[go: up one dir, main page]

TWI469794B - 抗細胞增殖化合物及其共軛物及其方法及用途 - Google Patents

抗細胞增殖化合物及其共軛物及其方法及用途 Download PDF

Info

Publication number
TWI469794B
TWI469794B TW99125854A TW99125854A TWI469794B TW I469794 B TWI469794 B TW I469794B TW 99125854 A TW99125854 A TW 99125854A TW 99125854 A TW99125854 A TW 99125854A TW I469794 B TWI469794 B TW I469794B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
compound
alkyl
unsubstituted
substituted
group
Prior art date
Application number
TW99125854A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201106976A (en
Inventor
Heng Cheng
Qiang Cong
Sanjeev Gangwar
Qian Zhang
Original Assignee
Medarex Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Medarex Llc filed Critical Medarex Llc
Publication of TW201106976A publication Critical patent/TW201106976A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI469794B publication Critical patent/TWI469794B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D215/00—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems
    • C07D215/02—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D215/12—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/06—Tripeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6829—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxins or Pseudomonas exotoxin A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C229/04—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C229/06—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton
    • C07C229/10—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton the nitrogen atom of the amino group being further bound to acyclic carbon atoms or to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings
    • C07C229/14—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton the nitrogen atom of the amino group being further bound to acyclic carbon atoms or to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings to carbon atoms of carbon skeletons containing rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C229/04—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C229/06—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton
    • C07C229/10—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton the nitrogen atom of the amino group being further bound to acyclic carbon atoms or to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings
    • C07C229/16—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton the nitrogen atom of the amino group being further bound to acyclic carbon atoms or to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings to carbon atoms of hydrocarbon radicals substituted by amino or carboxyl groups, e.g. ethylenediamine-tetra-acetic acid, iminodiacetic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
    • C07D417/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
    • C07K5/021—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing the structure -NH-(X)n-C(=0)-, n being 5 or 6; for n > 6, classification in C07K5/06 - C07K5/10, according to the moiety having normal peptide bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06139—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

