TWI478002B - 一種篩選治療或預防帕金森氏症及其併發症之候選藥物的方法 - Google Patents

Description

一種篩選治療或預防帕金森氏症及其併發症之候選藥物的方法

本發明係關於一種篩選治療或預防帕金森氏症及其併發症之候選藥物的方法，特別是以斑馬魚模式動物作為治療或預防帕金森氏症及其併發症候選藥物的初步預估效用的評估方法。

1817年由James Parkinson首次提出關於帕金森氏症(Parkinson’s disease，簡稱PD)的臨床報告，文中描述病患會有雙手、雙足顫抖或行走遲緩等病徵，隨著時間及病程推進，病情逐漸惡化後更有躁鬱(anxiety)、姿勢反射障礙(Postural instability)等臨床症狀出現，因此，PD病患不僅無法自主控制生理狀態及行為，其心理層面也容易產生負面情緒，而衍生焦躁不安、情緒低落或失控的情形。雖然引發PD的機制至今仍不明確，許多專家學者推測，PD的發生可能與氧化壓力(Oxidative stress)、粒線體功能喪失(Mitochondria dysfunction)以及發炎反應過程(Inflammatory process)等因素而導致大腦黑質區內多巴胺神經元死亡有關。

目前臨床上PD的治療為緩解療法，以維持PD病患於日常生活上的自主性及活動能力，常用PD藥物包括左旋多巴胺(Levodopa)、多巴胺類似物(Dopamine agonist)、兒茶酚-O-甲基轉移酶抑制物(Catechol-O-methyl transferase inhibitor,COMT inhibitor)或單胺氧化酶抑制物(Monoaminooxidase inhibitor,MAO inhibitor)等，然而，該等PD藥物只能緩解PD病症，不僅無法阻止PD的病程演進，亦不具有根治PD的功效。

為了找尋更有效阻止PD病程演進或根治PD的藥物，目前許多研究單位係以開發新穎PD藥物為主要目標。習用篩選PD藥物的方法，可以分成離體(in vitro )實驗模式或活體(in vivo )實驗模式。

離體實驗模式係以PD細胞模式作為篩選平台，如人類兒茶酚胺類神經母瘤細胞株(Human catecholaminergic neuroblastoma cell line，簡稱SH-SY5Y)、小鼠多巴胺神經細胞(MN9D)、大鼠嗜鉻性瘤細胞株(PC-12)等，其中又以SH-SY5Y係最為廣泛應用的細胞模式。然而，就系統完整度和實際應用面而言，細胞實驗模式與活體實驗模式相距甚遠，因此，許多研究改以模式動物模擬PD的臨床病徵，作為藥物篩選和病理機轉探討的應用。

活體實驗模式則主要係大白鼠活體模式，其誘導大白鼠發生PD方法，係於大白鼠的單邊側腦室注射6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，簡稱6-OHDA)，破壞中腦基底核黑質區之多巴胺神經細胞元，再利用右旋苯異丙胺(D-Amphetamine)刺激大量多巴胺的分泌，但受傷處之多巴胺神經元不足導致僅有單邊的身體有行動能力，最後形成單邊旋轉的行為(Circling Behavior)模式。以上述PD模式動物注射候選藥物，並於一預定時間內測量順時針和逆時針旋轉圈數來評估藥物治療之效果。

大白鼠模式動物與人類同為哺乳類動物，也擁有完整的神經系統，與離體實驗模式(細胞株)相較，大白鼠與人類具有較高同質性，將大白鼠模式動物應用於PD研究時，在探討致病和治療分子機轉時，可將實驗結果應用於人類的病理機轉。

然而，以大白鼠模式動物作為藥物篩選平台具有以下缺點：(1)研究單位必須購買同品系的實驗動物以減少個體差異，各研究單位還須投入經費飼養該批實驗動物，待實驗動物的個體長至適於進行試驗的大小時，才可將該批實驗動物製備成大白鼠PD模式；(2)誘導大白鼠成為PD模式的技術門檻較高，容易失敗或者造成大白鼠癱瘓甚至死亡，且有效誘導的效率亦不高；(3)由於大白鼠的生物質量大，其所需候選藥物的劑量也較多，如候選藥物為天然萃取物者，可能因為萃取不易而無法提供足夠量的候選藥物來進行試驗。

