性FVIIa(Baxter Healthcare SA,Vienna,Austria)後針對抗FVIIa抗體評估FVIIa基因轉殖小鼠。

以每週間隔向10隻對照野生型小鼠及5隻FVIIa基因轉殖小鼠靜脈內投予huFVIIa之劑量，每一劑量為於200μL體積中之10μg huFVIIa。在4次或8次每週一次給藥後取血清樣品且使用標準ELISA方案量測抗FVIIa抗體力價。圖8展示表現人類FVII之小鼠未對外源性人類FVII作出反應而產生抗FVII抗體，而對照小鼠產生高力價之抗FVII抗體。

以上實驗證明表現人類凝血因子VIII之基因轉殖動物之一個亞系(亞系E)及表現人類凝血因子VII之小鼠系分別對外源性投予之天然人類凝血因子VIII或VII具有耐受性。此等基因轉殖動物提供可用以研究對投予人類血液因子之活體內反應及治療性凝血因子之抑制劑形成的動物模型，該等抑制劑通常在接受取代療法之人類患者中出現且可在後天性血液因子病症(諸如，後天性A型血友病)中自發產生。

實施例8帶有新抗原之凝血因子對基因轉殖動物中之耐受性的破壞

為展示表現人類凝血因子之基因轉殖動物中對人類凝血因子之免疫耐受性可被破壞，將亞系E之動物(對天然人類FVIII免疫耐受)用包含帶有新抗原之人類FVIII之模型物質處理。藉由化學修飾天然人類FVIII產生新抗原。將動物用天然人類FVIII或帶有新抗原之人類FVIII處理。

將小鼠用200μL中之200ng FVIII(ADVATE,Baxter Healthcare SA,Vienna,Austria)或200ng帶有新抗原之FVIII(由Baxter Healthcare SA(Vienna,Austria)產生)的4次每週一次給藥來處理。在最後一次給藥後取血清樣品且使用標準ELISA方案量測抗FVIII抗體力價。

圖7中所示之結果證明經ADVATE處理之小鼠未形成抗FVIII抗體。然而，經包含新抗原之FVIII處理之9隻小鼠中有8隻形成抗FVIII抗原。此等結果證明此等基因轉殖動物提供可用以識別人類凝血因子中新抗原形成的模型。

實施例9研究表現凝血因子之基因轉殖動物中的血液因子耐受性

治療性血液因子之抑制劑的形成或抗血液因子抗體的自發形成顯著阻礙出血病症之有效治療。舉例而言，接受FVIII療法之血友病患者可能形成治療性蛋白質之抗體，該等抗體致使治療無效(Reding MT,Haemophilia 12(增刊6):30-36,2006)。此外，當個體自發產生抗FVIII抗體時，出現後天性A型血友病(acquired hemophilia A，AHA)。雖然迄今為止後天性血友病之病源學尚未明確，但AHA發生率在患有自體免疫疾病之個體、患有某些類型癌症之個體中較高，且已展示由對藥物治療(諸如，盤尼西林、氟達拉濱或干擾素-α)之過敏反應引起(Franchini等人，Med Sci Monit 13:RA55-61,2007)。

雖然血友病之動物模型已用以研究血友病患者中FVIII抑制劑之形成(Reipert等人，Brit J Heamatol 136:12-25,2006)，但尚不存在研究後天性A型血友病中耐受性的破壞或血友病患者中其他類型之耐受性的破壞的合適動物模型。本文所述之表現人類血液因子之基因轉殖動物為可用以研究後天性A型血友病及針對凝血因子之其他自發性自身免疫性或自發性抑制劑形成的模型。

在一具體態樣中，將表現人類FVIII之基因轉殖動物用已知引起AHA之藥物(諸如，盤尼西林、氟達拉濱或干擾素-α)處理，且評估動物中抗FVIII抗體之形成。在另一具體態樣中，向基因轉殖動物投予促發炎性細胞介素、toll樣受體之配位體或活體內誘發促發炎性細胞介素釋放以破壞FVIII耐受性之任何其他化合物。為測定抑制劑誘發水平，使用技術領域中熟知之技術量測凝血因子抑制劑。舉例而言，Bethesda Unit(BU)量表係用以評估FVIII抑制劑含量(Franchini M.,Haematology 11:119-25,2006)。如本文所述之ELISA方法亦用以量測抗血液因子抗體。亦在處理之前及之後，測定細胞介素及免疫相關分子之含量，以檢查免疫系統對自體抗體及其他抑制劑誘發之反應。

基因轉殖動物亦可用以研究AHA、對凝血因子之其他自發性自身免疫性或在重複投予治療性凝血因子後出現之其他凝血因子抑制劑的有效治療。將已形成血液因子抑制劑之基因轉殖小鼠用抑制體液免疫反應及後天性免疫反應之藥劑處理，例如投予類固醇、環孢素、γ-球蛋白及生物製劑，諸如利妥昔單抗(rituximab)(參見例如Collins,PW. Haemophilia 12(增刊6):94-101,2006；Alvarado等人，Clin Appl Thrombosis/Hemostasis 13:443-48,2007)，且評估自體抗體及其他抑制劑之含量。

亦已知在接受針對B型血友病之FIX治療之患者中形成抑制劑(DiMichele D.,Brit J Haematol 138:305-15,2007)。FIX之基因轉殖小鼠可用於研究使用如上針對FVIII及A型血友病所述之類似攝生法的B型血友病患者中抑制劑之形成。