抗細胞增殖化合物及其共軛物及其方法及用途
本發明係關於結構上與微管溶素(tubulysin)相關之化合物，其與配位體之共軛物，製造及使用此種化合物與共軛物之方法，以及包含此種化合物與共軛物之組合物。
微管溶素(tubulysin)為最初自黏液菌過渡型原囊黏細菌 或碟形囊球菌 之培養物所單離之細胞毒素，其中各生物體會產生微管溶素(tubulysin)之不同混合物(Sasse等人2000；Reichenbach等人1998)。其晶體結構與生物合成途徑已被闡明(Steinmetz等人2004)，且其生物合成基因已被定序(Hoefle等人2006b)。前微管溶素(Pretubulysin)，微管溶素(tubulysin)之一種生物合成先質，亦已被証實本身就具有顯著活性(Ullrich等人2009)(於本文中所引用文件之第一位作者或發明人與年份之完全引文，係列示於本專利說明書之文末)。
微管溶素(tubulysin)係歸屬於天然生成之抗有絲分裂多肽與縮肽之組群，其包括擬莖點黴毒素、多拉制菌素及隱藻素(Hamel 2002)。多肽或縮肽以外之抗有絲分裂劑亦存在，例如太平洋紫杉醇、美坦生(maytansine)及艾波希酮(epothilone)。在有絲分裂期間，細胞之微管係重組以形成有絲分裂紡錘體，其係為一種需要微管組份蛋白質α-與β-微管蛋白之快速組裝與分解之過程。抗有絲分裂劑會阻斷此過程，且防止細胞進行有絲分裂，惟在分子層級下，確實之阻斷機制可隨著藥劑而不同。微管溶素(tubulysin)會防止微管蛋白之組裝成微管，造成受影響細胞蓄積在G2 /M期，並經歷細胞凋零(Khalil等人2006)。反之，太平洋紫杉醇係藉由結合至微管及防止其分解而達成相同最終結果。
微管溶素(tubulysin)具有自一個蛋白質原與三個非蛋白質原胺基酸亞單位所建構之四肽基骨架：N-甲基六氫吡啶酸(Mep)、異白胺酸(Ile)、管式纈胺酸(Tuv)及管式苯丙胺酸(Tup，在下文式(I)中，RA 等於H)或管式酪胺酸(Tut，RA 等於OH)。約十二種天然生成之微管溶素(tubulysin)(被稱為A、B等)係為已知，其中結構變異之位置係在如式(I)與表1中所示之殘基RA 、RB 及RC 處：
Kaur等人2006已研究微管溶素(tubulysin)A之抗細胞增殖性質，並在異種移植檢測中發現其係比其他抗有絲分裂劑更有效，譬如太平洋紫杉醇與長春花鹼，且具抵抗多種癌細胞系之活性。再者，微管溶素(tubulysin)A會誘發癌細胞而非正常細胞中之細胞凋零，且在活體外檢測中顯示重要潛在抗血管生成性質。其他微管溶素(tubulysin)之抗有絲分裂性質亦已被評估，且一般已發現係有利地與非微管溶素(tubulysin)抗有絲分裂劑比較(參閱，例如Balasubramanian等人2009；Steinmetz等人2004；Wipf等人2004)。因此，在微管溶素(tubulysin)作為抗癌劑上有相當可觀重要性(參閱，例如Domling等人2005c；Hamel 2002)。
許多刊物係描述針對微管溶素(tubulysin)合成之努力，包括：Balasubramanian等人2009；Domling等人2006；Hoefle等人2003；Neri等人2006；Peltier等人2006；Sani等人2007；Sasse等人2007；Shankar等人2009；Shibue等人2009；及Wipf等人2004。其他刊物係描述經由微管溶素(tubulysin)類似物或衍生物之製備與評估之結構-活性關係(SAR)研究：Balasubramanian等人2008與2009；Domling 2006；Domling等人2005a；Ellman等人2009；Hoefle等人2001與2006a；Patterson等人2007與2008；Richter 2008；Vlahov等人2009；Wang等人2007；及Wipf等人2007與2010。SAR研究係主要探查在Mep環、Tuv亞單位之殘基RB 與RC 及Tup/Tut亞單位之芳族環或脂族碳鏈上之結構變異。
Domling等人2005係揭示微管溶素(tubulysin)與一般性地被描述為聚合體或生質分子之配對物分子之共軛物，但其中實際實例係限於作為配對物分子之聚乙二醇(PEG)。揭示微管溶素(tubulysin)之共軛物之其他文件為Boyd等人2008與2010；Vlahov等人2008a、2008b及2010；Leamon等人2008與2009；Reddy等人2009；及Low等人2009。Leung等人2002係揭示可被共軛至藥物以改良其生物活性與水溶解度之聚陰離子性多肽(包括微管溶素(tubulysin))。
Davis等人2008與Schluep等人2009係揭示環糊精為基礎之配方，其中微管溶素(tubulysin)係經由結合至Tup/Tut羧基之醯肼-二硫化物連結基部份基團，以共價方式連接至環糊精。
本發明係揭示新穎抗細胞增殖化合物，其係在結構上與微管溶素(tubulysin)相關，具抵抗許多癌細胞之細胞毒性或細胞抑制，且咸認係藉由抗有絲分裂機制發生作用。此等化合物可被共軛至配位體，譬如抗體，用於針對癌細胞之標的傳輸。
於一項具體實施例中，本發明係提供具有以式(II)表示之結構之化合物
其中n為0,1或2；R1 、R2 及R3 係獨立為H、未經取代或經取代之C1 -C10 烷基、未經取代或經取代之C2 -C10 烯基、未經取代或經取代之C2 -C10 炔基、未經取代或經取代之芳基、未經取代或經取代之雜芳基、未經取代或經取代之(CH2 )1-2 O(C1 -C10 烷基)、未經取代或經取代之(CH2 )1-2 O(C2 -C10 烯基)、未經取代或經取代之(CH2 )1-2 O(C2 -C10 炔基)、(CH2 )1-2 OC(=O)(C1 -C10 烷基)、未經取代或經取代之(CH2 )1-2 OC(=O)(C2 -C10 烯基)、未經取代或經取代之(CH2 )1-2 OC(=O)(C2 -C10 炔基)、未經取代或經取代之C(=O)(C1 -C10 烷基)、未經取代或經取代之C(=O)(C2 -C10 烯基)、未經取代或經取代之C(=O)(C2 -C10 炔基)、未經取代或經取代之環脂族、未經取代或經取代之雜環脂族、未經取代或經取代之芳烷基或未經取代或經取代之烷基芳基；R4 為
或；且R5 為H、C1 -C5 烷基、C2 -C5 烯基、C2 -C5 炔基、CO(C1 -C5 烷基)、CO(C2 -C5 烯基)或CO(C2 -C5 炔基)；或其藥學上可接受之酯，其藥學上可接受之醯胺，在R4 之羧基處，伴隨α-胺基酸之α-胺基，或其藥學上可接受之鹽。
較佳R4 為
其中在對羧基為α位之甲基上之立體化學為更佳，其係相應於天然微管溶素(tubulysin)，意即：
本發明亦提供新穎中間物，可用於合成根據式(II)之化合物。
於另一項具體實施例中，本發明係提供一種本發明化合物，其係經由連結基部份基團共軛至配位體(較佳為抗體，更佳為單株抗體，而最佳為人類單株抗體)，供其選擇性傳輸至標的細胞，譬如癌細胞。
於另一項具體實施例中，係提供一種物質組合物，其包含本發明之化合物與適合共軛至配位體之連結基部份基團。
於另一項具體實施例中，本發明係提供一種在患有癌症之病患中抑制癌細胞增殖之方法，其包括對該病患投予治療上有效量之本發明化合物或其與配位體(特別是抗體)之共軛物。於另一項具體實施例中，係提供一種抑制癌細胞增殖之方法，其包括使此種細胞與本發明化合物或其與配位體(特別是抗體)之共軛物在足以抑制此種癌細胞生長之條件下接觸。癌細胞可為結腸直腸癌、肝癌、前列腺癌、乳癌、黑色素瘤、神經膠質母細胞瘤、肺癌、胰癌、卵巢癌、多發性骨髓瘤、腎癌、白血病或淋巴瘤細胞。在配位體為抗體之情況下，抗體較佳係結合至藉由癌細胞所表現之抗原。
於另一項具體實施例中，係提供一種在患有此種癌症之病患中治療癌症之方法，其包括對該病患投予治療上有效量之本發明化合物或其與配位體(特別是抗體)之共軛物。於另一項具體實施例中，係提供本發明化合物或其與配位體(特別是抗體)之共軛物於藥劑製備上之用途，該藥劑係用於治療癌症。在此等具體實施例中，癌症可為結腸直腸癌、肝癌、前列腺癌、乳癌、黑色素瘤、神經膠質母細胞瘤、肺癌、胰癌、卵巢癌、多發性骨髓瘤、腎癌、白血病或淋巴瘤。在配位體為抗體之情況下，抗體較佳係結合至藉由癌症細胞所表現之抗原。
於另一項具體實施例中，係提供本發明化合物或其與配位體(較佳為抗體)之共軛物於藥劑製備上之用途，該藥劑係在患有此種癌症之病患中用於治療癌症。
發明詳述 定義
"抗體"係意謂整個抗體及其任何抗原結合片段(意即"抗原結合部份")或單鏈。整個抗體係為包含藉由二硫鍵互連之至少兩個重(H)鏈與兩個輕(L)鏈之糖蛋白。各重鏈係包含重鏈可變區(VH )，與包含三個功能部位CH1 、CH2 及CH3 之重鏈恒定區域。各輕鏈係包含輕鏈可變區(VL 或Vk )，與包含一個單一功能部位CL 之輕鏈恒定區域。VH 與VL 區域可進一步再分成高可變性之區域，稱為互補性決定區域(CDR)，散佈著更保守之骨架區域(FR)。各VH 與VL 係包含三個CDR與四個FR，以下列順序從胺基末端排列至羧基末端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。可變區域含有會與抗原交互作用之結合功能部位。恒定區域可媒介抗體之結合至宿主組織或因子，包括免疫系統之各種細胞(例如效應子細胞)與古典補體系統之第一種成份(Clq)。若抗體結合至抗原X，具有KD 為5 x 10-8 M或較低，更佳為1 x 10-8 M或較低，更佳為6 x 10-9 M或較低，更佳為3 x 10-9 M或較低，又更佳為2 x 10-9 M或較低，則抗體係被陳述會"專一性地結合"至抗原X。抗體可為嵌合、人化，或較佳為人類。重鏈恒定區域可經設計以影響糖基化作用類型或程度，延長抗體半衰期，增強或降低與效應子細胞或補體系統之交互作用，或調制某種其他性質。工程可藉由置換、添加或刪除一或多個胺基酸，或經由以得自另一種免疫球蛋白類型之功能部位置換一種功能部位，或前述之組合而達成。
抗體之"抗體片段"與"抗原結合部份"(或簡易地"抗體部份")，係意謂保有專一性地結合至抗原能力之抗體之一或多個片段。已証實抗體之抗原結合功能可藉由全長抗體之片段進行，譬如(i)Fab片段，其係為由VL 、VH 、CL 及CH1 功能部位所組成之單價片段；(ii)F(ab')2 片段，其係為包含藉由鉸鏈區域上二硫化物橋基所連結之兩個Fab片段之二價片段；(iii)Fab'片段，其基本上為具有鉸鏈區域一部份之Fab(參閱，例如Abbas等人，細胞與分子免疫學 ，第6版,Saunders Elsevier 2007)；(iv)由VH 與CH1 功能部位所組成之Fd片段；(v)由抗體單臂之VL 與VH 功能部位所組成之Fv片段，(vi)dAb片段(Ward等人,(1989)Nature 341 ：544-546)，其係由VH 功能部位所組成；(vii)經單離之互補性決定區域(CDR)；及(viii)一種毫微體，其係為含有單一可變功能部位與兩個恒定功能部位之重鏈可變區。再者，雖然Fv片段之兩個功能部位，VL 與VH ，係被個別基因編碼，但其可使用重組方法，藉由使得彼等能夠以單一蛋白質鏈製成之合成鏈結接合，其中VL 與VH 區域對係形成單價分子(稱為單鏈Fv或scFv)；參閱，例如Bird等人(1988)Science 242 ：423-426；與Huston等人(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 ：5879-5883)。此種單鏈抗體亦被涵蓋在抗體之"抗原結合部份"術語內。
"經單離之抗體"係意謂一種實質上不含具有不同抗原專一性之其他抗體之抗體(例如會專一性地結合抗原X之經單離抗體，係實質上不含會專一性地結合抗原X以外之抗原之抗體)。但是，會專一性地結合抗原X之經單離抗體，可具有對其他抗原之交叉反應性，譬如得自其他物種之抗原X分子。在某些具體實施例中，經單離之抗體係專一性地結合至人類抗原X，且不會與其他(非人類)抗原X抗原交叉反應。再者，經單離之抗體可實質上不含其他細胞物質及/或化學品。
"單株抗體"或"單株抗體組合物"係意謂單一分子組合物之抗體分子之製備，其係表現出對特定抗原決定部位之單一結合專一性與親和力。
"人類抗體"係意謂一種具有可變區域之抗體，其中骨架與CDR區域兩者(及恒定區域，若存在時)均衍生自人類胚細胞系免疫球蛋白定序。人類抗體可包括後來改質物，包括天然或合成改質物。人類抗體可包含未被人類胚細胞系免疫球蛋白定序編碼之胺基酸殘基(例如藉由活體外隨機或位置專一性致突變，或經由活體內體細胞突變所引進之突變型)。但是，"人類抗體"不包括其中衍生自另一種哺乳動物物種譬如老鼠之胚細胞系之CDR定序已被移植至人類骨架定序上之抗體。
"人類單株抗體"係意謂一種具有可變區域之表現出單一結合專一性之抗體，其中骨架與CDR區域兩者均衍生自人類胚細胞系免疫球蛋白定序。於一項具體實施例中，人類單株抗體係藉由雜種瘤製成，其包含得自基因轉殖非人類動物例如基因轉殖老鼠之B細胞，具有基因組，包含經融合至不滅細胞之人類重鏈基因轉殖與輕鏈基因轉殖。
"脂族"係意謂直鏈或分枝鏈、飽和或不飽和、非芳族烴部份基團，具有所指定碳原子數(例如在"C3 脂族"、"C1 -C5 脂族"或"C1 至C5 脂族"中，後述兩種措辭對於具有1至5個碳原子之脂族部份基團係為同義)，或其中碳原子數未經明確地指定，從1至4個碳原子(在不飽和脂族部份基團之情況中為2至4個碳))。
"烷基"係意謂飽和脂族部份基團，其中可應用關於指定碳原子數之相同慣用法。藉由說明，C1 -C4 烷基部份基團包括但不限於甲基、乙基、丙基、異丙基、異丁基、第三-丁基、1-丁基、2-丁基等。
"烯基"係意謂具有至少一個碳-碳雙鍵之脂族部份基團，其中可應用關於指定碳原子數之相同慣用法。藉由說明，C2 -C4 烯基部份基團包括但不限於乙烯基(ethenyl)(乙烯基(vinyl))、2-丙烯基(烯丙基或丙-2-烯基)、順式-1-丙烯基、反式-1-丙烯基、E-(或Z-)2-丁烯基、3-丁烯基、1,3-丁二烯基(丁-1,3-二烯基)等。
"炔基"係意謂具有至少一個碳-碳參鍵之脂族部份基團，其中可應用關於指定碳原子數之相同慣用法。藉由說明，C2 -C4 炔基包括乙炔基(ethynyl)(乙炔基(acetylenyl))、炔丙基(丙-2-炔基)、1-丙炔基、丁-2-炔基等。
"環脂族"係意謂飽和或不飽和、非芳族烴部份基團，具有1至3個環，各環具有3至8個(較佳為3至6個)碳原子。"環烷基"係意謂其中各環為飽和之環脂族部份基團。"環烯基"係意謂其中至少一個環具有至少一個碳-碳雙鍵之環脂族部份基團。"環炔基"係意謂其中至少一個環具有至少一個碳-碳參鍵之環脂族部份基團。藉由說明，環脂族部份基團包括但不限於環丙基、環丁基、環戊基、環戊烯基、環己基、環己烯基、環庚基、環辛基及金剛烷基。較佳環脂族部份基團為環烷基者，尤其是環丙基、環丁基、環戊基及環己基。
"雜環脂族"係意謂環脂族部份基團，其中在其至少一個環中，至高三個(較佳為1至2個)碳已被獨立選自N、O或S之雜原子置換，其中N與S可視情況被氧化，且N可視情況被四級化。同樣地，"雜環烷基"、"雜環烯基"及"雜環炔基"係個別意謂環烷基、環烯基或環炔基部份基團，其中其至少一個環已被如此修改。舉例之雜環脂族部份基團包括氮丙啶基、一氮四圜基、1,3-二氧陸圜基、環氧丙烷基、四氫呋喃基、四氫吡咯基、六氫吡啶基、六氫吡基、四氫哌喃基、四氫硫代哌喃基、四氫硫代哌喃基碸、嗎福啉基、硫代嗎福啉基、硫代嗎福啉基亞碸、硫代嗎福啉基碸、1,3-二氧伍圜基、四氫-1,1-二酮基噻吩基、1,4-二氧陸圜基、環硫丙烷基等。
"烷氧基"、"芳氧基"、"烷硫基"及"芳基硫基"係個別意謂-O(烷基)、-O(芳基)、-S(烷基)及-S(芳基)。實例係個別為甲氧基、苯氧基、甲硫基及苯硫基。
"鹵素"或"鹵基"係意謂氟、氯、溴或碘。
"芳基"係意謂具有單-,雙-或三環狀環系統之烴部份基團，其中各環具有3至7個碳原子，且至少一個環為芳族。在此環系統中之環可互相稠合(如在萘基中)或互相結合(如在聯苯基中)，且可稠合或結合至非芳族環(如在氫茚基或環己基苯基中)。藉由進一步說明，芳基部份基團包括但不限於苯基、萘基、四氫萘基、氫茚基、聯苯基、菲基、蒽基及苊萘基。
"雜芳基"係意謂具有單-,雙-或三環狀環系統之部份基團，其中各環具有3至7個碳原子，且至少一個環為芳族環，含有1至4個獨立選自N、O或S之雜原子，其中N與S可視情況被氧化，且N可視情況被四級化。此種含有至少一個雜原子之芳族環可稠合至其他類型之環(如在苯并呋喃基或四氫異喹啉基中)，或直接結合至其他類型之環(如在苯基吡啶基或2-環戊基吡啶基中)。藉由進一步說明，雜芳基部份基團包括吡咯基、呋喃基、硫苯基(噻吩基)、咪唑基、吡唑基、唑基、異唑基、噻唑基、異噻唑基、三唑基、四唑基、吡啶基、N-酮基吡啶基、嗒基、嘧啶基、吡基、喹啉基、異喹啉基、喹唑啉基、啈啉基、喹唑啉基、啶基、苯并呋喃基、吲哚基、苯并硫苯基、二唑基、噻二唑基、苯噻唑基、苯并咪唑基、苯并三唑基、二苯并呋喃基、咔唑基、二苯并苯硫基、吖啶基等。
在指示部份基團可經取代之情況下，譬如利用"經取代或未經取代"或"視情況經取代"措辭，如在"經取代或未經取代之C1 -C5 烷基"或"視情況經取代之雜芳基"中，此種部份基團可具有一或多個經獨立選擇之取代基，在數目上較佳為一至五個，在數目上更佳為一或兩個。取代基與取代型式可由一般熟諳此藝者關於取代基所連接之部份基團而經選擇，以提供化學上安定，且可藉由此項技藝中已知之技術以及本文中所提出方法合成之化合物。
"芳烷基"、"(雜環脂族)烷基"、"芳烯基"、"芳基炔基"、"聯芳基烷基"等係意謂烷基、烯基或炔基部份基團，視情況被芳基、雜環脂族、聯芳基等部份基團取代，視情況具有開放(不滿足)價鍵在烷基、烯基或炔基部份基團上，例如在苄基、苯乙基、N-咪唑基乙基、N-嗎福啉基乙基等中。反之，"烷基芳基"、"烯基環烷基"等係意謂芳基、環烷基等部份基團，視情況被烷基、烯基等部份基團取代，視情況例如在甲基苯基(甲苯基)或烯丙基環己基中。"羥烷基"、"鹵烷基"、"烷基芳基"、"氰基芳基"等係意謂烷基、芳基等部份基團，視情況被一或多個經確認之取代基(視情況為羥基、鹵基等)取代。
藉由說明，可容許取代基包括但不限於烷基(尤其是甲基或乙基)、烯基(尤其是烯丙基)、炔基、芳基、雜芳基、環脂族、雜環脂族、鹵基(尤其是氟基)、鹵烷基(尤其是三氟甲基)、羥基、羥烷基(尤其是羥乙基)、氰基、硝基、烷氧基、-O(羥烷基)、-O(鹵烷基)(尤其是-OCF3 )、-O(環烷基)、-O(雜環烷基)、-O(芳基)、烷硫基、芳基硫基、=O、=NH、=N(烷基)、=NOH、=NO(烷基)、-C(=O)(烷基)、-C(=O)H、-CO2 H、-C(=O)NHOH、-C(=O)O(烷基)、-C(=O)O(羥烷基)、-C(=O)NH2 、-C(=O)NH(烷基)、-C(=O)N(烷基)2 、-OC(=O)(烷基)、-OC(=O)(羥烷基)、-OC(=O)O(烷基)、-OC(=O)O(羥烷基)、-OC(=O)NH2 、-OC(=O)NH(烷基)、-OC(=O)N(烷基)2 、疊氮基、-NH2 、-NH(烷基)、-N(烷基)2 、-NH(芳基)、-NH(羥烷基)、-NHC(=O)(烷基)、-NHC(=O)H、-NHC(=O)NH2 、-NHC(=O)NH(烷基)、-NHC(=O)N(烷基)2 、-NHC(=NH)NH2 、-OSO2 (烷基)、-SH、-S(烷基)、-S(芳基)、-S(環烷基)、-S(=O)烷基、-SO2 (烷基)、-SO2 NH2 、-SO2 NH(烷基)、-SO2 N(烷基)2 等。
在被取代之部份基團為脂族部份基團之情況下，較佳取代基為芳基、雜芳基、環脂族、雜環脂族、鹵基、羥基、氰基、硝基、烷氧基、-O(羥烷基)、-O(鹵烷基)、-O(環烷基)、-O(雜環烷基)、-O(芳基)、烷硫基、芳基硫基、=O、=NH、=N(烷基)、=NOH、=NO(烷基)、-CO2 H、-C(=O)NHOH、-C(=O)O(烷基)、-C(=O)O(羥烷基)、-C(=O)NH2 、-C(=O)NH(烷基)、-C(=O)N(烷基)2 、-OC(=O)(烷基)、-OC(=O)(羥烷基)、-OC(=O)O(烷基)、-OC(=O)O(羥烷基)、-OC(=O)NH2 、-OC(=O)NH(烷基)、-OC(=O)N(烷基)2 、疊氮基、-NH2 、-NH(烷基)、-N(烷基)2 、-NH(芳基)、-NH(羥烷基)、-NHC(=O)(烷基)、-NHC(=O)H、-NHC(=O)NH2 、-NHC(=O)NH(烷基)、-NHC(=O)N(烷基)2 、-NHC(=NH)NH2 、-OSO2 (烷基)、-SH、-S(烷基)、-S(芳基)、-S(=O)烷基、-S(環烷基)、-SO2 (烷基)、-SO2 NH2 、-SO2 NH(烷基)及-SO2 N(烷基)2 。更佳取代基為鹵基、羥基、氰基、硝基、烷氧基、-O(芳基)、=O、=NOH、=NO(烷基)、-OC(=O)(烷基)、-OC(=O)O(烷基)、-OC(=O)NH2 、-OC(=O)NH(烷基)、-OC(=O)N(烷基)2 、疊氮基、-NH2 、-NH(烷基)、-N(烷基)2 、-NH(芳基)、-NHC(=O)(烷基)、-NHC(=O)H、-NHC(=O)NH2 、-NHC(=O)NH(烷基)、-NHC(=O)N(烷基)2 及-NHC(=NH)NH2 。
在被取代之部份基團為環脂族、雜環脂族、芳基或雜芳基部份基團之情況下，較佳取代基為烷基、烯基、炔基、鹵基、鹵烷基、羥基、羥烷基、氰基、硝基、烷氧基、-O(羥烷基)、-O(鹵烷基)、-O(芳基)、-O(環烷基)、-O(雜環烷基)、烷硫基、芳基硫基、-C(=O)(烷基)、-C(=O)H、-CO2 H、-C(=O)NHOH、-C(=O)O(烷基)、-C(=O)O(羥烷基)、-C(=O)NH2 、-C(=O)NH(烷基)、-C(=O)N(烷基)2 、-OC(=O)(烷基)、-OC(=O)(羥烷基)、-OC(=O)O(烷基)、-OC(=O)O(羥烷基)、-OC(=O)NH2 、-OC(=O)NH(烷基)、-OC(=O)N(烷基)2 、疊氮基、-NH2 、-NH(烷基)、-N(烷基)2 、-NH(芳基)、-NH(羥烷基)、-NHC(=O)(烷基)、-NHC(=O)H、-NHC(=O)NH2 、-NHC(=O)NH(烷基)、-NHC(=O)N(烷基)2 、-NHC(=NH)NH2 、-OSO2 (烷基)、-SH、-S(烷基)、-S(芳基)、-S(環烷基)、-S(=O)烷基、-SO2 (烷基)、-SO2 NH2 、-SO2 NH(烷基)及-SO2 N(烷基)2 。更佳取代基為烷基、烯基、鹵基、鹵烷基、羥基、羥烷基、氰基、硝基、烷氧基、-O(羥烷基)、-C(=O)(烷基)、-C(=O)H、-CO2 H、-C(=O)NHOH、-C(=O)O(烷基)、-C(=O)O(羥烷基)、-C(=O)NH2 、-C(=O)NH(烷基)、-C(=O)N(烷基)2 、-OC(=O)(烷基)、-OC(=O)(羥烷基)、-OC(=O)O(烷基)、-OC(=O)O(羥烷基)、-OC(=O)NH2 、-OC(=O)NH(烷基)、-OC(=O)N(烷基)2 、-NH2 、-NH(烷基)、-N(烷基)2 、-NH(芳基)、-NHC(=O)(烷基)、-NHC(=O)H、-NHC(=O)NH2 、-NHC(=O)NH(烷基)、-NHC(=O)N(烷基)2 及-NHC(=NH)NH2 。
在敘述範圍之情況下，如在"C1 -C5 烷基"或"5至10%"中，此種範圍係包括該範圍之終點，如在第一個情況中之C1 與C5 ，及在第二個情況中之5%與10%。
除非明確地指明特定立體異構物(例如藉由結構式中之有關聯立體中心上之粗或虛鍵結，藉由描繪結構式中之雙鍵為具有E或Z組態，或利用立體化學-指定命名法)，否則所有立體異構物均被包含在本發明之範圍內，作成純化合物以及其混合物。除非另有指出，否則個別對掌異構物、非對映異構物、幾何異構物及其組合與混合物全部均被本發明所涵蓋。
熟諳此藝者將明瞭的是，化合物可具有互變異構形式(例如酮基與烯醇形式)、共振形式及兩性離子形式，其係相當於本文所使用之結構式中所描繪者，且此結構式係涵蓋此種互變異構、共振或兩性離子形式。
"藥學上可接受之酯"係意謂會於活體內(例如在人類身體中)水解以產生母體化合物或其鹽，或本身具有類似母體化合物之活性之酯。適當酯類包括C1 -C5 烷基、C2 -C5 烯基或C2 -C5 炔基酯類，尤其是甲基、乙基或正-丙基。
"藥學上可接受之鹽"係意謂適用於醫藥配方之化合物之鹽。在化合物具有一或多種鹼性基團之情況下，此鹽可為酸加成鹽，譬如硫酸鹽、氫溴酸鹽、酒石酸鹽、甲烷磺酸鹽、順丁烯二酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽、雙羥萘酸鹽(雙羥萘甲酸鹽)、氫碘酸鹽、硝酸鹽、鹽酸鹽、乳酸鹽、硫酸甲鹽、反丁烯二酸鹽、苯甲酸鹽、琥珀酸鹽、甲烷磺酸鹽、乳酸生物酸鹽、辛二酸鹽、甲苯磺酸鹽等。在化合物具有一或多種酸性基團之情況下，此鹽可為以下鹽，譬如鈣鹽、鉀鹽、鎂鹽、葡甲胺鹽、銨鹽、鋅鹽、六氫吡鹽、丁三醇胺鹽、鋰鹽、膽鹼鹽、二乙胺鹽、4-苯基環己胺鹽、苄星(benzathine)鹽、鈉鹽、四甲基銨鹽等。多晶型結晶形式與溶劑合物亦被涵蓋在本發明之範圍內。
化合物
式(II)化合物之較佳具體實施例係以式(II-a)表示
其中n,R1 ,R2 及R3 均如上文關於式(II)所定義，且R4a 為或
在式(II-a)化合物中，相應於天然生成微管溶素(tubulysin)中之Tup/Tut之亞單位，在大小與親脂性上已經由刪除緊接於羧酸基後之兩個脂族碳原子而被降低，達至少兩個碳-意即，胺基目前係對羧酸基為α位，而非對其為γ位。在其中R4 為4-胺基苯基丙胺酸之情況中，胺基係構成會進一步降低親脂性之極性部份基團。SAR研究顯示親脂性為微管溶素(tubulysin)及其類似物或衍生物之生物學活性上之一項重要因素。Steinmetz等人2004與Neri等人2006兩者均揭示愈具親脂性之天然生成微管溶素(tubulysin)-意即具有Tup亞單位(在式I中，RA等於H)代替Tut亞單位(在式I中，RA等於OH)者-愈具有較大生物學活性。再者，在活性上之差異係被保留，而不管Tuv亞單位中之11-醯氧基殘基(在式(I)中之基團RC )之大小與親脂性為何(Steinmetz等人2004)。此等結果顯示親脂性Tup/Tut亞單位為特別重要之SAR元素。
上述觀察部份係部份在Balasubramanian等人之兩種研究中更加証明。在第一種研究(Balasubramanian等人2008)中，於Tup亞單位中，在對羧基為α位之碳上經二甲基化之類似物，係與其他情況下在相同位置處經脫甲基化之相同類似物作比較。經二甲基化之類似物係具有較大抗細胞增殖活性-惟活體外微管蛋白抑制IC50 為可比較-正如可能預期之結果，以其相對親脂性為基礎。但是，此趨勢並未在將三種類似物(一種α-碳係經脫甲基化，一種經單甲基化，及一種經二甲基化)作比較之第二個研究(Balasubramanian等人2009)被遵照。最具活性類似物為經脫甲基化者，然而經單甲基化者-意即具有天然Tup亞單位-顯然為最不具活性者。但是，後述類似物於分子中別處係具有其他修正，使得其基本上呈不活性，造成不清楚可獲取何種SAR推論，若具有時。
Patterson等人2007與Ellman等人2009係比較微管溶素(tubulysin)D與類似物之細胞毒性，其中僅苯乙基或γ-羧基係被保留在Tup亞單位中。苯乙基-保留之類似物針對三種癌細胞系係比微管溶素(tubulysin)D 3.6至13.6倍較不具活性，但當較低親脂性γ-羧基被保留時，有活性之更大損失，自25.7至62.5倍較不具活性。意即，活性之順序為：
上述文件係個別及合併地指出在Thp位點處之親脂性對於微管溶素(tubulysin)之生物學活性是特別重要的。因此，先前技藝指出Tup亞單位以苯丙胺酸(Phe)、4-胺基苯基丙胺酸(4-NH2 Phe)、正纈胺酸或根據式(II-a)之其他R4 亞單位之置換是不期望的，因每一種均會導致至少兩個脂族碳之損失，與Tup/Tut位點處之親脂性上之繼起降低。
式(II)化合物之另一項較佳具體實施例係以式(II-b)表示：
其中n,R1 ,R2 及R3 均如上文關於式(II)所定義。雖然化學式可在文獻中被發現，涵蓋-NH2 基團在Tup芳族環之4-位置上(Domling 2005a與2005b)，但尚無關於具有此種特徵之化合物可如何製造之揭示內容。
在式(II)、(II-a)及(II-b)中，R1 較佳為H、C1 -C5 烷基、C2 -C5 烯基或C2 -C5 烯基，而更佳為異白胺醯基殘基，意即：
在式(II)、(II-a)及(II-b)中，R2 較佳為H、C1 -C5 烷基、C2 -C5 烯基、CH2 O(C1 -C5 烷基)、CH2 O(C2 -C5 烯基)、CH2 O(C=O)(C1 -C5 烷基)或CH2 OC(=O)(C2 -C5 烯基)；而更佳為H、Me、Et、n-Pr、CH2 OMe、CH2 OEt、CH2 O(n-Pr)、CH2 OC(=O)i-Bu、CH2 OC(=O)n-Pr、CH2 OC(=O)CH=CH2 或CH2 OC(=O)Me，其中Me、n-Pr、CH2 OMe、CH2 OC(=O)i-Bu及CH2 O(n-Pr)係為尤佳。
在式(II)、(II-a)及(II-b)中，R3 較佳為H、C1 -C5 烷基、C2 -C5 烯基、C(=O)C1 -C5 烷基或C(=O)C2 -C5 烯基；而更佳為H、Me、Et或C(=O)Me。
在式(II)與(II-a)中，R4 與R4a 較佳為：或
在式(II)、(II-a)及(II-b)中，n較佳為1，且在式(II)之情況中，R5 較佳為甲基；意即，在Mep亞單位中之環較佳為N-甲基六氫吡啶基酮。
根據式(II-a)之化合物之較佳具體實施例係藉由式(II-a')描繪
其中R4a 係如上文關於式(II-a)所定義，R2 為H、C1 -C5 烷基、C2 -C5 烯基、CH2 O(C1 -C5 烷基)、CH2 O(C2 -C5 烯基)、CH2 O(C=O)(C1 -C5 烷基)或CH2 OC(=O)(C2 -C5 烯基)；且R3 為H、C1 -C5 烷基、C2 -C5 烯基、C(=O)C1 -C5 烷基或C(=O)C2 -C5 烯基。R2 較佳為H、Me、Et、n-Pr、CH2 OMe、CH2 OEt、CH2 OC(=O)i-Bu、CH2 OC(=O)n-Pr、CH2 OC(=O)CH=CH2 或CH2 OC(=O)Me；更佳為Me、n-Pr、CH2 OMe、CH2 OC(=O)i-Bu或CH2 O(n-Pr)。R3 較佳為H、Me、Et或C(=O)Me。
根據式(II-b)之化合物之較佳具體實施例係藉由式(II-b')描繪
其中R2 為H、C1 -C5 烷基、C2 -C5 烯基、CH2 O(C1 -C5 烷基)、CH2 O(C2 -C5 烯基)、CH2 O(C=O)(C1 -C5 烷基)或CH2 OC(=O)(C2 -C5 烯基)；且R3 為H、C1 -C5 烷基、C2 -C5 烯基、C(=O)C1 C5 烷基或C(=O)C2 C5 烯基。R2 較佳為H、Me、Et、n-Pr、CH2 OMe、CH2 OEt、CH2 OC(=O)i-Bu、CH2 OC(=O)n-Pr、CH2 OC(=O)CH=CH2 或CH2 OC(=O)Me，且R3 為H、Me、Et或C(=O)Me。
在R4 中之羧基被酯化之情況下，此酯較佳為C1 -C5 烷基酯，譬如Me、Et或Pr酯。或者，羧基可以氨或烷基胺被醯胺酸化。
於另一項具體實施例中，本發明係提供具有以式(II-c)表示之結構之化合物
其中R13 為Me、n-Pr、CH2 OMe或CH2 OC(=O)CH2 CH(Me)2 ；R14 為Me或C(=O)Me；且R15 為H或C1 -C5 烷基(較佳為H、Me或Et)。
在式(II-b)、(II-b')及(II-c)中，在對羧基為α位之甲基上之立體化學較佳為相應於天然生成之微管溶素(tubulysin)者，意即：
於一項較佳具體實施例中，本發明之化合物係呈R4 (或視情況為R4a )中羧基之醯胺形式，伴隨α-胺基酸之α-胺基。α-胺基酸可選自下列組成之組群：蛋白質原胺基酸、4-胺基苯基丙胺酸、正纈胺酸、正白胺酸及瓜胺酸。α-胺基酸較佳係選自下列組成之組群：丙胺酸、正纈胺酸、甘胺酸、離胺酸、精胺酸、瓜胺酸、正白胺酸、4-胺基苯基丙胺酸及苯丙胺酸。α-胺基酸之絕對組態較佳亦為蛋白質原者，意即L。在此項較佳具體實施例中，R4 (或R4a )較佳為：或
根據式(II)之本發明化合物之特殊實例包括化合物(III-a)至(III-y)。一些化合物係被描述為R4 羧基之藥學上可接受酯或藥學上可接受醯胺，伴隨α-胺基酸之α-胺基，或其甲酯。
及
本發明亦提供可用於合成本發明化合物之新穎中間物。根據式(VIII-a)之化合物可被用於製造根據式(II)或(II-b)之化合物，如本文之圖與實例中所陳述者。
在式(VIII-a)中，R7 為H或胺保護基，且R8 為H、C1 -C10 烷基、C2 -C10 烯基、C2 -C10 炔基、芳基、環脂族、烷基環脂族、芳烷基或烷基芳基。R7 較佳為H、Boc(第三-丁氧羰基)、Troc(2,2,2-三氯乙氧基羰基)、Bpoc((1-甲基-1-(4-聯苯基)乙氧羰基))、Cbz(苄氧羰基)、Aloc(烯丙氧基羰基)、甲胺或Fmoc(9-茀基甲氧羰基)。R8 較佳為H或C1 -C5 烷基(尤其是Me)。
另一種可用於合成本發明化合物之新穎中間物係具有根據式(VIII-b)之結構。使用式(VIII-b)化合物以製造本發明化合物係陳述於本文之圖與實例中。
在式(VIII-b)中，R9 與R10 係獨立為H或胺保護基，且R11 為H、C1 -C10 烷基、C2 -C10 烯基、C2 -C10 炔基、芳基、環脂族、烷基環脂族、芳烷基或烷基芳基。R9 與R10 較佳係獨立選自H、Boc、Troc、Bpoc、Cbz、Aloc、甲胺及Fmoc。R11 較佳為H或C1 -C5 烷基(尤其是Me)。在R9 與R10 各為胺保護基之情況下，其較佳為不同胺保護基。
關於式(VIII-a)與(VIII-b)化合物之其他適當胺保護基係揭示於Greene與Wuts，有機合成之保護基 ，第3版，第464-653頁(John Wiley & Sons,New York,1999)中，其揭示內容係併於本文供參考。
共軛物
於另一方面，係提供一種以式(IV)表示之共軛物，其包含根據本發明之細胞毒性化合物與配位體
[D(XD )a C(XZ )b ]m Z　(IV)
其中Z為配位體；D為根據本發明之細胞毒性化合物；且-(X3 )a C(XZ )b -係總稱為"連結基部份基團"或"連結基"，因其係連結Z與D。在連結基內，C為可分裂基團，其係經設計以在化合物D之所意欲生物學作用位置上被分裂；XD 與XZ 係被稱為間隔基部份基團(或"間隔基")，因其係個別隔開D與C及C與Z；下標a與b係獨立為0或1(意即XD 及/或XZ 之存在為選用的)；且下標m為1,2,3,4,5,6,7,8,9或10(較佳為1,2,3或4)。D、XD 、C、XZ 及Z係更完整地定義於下文。