為了克服上述缺點，自2000年起亦有研究單位嘗試以其他模式動物進行PD研究，如斑馬魚(Danio rerio )。

由於斑馬魚同屬於脊椎動物，其胚胎發育機制與哺乳動物有諸多類似，相對於習用大白鼠模式動物，斑馬魚飼養條件及生長環境單純，每次交配後約可產下300顆受精卵，所獲得同一品系的可用實驗數量遠大於大白鼠，藉此可減少個體差異所帶來的實驗誤差。

根據Anichtchik等人於2004年Neurochemistry期刊所發表「Neurochemical and behavioural changes in zebrafishDanio rerio after systemic administration of 6-hydroxy-dopamine and 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine」之論文資料，其以6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，簡稱6-OHDA)或1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，簡稱MPTP)肌肉注射至斑馬魚(體重為0.5~0.7克的成魚)體內，利用經誘導之斑馬魚體內的多巴胺(dopamine)及正腎上腺素(noradrenaline)含量作為判斷斑馬魚具有PD病症之依據。

由上述可知，該篇論文雖然提供一種誘導斑馬魚可能具有PD病徵的模式動物，然而，該篇論文並未揭示該經誘導之斑馬魚是否能夠作為PD藥物篩選平台。

有鑑於此，確實有必要提供一種誘導PD之操作程序簡便的PD藥物篩選平台，且能夠以該PD藥物篩選平台進行高通量遴選(High-throughput screening)的PD候選藥物篩選方法，以加速PD藥物的開發。

本發明之主要目的係提供一種篩選治療或預防帕金森氏症及其併發症之候選藥物的方法，係建立一操作簡易且低成本之帕金森氏症藥物篩選平台，以更準確地評估治療或預防帕金森氏症之候選藥物。

本發明之次一目的係提供一種篩選治療或預防帕金森氏症及其併發症之候選藥物的方法，係針對治療或預防帕金森氏症及其併發症(如躁鬱症)之候選藥物進行篩選。

為達到前述發明目的，本發明提供一種篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法，包含有：一試藥步驟，係使試驗魚接觸一PD候選藥物；一誘導步驟，以一PD誘導物誘導該試驗魚產生PD症狀，係為PD誘導試驗魚；一紀錄步驟，量測該PD誘導試驗魚於一水體中的游行距離或平均游行速度；及一評估PD基礎病徵步驟，將該PD誘導試驗魚的游行距離或平均游行速度，與一未接觸PD候選藥物之PD誘導魚相較，以該PD誘導試驗魚之游行距離或平均游行速度大於該未接觸PD候選藥物之PD誘導魚的游行距離或平均游行速度，作為該PD候選藥物具有治療或預防PD效果的評估依據。

本發明之篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法中，該紀錄步驟係於該水體分別定義一X、Y及Z軸，該X軸及Y軸間形成一XY基準面，該XY基準面係與水面平行，該Z軸朝向遠離水面方向延伸，X軸及Z軸間形成一XZ基準面，Y軸及Z軸間形成一YZ基準面，該PD誘導試驗魚或該PD誘導魚之游行距離及平均游行速度係以該PD誘導試驗魚或該PD誘導魚投影至該水體之XZ基準面或YZ基準面的游動軌跡為量測依據。

本發明之篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法中，該試藥步驟之試驗魚較佳為斑馬魚，該斑馬魚更佳係選擇自受精起算第0至9小時之斑馬魚受精卵。

本發明之篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法中，該試藥步驟之PD候選藥物較佳係於斑馬魚受精後第9小時後接觸該斑馬魚。

本發明之篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法中，該誘導步驟之PD誘導物選擇為6-羥基多巴胺。

本發明之篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法中，該誘導步驟之PD誘導物較佳係於斑馬魚受精起算第48小時後接觸該斑馬魚。

本發明之篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法中，該紀錄步驟之量測時間，較佳係自該斑馬魚受精起算第120至216小時。

本發明之篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法中，該水體係長度及寬度為1公分，高度為3公分的石英管。

本發明之篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法中，該PD候選藥物之濃度較佳為0.01微莫耳濃度(μM)至1.0毫莫耳濃度(mM)。