本文所述之基因轉殖動物能夠發現抗原特異性抗體，該等抗體對治療性人類蛋白質作出反應而產生且為預測哪些療法可能對患者有害及哪些療法可能最有益提供重要工具。

預計熟習此項技術者會想到如上文說明性實施例中所述之本發明的許多修改及變化。因此，本發明僅受限於諸如隨附申請專利範圍中所出現之限制。

圖1A及1B說明包含人類因子VIII聚核苷酸以便插入非人類動物基因組中之質體。

圖2A及2B說明包含人類vWF聚核苷酸以便插入非人類動物基因組中之質體。

圖3展示包括前導序列及起始及終止密碼子(粗體)之vWF插入物之序列(SEQ ID NO：16)。

圖4說明含有人類因子VII基因之載體。

圖5A及5B展示以人類FVIII基因轉殖的小鼠的不同亞系中抗FVIII抗體之產生。當給與4次每週一次靜脈內給藥(圖5A)或8次每週一次靜脈內給藥(圖5B)時，亞系G中之小鼠產生抗FVIII抗體。亞系E及I中之小鼠在任一給藥攝生法中均不產生抗FVIII抗體。

圖6展示以人類FVIII基因轉殖的小鼠的不同亞系中不同IgG亞類及IgA之抗FVIII抗體產生，8次靜脈內給藥，每週一次。當給與8次每週一次給藥(圖6A)時，亞系G中之小鼠產生IgG亞類IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c之抗FVIII抗體。亞系E中之小鼠不產生任何IgG亞類之抗FVIII抗體(圖6B)。亞系I中之4隻小鼠中有1隻產生IgG亞類IgG1、IgG2a、IgG2b之抗FVIII抗體(圖6C)。

圖7說明在施加天然FVIII或帶有新抗原之FVIII之4次每週一次靜脈內給藥後，表現人類FVIII轉殖基因之小鼠(亞系E)中產生抗FVIII抗體。

圖8說明表現人類FVII之基因轉殖小鼠及對照小鼠在接受外源性人類FVII後的抗體產生，8次靜脈內給藥，每週一次，每次給藥10μg rFVIIa。。

Claims (21)

1. 一種產生包含編碼選自由因子VIII、因子VII及溫韋伯氏因子(von Willebrand Factor)所組成之群組的人類凝血因子之聚核苷酸轉殖基因之基因轉殖小鼠的方法，該方法包含：將編碼該人類凝血因子之聚核苷酸序列引入小鼠之基因組DNA中，以提供包含編碼該人類凝血因子而非該基因轉殖小鼠的內源性相應凝血因子之聚核苷酸的基因轉殖小鼠，並將編碼人類主要組織相容性II類基因的聚核苷酸序列引入該小鼠的基因組DNA中，以置換該小鼠的內源性主要組織相容性II類基因之全部或部分。
2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該引入係藉由微注射進行。
3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該引入係使用病毒載體進行。
4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該聚核苷酸序列編碼人類vWF蛋白。
5. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該聚核苷酸序列編碼人類FVIII蛋白。
6. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該聚核苷酸序列編碼人類FVII蛋白。
7. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該聚核苷酸序列編碼人類FIX蛋白。
8. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該聚核苷酸序列 可操作性連接至啟動子聚核苷酸序列。
9. 如申請專利範圍第8項之方法，其中該啟動子係選自由以下者所組成之群組：α-胎蛋白啟動子、白蛋白啟動子、CMV啟動子及內源性凝血因子啟動子。
10. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該聚核苷酸序列包含聚A序列。
11. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該小鼠對該轉殖基因而言為純合(homozygous)的。
12. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該小鼠對該轉殖基因而言為雜合(heterozygous)的。
13. 一種產生包含編碼人類凝血因子之聚核苷酸之基因轉殖小鼠的方法，其包含：a)提供編碼選自由因子VIII、因子VII及溫韋伯氏因子所組成之群組的人類凝血因子及陽性可選擇性標記物基因之聚核苷酸序列，該標記物基因側接有loxP位點；b)在一定條件下將該聚核苷酸序列引入來自小鼠之胚胎幹細胞中，該條件使得該聚核苷酸序列同源性重組至該胚胎幹細胞之基因組基因座中，以產生含有編碼選自由因子VIII、因子VII及溫韋伯氏因子所組成之群組的人類凝血因子及該可選擇性標記物基因的聚核苷酸之胚胎幹細胞，並將編碼人類主要組織相容性II類基因的聚核苷酸序列引入該小鼠的基因組DNA中，以置換該小鼠的內源性主要組織相容性II類基因之全部或部分；c)將該經同源性重組之胚胎幹細胞注射至該小鼠之囊 胚中；d)將該經注射之囊胚引入假孕雌性小鼠中；及e)使該假孕雌性小鼠分娩一或多個含有該同源性重組DNA序列之基因轉殖小鼠，其中該一或多個基因轉殖小鼠表現該選自由以下者所組成之群組的人類凝血因子：因子VIII、因子VII及溫韋伯氏因子。
14. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該聚核苷酸包含可操作性連接至該人類凝血因子基因之啟動子。
15. 如申請專利範圍第14項之方法，其中該啟動子係選自由以下者所組成之群組：α-胎蛋白啟動子、白蛋白啟動子、CMV啟動子及內源性凝血因子啟動子。
16. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該聚核苷酸序列包含聚A序列。
17. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該可選擇性標記物為新黴素抗性基因neo 。
18. 如申請專利範圍第13項之方法，其中使來自步驟(e)之該一或多個基因轉殖小鼠與Cre 刪除(Cre -deleter)之小鼠品系雜交。
19. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該基因轉殖小鼠表現該人類vWF基因。
20. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該基因轉殖小鼠表現該人類FVIII蛋白。
21. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該基因轉殖小鼠表現該人類FVII蛋白。