TWI441651B - ｅＩＦ-５Ａ於殺多發性骨髓瘤細胞之用途 - Google Patents
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Description
本發明係關於細胞凋亡特異性真核起始因子("eIF－5A")及編碼該真核起始因子之聚核苷酸於殺多發性骨髓瘤細胞以及其他癌細胞之用途。本發明係關於細胞凋亡特異性eIF－5A或稱為"細胞凋亡特異性eIF－5A"或"eIF－5A1"之用途，以及eIF－5A2同功異型物於抑制多發性骨髓瘤、殺多發性骨髓瘤細胞及抑制及/或殺其他癌細胞生長之用途。
細胞凋亡係遺傳性漸進式細胞事件，其特徵在於良好界定之形態特徵，諸如細胞皺縮、染色質縮合、核碎裂及膜起泡。Kerr等人(1972)Br.J.Cancer,
26,239－257；Wyllie等人(1980)Int.Rev.Cytol,
68,251－306。細胞凋亡在正常組織發育及恆定性中起重要作用，且認為細胞凋亡程式中之缺陷在於導致自神經退化性病症及自體免疫性病症至贅瘤之廣泛範圍之人類病症。Thompson(1995)Science,
267,1456－1462；Mullauer等人(2001)Mutat.Res,
488,211－231。儘管細胞凋亡細胞之形態特徵經良好表徵，但僅已開始闡明調節此過程之分子路徑。
另一種涉及細胞凋亡之關鍵蛋白為由腫瘤抑制基因p53編碼之蛋白。此蛋白為據推測經由上調來調節細胞生長且誘發受損且遺傳上不穩定之細胞中之細胞凋亡的轉錄因子，該上調為Bax.Bold等人(1997)Surgical Oncology,
6,133－142；Ronen等人，1996；Schuler & Green(2001)Biochem.Soc.Trans.,
29,684－688；Ryan等人(2001)Curr.Opin.Cell Biol,
13,332－337；Zrnig等人(2001)Biochem.Biophys.Ada,
1551,F1－F37之上調。
咸信細胞凋亡路徑之改變在許多疾病過程(包括癌症)中起重要作用。Wyllie等人(1980)Int.Rev.Cytoi,
68,251－306；Thompson(1995)Science,
267,1456－1462；Sen & D'lncalci(1992)FEBS Letters,
307,122－127；McDonnell等人(1995)Seminars in Cancer and Biology,
6,53－60。對於癌症發育及進程之研究傳統上關注細胞增殖。然而，近來細胞凋亡在腫瘤形成中之重要作用已變得顯而易見。事實上，由於在腫瘤細胞中總是以某種方式改變對細胞凋亡之控制，因此目前關於細胞凋亡所知之大部分已使用腫瘤模型而獲知。Bold等人(1997)Surgical Oncology,
6,133－142。
細胞激素亦已包含於細胞凋亡路徑中。生物系統需要細胞相互作用以用於其調節，且細胞之間之交叉作用(cross－talk)一般涉及多種細胞激素。細胞激素為由多種不同細胞類型由於各種刺激而產生之介體。細胞激素為可對多種不同細胞類型產生多種不同作用之多效性分子，但在調節免疫反應及造血細胞增殖及分化中尤其重要。視特定細胞激素、相對濃度及其他介體之存在而定，細胞激素對靶細胞之作用可促進細胞存活、增殖、活化、分化或細胞凋亡。
已知去氧亥普酸合成酶(Deoxyhypusine synthase,DHS)及含亥普酸之真核轉譯起始因子－5A(eIF－5A)在許多細胞過程(包括細胞生長及分化)中起重要作用。亥普酸係一種獨特的胺基酸，發現於所有受檢真核細胞及古細菌中，但在真細菌中未發現，且eIF－5A為唯一已知之含亥普酸蛋白。Park(1988)J.Biol.Chem.,
263,7447－7449；Schmann & Klink(1989)；System.Appl.Microbiol.,
11,103－107；Bartig等人(1990)System.Appl.Microbiol.,
13,112－116；Gordon等人(1987a)J.Biol.Chem.,
262,16585－16589。以兩個轉譯後步驟形成活性eIF－5A：第一步驟為藉由以去氧亥普酸合成酶催化將亞精胺之4－胺基丁基部分轉移至前驅體eIF－5A之特異性離胺酸之α－胺基而形成去氧亥普酸殘基；第二步驟涉及由去氧亥普酸羥化酶羥化此4－胺基丁基部分以形成亥普酸。
eIF－5A之胺基酸序列在物種之間極保守且eIF－5A中亥普酸殘基周圍存在胺基酸序列之嚴格保守性，說明此修飾對於存活而言為重要的。Park等人(1993)Biofactors,
4,95－104。此假設進一步由以下觀察結果證明：至今在酵母中發現之eIF－5A之兩種同功異型物之鈍化或以其活化形式催化第一步驟之DHS基因之鈍化阻礙細胞分裂。Schnier等人(1991)Mol.Cell.Biol,
11,3105－3114；Sasaki等人(1996)FEBS Lett.,
384,151－154；Park等人(1998)J.Biol.Chem.,
273,1677－1683。然而，在酵母中缺失eIF－5A蛋白僅導致總蛋白合成之小幅減少，說明mRNA特定子集之轉譯可能需要eIF－5A，而蛋白之總合成並不需要eIF－5A。Tuite,M.(編),Protein Synthesis and Targeting in Yeast,NATO Series H.中之Kang等人(1993)之"Effect of initiation factor eIF－5A depletion on cell proliferation and protein synthesis"。近來發現與eIF－5A結合之配位子共享高度保守之基元亦證明eIF－5A之重要性。Xu & Chen(2001)J.Biol.Chem.,
276,2555－2561。另外，發現經修飾eIF－5A之亥普酸殘基對於與RNA之序列特異性結合尤為必要，且結合並不自核糖核酸酶提供蛋白。
另外，eIF－5A之細胞內缺失導致特異性mRNA在核中之大量積聚，指示eIF－5A可為使特定類別mRNA自核向細胞質穿梭之原因。Liu & Tartakoff(1997),Molecular Biology of the Cell之增刊，8,426a。第37版American Society for Cell Biology Annual Meeting摘要第2476號。eIF－5A在核孔相關核內長絲處之積聚及其與通用核輸出受體之相互作用進一步說明eIF－5A為核質穿梭蛋白而並非多核糖體之組份。Rosorius等人(1999)J.Cell Science,
112,2369－2380。
eIF－5A之第一cDNA係由Smit－McBride等人在1989年自人類選殖，且自此eIF－5A之cDNA或基因已自各種真核細胞選殖，該等真核細胞包括酵母、大鼠、雞胚胎、苜蓿及番茄。Smit－McBride等人(1989)J.Biol.Chem.,
264,1578－1583；Schnier等人(1991)(酵母)；Sano,A.(1995)在Imahori,M.等人(編)之Polyamines中之Basic and Clinical Aspects,VNU Science Press,The Netherlands,81－88(大鼠)；Rinaudo & Park(1992)FASEBJ.,
6,A453(雞胚胎)；Pay等人(1991)Plant Mol.Biol,
17,927－929(苜蓿)；Wang等人(2001)J.Biol.Chem.,216,
17541－17549(番茄)。
多發性骨髓瘤為進行性且致命之疾病，其特徵在於惡性漿細胞在骨髓中擴增及存在溶骨病變。多發性骨髓瘤為不可治癒但可治療之漿細胞癌症。漿細胞為產生有助於抵抗感染及疾病之免疫球蛋白(抗體)之免疫系統的重要部分。多發性骨髓瘤之特徵在於骨髓中之過量異常漿細胞及產生過量完整單株免疫球蛋白(IgG、IgA、IgD或IgE；"M－蛋白")或本斯－瓊斯(Bence－Jones)蛋白(游離單株輕鏈)。低血鈣、貧血、腎損傷、對細菌感染之易感性增加及正常免疫球蛋白之異常產生為多發性骨髓瘤之常見臨床表現。多發性骨髓瘤之特徵亦通常在於在骨盆、脊柱、肋骨及頭骨中常見之彌漫性骨質疏鬆症。
多發性骨髓瘤之習知療法包括化學療法、幹細胞移植、伴隨幹細胞移植之高劑量化學療法及補救療法。化學療法包括使用Thalomid(沙立度胺(thalidomide))、硼替佐米(bortezomib)、Aredia(帕米膦酸鹽(pamidronate))、甾類及Zometa(唑來膦酸(zoledronic acid))進行治療。然而，許多化學療法藥物對於活性分裂之非癌細胞(諸如骨髓、胃及腸內壁及毛囊之細胞)具有毒性。因此，化學療法可導致血細胞數量減少、噁心、嘔吐、腹瀉及脫髮。
習知化學療法或標準劑量化學療法通常為對患有多發性骨髓瘤之患者之主要或初始治療。患者亦可接受為高劑量化學療法及幹細胞移植準備之化學療法。感應療法(幹細胞移植之前之習知化學療法)可用於減少移植之前的腫瘤負荷。某些化學療法藥物因其對骨髓細胞具有較低毒性且導致自骨髓產生更多幹細胞而比其他藥物更適用於感應療法。適用於感應療法之化學療法藥物之實例包括地塞米松(dexamethasone)、沙立度胺/地塞米松、VAD(組合之長春新鹼(vincristine)、Adriamycin(多柔比星(doxorubicin))及地塞米松)及DVd(組合之聚乙二醇化脂質多柔比星(Doxil、Caelyx)、長春新鹼及減少時程之地塞米松)。
多發性骨髓瘤之標準治療為與強的松(prednisone)(皮質類固醇藥物)組合之美法侖(melphalan)，達到50%之效應率。不幸的是，美法侖為烷基化劑且較不適用於感應療法。皮質類固醇(尤其為地塞米松)有時單獨用於多發性骨髓瘤療法，尤其對老年患者及不可耐受化學療法之患者。地塞米松亦單獨或與其他藥劑組合用於感應療法中。雖然VAD為最常用之感應療法，但近來已展示DVd有效於感應療法。雖然近來已准許硼替佐米用於治療多發性骨髓瘤，但其具有極大毒性。然而，無一現存療法提供治癒之顯著潛能。因此，仍需要用於殺多發性骨髓瘤細胞之合適療法。本發明滿足此需要。
本發明提供一種抑制癌細胞生長及/或殺癌細胞之方法。本發明亦提供一種抑制或減慢癌細胞轉移能力之方法。抑制癌生長包括減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長且亦可涵蓋腫瘤之完全緩解。癌症可為任何癌症或腫瘤，其包括(但不限於)結腸癌、結腸直腸腺癌、膀胱癌、宮頸腺癌及肺癌。本發明之方法包含向患有該癌症之患者(哺乳動物，較佳為人類)投與eIF－5A、較佳為人類eIF－5A。儘管eIF－5A1較佳，但亦可使用eIF－5A2同功異型物。可藉由此項技術中已知之任何合適方法將eIF－5A傳遞至有此需要之受檢者。其可作為裸DNA(諸如生物合適介質中之DNA)傳遞，且經由IV或皮下注射或任何其他生物合適傳遞機制來傳遞。或者，可以諸如腺病毒載體之載體傳遞eIF－5A。或者，可以脂質體或用於將DNA傳遞至靶癌細胞之任何其他合適"載劑"來傳遞DNA。eIF－5A亦可直接傳遞至腫瘤位點。熟習此項技術者將可確定傳遞eIF－5A之劑量及治療方案之時長。
eIF－5A1及eIF－5A2為已知的且已於早期同在申請中之申請案中描述，諸如09/909,796(美國第6,867,237號)、10/141,647(已批准)、10/200,148、10/277,969、10/383,614、10/792,893、11/287,460、10/861,980、11/134,445、11/184,982、11/293,391、60/749,604及60/795,168，其均以引用的方式併入本文中。由於eIF－5A在物種之間為高度保守的，因此任何eIF－5A(來自人類、大鼠、小鼠、狗等)可用於本發明。人類eIF－5A較佳用於治療人類，等等。只要突變體eIF－5A可上調或增加eIF－5A之表現且因此抑制癌生長或殺癌細胞，eIF－5A則亦包括該突變體。
本發明亦提供一種藉由向細胞提供編碼eIF－5A1之核苷酸來活化該細胞中之MAPK/SAPK信號傳輸路徑的方法。eIF－5A1聚核苷酸及eIF－5A1蛋白如上所述。
本發明亦提供可用於殺骨髓瘤細胞之醫藥組合物，其包含編碼eIF5A之聚核苷酸。eIF5A可為eIF－5A1、eIF5A2或突變體eIF－5A1。較佳eIF5A為eIF－5A1。組合物可進一步包含傳遞媒劑。傳遞媒劑可為(但不限於)載體、質體、脂質體或樹狀體。
本發明亦提供eIF5A(較佳eIF－5A1)於製造用於殺患有多發性骨髓瘤之受檢者中之多發性骨髓瘤細胞之藥劑的用途。
本發明進一步提供一種殺多發性骨髓瘤細胞之方法，其包含向骨髓瘤細胞投與包含編碼eIF－5A1之聚核苷酸的組合物，其中該組合物殺多發性骨髓瘤細胞。eIF－5A1可為突變體，其中該突變體已使得保守離胺酸改變為另一胺基酸且其中該突變體不能亥普酸化(hypusinated)。適用於治療方法中之組合物如本文所述。
本發明進一步提供一種殺多發性骨髓瘤細胞之方法，其中除包含編碼eIF－5A1之聚核苷酸的組合物之外，亦提供包含導向eIF－5A1之siRNA之組合物。siRNA下調eIF－5A1之內源性表現，且因此下調IL－6之表現，此下調又導致骨髓瘤細胞中之細胞凋亡。包含eIF－5A1 siRNA之組合物可經靜脈投與或在傳遞媒劑(諸如質體、載體、脂質體或樹狀體)中投與。
已假設真核轉譯起始因子5A1(eIF5A1)充當核質穿梭蛋白，該蛋白涉及促進涉及細胞增殖之mRNA子集之轉譯。然而，亦已將eIF5A1確定為細胞凋亡之調節因子(Taylor等人，Invest Ophthalmol Vis Sci.
；45(10)：3568－76(2004))及可調節p53表現之促細胞凋亡蛋白(Li等人(2004)J Biol Chem.
；279：49251－49258；及此文獻之圖23)。腫瘤抑制蛋白p53在調節因壓力及DNA損傷引起之細胞週期停滯及細胞凋亡中起中心作用。儘管eIF5A1之過度表現可上調p53在癌細胞株中之表現(Li等人(2004)J Biol Chem.
；279：49251－49258；及此文獻之圖23)，但eIF5A1之過度表現亦可誘發缺乏p53之細胞株中之細胞凋亡(Taylor等人(2006)Journal of Molecular and Cellular Biology,2006年2月9日(決定申請中))，此指示eIF5A1之過度表現藉由多種機制誘發細胞凋亡。
eIF5A1之表現與細胞凋亡相關。以拓撲異構酶抑制劑放射菌素D處理之正常結腸纖維母細胞之西方墨點法(圖1A)表明在放射菌素D處理開始後24小時，eIF5A1蛋白表現與p53平行上調。由於暴露於氧化氮(NO)供體(SNP)而經受細胞凋亡之RKO細胞亦上調eIF5A1蛋白表現(圖1B)。在該等條件下，eIF5A1之RNA轉錄量不增加，其指出eIF5A1蛋白係由於mRNA之轉錄後調節而積聚(圖1A及圖1B)。該等結果指出eIF5A1可涉及由基因毒性壓力或氧化氮而導致之細胞凋亡。
部分由於對DHS及DHH抑制劑可誘發細胞週期停滯及細胞凋亡之報導及必須需要經亥普酸化之eIF5A1以維持細胞生長之結論，因此已長期建議細胞增殖中需要eIF5A1。然而，已確定經由使用siRNA對eIF5A1表現之特異性抑制對細胞生長無影響。HT－29細胞中對eIF5A1表現>90%之抑制經5天時間對細胞增殖無影響(圖2A－E)。然而，DHS抑制劑GC7對該等細胞之生長具有深遠影響(圖2C)。該等結果表明細胞生長可無需eIF5A1。亦令人關注的是，eIF5A1之抑制可部分保護HT－29細胞免受放射菌素D誘發之細胞毒性(圖2B)，其進一步證明eIF5A1涉及由基因毒性壓力導致之細胞凋亡。
eIF5A1 siRNA保護細胞免受細胞凋亡之能力促進檢驗eIF5A1蛋白抑制對p53表現之影響。RKO細胞具有僅在壓力條件下積聚之官能性p53蛋白。在放射菌素D處理後24小時，由siRNA所造成之eIF5A1抑制可抑制69%之p53蛋白之積聚(圖3A及圖3B)，其指出在基因毒性壓力期間適當表現p53需要eIF5A1。對抗eIF5A1之具有不同序列之第二siRNA亦可防止因放射菌素D引起之p53的上調(圖8B)，其指出此影響並非siRNA之非特異性影響。然而，eIF5A1可誘發RKO細胞(具有官能性p53)與RKO－E6細胞(不具有官能性p53；圖8A)中之細胞凋亡(圖4A及圖4B)，其指出eIF5A1亦可藉由與p53無關之機制誘發細胞凋亡。
構造表現eIF5A1或含有亥普酸修飾所需之保守離胺酸(K)(位置50)中之點突變之eIF5A1{eIF5A1(K50A)}的腺病毒構造。點突變導致離胺酸變為丙胺酸(A)。以任一構造感染HT－29細胞均誘發該等細胞中之細胞凋亡(圖5C及5D及圖6)且大幅降低細胞生存力(圖5E)。使用二維凝膠電泳法測定何種形式之eIF5A1由於感染Ad－eIF5A1或Ad－eIF5A1(K50A)而積聚(圖5B)。如所預期，未經修飾之eIF5A1在Ad－eIF5A1(K50A)感染後積聚。感染Ad－eIF5A1導致未經修飾及經去氧亥普酸修飾之eIF5A1之積聚顯著增加，其指示DHS及DHH活性不足以亥普酸化由病毒產生之大多數eIF5A1蛋白(圖5B)。該等結果有力地表明未經修飾之eIF5A1及可能經去氧亥普酸修飾之eIF5A1為導致細胞之細胞凋亡的形式。經亥普酸化之eIF5A1是否具有此能力尚不明確。
儘管已建議eIF5A1之核質穿梭功能，然而已報導主要在細胞質中表現eIF5A1(Shi等人，Exp Cell Res.
,225：348－356(1996b))。預期核質穿梭蛋白亦具有核定位。由於發現eIF5A1在細胞凋亡期間之功能，因此研究eIF5A1定位在細胞凋亡期間之改變。由兩種不同機制誘發HT－29細胞中之細胞凋亡，其為經由以IFN－γ及TNF－α處理之死亡受體活化及經由以放射菌素D處理之基因毒性壓力。間接免疫螢光法揭示eIF5A1定位在未經處理之生長細胞中為細胞質的(圖7)。然而，以細胞凋亡刺激劑處理極快刺激eIF5A1自主要細胞質定位向主要核定位移動(圖7A及圖7B)。eIF5A1定位之此移動極快發生，對於經IFNγ/TNF－α處理之細胞而言在10分鐘之內(圖7A)且對於經放射菌素D處理之細胞而言在90分鐘之內(圖7B)。該等結果指示在由死亡受體活化與基因毒性壓力誘發之細胞凋亡期間，eIF5A1具有核功能。
為澄清涉及細胞凋亡之eIF5A1為未經修飾之形式、經去氧亥普酸修飾之形式或經亥普酸修飾之形式，則由2D凝膠電泳法檢驗在細胞凋亡期間eIF5A1積聚之形式。藉由以放射菌素D(基因毒性壓力)刺激或以對抗Fas之促效抗體培育(死亡受體路徑)誘發HT－29細胞經受細胞凋亡。在1小時至24小時範圍內之各種時間點之後收集細胞溶解物，且接著由2D凝膠電泳法及使用eIF5A抗體之西方墨點法進行分析(圖9)。在未經處理之細胞中，與文獻中所報導相一致，eIF5A1蛋白主要為經亥普酸化之形式。兩種細胞凋亡誘發劑均刺激經去氧亥普酸化形式之eIF5A1之存在量增加，其在處理後1小時開始但在處理後24小時消失。在處理後2小時亦觀察到未經修飾eIF5A1之積聚。該等結果與涉及調節細胞凋亡之經去氧亥普酸化及/或未經修飾之eIF5A1一致。
以各種癌細胞株檢驗eIF5A1、eIF5A1(K50A)(突變體eIF5A1)及eIF5A2誘發細胞凋亡及抑制增殖之能力。eIF5A1與eIF5A1(K50A)均可誘發結腸癌細胞株HT－29(圖5、6及10)及膀胱癌細胞株HTB－9(圖11)及HTB－4(圖12)中之細胞凋亡。另外，感染表現eIF5A2之腺病毒可誘發膀胱癌細胞株HTB－9(圖11)及HTB－4(圖12)中之細胞凋亡。Ad－eIF5A1、Ad－eIF5A1(K50A)及Ad－eIF5A2均可抑制膀胱癌細胞株HTB－4(圖13)、HTB－9(圖14)、J82 HTB－1(圖15)及UMUC－3(圖16)之生長。該等病毒構造亦可抑制海拉宮頸腺癌細胞之生長(圖17)。由Ad－eIF5A1、Ad－eIF5A1(K50A)及Ad－eIF5A2感染引起之PARP分裂亦觀察到HTB－4細胞中之細胞凋亡(圖18)。通常涉及DNA修復、DNA穩定性及其他細胞事件之PARP在早期細胞凋亡期間由卡斯蛋白酶家族之成員分裂。對PARP之卡斯蛋白酶分裂之偵測已展示為細胞凋亡之標誌。Lazebnik Y等人，Nature 371,346－347(1994)。該等結果指示事實上eIF5A1及eIF5A2在細胞凋亡期間可具有冗餘功能。另外，eIF5A1之突變體形式可使各種細胞株停止生長且誘發細胞凋亡。野生型eIF5A1(及eIF5A2)誘發細胞凋亡之能力可與在將Ad－eIF5A1引入細胞中時由於DHS及DHH之有限活性而發生之經去氧亥普酸化及未經修飾eIF5A1之積聚有關(圖5B)。新近報導已展示為使外源性eIF5A1在細胞中以經亥普酸化之形式過度表現，DHS與DHH二者須在相同細胞中過度表現(Park等人2006,PNAS；
103(1)：51－56)。該等結果表明DHS及DHH抑制劑抑制細胞生長之能力可並非由於細胞增殖所需之經亥普酸化eIF5A1之減少，而可係由於未經修飾(DHS抑制劑)或經去氧亥普酸修飾(DHH抑制劑)之eIF5A1的積聚，該積聚又引發細胞中之細胞週期停滯及/或細胞凋亡。亦令人關注的是，注意到已發現DHS在某些細胞株中過度表現(Clement等人2006,FEBS J；
273(6)：1102－14)且已確定DHS為癌轉移中擴增基因之特徵組之一(Ramaswamy等人2003,Nat Genet；
33,49－54)。此資訊之一種可能解釋為某些癌細胞過度表現DHS以防止由未經修飾或經去氧亥普酸化之eIF5A1之積聚引發的細胞凋亡(其似乎在引發細胞經受細胞凋亡時積聚，參見圖9)。藉由過度表現DHS，癌細胞可藉由將eIF5A1保持在經亥普酸化且因此"安全"之形式來減少由基因毒性壓力及其他壓力子導致之細胞凋亡。
為闡明何種信號傳輸路徑受eIF5A1過度表現之影響，檢驗由A549肺癌細胞中之Ad－eIF5A1或Ad－eIF5A1(K50A)感染而引起之促細胞分裂活化蛋白激酶(MAPK)/應激活化蛋白激酶(SAPK)[MAPK/SAPK]路徑的活化。三個主要之MAPK路徑為ERK MAPK路徑、p38 MAPK路徑及JNK SAPK路徑。ERK MAPK路徑主要因細胞分裂刺激(諸如生長激素，如表皮生長因子(EGF))而引發且證明多種腫瘤之生長及存活。p38 MAPK路徑因細胞壓力、UV光、生長因子取消及前發炎性細胞激素而活化。經由磷酸化活化p38導致轉錄因子(諸如p53)之磷酸化，其又可導致p53之活性或穩定性增加。活化p38涉及促細胞凋亡與抗細胞凋亡路徑以及炎症。JNK/SAPK路徑調節對細胞壓力(包括UV光、DNA損傷及前發炎性細胞激素)之回應且導致轉錄因子(諸如c－jun)之磷酸化及活性增加。活化JNK路徑可導致許多細胞回應，包括生長、轉型及細胞凋亡。JNK路徑似乎為A549細胞中用於EGF誘發生長之預致敏效應路徑(Bost等人1997,JBC；
272：33422－33429)。以Ad－eIF5A1感染A549細胞誘發所有三種該等路徑之活化。在以EGF刺激之A549細胞中以漸增量之Ad－eIF5A1感染30分鐘，導致ERK及其下游靶p90RSK之漸增磷酸化/活化，而未經磷酸化之ERK之量保持不變(圖20)。亦觀察到由以劑量相關方式之Ad－eIF5A1感染引起之磷酸化/活化p38及磷酸化/活化JNK之強烈上調(圖20)。Ad－eIF5A1感染之時間過程揭示ERK、p38及JNK路徑之活化在感染之後維持24至72小時(圖21)。發現該等路徑之活化因未經亥普酸化之突變體eIF5A1、Ad－eIF5A1(K50A)的感染而劑量相關性增加(圖22)。令人關注的是，注意到使用MEK1抑制劑U1026抑制ERK之活化亦抑制JNK之活化(圖22)，其證實在該等細胞中，JNK因ERK之活化而活化(Bost等人1997,JBC；272：33422－33429)。相反，MEK1抑制劑一貫導致由Ad－eIF5A1或Ad－eIF5A1(K50A)感染引起p38之活化增加，其指示ERK路徑之活化因eIF5A1活化而負性調節p38路徑(圖22)。
圖38提供eIF5A1對A549肺癌細胞中MAPK/SAPK路徑及細胞凋亡之影響的假設模型。eIF5A1(野生型或不可經亥普酸化之突變體)(K50A)之過度表現誘發A549細胞中之細胞凋亡。eIF5A1之過度表現亦伴隨MAPK/SAPK路徑(包括p38、JNK及ERK)之增加。eIF5A1之過度表現誘發p53蛋白含量之增加，包括與p53之穩定性及活性增加相關聯之磷酸化形式p53的增加。p53之此增加取決於MEK/ERK路徑之活性及p53轉錄活性。然而，對MEK/ERK路徑之抑制及對JNK路徑較小程度上之抑制導致由eIF5A1誘發之細胞凋亡增強。該等結果指示eIF5A1可具有作為治療劑之用途以誘發癌細胞之細胞凋亡以及提高MEK抑制劑類抗癌藥物之殺癌細胞能力。
Ad－eIF5A1及Ad－eIF5A1(K50A)對p53之表現及磷酸化之影響可參見圖23。野生型與突變體eIF5A1之過度表現導致p53蛋白之總表現以劑量相關方式增加(圖23)。對兩種形式之eIF5A1，亦觀察到絲胺酸15上之p53磷酸化增加(圖23)。對於Ad－eIF5A1(K50A)，觀察到絲胺酸46上之p53磷酸化以劑量相關方式增加。p53可在絲胺酸15上由若干種激酶(包括ATM、ATR及p38)磷酸化，且此修飾降低MDM2結合p53且靶向其以供泛素化之能力，且藉此促進p53之積聚及官能活性。p53在絲胺酸46上由各種激酶(包括PKCδ及p38)磷酸化，且此修飾增加p53對促細胞凋亡促進劑之親和力且咸信對於p53誘發之細胞凋亡尤為重要。
腫瘤之侵襲及轉移為一複雜過程，其要求腫瘤細胞調整自身能力以黏附、使周圍細胞外基質降解，移位且在第二位點增殖且最終促進血管新生以維持延長生長。基底膜為細胞外基質(ECM)之鄰近薄片，其圍繞每一器官且充當大分子及細胞之障壁。可藉由以8 μm具有再生ECM之膜(MatrigelTM
)塗覆transwell且將回應於趨化性刺激可穿透此層且到達膜之另一側之細胞染色來量測腫瘤細胞之侵襲性。A549肺癌細胞具有高度侵襲性且可分泌蛋白，諸如基質金屬蛋白酶，其為可消化ECM組份之明膠酶。檢驗eIF5A1過度表現對A549細胞侵襲性之影響－Ad－eIF5A1或Ad－eIF5A1(K50A)之感染顯著減少經由MatrigelTM
塗覆transwell侵襲之細胞的數目(圖24)。
迄今為止呈現之結果表明以eIF5A1治療腫瘤之可能性可具有治療效益。因此使用小鼠中之實驗性轉移模型。在實驗II中，藉由以高度侵襲性之小鼠黑素瘤細胞株B16F10注射小鼠來開始實驗性轉移(第0天)。在第2、4、7、11、16、21、26及31天將編碼LacZ基因(作為DNA對照)或eIF5A1之質體DNA注射入尾部靜脈中。使用3種不同之DNA濃度：1×(3.3 mg/kg)、0.1×(0.3 mg/kg)及2×(6.6 mg/kg)。當小鼠瀕臨死亡時，殺死小鼠且移除肺並攝影(圖25)。當以編碼eIF5A1之質體DNA處理小鼠時觀察到腫瘤負荷之劑量相關性減少(圖25及圖26)。儘管2×劑量似乎比1×劑量效果較差，但觀察到在0.1×劑量與1×劑量之間腫瘤負荷顯著減少。腫瘤生長成肉眼可見之能力取決於新血管之形成(血管新生)。血管內皮生長因子(VEGF)為由許多腫瘤細胞分泌之細胞激素且為促進腫瘤血管新生之關鍵因素。藉由ELISA對來自實驗II中所分離之具有B16F10之肺的細胞溶解物進行VEGF表現之分析(圖27)。接受eIF5A質體DNA之小鼠中的VEGF含量顯著地劑量相關性減少，其指示eIF5A1可調節VEGF。
在實驗III中，再次使用使用尾部靜脈注射B16F10細胞之實驗性轉移模型，但此次使質體DNA與DOTAP複合以增加DNA於血清中之半衰期且增加肺腫瘤中對質體之吸收。在第7、14及21天注射DNA/DOTAP複合物。當小鼠瀕臨死亡時，殺死小鼠且移除肺並攝影(圖28)。當與接受LacZ質體DNA/DOTAJP複合物之小鼠相比時，以eIF5A1質體DNA/DOTAP複合物處理之小鼠的肺重量平均減少60%(圖29)。
為確定eIF5A1處理是否誘發黑素瘤腫瘤之細胞凋亡，對具有B16F0或B16F10皮下腫瘤之小鼠腫瘤內注射以Ad－eIF5A1(實驗IV)。48小時後，切除腫瘤，埋入石蠟中並切片。切片組織之TUNEL染色揭示Ad－eIF5A1誘發腫瘤細胞之細胞凋亡(圖30)。實驗V經設計以測定經腫瘤內注射之Ad－eIF5A1誘發細胞凋亡之能力是否將導致皮下B16F10腫瘤之腫瘤生長降低且增加存活率。將B16F10細胞經皮下注射入C57BL/6小鼠之側腹。當腫瘤已達到約8 mm之直徑時，對其經腫瘤內注射以Ad－LacZ、Ad－eIF5A1或緩衝液。每日重複注射總共持續3天，且隨後每隔一天注射直至腫瘤直徑超過15或16 mm，此時殺死小鼠。每日使用測徑規量測腫瘤尺寸且用於估計腫瘤體積。當以Ad－eIF5A1處理小鼠時，清楚地觀察到腫瘤生長延遲(圖31)。在處理開始後，僅接受緩衝液注射之小鼠最多生存4至6天，而在開始處理後接受Ad－LacZ注射之小鼠僅存活4天(圖32)。接受Ad－eIF5A1注射之小鼠在處理後至少生存8天且在處理後生存多達25天，其表明使用Ad－eIF5A1處理可導致具有腫瘤之小鼠的存活率顯著改良(圖32)。
因此，本發明提供一種抑制癌生長之方法。本發明亦提供一種抑制或減慢癌細胞轉移能力之方法。抑制癌生長包括減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長且亦可涵蓋腫瘤之完全緩解。抑制癌生長亦意謂殺癌細胞。癌症可為任何癌症或腫瘤，其包括(但不限於)結腸癌、結腸直腸腺癌、膀胱癌、宮頸腺癌及肺癌。
本發明之方法涉及對患有該癌症之患者(哺乳動物，較佳為人類)投與編碼eIF－5A之聚核苷酸、較佳編碼人類eIF－5A1之聚核苷酸，較佳為eIF－5A1寄存編號NM 001970(參見圖44)。儘管eIF－5A1較佳，但亦可使用eIF－5A2同功異型物(亦即寄存編號NM 020390)。可藉由此項技術中已知之任何合適方法來傳遞eIF－5A。其可作為裸DNA(諸如生物合適介質中之DNA)傳遞，且經由IV或皮下注射或任何其他生物合適傳遞機制來傳遞。或者，可在質體、載體(諸如腺病毒載體或任何合適表現載體)中傳遞eIF－5A。
或者，可在脂質體或任何其他用於將DNA(或質體或表現載體)傳遞至靶腫瘤或癌細胞之合適"載劑"或"媒劑"中傳遞DNA。舉例而言，參見Luo,Dan等人，Nature Biotechnology
，第18卷，2000年1月，第33－37頁綜述合成DNA傳遞系統。儘管本發明者早期已展示eIF－5A1對正常組織為無毒的(參見2005年11月28日申請之申請中申請案11/293,391，其全文以引用的方式併入本文中)，但較佳為傳遞系統(與直接投與eIF－5A聚核苷酸/質體/表現載體相比)。較佳傳遞系統向腫瘤或癌細胞群提供有效量之eIF－5A，以及較佳向腫瘤或癌細胞群提供靶向傳遞。因此，較佳經由奈米尺寸之媒劑(諸如脂質體、樹狀體或相似無毒奈米微粒)傳遞eIF－5A核苷酸/質體/表現載體。另外，媒劑在向腫瘤或細胞群傳遞有效量之eIF－5A核苷酸/質體/表現載體時，較佳保護eIF－5A核苷酸/質體/表現載體免受過早清除或免於導致免疫反應。例示性媒劑可在自與eIF－5A核苷酸/質體/表現載體相關之簡單奈米微粒至具有連接至其表面以靶向特異性細胞受體之配位子之較複雜聚乙二醇化媒劑(諸如聚乙二醇化脂質體)的範圍內。
此項技術中已知脂質體及聚乙二醇化脂質體。在習知脂質體中，待傳遞之分子(亦即小藥物、蛋白、核苷酸或質體)含在脂質體之中心腔內。熟習此項技術者將瞭解，亦存在適用於分子傳遞之"隱形"、靶向及陽離子型脂質體。舉例而言，參見Hortobagyi,Gabriel N.等人，J.Clinical Oncology，第
19卷，第14版2001年7月：3422－3433及Yu,Wei等人Nucleic Acids Research.
2004,32(5)；e48。脂質體可經靜脈內注射且可經修飾以使其表面更具親水性(藉由向雙層中添加聚乙二醇("聚乙二醇化"))，其延長脂質體於血流中之循環時間。該等脂質體稱為"隱形"脂質體且尤其可用作親水性(水溶性)抗癌藥物(諸如多柔比星及米托蒽醌(mitoxantrone))之載劑。為增進藥物載運脂質體對靶細胞(諸如腫瘤細胞)之特異性結合性質，可將特異性分子(諸如抗體、蛋白、肽等)連接於脂質體表面上。舉例而言，癌細胞上存在之受體的抗體可用於使脂質體靶向癌細胞。在靶向多發性骨髓瘤之情況下，例如葉酸鹽、Il－6或運鐵蛋白可用於使脂質體靶向多發性骨髓瘤細胞。
樹狀體在此項技術中亦為已知且提供較佳之傳遞媒劑。舉例而言，參見論述樹狀體之Marjoros,Istvan,J.，等人，"PAMAM Dendrimer－Based Multifunctional Conjugate for Cancer Therapy：Synthesis,Characterization,and Functionality," Biomacromolecules，第7卷，2006年第2期；572－579及Majoros,Istvan J.，等人，J.Med.Chem
,2005.48,5892－5899。
eIF－5A亦可直接傳遞至腫瘤位點。熟習此項技術者將可確定eIF－5A之劑量及傳遞eIF－5A之治療方案的時長。
本發明之另一實施例提供一種誘發多發性骨髓瘤細胞中細胞死亡之方法。多發性骨髓瘤為一種產生高含量可導致骨損害及腫瘤進程之發炎性細胞激素類型的骨髓癌症。細胞激素IL－1B及IL－6充當骨髓瘤細胞之生長因子。
將編碼含有腺病毒載體構造之eIF－5A1之聚核苷酸(編碼區之全長)投與至多發性骨髓瘤細胞株KAS 6/1細胞。KAS 6/1細胞株係產生於梅歐醫院(Mayo Clinic)且於Westendorf,JJ.，等人，Leukemia
(1996)10,866－876中報導。該細胞株直接自患有侵襲性多發性骨髓瘤之患者之分離株而產生。本發明者已展示當將含有腺病毒構造之eIF－5A投與至KAS 6/1細胞時，與已僅經對照載體處理之細胞(圖1中示為"CTL")相比，垂死或死亡細胞之數目增加(餘下較少活癌細胞)(圖41中示為"WT")。參見圖41。與未經處理細胞約25%死亡相比，經因子5A1處理之癌細胞約90%死亡。因此，本發明之一實施例提供一種藉由提供編碼eIF－5A1之聚核苷酸以上調eIF－5A1之表現且導致多發性骨髓瘤細胞死亡來殺骨髓瘤細胞的方法。
另外，IL－6亦連同對照(示為"CTL＋IL－6")及eIF－5A構造(圖41中示為"WT＋Il－6")一起投與。IL－6為充當骨髓瘤細胞之生長因子之細胞激素。結果展示即使當將IL－6與eIF－5A構造共投與時，仍可實現細胞凋亡之增加。參見圖41。此結果展示因子5A1不僅可殺骨髓瘤細胞，在IL－6存在下亦可除去骨髓瘤細胞。此發現令人關注之處在於已證明在IL－6存在下，使用標準療法(諸如地塞米松)極為難以誘發骨髓瘤細胞中之細胞凋亡。
另外，亦已單獨("MUT")或與IL－6("MUT＋IL－6")一起投與具有突變體eIF－5A(K50A)之腺病毒構造(由於將位置50之保守離胺酸改變為另一胺基酸而不可亥普酸化)。結果展示即使在IL－6存在下，與對照細胞相比突變體eIF－5A1亦可增加細胞凋亡。參見圖41。因此，本發明之一實施例提供一種藉由投與突變體eIF－5A1(該突變體不可被亥普酸化)來殺骨髓瘤細胞之方法。突變體eIF－5A1導致未經亥普酸化eIF－5A1之表現增加，此使得骨髓瘤細胞之細胞死亡增加。
由於IL－6充當骨髓瘤細胞之生長因子，因此下調IL－6之表現亦將提供一種殺骨髓瘤細胞之方法。本發明者已展示對抗eIF－5A1之siRNA(關於siRNA構造，參見圖43及46A及46B)不僅下調內源性eIF－5A1之表現，且亦下調各種前發炎性細胞激素之表現。因此，本發明之一實施例提供一種殺骨髓瘤細胞之方法，該方法藉由投與對抗細胞凋亡特異性eIF－5A之siRNA以下調IL－1B之內源性表現，其隨之又下調IL－6之表現，其隨之又提供較少IL－6來充當骨髓瘤細胞之生長因子。藉由下調IL－6之表現，存在較少可得之對於骨髓瘤細胞之持續生長及存活所必需之IL－6。
在另一實施例中，投與編碼eIF－5A之聚核苷酸以結合對抗eIF－5A1之siRNA提供骨髓瘤細胞中細胞凋亡之增加。較佳在載體(諸如腺病毒載體)中投與編碼eIF－5A1之聚核苷酸以使得siRNA不抑制外源性eIF－5A1之表現。舉例而言，雖然siRNA靶向3'UTR，但編碼外源性eIF－5A1之聚核苷酸較佳含有完整之開放閱讀框架(ORF)，且因此不具有由siRNA靶向之3'UTR。合適siRNA構造先前已描述於同在申請中之申請案11/287,460、11/134,445、11/184,982及11/293,391中，所有均以其全文引用的方式併入本文中。亦參見圖43及46A及46B。eIF－5A1於骨髓瘤細胞中表現且導致細胞死亡。另外，eIF－5A1 siRNA減少eIF－5A之內源性表現之表現，其隨之又減少IL－6之表現，且隨之增加骨髓瘤細胞中之細胞死亡。在此方法中，如上所述之突變體eIF－5A亦可用於載體構造中。
本發明亦提供一種殺多發性骨髓瘤細胞之組合療法。可結合標準療法投與包含編碼eIF5A(較佳eIF5A1)之聚核苷酸的組合物。可在習知療法之前、期間或之後投與eIF5A組合物。eIF5A可作為醫藥組合物投與或可於如上所述之傳遞媒劑中投與。
化學物質
以50 μM之濃度使用DHS之抑制劑N1－甲脒基－1,7－二胺基庚烷(GC7；Biosearch Technologies)。以0.5或1.0 μg/ml使用放射菌素D(Calbiochem)。硝普鈉及去鐵胺購自Sigma且分別以3 mM及500 μM之濃度使用。佈雷菲爾得菌素A亦得自Sigma且以4 nM之濃度使用。
細胞培養及處理
人類結腸腺癌細胞株HT－29用於細胞增殖及eIF5A定位研究且為來自Anita Antes(University of Medicine and Dentistry of New Jersey)之友善贈與。將HT－29細胞保持在補充有1 mM丙酮酸鈉、10 mM HEPES及10%胎牛血清(FBS)之RPMI 1640中。所有其他細胞株均得自美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection)。CCD112Co為正常結腸纖維母細胞細胞株。RKO為含有野生型p53之人類結腸直腸癌細胞株(CRL－2577)。RKO－E6細胞株(CRL－2578)衍生自RKO細胞株。其含有穩定整合之人類乳頭狀瘤病毒E6致癌基因且因此缺乏可觀之官能性p53腫瘤抑制蛋白。使RKO、RKO－E6、A549及細胞株CCD112Co生長於以2 mM L－麩醯胺酸及經調整含有1.5 g/L碳酸氫鈉、0.1 mM非必需胺基酸、1 mM丙酮酸鈉且補充以10% FBS之厄爾氏均衡鹽溶液(Earle's Balanced Salt Solution)改質之伊格爾最低必需培養基(Eagle Minimum Essential Medium)中。將細胞維持在37℃下含有5% CO2
之增濕環境中。
質體之選殖及構造
藉由RT－PCR，自使用GenElute哺乳動物RNA小規模純化套組(Sigma)根據製造商對黏附細胞之實驗程序自RKO細胞分離之總RNA選殖人類eIF5A。所用之引子為：前置引子5'－CGAGTTGGAATCGAAGCCTC－3'；及反置引子5'－GGTTCAGAGGATCACTGCTG－3'。將所得532鹼基對產物次選殖至pGEM－T Easy(Promega)中且測序。將所得質體用作使用引子之PCR的模板：前置引子5'－GCCAAGCTTAATGGCAGATGATTTGG－3'；及反置引子5'－CCTGAATTCCAGTTATTTTGCCATGG－3'，且將PCR產物次選殖至pHM6(血球凝集素[HA]標記；Roche Molecular Biochemicals)之Hind
lII及Eco
R1位點中以產生pHM6－eIF5A載體。藉由PCR使用以下引子產生eIF5A(pHM6－eIF5A△37)之C末端截斷構造：前置引子5'－GCCAAGCTTAATGGCAGATGATTTGG－3'；及反置引子5'－GCCGAATTCTCCCTCAGGCAGAGAAG－3'。將所得PCR產物次選殖至pHM6載體中。將pHM6－LacZ載體(Roche Molecular Biochemicals)用於最優化轉染且用作轉染對細胞凋亡之作用的對照。
北方墨點法
使RKO細胞在6孔培養盤上生長至長滿且以1.0 μg/ml放射菌素D處理0、1、4或8小時。使用GenElute哺乳動物RNA小規模純化套組(Sigma)自細胞分離總RNA且將5 μg RNA在1.2%瓊脂糖/甲醛凝膠上分餾。根據已建立之方法以與eIF5A之3'非轉譯區(3'－UTR)同源之32
P－標記cDNA探測膜。藉由RT－PCR使用以下引子自RKO細胞選殖用於北方墨點法之eIF5A 3'－UTR cDNA：前置引子5'－GAGGAATTCGCTGTTGCAATCAAGGC－3'；及反置引子5'－TTTAAGCTTTGTGTCGGGGAGAGAGC－3'。藉由RT－PCR使用以下引子選殖用作用於北方墨點法之負載對照的β－肌動蛋白cDNA：前置引子5'－GATGATATCGCCGCGCTCGT－3'；及反置引子5'－GTAGATGGGCACAGTGTGGGTG－3'
。
質體之轉染及細胞凋亡之偵測
使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)根據製造商推薦之實驗程序以質體DNA瞬間轉染RKO及RKO－E6細胞。轉染後48小時，藉由末端去氧核苷酸轉移酶介導之dUTP－地高辛配基(digoxigenin)缺口末端標記(TUNEL)使用DNA斷裂偵測套組(Oncogene Research Products)根據製造商之實驗程序偵測含有斷裂DNA之細胞凋亡細胞。對於螢光顯微分析而言，根據由Taylor等人(2004)所述之方法將細胞在8孔培養載片上轉染，以4%之甲醛固定且接著以TUNEL標記且以Hoescht 33258染色。
siRNA之轉染
所有siRNA均得自Dharmacon。靶向eIF5A mRNA(寄存編號BC085015)之3'UTR之eIF5A siRNA具有以下序列：有義股5'－GCUGGACUCCUCCUACACAdTdT－3'；及反義股3'－dTdTCGACCUGAGGAGGAUGUGU－5'。針對eIF5A之第二siRNA(5A－2)具有以下序列：有義股5'－AGGAAUGACUUCCAGCUGAdTdT－3'；及反義股3'－dTdTUCCUUACUGAAGGUCGACU－5'。所用之對照siRNA具有eIF5A特異性siRNA之反向序列且與任何已知之人類基因產物無相似性。對照siRNA具有以下序列：有義股5'－ACACAUCCUCCUCAGGUCGdTdT－3'；及反義股3'－dTdTUGUGUAGGAGGAGUCCAGC－5'。使用Lipofectamine 2000將細胞以siRNA12
轉染且用於增殖研究或西方墨點法。
西方墨點法
使用沸騰溶解緩衝液[2% SDS、50 mM Tris－HCl(pH 7.4)]分離用於西方墨點法之蛋白。使用二喹啉甲酸套組(Bicinchoninic Acid Kit,Sigma)測定蛋白濃度。對於西方墨點法而言，將5 μg總蛋白在12% SDS－聚丙烯醯胺凝膠上分餾且轉移至聚偏二氟乙烯膜。所用之第一抗體為抗－eIF5A(BD Transduction Laboratories；小鼠IgG)及抗－β－肌動蛋白(Oncogene；小鼠IgM)，二者均於5%牛奶中稀釋為1：20,000。第二抗體為與辣根過氧化物酶(HRP；Sigma)共軛之抗小鼠IgG及抗小鼠IgM－HRP(Oncogene)。使用增強之化學發光法(ECL,Amersham Biosciences)觀測抗體蛋白複合物。偵測eIF5A之後，根據由ECL Plus西方墨點法偵測系統提供之實驗程序去除墨點且以抗－β－肌動蛋白抗體再探測以確定相等負載。
使用MAPK溶解緩衝液(10 mM Tris－pH 7.4,2% SDS,10%甘油)中收集之溶解物進行對用於MAPK/SAPK路徑分析之來自A549細胞之溶解物的西方墨點分析。在10% SDS－PAGE凝膠上分離10微克溶解物且轉移至PVDF膜。將該膜於PBS中之5%無脂肪脫脂牛奶中阻斷1小時，以PBS洗滌且與第一抗體以1：1000於5% BSA/PBS－T中在4℃下在震盪下培育隔夜。MAPK/SAPK抗體(P－p38、p38、P－JNK、JNK、P－ERK、ERK、p90RSK)購自Cell Signaling。用於A549研究之p53抗體亦得自Cell Signaling且以類似形式使用。
2－D凝膠電泳
對於2－D凝膠電泳而言，在冷溶解緩衝液(7 M尿素、2 M硫脲、30 mM Tris、4% CHAPS、蛋白酶抑制劑混合液)中收穫HT－29細胞溶解物，超音波降解處理且藉由離心清除碎片。使用布拉福(Bradford)法測定蛋白濃度。以Ettan IPGphor等電聚焦系統(Amersham Biosciences)根據製造商之說明書進行第一向等電聚焦。在室溫下，將固定乾膠條(Immobiline DryStrip,7 cm pH 4－7；Amersham Biosciences)連同細胞溶解物一起於再水合緩衝液(8 M尿素，2% CHAPS,0.2% DTT,0.5% pH 4－7 IPG緩衝液，0.002%溴酚藍)中再水合12小時。將等電聚焦在500 V下進行30 min，在1000 V下進行30 min且在5000 V下進行1小時40 min。接著藉由SDS－PAGE分離IPG膠條凝膠上之蛋白且轉移至PVDF膜(Amersham Biosciences)。使用eIF5A抗體(BD Biosciences)進行西方墨點法分析。
腺病毒之產生
使用AdMaxTM
Hi－IQ系統(Microbix Biosystems Inc.,Toronto,Canada)構造表現人類eIF5A或具有防止亥普酸化之單點突變(K50→A50)之eIF5A[eIF5A(K50A)]的腺病毒(腺病毒5血清型，E1,E3－去除)。使用PCR在eIF5A cDNA中產生位點特異性突變。eIF5A cDNA藉由PCR使用質體DNA作為模板擴增，且接合至腺病毒穿梭載體pDC516(io)之Sma
I位點。PCR引子之序列為：前置引子5'－GCCAAGCTTAATGGCAGATGATTTGG－3'；及反置引子5'－CCTGAATTCCAGTTATTTTGCCATGG－3'。將腺病毒基因組質體載體pBHGfrt(del)E1,3FLP及穿梭載體在大腸桿菌(E.coli
)DH5α中繁殖且使用Qiagen EndoFree Plasmid Mega套組純化。使用由Microbix Biosystems Inc.推薦之CaCl2
法將5 μg腺病毒基因組質體pBHGfrt(del)E1,3FLP及穿梭載體pDC516(io)－eIF5A或pDC516(io)－eIF5A(K50A)各自於60 mm培養盤中轉染至60－80%長滿之293－IQ細胞(Microbix Biosystems)中。在37℃下培育7至10天之後出現斑塊，且將所得腺病毒微粒[Ad－eIF5A及Ad－eIF5A(K50A)]在293－IQ細胞中擴增。藉由CsCl梯度超速離心根據由Microbix Biosystems Inc提供之實驗程序製備純的高效價腺病毒原料。表現LacZ(Ad－LacZ；血清型5；E1,E3－去除)之腺病毒載體購自Qbiogene(California,USA)且在該等實驗中用作對照及報導子。以與Ad－eIF5A及Ad－eIF5A(K50A)病毒相同之方式擴增及純化Ad－LacZ腺病毒。
腺病毒感染及Annexin V標記
將HT－29、HTB－9或HTB－4細胞以每盤1×106
個細胞接種於100 mm組織培養盤中且第二天於5 ml RPMI 1640＋2% FBS中以3000個感染單元/細胞之腺病毒感染。在4小時之後向細胞中添加其他培養基且將FBS之濃度升至10%。在BD感染後24、48或72小時，根據製造商之實驗程序(Biosciences)，藉由胰蛋白酶消化作用分離細胞，洗滌且以Annexin V－FITC染色。由流式細胞儀(Coulter Epics XL－MCL)使用488 nm氬雷射源及用於螢光素偵測之濾光片揀選細胞且由WinMDI 2.8分析資料。
以3000個感染單元/細胞感染HT－29細胞且使用1500個感染單元/細胞對A549細胞進行實驗。
增殖檢定
使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)於96孔培養盤上以siRNA轉染HT－29細胞。以XTT細胞增殖套組(Roche Applied Science)量測增殖細胞之代謝活性。依照製造商之實驗程序，使用BrdU細胞增殖套組(Roche Applied Science)量測DNA合成。為在腺病毒感染後進行XTT檢定，於96孔培養盤中每孔塗覆5000個細胞。次日，分別以Ad－lacZ、Ad－eIF5A1及Ad－eIF5A1(K50A)(Ad－eIF5A1M)感染細胞，以未經處理之細胞作為陰性對照且以經放射菌素D處理之細胞作為陽性對照。添加XTT受質且以A690 nm作為參照來量測A475 nm。
間接免疫螢光法
於經聚－L－離胺酸塗覆之玻璃蓋片上培養HT－29細胞。以200單位之干擾素γ(IFN－γ；Roche Applied Science)與次長滿細胞進行培育16小時，繼而以TNF－α(100 ng/ml；Leinco Technologies)培育10分鐘至8小時之時間。或者，以1.0 μg/ml放射菌素D處理細胞歷時30分鐘至16小時之漸增時長。將經處理之細胞以3%甲醛(無甲醇；Polysciences Inc.)固定20分鐘，以PBS洗滌兩次歷時5分鐘且以含有100 mM甘胺酸之PBS洗滌一次歷時5分鐘，且以PBS中之0.2% Triton X－100滲透4分鐘。接著使用標準實驗程序標記細胞以用於免疫螢光分析。第一抗體為以1：250之稀釋比培育1小時之抗－eIF5A(BD Transduction Laboratories；小鼠IgG)。第二抗體為以1：200之稀釋比使用1小時之抗－小鼠IgG－AlexaFluor 488(Molecular Probes)。在抗體標記之後，以Hoescht 33258將核染色且由螢光顯微法觀察經標記之細胞。
Matrigel TM 細胞侵襲檢定
以1500個感染單元/細胞之腺病毒感染A549細胞且培育24小時。接著以胰蛋白酶分離細胞，以無血清之培養基洗滌且於無血清之培養基中以30,000個細胞/孔塗覆於已以15 μg MatrigelTM
基底膜基質(BD Biosciences)預塗佈之transwell(Falcon 8.0 μm細胞培養池)上。將含有10% FBS之培養基置於底部孔中(24孔盤中transwell所在之孔)且將細胞再培育24小時。在培育之後，將培養基自transwell之上腔室移除，移除transwell且置於24孔培養盤之含有500微升結晶紫之孔中。將transwell在染料中培育20分鐘且接著藉由將該transwell浸於一燒杯之水中重複洗滌。將預濕潤之棉簽用於自該transwell頂部表面刮除細胞。藉由光學顯微法觀察已移至transwell底部表面之細胞，攝影且計數每視野之移動細胞的數目。參見圖24。
統計學
使用司徒頓t測試進行統計分析。以95%以上之置信度(P<0.05)確定顯著性。
小鼠及腫瘤之產生
5－7週大之C57BL/6小鼠購自Charles River,Quebec,Canada。在實驗開始之前使小鼠適應一週。B16F10鼠科黑素瘤細胞購自ATCC且培養於DMEM－10% FBS中。胰蛋白酶化細胞單層且以MEM－10% FBS中和。將細胞以PBS洗滌兩次且藉由錐蟲藍染色測定細胞生存力。為進行實驗性轉移實驗(實驗II及實驗III)，藉由將B16F10細胞經尾部靜脈注射至6週大之小鼠中而在肺中產生黑素瘤腫瘤。將B16F10細胞在PBS中稀釋至1×106
個活細胞/ml。經由尾部靜脈將200 μl細胞注射至各小鼠中。為進行皮下腫瘤實驗(實驗IV及實驗V)，藉由將500,000個B16F10細胞經皮下注射至10至14週大之小鼠的右側腹中而產生黑素瘤腫瘤。在所有實驗結束(當小鼠瀕臨死亡或腫瘤超過預定尺寸)時，藉由CO2
吸入使小鼠安樂死。
質體DNA之構造及純化
缺乏CpG二核苷酸之pCpG－lacZ表現載體購自InvivoGen,San Diego,USA。藉由首先以Ncol及Nhel消化質體且分離3.1 kb之pCpG載體骨架(藉此移除LacZ編碼序列)且與含有HA標記之eIF5A1的經PCR擴增之cDNA接合(pCpG－HA5A1)來將HA－標記之eIF5A1 cDNA次選殖至pCpG－lacZ載體中。PCR引子為eIF－5A1前置引子：HA－5A1前置引子：5'－GCTCCATGGATGTACCCATACGACGTCCC－3'；及eIF5A1反置引子：5'－CGCGCTAGCCAGTTATTTTGCCATCGCC－3'。將pCpG－lacZ及pCpG－HA5A1在培養於含有25 μg/ml zeocin之LB或2XYT培養基中之大腸桿菌GT115中擴增。提取質體且藉由QIAGEN Endofree Plasmid Giga套組純化。藉由260 nm之UV吸收及瓊脂糖凝膠電泳法量測DNA濃度。
質體DNA之尾部靜脈注射(實驗II)
在第2、4、7、11、16、21、26、31天將溶解於1×PBS中之質體DNA(以體重計約為200 μl)注射至小鼠之尾部靜脈中。質體DNA濃度為2×660 ng/μl(6.6 mg/kg)，1×330 ng/μl(3.3 mg/kg)，及0.1×33 ng/μl(0.33 mg/kg)。
體重及肺重：
在尾部靜脈注射之前或每週一及週五量測體重。當小鼠發病(昏睡，呼吸窘迫)時以CO2
使其安樂死且移除肺、稱重、攝影、冷凍且儲存在－70℃下。參見圖25－27。
VEGF ELISA：
以PBS洗滌所收穫之肺組織，於乾冰中冷凍且儲存在－70℃下。自基本肺組織分離蛋白溶解物。使用小鼠VEGF免疫檢定套組(R&D Systems,Inc.Minneapolis,USA)，將50 μg肺組織蛋白用於測定小鼠肺中之VEGF濃度。
質體DNA/DOTAP複合物之注射
對6週大之小鼠經尾部靜脈注射以B16F10黑素瘤細胞(每隻小鼠為200 μl PBS中之50,000個細胞)、質體DNA及含有50 μg經無內毒素套組純化之質體DNA之DNA載劑複合物，且在第7、14及21天向小鼠體內經尾部靜脈注射80 μg DOTAP。在第25天殺死小鼠。移除肺、稱重且攝影。參見圖28－29。
腺病毒構造之注射及TUNEL
向10週大C57BL/6小鼠之右側腹中經皮下注射以500,000個B16F0或B16F10細胞。當腫瘤達到約4 mm之直徑時(在B16細胞注射後10－12天)，將50 μl PBS中之1×109
個pfu Ad－5A1注射至腫瘤中。在48小時後殺死小鼠且切除腫瘤，固定且埋入石蠟中。藉由TUNEL(Promega)根據製造商之實驗程序將各細胞腫瘤類型(Ad－5A1－1及Ad－5A1－2)之兩個切片染色。對於每一細胞類型而言，包括陰性對照載片(Ad－5A1陰性)，其中TUNEL反應中省去TdT酶。參見圖30。
腫瘤之產生
對14週大C57BL/6小鼠之右側腹經皮下注射以500,000個B16F10細胞(於100 μl PBS中)。每日檢查腫瘤形成之進程直至腫瘤尺寸達到約8 mm之直徑。
以腺病毒注射
當腫瘤尺寸達到8 mm之直徑時開始處理。對小鼠注射以1×109
斑塊形成單元(pfu)之Ad－eIF5A1或Ad－LacZ。注射分佈於腫瘤中之3個位點。最初3天每天注射小鼠且其後接著每隔一天注射直至殺死小鼠。當腫瘤尺寸在一個方向上超過15至16 mm時殺死小鼠。僅緩衝液之小鼠僅接受懸浮腺病毒之緩衝液(10 mM Tris－HCl pH 7.4,10 mM MgCl2
,10%甘油)。每天使用測徑規量測腫瘤尺寸且使用以下等式計算腫瘤體積：腫瘤體積(mm3
)＝L*W2
*0.52其中L＝長度，W＝寬度(通常為較短尺寸)參見圖31及圖32。
以表現LacZ(Lac)或eIF5A1(5A)之腺病毒感染A549肺癌細胞。在感染後4小時，以含有DMSO、10 μM p38抑制劑SB203580(Calbiochem)、10 μM JNK抑制劑II(Calbiochem)、10 μM MEK抑制劑U1026(Calbiochem)或30 μM p53抑制劑Pifithrin－a(Calbiochem)之培養基替代培養基。48小時後，以EGF處理細胞30分鐘且收穫細胞溶解物。使用針對總p53(p53)、或在絲胺酸15上磷酸化之p53[P－p53(ser15)]或在37上磷酸化之p53[P－p53(ser37)]之抗體對溶解物進行西方墨點法分析。參見圖33。
圖33中所示之結果展示Ad－eIF5A1在感染後48小時內誘發p53之積聚。該圖亦展示Ad－eIF5A1在感染後48小時內誘發p53之磷酸化；p53之積聚及磷酸化由MEK之抑制劑抑制；p53之積聚及磷酸化由具有p53活性之抑制劑抑制；eIF5A1刺激p53之MEK依賴性磷酸化；且eIF5A1刺激p53之p53依賴性積聚。
以表現LacZ之腺病毒(Ad－LacZ)或表現eIF5A1之腺病毒(Ad－eIF5A1)感染A549肺癌細胞。48小時後，自細胞分離總RNA。藉由即時PCR使用GAPDH作為參照基因測定p53及bax mRNA轉錄量之量。p53引子為：5'－CGCTGCTCAGATAGCGATGGTC－3'(5'端引子)及5'－CTTCTTTGGCTGGGGAGAGGAG－3'(3'端引子)[該等p53引子序列得自：Li等人(2004).A Novel eIF5A/complex Functions as a Regulator of p53 and p53－dependent Apoptosis,J Biol Chem.279 49251－49258]。參見圖34，其展示eIF5A1之過度表現誘發p53在mRNA量上之積聚，但未見對bax之影響。
以表現LacZ之腺病毒(Ad－LacZ)或表現eIF5A1之腺病毒(Ad－eIF5A1)感染A549肺癌細胞。在感染後4小時，以含有DMSO、10 μM MEK抑制劑U1026(Calbiochem)或30 μM p53抑制劑Pifithrin－a(Calbiochem)之培養基替代培養基。48小時後，自細胞分離總RNA。藉由即時PCR使用GAPDH作為參照基因測定p53轉錄量之量。p53引子為：5'－CGCTGCTCAGATAGCGATGGTC－3'(5'端引子)及5'－CTTCTTTGGCTGGGGAGAGGAG－3'(3'端引子)[該等p53引子序列得自：Li等人(2004).A Novel eIF5A/complex Functions as a Regulator of p53 and p53－dependent Apoptosis,J Biol Chem.
279 49251－49258]。參見圖35，其展示p53之eIF5A1依賴性積聚取決於p53之轉錄活性，且由eIF5A1而產生之p53蛋白之上調導致p53 mRNA之轉錄增加。
以表現LacZ之腺病毒(Ad－LacZ)或表現eIF5A1之腺病毒(Ad－eIF5A1)感染A549肺癌細胞。在感染後4小時，以含有DMSO、10 μM MEK抑制劑U1026(Calbiochem)或30 μM p53抑制劑Pifithrin－a(Calbiochem)之培養基替代培養基。48小時後，自細胞分離總RNA。藉由即時PCR使用GAPDH作為參照基因測定p53轉錄量之量。TNFR1引子為：TNFR1－F 5' ATCTCTTCTTGCACAGTGG 3'及TNFR1－R 5' CAATGGAGTAGAGCTTGGAC 3'。參見圖36，其展示TNFR1 mRNA含量藉由以Ad－eIF5A1感染而上調且此TNFR1 mRNA之積聚部分取決於MEK。此TNFR1 mRNA之積聚取決於p53之轉錄活性。
以表現LacZ(Lac)或eIF5A1(5A)之腺病毒感染A549肺癌細胞。在感染後4小時，以含有DMSO、10 μM p38抑制劑SB203580(Calbiochem)、10 μM JNK抑制劑II(Calbiochem)、10 μM MEK抑制劑U1026(Calbiochem)或30 μM p53抑制劑Pifithrin－a(Calbiochem)之培養基替代培養基。48小時後，收穫細胞且藉由Annexin/PI染色(BD Bioscience)，繼而藉由流式細胞儀分析來測定經受細胞凋亡之細胞百分率。參見圖37。
圖37展示Ad－eIF5A1在感染後48小時內誘發細胞凋亡；JNK之抑制增加由eIF5A1誘發之細胞凋亡；MEK之抑制增加由eIF5A1誘發之細胞凋亡且p53之抑制減少由eIF5A1誘發之細胞凋亡。
對小鼠經皮下注射以50,000個B16－F0黑素瘤細胞。當腫瘤達到約5×5 mm(65 mm3
)之尺寸時，開始腫瘤內注射。每隔一天以每個腫瘤3個位點向腫瘤中注射稀釋於50－100 μl PBS/10%甘油緩衝液中之1×109
pfu之Ad－lacZ(群2)、Ad－eIF5A1(群3)或Ad－eIF5A2(群4)或僅注射緩衝液(群1)。每隔一天量測腫瘤尺寸直至當腫瘤尺寸達到體重之10%殺死小鼠。參見圖39。
對小鼠經皮下注射以50,000個B16－F0黑素瘤細胞。當腫瘤達到約5×5 mm(65 mm3
)之尺寸時，開始腫瘤內注射。每隔一天以每個腫瘤3個位點向腫瘤中注射稀釋於50－100 μl PBS/10%甘油緩衝液中之1×109
pfu之Ad－lacZ(群2)、Ad－eIF5A1(群3)或Ad－eIF5A2(群4)或僅注射緩衝液(群1)。當腫瘤尺寸達到體重之10%時，殺死小鼠。參見圖40。
在第0天，以3000 IFU/細胞野生型或突變體eIF5a(不可亥普酸化－保守離胺酸突變)腺病毒載體構造感染KAS 6/1多發性骨髓瘤細胞歷時4小時。建立使用或不使用存在於感染後培養基中之IL－6的3個複本。另外，塗覆KAS細胞作為對照(未經感染)。
在第2天及第4天進行MTT及annexin/PI檢定。收穫上清液。結果展示於圖41中。
圖1展示eIF5A1表現由基因毒性壓力及氧化氮而增加。A)對經0.5 μg/ml放射菌素D處理0、1、4、8及24小時之正常結腸纖維母細胞中之eIF5A表現進行北方墨點法(頂部面板)及西方墨點法(底部面板)分析。以對抗eIF5A、p53及β－肌動蛋白之抗體探測西方墨點法。B)對經3 mM硝普鈉處理0、2、4、8及24小時之RKO細胞中之eIF5A表現進行北方墨點法(頂部面板)及西方墨點法(底部面板)分析。以對抗eIF5A及β－肌動蛋白之抗體探測西方墨點法。RKO細胞不以顯著量表現eIF5A2。另外，eIF－5A2在尺寸上僅比eIF－5A1長1個胺基酸，但其在SDS PAGE凝膠上前進得較高，以使得若表現eIF－5A2，則可見與eIF－5A1分離之條帶。
圖2展示對eIF5A1表現之抑制對細胞增殖無影響。A)在以eIF5A1 siRNA或對照siRNA轉染後72小時自HT－29細胞分離之細胞溶解物的西方墨點。展示來自兩個獨立實驗之西方墨點。以對抗eIF5A及β－肌動蛋白之抗體探測墨點。B)使用XTT細胞增殖檢定法量測以eIF5A1 siRNA轉染之細胞的代謝活性。在以對照siRNA或eIF5A1 siRNA轉染之前24小時將HT－29細胞接種於96孔培養盤上。轉染後24小時，將細胞在未經處理下靜置，或以放射菌素D(1.0 μg/ml)處理48小時，之後量測代謝活性。值為重複進行四次之兩個實驗的平均值，且將其正規化為對於0小時對照所獲得之設定為1之值。C)將以對照或eIF5A1 siRNA轉染之HT－29細胞的增殖活性與以50 μM GC7培育72小時之細胞的增殖活性相比較。藉由BrdU併入法量測細胞增殖。值為n＝4之平均值±SE，且將其正規化為對於GC7(＋)血清樣本設定為1之值。星號(＊
)表示藉由配對司徒頓t
測試(paired Studentt
－test)(p
<0.01)認為顯著不同之值。D)XTT及E)自轉染之日(第0天)至轉染後第5天以對照siRNA或eIF5A siRNA轉染之HT－29細胞的BrdU併入法細胞增殖檢定。將第0天之值設定為1。
圖3展示eIF5A1回應於放射菌素D調節p53之表現。以對照siRNA(C)或eIF5A siRNA(5A－1)轉染RKO細胞。轉染後72小時，以0.5 μg/ml放射菌素D處理細胞歷時0、4、8或24小時。A)以對抗eIF5A、p53或β－肌動蛋白之抗體點墨之細胞溶解物之西方墨點法。結果表示3個獨立實驗。B)正規化為對應肌動蛋白條帶之西方墨點中p53相對強度之圖式。值為最小值n＝3之平均值±SE。
圖4展示與p53無關之人類eIF5A1之過度表現誘發細胞凋亡。以pHM6－LacZ、pHM6 eIF5A或pHM6－eIF5A△37(C末端之37胺基酸截斷)轉染RKO細胞(A)或RKO－E6細胞(B)。轉染後48小時，固定細胞且使用TUNEL法標記。以Hoescht 33258將核染色且藉由螢光顯微法觀察經標記之細胞。經亮綠染色之細胞計為細胞凋亡。經Hoescht－染色之核用於測定總細胞數。值為n＝4(A)或n＝3(B)之平均值±SE。星號(＊
)表示藉由配對司徒頓t測試(p
<0.02)與對照(pHM6－LacZ)之顯著差異。C)在以0.5 μg/ml放射菌素D處理後0、4、8及24小時收穫之RKO及RKO－E6細胞溶解物之西方墨點法。以對抗p53及β－肌動蛋白之抗體探測墨點。
圖5展示eIF5A1腺病毒構造誘發結腸癌細胞中之細胞凋亡。A)以Ad－LacZ(L)、AdeIF5A1(5A)或Ad－eIF5A(K50A)(K50A)感染後72小時，自HT－29細胞分離之細胞溶解物之西方墨點法。B)以GC7或DFO處理72小時之後或以腺病毒構造感染後72小時，自HT－29細胞分離之細胞溶解物之2－D凝膠電泳，繼而使用對抗eIF5A之抗體進行西方墨點分析。除對於來自過度表現eIF5A之經腺病毒感染細胞之溶解物分離0.3 μg蛋白之外，分離7 μg蛋白。C)頂部面板：以腺病毒構造感染後48小時，HT－29細胞之TUNEL染色。底部面板：相同視野中經Hoechst染色之細胞核。所有相片均以400×放大倍數拍攝。結果表示3個獨立實驗。D)以腺病毒構造感染後48小時，HT－29細胞之細胞凋亡百分率。值為n＝3之平均值±SE。E)以腺病毒構造感染後7天，HT－29細胞之XTT細胞增殖檢定。值為n＝4之平均值±SE。
圖6展示經eIFA1腺病毒構造感染之HT－29細胞之Annexin V及PI染色。A)經腺病毒構造感染後48小時，HT－29細胞之Annexin－FITC及碘化丙啶(PI)標記之頻率分佈圖。B)以腺病毒構造感染後或以細胞凋亡誘發劑(放射菌素D或佈雷菲爾得菌素A(Brefeldin A))處理後24、48及72小時，如由Annexin V標記法及流式細胞儀分析所測定之HT－29細胞之細胞凋亡百分率。值為n＝2之平均值±SE(事件數>5000)。
圖7展示eIF5A1之免疫螢光定位。藉由間接免疫螢光法測定經IFN－γ及TNF－α(A)或放射菌素D(B)刺激之HT－29細胞中之eIF5A蛋白的次細胞定位。Hoechst 33258用於對核染色。A)HT－29細胞未經處理，或以IFN－γ預致敏16小時，之後以TNF－α刺激0 min[(－)TNF－α]、10 min或30 min。頂部面板：eIF5A1之免疫螢光偵測；中間面板：相同視野中經Hoechst染色之細胞核；底部面板：合併圖像。B)HT－29細胞未經處理或以放射菌素D處理0.5 h、1.5 h或4 h。頂部面板：eIF5A1之免疫螢光偵測；中間面板：相同視野中經Hoechst染色之細胞核；底部面板：合併圖像。所有相片均以400×放大倍數拍攝。結果表示3個獨立實驗。
圖8展示eIF5A1回應於放射菌素D調節p53之表現。RKO－E6細胞不表現p53。A)以0.5 μg/ml放射菌素D處理RKO或RKO－E6細胞歷時1、4、8或24小時。收穫細胞溶解物且使用西方墨點法分析p53表現。B)以對照siRNA(C)、eIF5A siRNA(5A－1)或靶向eIF5A之不同區域之第二eIF5A siRNA(5A－2)轉染RKO細胞。轉染後72小時，以0.5 μg/ml放射菌素D處理細胞歷時0、4、8或24小時。A)以對抗eIF5A、p53或β－肌動蛋白之抗體點墨之細胞溶解物之西方墨點法。結果表示3個獨立實驗。
圖9展示經去氧亥普酸化eIF5A1在細胞凋亡期間積聚。此圖提供以放射菌素D(A)或促效劑Fas抗體(B)處理1至24小時範圍內之時間後，自HT－29細胞分離之細胞溶解物的2－D凝膠電泳，繼而使用對抗eIF5A之抗體進行西方墨點分析。
圖10展示感染Ad－eIF5A1或Ad－eIF5A1(K50A){Ad－eIF5A1M}誘發HT－29結腸直腸腺癌細胞中之細胞凋亡。B)此圖提供以腺病毒構造感染後或以細胞凋亡誘發劑(放射菌素D或佈雷菲爾得菌素A)處理後24、48及72小時，如由Annexin V標記法及流式細胞儀分析所測定之HT－29細胞之細胞凋亡百分率。值為n＝2之平均值±SE(事件數>5000)。
圖11展示感染Ad－eIF5A1或Ad－eIF5A2誘發HTB－9膀胱癌細胞中之細胞凋亡。此圖提供以腺病毒構造感染後或以細胞凋亡誘發劑(放射菌素D或佈雷菲爾得菌素A)處理後24、48及72小時，如由Annexin V標記法及流式細胞儀分析所測定之HTB－9細胞之細胞凋亡百分率。值為n＝2之平均值±SE(事件數>5000)。
圖12展示感染Ad－eIF5A1或Ad－eIF5A2誘發HTB－4膀胱癌細胞中之細胞凋亡。此圖提供以腺病毒構造感染後或以細胞凋亡誘發劑(放射菌素D或佈雷菲爾得菌素A)處理後24、48及72小時，如由Annexin V標記法及流式細胞儀分析所測定之HTB－4細胞之細胞凋亡百分率。值為n＝2之平均值±SE(事件數>5000)。
圖13展示感染Ad－eIF5A1、Ad－eIF5A1(K50A){Ad－eIF5A1M}或Ad－eIF5A2抑制HTB－4膀胱癌細胞之生長。此圖提供以腺病毒構造感染後24、48及72小時，HTB－4細胞之XTT細胞增殖檢定之結果。值為n＝2之平均值±SE。
圖14展示感染Ad－eIF5A1、Ad－eIF5A1(K50A){Ad－eIF5A1M}或Ad－eIF5A2抑制HTB－9膀胱癌細胞之生長。此圖提供以腺病毒構造感染後24、48及72小時，HTB－9細胞之XTT細胞增殖檢定之結果。值為n＝2之平均值±SE。
圖15展示感染Ad－eIF5A1、Ad－eIF5A1(K50A){Ad－eIF5A1M}或Ad－eIF5A2抑制HTB－1膀胱癌細胞之生長。此圖提供以腺病毒構造感染後24、48及72小時，HTB－1細胞之XTT細胞增殖檢定之結果。值為n＝2之平均值±SE。
圖16展示感染Ad－eIF5A1、Ad－eIF5A1(K50A){Ad－eIF5A1M}或Ad－eIF5A2抑制UMUC－3膀胱癌細胞之生長。此圖提供以腺病毒構造感染後24、48及72小時，UMUC－3細胞之XTT細胞增殖檢定之結果。值為n＝2之平均值±SE。
圖17展示感染Ad－eIF5A1、Ad－eIF5A1(K50A){Ad－eIF5A1M}或Ad－eIF5A2抑制海拉(HeLa)宮頸腺癌細胞之生長。此圖提供以腺病毒構造感染後24、48及72小時，海拉細胞之XTT細胞增殖檢定之結果。值為n＝2之平均值±SE。
圖18展示感染Ad－eIF5A1、Ad－eIF5A1(K50A)(Ad－eIF5A1M)或Ad－eIF5A2誘發HTB－4細胞中之PARP分裂。此圖提供以腺病毒構造感染後48或72小時，使用PARP、eIF5A及β－肌動蛋白抗體對自HTB－4細胞分離之細胞溶解物進行西方墨點法的結果。
圖19展示感染Ad－eIF5A1、Ad－eIF5A1(K50A)(Ad－eIF5A1M)或Ad－eIF5A2不誘發HTB－1細胞中之PARP分裂。此圖提供以腺病毒構造感染後48或72小時，使用PARP、eIF5A及β－肌動蛋白抗體對自HTB－1細胞分離之細胞溶解物進行西方墨點法的結果。
圖20展示eIF5A1在A549肺癌細胞中之過度表現活化MAPK/SAPK信號傳輸路徑。使用Ad－eIF5A1(5A)以漸增之感染複數(MOI)感染A549細胞。使用Ad－LacZ(Lac)感染細胞用於比較。感染之後48小時，以EGF處理細胞歷時30分鐘且收穫細胞溶解物以用於西方墨點法分析。
圖21展示eIF5A1在A549肺癌細胞中之過度表現活化MAPK/SAPK信號傳輸路徑。使用Ad－eIF5A1(5A)或Ad－LacZ(L)以50之MOI感染A549細胞。感染之後6、24、48或72小時，以EGF處理細胞歷時30分鐘且收穫細胞溶解物以用於西方墨點法分析。
圖22展示不可亥普酸化之突變體eIF5A1之過度表現活化MAPK/SAPK信號傳輸路徑。使用Ad－eIF5A1(K50A)(M)以漸增之感染複數(MOI)感染A549細胞。使用Ad－eIF5A1(5A)及Ad－LacZ(Lac)感染細胞用於比較。使用或不使用MEK抑制劑U1026培育細胞。感染之後48小時，以EGF處理細胞歷時30分鐘且收穫細胞溶解物以用於西方墨點法分析。
圖23展示eIF5A1或突變體eIF5A1(K50A)在A549肺癌細胞中之過度表現增加p53之表現。使用Ad－eIF5A1(5A)或Ad－eIF5A1(K50A)(M)以漸增之感染複數(MOI)感染A549細胞。使用Ad－LacZ(Lac)感染細胞用於比較。使用或不使用MEK抑制劑U1026培育細胞。感染之後48小時，以EGF處理細胞歷時30分鐘且收穫細胞溶解物以用於西方墨點法分析。
圖24展示eIF5A1或突變體eIF5A1(K50A)之過度表現降低A549肺癌細胞經由MatrigelTM
細胞外基質之侵襲能力。以腺病毒構造感染後24小時，將A549細胞接種至無血清培養基中經MatrigelTM
塗佈之transwell上。將含血清培養基置於底部孔中作為化學引誘劑。塗覆之後24小時，以結晶紫染色已侵入transwell底部表面之細胞且藉由在光學顯微鏡下計數細胞來測定每視野中之平均細胞數。對於每樣本最少計數6個視野。
圖25展示實驗II之結果：在具有B16F10之C57BL/6小鼠中，肺腫瘤負載因eIF5A1而顯著減少。將200,000個B16F10細胞注射入6週大C57BL/6小鼠之尾部靜脈中。在第2、4、7、11、16、21、26及31天將具有LacZ基因(作為DNA對照)或eIF5A1之質體DNA注射入尾部靜脈中。使用3種不同之DNA濃度：1×(3.3 mg/kg)、0.1×(0.3 mg/kg)及2×(6.6 mg/kg)。將接受PBS而非B16F10細胞之小鼠用作陰性對照，而將接受PBS而非質體DNA注射之具有B16F10之小鼠用作陽性對照。當小鼠瀕臨死亡時，殺死小鼠且移除肺並攝影。
圖26展示實驗II之結果：在具有B16F10之C57BL/6小鼠中，肺重量因eIF5A1而顯著減少。將200,000個B16F10細胞注射入6週大C57BL/6小鼠之尾部靜脈中。在第2、4、7、11、16、21、26及31天將具有LacZ基因(作為DNA對照)或eIF5A1之質體DNA注射入尾部靜脈中。使用3種不同之DNA濃度：1×(3.3 mg/kg)、0.1×(0.3 mg/kg)及2×(6.6 mg/kg)。將接受PBS而非B16F10細胞之小鼠用作陰性對照，而將接受PBS而非質體DNA注射之具有B16F10之小鼠用作陽性對照。當小鼠瀕臨死亡時，殺死小鼠且移除肺並稱重。
圖27展示實驗II之結果：在具有B16F10之C57BL/6小鼠中，VEGF表現因eIF5A1而顯著減少。將200,000個B16F10細胞注射入6週大C57BL/6小鼠之尾部靜脈中。在第2、4、7、11、16、21、26及31天將具有LacZ基因(作為DNA對照)或eIF5A1之質體DNA注射入尾部靜脈中。使用3種不同之DNA濃度：1×(3.3 mg/kg)、0.1×(0.3 mg/kg)及2×(6.6 mg/kg)。將接受PBS而非B16F10細胞之小鼠用作陰性對照，而將接受PBS而非質體DNA注射之具有B16F10之小鼠用作陽性對照。當小鼠瀕臨死亡時，殺死小鼠且移除肺並稱重。一旦測定肺重量，則將肺冷凍且稍後用於VEGF ELISA。在溶解緩衝液中研磨肺組織且藉由ELISA測定溶解物中存在之VEGF之量。
圖28展示實驗III之結果：藉由使DNA與DOTAP複合改良eIF5A1基因療法之抗腫瘤功效。將50,000個B16F10細胞注射入6週大C57BL/6小鼠之尾部靜脈中(第0天)。將具有LacZ基因(作為DNA對照)或eIF5A1之質體DNA與DOTAP複合，之後在第7、14及21天將其注射入尾部靜脈中。將接受無質體DNA之DOTAP注射之無腫瘤小鼠用作對DOTAP作用之對照。在第25天殺死小鼠且移除肺並攝影。
圖29展示實驗III之結果：藉由使DNA與DOTAP複合改良eIF5A1基因療法之抗腫瘤功效。將50,000個B16F10細胞注射入6週大C57BL/6小鼠之尾部靜脈中(第0天)。將具有LacZ基因(作為DNA對照)或eIF5A1之質體DNA與DOTAP複合，之後在第7、14及21天將其注射入尾部靜脈中。將接受無質體DNA之DOTAP注射之無腫瘤小鼠用作對DOTAP作用之對照。在第25天殺死小鼠且移除肺並稱重。在具有B16F10之C57BL/6小鼠中，肺重量因eIF5A1質體DNA/DOTAP複合物而顯著減少。
圖30展示實驗IV之結果：Ad-eIF5A1注射誘發B16F0及B16F10腫瘤中之細胞凋亡。將500,000個B16F0或B16F10細胞經皮下注射入C57BL/6小鼠之右側腹中。當腫瘤達到約4mm之直徑時(在B16細胞注射後10-12天)，將50μl PBS中之1×109
pfu Ad-5A1注射入腫瘤中。在48小時後殺死小鼠且切除腫瘤，固定且埋入石蠟中。藉由TUNEL(Promega)根據製造商之實驗程序染色各細胞腫瘤類型(Ad-5A1-1及Ad-5A1-2)之兩個切片。對於每一細胞類型而言，包括陰性對照載片(Ad-5A1陰性)，其中TUNEL反應中省去TdT酶。
圖31展示實驗V之結果：藉由注射以Ad-eIF5A1顯著延遲腫瘤生長。對具有皮下B16－F10之C57BL/6注射以1×109
pfu之Ad－eIF5A1或Ad－LacZ或等體積之緩衝液。當腫瘤達到約8 mm之直徑時開始第一天之處理且指定為第0天。最初3天每天對小鼠注射，且隨後每隔一天注射直至殺死小鼠。當腫瘤尺寸在一個方向上超過15至16 mm時，殺死小鼠。每組3隻小鼠。以Ad－eIF5A1處理組1小鼠(1－1、1－2、1－3)，以Ad－LacZ注射組2小鼠(2－1、2－2、2－3)且組3小鼠(3－1、3－2、3－3)僅接受緩衝液。每天使用測徑規量測腫瘤尺寸且用於估計腫瘤體積。
圖32展示實驗V之結果：藉由注射以Ad－eIF5A1顯著增加存活率。對具有皮下B16－F10之C57BL/6注射以1×109
pfu之Ad－eIF5A1或Ad－LacZ或等體積之緩衝液。當腫瘤達到約8 mm之直徑時開始第一天之處理且指定為第0天。最初3天每天對小鼠注射，且隨後每隔一天注射直至殺死小鼠。當腫瘤尺寸在一方向上超過15至16 mm時，殺死小鼠。每組3隻小鼠。以Ad－eIF5A1處理組1小鼠(1－1、1－2、1－3)；以Ad－LacZ注射組2小鼠(2－1、2－2、2－3)；且組3小鼠(3－1、3－2、3－3)僅接受緩衝液。
圖33展示eIF－5A1增加p53腫瘤抑制蛋白在A549肺癌細胞中之積聚及磷酸化。
圖34展示eIF－5A1增加A549肺癌細胞中之p53 mRNA含量。
圖35展示p53含量之增加取決於p53在A549肺癌細胞中之轉錄活性。
圖36展示在A549肺癌細胞中藉由以eIF-5A1感染而上調TNFR1 mRNA含量。
圖37展示eIF-5A1誘發A549肺癌細胞中之細胞凋亡且使用MEK抑制劑增加由eIF-5A1誘發之細胞凋亡的量。
圖38展示eIF-5A1對A549肺癌細胞中MAPK/SAPK路徑及細胞凋亡之作用的假設模型。
圖39展示eIF-5A1在抑制腫瘤生長(在小鼠異種移植模型(B16-FO黑素瘤細胞)中)方面優於eIF-5A2。
圖40展示eIF-5A1在延長小鼠存活(在小鼠異種移植模型(B16-FO黑素瘤細胞)中)方面優於eIF-5A2。
圖41展示與經有或無IL-6之對照處理之細胞相比，eIF-5A增加死亡或垂死細胞之數目(Annexin-PI-處理後4天)。
圖42提供自RKO細胞分離之人類eIF5A2之序列及與Genbank(寄存編號XM 113401)中人類eIF5A2之序列的對準(eIF5A2=增殖之eIF-5A)。
圖43提供eIF-5A1 siRNA之位置及序列。
圖44提供人類eIF-5A1(ACC.NM_001970)與人類eIF-5A2(ACC.NM_020390)之核苷酸對準。
圖45提供人類eIF-5A1與人類eIF-5A2之胺基酸對準。
圖46A及46B提供eIF-5A1 siRNA之位置及序列。圖46A提供siRNA在eIF5A1 mRNA中之位置(轉譯開始及停止為粗體且加下劃線)。
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人工序列之描述：合成siRNA序列<220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> a,t,c,g or u <400> 86<210> 87 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 結合DNA/RNA分子之描述：合成寡核苷酸<220> <223> 人工序列之描述：合成siRNA序列<400> 87<210> 88 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：合成siRNA序列<400> 88<210> 89 <211> 21 <212> RNA <213> 人工序列<220> <223> 結合DNA/RNA分子之描述：合成寡核苷酸<220> <223> 人工序列之描述：合成siRNA序列<220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> a,t,c,g or u <400> 89<210> 90 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 結合DNA/RNA分子之描述：合成寡核苷酸<220> <223> 人工序列之描述：合成siRNA序列<400> 90<210> 91 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 結合DNA/RNA分子之描述：合成寡核苷酸<220> <223> 人工序列之描述：合成siRNA序列<400> 91<210> 92 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：合成siRNA序列<400> 92<210> 93 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：引子<400> 93<210> 94 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：引子<400> 94<210> 95 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：引子<400> 95
Claims (19)
- 一種醫藥組合物，其係用於治療需此之人類受檢者之多發性骨髓瘤之方法，其包含：(a)一表現載體，其包含編碼突變真核起始因子5A1(eIF-5A1)之聚核苷酸，該聚核苷酸係由下所組成：將SEQ ID NO：21之殘基50改變為另一使突變體eIF-5A1無法被亥普酸化(hypusinated)之胺基酸；及(b)一含量之小干擾RNA(siRNA)，其中該siRNA之聚核苷酸序列干擾內源性eIF-5A之表現而非突變體eIF-5A。
- 如請求項1之醫藥組合物，其中該表現載體及siRNA囊封於脂質體中。
- 如請求項2之醫藥組合物，其中該脂質體係經靜脈內投與。
- 如請求項1之醫藥組合物，其中該siRNA之一股包含5'-GCUGGACUCCUCCUACACAdTdT-3'之聚核苷酸序列且該siRNA之互補股包含3'-dTdTCGACCUGAGGAGGAUGUGU-5'之聚核苷酸序列。
- 如請求項1之醫藥組合物，其中該siRNA之一股由5'-GCUGGACUCCUCCUACACAdTdT-3'之聚核苷酸序列所組成且該siRNA之互補股由3'-dTdTCGACCUGAGGAGGAUGUGU-5'之聚核苷酸序列所組成。
- 如請求項1之醫藥組合物，其中該siRNA之含量可有效誘發人類受檢者中多發性骨髓瘤細胞之凋亡。
- 如請求項1之醫藥組合物，其中該siRNA之一股包含5'-AAGCUGGACUCCUCCUACACAdTdT-3'之聚核苷酸序列且該siRNA之互補股包含3'-dTdTUUCGACCUGAGGAGGAUGUGU-5'之聚核苷酸序列。
- 如請求項1之醫藥組合物，其中該siRNA之一股由5'-AAGCUGGACUCCUCCUACACAdTdT-3'之聚核苷酸序列所組成且該siRNA之互補股由3'-dTdTUUCGACCUGAGGAGGAUGUGU-5'之聚核苷酸序列所組成。
- 如請求項1之醫藥組合物，其中位於SEQ ID NO：21中K50之取代為K50A。
- 如請求項9之醫藥組合物，其中該編碼含有位於殘基50之取代之突變體eIF-5A1包含SEQ ID NO：19之編碼區。
- 如請求項9之醫藥組合物，其中該編碼含有位於殘基50之取代之突變體eIF-5A1由SEQ ID NO：19之編碼區所組成。
- 如請求項1之醫藥組合物，其中該siRNA靶向該內源性eIF-5A之3'非轉譯區(3'-UTR)。
- 如請求項1之醫藥組合物，其中該表現載體為腺病毒載體。
- 一種如請求項1至13項中任一項之醫藥組合物之用途，其係用於製備殺多發性骨髓瘤細胞之藥物。
- 如請求項14之用途，其中該siRNA下調eIF-5A1之內源性表現，且其中該eIF-5A1表現之下調將IL-6之表現下調且其中該IL-6之下調可殺多發性骨髓瘤細胞。
- 如請求項14之用途，其中該藥物係與習知多發性骨髓瘤療法一起投與。
- 一種如請求項1至13項中任一項之醫藥組合物之用途，其係用於製備誘發患有多發性骨髓瘤受檢者中多發性骨髓瘤細胞中細胞凋亡之藥物。
- 如請求項17之用途，其中該藥物係經靜脈內投與。
- 如請求項17之用途，其中該藥物進一步包含樹狀體。
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