本發明提供另一種篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法，包含有：一試藥步驟，係使試驗魚接觸一PD候選藥物；一誘導步驟，以一PD誘導物誘導該試驗魚產生PD症狀，係為PD誘導試驗魚；一紀錄步驟，量測該PD誘導試驗魚處於一水體底層的時間；一評估PD併發病徵步驟，將該PD誘導試驗魚處於水體底層的時間與一未接觸PD候選藥物之PD誘導魚相較，以該PD誘導試驗魚處於水體底層的時間小於該未接觸PD候選藥物之PD誘導魚處於水體底層的時間，作為該PD候選藥物具有治療或預防PD併發的躁鬱症效果的評估依據。

本發明之篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法中，該紀錄步驟係於該水體分別定義一X、Y及Z軸，該X軸及Y軸間形成一XY基準面，該XY基準面係與水面平行，該Z軸朝向遠離水面方向延伸，X軸及Z軸間形成一XZ基準面，Y軸及Z軸間形成一YZ基準面，該紀錄步驟之水體底層係指遠離該XY基準面之區域。

本發明之篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法中，該試藥步驟之試驗魚較佳為斑馬魚，該斑馬魚更佳係選擇自受精起算第0至9小時之斑馬魚受精卵。

本發明之篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法中，該試藥步驟之PD候選藥物較佳係於斑馬魚受精後第9小時後接觸該斑馬魚。

本發明之篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法中，該誘導步驟之PD誘導物選擇為6-羥基多巴胺。

本發明之篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法中，該誘導步驟之PD誘導物較佳係於斑馬魚受精起算第48小時後接觸該斑馬魚。

本發明之篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法中，該紀錄步驟之量測時間，較佳係自該斑馬魚受精起算第120至216小時。

本發明之篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法中，該水體係長度及寬度為1公分，高度為3公分的石英管。

本發明之篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法中，該PD候選藥物之濃度為0.01 μM至1.0 mM。

為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：本發明係以一PD誘導物誘使一模式動物(如本發明之試驗魚)產生PD病症，而獲得一誘導模式動物，並藉由該誘導模式動物的游動行為作為判斷PD及其併發症病症之依據，提供一種PD候選藥物的篩選平台，以應用於評估或預測PD候選藥物之有效治療或預防PD及其併發症之方法。如此，不僅可以達到簡化篩選PD藥物篩選平台之操作程序之功效，降低PD藥物篩選成本，更可以同時篩選可改善PD及PD併發症病症(如躁鬱症)之藥物，係有利於PD藥物之開發。

請參照第1圖所示，本發明第一實施例係提供一種篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法，主要係針對可改善PD基礎病徵之藥物進行篩選，包含：一試藥步驟S11、一誘導步驟S12、一紀錄步驟S13及一評估PD基礎病徵步驟S14。

該試藥步驟S11，係使試驗魚接觸一PD候選藥物。舉例而言，本發明之試驗魚係選擇為斑馬魚，更佳係提供斑馬魚受精卵進行後續試驗。自斑馬魚受精卵受精時起算為第0小時，斑馬魚受精卵通常於受精後約48小時，即可孵化成仔魚，本實施例較佳係提供自斑馬魚受精起算第0至9小時之斑馬魚受精卵，並於該斑馬魚受精起算第9小時後加入該PD候選藥物，較佳係於第9小時起加入該PD候選藥物，使該斑馬魚持續接觸該PD候選藥物，以測試該PD候選藥物是否具有保護斑馬魚不受到後續PD誘導物而發生PD病徵，此外，待該斑馬魚以PD誘導物誘導時，亦持續與該PD候選藥物接觸，以測試該PD候選藥物是否具有緩解PD病徵之效果。

原則上，本發明之PD候選藥物測試濃度係以不會造成該試驗魚致死濃度為基準，並依照不同的PD候選藥物提供不同適用濃度之數個組別；本實施例之該PD候選藥物之濃度較佳為0.01 μM至1.0 mM，但不以此為限。