配位體Z-例如抗體-係提供瞄靶功能。藉由結合至其抗原或受體所位於之標的組織或細胞，配位體Z係導引共軛物至該處。標的組織或細胞較佳為癌症組織或細胞，且抗原或受體為腫瘤有關聯之抗原，意即藉由癌細胞獨特表現或藉由癌細胞過度表現之抗原，與非癌性細胞作比較。基團C在標的組織或細胞上之分裂係釋出化合物D，以局部施加其細胞毒性作用。於一些情況中，共軛物係藉由細胞攝粒作用與分裂發生在標的細胞內，而被內部化至標的細胞中。依此方式，化合物D之精確傳輸係在所意欲作用之位置處達成，降低所需要之劑量。而且，化合物D以其共軛狀態通常為生物學上不活性(或顯著地較不具活性)，於是降低針對非標的組織或細胞之不想要毒性。因抗癌藥對細胞一般而言係經常為高度毒性，故此係為一項重要考量。
如藉由下標m所反映，配位體Z之各分子可與超過一個化合物D共軛，依可用於共軛作用之位置D之數目及所採用之實驗條件而定。熟諳此藝者將明瞭的是，雖然配位體Z之各個別分子係被共軛至化合物D之整數，但共軛物之製備可分析關於化合物D對配位體Z之非整數比例，反映出統計平均值。
配位體Z及其共軛作用
配位體Z較佳為抗體。為方便與簡略而非限制起見，本文中關於配位體Z共軛作用之詳細後續討論，係以其為抗體之背景撰寫，但熟諳此藝者將明瞭的是，其他類型之配位體Z可經共軛(加以必要之更改 )。例如，與作為配位體之葉酸之共軛物可以在其表面具有葉酸鹽受體之細胞為標的(Vlahov等人2008a,2008b及2010；Leamon等人2009)。由於相同理由，下文詳細討論係主要以抗體Z對化合物D之1:1比例為觀點而撰寫。
配位體Z較佳為抵抗腫瘤有關聯抗原之抗體，允許包含此種配位體Z之共軛物選擇性地以癌細胞為標的。此種抗原之實例包括：間皮素、前列腺專一細胞膜抗原(PSMA)、CD19、CD22、CD30、CD70、B7H4(亦稱為O8E)、蛋白質酪胺酸激酶7(PTK7)、RG1、CTLA-4及CD44。抗體可為動物(例如老鼠)、嵌合、人化，或較佳為人類。抗體較佳為單株，尤其是單株人類抗體。抵抗一些前述抗原之人類單株抗體之製備，係揭示於Korman等人,US 2009/0074660A1(B7H4)；Rao-Naik等人，US 2009/0142349 A1 A2(CD19)；King等人,WO 2008/070569 A2(CD22)；Keler等人,US 7,387,776B2(2008)(CD30)；Terrett等人,US 2009/0028872 A1(CD70)；Korman等人,US 6,984,720 B1(2006)(CTLA-4)；Korman等人,US 2009/0217401 A1(PD-1)；Huang等人,US 2008/0279868 A1(PSMA)；Lu等人,US 2010/0034826 A1(PTK7)；Harkins等人,US 7,335,748 B2(2008)(RG1)；Terrett等人,WO 2009/045957 A1(間皮素)；及Xu等人，US 2010/0092484 A1(CD44)中；其揭示內容均併於本文供參考。
配位體Z亦可為抗體片段或抗體擬似物，譬如affibody、功能部位抗體(dAb)、毫微體、單一個體、DARPin、anticalin、versabody、duocalin、lipocalin或avimer。
在配位體Z上之數種不同反應性基團之任一種可為共軛位置，包括在離胺酸殘基中之ε-胺基、懸垂碳水化合物部份基團、羧酸基、二硫化物基團及硫醇基。各類型之反應性基團均表示權衡，具有一些優點與一些缺點。關於適用於共軛作用之抗體反應性基團之回顧，參閱，例如Garnett,Adv. Drug Delivery Rev. 53(2001),171-216，及Dubowchik與Walker，藥理學與治療學83(1999),67-123，其揭示內容均併於本文供參考。
於一項具體實施例中，配位體Z係經由離胺酸ε-胺基共軛。大部份抗體具有多重曝露之離胺酸ε-胺基，其可經由醯胺、脲、硫脲或胺基甲酸酯鍵結，使用此項技藝中已知之技術共軛，包括使用異雙官能性劑之修正(如進一步於下文所述者)。但是，難以控制何種ε-胺基及有多少種ε-胺基會反應，導致在共軛物製備時之潛在逐批變異性。而且，共軛作用可造成對於保持抗體原本構形為重要之質子化ε-胺基之中和作用，或可發生在接近抗原結合位置之離胺酸上或於該結合位置上，皆不為所想要之存在處。
於另一項具體實施例中，配位體Z可經由碳水化合物側鏈共軛，因許多抗體係被糖基化。碳水化合物側鏈可以過碘酸鹽氧化，以產生醛基團，其依次可與胺類反應，以形成亞胺基團，譬如在縮胺脲、肟或腙中。若需要，則亞胺基團可經由以氰基硼氫化鈉之還原作用而被轉化成更安定胺基。關於經由碳水化合物側鏈之共軛作用之其他揭示內容，參閱例如Rodwell等人，Proc. Nat'l Acad .Sci. USA 83,2632-2636(1986)；其揭示內容係併於本文供參考。與離胺酸ε-胺基一樣，有關於共軛位置定位與化學計量之再現性之關切事項。
於又另一項具體實施例中，配位體Z可經由羧酸基共軛。於一項具體實施例中，末端羧酸基係被官能基化，以產生二胺脲，其係接著與帶有醛之共軛作用部份基團反應。參閱Fisch等人，生物共軛物化學 1992 ,3,147-153。
於又另一項具體實施例中，抗體Z可經由二硫化物基團共軛，其係橋接在抗體Z上之半胱胺酸殘基及在共軛物其他部份上之硫。一些抗體缺少自由態硫醇基(氫硫基)，但具有二硫化物基團，例如在鉸鏈區域中。於此種情況中，自由態硫醇基可藉由原本二硫化物基團之還原作用而產生。如此產生之硫醇基可接著用於共軛作用。參閱，例如Packard等人,Biochemistry 1986 ,25,3548-3552；King等人，Cancer Res. 54,6176-6185(1994)；及Doronina等人,Nature Biotechnol . 21(7),778-784(2003)；其揭示內容均併於本文供參考。再一次，有關於共軛位置定位與化學計量及抗體原本構形之可能瓦解之關切事項。
多種方法係為關於引進自由態硫醇基至抗體中，而不會使原本二硫鍵斷裂所已知，此方法可以本發明之配位體Z實施。依所採用之方法而定，可引進可預測數目之自由態氫硫基在預定位置處。於一項有效途徑中，係製備突變抗體，其中半胱胺酸係用以取代另一種胺基酸。參閱，例如Eigenbrot等人,US 2007/0092940 A1；Chilkoti等人,Bioconjugate Chem. 1994 ,5 ,504-507；Urnovitz等人,US 4,698,420(1987)；Stimmel等人,J. Biol. Chem. ,275(39),30445-30450(2000)；Bam等人,US 7,311,902 B2(2007)；Kuan等人,J. Biol. Chem. ,269(10),7610-7618(1994)；Poon等人,J. Biol. Chem. ,270(15),8571-8577(1995)。於另一項有效途徑中，係將額外半胱胺酸添加至C-末端中。參閱，例如Cumber等人,J. Immunol. ,149,120-126(1992)；King等人，Cancer Res. ,54,6176-6185(1994)；Li等人,Bioconjugate Chem. ,13,985-995(2002)；Yang等人，蛋白質工程 ,16,761-770(2003)；及Olafson等人，蛋白質施工設計與選擇 ,17,21-27(2004)。關於引進自由態半胱胺酸之較佳方法係為由Liu等人,WO 2009/026274 A1所陳述者，其中帶有胺基酸定序之半胱胺酸係被添加至抗體重鏈之C-末端中。此方法係引進已知數目之半胱胺酸殘基(每重鏈一個)在遠離抗原結合位置之已知位置上。在此段落中所引用文件之揭示內容全部均併於本文供參考。
於又另一項具體實施例中，離胺酸ε-胺基可以異雙官能性試劑譬如2-亞胺基硫伍圜或N-琥珀醯亞胺醯基-3-(2-吡啶基二硫基)-丙酸鹽(SPDP)改質，使ε-胺基轉化成硫醇或二硫化物-可以說是產生半胱胺酸替代品。但是，此方法係遭遇到與適當ε-胺基有關聯之相同共軛作用位置與化學計量限制之問題。
於又另一項較佳具體實施例中，配位體Z係經由硫醇基對受體部份基團之親核性加成產物共軛。較佳受體部份基團為順丁烯二醯亞胺基團，其與抗體硫醇基之反應係一般性地示於下文。硫醇基可為原本者或如上述所引進者。
連結基-(X D ) a C(X Z ) b -
如上述，本發明共軛物之連結基部份包含至高三種元素：可分裂基團C及選用之間隔基XZ 與XD 。
可分裂基團C為可在生理學條件下分裂之基團，較佳係經選擇，以致當共軛物係一般性地在血漿中循環時，該基團為相對較安定，但一旦共軛物抵達接近標的細胞、於其上或在其內之共軛物意欲作用位置，該基團會立即分裂。於抗體Z之結合至標的細胞表面上所顯示之抗原時，共軛物較佳係藉由標的細胞之細胞攝粒作用而被內部化。接著，基團C之分裂係發生在標的細胞之泡囊體中(早期內囊胞、晚期內囊胞，或尤其是溶酶體)。
於一項具體實施例中，基團C為pH敏感性基團。在血漿中之pH係稍微高於中性，然而在溶酶體內部之pH為酸性，大約5。因此，其分裂係經酸催化之基團C，於溶酶體內部，會在數個數量級快於血漿中速率之速率下分裂。適當酸-敏感性基團之實例包括順式-烏頭醯基醯胺類與腙類，如在Shen等人,US 4,631,190(1986)；Shen等人,US 5,144,011(1992)；Shen等人,Biochem. Biophys. Res. Commun., 102,1048-1054(1981)，及Yang等人,Proc. Natl Acad. Sci(USA) ,85,1189-1193(1988)中所述者；其揭示內容均併於本文供參考。
於另一項具體實施例中，基團C為二硫化物。二硫化物可在依賴環境硫醇濃度之速率下，藉由硫醇-二硫化物交換機制分裂。因谷胱甘肽及其他硫醇類之胞內濃度高於其血清濃度，故二硫化物之分裂速率於胞內上為較高。再者，硫醇-二硫化物交換之速率可藉由二硫化物之立體與電子特徵調整而調制(例如烷基-芳基二硫化物對烷基-烷基二硫化物；在芳基環上之取代等)，使得具有增強血清安定性或特定分裂速率之二硫化物鏈結之設計得以實現。關於共軛物中之二硫化物可分裂基團之其他揭示內容，參閱，例如Thorpe等人,Cancer Res. 48,6396-6403(1988)；Santi等人,US 2005/0287155 A1；Ng等人,US 6,989,452 B2(2006)；Ng等人,WO 2002/096910 A1；Boyd等人,US 7,691,962 B2；及Sufi等人，WO 2008/083312 A2；其揭示內容均併於本文供參考。
較佳基團C係包含肽鍵，其係優先地在所意欲作用位置上藉由蛋白酶分裂，與在血清中藉由蛋白酶不同。典型上，基團C包含1至20個胺基酸，較佳為1至6個胺基酸，更佳為1至3個胺基酸。胺基酸可為天然及/或非天然α-胺基酸。天然胺基酸係為被遺傳密碼所編碼者，以及自其衍生之胺基酸，例如羥脯胺酸、γ-羧基麩胺酸酯、瓜胺酸及O-磷酸絲胺酸。胺基酸一詞亦包括胺基酸類似物與擬似物。類似物係為具有天然胺基酸之相同一般H2 N(R)CHCO2 H結構之化合物，惟R基團不為天然胺基酸中所發現者。類似物之實例包括高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸-亞碸及甲硫胺酸甲基鋶。胺基酸擬似物係為具有與α-胺基酸之一般化學結構不同之結構，但以類似其之方式發揮功能之化合物。"非天然胺基酸"一詞係意欲表示"D"立體化學形式，天然胺基酸為"L"形式。
基團C較佳係含有胺基酸定序，其係為蛋白酶之分裂辨識定序。許多分裂辨識定序係為此項技藝中已知。參閱，例如Matayoshi等人Science 247：954(1990)；Dunn等人Meth .Enzymol . 241：254(1994)；Seidah等人Meth .Enzymol . 244：175(1994)；Thornberry,Meth .Enzymol . 244：615(1994)；Weber等人Meth .Enzymol . 244：595(1994)；Smith等人Meth .Enzymol . 244：412(1994)；及Bouvier等人Meth .Enzymol . 248：614(1995)；其揭示內容均併於本文供參考。
對於不意欲被細胞內部化之共軛物而言，基團C可經選擇，以致其係藉由存在於標的組織附近之胞外間質中之蛋白酶分裂，例如藉由近處瀕臨死亡細胞所釋出之蛋白酶或腫瘤有關聯之蛋白酶。舉例之胞外腫瘤有關聯之蛋白酶為間質金屬蛋白酶(MMP)、甲拌磷寡肽酶(TOP)及CD10。
對於經設計以被細胞內部化之共軛物而言，基團C較佳係包含胺基酸定序，其係經選擇用於藉由內囊胞或溶酶體蛋白酶分裂，尤其是後者。此種蛋白酶之非限制性實例包括組織蛋白酶B、C、D、H、L及S，尤其是組織蛋白酶B。組織蛋白酶B係優先地在定序-AA2 -AA1 -下分裂肽，其中AA1 為鹼性或強氫鍵胺基酸(譬如離胺酸、精胺酸或瓜胺酸)，且AA2 為疏水性胺基酸(譬如苯丙胺酸、纈胺酸、丙胺酸、白胺酸或異白胺酸)，例如Val-Cit(其中Cit表示瓜胺酸)或Val-Lys(此處，胺基酸定序係以N-至-C方向書寫，如在H2 N-AA2 -AA1 -CO2 H中，除非內文另有明白指示。)關於組織蛋白酶-可分裂基團之其他資訊，參閱Dubowchik等人,Biorg. Med. Chem. Lett. 8 ,3341-3346(1998)；Dubowchik等人,Bioorg. Med. Chem. Lett .,8 3347-3352(1998)；及Dubowchik等人,Bioconjugate Chem. 13 ,855-869(2002)；其揭示內容均併於本文供參考。可用於分裂肽基連結基之另一種酵素為豆莢蛋白，一種會優先地在Ala-Ala-Asn下分裂之溶酶體半胱胺酸蛋白酶。
於一項具體實施例中，基團C為包含二-胺基酸定序-AA2 -AA1 -之肽，其中AA1 為離胺酸、精胺酸或瓜胺酸，且AA2 為苯丙胺酸、纈胺酸、丙胺酸、白胺酸或異白胺酸。於另一項具體實施例中，C係包含一至五個胺基酸之定序，選自下列組成之組群：Val-Cit、Ala-Val、Val-Ala-Val、Lys-Lys、Ala-Asn-Val、Val-Leu-Lys、Cit-Cit、Val-Lys、Ala-Ala-Asn、Lys、Cit、Ser及Glu。
包含單一胺基酸之可分裂基團C之製備與設計，係揭示於Chen等人,US 2010/0113476 A1中，其揭示內容係併於本文供參考。
基團C亦可為可光分裂者，例如硝基苄基醚，其係在曝露至光時分裂。
基團C可直接結合至抗體Z或化合物D；意即，間隔基XZ 與XD 可視情況為不存在。例如，若基團C為二硫化物，則兩個硫之一可為半胱胺酸殘基或其替代品在抗體Z上。或，基團C可為腙，其係在抗體之碳水化合物側鏈上結合至醛。或，基團C可為與抗體Z之離胺酸ε-胺基一起形成之肽鍵。於一項較佳具體實施例中，化合物D係經由化合物D中對羧基或胺基之肽基鍵結直接結合至基團C。
當存在時，間隔基XZ 係提供基團C與抗體Z間之空間分離，以免前者會立體上干擾藉由後者之抗原結合，或後者會立體上干擾前者之分裂。再者，間隔基XZ 可用以賦予共軛物增加之溶解度或降低之聚集性質。間隔基XZ 可包含一或多個模組鏈段，其可以任何數目之組合被組裝在一起。關於間隔基XZ 之適當鏈段之實例為：及其中下標r為1至24，較佳為2至4。此等鏈段可合併以製成間隔基XZ ，譬如：或
間隔基XD ，若存在時，係提供基團C與化合物D間之空間分離，以免後者會立體上或電子上干擾前者之分裂。間隔基XD 亦可用以引進其他分子質量與化學官能基至共軛物中。一般而言，該其他質量與官能基會影響共軛物之血清半生期及其他性質。因此，經過間隔基之明智選擇，共軛物之半生期可經調制。間隔基XD 亦可組裝自模組鏈段，如上文間隔基XZ 之內文中所述者。
間隔基XZ 或XD 或兩者可包含自行犧牲部份基團。自行犧牲部份基團係為一種部份基團，其係(1)結合至基團C與抗體Z或細胞毒素D，且(2)具有一種結構，以致自基團C之分裂會起始反應順序，而造成自行犧牲部份基團本身視情況自抗體Z或細胞毒素D分離。換言之，在遠離抗體Z或細胞毒素D之位置上之反應(自基團C之分裂)亦會造成XZ -Z或XD -D鍵結斷裂。自行犧牲部份基團之存在，於間隔基XD 之情況中係為所想要的，因為若在共軛物之分裂後，間隔基XD 或其一部份係欲保持連接至細胞毒素D，則後者之生物學活性可被減弱。自行犧牲部份基團之使用，在可分裂基團C為多肽之情況下係尤其是所想要的。
經結合至配對物分子D上之羥基或胺基之舉例自行犧牲部份基團(i)-(v)係示於下文：
自行犧牲部份基團係為在虛線a與b間之結構，使用所示之相鄰結構特徵以提供上下文。自行犧牲部份基團(i)與(v)係結合至化合物D-NH2 (意即，化合物D係經由胺基共軛)，然而自行犧牲部份基團(ii)、(iii)及(iv)係結合至化合物D-OH(意即，化合物D係經由羥基或羧基共軛)。在虛線b上之醯胺鍵結之分裂係釋出醯胺氮作為胺氮，起始反應順序，其係視情況造成虛線a上之鍵結分裂及D-OH或D-NH2 之繼起釋出。關於自行犧牲部份基團之其他揭示內容，參閱Carl等人,J. Med. Chem. ,24(3),479-480(1981)；Carl等人,WO 81/01145(1981)；Dubowchik等人，藥理學與治療學 ,83 ,67-123(1999)；Firestone等人,US 6,214,345 B1(2001)；Toki等人,J. Org. Chem. 67 ,1866-1872(2002)；Doronina等人,Nature Biotechnology 21 (7),778-784(2003)(勘誤表第941頁)；Boyd等人,US 7,691,962 B2；Boyd等人,US 2008/0279868 A1；Sufi等人,WO 2008/083312 A2；Feng,US 7,375,078 B2；及Senter等人,US 2003/0096743 A1；其揭示內容均併於本文供參考。
化合物D-連結基組合物
本發明之共軛物較佳係以下述方式製成，首先將化合物D與連結基(XD )a C(XZ )b 接合，以形成以式(V-a)表示之藥物-連結基組合物：
D-(XD )a C(XZ )b -R31 　(V-a)
其中R31 為一種官能基，適合與抗體Z上之官能基反應，以形成共軛物。適當基團R31 之實例包括：
其中R32 為Cl、Br、F、甲烷磺酸鹽或甲苯磺酸鹽，且R33 為Cl、Br、I、F、OH、-O-N-琥珀醯亞胺醯基、-O-(4-硝基苯基)、-O-五氟苯基或-O-四氟苯基。一般可用於製備適當部份基團D-(XD )a C(XZ )b -R31 之化學係揭示於Ng等人,US 7,087,600 B2(2006)；Ng等人,US 6,989,452 B2(2006)；Ng等人,US 7,129,261 B2(2006)；Ng等人,WO 02/096910 A1；Boyd等人,US 7,691,962 B2；Chen等人,US 2006/0004081 A1；Gangwar等人,US 2006/0247295 A1；Boyd等人,US 2008/0279868 A1；Gangwar等人,US 2008/0281102 A1；Gangwar等人,US 2008/0293800 A1；Sufi等人,WO 2008/083312 A2；及Chen等人,US 2010/0113476 A1；其揭示內容均併於本文供參考。
於一項較佳具體實施例中，R31 為順丁烯二醯亞胺，且細胞毒性化合物-連結基分子可以式(V-b)表示：
其中n為0,1或2；R1 、R2 及R3 係獨立為H、未經取代或經取代之C1 -C10 烷基、未經取代或經取代之C2 -C10 烯基、未經取代或經取代之C2 -C10 炔基、未經取代或經取代之芳基、未經取代或經取代之雜芳基、未經取代或經取代之(CH2 )1-2 O(C1 -C10 烷基)、未經取代或經取代之(CH2 )1-2 O(C2 -C10 烯基)、未經取代或經取代之(CH2 )1-2 O(C2 -C10 炔基)、(CH2 )1-2 OC(=O)(C1 -C10 烷基)、未經取代或經取代之(CH2 )1-2 OC(=O)(C2 -C10 烯基)、未經取代或經取代之(CH2 )1-2 OC(=O)(C2 -C10 炔基)、未經取代或經取代之C(=O)(C1 -C10 烷基)、未經取代或經取代之C(=O)(C2 -C10 烯基)、未經取代或經取代之C(=O)(C2 -C10 炔基)、未經取代或經取代之環脂族、未經取代或經取代之雜環脂族、未經取代或經取代之芳烷基或未經取代或經取代之烷基芳基；R4’ 為
其中R12 為H、C1 -C5 烷基、C2 -C5 烯基或C2 -C5 炔基；且R5 為H、C1 -C5 烷基、C2 -C5 烯基、C2 -C5 炔基、CO(C1 -C5 烷基)、CO(C2 -C5 烯基)或CO(C2 -C5 炔基)；XD 與XZ 為間隔基；C為可分裂基團；及a與b係獨立為0或1；其中基團R4’ 係經由於其中之羧基或胺基連結至基團XD (在a為1之情況中)或至基團C(在a為0之情況中)。
在R4’ 中之羧基或胺基與基團XD 或C間之連結較佳係視情況經由醯胺鍵結。
在以下結構中
在對羧基為α位之甲基上之立體化學較佳係相應於天然生成之微管溶素(tubulysin)，意即：
較佳情況是，在式(V-b)中，n為1，R1 為異白胺醯基殘基，a為0，b為1，且C包含一至五個胺基酸(較佳為一至二個)，及R4’ 係藉由可以酵素方式分裂之肽基鍵結結合至C，而R5 為Me。此項較佳具體實施例係以式(V-c)表示：
其中R2 、R3 及R4’ 均如關於式(V-b)所定義，各AA係獨立為天然胺基酸，且XZ 為CH2 CH2 NHC(=O)(CH2 )2-5 或C(=O)(CH2 )2-5 。較佳胺基酸AA為離胺酸、瓜胺酸、丙胺酸、纈胺酸、甘胺酸及苯丙胺酸。
在式(V-b)中，R1 較佳為H、C1 -C5 烷基、C2 -C5 烯基或C2 -C5 烯基，而更佳為異白胺醯基殘基，意即：
在式(V-b)與(V-c)中，R2 較佳為H、C1 -C5 烷基、C2 -C5 烯基、CH2 O(C1 -C5 烷基)、CH2 O(C2 -C5 烯基)、CH2 O(C=O)(C1 -C5 烷基)或CH2 OC(=O)(C2 -C5 烯基)；而更佳為為H、Me、Et、CH2 OMe、CH2 OEt、CH2 OC(=O)i-Bu、CH2 OC(=O)n-Pr、CH2 OC(=O)CH=CH2 或CH2 OC(=O)Me。
在式(V-b)與(V-c)中，R3 較佳為H、C1 -C5 烷基、C2 -C5 烯基、C(=O)C1 -C5 烷基或C(=O)C2 -C5 烯基；而更佳為為H、Me、Et或C(=O)Me。
在式(V-b)與(V-c)中，R4’ 較佳為
其中等於以下之R4’
及等於H、Me或Et之R12 為尤佳。
在式(V-b)中，n較佳為1，且R5 較佳為甲基；意即，在Mep亞單位中之環較佳為N-甲基六氫吡啶基酮。
於另一項具體實施例中，本發明係提供具有以式(V-d)表示之結構之化合物
其中R13 為Me、n-Pr、CH2 OMe或CH2 OC(=O)CH2 CH(Me)2 ；R14 為Me或C(=O)Me；且R15 為H或C1 -C5 烷基(較佳為H、Me或Et)；R16 為離胺酸((CH2 )4 NH2 )或瓜胺酸((CH2 )3 NHC(=O)NH2 )側鏈基團；R17 為纈胺酸(C(Me)2 )或丙胺酸(Me)側鏈基團；及p為0或1。
本發明之特定細胞毒性化合物-連結基構造物之實例，係示於下文式(VI-a)至(VI-t)中。化合物-連結基(VI-n)係為尤佳。其具有順丁烯二醯亞胺，且係預備藉由譬如下文所述之程序，經由於其上之氫硫基共軛至抗體。
共軛物之製備
下文為說明性程序，以自由態硫醇基之引進至抗體中為基礎，其方式是離胺酸ε-胺基與2-亞胺基硫伍圜之反應，接著為與含順丁烯二醯亞胺之藥物-連結基部份基團之反應，譬如上文所述者。首先，抗體係被緩衝劑交換至含有50 mM NaCl與2 mM二乙三胺五醋酸(DTPA)之0.1M磷酸鹽緩衝劑(pH 8.0)中，並濃縮至5-10毫克/毫升。硫醇化作用係經過添加2-亞胺基硫伍圜至抗體中而達成。欲被添加2-亞胺基硫伍圜之量可藉由初步實驗測定，且會隨著抗體而改變。於初步實驗中，將漸增量之2-亞胺基硫伍圜之滴定量添加至抗體中，且在與抗體於室溫(室溫大約25℃)下一起培養1小時之後，抗體係使用SEPHADEXTM G-25管柱，被脫鹽至50 mM pH 6.0 HEPES緩衝劑中，而所引進硫醇基之數目係經由與二硫基雙吡啶(DTDP)之反應而快速地測定。硫醇基與DTDP之反應會造成硫代吡啶之釋出，其可在324毫微米下以光譜方式監測。典型上係使用在0.5-1.0毫克/毫升之蛋白質濃度下之試樣。在280毫微米下之吸光率可用以精確地測定試樣中之蛋白質濃度，然後將一液份之各試樣(0.9毫升)與0.1毫升DTDP(在乙醇中之5 mM儲備溶液)於室溫下一起培養10分鐘。亦伴隨著單獨緩衝劑加上DTDP之空白試驗試樣一起培養。於10分鐘後，度量在324毫微米下之吸光率，且硫醇基之數目係使用19,800 M-1 之關於硫代吡啶之消光係數定量。
典型上，每抗體約三個硫醇基之硫醇化作用程度係為所想要的。例如，使用一些抗體，這可藉由添加15-倍莫耳過量之2-亞胺基硫伍圜，接著在室溫下培養1小時而達成。然後，將抗體與2-亞胺基硫伍圜，在所要之莫耳比下培養，接著脫鹽至共軛作用緩衝劑(含有5 mM甘胺酸與2 mM DTPA之50 mM pH 6.0 HEPES緩衝劑)中。經硫醇化之物質係被保持在冰上，同時所引進硫醇類之數目係按上述定量。
於確認所引進硫醇類之數目後，在每一硫醇3-倍莫耳過量下添加藥物-連結基部份基團。使共軛反應在亦含有最後濃度為5%之二甲亞碸(DMSO)或類似替代溶劑之共軛作用緩衝劑中進行。通常，使藥物-連結基儲備溶液溶於100%DMSO中。將儲備溶液直接添加至經硫醇化之抗體中，其具有所添加之足夠DMSO，以使最後濃度來到10%，或在含有最後濃度為10%之DMSO之共軛作用緩衝劑中預稀釋，接著添加至等體積之經硫醇化抗體中。
將共軛反應混合物於室溫下培養2小時，並攪拌。在培養之後，使共軛反應混合物離心，並經過0.2微米濾器過濾。共軛物之純化可經過層析，使用多種方法達成。於一種方法中，使共軛物在以含有5 mM甘胺酸與50 mM NaCl之50 mM pH 7.2 HEPES緩衝劑預先達成平衡之SEPHACRYLTM S200管柱上，使用尺寸排阻層析純化。層析係於28公分/小時之線性流速下進行。收集含有共軛物之溶離份，匯集，及濃縮。在一種替代方法中，純化可經過離子交換層析達成。條件係隨著抗體而改變，且應於各情況中達最佳化。例如，將抗體-藥物共軛物反應混合物施用至在含有5 mM甘胺酸之50 mM pH 5.5 HEPES中預先達成平衡之SP-SEPHAROSETM 管柱。使用pH 5.5下之0-1M NaCl在平衡緩衝液中之梯度液，使抗體共軛物溶離。匯集含有共軛物之有關聯溶離份，並對著調配物緩衝劑(含有5 mM甘胺酸與100 mM NaCl之50 mM pH 7.2 HEPES緩衝劑)滲析。
熟諳此藝者將明瞭的是，上述條件與操作法係為舉例及非限制性，且關於共軛作用之其他途徑係為此項技藝中所已知，並可使用於本發明中。
使用前述技術，本發明化合物係使用抗體2A10，一種抗-PSMA抗體(Huang等人,US 2009/0297438)；2H5，一種抗-CD70抗體(Terrett等人,US 2009/0028872)；1F4，一種抗-CD70抗體(Coccia等人,WO 2008/074004)；或6A4，一種抗-間皮素抗體(Terrett等人,WO 2009/045957)共軛。所形成之共軛物可藉由下列化學式描繪，其中Ab表示抗體。熟諳此藝者將明瞭的是，在此等化學式中，為簡化起見，細胞毒素-抗體化合物比例係顯示為1:1，但事實上，該比例係經常為較大，譬如在2至3之間。
醫藥組合物
於另一方面，本發明揭示內容係提供一種醫藥組合物，其包含本發明揭示內容之化合物，與藥學上可接受之賦形劑一起調配。其可視情況含有一或多種其他醫藥活性成份，譬如抗體或另一種藥物。醫藥組合物可以使用另一種治療劑，尤其是另一種抗癌劑之組合療法投藥。
醫藥組合物可包含一或多種賦形劑。可使用之賦形劑包括載劑、表面活性劑、增稠或乳化劑、固體黏合劑、分散液或懸浮液助劑、增溶劑、著色劑、矯味劑、塗層、崩解劑、潤滑劑、增甜劑、防腐劑、等滲劑及其組合。適當賦形劑之選擇與用途係陳述於Gennaro編著,Remington：製藥科學與實務 ，第20版(Lippincott Williams ＆ Wilkins 2003)，其揭示內容係併於本文供參考。
醫藥組合物較佳係適用於靜脈內、肌內、皮下、非經腸、脊髓或表皮投藥(例如藉由注射或灌注)。依投藥途徑而定，活性化合物可以一種物質塗覆，以保護其免於酸類作用及可使其失活之其他天然條件。"非經腸投藥"措辭係意謂經腸與局部投藥以外之投藥模式，通常藉由注射，且包括而不限於靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜腔內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蜘蛛膜下、椎管內、硬膜外及胸骨內注射與灌注。或者，醫藥組合物可經由經腸途徑投藥，譬如局部、表皮或黏膜投藥途徑，例如以鼻內方式、經口方式、陰道方式、直腸方式、舌下方式或局部方式。
醫藥組合物可呈無菌水溶液或分散液之形式。其亦可經調配在微乳化液、微脂粒或其他適合用以達成高藥物濃度之有序結構中。
可與載劑物質合併以產生單一劑型之活性成份之量係依被治療之病患與特定投藥模式而改變，且一般情況是會產生治療效果之組合物之量。一般而言，在一百個百分比之中，此量之範圍為約0.01百分比至約九十九百分比之活性成份，較佳為約0.1百分比至約70百分比，最佳為約1百分比至約30百分比之活性成份，且併用藥學上可接受之載劑。
劑量服用法係經調整以提供治療回應。例如，可投予單一大丸劑，可隨著時間投予數個分離劑量，或劑量可按由狀況之迫切性所指示，而成比例地減少或增加。尤其有利的是，為了易於投藥與劑量均勻性，係調配呈劑量單位形式之非經腸組合物。"劑量單位形式"係指適合作為單一劑量之物理上分立單位，以供欲被治療之病患使用；各單位含有預定量之活性化合物，經計算以產生所要之治療回應，且伴隨著所需要之醫藥載劑。
劑量範圍為約0.0001至100毫克/公斤，且更通常為0.01至5毫克/公斤宿主體重。例如，劑量可為0.3毫克/公斤體重、1毫克/公斤體重、3毫克/公斤體重、5毫克/公斤體重或10毫克/公斤體重，或在1-10毫克/公斤之範圍內。舉例之治療服用法為每週投藥一次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次、每月一次、每3個月一次或每三至6個月一次。較佳劑量服用法包括1毫克/公斤體重或3毫克/公斤體重，經由靜脈內投藥，使用下列服藥時間表之一：(i)每四週，用於六份劑量，然後每三個月；(ii)每三週；(iii)3毫克/公斤體重，一次，接著為1毫克/公斤體重，每三週。在一些方法中，劑量係經調整，以達成血漿抗體濃度為約1-1000微克/毫升，而在一些方法中為約25-300微克/毫升。
"治療上有效量"之本發明化合物較佳係造成疾病徵候嚴重性上之降低，無疾病徵候期間之頻率與延續時間上之增加，或由於此疾病折磨所致減弱或病廢之預防。例如，對於治療帶有腫瘤之病患，"治療上有效量"較佳係抑制腫瘤生長達至少約20%，更佳為達至少約40%，又更佳為達至少約60%，而又更佳為達至少約80%，相對於未經治療之病患。治療上有效量之治療化合物可在病患中(其典型上為人類，但可為另一種哺乳動物)降低腫瘤大小，或在其他情況下改善病徵。
醫藥組合物可為受控或持續釋出配方，包括植入物、經皮貼藥及微包膠傳輸系統。可使用生物可降解、生物可相容之聚合體，譬如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐類、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯及聚乳酸。參閱，例如持續與受控釋出藥物傳輸系統 ，J.R. Robinson編著，Marcel Dekker公司，New York,1978。
治療組合物可經由醫療裝置投予，譬如(1)無針皮下注射裝置(例如US 5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；及4,596,556)；(2)微灌注泵(US 4,487,603)；(3)經皮裝置(US 4,486,194)；(4)灌注設備(US 4,447,233與4,447,224)；及(5)滲透裝置(US 4,439,196與4,475,196)；其揭示內容均併於本文供參考。
在某些具體實施例中，醫藥組合物可經調配以確保適當分佈於活體內。例如，為確保本發明之治療化合物越過血液-腦部障壁，其可被調配在微脂粒中，其可另外包含瞄靶部份基團，以增強選擇性輸送至特定細胞或器官。參閱，例如US 4,522,811；5,374,548；5,416,016；及5,399,331；V.V. Ranade(1989)J. Clin. Pharmacol. 29： 685；Umezawa等人,(1988)Biochem.Biophys. Res. Commun. 153： 1038；Bloeman等人(1995)FEBS Lett. 357： 140；M. Owais等人(1995)Antimicrob. Agents Chemother. 39： 180；Briscoe等人(1995)Am. J. Physiol. 1233： 134；Schreier等人(1994)J. Biol. Chem. 269： 9090；Keinanen與Laukkanen(1994)FEBS Lett. 346： 123；及Killion與Fidler(1994)Immunomethods 4： 273。
用途
本發明化合物或其共軛物可用於治療疾病，譬如但不限於過度增殖性疾病，包括：頭部與頸部之癌症，其包括頭部、頸部、鼻腔、鼻旁竇、鼻咽、口腔、口咽、喉、咽下部、唾液腺之腫瘤，及亞神經節瘤；肝臟與膽樹之癌症，特別是肝細胞癌；腸癌，特別是結腸直腸癌；卵巢癌；小細胞與非小細胞肺癌(SCLC與NSCLC)；乳癌肉瘤，譬如纖維肉瘤、惡性纖維狀組織細胞瘤、胚胎橫紋肌肉瘤、平滑肌肉瘤、神經纖維肉瘤、骨肉瘤、滑膜肉瘤、脂肉瘤及肺胞性軟部肉瘤；白血病，譬如急性前骨髓細胞白血病(APL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴胚細胞白血病(ALL)及慢性骨髓性白血病(CML)；中樞神經系統之贅瘤，特別是腦癌；多發性骨髓瘤(MM)，淋巴瘤，譬如霍奇金(Hodgkin)氏淋巴瘤、淋巴漿細胞淋巴瘤、濾胞淋巴瘤、黏膜有關聯之淋巴樣組織淋巴瘤、外膜細胞淋巴瘤、B-細胞大細胞淋巴瘤、巴氏(Burkitt)淋巴瘤及T-細胞大細胞淋巴退變瘤。臨床上，本文中所述組合物之方法與用途之實施，會造成癌生長之大小或數目上之減少及/或有關聯病徵上之降低(在適用之情況下)。病理學上，本文中所述組合物之方法與用途之實施將產生病理學上有關聯之回應，譬如：癌細胞增殖之抑制、癌症或腫瘤大小上之降低、進一步轉移之預防及腫瘤血管生成之抑制。治療此種疾病之方法包括對病患投予治療上有效量之本發明組合。此方法可按需要重複。癌症可尤其是結腸直腸癌、肝癌、前列腺癌、乳癌、黑色素瘤、神經膠質母細胞瘤、肺癌、胰癌、卵巢癌、多發性骨髓瘤、腎癌、白血病(尤其是ALL、APL或AML)或淋巴瘤。
本發明化合物或其共軛物可併用其他抗癌或細胞毒劑一起投藥，包括抗體、烷基化劑、血管生成抑制劑、抗代謝物、DNA分裂劑、DNA交聯劑、DNA插入劑、DNA小溝結合劑、烯二炔類、熱震蛋白質90抑制劑、組織蛋白脫乙醯酶抑制劑、免疫調制劑、微管安定劑、核苷(嘌呤或嘧啶)類似物、核輸出抑制劑、蛋白質降解體抑制劑、拓樸異構酶(I或II)抑制劑、酪胺酸激酶抑制劑及絲胺酸/蘇胺酸激酶抑制劑。專一抗癌症或細胞毒劑包括β-拉帕醌、安沙米托辛(ansamitocin) P3、歐利制菌素(auristatin)、二卡如醯胺(bicalutamide)、博來黴素、博替左米(bortezomib)、白血福恩(busulfan)、卡林斯定(callistatin) A、喜樹鹼、卡配西塔賓(capecitabine)、CC-1065、順氯胺鉑、隱藻素、道諾紅菌素、戴索唑(disorazole)、多謝他索(docetaxel)、多克索紅菌素、都卡黴素(duocarmycin)、達內黴素(dynemycin) A、艾波希酮(epothilone)、衣托糖苷(etoposide)、5-氟脫氧尿苷、5-氟脫氧尿苷、弗達拉賓(fludarabine)、氟尿嘧啶、吉非汀尼伯(gefitinib)、吉丹那黴素(geldanamycin)、17-烯丙基胺基-17-脫甲氧基-吉丹那黴素(geldanamycin)(17-AAG)、17-(2-二甲胺基乙基)胺基17-脫甲氧基吉丹那黴素(17-DMAG)、真西塔賓(gemcitabine)、羥基脲、愛馬汀尼伯(imatinib)、干擾素、間白血球活素、伊利諾提肯(irinotecan)、美坦生(maytansine)、胺甲喋呤、絲裂黴素C、草酸胺鉑、太平洋紫杉醇、癸二醯基醯基苯胺異羥肟酸(SAHA)、噻替哌(thiotepa)、拓波提肯(topotecan)、三氯制菌素(trichostatin) A、長春花鹼、長春新鹼、長春花素、連那利多麥(lenalidomide)()、貝發西馬伯(bevacizumab)()、搓史圖諸馬伯(trastuzumab)()及些圖西馬伯(cetuximab)()。
 實例
本發明之實施可參考下文實例而進一步明瞭，其係藉由說明方式提供，而非限制。
實例1-圖式1
圖式l(圖la 與lb )係描繪一種關於製成本發明化合物之方法。
硫醯胺 2. 　於室溫(RT)下，將2,2-二乙氧基乙腈1 (25克，193毫莫耳)與(NH4 )2 S(40毫升，265毫莫耳，45%水溶液)在300毫升甲醇(MeOH)中混合。使反應混合物保持過夜後，使其在真空下濃縮，並使殘留物溶於醋酸乙酯(EtOAc)中。將EtOAc溶液以飽和NaHCO3 溶液，接著以鹽水洗滌，且以無水Na2 SO4 脫水乾燥。使EtOAc蒸發，而得硫醯胺2(26克，159毫莫耳，82%)，為白色固體。1 HNMR(400 MHz,CDCl3 )δ5.01(s,1H),3.67(m,4H),1.22(t,J=7.2 Hz,6H)。
2-(二乙氧基甲基)噻唑-4-羧酸甲酯3. 　將100克分子篩(3A)添加至硫醯胺2 (25克，153毫莫耳)與溴基丙酮酸甲酯(20毫升，163毫莫耳)在300毫升MeOH中之反應混合物內。使混合物回流1.5小時後，使其冷卻，並經過CELITETM 過濾。使濾液濃縮，且通過管柱(二氯甲烷(DCM)：EtOAc，8:1)，獲得噻唑羧酸酯3(34.5克，140毫莫耳，91%)，為固體，將其使用於下一步驟，無需進一步純化。
2-甲醯基噻唑-4-羧酸甲酯4. 　使噻唑-4-羧酸酯3 (30克，122毫莫耳)溶於300毫升丙酮中，於其中添加HCl水溶液(21毫升，2M)。使反應混合物在室溫下保持過夜後，將反應混合物加熱，並於60℃下保持2小時。然後，使反應混合物冷卻，且在真空下蒸發，獲得殘留物，使其溶於200毫升DCM中。接著，將DCM溶液以飽和NaHCO3 溶液，然後以鹽水洗滌，及以無水Na2 SO4 脫水乾燥。過濾DCM溶液，並在真空下濃縮，獲得濃溶液，將其藉由醚研製，獲得2-甲醯基噻唑-4-羧酸甲酯4 (14克，82毫莫耳，54%，歷經兩個步驟)，為白色固體。1 HNMR(400 MHz,CDCl3 )δ133-8-p 110.16(d,J=1.3 Hz,1H),8.53(d,J=1.3 Hz,1H),4.01(s,3H)。
亞磺醯基亞胺 7 .　使(S)-2-甲基丙烷-2-亞磺醯基醯胺5 (7.3毫升，68毫莫耳)溶於100毫升四氫呋喃(THF)中，在室溫下，於其中添加Ti(OEt)4 (27毫升，130毫莫耳)與3-甲基-2-丁酮6 (8克，41毫莫耳)。使反應混合物回流過夜，然後冷卻，並添加至鹽水溶液中。過濾所形成之混合物，且將濾餅以EtOAc洗滌。使有機相濃縮，獲得殘留物，使其接受矽膠管柱層析(DCM：EtOAc，4:1)，獲得亞磺醯基亞胺7 (9.5克，37毫莫耳，75%)，為油狀物。1 HNMR(400 MHz,CDCl3 )δ2.53(m,1H),2.29(s,3H),1.22(s,9H),1.12(d,J=4.2 Hz,3H),1.10(d,J=4.2 Hz,3H)MS(ES+)m/z,計算值：m+1,190.12,實測值190。
化合物 8 . 　於-78℃下，將鋰二異丙基胺("LDA"，60毫升，108毫莫耳，1.8M)添加至200毫升醚中，接著添加200毫升醚中之亞磺醯基亞胺7 (18.9克，100毫莫耳)，並將所形成之反應混合物攪拌40分鐘。將ClTi(OiPr)3 (203毫莫耳，48.4毫升)添加至反應混合物中，且將溶液攪拌60分鐘。將2-甲醯基噻唑-4-羧酸甲酯4 (12.5克，72.6毫莫耳)在180毫升THF中之溶液慢慢添加至反應混合物中。於-78℃下另外2小時後，添加醋酸與THF之混合物(1/5 v/v，4.9毫升)。使混合物溫熱至5℃，歷經1小時，然後倒入鹽水溶液中。接著，將所要之產物以醚與EtOAc溶液自鹽水溶液萃取。然後，使有機相以無水MgSO4 脫水乾燥，過濾，及蒸發。使殘留物通過2個管柱(DCM：EtOAc與己烷：EtOAc)，獲得化合物8 (19.6克，54毫莫耳，75%)，為油狀物。MS(ES+)m/z,計算值：m+1,361.12,實測值361。
化合物 9 . 　使化合物8 (19克，52.7毫莫耳)在200毫升THF中之溶液冷卻至-78℃，然後慢慢添加Ti(OEt)4 (21.7毫升，105毫莫耳)。60分鐘後，當溶液變得透明時，添加NaBH4 (31毫莫耳，1.17克)，在2小時(較長反應時間會造成酯之還原作用)後，添加10毫升MeOH。接著，使混合物溫熱至0℃，倒入大量冰中之1毫升HOAc內。過濾混合物，並將濾餅以EtOAc洗滌。於分離後，使有機相以Na2 SO4 脫水乾燥，且蒸發。使最後殘留物通過管柱(DCM：EtOAc，1:4)，獲得化合物9 (19克，52毫莫耳，99%)，為油狀物。1 HNMR(400 MHz,CDCl3 )δ8.1(s,1H),5.54(d,J=6.7 Hz,1H),5.16(m,1H),3.92(s,3H),3.42((m,1H),3.32(d,J=8.4 Hz,1H),2.25(m,1H),1.88(m,1H),1.68(m,1H),1.26(s,9H),0.91(d,J=6.8 Hz,3H),0.87(d,J=6.7 Hz,3H).13 CNMR(100 MHz,CDCl3 )δ177.9,162.1,146.6,127.7,67.9,58.6,56.4,52.5,40.8,33.9,23.1,19.8,17.4. MS(ES+) m/z,計算值：m+1,363.13,實測值363。
二甲基化之化合物 10 . 　於5℃下，將氫化鈉(9.69毫莫耳，60%，387毫克)添加至化合物9 在6毫升N,N-二甲基甲醯胺(DMF)中之溶液內，於60分鐘後，接著為碘化甲烷(607微升，9.7毫莫耳)。將反應混合物攪拌3小時後，將混合物倒入冰冷飽和NH4 Cl溶液中。添加乙醚，並將有機層以鹽水洗滌，以無水MgSO4 脫水乾燥，及濃縮，而得殘留物。使殘留物通過管柱(己烷：EtOAc 1:4)，獲得二甲基化之化合物10 (314毫克，0.805毫莫耳，33%)，為液體。1 HNMR(400 MHz,CDCl3 )δ8.17(s,1H),4.87(dd,J=11.0 Hz,J=2.5 Hz,1H),3.94(s,3H),3.50(s,3H),3.40(m,1H),2.58(s,3H),1.99(m,1H),1.83(m,2H),1.25(s,9H),0.98(d,J=6.8 Hz,3H),0.95(d,J=6.7 Hz,3H)MS(ES+) m/z,計算值：m+1,391.16,實測值391。
單甲胺 11 . 　將HCl水溶液(4N，在二氧陸圜中，0.5毫升)添加至二甲基化之化合物10 (370毫克，0.95毫莫耳)在5毫升MeOH中之溶液內。將反應混合物攪拌60分鐘後，使其在真空下蒸發，獲得單甲胺11 (362毫克)，為其HCl鹽，將其使用於下一步驟，無需進一步純化。MS(ES+) m/z,計算值：m+1,287.14,實測值287。
醯 胺 12 . 　於室溫下，將單甲胺11 (362毫克，1.12毫莫耳)、Fmoc化合物22 (根據Wipf等人2007製成；1.2克，3.38毫莫耳)及N,N-二異丙基乙胺(DIEA，976微升，5.6毫莫耳)在5毫升DMF中混合。於攪拌24小時後，濃縮混合物，並使殘留物溶於EtOAc中。將有機相以NaHCO3 、鹽水洗滌，以無水MgSO4 脫水乾燥，及濃縮，而得殘留物。使殘留物通過管柱(己烷：EtOAt：MeOH 7:3:0.6)，獲得醯胺12 (466毫克，0.75毫莫耳，67%)，為油狀物。(ES+) m/z,計算值:m+1,622.2,實測值622。
化合物 13 . 　於室溫下，使醯胺12 (466毫克，0.75毫莫耳)溶於含有5%六氫吡啶之8毫升DCM中。1小時後，在真空下蒸發混合物，並使殘留物通過管柱，而得油狀物(150毫克)，然後，將其與(D)-N-甲基甲基六氫吡啶酸23 ("D-Mep"，根據Peltier等人,2006製成；50毫克，0.35毫莫耳)、六氟磷酸N,N,N',N'-四甲基-O-(7-氮苯并三唑-1-基)("HATU"，126毫克，0.33毫莫耳)、DIEA(152微升，0.84毫莫耳)在2毫升DCM中混合。於攪拌2.5小時後，蒸發溶劑，獲得殘留物，使其溶於EtOAc中。接著，將有機相以飽和NaHCO3 、鹽水洗滌，以無水MgSO4 脫水乾燥，及濃縮，而得殘留物。使殘留物通過管柱(DCM：MeOH 0-10%)，獲得化合物13 (99毫克，0,188毫莫耳，25%)，為油狀物。MS(ES+)m/z,計算值：m+1,525.3,實測值525。
酸 14 .使化合物13 (99毫克，0.18毫莫耳)溶於3毫升MeOH與水(3:1 v：v)之混合物中，於其中添加NaOH(370微升，0.37毫莫耳，1M)。在攪拌兩小時後，使反應混合物中和，及濃縮，而得殘留物。使殘留物通過C-18管柱(水(1%三氟醋酸("TFA"))：乙腈(ACN)(1% TFA)，0-100%)，獲得酸14 (78毫克，0.125毫莫耳，69%)，為TFA鹽。MS(ES+)m/z,計算值：m+1,511.29,實測值511。
化合物 15 .　於室溫下，將DIEA(24微升，137微莫耳)添加至酸14 (9毫克，14.4微莫耳，TFA鹽)與HATU(6毫克，15微莫耳)在DMF(0.5毫升)中之溶液內。使所有酸14 活化(藉HPLC監測)後，添加管式苯丙胺酸(根據Peltier等人2006製成；6.5毫克，27微莫耳，HCl鹽)。在攪拌20分鐘後，使反應混合物通過C-18管柱(水(1% TFA)：ACN(1% TFA)，0-100%)，獲得化合物15 (2.5毫克，3微莫耳，21%)，為白色TFA鹽。MS(ES+)m/z，計算值：m+1,700.4,實測值700。
化 合物 16. 　將DIEA(20微升，0.11毫莫耳)添加至酸14 (12毫克，0.019毫莫耳，TFA鹽)、苯丙胺酸甲酯(5.3毫克，0.024毫莫耳，為HCl鹽)及HATU(11.4毫克，0.03毫莫耳)在0.5毫升DMF中之溶液內。30分鐘後，使反應混合物通過C-18管柱(水(1% TFA)：ACN(1% TFA)0-100%)，獲得化合物16 (4.2毫克，0.005毫莫耳，26%)，為白色TFA鹽。MS(ES+)m/z,計算值：m+1,672.89,實測值672.5。化合物16 亦被稱為上文化合物(III-c)。
化合物 17. 　將DIEA(7微升，0.04毫莫耳)添加至酸14 (5毫克，0.008毫莫耳)、正纈胺酸甲酯("NVaM"，2毫克，0.012毫莫耳)及HATU(4.5毫克，0.012毫莫耳)在DMF中之溶液內。將反應混合物攪拌30分鐘後，使粗製混合物通過C-18管柱(水(1% TFA)：ACN(1% TFA)0-100%)，獲得化合物17 (1.3毫克，0.0017毫莫耳，21%)，為白色TFA鹽。MS(ES+)m/z,計算值：m+1,624.85，實測值624.5。化合物17 亦被稱為上文化合物(III-e)。
酸18. 　將NaOH水溶液(75微升，0.75毫莫耳，10M)添加至化合物16 (168毫克，0.25毫莫耳)在MeOH與THF之混合物中之溶液內。於攪拌過夜後，使混合物中和，並凍乾至乾涸。將固體使用於下一步驟，無需進一步純化。MS(ES+)m/z,計算值：m+1,658.36,實測值658.4。酸18 亦被稱為上文化合物(III-o)。
正纈胺醯基醯胺 19 .將DIEA(5微升，0.03毫莫耳)添加至酸18 (5毫克，0.006毫莫耳)、HATU(3.5毫克，0.009毫莫耳)及NVaM(1.5毫克，0.009毫莫耳)在DMF中之溶液內。於攪拌30分鐘後，使反應混合物通過C-18管柱(水(1% TFA)：ACN(1% TFA) 0-100%)，獲得正纈胺醯基醯胺19 (2.2毫克，0.0025毫莫耳，40%)，為白色TFA鹽。MS(ES+)m/z ,計算值：m+1,772.02,實測值771.5。正纈胺醯基醯胺19 亦被稱為上文化合物(III-f)。
化 合物 24 、 25 及 26 .此等三種化合物係使用類似上述之程序，合成自酸14 或18 。使產物藉由C-18管柱全部純化(水(1% TFA)：ACN(1% TFA)0-100%)。產率係從25至50%變化。化合物24 ：MS(ES+) m/z,計算值：m+1,743.4,實測值743。化合物25 ：MS(ES+) m/z,計算值：m+1,686.39,實測值686.5。化合物26 ：MS(ES+)m/z,計算值：m+1,700.40,實測值700.5。
化合物24 亦被稱為上文化合物(III-g)。
化合物 26a. 　按照如關於化合物16 所述之相同程序，使化合物14 與Ala-Phe OMe偶合。使產物藉由C-18管柱純化(水(1% TFA)：ACN(1% TFA)，0-100%)。MS(ES+) m/z,計算值：m+1,743,實測值743.4。化合物26a 亦被稱為上文化合物(III-1)。
實例2-圖式2
此實例係描述圖式2(圖2 )中所示化合物之合成。
化合物 28. 　於室溫下，將苯丙胺酸甲酯(10毫克，46.5微莫耳)與HATU(14.7毫克，38.6微莫耳)添加至化合物27 (根據Peltier等人,2006製成；10毫克，15.5微莫耳，甲酸鹽)在0.5毫升DMF中之溶液內，接著為DIEA。於攪拌30分鐘後，添加DMSO(2毫升)，並使反應混合物直接地接受C-18管柱(水(5 mM甲酸銨，pH 7.2)：ACN 0-100%)，獲得化合物28 (3.2毫克，25%)，為白色固體(甲酸鹽)。MS(ES+) m/z,計算值：m+1,758.41,實測值758.4。化合物28 亦被稱為上文化合物(III-h)。
化合物 29 . 　於0℃下，將醋酸酐(30微升，290微莫耳)添加至化合物28 (3.2毫克，3微莫耳，甲酸鹽)在0.5毫升吡啶中之溶液內。在攪拌24小時後，使溶劑自反應混合物蒸發，並使殘留物通過正規矽膠管柱(DCM：MeOH 0-10%)，獲得化合物29 (2.0毫克，83%)，為油狀物。MS(ES+) m/z，計算值：m+1,800.42，實測值800.4。化合物29 亦被稱為上文化合物(III-i)。
O-乙醯基，N,O-縮醛 29a. 　使化合物29 (2毫克，2.4微莫耳)溶於0.5毫升MeOH中，於其中添加一滴在二氧陸圜中之4NHCl。將反應混合物在室溫下攪拌過夜後，濃縮混合物，並使殘留物溶於DMSO中，接著，使其通過C-18管柱(水(20 mM甲酸銨，pH 6.1)：ACN(0-100%)，於凍乾後，獲得O-乙醯基，N,O-縮醛29a (1.38毫克，75%)，為白色固體(甲酸鹽)。MS(ES+) m/z，計算值：m+1,730，實測值730.4。O-乙醯基，N,O-縮醛29a 亦被稱為上文化合物(III-m)。
N ,O-縮醛 29b . 　使化合物28 (5毫克，6微莫耳)溶於MeOH中，於其中添加1滴在二氧陸圜中之4N HCl。將反應混合物攪拌24小時後，使溶液濃縮，且使用於下一步驟反應，無需進一步純化。MS(ES+) m/z，計算值：m+1,687，實測值688.4。N,O-縮醛29b 亦被稱為上文化合物(III-n)。
O-甲基，N,O-縮醛 29c . 　使N,O-縮醛29b (約5毫克，7.2微莫耳)溶於DMF中，在0℃下，於其中添加硫酸二甲酯(3微升，37微莫耳)與NaH(2毫克，50微莫耳，60%，在礦油中)。1小時後，使混合物溶於DMSO中，並通過C-18管柱(水(20 mM甲酸銨，pH 6.1)：ACN(0-100%)，獲得O-甲基，N，O-縮醛29c ，為半固體(0.31毫克，5%；含有相同MW之未經確認化合物之混合物)，MS(ES+) m/z，計算值：m+1,702，實測值702.4。O-甲基，N,O-縮醛29c 亦被稱為上文化合物(III-k)。
實例3-圖式3
圖式3(圖3 )顯示一種關於製成根據式(II-b)之化合物之程序。
醇 30 .　於0℃下，將TFA(171毫升)添加至(S)-1-羥基-3-(4-硝基苯基)丙-2-基胺基甲酸第三-丁酯20 (Erlanson等人,US 7,214,487 B2；13.9克，46.9毫莫耳)在DCM(272毫升)中之溶液內。使反應混合物溫熱至室溫，並使反應進行25分鐘。濃縮溶液，而得9.2克粗製(S)-2-胺基-3-(-4-硝基苯基)丙-1-醇，為白色固體。於此粗產物與碳酸鈉(12.4克，117.3毫莫耳)在THF(87毫升)與水(87毫升)中之溶液內，添加N-乙氧羰基鄰苯二甲醯亞胺("CEPT"，12.3克，56.3毫莫耳)。將反應混合物在室溫下攪拌4小時後，添加EtOAc(150毫升)。以EtOAc萃取水相。將合併之有機層以鹽水洗滌，以無水Na2 SO4 脫水乾燥，過濾，且在真空下濃縮，獲得粗製殘留物，使其藉急驟式層析純化，以0-100% EtOAc在己烷中之梯度液自矽膠溶離，獲得12.3克醇30 。MS：(+) m/z 327.0(M+1)。
三氟甲烷磺酸鹽31. 　在-78℃下，於醇30 (1克，3.06毫莫耳)在無水DCM(18毫升)中之溶液內，添加吡啶(0.274毫升，3.36毫莫耳)。將反應混合物於-78℃下攪拌5分鐘後，添加三氟甲烷磺酸酐(0.568毫升，3.36毫莫耳)。將反應混合物於-78℃下攪拌45分鐘，然後在室溫下45分鐘。於濾出沉澱物後，使濾液藉急驟式層析純化，以DCM自矽膠溶離，而產生0.84克三氟甲烷磺酸鹽31 。1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )δ8.10(2H,d,J=8.8 Hz),7.81(2H,m),p7.74(2H,m),7.36(2H,J=8.8 Hz),5.13(1H,t,J=10.0 Hz),4.99(1H,m),4.80(1H,dd,J=4.8,5.6 Hz),3.52(1H,dd,J=3.2,11.2 Hz),及3.27(1H,dd,J=5.6,8.8 Hz)。
二酯32.　 於0℃下,將甲基丙二酸二乙酯(0.71毫升，4.12毫莫耳)逐滴添加至氫化鈉(0.161克，在礦油中之60%分散液，4.03毫莫耳)在無水THF(4.7毫升)中之懸浮液內。將反應混合物在0℃下攪拌10分鐘，然後於室溫下10分鐘。在0℃下，將所形成之溶液慢慢添加至三氟甲烷磺酸鹽31 (0.84克，1.83毫莫耳)在無水THF(9.4毫升)中之溶液內。將反應混合物於0℃下攪拌過夜後，添加飽和NH4 Cl水溶液(20毫升)。以EtOAc萃取水溶液，並將合併之有機層以鹽水洗滌，以MgSO4 脫水乾燥，過濾，及在真空下濃縮，獲得殘留物。使粗產物藉急驟式層析純化，以0-50% EtOAc在己烷中之梯度液自矽膠溶離，而得0.57克二酯32 。MS:(+)m/z 483.3(M+1)。
單 酯 33 . 　 將二酯32 在6N HCl(10毫升)與醋酸(10毫升)中之溶液於145℃下加熱2天。使有機溶液濃縮，而得0.41克粗製(R)-4-胺基-2-甲基-5-(4-硝基苯基)戊酸之鹽酸鹽，為白色固體。
將2,2-二甲氧基丙烷("DMP"，4毫升，32.6毫莫耳)添加至粗產物之鹽酸鹽與濃HCl(1毫升)在無水MeOH(20毫升)中之溶液內。將反應混合物在60℃下加熱過夜。使有機溶液濃縮，而得0.43克粗製(R)-4-胺基-2-甲基-5-(4-硝基苯基)戊酸甲酯之鹽酸鹽，為白色固體。
於室溫下，將三乙胺(0.44毫升，3.1毫莫耳)添加至粗製(R)-4-胺基-2-甲基-5-(4-硝基苯基)戊酸甲酯之鹽酸鹽與二碳酸二-第三-丁酯(0.369克，1.69毫莫耳)在ACN(10毫升)中之溶液內。將反應混合物在室溫下攪拌4小時後，蒸發溶劑。添加水(20毫升)，並以EtOAc萃取水溶液。將合併之有機層以鹽水洗滌，以Na2 SO4 脫水乾燥，過濾，及濃縮。使粗產物藉急驟式層析純化，以0-30% EtOAc在己烷中之梯度液自矽膠溶離，而得0.31克單酯33 ，為無色油。MS：(+) m/z 267.3(M-99)。
羧 酸 34 . 將單酯33 (0.31克，0.846毫莫耳)在6N HCl中之溶液於130℃下加熱1.5小時。使有機溶液濃縮，而得0.244克羧酸34 ，為白色固體。MS：(+) m/z 253.1(M+1)。
硝基酸 35 . 於0℃下，將化合物34a (80.4毫克，0.149毫莫耳，根據Patterson等人2008製成)添加至五氟基酚(41.1毫克，0.224毫莫耳)與N,N'-二異丙基碳化二亞胺("DIC"，0.0255毫升，0.164毫莫耳)在DCM(0.76毫升)中之0.2M溶液內。使反應混合物溫熱至室溫，並於室溫下攪拌過夜。蒸發溶劑。添加EtOAc(18毫升)，且過濾粗產物，及以EtOAc沖洗反應容器。使濾液在減壓下濃縮，並使用粗製物質，無需進一步純化。將DMF(0.6毫升)添加至粗產物中，接著為羧酸34 (0.129克，0.448毫莫耳)與DIEA(0.13毫升，0.745毫莫耳)。將反應混合物在室溫下攪拌過夜，且蒸離溶劑。使粗產物藉急驟式層析純化，以10-20% MeOH在含有1% NH4 OH之DCM中之梯度液自矽膠溶離，而得0.11克硝基酸35 ，為白色固體。MS：(+) m/z 773.4(M+1)。
胺基酸 36 . 將硝基酸35 (0.11克，0.142毫莫耳)與鈀/碳(10%，15毫克)在MeOH(5毫升)中之溶液於氫大氣下攪拌4小時。濾出觸媒，並使濾液濃縮，而得91毫克胺基酸36 ，為白色固體。MS：(+)m/z 743.5(M+1)。胺基酸36 亦被稱為上文化合物(III-b)。
甲酯 36a . 　將HCl(1滴，37%)添加至胺基酸36 (1.9毫克，2.5毫莫耳)與2,2-二甲氧基丙烷("DMP"，0.05毫升，0.41莫耳)在MeOH(0.5毫升)中之溶液內。將反應混合物於室溫下攪拌2小時，然後濃縮。使粗產物藉製備型HPLC純化，而得1.7毫克甲酯36a ，為白色固體。MS：(+)m/z 757.5(M+1)。酯36a 亦藉由式(III-t)而被描繪於本專利說明書中。
實例4-圖式4
圖式4(圖4 )顯示一種關於將肽基連結基與反應性官能基連接至本發明化合物之方法，預備供共軛作用。
化合物 37. 　將DIEA、Fmoc-Lys(Boc)-OH(17.3毫克，0.037毫莫耳)及HATU(12.8毫克，0.0336毫莫耳)在DMF(0.3毫升)中之溶液於室溫下攪拌5分鐘。溶液之pH值係被保持在8與9之間。接著，將胺基酸36 (25毫克，0.0336毫莫耳)在DMF(2毫升)與DIEA中之溶液添加至反應混合物中，保持pH在8與9之間。於室溫下攪拌15分鐘後，添加飽和NH4 Cl溶液(5毫升)，以使反應淬滅。以EtOAc萃取水溶液，並使合併之有機層脫水乾燥，過濾，及濃縮。使粗產物藉急驟式層析純化，以0-20% MeOH在DCM中之梯度液自矽膠溶離，而得36.1毫克化合物37 。MS：(+)m/z 1193.6(M+1)。
化合物 38. 　將六氫吡啶添加至化合物37 (36.1毫克，0.0302毫莫耳)在DMF(2毫升)中之溶液內，保持pH在9與10之間。於室溫下攪拌20分鐘後，使有機溶液濃縮，而得29.3毫克粗製自由態α-胺基化合物。
將DIEA添加至6-順丁烯二醯亞胺基己酸(7.0毫克，0.0332毫莫耳)與HATU(11.5毫克，0.0302毫莫耳)在DMF(0.3毫升)中之溶液內，保持pH在8與9之間。將反應混合物在室溫下攪拌5分鐘。接著，添加DIEA與DMF中之粗製自由態胺基化合物(2毫升)，保持pH在8與9之間。將反應混合物在室溫下攪拌15分鐘後，使粗產物藉製備型HPLC純化，而得9.1毫克化合物38 ，為白色固體。MS：(+) m/z 1164.6(M+1)。
化 合物 39 . 　將TFA(1.5毫升)添加至化合物38 (9.1毫克，0.0078毫莫耳)在DCM(1.5毫升)中之溶液內。將反應混合物在室溫下攪拌15分鐘後，使粗產物藉製備型HPLC純化，而得5.0毫克所要化合物39 之TFA鹽，為白色固體。MS：(+) m/z 1064.8(M+1)。化合物39 之自由態鹼結構亦為上文所示，為化合物(VI-b)。化合物39 之一部份醯胺亦在其製備中被單離成副產物。MS：(+) m/z 1063.6(M+1)。此醯胺亦藉由式(VI-q)而被描繪於本專利說明書中。
實例5 -圖式5
圖式5(圖5 )顯示一種關於製成根據式(II-b)之化合物之替代程序。
胺基酯 42 . 　將1,4-二氧陸圜中之4.0N HCl(6.7毫升)添加至化合物41 (根據Patterson等人2008製成；1克，2.66毫莫耳)在乙醇(17毫升)中之溶液內。將反應混合物在室溫下攪拌2小時，然後濃縮，而得0.82克胺基酯42 ，為白色固體。MS：(+)m/z 273.3(M+1)。
疊氮基酯 43 .　將氯化草醯(1.71毫升，19.95毫莫耳)與DMF(0.33毫升，4.26毫莫耳)添加至疊氮基異白胺酸(Lundquist等人，Org. Lett. 2001 ,3,781；0.669克，4.26毫莫耳)在己烷(176毫升)中之溶液內。將反應混合物在室溫下攪拌1小時，過濾，及濃縮，而得氯化醯。於0℃下，將氯化醯與DIEA(2.32毫升，13.3毫莫耳)添加至胺基酯42 (0.82克，2.66毫莫耳)在DCM(26.7毫升)中之溶液內。使反應混合物溫熱至室溫，並於室溫下攪拌過夜。添加鹽水，以使反應淬滅，且以EtOAc萃取水溶液。使合併之有機層以Na2 SO4 脫水乾燥，過濾，及在真空下濃縮。使粗產物藉急驟式層析純化，以0-50% EtOAc在己烷中之梯度液自矽膠溶離，而得0.86克疊氮基酯43 ，為白色固體。MS：(+)m/z 412.3(M+1)。
三乙基矽烷基化合物 44 .　於0℃下，將2,6-二甲基吡啶(1.22毫升，10.45毫莫耳)與三氟甲烷磺酸三乙基矽烷酯(1.14毫升，5.02毫莫耳)添加至疊氮基酯43 (0.86克，2.09毫莫耳)在DCM(11毫升)中之溶液內。使反應混合物溫熱至室溫，歷經1小時，然後於室溫下攪拌另一個小時。添加鹽水，以使反應淬滅，並以EtOAc萃取水溶液。使合併之有機層脫水乾燥，過濾，及濃縮。使粗產物藉由矽膠急驟式層析純化，以0-30% EtOAc在己烷中之梯度液溶離，而得1.1克三乙基矽烷基化合物44 。MS：(+) m/z 526.4(M+1)。
N-甲基化合物 45 .使三乙基矽烷基化合物44 (1.04克，1.98毫莫耳)在THF(6.5毫升)中之溶液於-45℃下冷卻，並添加六甲基二矽氮化鉀(0.5M，在甲苯中，4.75毫升，2.37毫莫耳)。將所形成之混合物在-45℃下攪拌20分鐘。添加碘化甲烷(0.37毫升，5.94毫莫耳)，且使反應混合物溫熱至室溫，歷經4小時，此時，以乙醇(10毫升)使反應淬滅。將粗產物以EtOAc稀釋，並以鹽水洗滌，且將水層以EtOAc萃取。使合併之有機層以無水Na2 SO4 脫水乾燥，過濾，及在真空下濃縮。使粗產物藉急驟式層析純化，以0-30% EtOAc在己烷中之梯度液自矽膠溶離，而得0.91克N-甲基化合物45 。MS：(+)m/z 540.4(M+1)。
化合物 46 .將N-甲基化合物45 (1.0克，1.85毫莫耳)在經脫氧之AcOH/H2 O/THF(65毫升，3:1:1，v/v/v)中之溶液，於室溫下攪拌36小時。添加甲苯(250毫升)，並使溶液濃縮。使粗產物藉急驟式層析純化，以0-100% EtOAc在己烷中之梯度液自矽膠溶離，而得0.46克化合物46 ，為油狀物。MS：(+) m/z 426.3(M+1)。
甲 基醚 47 .於-78℃下，將六甲基二矽氮化鉀("KHMDS"，0.5M，在甲苯中，2.54毫升，1.27毫莫耳)添加至化合物46 (0.45克，1.06毫莫耳)在THF(5毫升)中之溶液內。將反應混合物在-78℃下攪拌20分鐘。添加碘化甲烷(0.2毫升，3.18毫莫耳)，並使反應混合物溫熱至-20℃，歷經2小時，此時，以飽和NH4 Cl溶液使反應淬滅。以EtOAc萃取水溶液。使合併之有機層以無水Na2 SO4 脫水乾燥，過濾，及在真空下濃縮。使粗產物藉急驟式層析純化，以0-50% EtOAc在己烷中之梯度液自矽膠溶離，而得0.41克化合物47 ，為無色油。MS：(+)m/z 440.3(M+1)。
化合物 48 .　於D-Mep(0.45克，3.14毫莫耳)在EtOAc(10毫升)中之溶液內，添加五氟基酚(0.64克，3.47毫莫耳)與N,N'-二環己基碳化二亞胺("DCC"，0.72克，3.47毫莫耳)。將反應混合物在室溫下攪拌過夜後，過濾沉澱物，並以EtOAc洗滌。於所形成之濾液中，添加化合物47 (0.46克，1.05毫莫耳)與鈀/碳(10重量%，0.36克)。將反應混合物於氫大氣下攪拌過夜。濾出觸媒，接著，使濾液在真空下濃縮。使粗產物藉急驟式層析純化，以0-5% MeOH在EtOAc中之梯度液自矽膠溶離，而得0.43克化合物48 ，為無色油。MS：(+) m/z 539.4(M+1)。
羧酸 49 .　在室溫下，於化合物48 (0.43克，0.80毫莫耳)在經脫氧之1,4-二氧陸圜(8毫升)中之溶液內，添加經脫氧之氫氧化鋰水溶液(0.6M，4毫升)。將反應混合物在室溫下攪拌2小時，然後於真空下濃縮。使粗產物藉急驟式層析純化，以10-30% MeOH在含有1% NH4 OH之DCM中之梯度液自矽膠溶離，而得0.3克羧酸49 ，為白色固體。MS：(+) m/z 511.4(M+1)。
硝基酸 50 ._　於0℃下，將羧酸49 (80毫克，0.157毫莫耳)添加至五氟基酚(43.3毫克，0.235毫莫耳)與DIC(0.0269毫升，0.173毫莫耳)在DCM(0.8毫升)中之0.2M溶液內。使反應混合物溫熱至室溫，並在此種溫度下攪拌過夜。蒸發溶劑。添加醋酸乙酯(18毫升)，且將粗產物過濾，伴隨著反應容器之EtOAc沖洗。使濾液於減壓下濃縮，並使用粗製物質，無需進一步純化。將DMF(0.6毫升)添加至粗產物中，接著為羧酸34 (0.136克，0.47毫莫耳)與DIEA(0.137毫升，0.785毫莫耳)。將反應混合物在室溫下攪拌過夜，然後，使溶劑於真空下蒸發。使粗產物藉急驟式層析純化，以10-20% MeOH在含有1% NH4 OH之DCM中之梯度液自矽膠溶離，而得0.1克硝基酸50 ，為白色固體。MS：(+) m/z 745.4(M+1)。
胺基酸 51. 　將硝基酸50 (0.1克，0.134毫莫耳)與鈀/碳(10%，14毫克)在MeOH(5毫升)中之混合物於氫大氣下攪拌4小時。濾出觸媒，並使濾液在真空下濃縮，而得87.3毫克胺基酸51 ，為白色固體。MS：(+) m/z 715.5(M+1)。胺基酸51 亦被稱為上文化合物(III-j)。
實例6-圖式6
圖式6(圖6 )顯示關於製成根據式(II-b)之化合物之又再另一個程序。
羥基硝基化合物 52. 　於0℃下，將化合物27 (圖式2)(16.4毫克，0.0275毫莫耳)添加至五氟基酚(7.6毫克，0.0413毫莫耳)與DIC(0.0094毫升，0.0606毫莫耳)在DCM(0.2毫升)中之0.2M溶液內。使反應混合物溫熱至室溫，並於室溫下攪拌過夜。蒸發溶劑。添加EtOAc(3毫升)，且將粗產物過濾，及以EtOAc沖洗反應容器。使濾液在減壓下濃縮，並使用粗製物質，無需進一步純化。將DMF(0.1毫升)添加至粗產物中，接著為羧酸34 (圖式3)(20.8毫克，0.083毫莫耳)與N,N-二異丙基乙胺(0.024毫升，0.138毫莫耳)。將反應混合物在室溫下攪拌過夜，然後，使溶劑蒸發。使粗產物藉急驟式層析純化，以0-10% MeOH在DCM中之梯度液自矽膠溶離，而得14.9毫克羥基硝基化合物52 ，為白色固體。MS：(+) m/z 831.5(M+1)。
乙醯基硝基化合物53. 　使羥基硝基化合物52 (14.9毫克，0.018毫莫耳)在吡啶(0.23毫升)中之0.1M溶液於0℃下冷卻，並添加醋酸酐(0.054毫升，0.57毫莫耳)。使反應混合物溫熱至室溫，歷經2小時，且於室溫下攪拌24小時。使反應混合物冷卻至0℃，並添加1,4-二氧陸圜與水之1:1混合物。使反應混合物溫熱至室溫，接著在此溫度下攪拌12小時。蒸發溶劑，且使殘留物藉製備型HPLC純化，而得2.2毫克乙醯基硝基化合物53 ，為白色固體。MS：(+) m/z 873.2(M+1)。
乙醯胺基化合物54 .　將乙醯基硝基化合物53 (2.2毫克，0.0025毫莫耳)與鈀/碳(10%，1毫克)在甲醇(0.2毫升)中之混合物於氫大氣下攪拌4小時。濾出觸媒，並使濾液濃縮。使粗產物藉製備型HPLC純化，而得0.1毫克乙醯基硝基化合物54 ，為白色固體。MS：(+) m/z 843.2(M+1)。乙醯胺基化合物54 亦被稱為上文化合物(III-a)。
實例7-圖式7
圖式7(圖7 )顯示關於製成本發明化合物之又再另一個程序。
化 合物 55. 　於0℃下，將化合物34a (圖式3)(70毫克，0.13毫莫耳)添加至五氟基酚(35.9毫克，0.195毫莫耳)與DIC(0.0223毫升，0.143毫莫耳)在DCM(0.66毫升)中之0.2M溶液內。使反應混合物溫熱至室溫，並於室溫下攪拌過夜。蒸發溶劑。添加EtOAc(16毫升)，且將粗產物過濾，及以EtOAc沖洗反應容器。使濾液在減壓下濃縮，並使用粗製物質，無需進一步純化。將DMF(0.5毫升)添加至粗產物中，接著為對-硝基-苯丙胺酸(82.0毫克，0.39毫莫耳)與DIEA(0.114毫升，0.65毫莫耳)。將反應混合物在室溫下攪拌過夜，然後，使溶劑蒸發。使粗產物藉急驟式層析純化，以10-20% MeOH在含有1% NH4 OH之DCM中之梯度液自矽膠溶離，而得65.2毫克化合物55 ，為白色固體。MS：(+) m/z 731.0(M+1)。
