TWI454575B - 抗凝血蛋白原之適體、包含其之檢測套組與方法及其最適化篩選方法 - Google Patents
抗凝血蛋白原之適體、包含其之檢測套組與方法及其最適化篩選方法 Download PDFInfo
- Publication number
- TWI454575B TWI454575B TW101119796A TW101119796A TWI454575B TW I454575 B TWI454575 B TW I454575B TW 101119796 A TW101119796 A TW 101119796A TW 101119796 A TW101119796 A TW 101119796A TW I454575 B TWI454575 B TW I454575B
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- aptamer
- prothrombin
- binds
- dna
- sequence
- Prior art date
Links
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 title claims description 90
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 title claims description 57
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 title 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 title 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 title 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 claims description 55
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 claims description 55
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 37
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 29
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 claims description 17
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 claims description 17
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 11
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 claims description 9
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 claims description 7
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 claims description 7
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 36
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 22
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 17
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 8
- GJWMYLFHBXEWNZ-UHFFFAOYSA-N tert-butyl (4-ethenylphenyl) carbonate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)OC1=CC=C(C=C)C=C1 GJWMYLFHBXEWNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 6
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 6
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 6
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 6
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 5
- UIZZRDIAIPYKJZ-UHFFFAOYSA-J BoBo-3 Chemical compound [I-].[I-].[I-].[I-].S1C2=CC=CC=C2[N+](C)=C1C=CC=C1C=CN(CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C)(C)CCCN2C=CC(=CC=CC3=[N+](C4=CC=CC=C4S3)C)C=C2)C=C1 UIZZRDIAIPYKJZ-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229930003756 Vitamin B7 Natural products 0.000 description 4
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000011735 vitamin B7 Substances 0.000 description 4
- 235000011912 vitamin B7 Nutrition 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 2
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 2
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 2
- 208000001435 Thromboembolism Diseases 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 2
- 108091005948 blue fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 2
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 2