該誘導步驟S12，以一PD誘導物誘導該試驗魚產生PD症狀，係為PD誘導試驗魚。舉例而言，該PD誘導物可以選擇為6-OHDA、MPTP、魚藤酮(Rotenone)或巴拉刈(Paraquat)，本實施例係以6-OHDA誘導斑馬魚產生PD病徵，本實施例較佳係於該斑馬魚自受精起算第48小時後，加入100~250莫耳濃度(μM)之6-OHDA，以誘導其成為具有PD病徵之斑馬魚。如此，該經誘導之試驗魚的生理狀況較為穩定，且能延長該試驗魚具有PD病徵至少達到9天，延長後續用以篩選PD候選藥物的試驗時間。

該紀錄步驟S13，量測該PD誘導試驗魚於一水體中的游行距離或平均游行速度。更詳言之，請參照第2圖所示，該水體定義X、Y及Z軸，該X軸及Y軸間形成一XY基準面，該XY基準面係與該水體之水面平行，X軸及Z軸間形成一XZ基準面，Y軸及Z軸間形成一YZ基準面，該PD誘導試驗魚之游行距離及平均游行速度係以該PD誘導試驗魚投影至該水體之XZ基準面或YZ基準面的游動軌跡為量測依據。本實施例較佳係於該斑馬魚受精起算第120至216小時，紀錄其於5分鐘內投影至第2圖所示之XZ基準面的移動軌跡、游行距離及平均游行速度。本發明所指之水體係包含容納水(或海水)的容器及水本身，且該容器較佳係能夠經由XZ基準面或YZ基準面之一面觀察到水體內部情形；本實施例較佳之水體係長寬為1公分，高度為3公分之石英管，該石英管可容納2毫升的水。

本發明藉由該PD誘導試驗魚於水體內投影至該XZ基準面或該YZ基準面的移動軌跡，而能夠解決因水體積大而無法清楚紀錄該PD誘導試驗魚於遠離水表面時的移動軌跡的問題。

該評估PD基礎病徵步驟S14，將該PD誘導試驗魚的游行距離或平均游行速度，與一未接觸PD候選藥物之PD誘導魚相較，以該PD誘導試驗魚之游行距離或平均游行速度大於該未接觸PD候選藥物之PD誘導魚的游行距離或平均游行速度，作為該PD候選藥物具有治療或預防PD效果的評估依據。舉例而言，本發明該PD誘導試驗魚與該未接觸PD候選藥物之PD誘導魚之游行距離或平均游行速度的數據統計差異，係隨使用者自定義，較佳係以ANOVA進行統計分析，或以Duncan法進行多重組間差異性比較，其p 值設定為0.5、0.1或0.05，若該實驗組與該控制組相較p 值小於0.5、0.1或0.05時，則二組具有顯著差異，表示該候選藥物具有治療PD之潛力。

更詳言之，以未接觸PD候選藥物或PD誘導物之正常試驗魚之游行距離或平均游行速度為基準，該未接觸PD候選藥物之PD誘導魚的游行距離及平均游行速度會比正常試驗魚為低且具有顯著差異，而該已接觸PD候選藥物之PD誘導試驗魚的游行距離及平均游行速度若與該未接觸PD候選藥物之PD誘導魚相較為高，則代表該PD候選藥物具有治療PD之潛能，更佳係該已接觸PD候選藥物之PD誘導試驗魚的游行距離及平均游行速度若與正常試驗魚相較不具有顯著差異者，則代表該PD候選藥物之治療潛能更高。

請參照第3圖所示，本發明之第二實施例係提供另一種篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法，主要針對可改善PD併發病徵之藥物進行篩選，係包含：一試藥步驟S21、一誘導步驟S22、一紀錄步驟S23及一評估PD併發病徵步驟S24；其中，本發明之試藥步驟S21與該誘導步驟S22之技術內容與該試藥步驟S11與該誘導步驟S12相同，在此恕不贅述。

該紀錄步驟S23，量測該PD誘導試驗魚處於一水體底層的時間。更詳言之，該PD誘導試驗魚置於如第2圖所示之水體，該水體具有自定義之X、Y及Z軸，該X軸及Y軸間形成一XY基準面，該XY基準面係與該水體之水面平行，X軸及Z軸間形成一XZ基準面，該Z軸朝向遠離水面方向延伸，Y軸及Z軸間形成一YZ基準面，將該水體分成不同深度的表層s、中層m及底層b，該表層s為接近該XY基準面之區域，該底層b為遠離該XY基準面之區域，該中層m則介於該表層s及該底層b之間。本實施例較佳係於該斑馬魚受精後第120至216小時後，紀錄其於5分鐘內處於該水體底層的時間。

該評估PD併發病徵步驟S24，將該PD誘導試驗魚處於水體底層的時間與一未接觸PD候選藥物之PD誘導魚相較，以該PD誘導試驗魚處於水體底層的時間小於該未接觸PD候選藥物之PD誘導魚處於水體底層的時間，作為該PD候選藥物具有治療或預防PD併發的躁鬱症效果的評估依據。舉例而言，本發明該已接觸PD候選藥物之PD誘導試驗魚與該未接觸PD候選藥物之PD誘導魚處於水體底層的時間的數據統計差異，係隨使用者自定義，較佳係以ANOVA進行統計分析，或以Duncan法進行多重組間差異性比較，其p 值設定為0.5、0.1或0.05，若該已接觸PD候選藥物之PD誘導試驗魚與該未接觸PD候選藥物之PD誘導魚相較p 值小於0.5、0.1或0.05時，則二組具有顯著差異，表示該PD候選藥物具有治療PD併發躁鬱症之潛力。

更詳言之，以未接觸PD候選藥物或PD誘導物之正常試驗魚處於水體底層的時間為基準，該未接觸PD候選藥物之PD誘導魚處於水體底層的時間會比正常試驗魚為高且具有顯著差異，而該已接觸PD候選藥物之PD誘導試驗魚處於水體底層的時間若與該未接觸PD候選藥物之PD誘導魚相較後為低，則代表該PD候選藥物具有治療PD併發躁鬱症之潛能，更佳係該已接觸PD候選藥物之PD誘導試驗魚處於水體底層的時間若與正常試驗魚相較不具有顯著差異者，則代表該PD候選藥物之治療PD併發躁鬱症之潛能更高。

為證實本發明篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法，確實能夠用以評估PD候選藥物之具有治療或預防PD或其併發症(如躁鬱症)的潛能，以下為本發明之較佳實施例：(A)PD症狀誘發試驗及(B)本發明評估習用PD藥物改善PD症狀之試驗。

本發明較佳係挑選4個月大的斑馬魚，以一水產養殖系統(遠東儀器，五段獨立型飼育裝置)，控制水溫於28℃，並保持每天14小時光週期和10小時的暗週期，每日固定時間餵食豐年蝦(Artemia)及維持水質。當雌性斑馬魚產卵前，於產卵缸中放入等比例數量之公、母魚，並以透明擋板隔離該公、母魚，待暗週期開始前將擋板移除，隔天受到光週期刺激後，公、母魚開始沝並受精產卵，時間約為1~2小時，並收集該斑馬魚受精卵至如第1表所示之漢克緩衝液(Hank’s buffer)中，以備後續試驗。

將一批斑馬魚受精卵置於石英管(其長寬為1公分，高度為3公分)內，每支石英管僅容納一個斑馬魚受精卵，以便記錄其游動軌跡，其中養殖溶液為漢克緩衝液，體積為2.0毫升(ml)；其中，本實施例之斑馬魚受精卵孵化成仔魚後，係自受精起算第5天起才具有明顯的運動行為，故以下試驗皆係於受精起算第5天進行運動行為的紀錄及測量。

(A)PD症狀誘發試驗

為證實本發明以6-OHDA誘導斑馬魚後，該經誘導之斑馬魚的行為模式確實具有PD症狀，如游行距離或平均游行速度下降。請參照第2表所示，本實施例係取4組斑馬魚(各組皆為16重複)，其中，第A1組係控制組，不添加任何誘導物；第A2至A4組則分別於受精後第2、3及4天添加250 μM之6-OHDA(溶劑為2%之L-抗壞血酸)誘發斑馬魚產生PD症狀，並且於受精後第5天，測試各組別斑馬魚於5分鐘內的游行距離、游行速度及於水體底層的停留時間。

本實施例係以動物行為監測系統(Animal Video Behavior System，新加科技有限公司，TM-01)，拍攝各石英管之XZ基準面，紀錄各組別斑馬魚於XZ基準面的游行距離，並計算出其平均游行速度；另紀錄各組別斑馬魚停留於水體底層的時間，該水體係如第2圖所示，其中該水體之長寬度為1.0公分，深度為2.7公分，本實施例所指「水體底層」係自水面起算2~3公分深處。

請參照第3至5圖所示，未添加任何誘導物的第A1組，其平均游行速度約為2.5公釐/秒(mm/sec)，游行距離約為750 mm，而停留於水體底層的時間僅約30秒；以ANOVA比較各組間的差異(p <0.05)，第A3及A4組之平均游行速度及游行距離相較於第A1組明顯下降，且水體底層的停留時間也明顯增加。據此，後續試驗則以本試驗第A4組的條件誘導斑馬魚產生PD症狀。

由此可知，對斑馬魚(仔魚)於受精後第2~4天時，以250 μM之6-OHDA誘導產生PD症狀的行為遲緩現象，且較佳係使斑馬魚接觸6-OHDA至少2天以上，確實能夠使斑馬魚產生游行速度變慢及游行距離變短的症狀；此外，成功誘導具有PD症狀的斑馬魚，也會發生如躁鬱症的症狀，斑馬魚停留於水體底層的時間也明顯增加，因此，藉由紀錄斑馬魚停留於水體底層的時間，也能夠作為篩選治療躁鬱症候選藥物的治療效果。

據此，以本發明所揭示篩選治療PD及其併發症之候選藥物的方法，確實係能夠獲得具有明顯PD症狀及由PD所引起躁鬱症狀的模式動物，藉由該模式動物能夠簡化遴選該PD及躁鬱症之候選藥物測試平台的製備程序。

(B)本發明評估習用PD藥物改善PD症狀之試驗

為證實本發明篩選治療PD及其併發症之候選藥物的方法確實能夠反應待測藥物之潛在療效，本實施例係以習用PD藥物(Sinemet)及可能具有PD療效的維他命E，作為待測藥物。

請參照第3表所示，取4組斑馬魚(各組皆為12重複)，其中，第B1組係控制組，不添加任何誘導物或候選藥物；第B2組係於受精後第9小時添加1% DMSO(為候選藥物維他命E之溶劑)，再於受精後第2天添加誘導物6-OHDA；第B3組係於受精後第9小時添加100 μM之候選藥物維他命E，再於受精後第2天添加誘導物6-OHDA：第B4組係於受精後第9小時添加100 μM之候選藥物維他命E，再於受精後第2天添加誘導物6-OHDA之溶劑(2% L-抗壞血酸)。各組別分別於受精後第5至9天，測試5分鐘內的游行距離、游行速度及於水體底層的停留時間。

請參照第6至8圖所示，未添加任何添加物的第B1組為控制組，而第B2組則係以250 μM之6-OHDA誘導成具有PD症狀的斑馬魚，本實施例以Duncan法比較各組間的平均游行速度、游行距離及水體底層停留時間的差異(p <0.05)。將第B3組的平均游行速度、游行距離及水體底層停留時間與第B1及B2組相較，維他命E可改善由6-OHDA引起的PD症狀及由PD引起之躁鬱症狀，第B3組與第B2組之間具有顯著差異。

請參照第4表所示，取4組斑馬魚(各組皆為12重複)，其中，第B5組係控制組，不添加任何誘導物或候選藥物；第B6組係於受精後第9小時添加1% PBS(為候選藥物Sinemet之溶劑)，再於受精後第2天添加誘導物6-OHDA；第B7組係於受精後第9小時添加2.5微克/毫升(μg/ml)之候選藥物Sinemet，再於受精後第2天添加誘導物6-OHDA：第B8組係於受精後第9小時添加25 μg/ml之候選藥物Sinemet，再於受精後第2天添加誘導物6-OHDA。各組別分別於受精後第5至7天，測試5分鐘內的游行距離、游行速度及於水體底層的停留時間。

請參照第9至10圖所示，未添加任何添加物的第B5組為控制組，而第B6組則係以250 μM之6-OHDA誘導成具有PD症狀的斑馬魚，本實施例以Duncan法比較各組間的平均游行速度、游行距離及水體底層停留時間的差異(p <0.05)。將第B3及B4組的平均游行速度、游行距離及水體底層停留時間與第B1及B2組相較，以本發明所揭示之方法確實可反應出習用PD藥物Sinemet改善由6-OHDA引起的PD症狀及由PD引起之躁鬱症狀，第B3組與第B2組之間具有顯著差異；此外，由第11圖可知，習用PD藥物Sinemet也具有改善斑馬魚的躁鬱症狀。

由此可知，以本發明之斑馬魚PD模式測試候選藥物的治療潛能，確實能夠利用簡易儀器記錄斑馬魚的平均游行速度及游行距離來評估PD症狀的改善情況，且也能夠藉由紀錄斑馬魚停留於水體底層的時間來評估躁鬱症的改善情況。

據此，本發明所揭示篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法，確實能夠簡化製備該PD模式動物的程序，不僅係以容易測量及描述的參數(平均游行速度、游行距離及水體底層的停留時間)評估該PD及其併發症之候選藥物治療潛能，又能夠清楚呈現斑馬魚於水體中的實際情況，不會因水體積過小而使斑馬魚產生壓迫行為，藉此提高本發明測試PD候選藥物的偵測靈敏度及可性度；本發明提供一種操作方式簡便、成功率高且實驗維持成本低的高通量(High-throughput)PD及其併發症候選藥物之篩選方法，更有助於加速現階段測試PD及其併發症候選藥物的開發。

藉此，本發明之篩選治療或預防帕金森氏症及其併發症之候選藥物的方法，係提供一種操作簡易且低成本之帕金森氏症藥物篩選平台，藉由紀錄並分析該篩選平台於水體下的移動軌跡，能達到提高反應候選藥物治療或預防帕金森氏症及其併發症之療效之靈敏度及可信度功效。

本發明之篩選治療帕金森氏症及其併發症之候選藥物的方法，係提供一種操作簡易且低成本之帕金森氏症藥物篩選平台，藉由紀錄並分析該篩選平台處於水體底層的停留時間，而能達到進一步評估該候選藥物是否具有治療或預防由帕金森氏症所引起躁鬱症療效之功效。

雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

S11．．．試藥步驟

S12．．．誘導步驟

S13．．．紀錄步驟

S14．．．評估PD基礎病徵步驟

S21．．．試藥步驟

S22．．．誘導步驟

S23．．．紀錄步驟

S24．．．評估PD併發病徵步驟

s．．．表層

m．．．中層

b．．．底層

第1圖：本發明篩選治療帕金森氏症及其併發症之候選藥物的方法的步驟方塊圖(一)。

第2圖：本發明斑馬魚於水體下之座標示意圖。

第3圖：本發明篩選治療帕金森氏症及其併發症之候選藥物的方法的步驟方塊圖(二)。

第4圖：本實施例第A1至A4組之平均游行速度長條圖。

第5圖：本實施例第A1至A4組之游行距離長條圖。

第6圖：本實施例第A1至A4組之水體底層停留時間長條圖。

第7圖：本實施例第B1至B4組之平均游行速度長條圖。

第8圖：本實施例第B1至B4組之游行距離長條圖。

第9圖：本實施例第B1至B4組之水體底層停留時間長條圖。

第10圖：本實施例第B5至B8組之平均游行速度長條圖。

第11圖：本實施例第B5至B8組之游行距離長條圖。

第12圖：本實施例第B5至B8組之水體底層停留時間長條圖。

S11．．．試藥步驟

S12．．．誘導步驟

S13．．．紀錄步驟

S14．．．評估PD基礎病徵步驟

Claims (22)

1. 一種篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法，係包含：一試藥步驟，係使試驗魚接觸一PD候選藥物；一誘導步驟，以一PD誘導物誘導該試驗魚產生PD症狀，係為PD誘導試驗魚；一紀錄步驟，量測該PD誘導試驗魚於一水體中的游行距離或平均游行速度；及一評估PD基礎病徵步驟，將該PD誘導試驗魚的游行距離或平均游行速度，與一未接觸PD候選藥物之PD誘導魚相較，以該PD誘導試驗魚之游行距離或平均游行速度大於該未接觸PD候選藥物之PD誘導魚的游行距離或平均游行速度，作為該PD候選藥物具有治療或預防PD效果的評估依據。
2. 如申請專利範圍第1項所述之篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法，其中該紀錄步驟係於該水體分別定義一X、Y及Z軸，該X軸及Y軸間形成一XY基準面，該Z軸朝向遠離水面方向延伸，該XY基準面係與水面平行，X軸及Z軸間形成一XZ基準面，Y軸及Z軸間形成一YZ基準面。
3. 如申請專利範圍第2項所述之篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法，其中該紀錄步驟中該PD誘導試驗魚或該PD誘導魚之游行距離及平均游行速度係以該PD誘導試驗魚或該PD誘導魚投影至該水體之XZ基準面或YZ基準面的游動軌跡為量測依據。
4. 如申請專利範圍第1項所述之篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法，其中該試藥步驟之試驗魚係斑馬魚。
5. 如申請專利範圍第4項所述之篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法，其中該斑馬魚係自受精起算第0至9小時之斑馬魚受精卵。
6. 如申請專利範圍第4項所述之篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法，其中該試藥步驟之PD候選藥物係於斑馬魚受精起算第9小時後接觸該斑馬魚。
7. 如申請專利範圍第1項所述之篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法，其中該誘導步驟之PD誘導物為6-羥基多巴胺、1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶、魚藤酮或巴拉刈。
8. 如申請專利範圍第4項所述之篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法，其中該誘導步驟之PD誘導物，係於斑馬魚受精起算第48小時後接觸該斑馬魚。
9. 如申請專利範圍第4項所述之篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法，其中該紀錄步驟之量測時間，係自該斑馬魚受精起算第120至216小時。
10. 如申請專利範圍第1項所述之篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法，其中該水體係長度及寬度為1公分，高度為3公分的石英管。
11. 如申請專利範圍第1項所述之篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法，其中該PD候選藥物之濃度為0.01微莫耳濃度至1.0毫莫耳濃度。
12. 一種篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法，係包含：一試藥步驟，係使試驗魚接觸一PD候選藥物；一誘導步驟，以一PD誘導物誘導該試驗魚產生PD症狀，係為PD誘導試驗魚；一紀錄步驟，量測該PD誘導試驗魚處於一水體底層的時間；一評估PD併發病徵步驟，將該PD誘導試驗魚處於水體底層的時間與一未接觸PD候選藥物之PD誘導魚相較，以該PD誘導試驗魚處於水體底層的時間小於該未接觸PD候選藥物之PD誘導魚處於水體底層的時間，作為該PD候選藥物具有治療或預防PD併發的躁鬱症效果的評估依據。
13. 如申請專利範圍第12項所述之篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法，其中該紀錄步驟係於該水體分別定義一X、Y及Z軸，該X軸及Y軸間形成一XY基準面，該XY基準面係與水面平行，該Z軸朝向遠離水面方向延伸，X軸及Z軸間形成一XZ基準面，Y軸及Z軸間形成一YZ基準面。
14. 如申請專利範圍第13項所述之篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法，其中該紀錄步驟之水體分成不同深度的表層、中層及底層，該底層係指遠離該XY基準面之區域。
15. 如申請專利範圍第12項所述之篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法，其中該試藥步驟之試驗魚係斑馬魚。
16. 如申請專利範圍第15項所述之篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法，其中該斑馬魚係自受精起算第0至9小時之斑馬魚受精卵。
17. 如申請專利範圍第15項所述之篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法，其中該試藥步驟之PD候選藥物係於斑馬魚受精起算第9小時後接觸該斑馬魚。
18. 如申請專利範圍第12項所述之篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法，其中該誘導步驟之PD誘導物為6-羥基多巴胺、1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶、魚藤酮或巴拉刈。
19. 如申請專利範圍第15項所述之篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法，其中該誘導步驟之PD誘導物，係於斑馬魚受精起算第48小時後接觸該斑馬魚。
20. 如申請專利範圍第15項所述之篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法，其中該紀錄步驟之量測時間，係自該斑馬魚受精後第120至216小時。
21. 如申請專利範圍第12項所述之篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法，其中該水體係長度及寬度為1公分，高度為3公分的石英管。
22. 如申請專利範圍第12項所述之篩選治療或預防PD及其併發症之候選藥物的方法，其中該PD候選藥物之濃度為0.01微莫耳濃度至1.0毫莫耳濃度。