化合物 56. 將化合物55 (65.2毫克，0.089毫莫耳)與鈀/碳(10%，9.4毫克)在MeOH(3毫升)中之混合物於氫大氣下攪拌4小時。濾出觸媒，並使濾液濃縮，而得33.8毫克化合物56 ，為白色固體。MS：(+)m/z 701.2(M+1)。化合物56 亦被稱為上文化合物(III-d)。
實例8 -圖式8
圖式8(圖8a )顯示一種關於製成根據式(VIII-b)之化合物之方法，該化合物可作為中間物使用，以製成本發明化合物。
Boc酯 58. 於胺基酯57 (Chem-Impex，5克，19.18毫莫耳)與二碳酸二-第三-丁酯("(Boc)2 O"，Aldrich，4.6克，21.10毫莫耳)在DMF(Acros，無水，50毫升)中之溶液內，添加三乙胺("TEA"，Aldrich，8.36毫升，60毫莫耳)。將反應混合物攪拌0.5小時。HPLC分析顯示反應已完成。以EtOAc(500毫升)稀釋反應混合物，並將有機層以水(200毫升)，接著以鹽水(200毫升)洗滌，以無水MgSO4 脫水乾燥，及濃縮。使粗產物於120克CombiFlash管柱上，以DCM中之0-5% MeOH純化，而產生白色固體Boc酯58 (5.6克，81%)。1 HNMR(DMSO)δ8.18(d,2H),7.47(d,2H),7.38(d,1H),4.23(m,1H),3.60(s,3H),3.15(m,1H),2.95(m,1H),1.23(s,9H)。
烯烴 59. 　於Boc酯58 (230毫克，0.68毫莫耳)在DCM(Acros，無水，2毫升)中，已於乾冰-丙酮內冷卻至-78℃之溶液中，慢慢添加DIBAL(Aldrich，1M，在DCM中，1毫升)。將反應混合物攪拌，並溫熱至-20℃，歷經3小時。添加(1-乙氧羰基亞乙基)-三苯基磷烷(Aldrich，492毫克，1.36毫莫耳)。將反應混合物在-20℃下攪拌1小時。以EtOAc(100毫升)稀釋反應混合物，且將所形成之有機物質以水(50毫升)，接著以鹽水(50毫升)洗滌，以無水MgSO4 脫水乾燥，及濃縮。使粗產物於10克COMBIFLASHTM 管柱上，以己烷中之0-50% EtOAc純化，而產生白色固體烯烴59 (151毫克，59%)。1 HNMR(DMSO)δ8.18(d,2H),7.47(d,2H),7.22(d,1H),6.51(d,1H),4.48(m,1H),4.11(q,2H),2.80-2.94(m,2H),1.62(s,3H),1.23(s,9H),1.16(t,3H)。
芳基胺 60. 　將烯烴59 (148毫克，0.39毫莫耳)在EtOH(Acros，無水，3毫升)與Pd/炭(Aldrich，10%，50毫克)中之溶液，於H2 下攪拌過夜。以DCM(10毫升)稀釋反應混合物，並經過CELITETM 過濾。使濾液濃縮，且使粗產物於4克COMBIFLASHTM 管柱上，以DCM中之0-20% MeOH純化，而產生芳基胺60 ，為白色固體(102毫克，75%)。1 HNMR(DMSO)δ7.18(d,2H),7.11(s,2H),6.71(d,1H),3.98(q,2H),3.51(m,1H),2.57(m,2H),2.41(m,1H),1.63(m,1H),1.37(m,1H),1.29(s,9H),1.09(t,3H),0.99(d,3H),MS(ES+)m/z,計算值：m+1,351.2,實測值351.2。
實例9-圖式9
圖式9(圖8b) 顯示另一種關於製成根據式(VIII-b)之化合物之方法，該化合物可作為中間物使用，以製成本發明化合物。
胺基酸 61. 　 將羧酸24 (圖式3，圖3 )(4.4毫克，0.0025毫莫耳)與鈀/碳(10%，1毫克)在MeOH(0.5毫升)中之混合物，於氫大氣下攪拌過夜。濾出觸媒，並使濾液濃縮，而得3.5毫克胺基酸61 ，為白色固體。MS：(+)m/z 223.3(M+1)。
實例10-圖式10、11及12
圖式10(圖8c) 顯示另一種關於製成根據式(VIII-b)之化合物之方法，該化合物可作為中間物使用，以製成本發明化合物。
化 合物 62. 　 將單酯33 (圖式3，圖3 )(0.34克，0.93毫莫耳)與鈀/碳(10%，50毫克)在甲醇(20毫升)中之混合物，於氫大氣下攪拌過夜。濾出觸媒，並使濾液濃縮，而得0.29克化合物62 ，為白色固體。MS：(+)m/z 237.3(未具有Boc)。
圖式11(圖9) 係說明可如何使用根據式(VIII-b)之化合物，以製成本發明化合物。使Boc酯62 轉化成Bpoc酯62a ，其方式是首先，使芳族胺基以Fmoc基團保護，以TFA處理，以自脂族胺基移除Boc基團，以碳酸α,α-二甲基-對-苯基苄基苯酯(8Cl)處理，在該處安裝Bpoc基團，及以六氫吡啶移除Fmoc基團。使Bpoc酯62a 與羧酸63 ，以HATU偶合，而產生中間物酯，然後，使其以LiOH水解，以產生化合物64 。自化合物64 移除Cbz保護基之氫化作用，接著為與6-順丁烯二醯亞胺基己酸之HATU所媒介偶合，及Bpoc基團以醋酸之移除，產生胺基酸65 。與化合物34a (圖式3，圖3 )之另一種HATU所媒介偶合，產生化合物66 。Boc保護基以TFA之移除，獲得化合物67 ，預備供共軛作用。
利用式(VIII-b)化合物之又再另一個模式係示於圖式12(圖10 )中。自化合物34a 開始，與化合物68 之HATU所媒介偶合，獲得Boc酯69 。Boc基團以TFA之移除，及酯以LiOH之水解作用，獲得胺基酸36 ，其可按圖式4(圖4 )中所示被精巧地製成，以製備適用於共軛作用之組合物。
實例11-化合物70
化合物 70. 　於0℃下，使微管溶素(tubulysin)D(根據Peltier等人2006製成；2毫克，2.4微莫耳)溶於MeOH中。於此溶液中，添加一滴HCl(0.1M)。將反應混合物在室溫下攪拌過夜後，使溶液在真空下蒸發，獲得殘留物，使其通過短管柱(DCM：MeOH 0-10%)，獲得化合物70 (1.3毫克，1.6微莫耳，67%)，為油狀物。MS(ES+)m/z，計算值：m+1,772.42,實測值772。
熟諳此藝者將明瞭的是，圖式之一般操作法可經修改，以製造上文所特別描述者以外之本發明化合物。例如，化合物14 (與化合物49 相同)可用以製造本發明之許多其他化合物，其方式是使其與Tup亞單位之其他替代物偶合。作為另一項實例，藉由以化合物9 (圖式1)更換所使用之試劑，化合物44 與46 (圖式5)，其係為除了所特別舉例者以外之在式(II)中之基團R2 與R3 上之變型，可合成而得。
實例12-共軛物之製備
此實例係描述細胞毒素-連結基構造物(VI-b)與抗-CD70單株抗體2H5之共軛物之製備(Terrett等人，US 2009/0028872 A1；Coccia等人，WO 2008/074004 A2)。其係為其他共軛物之製備中所使用程序之代表例。
在20 mM磷酸鈉，50 mM NaCl,100 μM DTPA,pH 7.5中之~5毫克/毫升下之抗-CD70抗體2H5，係以13-倍莫耳過量之2-亞胺基硫伍圜被硫醇化。使硫醇化作用反應在室溫下進行1小時，伴隨著連續混合。
在硫醇化作用之後，抗體係經由PD10管柱(交聯葡聚糖(Sephadex) G-25)，被緩衝劑交換至共軛作用緩衝劑(50 mM HEPES,5 nM甘胺酸，2 mM DTPA,pH 6.0)中。經硫醇化抗體之濃度係在280毫微米下測定。硫醇濃度係使用二硫基雙吡啶檢測度量。
在每抗體之硫醇3-倍莫耳過量下添加構造物(VI-b)在DMSO中之5 mM儲備液，並於室溫下混合90分鐘。在共軛作用之後，於每抗體10倍莫耳過量之硫醇下，添加DMSO中之100 mMN-乙基順丁烯二醯亞胺，以使任何未反應之硫醇基淬滅。此淬滅反應係在室溫下完成，歷經一小時，伴隨著連續混合。
在陽離子交換層析純化之前，抗-CD70抗體藥物共軛物係經0.2微米過濾。SP SEPHAROSETM 高性能陽離子交換管柱(CEX)係以5份管柱體積(CV)之50 mM HEPES,5 mM甘胺酸,1 M NaCl,pH 6.0再生。於再生作用之後，以3 CV之平衡緩衝液(50 mM HEPES,5 mM甘胺酸,pH 6.0)，使管柱達成平衡。裝填共軛物，並將管柱以平衡緩衝液洗滌一次。使共軛物以50 mM HEPES,5 mM甘胺酸,200 mM NaCl,pH 6.0溶離。溶離物係以溶離份收集。然後，管柱係以50 mM HEPES,5 mM甘胺酸,1M NaCl,pH 6.0再生，以移除蛋白質聚集體與任何未反應者(VI-b)。
匯集含有單體性抗體共軛物之溶離份。抗體共軛物濃度與取代比例係藉由度量280與252毫微米下之吸光率而測得。
經純化之溶離物匯集庫係藉由透析，被緩衝劑交換至30毫克/毫升蔗糖,10毫克/毫升甘胺酸,pH 6.0中。於透析後，將右旋醣酐40在10毫克/毫升下添加至試樣中。濃度與取代比例(SR)係藉由度量280與252毫微米下之吸光率而測得。SR為每莫耳抗體2.2莫耳細胞毒素。
實例13-增殖檢測
此實例係一般性地描述用以檢測本發明化合物或其共軛物之抗細胞增殖活性之程序。人類腫瘤細胞系係得自美國培養物類型收集處(ATCC),郵政信箱1549,Manassas,VA 20108,USA，且根據來自ATCC之說明書培養。將細胞個別在1.0 x 103 或1.0 x 104 個細胞/井下，接種於96-井板中，歷經3小時，供ATP檢測或3 H胸苷檢測。將自由態(未經共軛)化合物或其共軛物之1:3連續稀釋液添加至井中。使板培養24至72小時。使3 H胸苷板以每井1.0 μCi之3 H-胸苷脈衝，歷經總培養期之最後24小時，採集，且在Top Count閃爍計數器(Packard儀器，Meriden,CT)上讀取。於ATP板中之ATP含量係使用發光細胞存活力套件，按照製造者之手冊度量，且在20/20發光計上讀取(兩者均得自Promega,Madison,WI,USA)。EC50 值-藥劑抑制或降低細胞增殖達50%下之濃度-係使用PRISMTM 軟體版本4.0(GraphPad軟體,La Jolla,CA,USA)測得。
實例14-細胞毒素活體外活性
使用3 H胸苷或ATP發光檢測或兩者，本發明化合物之活性係針對下列癌細胞系作檢測：HCT-15(結腸直腸癌、多重抗藥性(MDR))；Hep3B(肝癌)；LNCaP(前列腺癌、雄激素受體陽性(AR+ ))；MDA-MB-231(乳癌，雌激素受體、黃體酮受體及Her2陰性(三重陰性))；A2058(黑色素瘤)；U-87 MG(神經膠質母細胞瘤)；NCI-H460(NSCLC)；A549(NSCLC)；HPAC(胰癌，原發性)；PC3(前列腺癌、AR- )；BT474(乳癌、Her2高度地陽性(Her2hi))；SKOV3(卵巢癌、Her2hi)；786-O(腎癌)；UO-31(腎癌、MDR)；NCI-H740(SCLC)；DMS53(SCLC)；SK-BR3(乳癌、Her2hi)；ZR-75(乳癌、雌激素受體陽性)；OVCAR3(卵巢癌)；HL-60(APL)；OVCAR8/Adr(卵巢癌、MDR)；CEM-C1(ALL)；Nomo-1(AML)；RPMI-8226(MM))；Raji(淋巴瘤)；SW-480(結腸直腸癌，轉移性)；SW-620(結腸直腸癌)；及H226(肺癌)(並非所有化合物均針對所有細胞系作檢測)。
下列化合物係作為參考物或比較細胞毒素使用：多克索紅菌素(Dox)、細胞毒素CBI(環丙[C]苯并[e]吲哚-4-酮種類之DNA小溝烷基化劑)、微管溶素(tubulysin)D(Tub D，表1)及MMAF之甲酯("MMAF"，一種歐利制菌素(auristatin)-相關之化合物；參閱Sutherland等人，J. Biol. Chem. 2006 ,281(15),10540-10547)。
圖I1a 與I1b 係個別顯示關於本發明化合物針對HL-60與786-O細胞之3 H胸苷增殖檢測之說明性圖形，以細胞毒素CBI與微管溶素(tubulysin)D作為比較化合物，使用48小時之培養期。
圖12a 與12b 係個別顯示關於第二組本發明化合物針對HL-60與786-O細胞之ATP發光增殖檢測之說明性圖形，使用72小時之培養期。圖12c 與12d 係個別顯示關於相同組化合物再一次針對HL-60與786-O細胞之3 H胸苷增殖檢測之圖形，使用72小時培養期。於各情況中，多克索紅菌素係作為比較化合物使用。
表2係提供關於使用3 H胸苷方法之增殖檢測，使用72小時培養期之數據。
表3係提供關於ATP發光增殖檢測，使用如所指出之48、72或96小時培養期之數據。
此外，下列EC50 值係使用ATP檢測與72小時培養期，對於下列化合物針對H226細胞系而進行度量：化合物36a (0.307 nM)；化合物109 (1.609 nM)；及化合物112 (0.67-1.16 nM)。下列EC50 值係使用ATP檢測與48小時培養期，對於下列化合物針對OVACAR8/Adr細胞系而進行度量：化合物36a (17.05 nM)；化合物84a (>300 nM)；化合物84b (47.2 nM)；化合物109 (24.9 nM)；及化合物112 (12 nM)。
實例15-共軛物活體外活性
圖13 係顯示在3 H胸苷增殖檢測中本發明共軛物之活性，其係針對為CD70陽性之786-O腎癌細胞度量。培養期為72小時。摘錄自圖13 曲線之EC50 值係示於表4中，伴隨著得自其他實驗之數據。細胞系LNCap係為會表現前列腺專一細胞膜抗原(PSMA)之前列腺癌細胞系；H226係為會表現間皮素之肺癌細胞系。用於共軛作用之抗體為2A10，一種抗-PSMA抗體(Huang等人,US 2009/0297438)；2H5，一種抗-CD70抗體(Terrett等人,US 2009/0028872)；1F4，一種抗-CD70抗體(Coccia等人,WO 2008/074004)；及6A4，一種抗-間皮素抗體(Terrett等人,WO 2009/045957)。作為對照組，Sufi等人,WO 2008/083312之化合物J("化合物J"，一種DNA小溝結合/烷基化劑)係作為共軛作用配對物使用，且白喉毒素("DTX")係作為未經共軛之非專一性對照組使用。
數據顯示CD70-專一抗體為共軛物能夠有效地傳輸細胞毒素至CD70-陽性786-O細胞所必須：抗體2A10之共軛物，其係對不同抗原(PSMA)專一，係具有低或無活性。反之，抗-CD70抗體之所有共軛物均為活性。化合物(VI-a)與(VI-b)之共軛物在活性上可與化合物J共軛物(一種習知共軛作用配對物)作比較，且其共軛物之一係進行臨床試驗。值得注意的是，化合物(VI-a)與(VI-b)之共軛物顯示極少非專一性毒性：將2A10-(VI-a)及2A10-(VI-b)之活性與2A10-CBI之活性作比較。
實例16 -共軛物活體內活性
將CD70-陽性人類腎癌786-O細胞(目錄CRL-1932，最初得自ATCC)於活體外，根據ATCC說明書培養。採集細胞，將每200微升DPBS/MATRIGELTM (1:1)2百50萬個細胞以皮下方式植入CB17.SCID老鼠之腰窩區域中。腫瘤係每週使用Fowler電子數位測徑器(62379-531型；Fred V. Fowler公司,Newton,MA,USA)，以3維數度量，且數據係使用得自Studylog公司(South San Francisco,CA,USA)之StudyDirector軟體，以電子方式記錄。每日檢查動物關於姿勢、洗梳及呼吸變化，以及迷睡。亦將動物每週稱重，且若體重減輕為≧20%，則使其安樂死。當腫瘤達到平均大小為194立方毫米時，將各6隻老鼠之組群在0.3微莫耳/公斤體重下，以單一腹膜腔內(IP)劑量之試驗共軛物(例如2H5-(VI-b))與同型物對照組(2A10-(VI-b))治療。老鼠之腫瘤體積(LWH/2)與體重係在各研究之整個過程中被記錄，其係被允許在最初服藥後進行大約2個月。Excel試算表巨集係用以計算腫瘤大小之平均、SD及中間值。將數據使用Prism軟體版本4.0作圖。
異種移植研究結果係示於圖14 中，其中說明標識均具有如在前述實例中及在圖13 中之相同意義。數據係証實本發明化合物之共軛物針對CD70+ 786-O細胞之活體內活性。化合物(VI-a)及(VI-b)與抗-CD70抗體2H5之兩種共軛物，係於研究期間造成平均腫瘤大小上之降低至小於一半，然而當投予媒劑對照組或與抗-PSMA抗體2A10之共軛物時，腫瘤平均體積係大於兩倍。
實例17-圖式13
圖式13(圖15 )顯示一種關於製成可用於製成本發明化合物之對掌異構上純4-硝基管式苯丙胺酸(4-NO2 Tup)82a 與82b 之方法。
化合物 80 . 　將二碳酸二-第三-丁酯(90.5毫克，0.42毫莫耳)添加至圖式3之化合物34 (0.1克，0.35毫莫耳)在0.7M NaOH水溶液(1毫升)中之混合物內。將反應混合物在室溫下攪拌3小時，然後以0.5N HCl酸化至pH 3。
在以EtOAc萃取水溶液三次後，使合併之有機層脫水乾燥，過濾，及濃縮。使粗產物藉急驟式層析純化，以0-20%甲醇在DCM中之梯度液自矽膠溶離，而得0.117克化合物80 ，為白色固體。MS：(+) m/z 253.1(M+1，未具有Boc)。
(-)- 醇酯類 81a 與 81b . 　於室溫下，將DCC(87.8毫克，0.43毫莫耳)添加至化合物80 、(-)-醇(66.6毫克，0.43毫莫耳)及4-(二甲胺基)-吡啶("DMAP"，10.4毫克，0.085毫莫耳)在DCM(1.5毫升)中之溶液內。將反應混合物在室溫下攪拌3小時後，濾出沉澱物。然後濃縮濾液。使粗產物藉急驟式層析純化，以0-20% EtOAc在己烷中之梯度液自矽膠溶離，而得55.7毫克酯81a ，為白色固體，與55.7毫克酯81b ，為白色固體。關於酯81a 之MS：(+) m/z 391.2(M+1，未具有Boc)；關於酯81b 之MS：(+) m/z 391.2(M+1，未具有Boc)。
4-NO 2 Tup 82a 與 82b . 　將酯81a 在6N HCl(40毫克，0.082毫莫耳)中之溶液於130℃下加熱1.5小時。使反應混合物濃縮，獲得23.5毫克4-NO2 Tup82a ，為白色固體。1 H NMR(D2 O,400 MHz)：δ8.04(d,2H,J=8.4 Hz),7.33(d,2H,J=8.4 Hz),3.50(m,1H),3.03(dd,1H,J=6.8,14.4 Hz),2.89(dd,1H,J=7.6 Hz,14.4 Hz),2.45-2.39(m,1H),1.92-1.84(m,1H),1.62-1.55(m,1H)及0.98(d,3H,J=7.2 Hz)；MS：(+) m/z 253.1(M+1)。4-NO2 Tup82b 係藉由相同程序，在相同規模下獲得，為白色固體(23.5毫克)。1 H NMR(D2 O,400 MHz)：δ8.03(d,2H,J=8.4 Hz),7.33(d,2H,J=8.4 Hz),3.50(m,1H),2.93(dd,2H,J=2.0,7.6 Hz),2.54-2.48(m,1H),1.86-1.78(m,1H),1.60-1.53(m,1H)及0.98(d,3H,J=6.8 Hz)；MS：(+) m/z 253.1(M+1)。
實例18-圖式14
圖式14(圖16 )係描繪4-NO2 Tup82a 與82b 之轉化成本發明化合物。
硝基酸 83a . 　於0℃下，將圖式3之化合物34a (10毫克，0.019毫莫耳)添加至五氟基酚(5.1毫克，0.028毫莫耳)與N,N'-二異丙基-碳化二亞胺("DIC"，0.0032毫升，0.021毫莫耳)在DCM(0.2毫升)中之0.2M溶液內。使反應混合物溫熱至室溫，並於此種溫度下攪拌過夜。蒸發溶劑。添加EtOAc(1.8毫升)，且將粗產物過濾，及以EtOAc沖洗反應容器。使濾液在減壓下濃縮，及使用粗製五氟苯基，無需進一步純化。將DMF(0.2毫升)添加至粗製酯中，接著為4-NO2 Tup82a (10.7毫克，0.037毫莫耳)與DIEA(0.013毫升，0.074毫莫耳)。將反應混合物在室溫下攪拌過夜，然後蒸離溶劑。使粗產物藉急驟式層析純化，以含有1% NH4 OH之0-20% MeOH在DCM中之梯度液自矽膠溶離，而得12.9毫克硝基酸83a ，為白色固體。MS：(+) m/z 773.4(M+1)。
替代途徑硝基酸 83a ： 將DIEA添加至化合物34a(10毫克，0.019毫莫耳)與HATU(7.8毫克，0.020毫莫耳)在DMF(0.3毫升)中之溶液內，保持pH在8-9下。將反應混合物在室溫下攪拌5分鐘。然後添加DIEA與DMF(1毫升)中之硝胺82a (5.4毫克，0.019毫莫耳)，保持pH在8-9下。將反應混合物在室溫下攪拌15分鐘後，使粗產物藉製備型HPLC純化，而得13.4毫克硝基酸83a ，為白色固體。
硝基酸83b係藉由相同替代途徑，在相同規模下製成，且係以白色固體獲得(13.4毫克)。MS：(+) m/z 773.4(M+1)。
胺 84a . 　將硝基酸83a (7.5毫克，0.0097毫莫耳)與鈀/碳(10%，1.1毫克)在MeOH(0.37毫升)中之混合物於氫大氣下攪拌4小時。濾出觸媒，並使濾液濃縮。使粗產物藉製備型HPLC純化，而得6.2毫克胺84a ，為白色固體。1 H NMR(CD3 OD,400 MHz)：δ8.06(s,1H),7.36(d,2H,J=8.4 Hz),7.17(d,2H,J=8.4 Hz),5.70(dd,1H,J=2.8,10.8 Hz),4.71(d,1H,J=7.2 Hz),4.44-4.35(m,2H),3.74(d,1H,J=9.6 Hz),3.49-3.45(m,1H),3.36-3.35(m,1H),3.30-3.25(m,1H),3.13(s,3H),3.14-3.04(m,1H),2.93(d,2H,J=8.4 Hz),2.74(s,3H),2.48-2.28(m,3H),2.15(s,3H),2.19-2.03(m,2H),1.95-1.86(m,4H),1.80-1.71(m,2H),1.71-1.57(m,3H),1.24-1.13(m,1H),1.16(d,3H,J=7.2 Hz),1.04(d,3H,J=6.4 Hz),1.02(d,3H,J=6.8 Hz),0.94(t,3H,J=7.2 Hz)及0.84(d,3H,J=6.8 Hz)；MS：(+) m/z 743.4(M+1)。
使用相同程序，在8毫克規模下，使硝基酸83b 氫化成胺84b 。獲得胺84b ，為白色固體(6.7毫克)。1 H NMR(CD3 OD,400 MHz)：δ8.06(s,1H),7.35(d,2H,J=8.4 Hz),7.16(d,2H,J=8.4 Hz),5.70(dd,1H,J=2.8,11.2 Hz),4.72(d,1H,J=7.2 Hz),4.49-4.32(m,2H),3.75(d,1H,J=10.0 Hz),3.49-3.45(m,1H),3.36-3.35(m,1H),3.33-3.31(m,1H),3.12(s,3H),3.12-3.04(m,1H),2.91(d,2H,J=7.6 Hz),2.74(s,3H),2.57-2.52(m,1H),2.45-2.37(m,1H),2.33-2.28(m,1H),2.15(s,3H),2.19-2.13(m,1H),2.03-1.88(m,5H),1.81-1.57(m,5H),1.24-1.13(m,1H),1.17(d,3H,J=6.8 Hz),1.04(d,3H,J=6.4 Hz),1.02(d,3H,J=7.2 Hz),0.94(t,3H,J=7.2 Hz)及0.84(d,3H,J=6.4 Hz)；MS：(+) m/z 743.4(M+1)。
化合物84a 與84b 亦藉由式(III-r)與(III-s)而被個別描繪於本專利說明書中。
實例19-圖式15
圖式15(圖17 )係描繪具有單一胺基酸(瓜胺酸)連結基之本發明之預備共軛作用化合物之合成。
化合物 85 . 　將圖式10之化合物62 (0.22克，0.654毫莫耳)、Fmoc-保護之瓜胺酸(0.39克，0.981毫莫耳)及N-(3-二甲胺基丙基)-N'-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽("EDCI"，0.188克，0.981毫莫耳)在DMF(4毫升)中之混合物於室溫下攪拌過夜。藉由添加飽和NH4 Cl使反應淬滅，並以EtOAc萃取水溶液。使合併之有機層脫水乾燥，過濾，及濃縮。使粗產物藉急驟式層析純化，以0-100% MeOH在DCM中之梯度液自矽膠溶離，而得0.42克化合物85 ，為白色固體。MS：(+) m/z 716.4(M+1)。
化合物 86 . 　將六氫吡啶添加至化合物85 (0.248克，0.346毫莫耳)在DMF中之溶液內，保持pH在9-10下。將反應混合物在室溫下攪拌20分鐘，然後濃縮，而得0.17克化合物86 。MS：(+) m/z 494.4(M+1)。
化合物 87. 　將水(3毫升)中之LiOH(26.6毫克，1.11毫莫耳)添加至化合物86 (0.17克，0.346毫莫耳)在THF(2毫升)中之溶液內。將反應混合物在室溫下攪拌2小時後，部份移除溶劑。以HCl使水溶液酸化至pH 2-3，並濃縮。使殘留物再溶於DMF(2毫升)中，且添加6-順丁烯二醯亞胺基己酸N-琥珀醯亞胺醯酯(0.16克，0.519毫莫耳)與DIEA(0.091毫升，0.519毫莫耳)。將反應混合物在室溫下攪拌10分鐘後，使粗產物藉製備型HPLC純化，而得0.198克化合物87 ，為白色固體。MS：(+) m/z 673.4(M+1)。
化合物 88. 　於室溫下，將TFA(0.5毫升)添加至化合物87 (12.5毫克，0.019毫莫耳)在DCM(0.5毫升)中之溶液內。將反應混合物在室溫下攪拌5分鐘，然後濃縮，而得12.8毫克化合物88 ，為白色固體。MS：(+) m/z 573.4(M+1)。
化合物 89 . 　將DIEA添加至圖式3之化合物34a (5毫克，0.0093毫莫耳)與HATU(3.9毫克，0.010毫莫耳)在DMF(0.3毫升)中之溶液內，保持pH在8-9下。將反應混合物於室溫下攪拌5分鐘。然後，添加DIEA與DMF(1毫升)中之化合物88 (12.8毫克，0.019毫莫耳)，保持pH在8-9下。將反應混合物於室溫下攪拌15分鐘後，使粗產物藉製備型HPLC純化，而得8.6毫克化合物89 ，為白色固體。MS：(+) m/z 1093.8(M+1)。化合物89 亦藉由式(VI-m)而被描繪於本專利說明書中。
化合物 90 . 　將DIEA添加至圖式5之化合物49 (5毫克，0.0098毫莫耳)與HATU(4.1毫克，0.011毫莫耳)在DMF(0.3毫升)中之溶液內，保持pH在8-9下。將反應混合物於室溫下攪拌5分鐘。然後，添加DIEA與DMF(1毫升)中之化合物88 (13.5毫克，0.0196毫莫耳)，保持pH8-9。將反應混合物在室溫下攪拌15分鐘後，使粗產物藉製備型HPLC純化，而得8.9毫克化合物90 ，為白色固體。MS：(+) m/z 1065.6(M+1)。化合物90 亦藉由式(VI-p)而被描繪於本專利說明書中。
實例20-圖式16
圖式16(圖18 )係描繪具有二肽(瓜胺酸-纈胺酸)連結基之本發明之預備共軛作用化合物之製備。
化合物 91 . 　將DIEA添加至Fmoc-保護之纈胺酸(62.3毫克，0.184毫莫耳)與HATU(63.6毫克，0.167毫莫耳)在DMF(0.5毫升)中之溶液內，保持pH在8-9下。將反應混合物於室溫下攪拌5分鐘。然後，添加DIEA與DMF(1毫升)中之圖式15之化合物86 (82.5毫克，0.167毫莫耳)，保持pH在8-9下。將反應混合物於室溫下攪拌15分鐘後，藉由添加0.05% TFA水溶液使反應淬滅。以EtOAc萃取水溶液，並使合併之有機層脫水乾燥，過濾，及濃縮。使粗產物藉急驟式層析純化，以0-20% MeOH在DCM中之梯度液自矽膠溶離，而得0.13克化合物91 ，為白色固體。MS：(+) m/z 815.5(M+1)。
化合物 92 . 　將六氫吡啶添加至化合物91 (0.144克，0.177毫莫耳)在DMF中之溶液內，保持pH在9-10下。將反應混合物在室溫下攪拌20分鐘，然後濃縮。使殘留物溶於THF(2.5毫升)中，並添加水(1.3毫升)中之LiOH(16.3毫克，0.681毫莫耳)。將反應混合物在室溫下攪拌2小時後，部份移除溶劑。以HCl使水溶液酸化至pH 2-3，接著濃縮。使殘留物再溶於DMF(2.5毫升)中，然後，添加6-順丁烯二醯亞胺基己酸N-琥珀醯亞胺醯酯(0.105克，0.341毫莫耳)與DIEA(0.060毫升，0.341毫莫耳)。將反應混合物在室溫下攪拌10分鐘後，使粗產物藉製備型HPLC純化，而得0.116克化合物92 ，為白色固體。MS：(+) m/z 772.5(M+1)。
化合物 93 . 　於室溫下，將TFA(0.6毫升)添加至化合物92 (14.4毫克，0.019毫莫耳)在DCM(1毫升)中之溶液內。將反應混合物在室溫下攪拌5分鐘，然後濃縮，而得14.7毫克化合物93 ，為白色固體。1 H NMR(CD3 OD,400 MHz)：δ7.58(dd,2H,J=1.6,8.4 Hz),7.21(dd,2H,J=2.8,8.8 Hz),6.79(s,2H),4.48(m,1H),4.13(d,1H,J=7.6 Hz),3.57-3.46(m,3H),3.33-3.32(m,1H),3.22-3.09(m,2H),2.91-2.80(m,1H),2.27(t,2H,J=7.2 Hz),2.09-1.85(m,3H),1.81-1.54(m,8H),1.35-1.29(m,3H),1.19(d,1.5H,J=6.8 Hz),1.18(d,1.5H,J=7.2 Hz),0.98(d,3H,J=2.4 Hz),0.96(d,3H,J=2.8 Hz)；MS：(+) m/z 672.4(M+1)。
化合物 94 . 　將DIEA添加至圖式3之化合物34a (11毫克，0.0204毫莫耳)與HATU(7.8毫克，0.0204毫莫耳)在DMF(0.3毫升)中之溶液內，保持pH在8-9下。將反應混合物於室溫下攪拌5分鐘。然後，添加DIEA與DMF(1毫升)中之化合物93 (14.7毫克，0.019毫莫耳)，保持pH在8-9下。將反應混合物於室溫下攪拌15分鐘後，使粗產物藉製備型HPLC純化，而得18.9毫克化合物94 ，為白色固體。MS：(+) m/z 1192.6(M+1)。化合物94 亦藉由式(VI-n)而被描繪於本專利說明書中。
化合物27之醋酸鹽 .　於0℃下，將醋酸酐(0.248毫升)添加至圖式2之化合物27 (Peltier等人,2006；0.13克，0.218毫莫耳)在吡啶(2.6毫升)中之溶液內。接著，將反應混合物於室溫下攪拌過夜。使反應混合物在0℃下冷卻後，添加水與1,4-二氧陸圜之溶液(12毫升，v/v 1:1)。將反應混合物於室溫下攪拌過夜，然後濃縮。使粗產物藉急驟式層析純化，以10-20%MeOH在DCM中之梯度液自矽膠溶離，而得0.114克化合物27 之醋酸鹽，為白色固體。MS：(+) m/z 639.4(M+1)。
化合物 95 .　將DIEA添加至化合物27 之醋酸鹽(3.8毫克，0.0059毫莫耳)與HATU(2.5毫克，0.0065毫莫耳)在DMF(0.3毫升)中之溶液內，保持pH在8-9下。將反應混合物於室溫下攪拌5分鐘。然後，添加DIEA與DMF(1毫升)中之化合物93 (5.6毫克，0.0071毫莫耳)，保持pH在8-9下。將反應混合物於室溫下攪拌15分鐘後，使粗產物藉製備型HPLC純化，而得6.5毫克化合物95 ，為白色固體。MS：(+) m/z 1292.7(M+1)。化合物95 亦藉由式(VI-o)而被描繪於本專利說明書中。
實例21 -圖式17
參考圖式17(圖19 )，此實例係描述酸108 之合成，該酸為可用於本發明化合物製備之中間物。
甲酯 100. 　將二氧陸圜中之HCl(8.3毫升，4M，33.2毫莫耳)添加至圖式1之化合物9 (8克，22.1毫莫耳)在MeOH(10毫升)中之溶液內。將反應混合物在室溫下攪拌。20分鐘後，使溶液在真空下蒸發，獲得甲酯100 ，為油狀物(6.5克)，將其使用於下一反應步驟，無需進一步純化。
丙胺 101. 　將丙醛(700微升，7.36毫莫耳)與NaBH(OAc)3 (2.8克，13.2毫莫耳)添加至甲酯100 (1.96克，6.6毫莫耳)在DCM(10毫升)中之溶液內。將反應混合物在5℃下攪拌。1小時後，使混合物溶於EtOAc中，並以7% K2 CO3 溶液洗滌兩次，接著以鹽水。使EtOAc層以無水Na2 SO4 脫水乾燥，然後在真空下蒸發，而產生殘留物，使其通過管柱(MeOH：DCM. 0-10%)，獲得丙胺101 (1.12克，60%)，為油狀物。1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )δ8.17(s,1H),5.43(t,J=4.6 Hz,1H),3.93(s,3H),3.07-2.87(m,2H),2.82-2.70(m,1H),2.54(s,1H),2.45-2.26(m,2H),2.16-2.02(m,1H),1.73(m,2H),1.05-0.94(m,9H). MS m/z C14 H25 N2 O3 S(M+1)+ 計算值301.2,實測值301。
化合物 102 . 　將六氟磷酸(苯并三唑-1-基氧基)-三吡咯啶基鏻("PyBop"，1.28克，2.47毫莫耳)、HOBt(0.33克，2.47毫莫耳)、Boc-保護之異白胺酸(430微升，2.47毫莫耳)添加至丙胺101 (570毫克，1.9毫莫耳)在DCM(5毫升)中之溶液內。將反應混合物在室溫下攪拌。20分鐘後，添加EtOAc(200毫升)，並將有機層以10%檸檬酸(兩次)、飽和NaHCO3 及鹽水洗滌。使EtOAc層以無水Na2 SO4 脫水乾燥，然後在真空下蒸發，而產生殘留物，使其通過管柱，獲得化合物102 (0.55克)，為油狀物。MS m/z C25 H44 N3 O6 S(M+1)+ 計算值514.3,實測值514.3。
疊氮基酯 104 . 　將DCM(3毫升)中之氯化醯103 (2毫莫耳，Lundquist等人2001；亦參閱上文在圖式5之疊氮基酯43 之製備中)添加至化合物102 (0.55克，1.1毫莫耳)在DCM(10毫升)與DIEA(871微升，5毫莫耳)中之溶液內。將反應混合物於5℃下攪拌。在攪拌10分鐘後，使混合物於真空下蒸發，獲得殘留物，使其通過管柱，獲得疊氮基酯104 (300毫克)，為油狀物。MS m/z C31 H53 N6 O7 S(M+1)+ 計算值653.4,實測值653。
化合物 106 . 　將五氟苯基酯105 (2.1毫莫耳，Peltier等人2006)在1毫升EtOAc中之溶液添加至疊氮基酯104 (300毫克，0.46毫莫耳)與Pd/C(10%，50毫克)在EtOAc(5毫升)中之溶液內。將反應燒瓶使用氣瓶充填H2 ，並在室溫下攪拌過夜。於攪拌過夜後，將反應混合物過濾，在真空下濃縮，然後通過管柱(MeOH：DCM，0-10%)，獲得化合物106 (170毫克)，為油狀物。MS m/z C38 H66 N5 O8 S(M+1)+ 計算值752.5,實測值752.5。
化合物 107 . 　於室溫下，將NaOH(120微升，1.2毫莫耳，10M)添加至化合物106 (170毫克，0.22毫莫耳)在MeOH(10毫升)中之溶液內。於攪拌2小時後，以濃HCl使反應混合物酸化至pH 2。然後，使反應混合物在真空下蒸發，並通過逆相管柱(ACN：H2 O，0-100%，具有0.1% TFA)。於凍乾後，獲得化合物107 (63毫克)，為白色粉末。HPLC分佈形態顯示其為旋轉異構物之混合物。MS m/z C26 H45 N4 O5 S(M+1)+ 計算值525.3,實測值525。
酸 108. 　於5℃下，將醋酸酐(60微升，0.64毫莫耳)添加至化合物107 (63毫克，0.12毫莫耳)在吡啶(1毫升)中之溶液內。使溫度逐漸升高至室溫。使反應進行過夜後，添加水(100微升)。於另外5小時後，將揮發性有機物質在真空下移除，獲得殘留物，使其通過逆相管柱(ACN：H2 O，0-100%，具有0.1% TFA)，獲得酸108 (42毫克)，為油狀物。1 H NMR(400 MHz,CD3 OD)δ8.35(s,1H),5.71(dd,J=11.4,1.4 Hz,1H),4.63(d,J=9.1 Hz,1H),3.97(t,J=16.4 Hz,1H),3.65-3.42(m,2H),3.21-3.05(m,2H),2.87(s,3H),2.34-2.14(m,4H),2.13(s,3H),2.03-1.46(m,10H),1.29-1.06(m,1H),1.04-0.85(m,15H). MS m/z C28 H47 N4 O5 S(M+1)+ 計算值567.3,實測值567。
實例22-圖式18與19
圖式18(圖20a 與20b )顯示本發明化合物作為前述實例中製成之酸108 使用之合成。
關於HATU所媒介偶合之一般程序. 　於5℃下，將HATU(1.2x過量)與DIEA(4x過量)添加至酸108 在DMF中之溶液內。將反應混合物攪拌10分鐘後，添加其相應之胺。將反應混合物再攪拌10分鐘，然後，將其以DMSO與0.1% TFA溶液稀釋。使所形成之混合物通過逆相管柱(ACN：H2 O，0-100%，具有0.1% TFA)。分析已收集之溶離份，並使所要之溶離份凍乾，獲得其相應之產物。
化合物 109 . 　自酸108 與苯丙胺酸甲酯之偶合而獲得。MS m/z C38 H58 N5 O7 S(M+1)+ 計算值728.4,實測值728.4。化合物109 亦於上文被描繪成結構(III-x)。
化合物 111 . 　自酸108 與化合物110 (下文所述之製備)之偶合而獲得。MS m/z C42 H63 N6 O9 S(M+1)+ 計算值827.4,實測值827.5。
化合物 112 . 　於化合物111 (5毫克，6微莫耳)在2毫升Me OH中之溶液內，添加Pd/C(10%，10毫克)。將反應燒瓶使用氣瓶充填H2 ，並在室溫下攪拌2小時。然後過濾反應混合物，於真空下濃縮，及通過逆相管柱(ACN：H2 O，0-100%，具有0.1% TFA)，獲得化合物112 (2.1毫克)，為白色粉末。MS m/z C42 H67 N6 O7 S(M+1)+ 計算值799.5,實測值799.5。化合物112 亦於上文被描繪成結構(III-y)。
化合物 114 . 　自酸108 與化合物113 (下文所述之製備)之偶合而獲得。MS m/z C41 H64 N5 O7 S(M+1)+ 計算值770.4,實測值770。
化合物 116 . 　自酸108 與化合物115 (下文所述之製備)之偶合而獲得。MS m/z C61 H95 N11 O13 S(M+2)+ 計算值610.9,實測值611。化合物116 亦於上文被描繪成結構(VI-t)。
化合物 117 . 　自酸108 與α-N-乙醯基離胺酸甲酯之偶合而獲得。MS m/z C37 H63 N6 O8 S(M+1)+ 計算值751.4,實測值751.5。
化合物 110 . 　使圖式8之烯烴59 (作為乙酯而非甲酯，1克，2.6毫莫耳)溶於含有5% TFA之DCM(10毫升)中，並將反應混合物在5℃下攪拌。40分鐘後，使混合物在真空下乾燥，而得化合物110 (0.3克，100%)，為半固體。1 H NMR(400 MHz,CD3 OD)δ8.22-8.17(m,2H),7.50(dd,J=9.0,2.2 Hz,2H),6.58(d,J=10.0 Hz,1H),4.45(td,J=9.8,5.3 Hz,1H),4.19(q,J=7.1 Hz,2H),3.35-3.28(m,1H),3.06(dd,J=13.2,9.6 Hz,1H),1.55(d,J=0.9 Hz,3H),1.27(t,J=7.1 Hz,3H)。
化合物 113 . 　將HCl(2.5毫升，10毫莫耳，4M)添加至化合物118 (2克，5.5毫莫耳，Peltier等人2006)在MeOH(10毫升)中之溶液內，並將反應混合物於室溫下攪拌。20分鐘後，使反應混合物在真空下乾燥，而得化合物113 (2克，100%)，為半固體。將粗產物使用於下一步驟反應，無需進一步純化。MS m/z C13 H19 NO2 (M+1)+ 計算值222.1,實測值222。
圖式19(圖21 )顯示化合物115 之合成，該化合物係被使用於上文化合物116 之合成中。
化 合 物 120 . 　將DIEA(697微升，12毫莫耳)與纈胺酸第三-丁酯543(627毫克，3毫莫耳)添加至6-順丁烯二醯亞胺基己酸("6-MHA"，622毫克，3毫莫耳)與HATU(1.14克，3毫莫耳)之10毫升DCM溶液中。20分鐘後，添加EtOAc(200毫升)。將有機相以10%檸檬酸、飽和NaHCO3 溶液及鹽水洗滌。接著，使其以無水Na2 SO4 脫水乾燥，及藉蒸發移除溶劑。使所形成之殘留物通過管柱(己烷：EtOAc，0-80%)，獲得化合物120 (900毫克)，為油狀物。1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )δ6.66(s,2H),5.94(d,J=8.5 Hz,1H),4.44(dd,J=8.7,4.5 Hz,1H),3.49(t,J=7.2 Hz,2H),2.31-2.06(m,3H),1.73-1.54(m,4H),1.45(s,9H),1.37-1.25(m,2H). MS m/z C19 H31 N2 O5 (M+1)+ 計算值367.2,實測值367。
化合物 121 . 　於室溫下，使化合物120 (1克，2.73毫莫耳)溶於20毫升DCM與3毫升TFA中。1小時後，使混合物藉蒸發乾燥，獲得化合物121 (1克)，為油狀物，使用之而無需進一步純化。MS m/z C15 H23 N2 O5 (M+1)+ 計算值311.2,實測值311。
化合物 123 . 　將DIEA(920微升，5.28毫莫耳)與化合物122 (500毫克，1.32毫莫耳；參閱下文圖式22與實例25)添加至Fmoc-保護之瓜胺酸(524毫克，1.32毫莫耳)與HATU(601毫克，1.58毫莫耳)之10毫升DMF溶液中。20分鐘後，添加200毫升EtOAc。將有機相以10%檸檬酸、飽和NaHCO3 溶液及鹽水洗滌。接著，使其以無水Na2 SO4 脫水乾燥，並蒸發EtOAc。使所形成之殘留物通過管柱(MeOH：DCM；0-10%)，獲得固體。使此固體溶於具有5%六氫吡啶之DMF(5毫升)中。1小時後，蒸發溶液，並使殘留物通過逆相管柱(ACN：H2 O；0-100%，具有0.1% TFA)，獲得化合物123 (212毫克)。MS m/z C27 H46 N5 O6 (M+1)+ 計算值536.3,實測值536.4。
化合物 124 . 　將DIEA(404微升，2.4毫莫耳)與化合物560 (321毫克，0.6毫莫耳)添加至化合物550 (180毫克，0.58毫莫耳)與HATU(220毫克，0.58毫莫耳)之5毫升DMF溶液中。20分鐘後，添加200毫升EtOAc。將有機相以10%檸檬酸、飽和NaHCO3 溶液及鹽水洗滌。接著，使其以無水Na2 SO4 脫水乾燥，並蒸發EtOAc。使所形成之殘留物通過管柱(MeOH：DCM；0-20%)，獲得化合物124 (240毫克)，為油狀物。MS m/z C42 H66 N7 O10 (M+1)+ 計算值828.5，實測值828.5。
化合物 115 . 　使化合物124 (240毫克，0.29毫莫耳)溶於TFA與DCM(1:1)之5毫升溶液中。3小時後，使混合物藉蒸發乾燥，並使用所形成之化合物115 ，無需進一步純化。自NMR，獲得兩種(5:1)異構物之混合物。主要異構物係經報告：1 H NMR(400 MHz,CD3 OD)δ8.27(d,J=7.5 Hz,1H),7.58(dd,J=8.5,1.9 Hz,2H),7.21(d,J=8.5 Hz,2H),6.79(s,2H),4.48(dd,J=13.3,8.1 Hz,1H),4.14(dd,J=7.5,4.9 Hz,1H),3.62-3.38(m,3H),3.25-2.97(m,3H),2.96-2.78(m,2H),2.70-2.40(m,1H),2.32-2.21(m,2H),2.11-1.92(m,2H),1.94-1.83(m,1H),1.82-1.70(m,1H),1.70-1.49(m,7H),1.19(d,J=7.0 Hz,3H),0.97(dd,J=6.8,2.8 Hz,6H). MS m/z C33 H50 N7 O8 (M+1)+ 計算值672.4,實測值672。
實例23-圖式20
圖式20(圖22 )顯示化合物131 之合成，該化合物為用於製成本發明化合物之中間物。
化合物 125 . 　使圖式1之化合物9 (3克，8.29毫莫耳)溶於THF(20毫升)與硫酸二甲酯(1.2毫升，12.4毫莫耳)中。在5℃下，於此溶液中，分次添加NaH(552毫克，13.8毫莫耳)，歷經1.5小時。然後，將反應混合物倒入飽和NH4 Cl溶液中。將EtOAc添加至反應混合物中，並以鹽水洗滌有機相，且脫水乾燥，及在真空下蒸發，獲得殘留物。使所形成之殘留物通過管柱(己烷：EtOAc，0-100%)，獲得化合物125 (1.2克)，為油狀物。1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )δ8.12(s,1H),4.95(dd,J=10.0,3.3 Hz,1H),3.89(s,3H),3.50(s,3H),3.45-3.40(m,2H),1.93-1.79(m,2H),1.74-1.65(m,1H),1.20(s,9H),0.84(d,J=6.8 Hz,3H),0.80(d,J=6.8 Hz,3H). MS m/z C16 H29 N2 O4 S2 (M+1)+ 計算值377.1,實測值377.2。
化合物 126 . 　將二氧陸圜中之HCl(1毫升，4毫莫耳)添加至化合物125 (0.7克，1.86毫莫耳)在MeOH(10毫升)中之溶液內。將反應混合物在室溫下攪拌。20分鐘後，使揮發性物質於真空下蒸發，獲得化合物126 (0.8克)，為油狀物，將其使用於下一反應步驟，無需進一步純化。MS m/z C12 H21 N2 O3 S(M+1)+ 計算值273.1,實測值273。
化合物 127 . 　在5℃下，於化合物126 (616毫克，2毫莫耳)在DCM(10毫升)與DIEA(1.8毫升，10毫莫耳)中之溶液內，添加5毫升DCM中之化合物103 (圖式17，6毫莫耳)。將反應混合物在室溫下攪拌3小時。3小時後，將反應混合物倒入飽和NaHCO3 溶液與EtOAc中。以鹽水洗滌有機相，脫水乾燥，及蒸發。使所形成之殘留物通過管柱(己烷：EtOAc，0-50%)，獲得化合物127 (594毫克，72%)，為半油狀物。1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )δ8.18(s,1H),6.47(d,J=9.9 Hz,1H),4.60-4.52(m,1H),4.23-4.13(m,1H),3.96-3.95(m,1H),3.94(s,3H),3.44(s,3H),2.21-2.08(m,1H),1.94-1.84(m,2H),1.84-1.71(m,1H),1.52-1.38(m,1H),1.35-1.20(m,1H),1.07(d,J=6.9 Hz,3H),0.95-0.85(m,9H).13 C NMR(101 MHz,CDCl3 )δ176.00,168.63,161.92,146.90,128.24,78.81,70.34,58.97,52.72,50.76,40.48,38.62,32.24,24.32,19.13,18.13,16.25,11.82. MS m/z C18 H30 N5 O4 S(M+1)+ 計算值412.2,實測值412.3。
化合物 129. 於-43℃下，將六甲基二矽氮化鉀("KHMDS"，0.19毫莫耳，0.375毫升甲苯溶液)添加至化合物127 (50毫克，0.12毫莫耳)之THF(0.5毫升)溶液中。20分鐘後，添加化合物128 (0.36毫莫耳，137微升，Abe等人1997)。2小時後，添加100微升MeOH，並將反應混合物倒入飽和NH4 Cl溶液中。接著添加EtOAc。於液層之分離後，將有機相以鹽水洗滌，以無水Na2 SO4 脫水乾燥，及藉蒸發移除溶劑。使所形成之殘留物通過管柱(己烷：EtOAc，0-50%)，獲得化合物129 (51毫克)，為半固體。1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )δ8.16(s,1H),5.70(s,1H),5.43(d,J=12.4 Hz,1H),5.32(d,J=12.3 Hz,1H),4.39(d,J=10.6 Hz,1H),3.92(d,J=11.7 Hz,3H),3.53-3.44(m,1H),3.37(d,J=10.5 Hz,3H),2.41(d,J=7.2 Hz,2H),2.37-2.11(m,4H),1.92-1.68(m,2H),1.37-1.21(m,1H),1.12-0.85(m,18H).13 C NMR(101 MHz,CDCl3 )δ175.24,172.79,171.21,161.90,147.09,128.25,78.44,68.69,63.35,58.71,52.48,43.23,38.63,34.91,31.01,25.73,25.25,22.58,22.56,22.48,20.45,19.62,16.14,10.65. MS m/z C24 H40 N5 O6 S(M+1)+ 計算值526.3,實測值424.3(N,O縮醛之破碎)。
化合物 130. 　於室溫下，將化合物129 (200毫克，0.38毫莫耳)與105 (Peltier等人2006；4毫莫耳)在5毫升EtOAc與Pd/C(150毫克，10%)中混合。將反應燒瓶抽氣，並使用氣瓶以H2 再充填。在室溫下攪拌過夜後，將混合物過濾，且蒸發溶劑。在管柱層析(SiO2 ，MeOH：DCM，0-10%)後，獲得化合物130 (97毫克)，為固體。MS m/z C31 H53 N4 O7 S(M+1)+ 計算值625.4,實測值625.5。
化合物 131. 　將氫氧化三丁基錫(181毫克，0.59毫莫耳)添加至化合物130 (97毫克，0.16毫莫耳)在10毫升1,2-二氯乙烷中之溶液內。於67℃下22小時後，使混合物蒸發，並通過逆相管柱(ACN：(20 mM NH4 (HCO3 )緩衝劑，pH 7)，5-100%)，獲得化合物131 (34毫克)，為固體。MS m/z C30 H51 N4 O7 S(M+1)+ 計算值611.3,實測值510(在N,O縮醛下之破碎)。
實例24-圖式21
圖式21(圖23 )顯示本發明化合物使用化合物131 作為先質之合成。
化合物 132. 　於室溫下，使化合物60 (圖式8，200毫克，0.57毫莫耳)溶於具有20% TFA之2毫升DCM中。1小時後，使揮發性物質蒸發，獲得化合物132 (200毫克)，為黃色固體，使用之而無需進一步純化。
化合物 133. 　於-43℃下，將DIEA(43微升，0.2毫莫耳)添加至化合物131 (30毫克，0.049毫莫耳)與HATU(22.3毫克，0.059毫莫耳)之DMF(1毫升)溶液中。10分鐘後，添加化合物132 (15毫克，0.06毫莫耳)。接著，使混合物升高至室溫。最後，使混合物通過逆相管柱(ACN：(20 mM NH4 (HCO3 )緩衝劑，pH 7)，5-100%)，獲得化合物133 (20毫克)，為白色粉末。MS m/z C44 H73 N6 O8 S(M+1)+ 計算值843.5,實測值843.5。化合物133 亦於上文被描繪成結構(III-u)。
化合物 134 . 　使化合物133 (2毫克，2.4微莫耳)溶於0.5毫升甲醇中，並以1M HCl將溶液之pH值調整至1。於攪拌過夜後，蒸發揮發性物質，且使殘留物通過逆相管柱(ACN：(20 mM NH4 (HCO3 )緩衝劑，pH 7)，5-100%)，獲得化合物134 (0.7毫克)，為白色粉末。MS m/z C40 H65 N6 O7 S(M+1)+ 計算值773.5，實測值773.5。化合物134 亦於上文被描繪成結構(III-v)。
化合物 135 . 　使化合物133 (2毫克，2.4微莫耳)溶於0.5毫升正-丙醇中，並以1M HCl將溶液之pH值調整至1。於攪拌過夜後，蒸發混合物，且使殘留物通過逆相管柱(ACN：(20 mM NH4 (HCO3 )緩衝劑，pH 7)，5-100%)，獲得化合物135 (0.4毫克)，為白色粉末。MS m/z C42 H69 N6 O7 S(M+1)+ 計算值802.5,實測值801.5。化合物135 亦於上文被描繪成結構(III-w)。
實例25-圖式22
圖式22(圖24 )顯示一種關於製成化合物142 之方法，該化合物可作為中間物使用，以製成本發明化合物。
化合物 136 . 　將NaOH(800微升，10M，8毫莫耳)與圖式8之化合物59 (1.65克，4.37毫莫耳)一起添加至THF與MeOH(1:1)之20毫升溶液中。於攪拌過夜後，在5℃下，以3N HCl將溶液之pH值調整至1。於蒸發溶劑後，添加200毫升EtOAc。在分離後，將有機相以鹽水洗滌，以無水Na2 SO4 脫水乾燥，並蒸發EtOAc。使殘留物通過管柱(MeOH：DCM；0-10%)，獲得化合物136 (1.2克)，為油狀物。1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )δ8.21-8.12(m,2H),7.41-7.32(m,2H),6.62(d,J=8.8 Hz,1H),4.82-4.57(m,2H),3.15-3.02(m,1H),2.90(dd,J=13.3,7.2 Hz,1H),1.71(d,J=1.2 Hz,3H),1.41(s,9H)。
化合物 137 . 　於133℃下，將DMF-二-第三-丁基縮醛(1毫升，4毫莫耳)添加至化合物136 (128毫克，0.36毫莫耳)之6毫升甲苯溶液中。10分鐘後，使反應混合物冷卻，並蒸發溶劑。使殘留物通過管柱(己烷：EtOAc；0-30%)，獲得化合物137 (133毫克)，為油狀物。1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )δ8.19-8.10(m,2H),7.39-7.30(m,2H),6.39(dd,J=9.1,1.5 Hz,1H),4.63(d,J=39.1 Hz,2H),3.03(dd,J=13.2,6.2 Hz,1H),2.90(dd,J=13.3,7.0 Hz,1H),1.67(d,J=1.5 Hz,3H),1.47(s,9H),1.39(s,9H)。
化合物 122 . 　將化合物137 (540毫克，1.22毫莫耳)、Pd/C(136毫克，10%)及3N HCl(0.3毫升)添加至DCM與MeOH(30毫升：5毫升)之混合物中。將燒瓶使用氣瓶充填H2 。在室溫下攪拌過夜後，過濾混合物，及濃縮，而得化合物122 (550毫克)，為半固體。MS m/z C21 H35 N2 O4 (M+1)+ 計算值379.3,實測值223(Boc之損失)。
化合物 138 . 　於氫氣瓶下，在室溫下，將化合物136 (100毫克，0.28毫莫耳)與Pd/C(20毫克，10%)在5毫升MeOH與DCM(1:1 v:v)之混合物中混合。於攪拌過夜後，過濾混合物，並在真空下蒸發溶劑，獲得化合物138 (95毫克)，為油狀物，將其使用於下一反應步驟，無需進一步純化。MS m/z C17 H27 N2 O4 (M+1)+ 計算值323.2,實測值223。
化合物 139 . 　於室溫下，將化合物138 (10毫克，0.03毫莫耳)、氯化第三-丁基二甲基矽烷("TBDMSCl"，4.5毫克，0.03毫莫耳)及咪唑(4毫克，0.06毫莫耳)在1毫升DMF中混合。於室溫下，將Fmoc-保護之瓜胺酸(24毫克，0.06毫莫耳)、草酸N,N'-二琥珀醯亞胺醯酯("DSO"，8毫克，0.06毫莫耳)及DIEA(20微升，0.12毫莫耳)在另一份1毫升DMF中混合。1小時後，將兩種溶液混合，並使混合物保持在室溫下。於攪拌過夜後，添加EtOAc，且將溶液以10%檸檬酸水溶液與鹽水洗滌。接著，使有機相以無水Na2 SO4 脫水乾燥，及在真空下蒸發。使所形成之殘留物通過管柱(MeOH：DCM，0-10%)，獲得化合物139 (7毫克)，為油狀物。MS m/z C38 H48 N5 O8 (M+1)+ 計算值702,實測值702。
化合物 141. 　使化合物139 (10毫克，0.014毫莫耳)溶於具有5%六氫吡啶之1毫升DMF中。20分鐘後，在真空下蒸發溶劑，並將殘留物與N-琥珀醯亞胺醯基-4-順丁烯二醯亞胺基丁酸鹽140 (5.6毫克，0.028毫莫耳)及DIEA(5微升，0.028毫莫耳)在1毫升DMF中混合。10分鐘後，在真空下自反應混合物移除溶劑，且通過管柱(MeOH：DCM，0-20%)，獲得化合物141 (6毫克)，為固體。MS m/z C31 H45 N6 O9 (M+1)+ 計算值645,實測值645。
化 合物 142. 　使化合物141 (6毫克，0.01毫莫耳)溶於具有10% TFA之1毫升DCM中。10分鐘後，在真空下蒸發溶劑，獲得化合物142 (6毫克)，使用於下一反應步驟，無需進一步純化。
實例26-圖式23
圖式23(圖25 )顯示根據圖式22所製成化合物142 之精巧地製成本發明化合物。
化合物 145 . 　於5℃下，將150微升MeOH中之HCl(30微莫耳)添加至圖式2之化合物27 (5毫克，8.3微莫耳)在0.7毫升MeOH中之溶液內。使溫度逐漸上升至室溫。於攪拌過夜後，使混合物蒸發，並溶於0.7毫升吡啶中。於此溶液中，在5℃下，添加Ac2 O(28微升，296微莫耳)。使溫度逐漸上升至室溫，且於攪拌過夜後，添加50微升H2 O。3小時後，使揮發性物質蒸發，及蒸發所形成之殘留物，獲得化合物145 (4.7毫克)，為半固體。MS m/z C27 H45 N4 O7 S(M+1)+ 計算值569.3,實測值569。
化合物 146 . 　於5℃下，將DIEA(6微升，34微莫耳)與化合物142 (5.5毫克，8.3微莫耳)添加至化合物530 (4.7毫克，8.3微莫耳)與HATU(3.2毫克，8.4微莫耳)之0.5毫升DMF溶液中。20分鐘後，使所形成之混合物通過逆相管柱(ACN：(20 mMNH4 (HCO3 )緩衝劑，pH 7)，5-100%)，獲得化合物146 (4.5毫克)，為白色固體。MS m/z C53 H79 N10 O13 S(M+1)+ 計算值1095.5,實測值1095.5。化合物146 亦於上文被描繪成結構(VI-r)。
化 合物 147 . 　將DIEA(1.4微升，8微莫耳)與一滴飽和NH4 Cl溶液添加至化合物146 (2毫克，1.8微莫耳)與HATU(1.6毫克，4.6微莫耳)之0.5毫升DMF溶液中。10分鐘後，使混合物通過逆相管柱(ACN：(20 mM NH4 (HCO3 )緩衝劑，pH 7)，5-100%)，獲得化合物147 (0.5毫克)，為半固體。MS m/z C53 H80 N11 O12 S(M+1)+ 計算值1094.6,實測值1094。化合物147 亦於上文被描繪成結構(VI-s)。
實例27-4-胺基管式苯丙胺酸非對映異構物
化合物122 (上文實例25)係經測定為如下述之非對映異構物148a 與148b 之3:1混合物。
於室溫下，使化合物122 (10毫克，0.026毫莫耳)溶於TFA與DCM(1:1)之2毫升混合物中。3小時後，蒸發溶劑，並使殘留物通過逆相管柱(ACN：H2 O；0-100%，具有0.1% TFA)，獲得化合物149a 與149b 之3:1混合物。藉由將混合物之NMR光譜與製自化合物150 之化合物149a 之真實樣品之NMR作比較，在此混合物中之主要異構物係被指定結構149a 。
於5℃下，將濃HNO3 (10微升)添加至管式苯丙胺酸150 (Peltier等人2006；6毫克，0.025毫莫耳)之200微升濃H2 SO4 溶液中。20分鐘後，將溶液傾倒在2毫升經冷卻之7% K2 CO3 溶液上。然後添加10毫升EtOAc。於分離後，使有機相藉蒸發乾燥，並使殘留物通過逆相管柱(ACN：H2 O；0-100%，具有0.1% TFA)，獲得硝基化合物151 (5毫克)。1 H NMR(400 MHz,CD3 OD)δ8.27-8.21(m,2H),7.56-7.49(m,2H),3.69-3.58(m,1H),3.07(d,J=7.2 Hz,2H),2.73-2.61(m,1H),2.04-1.91(m,1H),1.64(ddd,J=14.7,8.2,4.9 Hz,1H),1.20(d,J=7.1 Hz,3H). MS m/z C12 H17 N2 O4 (M+1)+ 計算值253.1,實測值253。
然後，使硝基化合物151 轉化成化合物149a ，如下述：於室溫下，將硝基化合物151 (5毫克，0.01毫莫耳)與Pd/C(10毫克，10%)在5毫升MeOH中混合。將燒瓶使用氣瓶充填H2 。1小時後，過濾混合物，並蒸發，而得化合物149a (4.5毫克)。1 H NMR(400 MHz,CD3 OD)δ7.08-7.03(m,2H),6.83-6.79(m,2H),3.51-3.41(m,1H),2.84-2.78(m,2H),2.68-2.58(m,1H),2.04-1.92(m,1H),1.60(d,J=7.8 Hz,1H),1.18(d,J=7.0,Hz,3H). MS m/z C12 H19 N2 O2 (M+1)+ 計算值223.1,實測值223。此NMR光譜為關於指定148a/148b 與149a/149b 混合物之主要成份之結構之基礎。
使化合物122 之試樣通過逆相管柱(ACN：H2 O；0-100%，具有0.1% TFA)，並收集具有較少異構物之溶離份，且凍乾。然後，將所形成之產物以TFA與DCM處理，以移除Boc基團。1小時後，蒸發溶劑，獲得產物，將其NMR光譜與化合物149a 之NMR光譜作比較後，其係被指定為化合物149b 。化合物149b ：1 H NMR(400 MHz,CD3 OD) 7.36-7.23(m,2H),7.22-7.09(m,2H),3.59-3.40(m,1H),3.04-2.84(m,2H),2.61-2.45(m,1H)2.07-1.87(m,1H),1.73-1.58(m,1H),1.21-1.09(d,J=7.2 Hz,3H)。
化合物148a、148b、149a 及149b 可用以製備具有4-胺基管式苯丙胺酸亞單位之本發明化合物，其中α-甲基之立體化學係利用上文所舉例之合成途徑(加以必要之更改 )而被定義。亦可將化合物82a 與82b (實例17)用於類似用途。
前文發明詳述係包括主要或唯一地與本發明之特定部份或方面有關係之章節。應明瞭的是，為清楚與方便性起見，特定特徵在不僅是所揭示之章節中可為有關聯的，且本文之揭示內容包括於不同章節中所發現資訊之所有適當組合。同樣地，雖然本文之各種圖與描述係關於本發明之特殊具體實施例，但應明瞭的是，在特殊特徵係被揭示於特定圖或具體實施例內文中之情況下，此種特徵亦可與另一種特徵合併使用於另一種圖或具體實施例之內文中，達適當之程度，或一般性地使用於本發明中。
再者，雖然本發明已以某些較佳具體實施例為觀點而被特別地說明，但本發明並不限於此種較佳具體實施例。而是，本發明之範圍係藉由隨文所附之請求項界定。
參考資料
前文本專利說明書中，關於以縮寫方式所引用之下列參考資料之第一位作者(或發明人)與日期之完全引文，係提供下文。此等參考資料之每一件均併於本文供參考，以提供所有目的。
Abe等人,WO 97/21712(1997)。
Boyd等人,US 2008/0279868 A1(2008)。
Boyd等人,US 7,691,962 B2(2010)。
Balasubramanian等人,Bioorg. Med. Chem. Lett .2008 ,18,2996-2999。
Balasubramanian等人,J. Med. Chem .2009 ,52(2),238-240。
Davis等人,US 2008/0176958 A1(2008)。
Domling,DE 10 2004 030 227 A1(2006)。
Domling等人,US 2005/0239713 A1(2005)[2005a]。
Domling等人,US 2005/0249740 A1(2005)[2005b]。
Domling等人,Mol. Diversity 2005 ,9,141-147[2005c]。
Domling等人,Ang. Chem. Int. Ed .2006 ,45,7235-7239。
Ellman等人,WO 2009/012958 A2(2009)。
Hamel等人,Curr. Med. Chem. -Anti -Cancer Agents 2002 ,2,19-53。
Hoefle等人,DE 100 08 089 A1(2001)。
Hoefle等人,Pure Appl. Chem. 2003 ,75(2-3),167-178。
Hoefle等人,US 2006/0128754 A1(2006)[2006a]。
Hoefle等人,US 2006/0217360 A1(2006)[2006b]。
Kaur等人,Biochem. J. 2006 ,396,235-242。
Khalil等人,ChemBioChem 2006 ,7,678-683。
Leamon等人,Cancer Res.2008 ,68(23),9839-9844。
Leamon等人,WO 2009/002993 A1(2009)。
Leung等人,US 2002/0169125 A1(2002)。
Low等人,WO 2009/026177 A1(2009)。
Lundquist等人,Org. Lett. 2001 ,3,781-783。
Neri等人,ChemMedChem 2006 ,1,175-180。
Patterson等人,Chem. Eur. J. 2007 ,13,9534-9541。
Patterson等人,J. Org. Chem. 2008 ,73,4362-4369。
Peltier等人,J. Am. Chem. Soc. 2006 ,128,16018-16019。
Reddy等人,Mol. Pharmaceutics 2009 ,6(5),1518-1525。
Reichenbach等人WO 98/13375 A1(1998)。
Richter,WO 2008/138561 A1(2008)。
Sani等人,Angew. Chem. Int. Ed. 2007 ,46,3526-3529。
Sasse等人,J. Antibiotics 2000 ,53(9),879-885。
Sasse等人,Nature Chem. Biol. 2007 ,3(2),87-89。
Schluep等人,Clin. Cancer Res.2009 ,15(1),181-189。
Shankar等人,SYNLETT 2009 ,8,1341-1345。
Shibue等人,Tetrahedron Lett. 2009 50,3845-3848。
Steinmetz等人,Angew. Chem. Int. Ed. 2004 ,43,4888-4892。
Ullrich等人,Angew. Chemie Int. Ed. 2009 ,48,4422-4425。
Vlahov等人,Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008 ,18(16),4558-4561[2008a]。
Vlahov等人,US 2008/0248052 A1(2008)[2008b]。
Vlahov等人,WO 2009/055562 A1(2009)。
Vlahov等人,US 2010/0048490 A1(2010)。
Wang等人,Chem. Biol. Drug. Des 2007 ,70,75-86。
Wipf等人,Org. Lett. 2004 ,6(22),4057-4060。
Wipf等人,Org. Lett. 2007 ,9(8),1605-1607。
Wipf等人,US 2010/0047841 A1(2010)。
圖1a 與1b 係合併描繪關於製造本發明化合物之圖式1。
圖2 與3 係個別描繪亦關於製造本發明化合物之圖式2與3。
圖4 係描繪適用於將肽基連結基與順丁烯二醯亞胺反應性基團連接至本發明化合物之圖式4。
圖5、6 及7 係個別描繪關於製造本發明化合物之圖式5、6及7。
圖8a、8b 及8c 係個別顯示關於製造可用於製備本發明化合物之中間物之圖式8、9及10。
圖9 與10 係個別顯示圖式11與12，說明中間物譬如圖8a-8c 中所示者可如何精巧地製成本發明化合物。
圖11a 與11b 係顯示關於第一組本發明化合物針對兩種不同類型癌細胞之3 H胸苷增殖檢測之圖形。
圖12a 與12b 係顯示關於第二組本發明化合物針對兩種不同類型癌細胞之ATP發光增殖檢測之圖形。圖12c 與12d 係顯示關於相同第二組化合物針對相同兩種類型癌細胞之3 H胸苷增殖檢測之圖形。
圖13 係顯示在3 H胸苷增殖檢測中，本發明化合物之共軛物抵抗腎癌細胞之活性。
圖14 係顯示在異種移植研究中，本發明化合物之共軛物抵抗腎癌細胞之活性。
圖15 係顯示關於製造可用於製造本發明化合物之中間物之圖式13。
圖16 係顯示關於自根據圖式13所製成中間物製造本發明合物之圖式14。
圖17 與18 係個別顯示關於製造本發明之預備共軛作用化合物之圖式15與16。
圖19 係顯示關於製造可用於製造本發明化合物之中間物之圖式17。
圖20a 與20b 係合併顯示關於自圖式17之中間物製備本發明化合物之圖式18。
圖21 係顯示關於製造圖式18中所使用中間物之圖式19。
圖22 係顯示關於合成在製造本發明化合物中所使用之中間物之圖式20。
圖23 係顯示關於自圖式20之中間物製造本發明化合物之圖式21。
圖24 係顯示關於製造又另一種可用於製造本發明化合物之中間物之圖式22。
圖25 係顯示關於自圖式22之中間物製造本發明化合物之圖式23。
(無元件符號說明)

Claims (18)

  1. 一種化合物，其係具有以式(II)表示之結構 其中n為0,1或2；R1 、R2 及R3 係獨立為H、未經取代或經取代之C1 -C10 烷基、未經取代或經取代之C2 -C10 烯基、未經取代或經取代之C2 -C10 炔基、未經取代或經取代之芳基、未經取代或經取代之雜芳基、未經取代或經取代之(CH2 )1-2 O(C1 -C10 烷基)、未經取代或經取代之(CH2 )1-2 O(C2 -C10 烯基)、未經取代或經取代之(CH2 )1-2 O(C2 -C10 炔基)、(CH2 )1-2 OC(=O)(C1 -C10 烷基)、未經取代或經取代之(CH2 )1-2 OC(=O)(C2 -C10 烯基)、未經取代或經取代之(CH2 )1-2 OC(=O)(C2 -C10 炔基)、未經取代或經取代之C(=O)(C1 -C10 烷基)、未經取代或經取代之C(=O)(C2 -C10 烯基)、未經取代或經取代之C(=O)(C2 -C10 炔基)、未經取代或經取代之環脂族、未經取代或經取代之雜環脂族、未經取代或經取代之芳烷基或未經取代或經取代之烷基芳基；R4 為 ，或；且R5 為H、C1 -C5 烷基、C2 -C5 烯基、C2 -C5 炔基、CO(C1 -C5 烷基)、CO(C2 -C5 烯基)或CO(C2 -C5 炔基)；或其藥學上可接受之酯，其藥學上可接受之醯胺(在R4 之羧基處，伴隨α-胺基酸之α-胺基)，或其藥學上可接受之鹽。
  2. 如請求項1之化合物，其係具有以式(II-a)表示之結構： 其中R4a 為
  3. 如請求項2之化合物，其係具有以式(II-a')表示之結構： 其中R2 為H、C1 -C5 烷基、C2 -C5 烯基、CH2 O(C1 -C5 烷基)、CH2 O(C2 -C5 烯基)、CH2 O(C=O)(C1 -C5 烷基)或CH2 OC(=O)(C2 -C5 烯基)；且R3 為H、C1 -C5 烷基、C2 -C5 烯基、C(=O)C1 -C5 烷基或C(=O)C2 -C5 烯基。
  4. 如請求項1之化合物，其係具有以式(II-b)表示之結構：
  5. 如請求項4之化合物，其係具有以式(II-b')表示之結構： 其中R2 為H、C1 -C5 烷基、C2 -C5 烯基、CH2 O(C1 -C5 烷基)、CH2 O(C2 -C5 烯基)、CH2 O(C=O)(C1 -C5 烷基)或CH2 OC(=O)(C2 -C5 烯基)；且R3 為H、C1 -C5 烷基、C2 -C5 烯基、C(=O)C1 -C5 烷基或C(=O)C2 -C5 烯基。
  6. 如請求項1之化合物，其係具有根據式(III-a)、(III-b)、(III-c)、(III-d)、(III-e)、(III-f)、(III-g)、(III-h)、(III-i)、(III-j)、(III-k)、(III-l)、(III-m)、(III-n)、(III-o)、(III-p)、(III-q)、(III-r)、(III-s)、(III-t)、(III-u)、(III-v)、(III-w)或(III-y)之結構：
  7. 如請求項1之化合物，其係具有以式(II-c)表示之結構： 其中R13 為Me、n-Pr、CH2 OMe或CH2 OC(=O)CH2 CH(Me)2 ；R14 為Me或C(=O)Me；且R15 為H或C1 -C5 烷基。
  8. 一種化合物-連結基分子，其係具有以式(V-b)表示之結構： 其中n為0,1或2；R1 、R2 及R3 係獨立為H、未經取代或經取代之C1 -C10 烷基、未經取代或經取代之C2 -C10 烯基、未經取代或經取代之C2 -C10 炔基、未經取代或經取代之芳基、未經取代或經取代之雜芳基、未經取代或經取代之(CH2 )1-2 O(C1 -C10 烷基)、未經取代或經取代之(CH2 )1-2 O(C2 -C10 烯基)、未經取代或經取代之(CH2 )1-2 O(C2 -C10 炔基)、(CH2 )1-2 OC(=O)(C1 -C10 烷基)、未經取代或經取代之(CH2 )1-2 OC(=O)(C2 -C10 烯基)、未經取代或經取代之(CH2 )1-2 OC(=O)(C2 -C10 炔基)、未經取代或經取代之C(=O)(C1 -C10 烷基)、未經取代或經取代之C(=O)(C2 -C10 烯基)、未經取代或經取代之C(=O)(C2 -C10 炔基)、未經取代或經取代之環脂族、未經取代或經取代之雜環脂族、未經取代或經取代之芳烷基或未經取代或經取代之烷基芳基；R4’ 為 其中R12 為H、C1 -C5 烷基、C2 -C5 烯基或C2 -C5 炔基；且R5 為H、C1 -C5 烷基、C2 -C5 烯基、C2 -C5 炔基、CO(C1 -C5 烷基)、CO(C2 -C5 烯基)或CO(C2 -C5 炔基)；XD 與XZ 為間隔基；C為可分裂基團；及a與b係獨立為0或1；其中基團R4’ 係經由於其中之羧基或胺基連結至基團XD (在a為1之情況中)或至基團C(在a為0之情況中)。
  9. 如請求項8之化合物-連結基分子，其係具有以式(V-c)表示之結構： 其中R2 、R3 及R4 如請求項8所定義，各AA獨立地為中性胺基酸，且 XZ 為CH2 CH2 NHC(=O)(CH2 )2-5 或C(=O)(CH2 )2-5 。
  10. 如請求項9之化合物-連結基分子，其係具有以式(V-d)表示之結構： 其中R13 為Me、n-Pr、CH2 OMe或CH2 OC(=O)CH2 CH-(Me)2 ；R14 為Me或C(=O)Me；R15 為H或C1 -C5 烷基；R16 為(CH2 )4 NH2 或(CH2 )3 NHC(=O)NH2 ；R17 為C(Me)2 或Me；且p為0或1。
  11. 如請求項8之化合物-連結基分子，其係具有以式(VI-a)至(VI-t)任一個所表示之結構：
  12. 如請求項8之化合物-連結基分子，其係具有以式(VI-o)表示之結構：
  13. 如請求項8之化合物-連結基分子，其係具有以式(VI-t)表示之結構：
  14. 一種共軛物，其包含如請求項8至13中任一項之化合物-連結基分子，該化合物-連結基分子經由配位體之氫硫基與該化合物-連結基分子之順丁烯二醯亞胺基團的親核性加成產物與配位體共軛，其中該配位體系選自抗體、抗體片段及抗體擬似物。
  15. 如請求項14之共軛物，其中該化合物-連結基分子，其係具有以式(VI-t)表示之結構： 且該配位體為人類單株抗-間皮素抗體6A4，6A4之重鏈可變區具有下列胺基酸序列：且6A4之輕鏈可變區具有下列胺基酸序列：
  16. 一種如請求項1至7中任一項之化合物或如請求項14或15之共軛物的用途，其係用於製備治療癌症之藥物。
  17. 一種化合物，其係具有根據式(VIII-a)之結構： 其中R7 為H或胺保護基，且R8 為H、C1 -C10 烷基、C2 -C10 烯基、C2 -C10 炔基、芳基、環脂族、烷基環脂族、芳烷基或烷基芳基。
  18. 一種化合物，其係具有根據式(VIII-b)之結構： 其中R9 與R10 係獨立為H或胺保護基，且R11 為H、C1 -C10 烷基、C2 -C10 烯基、C2 -C10 炔基、芳基、環脂族、烷基環脂族、芳烷基或烷基芳基。
TW99125854A 2009-08-03 2010-08-03 抗細胞增殖化合物及其共軛物及其方法及用途 TWI469794B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US23093209P 2009-08-03 2009-08-03
US23288309P 2009-08-11 2009-08-11