- YMXHPSHLTSZXKH-RVBZMBCESA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoate Chemical compound C([C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1)CCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O YMXHPSHLTSZXKH-RVBZMBCESA-N 0.000 description 1
- 101150090724 3 gene Proteins 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108010011619 6-Phytase Proteins 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 1
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 1
- 206010003178 Arterial thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108091008102 DNA aptamers Proteins 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 206010051055 Deep vein thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000651439 Homo sapiens Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- CQBGBBNNWBQAKG-UHFFFAOYSA-N N=[N+]=[N-].[Na] Chemical compound N=[N+]=[N-].[Na] CQBGBBNNWBQAKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 244000195452 Wasabia japonica Species 0.000 description 1
- 235000000760 Wasabia japonica Nutrition 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 108010063628 acarboxyprothrombin Proteins 0.000 description 1
- 239000004019 antithrombin Substances 0.000 description 1
- 230000011681 asexual reproduction Effects 0.000 description 1
- 238000013465 asexual reproduction Methods 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 description 1
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 229940039715 human prothrombin Drugs 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229940085127 phytase Drugs 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 208000015891 sexual disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 208000004043 venous thromboembolism Diseases 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical group O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本發明係關於一種適體(aptamer)。更特定而言，本發明係關於一種結合至凝血蛋白原之適體。本發明亦關於以上述適體偵測凝血蛋白原及檢測凝血疾病的方法。本發明更進一步關於一種適體的最適化篩選方法。
凝血蛋白原為凝血蛋白前驅物(Zymogen)，在凝血過程中會轉化生成凝血蛋白(Thrombin)，進而催化纖維蛋白原(fibrinogen)形成纖維蛋白(fibrin)，以完成凝血反應。正常人體中凝血蛋白原之濃度處於恆定狀態，當受外傷或是不正常凝血機制產生(如：血栓發生)時，大量凝血蛋白原便會減少而生成凝血蛋白，因此便能藉由檢測凝血蛋白原來判斷病患是否患有不正常凝血疾病，或是判斷該病患是否為凝血疾病高風險者。
適體為一種能與蛋白質(protein)和核酸(nucleic acid)相結合之寡核酸(oligonucleic acid)，也就是具有抗體特性的單股核酸。適體除具有一般蛋白質抗體(antibody)的專一性特性，更具有能以化學合成(oligonucleotide synthesis)或聚合酶連鎖反應方式大量生產核酸的特性，同時並擁有較高化學穩定性，而不像蛋白質抗體有合成不易且化學穩定性不佳之問題。與蛋白質抗體比較而言，適體更可克服許多使用上的限制，像是在篩選它的過程中無需動物或細胞培養，如此即可篩選出抗有毒物質或非免疫性的標的物之適體。再者由於適體的分子量較小，在試管內及細胞內的影像分析上是很好的工具。最重要的是，適體可經由化學性的修飾來配合應用，像是
為了偵測或固定化而引入官能基(functional groups)。目前適體也已可使用在毛細管電泳(capillary electrophoresis)、親合層析法、流式細胞儀(flow cytometry)和生物感測器。
適體(aptamer)於1990年被以「系統性配位子指數增益演繹程序(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment，簡稱SELEX)」篩選出來(Ellington and Szostak,1990)。而SELEX技術本質上類似達爾文的演化理論，利用大量序列不同的單股RNA或DNA分子庫與標的物進行雜交過程，經過不同的洗滌(wash)方式將非專一性鍵結之序列洗去後，利用聚合酶連鎖反應進行序列放大並單股化的過程後，再次投入下一次的篩選過程，如此經過多次篩選淘汰循環之後，其篩選到之單股分子庫對標的物的解離常數(Dissociation constant)可由原先μM降至nM等級，再經過定序、純化等步驟處理後，便得到數組可得到對該標的物專一性高、靈敏性強的適體。
至今SELEX技術的發展也漸趨完善。從利用放射性標定定量有無結合之寡核酸到以螢光標定，改善了成本昂貴及環境破壞之可能性的缺點。篩選與標的物有無結合之寡核酸的方法的方式也相當多元，像是利用離心法、硝化纖維濾紙過濾法、親合層析法、毛細管電泳、流式細胞術(flow cytometry)和磁珠的特性(Stoltenburg,Reinemann et al.,2005)等。將標的物固定在磁珠上進行SELEX的方法，優點是需要使用的標的物較少且操作方便，再加上與以硝化纖維濾紙過濾法比較而言，可以較少的循環得到適體。
本文中，術語「複數個」係用以描述本發明之元件或單元之數量。此
用語除非明確另有所指，否則應理解為兩個以上。
本文中的用語「一」或「一種」係用以敘述本發明之元件及成分。此術語僅為了敘述方便及給予本發明之基本觀念。此敘述應被理解為包括一種或至少一種，且除非明顯地另有所指，表示單數時亦包括複數。
本文中的用語「或」其意同「及/或」。
本發明提供一種結合至凝血蛋白原的適體(aptamer)，包含下列核苷酸序列：5’-TCCCTACGGGCGCTAACMVYNSVWBSRSYSHNWNVBVMYSNVDHYBBGCCACCGTGCTACAAC-3’(SEQ ID NO：14)其中，第1個核苷酸係T或不存在，且第10個核苷酸係G或不存在；N係A、T、C或G；R係G或A；Y係T或C；M係A或C；S係G或C；W係A或T；B係G、C或T；D係A、G或T；H係A、C或T；及V係A、C或G。
在一具體實施例中，該結合至凝血蛋白原的適體包含選自由下列組成之群組的核苷酸序列：5’-TCCCTACGGGCGCTAACCCTCCCACCACCCCCAGCCACCCAAATCCCGCCACCGTGCTACAAC-3’(SEQ ID NO：4)；5’-CCCTACGGCGCTAACCCTCCCACCACCCCCAGCCACCCAAATCCCGCCACCGTGCTACAAC-3’(SEQ ID NO：6)；5’-TCCCTACGGCGCTAACCCCTCCACGGCTCTCATGCCTCGCAATGTGCCACCGTGCTACAAC-3’(SEQ ID NO：7)；
5’-TCCCTACGGCGCTAACAGTGGGAGGGGTCTATGGTACCGTGGTTGGGCCACCGTGCTACAAC-3’(SEQ ID NO：8)；5’-TCCCTACGGCGCTAACCACACATCCACTGCTACACCACGCCTTCTTGCCACCGTGCTACAAC-3’(SEQ ID NO：9)；5’-TCCCTACGGCGCTAACCATACATTCTGAGAAGGGCTCACTCTTGGCCACCGTGCTACAAC-3’(SEQ ID NO：10)；及5’-GTTGTAGCACGGTGGCGGGATTTGGGTGGCTGGGGGTGGTGGGAGGGTTAGCGCCGTAGGG-3’(SEQ ID NO：12)。
在另一具體實施例中，該結合至凝血蛋白原的適體係由選自SEQ ID NOs：4、6、7、8、9、10或12的核苷酸序列所組成。
在一具體實施例中，本發明之結合至凝血蛋白原的適體不結合至凝血蛋白。
在一具體實施例中，本發明之結合至凝血蛋白原的適體的解離常數(Kd)小於19.5 nM。在另一具體實施例中，本發明之結合至凝血蛋白原的適體的解離常數(Kd)小於12.7 nM。
在一具體實施例中，本發明之結合至凝血蛋白原的適體的GC含量大於50%。在另一具體實施例中，本發明之結合至凝血蛋白原的適體的GC含量在約60%至約70%之間。
本發明亦提供一種檢測凝血疾病的套組，其包含如上述之結合至凝血蛋白原的適體。
本文中所述之「凝血疾病」後指受外傷或是不正常凝血機制產生(如：血栓發生)時，大量凝血蛋白原減少而生成凝血蛋白的有關疾病，在一具體實施例係指血栓栓塞性疾病，包括動脈血栓栓塞性疾病及靜脈血栓栓塞性疾病，例如但不限於心肌梗塞、腦梗塞、周邊動脈血栓形成及深靜脈血栓形成。因此本發明檢測凝血疾病的套組便可用於測凝血蛋白原，以判斷病患是否患有不正常凝血疾病，或是判斷該病患是否為凝血疾病高風險者。
本發明進一步提供一種在樣本中偵測凝血蛋白原的方法，包括：(1)提供如申請專利範圍第1項之結合至凝血蛋白原的適體；(2)將該樣本與該適體混合，以形成一凝血蛋白原-適體複合物；及(3)偵測該凝血蛋白原-適體複合物中的凝血蛋白原或適體。
本文中所述之「樣本」係收集自生物個體，可為血液、血清或血漿。本發明中所提及之個體為動物，包括人類或非人類的動物，如狗、貓、小鼠、大鼠、牛、綿羊、豬、山羊、或非人之靈長類，其中較佳為人類。
在一具體實施例中，該結合至凝血蛋白原的適體經標記物質標記。在另一具體實施例中，該標記物質係選自由同位素(例如：125
I、131
I、35
S、3
H、或32
P)、酵素(例如：鹼性磷酸酵素(alkaline phosphatase)、山葵過氧化酵素(horseradish peroxidase)、冷光素(luciferase)、或β-半乳糖酵素(β-galactosidase))、螢光物質(例如：螢光素(fluorescein)、羅丹明(rhodamine)、藻紅素(phycoerythrin)、綠色螢光蛋白(GFP)或藍色螢光蛋白(BFP))、發光物質(例如：QdotTM
奈米粒子，由Quantum Dot Corporation,Palo Alto,CA所提供)或磁性物質組成之群組。
本發明所提供之結合至凝血蛋白原的適體(aptamer)係利用簡化的SELEX技術篩選得到，具高專一性與親合性。本篩選方法省略溶離(elution)步驟，直接將篩選後之DNA分子經由聚合酶連鎖反應放大，經由單股化過程後投入下一次的篩選。
因此，本發明提供一種適體的最適化篩選方法，包括下列步驟：a.提供一由單股去氧核醣核酸序列組成的適體分子庫；b.提供一目標蛋白；c.將該適體分子庫與目標蛋白混合，形成一混合物以進行雜交；d.洗滌該混合物以去除未與該目標蛋白結合的單股去氧核醣核酸序列；e.以聚合酶鏈鎖反應放大與該目標蛋白結合的單股去氧核醣核酸序列，以得到聚合酶鏈鎖反應產物；及f.將該聚合酶鏈鎖反應產物單股化。
在一具體實施例中，該目標蛋白以維生素H進行標定並與磁珠接合。在另一具體實施例中，步驟d之洗滌係以TBSM緩衝液進行。在尚有另一具體實施例中，重複步驟c至步驟f五至十次以得到具高專一性與親合性的適體。每重複步驟c至步驟f一次稱為一個循環。
篩選過程中，可進一步同時進行對照組實驗，以與卵蛋白接合的磁珠與適體分子庫進行雜交，用以判斷適體分子庫中的序列與蛋白質專一性與
非專一性結合的差別。藉由測試聚合酶鏈鎖反應的圈數並配合核酸膠體電泳，以比較篩選到之專一性與非專一性結合的適體量。
本發明之篩選方法，進一步包含反篩選(counter selection)步驟，該反篩選可安排在任意兩循環之間。在反篩選步驟中，利用與卵蛋白接合(且未與凝血蛋白原接合)之磁珠與前一循環篩選得到的適體進行雜交，留下未與磁珠結合之適體，在經聚合酶鏈鎖反應放大與單股化之後，再度進行上述步驟c至步驟f。
本發明可能以不同的形式來實施，並不僅限於下列文中所提及的實例。下列實施例僅作為本發明不同面向及特點中的代表。
寡核苷酸分子庫中的序列包含一長度為30個核苷酸的中央隨機區域，兩旁分別為16個核苷酸長的特定序列：5’-TCCCTACGGCGCTAAC-N30-GCCACCGTGCTCAAC-3’(SEQ ID NO：1)。利用順向引子5’-TCCCTACGGCGCTAAC-3’(SEQ ID NO：2)及反向引子5’-biotin-GTTGTAGCACGGTGGC-3’(SEQ ID NO：3)藉由聚合酶鏈鎖反應(PCR)得到雙股DNA。所有的寡核苷酸皆由Purigo Biotech,Inc.
(台北，台灣)合成，且其長度經變性PAGE分析確認。
將凝血蛋白原利用膠體層析管柱(CentriSepTM
)，進行緩衝溶液交換，置換為0.1 M碳酸鈉緩衝溶液(50 mM碳酸化鈉、50 mM碳酸氫鈉、15 mM疊氮氫鈉，pH=9.6)，並加入適量NHS-biotin於室溫震盪混合1小時。再以相同方法將緩衝溶液換回TBSM(20 mM Tris、200 mM氯化鈉、5 mM氯化鉀、1 mM氯化鎂，pH=7.5)以利後續實驗工作。完成標定後再利用布拉福(Braford)蛋白質定量方法，以分光光度計測量595 nm波長之吸收度，對該標定維生素H之凝血蛋白原進行定量分析。
將磁珠先以TBSM緩衝液清洗2次，然後將已完成步驟一之凝血蛋白原與磁珠進行接合反應，以震盪混合器於室溫震盪1小時，後以磁座輔助，移除多餘的溶液。隨即加入回溫至95℃之適體分子庫，於室溫震盪混合1小
時，以完成雜交步驟。在此，以未接合凝血蛋白原之磁珠與相同的適體分子庫進行雜交，做為對照組，以利判斷其專一性與非專一性接合的差別。
同樣利用磁座移除多餘的液體後，對磁珠進行額外三次清洗。隨即加入100 μL之TBSM緩衝液混合，以便進行聚合酶連鎖反應，並利用核酸膠體電泳方法對產物進行定性分析。藉由核酸膠體電泳方法得到適合的聚合酶連鎖反應之圈數(cycles)，並以此圈數再次進行聚合酶連鎖反應將所得DNA分子進行數量放大步驟，以利後續的實驗分析。
由於經過聚合酶連鎖反應放大的產物為雙股DNA，所以還需經過DNA單股化的過程，才能進行下一次的篩選過程。利用具維生素H標定之反股引子(reverse primer)，配合磁座、卵蛋白修飾之磁珠與氫氧化鈉溶液，將PCR產物拆解成具有三級結構之單股DNA。隨後將溶液以膠體層析管柱(CentriSepTM
)置換成TBSM緩衝液，即可投入下階段篩選。
持續重複上述步驟，比較每次所得之電泳分析，在第五個循環(round)後以修飾有卵蛋白之磁珠進行反篩選(counter selection)，即不將凝血蛋白原固定於磁珠上而直接進行篩選，篩選過程中留下沒有與磁珠接合之DNA分子，而繼續進行聚合酶連鎖反應的序列放大和DNA分子單股化的步驟，
以繼續接下來的SELEX。希望藉此步驟降低非專一性結合。從第一圖可看出在第六、七個循環中放大專一性結合與非專一性結合所得目標序列的PCR反應圈數之差別有逐漸減少的趨勢。為了增加其篩選DNA之專一性，從第八個循環起，減少目標蛋白質加入的量至30μg。可以發現第九個循環時其專一性鍵結的量大幅超前非專一性鍵結。但第十個循環時非專一性結合又再度領先專一性結合，表示此時即為結束篩選之時。
利用pGEM®-T Easy Vector進行接合作用(ligation)，將從SELEX過程中篩選出來的DNA殖入載體。在4℃的環境下培養過夜後，將其轉形至勝任細胞(HITTM
-Competent Cell)中，接著塗至含抗生素的LB洋菜培養基上，於36℃下培養18小時。由於所使用的載體具有抗抗生素之基因，故沒有殖入載體的細菌不能存活。利用細菌大量無性生殖成菌落，以牙籤輕輕沾抹各菌落，再於裝有100 μL LB培養液的96孔盤中輕輕攪拌，並在36℃下培養18小時後，即可利用聚合酶連鎖反應將所要的DNA片段大量複製。最後再經過純化，即送至中研院公共儀器室做定序。
將經過十個篩選循環後所得之DNA分子庫以基因轉殖的方式大量複製其片段後送去定序與比對。根據其結果可發現在26條序列中有3條重複性序列(B8、F1、C2)及4條保守序列(E2、A1、C5、B2)如表一所列。
重複的序列可能是與目標蛋白質有較高親和力的一群，因其在篩選的過程中不斷地被大量複製，而在做接合作用時被轉殖的機率大增。以線上結構預測軟體(DNA Mfold server)畫出重複性序列及保守序列的二級結構如第二圖。
從文獻中可知，抗凝血蛋白原之DNA適體其GC含量皆較高，比較原始DNA分子庫、26條定序結果、重複性序列(B8、F1、C2)和文獻中篩選出的適體的GC含量如第三A圖至第三B圖所示。可以發現26條定序結果其GC含量比原始DNA分子庫來的高，且序列B8、F1、C2的GC含量更高，甚至高於文獻的適體。由此點可看出篩選到之DNA序列，有相當大的可能性可與凝血蛋白原鍵結。
利用適體與蛋白質結合時其構形改變的原理，搭配螢光染劑的特性測量篩選到之適體對將凝血蛋白原的親合力(affinity)及專一性(specificity)。簡言之，首先將500 nM溶於TBSM緩衝液的螢光染劑(BOBO-3，自Invitrogen購得)與99 μL 150 nM篩選到之適體混合避光震盪反應30分鐘，以形成適體-(BOBO-3)複合物，再將其與1 μL定濃度之待反應蛋白質(人類凝血酶原、人類α-凝血蛋白或牛血清白蛋白(BSA))充分混合，並將混和液移至96孔盤中，以螢光光譜儀進行掃瞄(Gemini EM，購自Molecular Device Inc.)。
由於各組適體辨識目標蛋白質後所造成的結構變化，可能使適體中的雙股結構(base-pairing structure)改變而造成螢光染劑脫附(Zhou et al.,2006)，或是幫助雙股結構的形成而造成螢光染劑吸附(Lai et al.,2007)，為考量這二種情況並修正每次實驗所造成的誤差值，本實驗將其量測到之螢光讀值進行常態化(normalization)處理，如式I。其中△S
為實驗組與控制組(不與蛋白質反應)之螢光訊號讀值差值除上控制組螢光讀值。常態化後之螢光讀值介於0與1間。
利用總體結合試驗模組(total binding assay model)對與凝血蛋白原鍵結的數據進行曲線配適法(curve fitting)，如式II，其中S B
為背景訊號，C P
為蛋白質濃度。可求得各組適體對凝血蛋白原的解離常數，以了解其對凝血蛋白原的親和力。非專一性目標蛋白質的部分(凝血蛋白與牛血清蛋白)則依總體結合試驗(total binding assay)的修正公式(式III)進行分析。非專一性目標物與適體的親和力應成線性，故以線性迴歸方式進行曲線配適。
將具有重複性之序列F1與未重複序列C5分別進行親和力與專一性測試，其結果如第四圖與第五圖。經過比較之後可發現，序列F1對凝血蛋白原的親和力不比序列C5來得大(KD
=19.5 nM>KD
=12.7 nM)，且對凝血蛋白原之專一性(與對凝血蛋白及牛血清蛋白比較而言)也不如序列C5。另外，重複序列C2其反股序列(r-C2)與文獻(Fitter and James,2005)中的序列(SEQ ID NO：13，TAGG-TGGGTAGGGTGGT)有相同的片段序列如表二中方框所示，證明該序列能與凝血蛋白原鍵結的可能性。將序列r-C2亦進行親和力與專一性測試，如第六圖，可發現其與凝血蛋白原之親和力(KD
=9.45 nM)與專一性都相當好。
此外，亦利用適體微陣列測試適體對將凝血蛋白原的專一性(specificity)。將B5、C5、B2、E2及A1等五條保守序列(conserved sequenses)及HT3、HT5、HTNC及F16等對照序列(control sequences)四重複印在玻片上。將20 μL由500 nm Cy3標記凝血酶原、500 nm Cy5標記凝血酶蛋白、1%阻斷劑(由Roche Applied Science購得)及TBSM緩衝液組成的溶液，與該適體微陣列在室溫培養40分鐘。培養結束後，以PB ST緩衝液(10 mM磷酸鹽、137 mM NaCl、3 mM KCl及0.05% Tween 20，pH 7.4)小心地潤洗該適體微陣列。接著以PBST緩衝液在避光環境下洗滌該適體微陣列三次，每次十分鐘，以進一步去除未與陣列結合的蛋白質。在短暫地以二次去離子水潤洗並甩乾之後，以生物晶片雷射螢光掃描儀(GenePix 4000B scanner，購自Molecular Devices Inc.)記錄適體微陣列的螢光訊號。
由第七A圖結果可看出，該些保守序列對凝血酶原具有高度專一性，且不會與凝血蛋白交互作用。分析凝血酶原對凝血蛋白的螢光強度比發現，適體E2的訊號強度甚至是抗凝血酶原適體F16訊號強度的15倍(第
七B圖)。
一個熟知此領域技藝者能很快體會到本發明可很容易達成目標，並獲得所提到之結果及優點，以及那些存在於其中的東西。本發明中之篩選方法乃較佳實施例的代表，其為示範性且不僅侷限於本發明領域。熟知此技藝者將會想到其中可修改之處及其他用途。這些修改都蘊含在本發明的精神中，並在申請專利範圍中界定。
本發明的內容敘述與實施例均揭示詳細，得使任何熟習此技藝者能夠製造及使用本發明，即使其中有各種不同的改變、修飾、及進步之處，仍應視為不脫離本發明之精神及範圍。
說明書中提及之所有專利及出版品，都以和發明有關領域之一般技藝為準。所有專利和出版品都在此被納入相同的參考程度，就如同每一個個別出版品都被具體且個別地指出納入參考。
在此所適當地舉例說明之發明，可能得以在缺乏任何要件，或許多要件、限制條件或並非特定為本文中所揭示的限制情況下實施。所使用的名詞及表達是作為說明書之描述而非限制，同時並無意圖使用這類排除任何等同於所示及說明之特點或其部份之名詞及表達，但需認清的是，在本發明的專利申請範圍內有可能出現各種不同的改變。因此，應了解到雖然已根據較佳實施例及任意的特點來具體揭示本發明，但是熟知此技藝者仍會修改和改變其中所揭示的內容，諸如此類的修改和變化仍在本發明之申請專利範圍內。
第一圖顯示SELEX過程中，非專一性與專一性鍵結的DNA於每個循環電泳結果中所得最早有PCR產物之PCR圈數的差值。
第二圖顯示篩選到重複性較高之適體的二級結構：(第二A圖)B8，dG為-2.67 kcal/mol；(第二B圖)F1，dG為-3.36 kcal/mol；(第二C圖)C2，dG為-1.11 kcal/mol；(第二D圖)E2，dG為-4.77 kcal/mol；(第二E圖)A1，dG為-6.73 kcal/mol；(第二F圖)C5，dG為-13.18 kcal/mol；及(第二G圖)B2，dG為-4.47 kcal/mol。
第三圖顯示GC含量的比較。(第三A圖)原始適體分子庫、26條定序結果、有重複性的序列(B8、F1、C2)及文獻中篩選出的適體(F16)之GC含量比較結果；(第三B圖)原始適體分子庫、26條定序結果、保守序列、B8及E2及文獻中篩選出的適體(F16)之GC含量比較結果。
第四圖顯示重複序列F1以螢光染劑BOBO-3測試親和力與專一性的結果。▲實線為對凝血蛋白原之反應，■為對凝血蛋白之反應，●為對牛血清白蛋白之反應。
第五圖顯示未重複序列C5以螢光染劑BOBO-3測試親和力與專一性的結果。對凝血蛋白之反應的部分，其趨勢與線性不符，反而較接近雙吸附鍵模型(Two Site Binding)，故改以此公式進行曲線配適法。
第六圖顯示重複序列C2之反股序列r-C2以螢光染劑BOBO-3測試親
和力與專一性的結果。▲實線為對凝血蛋白原之反應，■為對凝血蛋白之反應，●為對牛血清白蛋白之反應。
第七圖以適體微陣列確認專一性的結果。B5、C5、B2、E2及A1為保守序列；HT3及HT5為凝血蛋白適體；HTNC為非抗凝血蛋白(non-antithrombin)適體；而F16為先前已發表的抗凝血酶原適體。(第七A圖)適體同時與Cy3標記凝血酶原及Cy5標記凝血蛋白雜交；(第七B圖)凝血酶原對凝血蛋白的螢光強度比。
<110> 國立台灣大學
<120> 抗凝血蛋白原之適體、包含其之檢測套組與方法及其最適化篩選方法
<130> 1686-NTU-TW
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 適體分子庫中的合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(61)
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(46)
<223> n係a,c,g或t
<400> 1
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的順向引子
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<400> 2
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的反向引子
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<400> 3
<210> 4
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 篩選得到的B8適體
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(63)
<400> 4
<210> 5
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 篩選得到的F1適體
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(62)
<400> 5
<210> 6
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 篩選得到的C2適體
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(61)
<400> 6
<210> 7
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 篩選得到的E2適體
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(61)
<400> 7
<210> 8
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 篩選得到的A1適體
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(62)
<400> 8
<210> 9
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 篩選得到的C5適體
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(62)
<400> 9
<210> 10
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 篩選得到的B2適體
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(60)
<400> 10
<210> 11
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 經報導的F16適體
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(84)
<400> 11
<210> 12
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C2適體的互補序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(61)
<400> 12
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 文獻中的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<400> 13
<210> 14
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 篩選得到的凝血蛋白原適體
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(63)
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> n係a,c,g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> n係a,c,g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(34)
<223> n係a,c,g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(41)
<223> n係a,c,g或t
<400> 14
Claims (10)
- 一種結合至凝血蛋白原的適體(aptamer)，包含下列核苷酸序列或其互補序列：5’-TCCCTACGGGCGCTAACMVYNSVWBSRSYSHNWNVBVMYSNVDHYBBGCCACCGTGCTACAAC-3’(SEQ ID NO：14)其中，第1個核苷酸係T或不存在，且第10個核苷酸係G或不存在；N係A、T、C或G；R係G或A；Y係T或C；M係A或C；S係G或C；W係A或T；B係G、C或T；D係A、G或T；H係A、C或T：及V係A、C或G，其中該適體選自由SEQ ID NOs：4、6、7、8、9、10及12組成之群組的核苷酸序列。
- 如申請專利範圍第1項之結合至凝血蛋白原的適體，其不結合至凝血蛋白。
- 如申請專利範圍第1項之結合至凝血蛋白原的適體，其具有小於19.5nM的解離常數(Kd)。
- 如申請專利範圍第1項之結合至凝血蛋白原的適體，其具有小於12.7nM的解離常數(Kd)。
- 如申請專利範圍第1項之結合至凝血蛋白原的適體，其GC含量大於50%。
- 如申請專利範圍第1項之結合至凝血蛋白原的適體，其GC含量在約 60%至約70%之間。
- 一種檢測凝血疾病的套組，其包含如申請專利範圍第1項之結合至凝血蛋白原的適體。
- 一種在樣本中偵測凝血蛋白原的方法，包括：(1)提供如申請專利範圍第1項之結合至凝血蛋白原的適體；(2)將該樣本與該適體混合，以形成一凝血蛋白原-適體複合物；及(3)偵測該凝血蛋白原-適體複合物中的凝血蛋白原或適體。
- 如申請專利範圍第9項之在樣本中偵測凝血蛋白原的方法，其中該結合至凝血蛋白原的適體經標記物質標記。
- 如申請專利範圍第10項之在樣本中偵測凝血蛋白原的方法，其中該標記物質係選自由同位素、酵素、螢光物質、發光物質或磁性物質組成之群組。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW101119796A TWI454575B (zh) | 2012-06-01 | 2012-06-01 | 抗凝血蛋白原之適體、包含其之檢測套組與方法及其最適化篩選方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW101119796A TWI454575B (zh) | 2012-06-01 | 2012-06-01 | 抗凝血蛋白原之適體、包含其之檢測套組與方法及其最適化篩選方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TW201350578A TW201350578A (zh) | 2013-12-16 |
| TWI454575B true TWI454575B (zh) | 2014-10-01 |
Family
ID=50157870
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TW101119796A TWI454575B (zh) | 2012-06-01 | 2012-06-01 | 抗凝血蛋白原之適體、包含其之檢測套組與方法及其最適化篩選方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| TW (1) | TWI454575B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN119351407B (zh) * | 2024-12-30 | 2025-04-11 | 浙江工业大学 | 基于selex技术筛选的凝血酶特异性rna适配体及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TW201200874A (en) * | 2010-06-25 | 2012-01-01 | Univ Nat Cheng Kung | Aptamer and detection method for C-reactive protein |
-
2012
- 2012-06-01 TW TW101119796A patent/TWI454575B/zh not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TW201200874A (en) * | 2010-06-25 | 2012-01-01 | Univ Nat Cheng Kung | Aptamer and detection method for C-reactive protein |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 紀鈞瑋等人, "人工抗體篩選技術初探：以抗凝血蛋白原人工抗體為例", 2007年農機與生機論文發表會論文B10(http://www.bime.ntu.edu.tw/ciam/conf2007/pdf/B10.pdf), 2007/11/21 Fitter S et al., "Deconvolution of a Complex Target Using DNA Aptamers", The Journal of Biological Chemistry, vol.280, no.40, p.34193-34201, 2005/10/07 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TW201350578A (zh) | 2013-12-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8143004B2 (en) | Method of assaying target substance in sample, aptamer molecule method of constructing the same | |
| US8785132B2 (en) | Aptamer sandwich assays | |
| JP2003524419A (ja) | 近接プロービング方法およびキット | |
| CN101144814A (zh) | 应用适配子型试剂检测、鉴定和/或定量化合物的方法 | |
| JP2021535409A (ja) | 核酸に基づく検出方法 | |
| Wang et al. | An ultrasensitive fluorescence aptasensor for SARS-CoV-2 antigen based on hyperbranched rolling circle amplification | |
| WO2025087194A1 (zh) | 一种检测方法和试剂盒 | |
| Zeng et al. | Highly sensitive and specific graphene oxide-based FRET aptasensor for quantitative detection of human soluble growth stimulating gene protein 2 | |
| US20240229045A1 (en) | Aptamer for specifically recognizing soluble st2 protein and application of the same | |
| WO2022095141A1 (zh) | 一种gpc1 dna适配体及其应用 | |
| EP2046998A2 (en) | Molecular biosensors for detecting macromolecules and other analytes | |
| Jiang et al. | Semi-automated and efficient parallel SELEX of aptamers for multiple targets | |
| CA3029178C (en) | Double-stranded nucleic acid signal probe and method for detecting target molecule using same | |
| CN117467747A (zh) | 一种生物标志物检测方法 | |
| CN117343987A (zh) | 一种检测方法及试剂盒 | |
| TWI454575B (zh) | 抗凝血蛋白原之適體、包含其之檢測套組與方法及其最適化篩選方法 | |
| JP2010524459A (ja) | 未知の生体分子と一本鎖核酸の結合プロファイルを生成するための核酸チップ、核酸チップの製造方法、及び核酸チップを利用した未知の生体分子分析方法 | |
| KR100930974B1 (ko) | 레티놀 결합 단백질(ｒｂｐ4)에 특이적으로 결합하는ｄｎａ 앱타머 및 그 제조방법 | |
| KR100923048B1 (ko) | 미지의 생체분자와 단일가닥핵산의 결합 프로파일을생성하기 위한 핵산칩, 핵산칩의 제조방법, 및 핵산칩을이용한 미지의 생체분자 분석방법 | |
| CN116286834A (zh) | 一种特异性识别sST2蛋白的核酸适配体及其应用 | |
| US20230416816A1 (en) | Methods and devices for mulitplexed proteomic and genetic analysis and on-device preparation of cdna | |
| CN110819632B (zh) | 用于结合曲妥珠抗体的核酸适体 | |
| CN1521272B (zh) | 新型配体检测方法 | |
| Nagar et al. | Bead-Based SELEX for Aptamers Selection and Their Application in Detection of Diverse Antigens | |
| Zhang et al. | An off/on thrombin activated energy driven molecular machine for sensitive detection of human thrombin via non-enzymatic catalyst recycling amplification |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees |