TWI398255B

TWI398255B - 結合至腺苷酸ａａ受體和腺苷酸轉運子以預防及治療神經退化疾病的雙功能化合物

Info

Publication number: TWI398255B
Application number: TW099138959A
Authority: TW
Inventors: Yun Lian Lin; Yijuang Chern; Jim Min Fang; Jung Hsing Lin; Nai Kuei Huang
Original assignee: Academia Sinica
Priority date: 2009-11-13
Filing date: 2010-11-12
Publication date: 2013-06-11
Also published as: ES2645043T3; US20150374737A1; HUE035188T2; KR20120094492A; CN102740849A; EP2498774A4; EP2498774A1; TW201121549A; KR101830623B1; US10342818B2; WO2012064340A1; CN106377540A; US20120295863A1; EP2498774B1; CN106377540B

Description

結合至腺苷A 2A 受體和腺苷轉運子以預防及治療神經退化疾病的雙功能化合物

本發明提供一種用以治療神經退化疾病(neurodegenerative diseases)，如亨丁頓舞蹈症(Huntington’s disease，HD)之化合物的鑑定、合成和使用。

亨丁頓舞蹈症(HD)是一種因亨丁頓基因(Huntingtin gene，Htt)上CAG三連核苷酸擴展(CAG trinucleotide expansion)而引發的體染色體顯性神經退化疾病(autosomal dominant neurodegenerative disease)，該疾病會表現出舞蹈症(chorea)、失智(dementia)和精神症狀(psychiatric symptoms)。^1-3 雖然已有部分具和緩病徵效果的藥物被發表^4,5 ，但針對亨丁頓舞蹈症的有效治療方法仍有待研發。目前已知在基因轉殖小鼠模式實驗中，選擇性A_2A 腺苷受體的興奮劑(selective A_2A adenosine receptor(A_2A R)興奮劑)，CGS21680(簡稱CGS)，可以舒緩亨丁頓舞蹈症的症狀⁶ ，並且，這個化合物已被證實可以藉由增強泛素蛋白酶系統(ubiquitin-proteasome system)的活性來回復亨丁頓舞蹈症中尿素循環缺陷的問題⁷ 。然而，除了既有的副作用外，已知CGS更會引發免疫抑制作用⁸ ，因此並不適合於臨床上的運用。在另一方面，一種自天麻(Gastrodia elata B1)中分離出來且命名為T1-11(化合物1 )的腺苷類似物，也是一種A_2A 腺苷受體的興奮劑，已被證實具有抑制PC12細胞之去血清所引發細胞凋亡之機轉(serum-deprived apoptosis)的功效，因此可能具有治療神經退化疾病的潛力⁹ 。

A_2A R和腺苷轉運子(adenosine transporter，例如，平衡型核苷轉運子(ENT1))皆已被證實會定位在紋狀體(striatum)^10-13 ，即突變之亨丁頓基因聚集的地方¹⁴ 。抑制腺苷轉運子會區域性地提高腺苷的濃度，並進而提升激活(agonizing) A_2A R的效率。有趣的是，化合物1亦被認為是一種ENT1抑制劑。從另一方面來說，CGS潛在的免疫抑制作用也是A_2A R訊息傳遞的結果，顯示與A_2A R具有很強的結合親和力可能不是臨床上有效藥物的有利特性。

因此許多研究致力於修飾化合物1但保留它的多功能特性。此外，基於前述理由，具短暫或微弱結合能力的化合物可能較具有穩定結合能力的化合物來得適合¹⁵ ，尤其是在結合於A_2A R訊息傳遞系統的情況中。設計之多結合標的配體(designed multiple ligands，DMLs)^16,17 與經隨機篩選而得之雜亂的化合物是全然不同的概念，因為它們係經明確地設計而得以使欲呈現的特性最佳化。相較於具單一結合標的化合物(individually-targeting compounds)，科學界認為DMLs可能於治療具有複雜病因之疾病，如氣喘(asthma)、肥胖症(obesity)、癌症(cancer)和精神疾病上具有優勢^16-18 。一般理解，生物體內複雜聯絡網路的重複性與健全性可能是造成高度選擇性藥物無法表現出預期治療效果的原因¹⁹ 。近來評估顯示A_2A R的藥理特性確實相當複雜，因此，DMLs可能又更適合用於結合至A_2A R訊息傳遞系統²⁰ 。然而，一來因為難以藉電腦程式正確地架構出一配體與眾多標的交互作用的關係，二來考量到化學合成的諸多限制及對化合物之物化特性的要求，因此設計多結合標的配體往往是一個極具挑戰性的任務^21,22 。或許是因為越多的結合標的其複雜程度就越高，所以目前經報導的DMLs絕大多數為雙功能配體(dual-function ligand)²² 。

在我們前一個美國臨時申請案(美國臨時申請案號：61/260,932)中提到多個經合成且對腺苷受體和轉運子具有雙功能的化合物。這些化合物一般而言係具有一腺苷結構骨架，且於其N ⁶ 和C ^5’ 位置帶有下列修飾之結構的化合物：

其中，n為1至3；R¹ 係選自由(經取代之)苯((substituted)-benzene)、芳烴(polyarene)及雜環(heterocycle)所組成的群組；R² 係選自由鹵素、羥基、烷氧基、疊氧基(azido)、胺基、(經取代之)胺基、醯胺基、磺醯基(sulfanyl)、碸基(sulfonyl)、三唑基和氰基所組成的群組；及R³ 係選自由(經取代之)羰基、羧酸；(經取代之)脲基((substituted)carbamide)、氰基、(經取代之)炔基及(經取代之)四唑基所組成的群組。

較佳地，本發明的一個實施態樣中，該化合物具有下列結構：

其中，該經取代的雜環含有5元或6元環及該幷合雜環(fused heterocycle)含有氮、氧或硫作為雜原子，以及該取代基係選自氫、鹵素(氟、氯、溴和碘)、羥基、烷基(含1至6個碳)、三氟甲基(trifluoromethyl)和(經取代的)苯基團所組成的群組。

該雜環可以是吡咯、呋喃、噻吩、吡啶、六氫吡啶(piperidine)、六氫吡(piperazine)、吲哚、苯并呋喃(benzofuran)、苯并塞吩或喹啉。

另一個較佳實施態樣中，該化合物具有下列結構：

其中，該芳香環係選自由苯、萘、蒽、菲和芘所構成的群組；當n=1，該苯甲基團(benzyl group)可選擇性地具有選自由鹵素(氟、氯、溴和碘)、烷基(甲基、乙基、丙基、丁基和三氟甲基)、苯基(phenyl)、羧基、烷氧基(OR，其中R=CH₃ 、C₂ H₅ 、C₃ H₇ 或C₄ H₉ )、胺基(NRR’，其中R和R’代表H、CH₃ 、C₂ H₅ 、C₃ H₇ 、C₄ H₉ 或苯基)、醯胺基(NHCOR，其中R=CH₃ 、C₂ H₅ 、C₃ H₇ 或C₄ H₉ )、硝基、磺酸鹽(sulfonate)、烷醯基(COR，其中R=H、CH₃ 、C₂ H₅ 、C₃ H₇ 、C₄ H₉ 或苯基)和羧酸鹽(CO₂ R，其中R=H、CH₃ 、C₂ H₅ 、C₃ H₇ 、C₄ H₉ 或苯基)所構成的群組的取代基。

較佳地，該化合物具有下列結構：

其中，R³ 係選自由氫、烷基(含1至4個碳)和(經取代之)苯基所構成的群組，且R¹ 係如前所述。

另一較佳之化合物具有下列結構：

其中，R⁴ 係選自由氫、鹵素(氟、氯、溴和碘)、羥基、烷基(含1至6個碳)、三氟甲基和(經取代之)苯基所構成的群組，且R¹ 係如前所述。

再一較佳之化合物具有下列結構：

其中，R⁵ 係選自由氫和烷基(含1至4個碳)所構成的群組，且R¹ 係如前所述。

另一較佳之化合物具有下列結構：

其中，R係選自由氫、鹵素(氟、氯、溴和碘)、烷基(含1至4個碳)、三氟甲基、苯基、羥基、烷氧基(含1至4個碳)、(經取代之)胺基、(經取代之)醯胺基、氮基、磺酸鹽、羰基和羧酸鹽所構成的群組，且其係位於鄰位、間位或對位；其中，x為1至5。

本發明的另一個實施態樣提供一種神經退化疾病的治療方法，其包含：將有效量之至少一種前述化合物施予一需要治療的對象。該神經退化疾病可指因蛋白質錯誤摺疊所引發的蛋白質錯誤摺疊疾病。該蛋白質錯誤摺疊疾病包括阿茲海默症(Alzheimer’s disease)、帕金森氏症(Parkinson’s disease)、肌萎縮性側索硬化症(脊髓小腦共濟失調症)、普利昂病(Prion disease)、亨丁頓舞蹈症以及脊髓小腦共濟失調症(amyotrophic lateral sclerosis)。本發明之方法對於治療亨丁頓舞蹈症特別有用。

本發明的另一個實施態樣提供一種組合物，其包含有效量之至少一種前述化合物以及醫藥可接受之載體。

為了合理地設計適合做為亨丁頓舞蹈症之治療藥劑的雙功能配體，我們首先建構了兩個藥效基團模型(pharmacophore model)，其中一個是A_2A R興奮劑(A_2A R興奮劑)，另一個則是ENT1抑制劑。三維的藥效基團可以呈現一系列結合相同生物分子之活性區域且展現相同功能之化合物的化學功能特性的特定空間分布²³ ，這在該結合之生物分子的結構尚無法以高解析度之X-ray或NMR解出時，特別有用。藥效基團分析已成功地運用於多種藥物的研發工作^24-29 。雖然人類腺苷A_2A 受體的高解析晶體結構已經解出³⁰ ，但其顯示的是其與拮抗劑，ZM241385(簡稱ZM)結合的構型，而非興奮劑。另一方面，人類ENT1的晶體結構則尚未明朗，目前也未能找到合適的結構作為模板以進行同源模擬(homology modeling)。

我們基於化合物1的結構骨架設計了一系列腺苷的衍生物(第一圖)。只要藥效基團適性分析(pharmacophore fitting)預測該經修飾的化合物具有可接受的活性，該化學修飾即被採用。此外，並利用配體競爭結合試驗(competitive ligand binding assay)以確定該設計之化合物確實與A_2A R和ENT1具有良好的結合親和力。最後，這些化合物經進一步測試它們是否可以避免去血清培養之PC12細胞啟動凋亡機轉，而這將是它們是否具有治療神經退化疾病之潛力的關鍵性特徵^31,32 。

人類腺苷A _2A 受體興奮劑的藥效基團模型

在雙藥效基團藥物設計程序中，人類A_2A R(hA_2A R)興奮劑的三維藥效基團模型首先被建立以用於設計可供作為hA_2A R興奮劑的化合物。本說明書中選出的訓練資料(training set)中包括25個具不同程度之結構變異及hA_2A R活性(Ki from 1.2 nM to 187 μM)的化合物。具有潛力的hA_2A R興奮劑，CGS³³ ，也包括在這個訓練資料中。再利用Accelrys公司的Catalyst的HypoGen模組³⁴ 來建構這些配體的藥效基團模型。該建構出來的藥效基團係如第二A圖所示，其顯示出四個結構特徵，包括：疏水性區域(hydrophobic，HP，顯示為青色)、芳香環(ring aromatic，顯示為金色)、氫鍵給體(hydrogen bond donor，HBD，顯示為紅色)及氫鍵受體(hydrogen bond acceptor，HBA，顯示為綠色)。CGS與建構之藥效基團的四個特徵皆能良好的吻合(第二B圖)。相對地，S-(4-硝苯甲基)-6-硫肌苷(S-(4-nitrobenzyl)-6-thioinosine，NBTI)³⁵ 雖然展現了與腺苷轉運子強力的結合力，但因為缺乏一個芳香環的吻合(第二D圖)而在作為hA_2A R配體時，僅具弱親和力。該設計之雙功能配體1 、6 和11 則至少吻合於A_2A R興奮劑之藥效基團模型的三個特徵(第二C、二E和二F圖)。

平衡型核苷轉運子之抑制劑的藥效基團模型

為了設計一個同時可作為hA_2A R興奮劑和hENT1抑制劑的雙功能化合物，hENT1抑制劑之藥效基團模型也同樣被建構(第三A圖)。本說明書中選出的訓練資料中包括25個具有不同程度之hENT1抑制活性的化合物，其IC₅₀ 係在0.29 nM~32 μM之間。該建構之hENT1抑制劑的藥效基團模型僅由三個特徵組成，包括兩個氫鍵受體及一個芳香環。該五個化合物(NBTI、1 、CGS、6 及11 )皆可吻合這三個特徵。在hA_2A R興奮劑之藥效基團及hENT1抑制劑之藥效基團之間不同數量的吻合特徵反應出中化合物本身的特性。

仔細的檢視作為hA_2A R興奮劑之測試資料組中的化合物的結構後，我們發現多數化合物，尤其是被認定具有較高潛力的化合物，包括CGS，在核苷的5’位置帶有一個疏水性基團。因此，建構之藥效基團被設定必定要包括這個重要的特徵。相反的，在作為hENT1抑制劑的測試資料組中，幾乎所有化合物之核苷的5’位置皆帶有一個極性的羥基團。

兩個觀察標的之藥效基團之間的差異也提供了設計雙功能化合物的靈感。舉例來說，化合物6 不能完全吻合A_2A 受體之藥效基團模型的疏水性特徵，因此它顯然不若可以吻合所有特徵的CGS來得有潛力。然而，化合物6 卻可以與hENT1模型中的三個特徵良好的吻合。

至於化合物11 ，它可以與所有的特徵吻合，包括A_2A R藥效基團模型的疏水性特徵，但它仍同樣良好地吻合於hENT1藥效基團模型，顯示ENT1藥效基團模型有較高的耐受性(tolerance)。總結來說，藉著比較該兩個藥效基團模型的特徵和化合物吻合的程度，我們可以假設該hA_2A R的結合袋(binding pocket)中具有一個重要的疏水性區域，而該hENT1的結合袋可能對於容納該一系列化合物之核苷的5’位置的疏水性部分(hydrophobic moieties)較為彈性。在缺乏hENT1的結構資訊的情形下，藥效基團分析提供了我們於設計及了解雙功能化合物上所需的資訊。

腺苷衍生物的合成

一群代表性的腺苷類似物係依據該藥效基團模型而建立(反應流程1)。最早係自天麻⁹ 分離出來的化合物1 可高產率地藉由使6-氯嘌呤核呋喃糖苷(6-chloropurine ribofuranoside)(17 )與4-羥基苯甲胺(4-hydroxybenzylamine，以氯化氫鹽(hydrochloric salt)的形式)在二異丙基乙胺(diisopropylethylamine)的鹼性環境下進行取代反應而獲得。因為無法以商業方式取得4-羥基苯甲胺，因此以兩個步驟來製備之：使4-羥基苯甲醛與羥基胺(hydroxylamine)藉縮合反應(condensation reaction)生成一肟類(oxime)中間產物；接著使該肟類中間產物在Pd/C及HCl的催化下進行氫化反應。類似於化合物1 的製備程序，藉6-氯嘌呤核呋喃糖苷與合適之經取代的苯甲胺進行取代反應以製得一系列N ⁶ 位置經取代的腺苷衍生物2-6 。在N ⁶ -(3-吲哚乙基)腺苷(N ⁶ -(3-indolyethyl)adenosine)(6 )的製備中，採用微波輻射來取代傳統的加熱方法，以縮短反應時間。

在無水丙酮中使N ⁶ -(4-甲氧苯甲基)腺苷3 與2,2-二甲氧基丙烷(2,2-dimethoxypropane)反應生得相應之化合物3 的丙酮縮醛化衍生物(3 -acetonide)，其接著與對甲苯磺醯氯(p-toluenesulfonyl chloride)在吡啶(pyridine)存在下反應而得到一混合物，其含有前述3 -acetonide的甲苯磺酸(tosylate)衍生物和氯衍生物(反應流程1)。該甲苯磺酸衍生物並不穩定，反之，該氯化合物(化合物7 的丙酮縮醛化衍生物(7 -acetonide))則得以藉著層析法分離，再接續水解而得到化合物7 。將前述混合物在未進一步分離的情況下與疊氮化鈉(sodium azide)反應，並緊接著經酸催化水解，可生成具疊氮基的化合物8 (azido compound8 )。另外，使化合物8 的丙酮縮醛化衍生物(8 -acetonide)進行施陶丁格反應(Staudinger reduction)可生成一胺類中間產物，該胺類中間產物於酸中去除其2' ,3 ' -異亞丙基團(2' ,3 ' -isopropylidene)後可轉換為對應之乙醯胺化合物9 (acetamide9 )和磺醯胺化合物10 (sulfonamide10 )。

反應流程1，N ⁶ -(4-甲氧苯甲基)腺苷(N ⁶ -(4-methoxybenzyl)adenosine)的合成及其將其5’羥基分別取代為氯、疊氮基(azide)、乙醯胺(acetamide)和對甲苯磺醯胺(p-toluenesulfonamide)的反應流程。

反應流程2，藉速配接合反應(click reaction)修飾5’位置的疊氮基團以獲得三唑化合物(triazole compound)。

在另一個反應流程(反應流程2)中，使具疊氮基的化合物8 與1-己炔、1-辛炔和3-苯基-1-丙炔進行Cu⁺ 催化之1,3-偶極環加成反應(1,3-dipolar cycloaddition，速配接合反應)³⁸ 可獲得三唑衍生物12 ,13 和14 。同樣地，使化合物8 的丙酮縮醛化衍生物(8 -acetonide)與炔丙醇(propargyl alcohol)進行速配接合反應可生成一三唑化合物，該三唑化合物的羥基在反應過程中經活化而成為一甲磺酸(mesylate)，再進而被NaBH₄ 還原為一甲基。再將2' ,3' -異亞丙基團去除後，即可獲得化合物11 。

反應流程3，甲醯胺衍生物(carboxamide derivatives)及四唑衍生物(tetrazole derivatives)的合成。

使6-氯嘌呤核呋喃糖苷的丙酮縮醛化衍生物(acetonide)在2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基(2,2,6,6-tetramethylpiperidinyl-1-oxy,TEMPO)³⁹ 的催化下被二乙酸碘苯((diacetoxyiodo)benzene)氧化生成一羧酸化合物18 (carboxylic acid18 )。使該羧酸化合物18 與乙胺和氨水進行偶和反應而分別生成醯胺化合物19 和20 (amide19 ，amide20 )。使該化合物19 的氯原子被4-羥基苯甲胺取代而丙酮縮醛被水解之後，即製得醯胺化合物15 (amide15 )。另一方面，醯胺化合物20 與Me₂ SO、草醯基(oxalyl)、氯和二異丙基乙基胺(i -Pr₂ Net)反應後則轉換為腈化合物21 (nitrile21 )⁴⁰ 。在氯原子被4-甲氧苯甲基胺取代之後，使氰基與NaN₃ 進行1,3-偶極環加成反應，而使C-5’位置建立出所欲之四唑部分⁴¹ ，再進而於酸性環境下去除2' ,3' -異亞丙基團，即可獲得化合物16 。

N ⁶ -及 C ⁵ ’ -修飾之腺苷衍生物的生物性評估

經由MDS藥理服務中心(MDS Pharma Services)以放射性標定結合能力測試(radioligand binding assay)檢測所製得之腺苷類似物的藥理學性質。部分代表性之化合物的結合常數(K _i )係列於表一。具潛力之A_2A R興奮劑，CGS顯示缺乏抑制ENT1的活性，而ENT1抑制劑NBTI則沒有與A_2A R結合的能力。CGS和NBT1皆不是雙功能藥物。部分製得之腺苷類似物呈現對A_2A R和ENT1的雙重活性，尤其是，化合物1 、4 和6 分別對於A_2A R和ENT1具有於低微莫耳濃度及小於微莫耳濃度的K _i 值。除了化合物11 和15 ，C-5’位置經修飾的腺苷衍生物雖然仍保有對ENT1的高親和力，但其結合於A_2A R的能力都受到破壞。

^a 該放射性標定結合能力測試係由MDS藥理服務中心(台北，台灣)依據標準程序進行。^b 人類腺苷A_2A 受體。^c 天竺鼠平衡型轉運子1。

我們先前提到，自天麻的甲醇水溶液萃取物中分離得到的化合物1 得抑制JNK活性而避免去血清培養之PC12的細胞凋亡機轉¹⁵ 。在這個研究中，去血清培養之PC12細胞係以標示之劑量經該化合物處理24小時。然後以MTT測定法監測細胞存活量，並以相對於培養於血清之對照組的存活量的百分比來呈現。根據MTT測定法，在0.01 μM的濃度下，化合物4 和6 回復PC12細胞因為去血清而誘導之細胞凋亡機轉的能力與化合物1 相同。總結來說，這些化合物於活化腺苷受體及抑制腺苷轉運子的雙功能可能協同地提升腺苷的有效濃度，尤其是當這兩個蛋白質接近時。

藥效基團模型的統計評估

第四圖顯示A_2A R興奮劑之藥效基團模型的pK _i 實驗值相對於pK _i 理論值的散佈圖。pK _i 實驗值相對於pK _i 理論值的r ² 值為0.962，而均方根誤差(root-mean-square of error，RMSE)為0.658 kcal/mol。該藥效基團模型進一步經由CatScramble模組，並以費雪隨機取樣法(Fisher’s randomization test)測試是否具統計顯著性。該CatScramble模組隨機選取該pK _i 值19次，以建立數種新的假設(即，藥效基團模型)。19個假設中沒有一個的取樣數據具有低於前述假設的COST值。表二整合了第四圖所示之化合物吻合的特徵，並呈現該化合物上吻合該特徵的區域，與該藥效基團模型中該特徵的中心位置之間的距離偏差。從另一方面來看，表二即是第四圖的量化表。當一配體與一藥效基團吻合，其吻合(或對應)的程度便以一「吻合值」來表示。越高的吻合值表示越高的吻合程度，而電腦係根據兩個參數來計算該吻合值：該藥藥團特徵的重要性，以及該分子上之特徵與該藥效基團模型中的特徵的確切位置之間的鄰近程度。

具潛力之A_2A R興奮劑，CGS，與建構之藥效基團的四個特徵皆吻合，並且其吻合特徵區域距離藥效基團模型上該特徵確切位置的偏差也非常的小。相較於CGS，化合物1 欠缺一個與該藥效基團模型之特徵吻合的疏水性部分，因此呈現降低的親和力。而NBTI則缺乏一個芳香環部分，並因此失去了激發腺苷A_2A 受體的活性。這顯示在這個藥效基團模型中，芳香環特徵可能較疏水性部分來得重要。化合物6 不吻合於藥效基團模型的疏水性特徵，而化合物11 則展現了較高的吻合值。然而，相較之下，前述結合能力測試的結果則指出化合物6 (K _i =4.39 μM)展現了高於化合物11 (K _i =41.8 μM)約十倍的結合親和力。這也可以合理解釋為係因為化合物6 上所有特徵的位置與該特徵於藥效基團上的確切位置的偏差較小。

該建立之hENT1抑制劑的藥效基團模型僅具有三個特徵，分別是一個芳香環特徵以及兩個氫鍵受體。pK _i 實驗值相對於pK _i 理論值的r² 值為0.927，而RMSE為0.85 kcal/mol(第五圖)。該藥效圖模型進一步經CatScrambler模組測試。該五個化合物(NBTI、1 、CGS、6 和11 )皆可吻合於這三個特徵，因此距離該特徵之確切位置的偏差需要被比對(表三)。顯然地，最具潛力的抑制劑，NBTI，具有最高的吻合值，且對於三個特徵皆具有最小的偏差。化合物1 、11 和6 的吻合值分別為6.61、6.4和5.86，係與其測量之活性順序一致。CGS(具有高吻合值：7.1)由於對hENT1不具有抑制活性，因此顯然被排除在這個模型之外。然而，CGS是唯一具有得以吻合於核苷部分之芳香環特徵的化合物(第三圖)。因此，謹慎地檢視該吻合之官能基團是否確實相同於藥效基團分析之測試資料組的化合物上定義該對應特徵的官能基團是非常重要的。單單「吻合值」並不能作為合適性的考量。

結論

我們採用雙藥效基團模型的方式來設計結合於A_2A R訊息傳遞系統的雙功能化合物。基於化合物1 的結構骨架，我們設計並合成了一系列的腺苷衍生物，並且，如果藥效基團預測修飾後之化合物具有可接受的活性，便針對腺苷進行化學修飾。該配體競爭結合試驗的結果證實了設計之化合物確實皆得以適當的親和力與A_2A R和ENT1結合。根據代表性藥物T1-11於小鼠的口服劑量，該設計之化合物用於治療神經退化疾病(包括亨丁頓舞蹈症)的有效量為1.5-2.5 mg/kg。此外，不論是速放劑型或是持續釋放劑型，該設計之化合物較佳的給藥途徑皆為口服。總結來說，這些化合物經證實具有避免去血清PC12細胞之細胞凋亡的能力，而這些特徵關鍵地指出其具有治療神經退化疾病的潛力。

實驗設計 材料與方法

所有使用的試劑和溶劑皆為試劑等級(reagent grade)，並且，除非特別指明，否則在使用前並不需要額外的純化步驟。四氫呋喃(tetrahydrofuran)和二乙醚(diethyl ether)係以鈉/二苯基酮(Na/benzophenone)蒸餾而得。CH₂ Cl₂ 係以CaH₂ 蒸餾而得。所有對空氣或濕氣敏感的實驗皆於氬氣中進行。所有玻璃儀器於使用前係先於烘箱中烘乾超過兩個小時，再於促乾器(desiccators)中冷卻至室溫。微波反應係以聚焦單模微波儀器(focused single mode microwave unit)(CEM Discover)進行。該儀器設有一連續聚焦之微波輸送裝置，該裝置並設有一選擇式功率輸出單元。

熔點係由熔點測定儀(Yanaco micro apparatus)記錄。旋光度係以數位旋光測定儀測量(Japan JASCO Co. DIP-1000)。[α]_D 值的單位為10^-1 deg cm² g^-1 。紅外線光譜(IR)係以紅外線光譜儀(Nicolet Magna 550-II)測得。NMR圖譜係經核磁共振儀(Varian Unity Plus-400)(400 MHz)測得，此外，化學偏移(chemical shifts，δ)係對應於CHCl₃ /CDCl₃ 的δ_H 7.24/δ_C 77.0(t的中央譜線)、(CH₃ )₂ CO/(CD₃ )₂ CO的δ_H 2.05/δ_C 29.92、CH₃ OH/CD₃ OD的δ_H 3.31/δ_C 49.0及(CH₃ )₂ SO/(CD₃ )₂ SO的δ_H 2.49(m)/δ_C 39.5(m)，並以ppm來表示。該分裂信號(splitting patterns)則顯示為單峰(singlet，s)、二重峰(doublet，d)、三重峰(triplet，t)、四重峰(quartet，q)、多重峰(multiplet，m)及寬峰(broad，br)。偶合常數(coupling constants，J)係以Hz為單位。電噴灑質譜(ESI-MS)實驗係以高解析質譜儀(Bruker Daltonics BioTOF III)進行。薄層層析分析實驗(Analytical thin-layer chromatography，TLC)係於薄層層析板(E. Merck矽膠60 F254 plates，0.25 mm)上進行，而化合物係以紫外光、對甲氧苯甲醛(anisaldehyde)噴劑或茚三酮(ninhydrin)噴劑顯示。管柱層析法係以填充有70-230目之矽膠的管柱來進行。使用於A_2A -R及ENT1測試之化合物係經HPLC純化並於280nm的吸收波長下測定其純度為95%。

藥效基團模型的建立

使用Accelrys公司所出的Catalyst的HypoGen模組來建立人類A_2A R興奮劑和人類ENT 1抑制劑的藥效基團模型。關於測試資料組之化合物的化學結構及其與人類A_2A R(或人類ENT 1)的結合親和力的資訊，係自文獻中收集而得^41-44 。這些用來建立藥效基團的化合物的活性必須涵蓋至少四個數量級，而且在每一個對數級的化合物數目至少要有三個^23,45 。我們也建議，如同該測試資料組，選擇具有大的化學變異性的化合物⁴⁵ 。每一個化合物係預先以化學繪圖軟體(ChemDraw)繪製出草圖，再輸入Catalyst 4.11中，爾後利用“Best”選項來產生構型。在Catalyst軟體中，使用輪詢演算法自所有具有低能量的結構中得到250個能量不高於最低能量結構20.0 kcal/mol的結構。選擇了五個分子特徵，分別是：疏水性(HPh)、氫鍵受體(HBA)、氫鍵給體(HBD)、正離子性原子(positively ionizable atom，PI)、負離子性原子(negatively ionizable atom，NI)。所有的這些化合物皆會載入Catalyst軟體的試算表(spreadsheet)，並且設定預設之不準確度為3。其他設定參數則維持預設值。

N ⁶ -(4-羥基苯)腺苷　(1) ⁹

將氫氯酸羥胺(hydroxylamine hydrochloride，1.29 g，18.6 mmol)及醋酸鈉(sodium acetate，l.67 g，20.4 mmol)加入4-羥基苯甲醛(1.25 g，10.2 mmol)的乙醇溶液(20 mL)。於室溫下攪拌該反應的混合物6個小時。然後藉著降低壓力使乙醇排除。接著，將水加入殘存物中，並以Et₂ O(3×)萃取。將所得的有機層以MgSO₄ 乾燥。於減壓下以旋轉蒸發器(rotary evaporation)使揮發物質移除後，使殘存物於CH₂ Cl₂ 中再結晶，便可得4-羥基苯甲醛的肟類衍生物(1.3 g，93%)，C₇ H₇ NO₂ ，其係淡黃色固體，熔點(mp)為92.0-93.6℃。

在大氣壓力下及10% Pd/C(80 mg)存在下，使一含前述肟類衍生物之溶液(342 mg，2.5 mmol)及一於乙醇中的濃縮氫氯酸(1 mL)進行4個小時的氫化作用(hydrogenation)。使反應混合物經矽鈣石(Celite)過濾。將濾出液濃縮以產出4-羥基苯甲胺的氯化氫鹽衍生物，其係淡黃色固體，且在用於下一個步驟前，不需再額外純化。

將4-羥基苯甲胺(395 mg，以該氯化氫鹽的形式)、6-氯嘌呤核苷(6-chloropurine riboside，143 mg，0.5 mmol)及於1-丙醇中的二異丙基乙胺(DIEA，2 mL，12 mmol)混合為一混合物，並將該混合物於70℃加熱6個小時。接著，降低壓力使該混合物濃縮後，再加水研製形成白色沉澱。該白色沉澱經過濾後便可得到標題所述之化合物1 (151 mg，81%)。經搭載Inertsil ODS-3管柱(4.6×250 mm，5 μm)之HPLC測定該產物的純度為>99%。此外，該產物(C₁₇ H₁₉ N₅ O₅ )為白色粉末，熔點為208.7-209.2℃(文獻⁹ 記載為216-219℃)；[α]²⁰ _D =-64.5(DMSO，c =1)(文獻⁹ 記載[α]²⁵ _D =-87(MeOH，c =0.1))；TLC(MeOH/EtOAc(1：9))R _f =0.3；¹ H NMR(DMSO-d ₆ ,400 MHz)δ 9.22(1 H，s)，8.34(1H，s)，8.30(1 H，br s)，8.18(1 H，s)，7.12(2 H，d，J=8.0 Hz)，6.65(2 H，d，J=8.0 Hz)，5.86(1 H，d，J=5.6 Hz)，5.41(2 H，m)，5.18(1 H，d，J=5.6 Hz)，4.60(2 H，m)，4.13(1 H，q，J=4.6，7.4 Hz)，3.95(1 H，q，J=3.4，6.2 Hz)，3.66(1 H，m)，3.53(1 H，m)；¹³ C NMR(DMSO-d ₆ ，400 MHz)δ 155.3，153.6，151.6，147.6，139.1，129.5，127.9(2×)，119.2，114.4(2×)，87.6，85.6，73.3，70.5，61.5，42.4；以ESI-HRMS計算質荷比為374.1412[M+H]⁺ (C₁₇ H₂₀ N₅ O₅ 理論值為：374.1459)。

N ⁶ -(3-吲哚乙基)腺苷(6)

將一6-氯嘌呤脫氧核苷(6-chloropurine ribonucleoside)溶液(71 mg，0.25 mmol)，及於乙醇(3 mL)中的色胺(tryptamine，101 mg，0.63 mmol)和二異丙基乙胺(0.24 mL，2.88 mmol)置於一圓底燒瓶中。將該燒瓶置於一聚焦單模微波儀器的槽室中，並以150 W的強度照射處理10分鐘以使乙醇迴流(refluxing)。接著以旋轉蒸發器濃縮該混合物，並藉著快速層析儀(flash chromatography；矽膠，MeOH/EtOAc(1：9))純化殘存物，即可獲得化合物6 (85 mg，83%；即所請結構式(III) 之化合物)。經搭載HC-C18管柱(Agilent，4.6×250 mm，5 μm)之HPLC(液相採用溶離梯度為30-60%的CH₃ CN水溶液)測定該產物的純度為>99%。此外，該產物(C₂₀ H₂₂ N₆ O₄ )為白色粉末，熔點為187.0-187.2℃；[α]²⁰ _D =-55.7(CH₃ OH，c =1.0)；TLC(MeOH/EtOAc(1：9))R _f =0.41；¹ H NMR(DMSO-d ₆ ，400 MHz)δ 10.78(1 H，s)，8.33(1 H，s)，8.25(1 H，s)，7.96(1 H，br s)，7.61(1 H，d，J=7.2 Hz)，7.32(1 H，d，J=9.2 Hz)，7.18(1 H，s)，7.05(1 H，t，J=8.0 Hz)，5.80(1 H，d，J=6.0 Hz)，5.47-5.44(2 H，m)，5.20(1 H，d，J=4.4 Hz)，4.61(1 H，d，J=5.6 Hz)，4.14(1 H，d，J=2.8 Hz)，3.96(1 H，d，J=3.2 Hz)，3.77(1 H，br s)，3.69-3.52(2 H，m)，3.01(2 H，t，J=7.2 Hz)；¹³ C NMR(DMSO-d ₆ ，100 MHz)δ 154.3，152.2，148.0，139.5，136.0，127.1，122.4，120.8，119.6，118.3，118.1，111.7，111.2，87.9，85.8，73.4，70.6，61.6，40.5，25.1；以ESI-HRMS計算質荷比為411.1750[M+H]⁺ (C₂₀ H₂₃ N₆ O₄ 理論值為：411.1775)。

5’-疊氧基-5’-去氧-2’,3’-O-異亞丙基-N ⁶ -(4-甲氧苯甲基)腺苷(化合物8的丙酮縮醛化衍生物)

以注射器將於無水吡啶(6.0 mL)中的對甲苯磺醯氯(6.3 g,34.6 mmol)逐滴地加入於無水吡啶(36 mL)中的環狀縮醛化之N ⁶ -(4-甲氧苯甲基)腺苷(環狀縮醛化的化合物3 ，2.96 g，6.9 mmol)中。於室溫下攪拌該混合物6個小時。然後藉著減壓使吡啶移除，再以CH₂ Cl₂ 和H₂ O萃取殘存物。接著，使有機層經MgSO₄ 乾燥、經過濾、再經濃縮而獲得一磺酸鹽衍生物和氯衍生物的混合物(5：1)，如同¹ H NMR圖譜所示。將前述製得的混合物溶解於無水DMF(70 mL)中，並加入疊氮化鈉(1.34 g，20.6 mmol)。再將該混合物於80℃下攪拌6個小時，然後減壓以將其濃縮。接著，以CH₂ Cl₂ 和H₂ O萃取殘存物，再使有機層經MgSO₄ 乾燥、經過濾、再經濃縮以獲得一淡黃色油狀物。該淡黃色油狀物進一步經快速層析法(矽膠；CH₂ Cl₂ /MeOH(100：1))純化而獲得化合物8 的丙酮縮醛化衍生物(8 -acetonide，653 mg，總產率：21%)。該產物(C₂₁ H₂₄ N₈ O₄ )為無色油狀物；TLC(EtOAc/Hexane(6:4))R _f =0.39；[α]²³ _D =+5.0(EtOAc，c =1.0)；IR ν_max (neat) 3280，2987，2931，2101，1618，1512，1478，1375，1330，1296，1248，1211，1154，1091 cm^-1 ；¹ H NMR(CDCl₃ ，400 MHz)δ8.38(1 H，br s)，7.72(1H，br s)，7.26(2 H，d，J=8.8 Hz)，6.84(2 H，d，J=8.8 Hz)，6.37(1H，br s)，6.06(1 H，d，J=2.0 Hz)，5.46-5.44(1 H，m)，5.07-5.05(1 H，m),4.77(2 H，br s)，4.38-4.35(1 H，m)，3.77(3 H，s)，3.51-3.62(2 H，m)，1.61(3 H，s)，1.39(3 H，s)；¹³ C NMR(CDCl₃ ，100 MHz)δ158.7，154.5，153.1，147.9，139.0，130.2，128.8(2×)，120.1，114.4，113.8(2×)，90.4，85.6，83.9，82.0，55.2，52.2，43.7，29.7，27.1，25.3；以ESI-HRMS計算質荷比為453.1999[M+H]⁺ (C₂₁ H₂₄ N₈ O₄ 理論值為：453.1999)。

5’-乙醯胺-5’-去氧- N ⁶ -(4-甲氧苯甲基)腺苷　(9)

在室溫下，使含疊氮基之化合物8 的丙酮縮醛化衍生物(95 mg，0.21 mmol)與三苯膦(triphenylphosphine，66 mg，0.24 mmol)於THF/H₂ O(10：1，2 mL)中攪拌4.5個小時。接著，減壓使該混合物濃縮。以CH₂ Cl₂ 和H₂ O萃取(taken up)殘存物，再以氯化氫溶液(HCl)使之酸化至pH=2。然後，將水層分離，以飽和NaHCO₃ 水溶液中和後，再以CH₂ Cl₂ 萃取之。接著，使有機萃取物經MgSO₄ 乾燥、經過濾、再經濃縮以獲得一粗製胺類產物。

使該粗製胺類產物與乙酸酐(98.6 μL，1.05 mmol)於無水吡啶(0.2 mL)中反應。於室溫下攪拌該混合物1.5個小時，再減壓使其濃縮。接著，以CH₂ Cl₂ 和H₂ O萃取殘存物，再使有機層經MgSO₄ 乾燥、經過濾、經濃縮、再經快速層析法(矽膠；CH₂ Cl₂ /MeOH(98：2))純化，而獲得化合物9 的丙酮縮醛化衍生物(56 mg，兩步驟的產率為57%)。經搭載HC-C18管柱(Agilent，4.6×250 mm，5 μm)之HPLC(液相採用溶離梯度為30-60%的CH₃ CN水溶液)測定該產物的純度為>99%。該產物(C₂₃ H₂₈ N₆ O₅ )為一無色油狀物；TLC(CH₂ Cl₂ /MeOH(98：2))R _f =0.2；[α]²⁵ _D =-146.6(CHCl₃ ，c =1.0)；IR ν_max (neat) 3280，3062，2989，2930，2835，2358，1667，1620，1513，1376，1336，1296，1246，1215，1096，1034 cm^-1 ；¹ H NMR(CDCl₃ ，400 MHz)δ8.36-8.38(2 H，m)，7.73(1 H，s)，7.28(2 H，d，J=8.8 Hz)，6.86(2 H，d，J=8.8 Hz)，6.15(1 H，br s)，5.77(1 H，d，J=4.8 Hz)，5.26(1 H，t，J=4.8 Hz)，4.81(1 H，dd，J=4.0，2.4 Hz)，4.76(2 H，br s)，4.47-4.48(1 H，m)，4.11-4.17(1 H，m)，3.79(3 H，s)，3.24(1 H，d，J=14.4 Hz)，2.15(3H，s)，1.61(3 H，s)，1.34(3 H，s)；¹³ C NMR(CDCl₃ ，100 MHz)δ170.5，158.8，154.8，152.7，147.7，139.7，130.0，128.9(2×)，121.1，114.6，113.9(2×)，92.5，83.3，82.2，81.3，55.3，43.9，41.1，27.6，25.4，23.2；以ESI-HRMS計算質荷比為469.2193[M+H]⁺ (C₂₃ H₂₈ N₆ O₅ 理論值為：469.2190)。

在室溫下使該化合物9 的丙酮縮醛化衍生物(17.2 mg，0.037 mmol)於3 M HCl/THF(1:1，0.1 mL)中攪拌14個小時，然後再以飽和NaHCO₃ 水溶液中和。接著減壓使該混合物濃縮，再以CH₂ Cl₂ 和H₂ O萃取殘存物。接著，使有機層經MgSO₄ 乾燥、經過濾、再經濃縮而獲得標題所示之化合物9 (11 mg，70%)。經搭載HC-C18管柱(Agilent，4.6×250 mm，5 μm)之HPLC(液相採用20分鐘內溶離梯度為30-60%的CH₃ CN水溶液)測定該產物的純度為>99%。該產物(C₂₀ H₂₄ N₆ O₅ )為白色粉末；熔點為121.1-121.6℃；TLC(CH₂ C₁₂ /MeOH(9：1))R _f =0.5；[α]²⁵ _D =-108.7(THF，c =0.89)；IR ν_max (neat) 3275，3071，2923，2852，2360，1621，1512，1375，1339，1297，1245，1175，1126，1076 cm^-1 ；¹ H NMR(CDCl₃ ，400 MHz)δ8.76(1 H，s)，8.27(1H，s)，7.24(2 H，d，J=8.4 Hz)，6.81(2 H，d，J=8.4 Hz)，6.54(1 H，s)，5.70(1 H，d，J=5.6 Hz)，4.72(3 H，d，J=5.6 Hz)，4.23(1 H，s)，4.18(1 H，s)，3.98-4.03(1 H，m)，3.75(3 H，s)，3.13(1 H，d，J=14.0 Hz)，2.02(3 H，s)；¹³ C NMR(DMSO，100 MHz)δ169.4，157.9，154.3，152.3，148.3，140.2，131.8，128.4(2×)，119.8，113.5(2×)，87.9，83.6，72.6，71.3，55.1，42.4，41.1，22.7；以ESI-HRMS計算質荷比為427.1727[M+H]⁺ (C₂₀ H₂₄ N₆ O₅ 理論值為：427.1730)。

5’-去氧-5’-(4-甲基-1,2,3-三唑-1-基)- N ⁶ -(4-甲氧苯甲基) 腺苷　(11)

在室溫下將含疊氮基之化合物8 的丙酮縮醛化衍生物(313 mg，0.69 mmol)、CuSO₄ ‧5H₂ O(24.9 mg)、抗壞血酸鈉(sodium ascorbate，61.4 mg)和炔丙醇於H₂ O/t-BuOH(1:1，7 mL)中攪拌12個小時以成為一混合物，然後減壓使該混合物濃縮。接著，以CH₂ Cl₂ 和H₂ O萃取殘存物。接著，使有機層經MgSO₄ 乾燥、經過濾、再經濃縮而產出一丙酮縮醛化的三唑化合物(triazole acetonide，~220 mg)，其係為一無色油狀物；TLC(CH₂ Cl₂ /MeOH(9：1))R _f =0.5；以ESI-HRMS計算質荷比為509.2267[M+H]⁺ (C₂₄ H₂₈ N₈ O₅ 理論值為：509.2261)。

在室溫下將前面製得的三唑化合物與三乙胺(triethylamine，0.15 mL，1.08 mmol)和甲磺醯氯(methylsulfonyl chloride，0.08 mL，1.08 mmol)於無水CH₂ Cl₂ (4.3 mL)中攪拌兩個小時。接著減壓使該混合物濃縮，再以CH₂ Cl₂ 和H₂ O萃取殘存物。接著，使有機層經MgSO₄ 乾燥、經過濾、再經濃縮而產出一甲磺酸化合物(C₂₅ H₃₀ N₈ O₇ SNa)，其係為無色油狀物；TLC(EtOAc/Hex(4：1))R _f =0.45；以ESI-HRMS計算質荷比為609.1876[M+H]⁺ (C₂₅ H₃₀ N₈ O₇ SNa理論值為：609.1856)。

在0℃下使前述甲磺酸化合物與NaBH₄ (24.5 mg，0.65 mmol)於DMF中反應，然後於60℃下加熱6個小時。接著減壓使該混合物濃縮，再以CH₂ Cl₂ 和H₂ O萃取殘存物。接著，使有機層經MgSO₄ 乾燥、經過濾、再經濃縮而產出一化合物11 的丙酮縮醛化衍生物，其係為無色油狀物；TLC(EtOAc/Hex(4:1)) R_f =0.25；以ESI-HRMS計算質荷比為493.2312[M+H]⁺ (C₂₄ H₂₈ N₈ O₄ 理論值為：493.2312)。

於室溫下將前述化合物11 的丙酮縮醛化衍生物於3M的HCl/THF(1:1，0.33 mL)中攪拌14個小時，然後以飽和NaHCO₃ 水溶液將其中和。接著減壓使該混合物濃縮，再將殘存物溶解於THF之後，經過濾、濃縮而得到標題所示之化合物11 (48.1 mg，整體產率為25%)。經搭載HC-C18管柱(Agilent，4.6×250 mm，5 μm)之HPLC(液相採用溶離梯度為30-60%的CH₃ CN水溶液)測定該產物的純度為98%。該產物(C₂₁ H₂₄ N₈ O₄ )為白色粉末；熔點為183.0-183.2℃；TLC(CH₂ Cl₂ /MeOH(9:1))R _f =0.12；[α]²⁷ _D =+20.3(CH₃ OH，c =0.45)；IR ν_max (neat) 3217，2921，2850，2685，1620，1513，1470，1337，1297，1244，1176，1111，1058 cm^-1 ；¹ H NMR(CD₃ OD，400 MHz)δ8.22(1 H，s)，7.99(1H，s)，7.45(1 H，s)，7.31(2 H，d，J=8.8 Hz)，6.87(2 H，d，J=8.8 Hz)，5.96(1 H，d，J=4.0 Hz)，4.82-4.68(5 H，m)，4.46(1 H，t，J=4.0 Hz)，4.34(1 H，q，J=4.0 Hz)，3.77(3 H，s)，2.15(3 H，s)；¹³ C NMR(CDCl₃ ，100 MHz)δ158.7，154.2，152.9，148.0，142.8，138.8，130.1，128.8(2×)，123.1，119.6，113.8(2×)，89.3，82.2，73.4，70.8，55.2，50.9，43.9，10.5；以ESI-HRMS(負離子掃描)計算質荷比為451.1843[M-H]^- (C₂₁ H₂₄ N₈ O₄ 理論值為：451.1842)。

3,4-二羥基-5-[6-(4-羥基苯甲基胺基)-嘌呤-9-基]-四氫呋喃-2-羧酸醯乙胺　(15)

在40℃下，使6-氯嘌呤核呋喃糖苷的丙酮縮醛化衍生物(化合物17 的丙酮縮醛化衍生物，158 mg，0.48 mmol)與PhI(OAc)₂ (509 mg，1.56 mmol)及2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基(TEMPO，15.4 mg，0.1 mmol)於除氣(degassed)之CH₃ CN/H₂ O溶液(1:1，2.6 mL)中攪拌4個小時。接著減壓使該混合物濃縮而產出粗製的酸性化合物18 。

於室溫下，使該粗製的酸性化合物與乙胺(117 mg，以氯化氫鹽的形式)、鄰-(苯并三唑-1-基)-N,N,N' ,N' -四甲基脲六氟磷酸(O-(benzotriazol-1-yl)-N,N,N' ,N' -tetramethyluronium hexafluorophosphate；HBTU，375 mg，0.72 mmol)及二異丙基乙胺(0.5 ml，2.89 mmol)於無水DMF(11.6 mL)中反應14個小時。接著，減壓使該混合物濃縮後，以CH₂ Cl₂ 和H₂ O萃取殘存物，並使有機層經MgSO₄ 乾燥、經過濾、經濃縮、再經快速層析法(矽膠；EtOAc/hexane(1：1))純化，便獲得一無色油狀的醯胺產物19 。

接著，於70℃下，使該醯胺產物與4-羥基苯甲胺(385 mg，2.4 mmol，以氯化氫鹽的形式)及二異丙基乙胺(2.8 mL，16.9 mmol)於1-丙醇(28 mL)中反應2個小時。然後，減壓使該混合物濃縮後，以CH₂ Cl₂ 和H₂ O萃取殘存物，並使有機層經MgSO₄ 乾燥、經過濾、經濃縮、再經快速層析法(矽膠；CH₂ Cl₂ /MeOH(97：3))純化，而獲得化合物15 的丙酮縮醛化衍生物(179 mg，82%)。該產物(C₂₃ H₂₈ N₆ O₅ )為無色油狀物；TLC(EtOAc/hexane(4：1))R _f =0.13；[α]²² _D =-32.0(EtOAc，c =1.0)；IR ν_max (neat) 3347，3103，2982，2933，1732，1667，1615，1516，1479，1461，1376，1332，1295，1245，1212，1154，1088 cm^-1 ；¹ H NMR(CDCl₃ ，400 MHz)δ9.01(1 H，br s)，8.35(1H，br s)，7.81(1H，s)，7.14(1H，br s)，7.04(2 H，d，J=8.0 Hz)，6.68(2 H，d，J=8.0 Hz)，6.49(1 H，t，4.8 Hz)，6.03(1 H，d，J=2.4 Hz)，5.33-5.38(2 H，m)，4.70(3 H，s)，3.09-3.16(2 H，m)，1.62(3 H，s)，1.37(3 H，s),0.90(3 H，t，J=7.2 Hz)；¹³ C NMR(CDCl₃ ，100 MHz)δ168.7，155.8，154.2，153.1，147.7，139.1，128.8(3×)，119.6，115.4(2×)，114.3，91.6，85.6，83.3，82.4，43.9，34.0，27.0，25.1，14.2；以ESI-HRMS計算質荷比為455.2037[M+H]⁺ (C₂₂ H₂₆ N₆ O₅ 理論值為：455.2043)。

於室溫下，使該化合物15 的丙酮縮醛化衍生物(26 mg，0.057 mmol)於1 M HCl/THF(1:1，0.3 mL)中攪拌16個小時，然後以飽和之NaHCO₃ 水溶液中和之。於濃縮後，使該殘存物與水研製(triturated)而得到標題所示的化合物15 。該化合物15 接著經MeOH(14.65 mg，62%)再結晶。該產物(C₁₉ H₂₂ N₆ O₅ )為白色粉末，熔點為179.7-180.5℃；TLC(EtOAc)R _f =0.04；[α]²³ _D =-27.7(MeOH，c =1.0)；IR ν_max (neat) 3256，2688，2360，1618，1515，1335，1294，1232，1128，1052 cm^-1 ；¹ H NMR(CD₃ OD，400 MHz)δ8.29(1 H，s)，8.22(1H，s)，7.20(2 H，d，J=8.4 Hz)，6.73(2 H，d，J=8.4 Hz)，6.00(1 H，d，J=7.6 Hz)，4.76-4.73(1 H，m)，4.70(2 H，br s)，4.46(1 H，s)，4.30-4.31(1 H，m)，3.36(2 H，q，7.2 Hz)，1.21(3 H，t，7.2 Hz)；¹³ C NMR(CD₃ OD，100 MHz)δ171.8，157.5，155.8，153.6，149.1，141.9，130.5，129.9(2×)，121.3，116.2(2×)，90.5，86.3，74.9，73.4，44.9，35.2，15.3；以ESI-HRMS計算質荷比為413.1573[M-H]⁺ (C₁₉ H₂₁ N₆ O₅ 理論值為：413.1573)；元素分析的結果為：C，52.88；H，5.40；N，19.44(C₁₉ H₂₂ N₆ O₅ ‧H₂ O理論值：C，52.77；H，5.59；N，19.43)。

2-[6-(4-甲氧苯甲基胺基)-嘌呤-9-基]-5-(1 H -四唑-5-基)-四氫呋喃-3,4-二醇　(16)

在50℃下，將化合物17 的丙酮縮醛化衍生物(ca. 3.98 mmol)經PhI(OAc)₂ /TEMPO氧化而得之粗製酸性化合物18 於無水DMF((40 mL)中與氯化銨(426 mg，7.96 mmol)、苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷六氟磷酸(benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexa-fluorophosphate；PyBOP，3.07 g，5.97 mmol)、羥苯并三唑(hydroxybenzotriazole，HOBt，807 mg，5.97 mmol)及二異丙基乙胺(2.5 mL，15.9 mmol)反應14個小時。接著，減壓使該混合物濃縮後，以CH₂ Cl₂ 和H₂ O萃取殘存物，並使有機層經MgSO₄ 乾燥、經過濾、經濃縮、再經快速層析法(矽膠；EtOAc/hexane(1：1至4：1))純化，而獲得一無色油狀之醯胺產物20 。

在-78℃下，將一溶於CH₂ Cl₂ (10 mL)的二甲基亞碸溶液(0.85 mL，11.9 mmol)加入一溶於CH₂ Cl₂ (10 mL)的草醯氯溶液(0.7 mL，7.96 mmol)中。攪拌該混合物30分鐘，然後加入一溶於CH₂ Cl₂ (20 mL)的醯胺化合物20 (ca. 3.98 mmol)。再於-78℃下攪拌該混合物30分鐘，然後加入二異丙基乙胺(2.6 mL，15.9 mmol)。於攪拌1個小時之後，經由TLC試驗檢測出腈類化合物21 的形成。以CH₂ Cl₂ 和H₂ O萃取該混合物，並使有機層經MgSO₄ 乾燥、經過濾、經濃縮、再經快速層析法(矽膠；EtOAc/hexane(2：3))純化，而產出一無色油狀之腈類化合物21 (863 mg)，該腈類化合物21 並混雜有些許之HOBt。

於70℃下，將上述製得之腈類化合物(863 mg，2.68 mmol)與4-甲氧苯甲基胺(1.84 g，13.4 mmol)及二異丙基乙胺(15.5 mL)於1-丙醇(26 mL)中反應4個小時。然後，減壓使該混合物濃縮後，以CH₂ Cl₂ 和H₂ O萃取殘存物，並使有機層經MgSO₄ 乾燥、經過濾、經濃縮、再經快速層析法(矽膠；CH₂ Cl₂ /MeOH(300：1至150：1))純化，而獲得化合物22 (905 mg，整體產率為54%)。該產物(C₂₁ H₂₂ N₆ O₄ )為無色油狀物；TLC(EtOAc/hexane(4：1))R _f =0.55；[α]²⁶ _D =+25.8(EtOAc，c =1.0)；IR ν_max (neat) 3373，3282，2990，2925，2853，1679，1618，1512，1465，1376，1331，1295，1249，1212，1135，1086 cm^-1 ；¹ H NMR(CDCl₃ ，400 MHz)δ8.39(1 H，br s)，7.64(1 H，br s)，7.26(2 H，d，J=10.4 Hz)，6.83(2 H，d，J=10.4 Hz)，6.54(1 H，t，J=5.6 Hz)，6.13(1 H，s)，5.77(1 H，d，J=4.0 Hz)，5.68(1 H，dd，J=1.6，4.0 Hz)，4.95(1 H，d，J=1.6 Hz)，4.75(2 H，br s)，3.79(3 H，s)，1.57(3 H，s)，1.42(3 H，s)；¹³ C NMR(CDCl₃ ，100 MHz)δ158.8，154.5，153.2，148.2，138.9，130.2，128.9(2×)，119.7，115.9，114.5，113.9(2×)，91.6，84.6，83.9，75.1，55.3，44.0，26.6，25.1；以ESI-HRMS(負離子掃描)計算質荷比為421.1612[M-H]^- (C₂₁ H₂₂ N₆ O₄ 理論值為：421.1624)。

將於DMF(20 mL)中的腈類化合物22 溶液(905 mg，2.14 mmol)以及NH₄ Cl(429 mg，8.04 mmol)冷卻至0℃後，加入NaN₃ (523 mg，8.04 mmol)。接著，將冰浴移除，使該混合物於40℃加熱1個小時，然後再緩慢地增溫至90℃，並維持於90℃下攪拌該混合物9個小時。接著，將該混合物冷卻，並藉著減壓使之濃縮。接著，使其溶解於EtOAc後，經NaHCO₃ 水溶液(pH=8)萃取，然後添加HCl溶液(1 M)至水層以將其酸化至pH=2後，再以CH₂ Cl₂ 萃取。接著，使有機層經MgSO₄ 乾燥、經過濾、再經濃縮而得到一個實質上無雜質的四唑產物，即化合物16 的丙酮縮醛化衍生物。該產物(C₂₁ H₂₃ N₉ O₄ )為無色油狀物(460 mg，產率為46%)；TLC(CH₂ Cl₂ /MeOH(9：1))R _f =0.25；[α]²⁷ _D =+13.2(EtOAc，c =1.0)；IR ν_max (neat) 3361，2926，2852，1613，1513，1481，1375，1333，1293，1249，1210，1176，1154，1101，1034 cm^-1 ；¹ H NMR(CDCl₃ ，400 MHz)δ7.90(1 H，br s)，7.68(1 H，br s)，7.35(2 H，d，J=8.4 Hz)，6.86(2 H，d，J=8.4 Hz)，6.83(1 H，br s)，6.18(1 H，s)，5.85(1 H，s)，5.73(1 H，d，J=6.0 Hz)，5.49(1 H，d，J=6.0 Hz)，4.92(1 H，dd，J=6.8，7.6 Hz)，4.39(1 H，dd，J=4.0，10.4 Hz)，3.77(3 H，s)，1.69(3 H，s)，1.43(3 H，s)；¹³ C NMR(CDCl₃ ，100 MHz)δ158.4，154.9，152.9，152.6，146.2，138.5，129.5，129.2(2×)，118.4，114.2，113.7(2×)，93.4，85.9，83.7，82.3，55.4，44.1，27.1，25.2；以ESI-HRMS(負離子掃描)計算質荷比(C₂₁ H₂₃ N₉ O₄ 理論值為：464.1795)為464.1786[M-H]^- 。

於室溫下使化合物16 的丙酮縮醛化衍生物(460 mg,0.99 mmol)於3 M的HCl/THF(1：1，0.1 mL)中攪拌14個小時，然後以飽和之NaHCO₃ 水溶液中和之。接著，減壓使該混合物濃縮後，以THF萃取(taken up)殘存物，再使其過濾、濃縮而得到標題所示的化合物16 (320 mg，76%)。經搭載HC-C18管柱(Agilent，4.6×250 mm，5 μm)之HPLC(液相採用20分鐘內溶離梯度為30-60%的CH₃ CN水溶液)測定該產物的純度為99%。該產物(C₁₈ H₁₉ N₉ O₄ )為白色粉末；熔點為210.0-210.6℃；TLC(CH₂ Cl₂ /MeOH(9：1))R _f =0.05；[α]²⁶ _D =-25.8(THF，c =1.0)；IR ν_max (neat) 3397，2841，2692，1623，1511，1475，1419，1339，1302，1236，1180，1124，1045 cm^-1 ；¹ H NMR(DMSO-d ₆ ，400 MHz)δ8.82(1 H，s)，8.30(1 H，br s)，8.20(1H，s)，7.26(2 H，d，J=8.0 Hz)，6.83(2 H，d，J=8.0 Hz)，6.08(1 H，d，J=5.6 Hz)，5.53(1 H，d，J=6.0 Hz)，5.46(1 H，d，J=2.8 Hz)，5.18(1 H，s)，4.91(1 H，d，J=5.2 Hz)，4.62(2 H，br s)，4.20(1 H，s)，3.69(3 H，d，J=2.0 Hz)；¹³ C NMR(DMSO-d ₆ ，100 MHz)δ159.9，157.4，153.7，151.9，138.8，131.5，127.9(2×)，113.1(2×)，85.9，79.1，75.4，74.3，54.6，41.9；以ESI-HRMS(負離子掃描)計算質荷比為427.1727[M-H]^- (C₁₈ H₁₉ N₉ O₄ 理論值為：427.1730)。

放射性標定結合測試

放射性標定結合測試係經由MDS藥理服務中心(MDS Pharma Services)以放射性標定結合能力測試(radioligand binding assay)進行。

在A_2A 受體的結合能力測試中⁴⁶ ，將過量表現人類A_2A 受體的HEK293細胞的膜蛋白收集於25℃之含有³ H-CGS21680(50 nM)的反應緩衝液[50 mM Tris-HCl(pH 7.4)，10 mM MgCl₂ ，1 mM EDTA，和2 U/mL腺苷去胺酶]中處理90分鐘。添加50 μM的腺苷-5' -N-乙基羧基醯胺(NECA)以評估非特異性結合的狀況。

腺苷轉運子的結合能力測試則以前面所述的方式進行⁴⁷ 。將鄧肯-哈特利豚鼠(Duncan Hartley derived guinea pig)大腦皮質的膜質部分與³ H-標定的NBTI(0.5 nM)共同培養於25 ℃之含有50 mM Tris-HCl(pH 7.4)的緩衝液中30分鐘。添加5 μM NBTI以評估非特異性結合的狀況，NBTI在0.5 nM的濃度下僅會對ENT1產生抑制效果，因此對於平衡型核苷轉運子1(ENT1)是具有高親和力的抑制劑⁴⁸ 。該反應可經GF/B玻璃纖維過濾及相同的緩衝液清洗後終止。

MTT代謝分析

購買自ATCC(Manassas,VA,USA)的PC12細胞係以含10%之馬血清及5%之胎牛血清的DMEM培養液(Dulbecco's modified Eagle's medium)維持，並培養於37℃的CO₂ 培養箱(5%)。存活量係如習知地以3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二酚四唑溴化物(MTT)代謝分析進行^49,50 。簡要地說，先將培養於150-mm培養盤中的細胞以PBS清洗三遍，然後在使其再懸浮於DMEM中。接著，將懸浮中的細胞接種於96孔盤中(每個培養孔含1×10⁴ 個細胞)，並經或不經指定之試劑處理。於培養24個小時之後，將MTT(0.5 mg/mL)加入培養基中，並再培養3個小時。接著，去除培養基後，以DMSO溶解每個培養孔中四唑環經活細胞之粒腺體分裂產出的沉澱物(formazan crystals)。然後藉酵素免疫微盤分析儀(micro-enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) reader)於波長570/630 nm下測量每一個培養孔的吸光值。

A_2A R：A_2A 腺苷受體。

Ac₂ O：乙酸酐(acetic anhydride)。

CGS：6-胺基-9-(5-乙基氨基甲醯基-3,4-二羥基--2-基)-2-{2-[4-(2-羧乙基)苯基]乙胺}嘌呤(6-amino-9-(5-ethylcarbamoyl-3,4-dihydroxy-oxolan-2-yl)-2-{2-[4-(2-carboxyethyl)phenyl]ethylamino}purine)。

DIEA：二異丙基乙胺(diisopropylethylamine)。

DMF：N,N-二甲基甲醯胺(N,N-dimethylformamide)。

DML：設計之多結合標的配體(designed multiple ligands)。

ENT：平衡型核苷轉運子(equilibrative nucleotide transporter)。

ESI：電噴灑離子化(eletrospray ionization)。

EtOAc：乙酸乙酯(ethyl acetate)。

HD：亨丁頓舞蹈症(Huntington’s disease)。

hENT1：人類平衡型核苷轉運子1(human equilibrative nucleotide transporter 1)。

HBA：氫鍵受體(hydrogen bond acceptor)。

HBD：氫鍵給體(hydrogen bond donor)。

HBTU：2-(1H -苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲(2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium)。

HOBt：1-羥苯并三唑(1-hydroxybenzotriazole)。

HP：疏水性區域(hydrophobic)。

HPLC：高效能液相層析(high-performance liquid chromatography)。

IR：紅外線光譜(infrared)。

JNK：c-Jun N-末端激酶(c-Jun N-terminal kinase)。

MS：質譜術(mass spectrometry)。

MsCl：甲磺醯氯(methanesulfonyl chloride)。

MTT：3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二酚四唑溴化物((3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide))。

NBTI：S -(4-硝苯甲基)-6-硫肌苷(S -(4-nitrobenzyl)-6-thionosine))。

NMR：核磁共振(nuclear magnetic resonance)。

py：吡啶(pyridine)。

PyBOP：苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷六氟磷酸(benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate)。

RA：芳香環(ring aromatic)。

t-BuOH：三級丁醇(tertiary butanol)。

TEMPO：2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基(2,2,6,6-tetramethylpiperidinyl-1-oxy)。

THF：四氫呋喃(tetrahydrofuran)。

TLC：薄層層析(thin-layer chromatography)。

TsCl：對甲苯磺醯氯(p-toluenesulfonyl chloride)。

TsOH：對甲苯磺酸(p-toluenesulfonic acid)。

ZM：4-(2-[7-胺基-2-{2-呋喃基}{1,2,4}三唑酮{2,3-a}{1,3,5}三-5-基-胺基]乙基)酚(4-(2-[7-Amino-2-{2-furyl}{1,2,4}triazolo{2,3-a}{1,3,5}triazin-5-yl-amino]ethyl)phenol)。

第一圖顯示CGS、NBTI及其他經設計於N ⁶ -及C ^5' -位置修飾之腺苷衍生物的結構。

第二圖顯示腺苷A_2A 受體興奮劑的三維藥效基團模型；(A)藥效基團模型的結構特徵，藍色：疏水性區域(HP)，金色：芳香環(RA)，紅色：氫鍵給體(HBD)，綠色：氫鍵受體(HBA)；(B)CGS與藥效基團模型的吻合狀況；(C)化合物1 與藥效基團模型的吻合狀況；(D)NBTI的吻合狀況；(E)化合物6 的吻合狀況；(F)化合物11 的吻合狀況。

第三圖顯示人類平衡型核苷轉運子(hENT1)抑制劑的三維藥效基團模型；(A)藥效基團模型的結構特徵，金色：芳香環(RA)，綠色：氫鍵受體(HBA；HBA1與RA的距離為3.431；HBA2與RA的距離為10.388)；(B)NBTI與藥效基團模型的吻合狀況；(C)化合物1 的吻合狀況；(D)CGS的吻合狀況；(E)化合物6 的吻合狀況；(F)化合物11 的吻合狀況。

第四圖係一散點圖，其對應顯示A_2A -R興奮劑的pKi預測值和測量值；其中實心圓圈表示訓練資料之化合物，而空心圓圈表示合成之化合物。

第五圖係一散點圖，其對應顯示ENT1抑制劑的pKi預測值和測量值；其中實心圓圈表示訓練資料之化合物，而空心圓圈表示合成之化合物。

Claims

一種化合物，其具有下列結構(I )：其中，n為1至3，R¹ 係選自由經取代或未經取代之苯、芳烴、及5至6元含有氮、氧或硫雜原子之經取代或未經取代之單雜環或幷合雜環所組成的群組；R³ 係選自由鹵甲基、羥甲基、烷氧甲基、疊氮甲基、經取代或未取代之胺甲基、醯胺甲基、磺醯甲基、碸甲基、三唑甲基、氰甲基、經取代或未取代之羰基、-COOH、經取代或未經取代之脲基、氰基、經取代或未經取代之炔基及經取代或未經取代之四唑基所組成的群組；其限制條件係當n=1時，R¹ 不為4-羥基苯，且R³ 不為羥甲基。
如申請專利範圍第1項所述之化合物，其具有以下結構(II )：其中，該5至6元含有氮、氧或硫雜原子之經取代或未經取代之單雜環或幷合雜環，其取代基係選自氫、鹵素(氟、氯、溴和碘)、羥基、烷基(含1至6個碳)、三氟甲基和經取代或未經取代的苯基團所組成的群組。
如申請專利範圍第2項所述之化合物，其中前述5至6元含有氮、氧或硫雜原子之經取代或未經取代之單雜環或幷合雜環係選自由吡咯、呋喃、噻吩、吡啶、六氫吡啶、六氫吡、吲哚、苯并呋喃、苯并塞吩和喹啉所組成的群組。
如申請專利範圍第2項所述之化合物，其具有下列結構(III )：
如申請專利範圍第1項所述之化合物，其具有以下結構(IV )：其中，該芳香環係選自由苯、萘、蒽、菲和芘所構成的群組；當n=1，該苯甲基團可選擇性地具有選自由鹵素(氟、氯、溴和碘)、烷基(甲基、乙基、丙基、丁基和三氟甲基)、苯基、羥基、烷氧基(OR，其中R=CH₃ 、C₂ H₅ 、C₃ H₇ 或C₄ H₉ )、胺基(NRR’，其中R和R’代表H、CH₃ 、C₂ H₅ 、C₃ H₇ 、C₄ H₉ 或苯基)、醯胺基(NHCOR，其中R=CH₃ 、C₂ H₅ 、C₃ H₇ 或C₄ H₉ )、硝基、磺酸鹽、烷醯基(COR，其中R=H、CH₃ 、C₂ H₅ 、C₃ H₇ 、C₄ H₉ 或苯基)和羧酸鹽(CO₂ R，其中R=H、CH₃ 、C₂ H₅ 、C₃ H₇ 、C₄ H₉ 或苯基)所構成的群組的取代基。
如申請專利範圍第1項所述之化合物，係選自由以下結構所構成的群組：；其中R是甲基、正丁基、正己基、或苯甲基；
一種醫藥組合物，其包含如申請專利範圍第1項所述之化合物及一醫藥可接受之載體。
如申請專利範圍第7項所述之醫藥組合物，其中前述化合物對腺苷受體和轉運子具有協同式雙功能。
如申請專利範圍第7項所述之醫藥組合物，其係用於治療神經退化疾病。
如申請專利範圍第9項所述之醫藥組合物，其中前述神經退化疾病為蛋白質錯誤摺疊疾病、亨丁頓舞蹈症、或其組合。