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201106976A TW201106976A (en) 2011-03-01
TWI469794B true TWI469794B (zh) 2015-01-21

Family

ID=42782224

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW99125854A TWI469794B (zh) 2009-08-03 2010-08-03 抗細胞增殖化合物及其共軛物及其方法及用途

Country Status (28)

Country Link
US (6) US8394922B2 (zh)
EP (1) EP2461830B1 (zh)
JP (1) JP5859964B2 (zh)
KR (1) KR101759359B1 (zh)
CN (2) CN102725001B (zh)
AR (1) AR077701A1 (zh)
AU (1) AU2010279674B2 (zh)
BR (1) BR112012002615A2 (zh)
CA (1) CA2770042C (zh)
CL (1) CL2012000302A1 (zh)
CO (1) CO6501196A2 (zh)
DK (1) DK2461830T3 (zh)
EA (1) EA022288B1 (zh)
ES (1) ES2525351T3 (zh)
HR (1) HRP20140976T1 (zh)
HU (1) HUE026997T2 (zh)
IL (1) IL217717A (zh)
IN (1) IN2012DN00860A (zh)
MX (1) MX2012001665A (zh)
NZ (1) NZ597985A (zh)
PE (1) PE20121087A1 (zh)
PL (1) PL2461830T3 (zh)
PT (1) PT2461830E (zh)
SG (2) SG178095A1 (zh)
SI (1) SI2461830T1 (zh)
SM (1) SMT201400183B (zh)
TW (1) TWI469794B (zh)
WO (1) WO2011017249A1 (zh)

Families Citing this family (90)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1789391B1 (en) 2004-07-23 2017-06-28 Endocyte, Inc. Bivalent linkers and conjugates thereof
CA2680535C (en) 2007-03-14 2016-09-20 Endocyte, Inc. Binding ligand linked drug delivery conjugates of tubulysins
US9877965B2 (en) 2007-06-25 2018-01-30 Endocyte, Inc. Vitamin receptor drug delivery conjugates for treating inflammation
CA2690943A1 (en) 2007-06-25 2008-12-31 Endocyte, Inc. Conjugates containing hydrophilic spacer linkers
SI2187965T1 (sl) 2007-08-17 2020-03-31 Purdue Research Foundation Office Of Technology Commercialization Konjugati vezalca ligand-veznika PSMA in metode za uporabo
IT1394860B1 (it) * 2009-07-22 2012-07-20 Kemotech S R L Composti farmaceutici
US8394922B2 (en) * 2009-08-03 2013-03-12 Medarex, Inc. Antiproliferative compounds, conjugates thereof, methods therefor, and uses thereof
US9951324B2 (en) 2010-02-25 2018-04-24 Purdue Research Foundation PSMA binding ligand-linker conjugates and methods for using
KR101839163B1 (ko) 2010-06-08 2018-03-15 제넨테크, 인크. 시스테인 조작된 항체 및 접합체
JP5984854B2 (ja) * 2011-03-16 2016-09-06 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 移動相の調整によって、ポリペプチド単量体、凝集物およびフラグメントを分離するための選択性を向上させた、イオン交換クロマトグラフィー
TWI597065B (zh) 2011-06-10 2017-09-01 梅爾莎納醫療公司 蛋白質－聚合物－藥物共軛體
US10080805B2 (en) 2012-02-24 2018-09-25 Purdue Research Foundation Cholecystokinin B receptor targeting for imaging and therapy
US20140080175A1 (en) 2012-03-29 2014-03-20 Endocyte, Inc. Processes for preparing tubulysin derivatives and conjugates thereof
ES2887208T3 (es) * 2012-05-15 2021-12-22 Concortis Biosystems Corp Conjugados de fármacos y usos de los mismos
PT2872157T (pt) * 2012-07-12 2020-04-30 Hangzhou Dac Biotech Co Ltd Conjugados de moléculas de ligação celular com agentes citotóxicos
US11873281B2 (en) 2012-07-12 2024-01-16 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. Conjugates of cell binding molecules with cytotoxic agents
EP2708243A1 (en) 2012-09-17 2014-03-19 OntoChem GmbH Receptor ligand linked cytotoxic molecules
IN2015DN04147A (zh) 2012-10-16 2015-10-16 Endocyte Inc
KR102318999B1 (ko) 2012-11-15 2021-10-29 엔도사이트, 인코포레이티드 Psma 발현 세포에 의해 야기되는 질병을 치료하기 위한 컨쥬게이트
EP2922818B1 (en) 2012-11-24 2018-09-05 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd Hydrophilic linkers and their uses for conjugation of drugs to cell binding molecules
JP6334553B2 (ja) 2012-12-10 2018-05-30 メルサナ セラピューティクス，インコーポレイティド タンパク質−高分子−薬剤コンジュゲート
EP2931316B1 (en) 2012-12-12 2019-02-20 Mersana Therapeutics, Inc. Hydroxyl-polymer-drug-protein conjugates
PT2956173T (pt) 2013-02-14 2017-06-26 Bristol Myers Squibb Co Compostos de tubulisina, métodos de produção e utilização
US20140249315A1 (en) * 2013-03-01 2014-09-04 Endocyte, Inc. Processes for preparing tubulysins
CN110143999B (zh) 2013-03-15 2023-12-05 酵活英属哥伦比亚省公司 具细胞毒性和抗有丝分裂的化合物以及其使用方法
JP6171435B2 (ja) * 2013-03-18 2017-08-02 富士通株式会社 半導体装置及びその製造方法、電源装置、高周波増幅器
US10781259B2 (en) 2013-06-06 2020-09-22 Magenta Therapeutics, Inc. Modified antibodies and related compounds, compositions, and methods of use
WO2015057585A1 (en) * 2013-10-14 2015-04-23 Regents Of The University Of Minnesota Therapeutic compounds
GEP20237497B (en) 2013-10-18 2023-04-10 Deutsches Krebsforsch Labeled inhibitors of prostate specific membrane antigen (psma), their use as imaging agents and pharmaceutical agents for the treatment of prostate cancer
US20160287731A1 (en) 2013-11-14 2016-10-06 Endocyte, Inc. Compounds for Positron Emission Tomography
US20170168074A1 (en) 2013-11-25 2017-06-15 Ontochem Gmbh Method for diagnosing G-protein coupled receptor-related diseases
KR20160125361A (ko) 2013-12-27 2016-10-31 자임워크스 인코포레이티드 Ｖａｒ２ｃｓａ－약물 접합체
JP6560681B2 (ja) 2013-12-27 2019-08-14 ザイムワークス インコーポレイティド 薬物結合体のためのスルホンアミド含有連結系
AU2015213106B2 (en) * 2014-01-28 2019-07-25 Tube Pharmaceuticals Gmbh Cytotoxic tubulysin compounds for conjugation
WO2015127685A1 (en) 2014-02-28 2015-09-03 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd Charged linkers and their uses for conjugation
WO2015135659A1 (en) 2014-03-14 2015-09-17 Ontochem Gmbh Receptor ligand linked cytotoxic molecules
JP6644701B2 (ja) 2014-03-20 2020-02-12 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ 安定化したフィブロネクチンベーススキャフォールド分子
UY36075A (es) * 2014-04-11 2015-10-30 Medimmune Llc Derivados de tubulisina
ES2857192T3 (es) * 2014-06-03 2021-09-28 Jiaray Pharmaceuticals Inc Conjugado de mitomicina
CN104262455B (zh) * 2014-08-22 2017-05-03 亚飞（上海）生物医药科技有限公司 肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物及其制备和用途
US10682371B2 (en) 2014-08-22 2020-06-16 Yafei Shanghai Biolog Medicine Science & Technology Co. Ltd. Small molecule conjugates specifically activated in tumor microenvironment for targeting and use thereof
CN107108694B (zh) * 2014-09-11 2022-05-03 西雅图基因公司 含叔胺药物物质的靶向递送
SG11201701128YA (en) 2014-09-12 2017-03-30 Genentech Inc Cysteine engineered antibodies and conjugates
KR102494557B1 (ko) 2014-09-17 2023-02-02 자임워크스 비씨 인코포레이티드 세포독성 및 항유사분열성 화합물, 그리고 이를 이용하는 방법
US10077287B2 (en) 2014-11-10 2018-09-18 Bristol-Myers Squibb Company Tubulysin analogs and methods of making and use
US10100129B2 (en) 2014-11-21 2018-10-16 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against CD73 and uses thereof
EA038349B1 (ru) 2014-11-21 2021-08-12 Бристол-Маерс Сквибб Компани Антитела, содержащие модифицированные константные участки тяжелой цепи
EP3702367B1 (en) 2014-11-25 2024-05-15 Bristol-Myers Squibb Company Novel pd-l1 binding polypeptides for imaging
US10188759B2 (en) 2015-01-07 2019-01-29 Endocyte, Inc. Conjugates for imaging
EA201791896A1 (ru) * 2015-02-25 2018-02-28 Уильям Марш Райс Юниверсити Дезацетокситубулизин н и его аналоги
WO2016144608A1 (en) 2015-03-10 2016-09-15 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies conjugatable by transglutaminase and conjugates made therefrom
HUE061253T2 (hu) 2015-05-29 2023-06-28 Bristol Myers Squibb Co Antitestek OX40 ellen és azok felhasználásai
CA2991973C (en) 2015-07-12 2021-12-07 Suzhou M-Conj Biotech Co., Ltd. Bridge linkers for conjugation of a cell-binding molecule
US9839687B2 (en) 2015-07-15 2017-12-12 Suzhou M-Conj Biotech Co., Ltd. Acetylenedicarboxyl linkers and their uses in specific conjugation of a cell-binding molecule
EP3353198B1 (en) 2015-09-23 2020-06-17 Bristol-Myers Squibb Company Glypican-3binding fibronectin based scafflold molecules
JP6707804B2 (ja) * 2015-09-24 2020-06-10 エルジー・ケム・リミテッド 化合物およびこれを含む有機発光素子
EP3165237B1 (en) 2015-11-03 2018-12-19 Industrial Technology Research Institute Antibody-drug conjugate (adc) and method for forming the same
US11793880B2 (en) 2015-12-04 2023-10-24 Seagen Inc. Conjugates of quaternized tubulysin compounds
CA3006000A1 (en) 2015-12-04 2017-06-08 Seattle Genetics, Inc. Conjugates of quaternized tubulysin compounds
EP3394096A1 (en) 2015-12-21 2018-10-31 Bristol-Myers Squibb Company Variant antibodies for site-specific conjugation
CA3012960A1 (en) 2016-02-01 2017-08-10 Pfizer Inc. Tubulysin analogs and methods for their preparation
KR20220033522A (ko) 2016-03-04 2022-03-16 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 항-cd73 항체와의 조합 요법
CN109620949A (zh) * 2016-03-13 2019-04-16 曹帅 一种用于治疗骨癌的药物组合物
US20170326249A1 (en) * 2016-05-10 2017-11-16 Bristol-Myers Squibb Company Antibody-drug conjugate of an anti-glypican-3 antibody and a tubulysin analog, preparation and uses
WO2017196598A1 (en) * 2016-05-10 2017-11-16 Bristol-Myers Squibb Company Antibody-drug conjugates of tubulysin analogs with enhanced stability
US10106560B2 (en) 2016-06-16 2018-10-23 Bristol-Myers Squibb Company Process and intermediates for making tubulysin analogs
EP3500574B1 (en) 2016-08-19 2021-11-24 Bristol-Myers Squibb Company Seco-cyclopropapyrroloindole compounds, antibody-drug conjugates thereof, and methods of making and use
US20190218294A1 (en) 2016-09-09 2019-07-18 Bristol-Myers Squibb Company Use of an anti-pd-1 antibody in combination with an anti-mesothelin antibody in cancer treatment
US10517958B2 (en) 2016-10-04 2019-12-31 Zymeworks Inc. Compositions and methods for the treatment of platinum-drug resistant cancer
US10398783B2 (en) 2016-10-20 2019-09-03 Bristol-Myers Squibb Company Antiproliferative compounds and conjugates made therefrom
KR102345175B1 (ko) 2016-11-14 2021-12-31 항저우 디에이씨 바이오테크 씨오, 엘티디 결합 링커, 그러한 결합 링커를 함유하는 세포 결합 분자-약물 결합체, 링커를 갖는 그러한 결합체의 제조 및 사용
JP6585650B2 (ja) * 2017-03-23 2019-10-02 ハンヂョウ ディーエイシー バイオテック カンパニー リミテッド 細胞毒性剤と細胞結合受容体との共役体
US20200299400A1 (en) 2017-05-25 2020-09-24 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies comprising modified heavy constant regions
WO2019108685A1 (en) * 2017-11-29 2019-06-06 William March Rice University Tubulysin analogues as anticancer agents and payloads for antibody-drug conjugates and methods of treatment therewith
JP2021522193A (ja) 2018-04-17 2021-08-30 エンドサイト・インコーポレイテッドＥｎｄｏｃｙｔｅ， Ｉｎｃ． 癌を治療する方法
US11485741B2 (en) 2018-04-24 2022-11-01 Bristol-Myers Squibb Company Macrocyclic toll-like receptor 7 (TLR7) agonists
MX2020012674A (es) 2018-05-29 2021-02-09 Bristol Myers Squibb Co Porciones autoinmolantes modificadas para usarse en profarmacos y conjugados y metodos de uso y fabricacion.
US11020490B2 (en) 2018-06-22 2021-06-01 Bristol-Myers Squibb Company Antibody-drug conjugate with a tubulysin analog warhead having a stabilized acetate group in the TUV subunit
WO2020112781A1 (en) 2018-11-28 2020-06-04 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies comprising modified heavy constant regions
DK3886914T3 (da) 2018-11-30 2023-07-03 Bristol Myers Squibb Co Antistof omfattende en glutaminholdig letkæde-c-terminal forlængelse, konjugater deraf og fremgangsmåder samt anvendelser
CN113544155A (zh) 2018-12-12 2021-10-22 百时美施贵宝公司 经修饰用于转谷氨酰胺酶缀合的抗体、其缀合物以及方法和用途
EA202191769A1 (ru) 2018-12-21 2021-12-08 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Тубулизины и конъюгаты белок-тубулизин
US12473265B2 (en) 2019-05-20 2025-11-18 Endocyte, Inc. Methods for preparing PSMA conjugates
JP6842127B2 (ja) * 2019-05-22 2021-03-17 ハンヂョウ ディーエイシー バイオテック カンパニー リミテッド 細胞毒性剤と細胞結合受容体との共役体
IL289458B1 (en) 2019-06-29 2025-10-01 Hangzhou Dac Biotech Co Ltd Cell-binding conjugated derivative of tubulin molecule and method for its production
WO2021055306A1 (en) 2019-09-16 2021-03-25 Bristol-Myers Squibb Company Dual capture method for analysis of antibody-drug conjugates
CN113387829B (zh) * 2020-03-13 2023-04-07 凯特立斯（深圳）科技有限公司 一种沙库必曲的制备方法
EP4171653A2 (en) * 2020-06-24 2023-05-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Tubulysins and protein-tubulysin conjugates
JP7044419B2 (ja) * 2021-02-04 2022-03-30 ハンヂョウ ディーエイシー バイオテック カンパニー リミテッド 細胞毒性剤と細胞結合受容体との共役体
AU2021362997A1 (en) 2021-11-03 2024-05-16 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. Specific conjugation of an antibody

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102004030227A1 (de) * 2004-06-23 2006-01-26 Dömling, Alexander, Dr. Wirkstoffe mit antiangiogenetischen Eigenschaften
WO2008138561A1 (en) * 2007-05-10 2008-11-20 R & D Biopharmaceuticals Gmbh Tubulysine derivatives

Family Cites Families (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1981001145A1 (en) 1979-10-18 1981-04-30 Univ Illinois Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US5144011A (en) 1981-06-26 1992-09-01 Boston University Acidity-sensitive spacer molecule to control the release of pharmaceuticals from molecular carriers
US4631190A (en) 1981-06-26 1986-12-23 Shen Wei C Acidity-sensitive spacer molecule to control the release of pharmaceuticals from molecular carriers
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
US4698420A (en) 1985-02-25 1987-10-06 Xoma Corporation Antibody hybrid molecules and process for their preparation
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
TW420681B (en) 1995-12-08 2001-02-01 Lederle Japan Ltd Carbapenem-3-carboxylic acid ester derivatives
DE19638870B4 (de) 1996-09-23 2009-05-14 Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH Tubulysine, Verfahren zu ihrer Gewinnung und sie enthaltende Mittel
US7214487B2 (en) 1998-06-26 2007-05-08 Sunesis Pharmaceuticals, Inc. Methods for identifying compounds that modulate enzymatic activities by employing covalently bonded target-extender complexes with ligand candidates
ES2282133T3 (es) * 1999-08-24 2007-10-16 Medarex, Inc. Anticuerpos frente a la ctla-4 humano y sus usos.
DE10008089A1 (de) 2000-02-22 2001-10-31 Biotechnolog Forschung Gmbh Syntheseverfahren zur Herstellung von Tubulysinen
US20020169125A1 (en) * 2001-03-21 2002-11-14 Cell Therapeutics, Inc. Recombinant production of polyanionic polymers and uses thereof
MXPA03011094A (es) 2001-05-31 2004-12-06 Medarex Inc Citotoxinas, profarmacos, ligadores, y estabilizadores utiles para ello.
US7091186B2 (en) 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
CN1638800B (zh) * 2002-01-09 2014-07-16 梅达雷克斯有限责任公司 抗cd30的人类单克隆抗体
DK1523493T3 (da) * 2002-07-09 2013-12-02 Alexander Doemling Nye tubulysinanaloge
US7776814B2 (en) * 2002-07-09 2010-08-17 R&D-Biopharmaceuticals Gmbh Tubulysin conjugates
DE10241152A1 (de) * 2002-09-05 2004-03-18 GESELLSCHAFT FüR BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) Tubulysin-Biosynthese-Gene
FR2845630B1 (fr) * 2002-10-09 2005-09-30 Helitest Ags Dispositif de demasticage, notamment pour la refection de joints dans des structures de reservoirs d'aeronefs et container d'intervention
DE10254439A1 (de) * 2002-11-21 2004-06-03 GESELLSCHAFT FüR BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) Tubulysine, Herstellungsverfahren und Tubulysin-Mittel
TW200510454A (en) 2003-04-15 2005-03-16 Smithkline Beecham Corp Conjugates comprising human IL-18 and substitution mutants thereof
CN1826138B (zh) * 2003-07-22 2012-05-23 舍林股份公司 Rg1抗体及其用途
AU2005216251B2 (en) 2004-02-23 2011-03-10 Genentech, Inc. Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates
CA2564076C (en) * 2004-05-19 2014-02-18 Medarex, Inc. Chemical linkers and conjugates thereof
RU2402548C2 (ru) * 2004-05-19 2010-10-27 Медарекс, Инк. Химические линкеры и их конъюгаты
US7541330B2 (en) 2004-06-15 2009-06-02 Kosan Biosciences Incorporated Conjugates with reduced adverse systemic effects
CN104447992A (zh) 2004-09-23 2015-03-25 健泰科生物技术公司 半胱氨酸改造的抗体和偶联物
HRP20120709T1 (hr) * 2005-02-18 2012-10-31 Medarex, Inc. Humano monoklonsko protutijelo za prostata-specifiäśni membranski antigen (psma)
US7714016B2 (en) * 2005-04-08 2010-05-11 Medarex, Inc. Cytotoxic compounds and conjugates with cleavable substrates
EP3530736A3 (en) 2005-05-09 2019-11-06 ONO Pharmaceutical Co., Ltd. Human monoclonal antibodies to programmed death 1 (pd-1) and methods for treating cancer using anti-pd-1 antibodies alone or in combination with other immunotherapeutics
AU2006262232A1 (en) * 2005-06-20 2007-01-04 Medarex, Inc. CD19 antibodies and their uses
US8465724B2 (en) * 2005-08-19 2013-06-18 Endocyte, Inc. Multi-drug ligand conjugates
CN101312748A (zh) * 2005-09-26 2008-11-26 梅达莱克斯公司 抗体-药物轭合物和使用方法
NZ566395A (en) * 2005-09-26 2012-03-30 Medarex Inc Human monoclonal antibodies to CD70
PT1940789E (pt) * 2005-10-26 2012-02-01 Medarex Inc Métodos e compostos para preparar análogos cc-1065
CA2627190A1 (en) * 2005-11-10 2007-05-24 Medarex, Inc. Duocarmycin derivatives as novel cytotoxic compounds and conjugates
WO2007067730A2 (en) * 2005-12-08 2007-06-14 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to protein tyrosine kinase 7 ( ptk7 ) and their use
CA2630483C (en) * 2005-12-08 2015-05-19 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to o8e
CA2671457C (en) 2006-12-01 2017-09-26 Medarex, Inc. Human antibodies that bind cd22 and uses thereof
WO2008074004A2 (en) 2006-12-14 2008-06-19 Medarex, Inc. Human antibodies that bind cd70 and uses thereof
UY30776A1 (es) * 2006-12-21 2008-07-03 Medarex Inc Anticuerpos cd44
TWI412367B (zh) 2006-12-28 2013-10-21 Medarex Llc 化學鏈接劑與可裂解基質以及其之綴合物
US20080176958A1 (en) * 2007-01-24 2008-07-24 Insert Therapeutics, Inc. Cyclodextrin-based polymers for therapeutics delivery
CA2678514A1 (en) * 2007-02-21 2008-08-28 Medarex, Inc. Chemical linkers with single amino acids and conjugates thereof
WO2008106080A2 (en) * 2007-02-27 2008-09-04 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Synthesis of desacetoxytubulysin h and analogs thereof
CA2680535C (en) * 2007-03-14 2016-09-20 Endocyte, Inc. Binding ligand linked drug delivery conjugates of tubulysins
CA2690943A1 (en) 2007-06-25 2008-12-31 Endocyte, Inc. Conjugates containing hydrophilic spacer linkers
US7387981B1 (en) 2007-06-28 2008-06-17 Lyondell Chemical Technology, L.P. Direct epoxidation catalyst and process
US20110263650A1 (en) 2007-07-20 2011-10-27 Helmholtz-Zentrum Für Infektions-Forschung Gmbh Tubulysin D Analogues
SI2187965T1 (sl) 2007-08-17 2020-03-31 Purdue Research Foundation Office Of Technology Commercialization Konjugati vezalca ligand-veznika PSMA in metode za uporabo
WO2009026274A1 (en) 2007-08-22 2009-02-26 Medarex, Inc. Site-specific attachment of drugs or other agents to engineered antibodies with c-terminal extensions
US8268970B2 (en) 2007-10-01 2012-09-18 Bristol-Myers Squibb Company Human antibodies that bind mesothelin, and uses thereof
WO2009055562A1 (en) 2007-10-25 2009-04-30 Endocyte, Inc. Tubulysins and processes for preparing
EP2174947A1 (en) * 2008-09-25 2010-04-14 Universität des Saarlandes Bioactive pre-tubulysins and use thereof
US8394922B2 (en) 2009-08-03 2013-03-12 Medarex, Inc. Antiproliferative compounds, conjugates thereof, methods therefor, and uses thereof
US9163060B2 (en) * 2009-11-12 2015-10-20 R&D Biopharmaceuticals Gmbh Tubulin inhibitors

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102004030227A1 (de) * 2004-06-23 2006-01-26 Dömling, Alexander, Dr. Wirkstoffe mit antiangiogenetischen Eigenschaften
WO2008138561A1 (en) * 2007-05-10 2008-11-20 R & D Biopharmaceuticals Gmbh Tubulysine derivatives

Also Published As

Publication number Publication date
US8394922B2 (en) 2013-03-12
HK1164751A1 (zh) 2012-09-28
ES2525351T3 (es) 2014-12-22
EP2461830B1 (en) 2014-09-24
US20160060294A1 (en) 2016-03-03
US20130189256A1 (en) 2013-07-25
NZ597985A (en) 2013-08-30
US9226974B2 (en) 2016-01-05
US20110027274A1 (en) 2011-02-03
CA2770042C (en) 2017-02-28
IL217717A0 (en) 2012-03-29
US9580467B2 (en) 2017-02-28
DK2461830T3 (en) 2015-01-12
CA2770042A1 (en) 2011-02-10
EA201270242A1 (ru) 2012-07-30
CL2012000302A1 (es) 2012-07-20
PT2461830E (pt) 2014-12-11
PE20121087A1 (es) 2012-08-17
US8772542B2 (en) 2014-07-08
KR101759359B1 (ko) 2017-07-18
CO6501196A2 (es) 2012-08-15
JP2013501055A (ja) 2013-01-10
KR20120047998A (ko) 2012-05-14
TW201106976A (en) 2011-03-01
US8772543B2 (en) 2014-07-08
JP5859964B2 (ja) 2016-02-16
SMT201400183B (it) 2015-01-15
PL2461830T3 (pl) 2015-03-31
MX2012001665A (es) 2012-03-26
IN2012DN00860A (zh) 2015-07-10
US20130204033A1 (en) 2013-08-08
CN102725001B (zh) 2015-01-14
SI2461830T1 (sl) 2015-01-30
SG10201503332XA (en) 2015-06-29
US20130197259A1 (en) 2013-08-01
EA022288B1 (ru) 2015-12-30
WO2011017249A1 (en) 2011-02-10
BR112012002615A2 (pt) 2020-11-03
CN102725001A (zh) 2012-10-10
EP2461830A1 (en) 2012-06-13
HRP20140976T1 (hr) 2015-01-02
SG178095A1 (en) 2012-03-29
AU2010279674B2 (en) 2015-05-07
IL217717A (en) 2017-06-29
CN104592351A (zh) 2015-05-06
AR077701A1 (es) 2011-09-14
HUE026997T2 (en) 2016-08-29
US8802632B2 (en) 2014-08-12
US20140323690A1 (en) 2014-10-30
AU2010279674A1 (en) 2012-02-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI469794B (zh) 抗細胞增殖化合物及其共軛物及其方法及用途
CA2900854C (en) Tubulysin compounds, methods of making and use
HK1164751B (zh) 抗增殖化合物、其共軛、其方法和其用途
HK1212209B (zh) 妥布賴森化合物、製備和使用方法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees