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TWI441591B - 使植物表現後天性高溫逆境耐受性狀的方法及其應用 - Google Patents

使植物表現後天性高溫逆境耐受性狀的方法及其應用 Download PDF

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TWI441591B
TWI441591B TW99130236A TW99130236A TWI441591B TW I441591 B TWI441591 B TW I441591B TW 99130236 A TW99130236 A TW 99130236A TW 99130236 A TW99130236 A TW 99130236A TW I441591 B TWI441591 B TW I441591B
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Shawjye Wu
Lianchih Wang
Shinjye Wu
Chinghui Yeh
Chunan Lu
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Description

使植物表現後天性高溫逆境耐受性狀的方法及其應用
本發明是有關於一種使植物表現高溫逆境耐受性的方法，特別是有關於一種使轉基因植物表現出具有後天性高溫逆境耐受單一性狀的方法及其應用。
當植物生長在最適合的環境下，其生長繁殖為最旺盛，但因為植物不能自由改變生長的位置，外在環境的變化會直接影響植物的生長發育而造成損傷。環境中非生物性的逆境，如水分的逆境有乾旱或水災、溫度的逆境有高溫或寒冷、另外還有化學藥劑、重金屬、過氧化物等也會對植物造成傷害，這些傷害會抑制植物的生長，甚至使植物死亡。因此了解植物如何對抗對環境逆境，有助於農作物品種改良，增加農作物產量及品質(Wang et al. 2003)。
當前全球氣候異常改變，許多地區的溫度較之以往明顯上升或下降。例如在溫室效應的情況下，高溫逆境為主要影響植物生長的因素，且氣候暖化直接影響到的就是生態及糧食問題。過去對於植物抵抗高溫逆境的研究，主要集中在熱休克蛋白(Heat shock protein；HSP)；當植物處在比最適生長溫度高但非致死的高溫中，植物組織細胞會產生熱休克反應(Heat shock response)，使植物細胞產生大量熱休克蛋白，扮演分子伴侶(molecular chaperon)的角色，幫助細胞將因高溫而產生變性(denature)的蛋白質重新折疊(refolding)，並預防新合成的蛋白質錯誤折疊(misfolding)或聚集(aggregating)，使細胞維持正常的生理功能(Sun et al. 2002,Charng YY 2006,Banu EFEOLU 2009)。藉由上述機制，可幫助植物在面對短時間致死性的高溫逆境後繼續生存。
然而環境中除了短時間的高溫逆境，還有持續性的長時間高溫逆境，而植物如何在持續的長時間高溫逆境下生存與面對此種逆境的調控機制，目前尚未有完整的研究。由於環境逆境會影響植物生長，造成農作物的損傷，了解植物如何對抗持續性長時間高溫逆境的機制有助於農作物品種改良，增加農作物產量及品質(Wang et al. 2003)。
一般而言，欲提升植物後天的高溫逆境耐受能力可從兩種方法做起，一是以雜交及自然突變的方式篩選具有耐受高溫逆境能力性狀的植物；或是以分生技術異源或同源表達多個熱耐受相關蛋白來達成。
本發明之一態樣是在提供一種使植物表現後天性高溫逆境耐受性狀的方法，包含將一段可編碼產生細胞核輸出受體蛋白1A(nuclear export receptor 1A；簡稱EXPORTIN1A或XPO1A蛋白)的去氧核糖核酸片段，轉殖入一不具耐受高溫逆境性狀或耐高溫性不佳的植物細胞中，藉由表達外源性XPO1A蛋白，使轉殖株表現出可耐受高溫逆境的單一性狀，在面對高溫逆境後維持生長。
本發明之另一態樣是提供一種選殖轉基因植物的方法，利用可編碼產生XPO1A蛋白的去氧核糖核酸片段作為選擇性標幟(selection marker)構築於載體上並導入植物組織細胞，即可配合預馴化(pre-acclimation)處理及熱休克(heat shock)處理，選殖轉基因植物細胞。
依照本發明實施方式之一或多個實施例，可轉譯出XPO1A蛋白的去氧核糖核酸序列包含XPO1A 基因或與其同源且可編碼為XPO1A蛋白之序列；或與阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana )的XPO1A 同源且可編碼為XPO1A蛋白之序列。其中可轉譯出XPO1A蛋白的去氧核糖核酸片段係來自於阿拉伯芥的染色體DNA或人工合成。
依據本實施方式之一實施例，可編碼產生XPO1A蛋白的去氧核糖核酸可為具有序列編號：1(SEQ ID. NO:1)、序列編號：2之或序列編號：3之去氧核糖核酸序列的片段。
依據本實施方式之一實施例，選殖轉基因植物之預馴化處理為將植物幼苗培養於預馴化溫度中，再將該植物幼苗移至該植物幼苗之最適生長之溫度中培養。其中預馴化溫度係高於植物幼苗之最適生長溫度。
依據本實施方式之一實施例，選殖轉基因植物的方法之熱休克處理溫度為大於等於預馴化溫度，並且可使未成功轉殖之植株細胞死亡的最低溫度以上的溫度。
根據上述可知，本發明實施例之方法的特點在於僅需於轉基因植物組織細胞中表達外源性XPO1A蛋白，即可使植物產生後天耐受高溫逆境性狀，不需以人為方式額外表達其他熱耐受性相關蛋白，更非應用表達習知的高溫逆境蛋白來達成使植物具有高溫逆境性耐受的目的。
更特別的是，含有可編碼產生XPO1A蛋白的去氧核糖核酸片段、或含有序列編號：1、序列編號：2或序列編號：3所示序列之去氧核糖核酸片段的轉殖株，只表現出可耐受高溫逆境之單一性狀，而不影響植物在正常生理條件下的生長。
因此，利用在植物組織細胞中表達外源性XPO1A蛋白，可使轉基因植物產生耐受高溫逆境之單一性狀的特性，應用於選殖轉基因植物，配合本發明提出之預馴化處理及熱休克處理，具有取代抗藥基因等傳統選擇性標幟的潛力。
以下將分為兩大部分闡述本發明實施態樣之應用基礎及可行性：第一部分為揭示阿拉伯芥突變株之高溫逆境耐受性等生理試驗測試，以建立XPO1A蛋白可使植物表現後天性高溫逆境耐受性之應用基礎；第二部分則應用第一部分之測試結果，以實施例佐證可編碼產生XPO1A蛋白的去氧核糖核酸片段轉殖入植物細胞中對使轉殖株之耐受高溫逆境的效應，並提供可行之誘導轉殖株表現出可耐受高溫逆境的性狀的方法，以供產業應用。
第一部分：XPO1A蛋白功能分析 (一)、喪失熱耐受性之阿拉伯芥突變株之取得
阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)的基因體在西元2000年已被定序完成，係由五對染色體所組成，總共有114.5Mb。阿拉伯芥的生命週期短、體積小且產生子代數目大，因此被廣泛應用在遺傳學、分子生物學實驗上。此外由於阿拉伯芥容易以農桿菌進行轉殖，目前也累積了相當數量的突變株以及基因體資源(Gepstein et al.1995)。關於阿拉伯芥的生態型(ecotypes)如Columbia(Col)、Landsberg erecta(Ler)、Wassilewsdiaja(Ws)及不同的生態型的基因體之間的多型性(polymerphism)等相關資訊，所屬技術領域具有通常知識者均可在許多相關的網路或圖書館資源中取得；例如網站：http：//www.arabidopsis.org。
為了找出植物耐受高溫逆境之必要基因，以期運用於農作改良，本發明實施方式係利用前向式遺傳學(forward genetics)的策略，從阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana encotype Columbia；Col-0)篩選出一株對高溫逆境失去耐受性之突變株(heat intolerant，hit2 )。藉由遺傳定位的方式，確認其性狀是因為編碼為XPO1A蛋白的基因(XPO1A ,At5g17020)發生由G變A之點突變，造成其所編碼之蛋白質的第364個胺基酸，由原先之色胺酸(tryptophan)的編碼(TGG)變為不成熟之終止點(TGA)，從而使此阿拉伯芥突變株對高溫逆境失去耐受性。
根據阿拉伯芥之基因體分析，阿拉伯芥具有兩個XPO1 基因，XPO1A 及XPO1B 基因。一般咸認為兩個XPO1 基因的功能應為相同，可彼此(或與其他相關基因)產生互補或協同功能之性狀表現。
從基因序列在遺傳上的保留性來推測基因產物的功能，XPO1A 基因之產物XPO1A蛋白為一細胞核轉運接受器(nuclear transport receptor)，負責將核內物質轉運至核外，然而其在阿拉伯芥等植物細胞中的真實功能，目前仍未有全面的瞭解，亦從未有XPO1A蛋白與植物細胞可專一性對抗高溫逆境的認識或發現。
以目前對細胞核轉運接受器功能的研究顯示，細胞核轉運接受器通常藉由辨認某些蛋白質的特定胺基酸序列來轉運目標蛋白質。因此，一個細胞核轉運接受器一般可辨認具有某些特定胺基酸序列的多個蛋白質，因而負責一個以上物質之轉運；相對的，同一個物質也可以經由一個以上可辨認相同特定胺基酸序列的不同細胞核轉運接受器來運輸，故通常一個細胞核轉運接受器的基因發生突變，可能會被具有相同功能之細胞核轉運接受器產生功能上的互補，而不會表現出特殊性狀；另一方面，則可能一個細胞核轉運接受器的基因發生突變，而影響到多種物質的運輸，造成突變株表現出多重性狀改變的情況。
以下將藉由下列之方法，來分析XPO1A蛋白之耐熱機制，包括：
1、鑑定阿拉伯芥突變株之遺傳特性；
2、阿拉伯芥突變株之高溫耐受性的生理試驗；以及
3、阿拉伯芥XPO1A蛋白於植物組織中的表現。
(二)突變株之顯隱性及單一突變鑑定
喪失高溫耐受性的阿拉伯芥突變株之遺傳特性分析，可包含利用突變株與不同品系的阿拉伯芥野生株雜交及突變株之突變點的定位選殖等方法來鑑定突變株為顯性或隱性突變、突變株之突變點所在之位址。
為了確認喪失高溫耐受性的阿拉伯芥突變株為顯性或是隱性的突變、以及突變株為單一或是多點的突變，可利用hit2 突變株(來自Col-0背景)為雄配子，與Col-5(葉面上無毛的Columbia品系)為雌配子雜交，由於葉面上有無長毛為隱性的突變，如果雜交成功，從Col-5收到的種子植株應為葉面上長毛，且收到的F1 種子之染色體為一股帶有hit2 突變株染色體，另一股帶有Col-5染色體，可藉以鑑定hit2 突變株為顯性或是隱性的突變、以及突變株為單一或是多點的突變。
表一為阿拉伯芥突變株及exportin 1b(xpo1b -1 )突變株之基因分析，鑑定喪失高溫耐受性之阿拉伯芥hit2 突變株之顯隱性。鑑定方法為將野生株與hit2 突變株雜交之F1 、Col與hit2 的種子消毒後播種於MS培養基上並於22℃環境培養。之後取10日齡的植株，以37℃處理3天後觀察其表現型。另外留下一些F1 的種子，種植在土裡收F2 的種子，接下來以相同的方法處理F2 後觀察表現型變化。以143株野生株、140株hit2 突變株、57株hit2 與Col-5 F1 雜交(hit2 ×Col-5 F1 )、以及440株hit2 與Col-5 F2 雜交(hit2 ×Col-5 F2)的植株進行分析。
由表一可看出，10日齡的植株以37℃處理3天後於22℃培養約5-6天後，143株野生株(Col-0)全數持續生長，hit2 突變株則全數白化死亡(140株植株之高溫耐受度為0)，而hit2 ×Col-5 F1 為異合子，具有一股帶有野生株的染色體及一股帶有hit2 突變株的染色體，則全數持續生長(57株植株，存活57株)。而F2 之表現型(hit2 ×Col-5 F2 )在440株測試的植株中，其中有327株可以持續生長，133株呈現對長時間的熱處理敏感而產生白化死亡。由於F2 之表現型持續生長與白化死亡的比率為2.89：1，根據孟德爾遺傳學定律，可確認hit2 突變株為單一隱性突變。
根據表一，本發明經由前向式遺傳學方式，找出了XPO1A 基因及其產物XPO1A蛋白對植物細胞抵抗長期高溫逆境具有專一性的特殊耐熱機制，且亦確認了在XPO1A 單一基因突變下，即可造成植物對高溫敏感的性狀。
(三)突變株之突變點定位及圖譜
由於本發明之突變株是由化學性致突變劑甲基磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate；EMS)造成的點突變，因此使用以遺傳圖譜為基礎的基因選殖法(map-based cloning,MBC)來定位突變點的位置，此法又稱為定位選殖(positional cloning)。基因選殖法的原理為當細胞進行減數分裂時，姐妹染色體(sister- chromatin)之間會產生交叉(crossing-over)，使染色體產生不均等片段的交換，稱為遺傳重組(genetic recombination)，藉由計算基因之間染色體交換率(recombination frequency)可推測出兩基因間之相對位置；當染色體上的兩基因體位置(locus)相近則其共分離率(co-segregation)較高，染色體交換率低；而基因體位置相距較遠則共分離率低，染色體交換率較高。藉著在已知基因體位置上設計分子標記(makers)，並計算其染色體交換率與突變株表現型之間的關係，進而可推算出突變點的位置。即，當分子標記的交換率越大，則其離突變點位置越遠，交換率越小離突變點越近(Jander et al. 2002,Peters et al. 2003)。
分子標記之選定係以具有生態型專一性的基因標記(genetic markers)定位出本發明之突變株hit2 的突變位址。首先分別在5條染色體上各找出2組基因標記，測試突變株hit2 與那一條染色體上的基因標記具有較小之交換率，再於此標記兩側尋找其他標記，逐一將範圍縮小。
物種間生態型的差異可包含但不僅限於利用簡單序列長度多型性(simple sequence length polymorphism,SSLP)及限制酵素切割擴增片段多型性(cleaved amplified polymorphic sequence；CAPS)來分析。例如簡單序列長度多型性為利用不同生態型的個體間基因體有插入或缺失(insertion and deletion,InDels)的基因體多型性，造成不同生態型的同樣基因體位置片段大小不同。實驗上以聚合酵素連鎖反應(polymerase chain reaction,PCR)將該片段倍增，比較片段大小的不同來分辨生態型的差異。(Ponce MR 1999,Lukowitz W et al. 2000,Peters et al. 2003)。SSLP與CAPS是目前最為廣泛應用的分子標記方法，其共同特點為共顯性(co-dominant)的分子標記，可以辨認阿拉伯芥之兩條染色體，因此在進行實驗時可以提供充分的資訊；且SSLP與CAPS皆為以PCR為基礎，只需要使用瓊脂膠電泳(agarose gel electrophoresis)便可進行數據分析(Lukowitz W.et al. 2000)，操作上十分簡便省時，費用也較低。具有生態型專一性的基因標記可於TAIR網站(http://www.arabidopsis.org)上搜尋、或於Cereon Arabidopsis Polymorphism Collection網站(http://www.arabidopsis.org)下載已建檔之阿拉伯芥之去氧核糖核酸多型性資料庫，挑選出具有插入或刪除區段(insertion and deletion；InDel)或單核苷酸變異多型性(single nucleotide polymorphism；SNP)者，分別與Columbia生態型及Landsberg生態型之基因體序列比對，確認具有InDel或SNP之去氧核糖核酸多型性後，設計適合之引子(primer)以供進行SSLP或CAPS使用。上述之物種間生態型的差異分析及選擇具有生態型專一性基因標記的方法，此領域中具有通常知識者在不需過度實驗的情況下，可利用習知操作程序達成。
根據本發明實施例，定位之結果推知hit2 突變點坐落於阿拉伯芥第五對染色體，與分子標記so262有較低的染色體交換率17.8%，再經過更進一步分子標記染色體交換率分析後，hit2 突變位置在nga151 與Cer456932之間1.3Mb的距離處(Wang,2006)。本發明選擇nga 151 作為染色體上之基因標記，接著再將hit2 突變位置縮小至40kb，並進行基因體定序，找出造成hit2 突變株表現型的突變基因為XPO1A 。上述之基因操作方法，此領域中具有通常知識者可根據分子生物學技術操作之慣例，在不需過度實驗的情況下，選擇適當之操作手段即可達成；或根據與具有本發明相同技術內容之並主張新穎性優惠期限之學術論文“Isolation and characterization of the Arabidopsisheat-intolerant 2 (hit2 ) mutant reveal the essential role of the nuclear export receptor EXPORTIN1A(XPO1A) in plant heat tolerance”(New Phytologist(2010) 186:833-842或網址www.newphytologist.com)，此論文之所有內容亦全部併入於本說明書中。
請參照第1圖，為喪失高溫耐受性的阿拉伯芥突變株(hit2 )所在之去氧核糖核酸重組圖譜。其中，(A)部分標示hit2 突變株之突變位置，並以與突變位置相鄰的nga 151 作為染色體上之SSLP Marker；(B)部分為(A)部分所涵蓋之HIT2 區域之放大圖，其中HIT2 涵蓋之區域約為20 kb之片段大小，共有5個部分重疊(overlapping)的片段所組成，並於相對位置上標示其分子量(垂直線部分)之大小，括號中表示的數字則為其實際位於第5條染色體上之位置號碼；(C)部分為(B)部分所涵蓋的片段中，介於第5條染色體上標示CER483173與CER483157之間的約5 Kb大小的片段，以黑色顯示之區域為阿拉伯芥第5條染色體之At5g17020基因，其含有單一鹼基發生突變；(D)部分為突變株之At5g17020基因的外顯子-內含子結構(Exon-intron structure)，於At5g17020有一額外的T－DNA插入的對偶基因(alleles)片段，此外，亦標示了與At5g17020相鄰的xpo1a-1 及xpo1a-3 ；(E)部分為(D)部分所示之突變株之第1092鹼基處由G置換為A的單點突變情形。
根據第1圖(A)部分圖式所示，hit2 突變株之突變位置坐落於阿拉伯芥第5條染色體上一段3MB之區域中，與染色體上之nga151 相近。
(B)部分係繪示(A)部分所涵蓋之HIT2區域之放大圖，其中HIT2涵蓋之區域約為20 kb之片段大小，可再進一步定位出一段含有HIT2之突變區域之約5 Kb大小的片段。
(C)部分係顯示(B)部分所涵蓋的5 Kb片段為介於第5條染色體上標示CER483173與CER483157之間，經過解序並與野生株進行比對，發現位於阿拉伯芥第5條染色體之At5g17020位置(以黑色顯示)上有單一鹼基發生突變，經比對確認為XPO1A 基因。
(D)部分為(C)部分所示之阿拉伯芥突變株的At5g17020(約0.5Kb)基因放大圖，所含的外顯子-內含子結構以黑色方塊表示，阿拉伯芥高溫耐受性突變株在第13個exon處具有一由G置換為A的單點突變。
(E)部分為(D)部分所示之阿拉伯芥突變株之基因At5g17020於第1092鹼基處的由G置換為A的單點突變情形，顯示喪失高溫耐受性的阿拉伯芥突變株是由於XPO1A 基因突變，在其所編碼的第364個胺基酸處由G置換為A而產生了終止子，形成長度不完全的截斷XPO1A蛋白(truncated XPO1A)而影響了XPO1A所負責的生理的功能。
第1圖之(F)部分為xpola-1 與xpola-3 突變株之高溫耐受性表現型分析。10天齡的野生株及阿拉伯芥突變株在37℃培養4天後，xpola-1 與xpola-3 突變株之表現型；(G)部分則為野生株及喪失高溫耐受性的阿拉伯芥突變株經過44℃、20分鐘熱休克處理後8天的表現型。(F)部分之結果顯示在37℃培養4天後，只有野生株能存活下來，突變株全數死亡；(G)部分之結果顯示在經過44℃、20分鐘熱休克處理後8天，只有野生株能存活下來，突變株全數死亡。
(四)阿拉伯芥突變株之生理試驗：
為了揭示XPO1A 基因在植物對抗持續性長時間熱逆境所扮演的角色，以下進行一連串植物生理實驗，以喪失高溫耐受性之阿拉伯芥突變株與野生株比較，以確認XPO1A 基因之真實功能，包括：熱休克處理對突變株與野生株之表現型影響、阿拉伯芥野生株與突變株對持續高溫處理及短時間熱休克處理的敏感度、經歷不同方式的高溫處理後阿拉伯芥野生株及突變株幼苗後續生長情況及存活率、阿拉伯芥野生株及突變株對氧化性壓力之敏感度、高溫逆境所誘導之氧化性壓力及光照對阿拉伯芥野生株及突變株之影響等各種分析比較。
1、熱休克處理(Heat Shock)對突變株與野生株之表現型影響：
當植物處於非致死性的高溫時，會產生熱休克反應(heat shock response)，而熱休克反應會使細胞產生熱休克蛋白來幫助植物度過致死性的高溫逆境。由於喪失高溫耐受性之阿拉伯芥突變株hit2 是以長時間持續性的高溫為基礎篩選出來的突變株，因此可以藉由熱休克處理，觀察植株是否能產生熱休克反應來幫助植物度過致死性的高溫逆境，可有助了解植株在面對長時間持續性高溫的反應機制與面對短暫的高溫壓力之反應機制之間是否有關聯性。
第2圖為喪失高溫耐受性之阿拉伯芥突變株對於持續高溫處理及短時間熱休克處理的敏感度分析。其中(A)部分包含阿拉伯芥野生株(Wild type)與喪失高溫耐受性之阿拉伯芥突變株(hit2 )之幼苗，在以37℃之長時間熱處理前(左圖)、及經過37℃之長時間熱處理後培養4天(右圖)的對照照片；(B)部分為7日齡之阿拉伯芥野生株與喪失高溫耐受性之突變株，已具有展開之子葉(open eudicotyledons)及真葉(first pair of leaves)的植株，於44℃熱休克處理20分鐘後，植物恢復於室溫培養以恢復其生理運作(recovery)後，分別於培養第0、2、4及6天紀錄之幼苗表現型的演變。
第2圖(A)部分顯示，在以37℃之長時間熱處理前(左圖)，阿拉伯芥野生株(Wild type)與喪失高溫耐受性之阿拉伯芥突變株之幼苗生長情況無明顯差異；而經過37℃之長時間熱處理後持續培養4天，其中野生株不受影響持續生長，但對喪失高溫耐受性之突變株會產生致死作用。另外第2圖(B)部分則顯示，於44℃熱休克處理20分鐘，再將植物恢復於室溫培養之後的6天內，可觀察到野生株不受影響持續生長，而喪失高溫耐受性之突變株則無持續生長跡象，並於第4天開始枯黃，第6天即完全白化(bleached)死亡。
2、熱休克處理及預馴化處理(pre-acclimation)對突變株與野生株經歷高溫逆境後的存活率影響：
第3圖為經歷不同方式的高溫處理後，阿拉伯芥野生株及突變株幼苗之後續生長情況及存活率分析結果。第3圖最上方係繪示四種不同處理方式與處理時間(heating regimens)之簡圖，將7日齡的阿拉伯芥野生株及突變株幼苗分為處理(A)、處理(B)、處理(C)及處理(D)，各不同處理方式下方則顯示經過處理後的野生株及突變株之照片，最後將存活率分別計算於不同處理方式之最下方。存活率之計算係以經過上述處理後，仍持續生長綠色葉子的植株數量來計算。
其中，處理(A)為植株經過44℃處理30分鐘後，再於室溫持續培養至第8天之生長情況及存活率計算；處理(B)為植株經過44℃處理45分鐘後，再於室溫持續培養至第6天之生長情況及存活率計算；處理(C)為植株先經過37℃、60分鐘之預馴化處理後，於23℃培養60分鐘，再以44℃處理45分鐘後，於室溫持續培養至第8天之生長情況及存活率計算；處理(D)為植株先經過37℃、60分鐘之預馴化處理後，於23℃培養2天，再以44℃處理90分鐘後，於室溫持續培養至第8天之生長情況及存活率計算。
第3圖之結果顯示，經歷處理(A)之植株於44℃處理30分鐘後，野生株的生長略受熱休克處理的影響，存活率為95%，突變株則全部無法在經歷過處理(A)之熱休克處理後存活；而不論是野生株或突變株，經歷處理(B)之44℃、45分鐘之熱休克處理後，於室溫持續培養時均無法繼續生長，至第6天時已全部死亡。
然而，當野生株或突變株以處理(C)之方式，先將植株以37℃預馴化處理60分鐘後，於23℃培養60分鐘，再以44℃、45分鐘之熱休克處理，可發現喪失高溫耐受性之阿拉伯芥突變株與野生株一樣，可於熱休克處理後繼續存活。同樣的情況亦發生於以處理(D)之方式處理的野生株或突變株，植株先以37℃預馴化處理60分鐘後於23℃培養2天，再給予44℃、90分鐘之持續高溫熱休克處理，結果不論是突變株或野生株，均可於不受影響繼續存活。因此，由第3圖之結果可看出，喪失高溫耐受性之阿拉伯芥突變株的幼苗，其先天抵抗高溫逆境的能力雖然受到影響，但仍可受到後天之預馴化產生對高溫之耐受能力，顯示預馴化處理可扮演使植株產生熱休克反應之環境逆境，使細胞產生熱休克蛋白以因應高溫造成的蛋白質功能不彰或導致生理現象改變，從而可幫助植物度過後續的致死性長時間高溫逆境，大幅提高存活機會。
3、氧化性壓力對突變株與野生株之表現型影響：
第4圖為阿拉伯芥野生株與突變株之種子於23℃持續光照下，於含有可容許種子發芽之不同甲基紫(methyl viologen；MV)濃度的瓊脂培養基上培養之生長發育情況。甲基紫為一種常用的誘導之植物細胞產生氧化性壓力之試劑。第4圖依照數據呈現方式可大致分為兩部分，一部分為(A)-(C)，顯示阿拉伯芥野生株與突變株受到甲基紫抑制發芽或生長之曲線分析圖；另一部分為(D)，顯示阿拉伯芥野生株與突變株受到甲基紫抑制生長之情況的實際照片。
第4圖之(A)、(B)及(C)中，標示()之曲線代表阿拉伯芥野生株之種子或幼苗，標示()之曲線代表喪失高溫耐受性之阿拉伯芥突變株之種子或幼苗，各點之數據計算係以一個培養皿放置60個種子，且每一種處理方式至少進行三重複之結果。校正棒(Error bars)　顯示所有實驗的標準偏差；第4圖(D)為阿拉伯芥野生株及突變株的幼苗表現型，於含有0.5μM之培養基中生長14天後的實際照片，照片中的所有植株係取自於同一個培養基中。
其中，第4圖之(A)為經過不同濃度(0.1-0.6μM)之甲基紫處理後的阿拉伯芥野生株與突變株之種子發芽率的比較圖。種子發芽率(%)之計算，係於種子發芽10天後，計算目視可看到凸出根部(protruding radicals)的數量；(B)為經過不同濃度(0.1-0.6μM)之甲基紫處理後的阿拉伯芥野生株與突變株之幼苗成熟率(%)，即長出展開綠色子葉(green opened cotyledons)的比率的比較圖。幼苗成熟率(%)之計算，係於培養14天後，計算長出綠色子葉的種子數量；(C)為阿拉伯芥野生株與突變株幼苗於含有0.5μM甲基紫的瓊脂培養基上生長情況之比較圖，其中橫軸為生長天數。
由第4圖(A)的結果可得知，經過不同濃度(0.1-0.6μM)之甲基紫處理後，阿拉伯芥野生株與突變株之種子發芽率呈現相似的情況，顯示以0.1-0.6μM之濃度的甲基紫處理阿拉伯芥野生株與突變株之種子，不會對種子發芽產生明顯影響。
第4圖(B)的結果顯示，隨著甲基紫處理之濃度提高，明顯對阿拉伯芥突變株之幼苗成熟(長出展開的綠色子葉)產生不利影響，相較於阿拉伯芥野生株，突變株對於甲基紫誘導之氧化性壓力(methyl viologen-induced oxidative stress；MV-induced oxidative stress)更為敏感。
第4圖(C)的結果顯示，於含有0.5μM甲基紫的瓊脂培養基上生長之阿拉伯芥野生株與突變株，從第7-8天開始，阿拉伯芥突變株之幼苗成熟率呈現下降情況，可能由於突變株之展開的綠色子葉已經開始邁向衰老，而阿拉伯芥野生株則維持穩定之生長，並未有明顯下降情況。第4圖(C)的結果亦可佐證先前於第4圖(B)所觀察到的阿拉伯芥突變株對於甲基紫誘導之氧化性壓力較野生株更為敏感的現象。
第4圖(D)之照片可看出阿拉伯芥突變株並未持續長大並呈現白化的現象，而野生株則維持正常之綠色，且植株發育得比較好。
4、高溫逆境誘導之氧化性壓力及光照對阿拉伯芥野生株與突變株存活率之影響：
前述之第4圖已證實了阿拉伯芥突變株對氧化性壓力較野生株敏感，以下則藉由在光照或黑暗條件下，面對高溫逆境後的幼苗存活率來佐證阿拉伯芥突變株之xpo1a 突變是否與高溫逆境所誘導的氧化壓力敏感有關，並揭示阿拉伯芥突變株幼苗在遭遇高溫逆境之存活率是否會受光照之影響，以確認exportin 1A所參與之耐熱機制與高溫所產生之氧化壓力之間的關係。
第5圖為阿拉伯芥野生株及突變株在光照或黑暗條件下於面對高溫逆境後的幼苗存活率比較圖。其中，高溫逆境之處理方式包括處理方式A：以10日齡的植株，在有光照或黑暗條件下(以鋁箔紙包覆培養基之方式避光)，生長於37℃環境並持續培養4天後之存活率分析(圖中左邊部分)；處理方式B：以7日齡的幼苗於44℃處理20分鐘後，將植株移往23℃之培養環境，並在光照或黑暗條件下生長6天之存活率分析(圖中右邊部分)。存活率之計算係以經過上述處理後，仍持續存活的植株數量來計算，每一數據係為6重複實驗之平均值，並以校正棒顯示所有實驗的標準偏差。圖中標示“＊”符號係代表植株之存活率為零。
第5圖處理方式A之結果顯示，在避光環境下，可顯著提高阿拉伯芥突變株幼苗在高溫逆境(37℃培養4天)中的存活率達90%以上；而在光照環境下(標示“＊”符號處)，阿拉伯芥突變株幼苗在高溫逆境中的存活率為零。第5圖處理方式B之結果顯示，當阿拉伯芥突變株幼苗面對熱休克壓力(44℃處理20分鐘)時，如移至23℃之光照環境下持續培養，阿拉伯芥突變株幼苗的存活率仍為零(標示“＊”符號處)；然而如移至23℃之避光環境下培養時，則可恢復部分生理活性，產生存活率略為提昇約10%之現象。
根據第5圖所示之現象，顯示阿拉伯芥突變株幼苗在經歷熱休克時，可能快速地產生比高溫誘導之氧化壓力傷害更為嚴重的生理壓力，使光照培養對幼苗存活率的不利影響更為顯著。綜合上述結果，阿拉伯芥突變株之表現型可至少一部分歸因於欠缺充分之反應能力來對抗氧化傷害，而顯著地影響了幼苗在持續高溫逆境下的存活率，但對於保護植物對抗短時間的高溫熱休克時產生的影響則不大。由於高溫逆境會造成植物細胞活性氧的過度產生，而光照則會加強化活性氧的傷害，因此根據第5圖揭示之黑暗中生長之阿拉伯芥突變株比在光照下生長之植株具有更佳之熱逆境耐受性之結果，可說明XPO1A蛋白應具有讓植物耐受因高溫所造成的氧化壓力的作用。
(五)阿拉伯芥XPO1A蛋白於植物組織中的表現及其耐熱機制分析：
根據遺傳序列之保留性，XPO1A蛋白可歸類為輸入蛋白β-類細胞核轉運蛋白接受體家族(improtin β-like nuclear transport receptor super family)之成員，可與一種以上具有富含白胺酸之核輸出訊號胺基序列(leucine-rich nuclear export signals;leu-rich NESs)的蛋白質反應，將蛋白質輸送至細胞核外。此外，XPO1亦負責引導許多種類的RNA通過核被膜(nuclear envelope)，以及蛋白質在細胞核與細胞質之間的進出。
由於細胞核轉運接受器具有調節熱休克轉錄因子(heat shock factor)在細胞質與細胞核之不同空間中動態濃度平衡之能力，而熱休克因子則會影響抗氧化基因之轉錄，為了確認XPO1A蛋白與細胞熱休克反應之間的關係，可以抽取阿拉伯芥野生株之不同組織細胞的總核糖核酸(total RNA)，以專一性引子對(序列編號：4及序列編號：5)針對XPO1A 基因之轉錄作用進行反轉錄聚合酶連鎖反應(Reverse transdcriptional-polymerase chain reaction；RT-PCR)，並將增幅出之互補去氧核糖核酸(cDNA)以凝膠電泳分析之。
第6圖為阿拉伯芥野生株之各組織中XPO1A蛋白的基因表現分析。其中，第6圖之(A)部分為於23℃之環境下培養的阿拉伯芥野生株，於不同組織細胞中抽取之總核糖核酸(total RNA)並以序列編號：4及序列編號：5之專一性引子對進行反轉錄聚合酶連鎖反應之結果，內控制組(internal control)為分別抽取自相對應之組織的聚泛素(Poly-ubiquitin；UBQ10) RNA，以聚泛素之專一性引子對(Leeet al .,2006)進行RT-PCR；其中，凝膠電泳膠片之泳道1-6分別代表的組織為根部(root)、叢生葉(rosette leaf)、莖上的葉子(cauline leaf)、莖(stem)及花(flower)。
第6圖之(B)部分為10日齡之阿拉伯芥野生株幼苗於37℃之環境下培養0-48小時後，於不同時間點抽取之總核糖核酸，並以序列編號：4及序列編號：5之專一性引子對進行反轉錄聚合酶連鎖反應之結果，正控制組(positive control)為於相對應時間點時植株的熱休克蛋白17.6A(At-HSP17.6A )表現結果，內控制組為抽取自相對應時間點時植株的聚泛素表現結果。其中，凝膠電泳膠片之泳道上方所示數字分別代表植株被移至37℃後培養的小時數。從第6圖(A)可得知於23℃之培養環境下，阿拉伯芥的XPO1A 基因可於各個不同組織中表現，亦顯示XPO1A蛋白可於孢子體組織(sporophytic tissues)中表現；而第6圖(B)之結果顯示，雖然熱休克蛋白17.6A在經過高溫誘導後第6小時才大量表現，然而XPO1A蛋白之表現則自被移至37℃後開始至第48小時均呈現相對一致的情形，顯示XPO1A 基因對植物所遭遇之長期性高溫逆境具有專一性，XPO1A 基因應具傳遞熱逆境訊息因子之能力，且必然負責著某分子於細胞核/質內外之間的動態平衡，而此未知分子對植物耐受高溫亦必有關鍵之作用。根據上述表一及第1-6圖所示之分析結果，意謂著在高溫環境下，阿拉伯芥中的XPO1A蛋白和XPO1B蛋白兩者所負責的生理功能有所不同，且XPO1A對植物之正常生長為非必要，但對植物耐受高溫逆境則為絕對必要。對於相關技術領域之習知常識來說，XPO1A蛋白具有此種功能實為特殊且為一全新的概念。
第二部分：應用及實例
因此，利用此一全新的概念，本發明之一實施方式為將一段可編碼產生XPO1A蛋白的去氧核糖核酸片段轉殖入一植物細胞中，藉由使含此去氧核糖核酸片段的轉殖株表達外源性XPO1A蛋白，表現出可耐受高溫逆境的單一性狀。
本文中所述「可編碼產生XPO1A蛋白的基因」，為XPO1A 基因或與XPO1A 基因同源(homology)且同功(analogy)之序列。上述序列可透過轉殖方式由適當的植株中取得，或是可以人工合成DNA方式來獲得此序列。適於本發明之可用以獲取XPO1A 基因或與XPO1A 基因同源且同功序列的植株，可包含但不僅限於十字花科植物，十字花科植物例如可為阿拉伯芥。此領域中具有通常知識者可在不需過度實驗的情況下，利用已知操作程序，獲取XPO1A 基因或與XPO1A 基因同源且同功之序列。
上述「XPO1A 基因或與XPO1A 基因同源且同功之序列」，包括序列編號：1所示的序列、其互補序列(complementary sequences)以及保留性類似物(conservative analogs)，例如具有簡併性密碼子取代(degenerative codon substitutions)的同源性序列(homologous sequences)。根據本技術領域之常識，簡併性密碼子取代可以經由在核酸序列中的一或多個被選定的密碼子的第3位置處替換。
在本發明之實施例中，以所獲取之XPO1A 基因或與XPO1A 基因同源且同功之序列構築可轉譯出EXPOTIN1A的去氧核糖核酸片段，並轉殖入植物組織細胞，成為可於抵抗高溫逆境並維持正常生長之轉基因植物。適用於本發明之植物組織細胞可包含但不僅限於十字花科植物、蕃茄等植物的之根、莖或葉的組織細胞。
適用於本發明之轉基因方法，包括但不限於利用載體、基因槍、顯微注射法、穿孔處理法或微脂粒融合法，將可編碼產生XPO1A蛋白的去氧核糖核酸片段轉殖入植物組織細胞中。
適用於本發明之載體，包括但不限於將可轉譯出EXPOTIN1A的去氧核糖核酸片段以質體(plasmid)或以可感染植物之植物病毒載體(Viral vectors)轉染於一植物組織細胞。
例如，利用細菌轉形(transformation)方式，將質體轉殖入植物細胞；可包含但不僅限於以土壤農桿菌(Agrobacterium tumefaciens )，將含有可轉錄轉譯出XPO1A蛋白之基因片段的Ti-plasmid，導入植物宿主細胞；或者，將含可轉譯出EXPOTIN1A的去氧核糖核酸片段構築於病毒載體，感染特定植物宿主細胞。在一實施例中，載體可至少帶有一去氧核糖核酸片段，具有如序列編號：1所示之序列的去氧核糖核酸片段。
具有可編碼產生XPO1A蛋白序列之去氧核糖核酸片段，可於XPO1A 基因、與XPO1A 基因同源且同功之序列、或序列編號：1所示之序列上游具有一啟動子區域，啟動子區域可包含持續表現型啟動子或誘導表現型啟動子。例如可為35S promoter，或AlcA promoter(enthanol-inducible system)。在一實施例中，包含於序列編號：1所示之序列上游具有一持續表現型啟動子，此具有可編碼產生XPO1A蛋白序列之去氧核糖核酸片段為具有序列編號：2所示序列的片段。在另一實施例中，包含於序列編號：1所示之序列上游具有一誘導表現型啟動子，此具有可編碼產生XPO1A蛋白序列之去氧核糖核酸片段為具有序列編號：3所示序列的片段。
除非特別指明，否則本文中所述「啟動子區域」涵蓋RNA聚合酶複合物(RNA polymerase)所辨識之啟動子序列、調節蛋白(regulator)所辨識之一或多個調節序列、持續表現型或誘導表現型啟動子序列、轉錄起始點序列。
此外，可根據不同植物種屬，將與XPO1A 基因同源之去氧核糖核酸序列替換為目標宿主之偏好密碼子，或替換宿主偏好之啟動子區域序列，以促進異源XPO1A蛋白的表達。
依照本發明之另一實施方式，係利用可編碼產生XPO1A蛋白的去氧核糖核酸片段作為選殖轉基因植物的選擇性標幟(selection marker)。將一含有欲轉殖之基因與此選擇性標幟的重組基因片段，轉殖入一植物組織細胞中，並藉由特定之預馴化處理及熱休克處理，選殖出表現可耐受高溫逆境的單一性狀之轉殖株。
以下將提供本發明之一實施例，說明本發明之方法及異源XPO1A 基因於轉基因植物中表現，對於提昇宿主耐受高溫逆境能力的效果。
實施例： (請提供可行之轉殖例) 一、質體(pCAMBIA1300-XPO1A )之構築
第7圖為質體(pCAMBIA1300-XPO1A )之構築流程圖。在本實施例中，係以阿拉伯芥之染色體為模版，利用引子對(序列編號6及序列編號：7)增幅XPO1A 基因，得到可編碼產生XPO1A蛋白序列之去氧核糖核酸片段，如序列編號：2所示之去氧核糖核酸片段。
增幅出之片段先以Nco I及Bam HI截切，再與經由同樣限制酶剪切的載體pLOLA利用T4 接合酶(T4 DNA ligase)以適當比例進行接合，得到構築完成的pLOLA-35S-XPO1A -nos質體。
以Kpn I截切pLOLA-35S-XPO1A -nos質體，可得到於XPO1A 基因上游具有啟動子區域片段(序列編號：8)、XPO1A 基因下游加入終止子(Terminator)片段(序列編號：9)，且5’端及3’端具有Kpn I切位的去氧核糖核酸片段，將此可編碼產生XPO1A蛋白序列之去氧核糖核酸片段再與經由同樣限制酶剪切的Ti-plasmid載體pCAMBIA1300，利用T4 接合酶(T4 DNA ligase)以適當比例進行接合，得到構築完成的pCAMBIA1300-XPO1A 質體(序列編號：10)上述質體選殖操作，可以包含但不限定以下列步驟完成：首先進行植物組織之訊息核糖核酸(mRNA)萃取，可以商品化套組(Genemark Plant Total RNA Miniprep Purification Kit)萃取，或以習知的植物mRNA萃取方法進行，萃取到之RNA存放於-70℃保存。接著以反轉錄方式將mRNA合成cDNA模板。利用商品化套組(SuperScriptTM II Reverse Transcriptase,Invitrogen)進行反轉錄反應。反應物及試劑依下述比例依序進行：第一階段：1 μl的Oligo dT(500μg/μl)、5 μl的RNA(1 ng-5 μg)、1 μl的dNTP混合液(10mM)、5 μl的DEPC無菌水，反應總體積為12 μl，反應條件為65℃反應5分鐘後，以4℃終止反應。第二階段：4 μl的5倍first-strand緩衝液、1 μl的RNase抑制劑(40單位/μ1)、2 μl的0.1M DTT，反應條件為42℃反應2分鐘。第三階段：加入1 μl(200單位)反轉錄酶(SuperscripII Reverse Transcriptase)，於42℃反應50分鐘，之後以70℃處理15分鐘終止反應並保存於4℃，再加入1μl(2單位)的RNasH，於37℃處理20分鐘，去除所有未反應的RNA，合成之cDNA模板存放於-20℃保存。
接著以聚合酶連鎖反應擴增XPO1A 基因。反應物及試劑依下述比例進行：0.5 μl的cDNA模板，依序加入0.4 μl的dNTP溶液(10 mM)、1 μl的10倍濃縮聚合酶緩衝液(10X-Taq DNA polymerase buffer)、各0.4 μl的引子對(序列編號6及序列編號：7)及0.1 μ1的 Taq-聚合酶(Taq DNA polymerase)，加入6.7 μl無菌去離子水，調整總體積為9.5 μl，置於聚合酶連鎖反應儀中進行聚合酶連鎖反應。反應條件為94℃反應10分鐘，94℃反應30秒、以下進行40個循環：65℃反應30秒、68℃反應1分30秒、68℃反應7分鐘，降溫至25℃終止反應。並以瓊脂醣膠體電泳觀察PCR之結果。
PCR產物回收可以瓊脂醣膠體電泳進行分離。將含有目標片段之膠體切下，並利用本技術領域中常用回收DNA的方法或商品化套組進行回收。回收後的產物即可進行後續之剪切及接合反應。
DNA分子剪切依照限制酶廠商提供之流程進行。取適量DNA樣品與滅菌去離子水、限制酶緩衝液混合均勻後，再加入適量限制酶混合均勻，於酵素最適反應溫度下反應。
DNA接合反應利用商業化套組(-T and-T Easy Vector Systems)及依照T4 接合酶廠商提供之流程進行。取質體-T vector DNA及欲嵌入之DNA片段以適當比例混合後與滅菌去離子水、接合酶緩衝液混合均勻後，再加入適量接合酶混合均勻，於酵素最適反應溫度下反應一段時間再終止反應，即可進行轉形作用，轉形入大腸桿菌之DH5α勝任細胞中。
二、由大腸桿菌次選殖至農桿菌
將pCAMBIA1300-XPO1A 質體由大腸桿菌轉形至農桿菌，可參照Hofgen,R.,and Willmitzer,L.(1988). Storage of competent cells for agrobacterium transformation. Nucl. Acids Res.所提供之方法進行，例如可以包含但不限定以下列步驟完成：
(一)農桿菌勝任細胞之製備：
以200毫升含有適當抗生素之LB培養基(Luria-Bertani)於28℃培養農桿菌(Agrobacterium strain GV3101 PMP90)隔夜，當菌生長至指數期(OD550 約0.5-0.8)，將菌液離心10分鐘，以滅菌的tris-EDTA緩衝液(TE buffer)清洗2次，再以原培養體積之1/10重新懸浮於新的LB培養基中，分裝成500μl之冷凍管中，以液態氮冷凍並保存於-80℃。
(二)質體轉形：
將農桿菌勝任細胞置於冰上，加入約10μl欲轉形之質體DNA，置於冰上5分鐘後，放入液態氮中5分鐘後，再置於37℃水浴5分鐘，之後加入1毫升之LB培養基，於28℃震盪培養2-4小時，將菌體以離心方式濃縮並塗佈於LB平板培養基，於28℃培養2天。
三、植物細胞轉殖
(一)植物材料以阿拉伯芥為例，將阿拉伯芥種子播於有機培養土中，在22℃/18℃，16hr/8hr光/暗生長室中培養。待約一週後，第一對真葉長出即可分種至二吋盆中，持續培養3-4週後，摘心。
(二)以農桿菌將質體pCAMBIA1300-XPO1A 轉形入阿拉伯芥組織細胞，以真空滲入轉形法(Agrobacterium -mediated vacuum infiltration transformation)進行。
挑取Agrobacterium 單一菌落，培養在5毫升含適當抗生素之YEP中，於28℃下培養隔夜。第二天，將菌培養於250毫升培養液中，使菌量增加。將菌液離心，去掉上清液，以新鮮配置的AIM(無血清)培養基(配方：1/2 MS salt+維生素B5+0.01 mg/L BA+500 mg/L MES+5% sucrose+0.02% silwet-77)，重新懸浮細胞(OD600 =0.6-1)
取花序15公分左右的阿拉伯芥植株，剪掉果莢及已開的花，並將花盆開口的部分封住以避免土壤掉落後，將植物倒扣使花序插入菌液中。抽氣(抽氣幫浦為GAST U.S.A. RAA-V 111-EB)15分鐘，接著讓植物平躺，置於黑暗中，隔天再立起。於22℃/18℃，16hr/8hr之光/暗培養約一個半月後可以收取種子。
雖然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
<110>國立中央大學
<120>使植物表現後天性高溫逆境耐受性狀的方法及其應用
<160>
<210>SEQ ID NO: 1
<211>3228
<212>DNA
<213>
<220>CDS
<223>XPO1A 基因序列
<400>1
<210>SEQ ID NO: 2
<211>3516
<212>DNA
<213>人工序列
<220>CDS
<223>可轉錄XPO1A的DNA片段
<400>2
<210>SEQ ID NO: 3
<211>32283453
<212>DNA
<213>人工序列
<220>CDS
<223>可轉錄XPO1A的DNA片段
<400>3
<210>SEQ ID NO: 4
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>primer
<223>進行RT-PCR反轉錄增幅部分XPO1A 之mRNA片段的引子(Foward)
<400>4
<210>SEQ ID NO: 5
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>primer
<223>進行RT-PCR增幅部分XPO1A 之mRNA片段的引子(reversed)
<400>5
<210>SEQ ID NO: 6
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>primer
<223>進行PCR增幅全長XPO1A 的引子(Foward)
<400>7
<210>SEQ ID NO: 7
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>primer
<223>進行PCR增幅全長XPO1A 的引子(reversed)
<400>5
<210>SEQ ID NO: 8
<211>348
<212>DNA
<213>人工序列
<220>promoter
<223>35S promoter
<400>8
<210>SEQ ID NO: 9
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>terminater
<223>XPO1A 基因下游終止子
<400>9
<210>SEQ ID NO: 10
<211>8956
<212>DNA
<213>人工序列
<220>環狀的核酸序列
<223>可於植物宿主細胞中表現XPO1A蛋白的質體pCAMBIA1300序列
<400>10
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：
第1圖為喪失高溫耐受性的阿拉伯芥突變株(hit2 )所在之去氧核糖核酸重組圖譜。。
第2圖為喪失高溫耐受性之阿拉伯芥突變株對於持續高溫處理及短時間熱休克處理的敏感度分析。
第3圖為經歷不同方式的高溫處理後，阿拉伯芥野生株及突變株幼苗之後續生長情況及存活率分析結果。
第4圖為為阿拉伯芥野生株與突變株之種子於23℃持續光照下，於含有可容許種子發芽之不同甲基紫濃度的瓊脂培養基上培養之生長發育情況。
第5圖為阿拉伯芥野生株及突變株在光照或黑暗條件下於面對高溫逆境後的幼苗存活率比較圖。
第6圖為阿拉伯芥野生株之各組織中XPO1A蛋白的基因表現分析。
第7圖為質體pCAMBIA1300-XPO1A 之構築流程圖。

Claims (12)

  1. 一種使植物表現後天性耐受高溫逆境性狀的方法，包含：將一段包含序列編號：1所示的序列的去氧核糖核酸片段，轉殖入一植物細胞中；以及表達一外源性細胞核輸出受體蛋白1A(nuclear export receptor 1A)，使含此去氧核糖核酸片段的轉殖株表現出可耐受高溫逆境的單一性狀。
  2. 如請求項1所述之使植物表現後天性耐受高溫逆境性狀的方法，其中該包含序列編號：1所示序列的片段上游具有一持續表現型或誘導表現型啟動子序列。
  3. 如請求項2所述之使植物表現後天性耐受高溫逆境性狀的方法，其中該包含序列編號：1所示序列的片段為具有序列編號：2所示序列的片段。
  4. 如請求項2所述之使植物表現後天性耐受高溫逆境性狀的方法，其中該包含序列編號：1所示序列的片段為具有序列編號：3所示序列的片段。
  5. 如請求項1所述之使植物表現後天性耐受高溫逆境性狀的方法，其中該植物細胞為十字花科植物或番茄之組織細胞。
  6. 如請求項1所述之使植物表現後天性耐受高溫逆境性狀的方法，其中將該含有可編碼產生細胞核輸出受體蛋白1A(nuclear export receptor 1)的去氧核糖核酸片段送入該植物細胞的方法為利用質體或病毒載體轉染。
  7. 如請求項6所述之使植物表現後天性耐受高溫逆境性狀的方法，其中該質體為Ti-plasmid。
  8. 一種利用使植物表現後天性耐受高溫逆境性狀來選殖轉基因植物的方法，包含：構築一重組基因片段，包含一欲轉殖之基因及一選擇性標幟，其中該選擇性標幟為包含序列編號：1所示序列的去氧核糖核酸片段；將該重組基因片段轉殖入一植物組織細胞中；進行一預馴化處理，包含將該植物組織細胞生長出之植物幼苗培養一預馴化溫度中，其中該預馴化溫度高於該植物幼苗之最適生長溫度，再將該植物幼苗移至該植物幼苗之最適生長之溫度中培養；進行一熱休克處理，其中該熱休克處理之溫度為大於等於該預馴化溫度，並且可使未成功轉殖之植株細胞死亡的最低溫度；以及挑選出可於該熱休克處理後存活之單一性狀的植株，即為轉基因成功之轉植株。
  9. 如請求項8所述之使植物表現後天性耐受高溫逆境性狀來選殖轉基因植物的方法，其中該包含序列編號：1所示序列的片段為具有序列編號：2所示序列的片段。
  10. 如請求項8所述之使植物表現後天性耐受高溫逆境性狀來選殖轉基因植物的方法，其中該包含序列編號：1所示序列的片段為具有序列編號：3所示序列的片段。
  11. 如請求項8所述之使植物表現後天性耐受高溫逆境性狀來選殖轉基因植物的方法，其中該預馴化處理溫度為37℃，時間為一小時，將該植物幼苗移至該最適生長溫度中培養之時間大於等於該預馴化處理之時間。
  12. 一種具有熱耐受性的轉形細胞株，包含一段含序列編號：1所示序列的外源性去氧核糖核酸片段。
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