TWI392504B - 用於診斷及／或治療卵巢癌之抗原多肽 - Google Patents
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Description
本發明提供一種可表現於卵巢癌個體之經分離抗原多肽。本發明亦提供一種利用本發明抗原多肽之診斷方法以及藉由抑制本發明抗原多肽之基因來預防或治療卵巢癌。
卵巢癌是全世界女性癌症死亡之主因，其較所有其他婦科惡性腫瘤更易致死。所有女性均有罹患卵巢癌之風險，而年長女性較年輕女性更易罹患此疾病。約90%罹患卵巢癌的女性超過40歲，數目最多者為55歲或更大。雖然卵巢癌仍為罹患婦科惡性腫瘤細胞增生之女性頭號殺手，然若早期發現卵巢癌，治療效果顯著。然而，卵巢癌早期並不表現許多症狀，所以卵巢癌病例發現時癌症通常已擴散。早期(I/II)卵巢癌很難診斷，當其擴散並發展成晚期(III/IV)卵巢癌後，診斷較容易。其原因在於大部分的普遍症狀並不具專一性。大約75%診斷出卵巢癌之女性於初次診斷時便已罹患晚期(III及IV)卵巢癌。
具懷孕可能性之女性都應測量血清BHCG含量(Christoph Steinmeyer,Tumor Biol 2003;24:13-22)。再者，應測量年輕女性及疑似罹患卵巢癌之青少年之血清α胎兒蛋白(AFP)及乳酸脫氫酶(LDH)含量，因為病人愈年輕，其愈有可能罹患惡性生殖細胞腫瘤。然而，除前述物質外，一直以來都相當缺乏有益於診斷及監測之抗原。婦科惡性腫瘤(尤其是卵巢癌，其通常在診斷出前就已擴散至整個骨盆腔)已證實上述事實。許多此等癌症呈現非常侵犯性的生長模式，通常化療對彼等的效果較佳。因此，迫切需要精確之方法，藉此可早期診斷此等疾病。
Bast,et al.,N. Engl. J. Med. 309:883(1983)揭示漿液性囊腺瘤卵巢抗原CA-125於監測卵巢癌病人方面具有顯著價值。該抗原係利用單株抗體OC125(藉由刺激具有卵巢癌細胞株OVCA 433之小鼠所製備)所分離出。其可辨認OVCA 433細胞及14種其他卵巢癌細胞株中之13種細胞株之細胞表面抗原。該抗原為高分子量(>200,000道耳吞)醣蛋白，其自組織培養培養基中部分純化(Masuko,et al.,Cancer Res. 44:2813,1984)。再者，US 4,921,790係關於漿液性囊腺瘤卵巢腫瘤抗原CA-125之40KDa次單元，其有益於診斷及監測卵巢癌。雖然有血液測試結果聲稱CA-125有益於鑑別性診斷並追蹤此疾病，但並未指出其可有效篩選早期卵巢癌，因為其敏感度及專一性太低。而血清CA-125或結合其他已知之指示劑並未能明確診斷惡性腫瘤或特別嚴重之惡性腫瘤(如卵巢癌)。
近年來研究著重於結合腫瘤標記蛋白質體學與其它指示劑，以提高準確度。此方法之挑戰性在於卵巢癌之族群盛行率很低，此意謂即使測試方法具有高敏感度及專一性，仍有可能導致一些偽陽性結果(即對未罹患癌症之病人進行手術)。然而，蛋白質體學之貢獻仍屬早期階段，且其需進一步琢磨改善。近年來之蛋白質體學研究標示了個人化量身訂做療法的開端。近年來，無論是病人之診斷或5年存活率均未有顯著改進。此實際上肇因於此疾病有很高比率在初次診斷時即發現已為晚期階段。因此，仍存在著發展新偵測科技以改善早期診斷及降低晚期階段初次診斷(advanced-stage initial diagnosis)之挑戰。
本發明提供一種表現於卵巢癌個體內之經分離抗原多肽，其係選自由以下所組成群：(a)一種包含與SEQ ID NO:2具有至少85%序列同一性之胺基酸序列之多肽；(b)由在嚴格條件下與SEQ ID NO:1雜交之多核苷酸或SEQ ID NO:1之全長互補序列所編碼之多肽；(c)包含與SEQ ID NO:1具有至少85%序列同一性之核苷酸序列之多核苷酸所編碼之多肽；及(d)一種含有SEQ ID NO:4所示多核苷酸所編碼之胺基酸片段或含有SEQ ID NO:3所示胺基酸片段之多肽；其限制條件為該多肽序列包含於(a)、(b)或(c)中。
本發明亦提供一種編碼本發明之經分離抗原多肽之多核苷酸。
本發明另外提供一種可專一性結合至一種序列之抗體，該序列至少包含位於本發明抗原多肽C末端之一致序列(consensus sequence)X1
-P-H-X2
-Y-X3
-X4
。
本發明另外提供一種用於偵測個體卵巢癌之套組，其包含本發明之抗體。
本發明另外提供一種診斷個體罹患卵巢癌之方法，其包含：於足以偵測該表現之條件及時間下，偵測取自個體之生物檢體中本發明抗原多肽之表現，其中該抗原多肽表現代表罹患卵巢癌，且該抗原多肽過度表現代表其不但罹患卵巢癌且卵巢癌已轉移。
本發明另外提供一種診斷個體罹患卵巢癌之方法，其包含：於足以偵測抗體與該一致序列結合之條件及時間下，使取自個體之生物檢體與本發明之抗體接觸，以測定該生物檢體中是否存在本發明之抗原多肽，其中該結合代表罹患卵巢癌。本發明亦提供一種預防及/或治療卵巢癌之方法，其包含抑制本發明之抗原多肽表現之步驟。
卵巢癌病人低存活率的原因之一為缺乏早期偵測此疾病之良好診斷標記。未能有效治療卵巢癌使早期診斷更形困難，而缺乏對於卵巢癌生物學之全面性瞭解則阻礙卵巢癌之有效治療。本發明提供由OVTA1基因所表現之卵巢癌標記(OVTA1)而克服上述缺失。利用本發明之OVTA1，可高專一性及高敏感性地診斷卵巢癌。再者，使本發明之OVTA1表現降低會抑制卵巢腫瘤細胞生長及轉移，此結果顯示，其可作為治療卵巢癌之標的。
本文中，用語「變體(variant)」意謂異型物(isoform)、基因之對偶基因變體或其區域、基因之天然突變型式或其區域、或具有胺基酸序列之多肽或片段，其中該胺基酸序列一或多個胺基酸不同但保留一或多個所欲之特徵生物功能。可藉由增加一或多個胺基酸至胺基酸序列、自胺基酸序列刪除一或多個胺基酸及/或以一或多個胺基酸取代其他胺基酸來達成上述。胺基酸倒轉(inversion)及任何其他導致胺基酸序列改變之突變性改變亦包含於此定義中。可使核酸序列之核苷酸改變，隨著突變之核酸序列表現而改變所欲改變之胺基酸，因而製備變體。或者(例如)，可合成含有所欲胺基酸改變之胺基酸序列，此係為技藝人士能力範圍內所熟習者。
本文中，用語「OVTA1基因(OVTA1 gene)」意謂具有位於GenBank編號AB023216之序列之核苷酸438至4229(SEQ ID NO:1)之全長基因(AB0232167之整個序列揭示於http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db=nuccore&id=14133228)。序列「AB023216」及其蛋白質產物「KIAA0999」(產物編號：06551；基因/蛋白質特性表揭示於http://www.kazusa.or.jp/huge/gfpage/KIAA0999)
揭示於DNA Res. 1999 Feb 26;6(1):63-70，而其編碼基因序列、其所編碼之功能性蛋白質及其功能至今仍屬未知。
本文中，用語「OVTA1蛋白質(OVTA1 protein)」意謂OVTA1基因所編碼之蛋白質之全長序列，而其胺基酸序列示於SEQ ID NO:2中。
本文中，用語「經分離(isolated)」意謂該物質係自其原來環境(例如，若其為天然產生者，其天然環境)移除。例如，動物體內之天然多肽或多核苷酸並非經分離者，與天然系統中某些或所有共存物質分離之相同多肽或多核苷酸為經分離者。此種多肽或多核苷酸可為組合物之一部分，且若該組合物不為該自然環境之一部份，該多肽或多核苷酸仍屬經分離者。
本文中，用語「多肽(polypeptide)」意謂藉鄰接之α胺基及羧基間之肽鍵彼此連接之線性胺基酸。
本文中，用語「多核苷酸(polynucleotide)」或「核苷酸(nucleotide)」意謂包含DNA之多核苷酸。多核苷酸之實例亦包括包含(但不限於)單股型式、雙股型式、髮夾、主幹-及-環(stem-and-loop)結構及類似者之所有序列型式。
本文中，用語「編碼(encoding)」或「經編碼(encoded)」意謂多核苷酸或核酸包含直接將該核苷酸序列轉譯為特定蛋白質之必需訊息。利用密碼子具體描述編碼蛋白質之訊息。編碼蛋白質之核酸或多核苷酸可能包含該核酸轉錄區內之非轉錄序列(如插入序列(intron))，或其可能缺少此插入之非轉錄序列(如cDNA之情形)。
本文中，用語「多肽(polypeptide)」、「肽(peptide)」及「蛋白質(protein)」可互相替換，其意謂胺基酸殘基之聚合物。此用語適用於其中一或多個胺基酸殘基為對應天然胺基酸之人工化學類似物之胺基酸聚合物，及適用於天然胺基酸聚合物。
本文中，用語「卵巢癌(ovarian cancer)」包含初級及轉移性卵巢癌。惡性腫瘤分類為卵巢癌之標準係為此技藝中所熟知(參見Bell et al.,1998 Br. J. Obstet. Gynaecol. 105:1136;Meier et al.,1997 Anticancer Res. 17(4B):3019;Cioffi et al.,1997 Tumori 83:594)，來自初級及轉移性腫瘤之人類卵巢癌細胞株(如OVCAR-3,Amer. Type Culture Collection,Manassas,Va.;Yuanet al
.,1997 Gynecol. Oncol. 66:378)亦已建立及特徵化。
本文中，用語「抗體(antibodies)」包含多株抗體、單株抗體、及其片段，以及任何天然或經重組製備之結合部分，其為專一性結合本發明抗原多肽之分子。若抗體以高親和力結合本發明之抗原多肽，其可定義為「免疫專一性」或專一性結合。可利用習知技術(例如Scatchardet al
.,Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660(1949)所描述者)測定結合部分或抗體之親和力。
本文中，用語「表現(expression)」包含任何涉及製備多肽之步驟，包括(但不限於)轉錄、轉錄後修飾、轉譯、轉譯後修飾及分泌。
本文中，用語「表現載體(expression vector)」意謂包含編碼本發明多肽之多核苷酸之線形或環狀DNA分子，其中該多核苷酸係可操作連結至可提供其表現之額外核苷酸。用語「可操作連結(operably linked)」意謂一種構型，其中控制序列位於相對於多肽序列之編碼序列之適當位置，以便控制序列指揮多肽之編碼序列之表現。
本文中，用語「宿主細胞(host cell)」包含可經包含本發明多核苷酸之核酸構築體轉型、轉染、轉導及類似者之任何細胞型式。
本文中，用語「同一性(identity)」意謂兩個胺基酸序列或兩個核苷酸序列間之相關性。為了本發明之目的，以習知方法及軟體測定兩個胺基酸序列或兩個核苷酸序列間之同一性程度。例如，Clustal法(Higgins,1989,CABIOS 5:151-153)或Wilbur-Lipman法(Wilbur and Lipman,1983,Proceedings of the National Academy of Science USA 80:726-730)。
本發明係首次出乎意料地發現可表現於卵巢癌病人之OVTA1基因編碼之抗原多肽(OVTA1蛋白質)。上述抗原多肽命名為卵巢腫瘤相關抗原。藉由偵測各體中抗原多肽(OVTA1蛋白質)之存在，以診斷卵巢癌。
本發明提供表現於卵巢癌病人中之經分離抗原多肽，其係選自由以下所組成群：(a)一種包含與SEQ ID NO:2具有至少85%序列同一性之胺基酸序列之多肽；(b)由在嚴格條件下與SEQ ID NO:1雜交之多核苷酸或SEQ ID NO:1之全長互補序列所編碼之多肽；(c)包含與SEQ ID NO:1具有至少85%序列同一性之核苷酸序列之多核苷酸所編碼之多肽；及(d)一種含有SEQ ID NO:4所示多核苷酸所編碼之胺基酸片段或含有SEQ ID NO:3所示胺基酸片段之多肽；其限制條件為該多肽序列包含於(a)、(b)或(c)中。
在第一態樣中，本發明係關於含有與SEQ ID NO:2具有85%，較佳為至少90%，更佳為至少95%，及最佳為至少98%同一性之胺基酸序列之經分離多肽，其可表現於卵巢癌病人中。
本發明之多肽較佳係含有可表現於卵巢癌病人中之SEQ ID NO:2之胺基酸序列、其變體或其片段。根據本發明，本發明之變體可能為包含一或多個SEQ ID NO:2之保守性胺基酸取代、刪除及/或插入作用之人工變體或其成熟多肽。胺基酸改變較佳為微幅修改，亦即，其為不顯著改變蛋白質折疊及/或活性之保守性胺基酸取代或插入作用。保守性取代作用之實例為鹼性胺基酸(精胺酸、賴胺酸及組胺酸)、酸性胺基酸(穀胺酸及天門冬胺酸)、極性胺基酸(穀胺醯胺及天門冬醯胺)、疏水性胺基酸(亮胺酸、異亮胺酸及纈胺酸)、芳香性胺基酸(苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸)、及小胺基酸(甘胺酸、丙胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及甲硫胺酸)之群中。一般不改變特定活性之胺基酸取代係為此技藝中習知，並揭示於(例如)H. Neurath and R. L. Hill,1979,The Proteins,Academic Press,New York中。最常見之互換為Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu及Asp/Gly。
根據本發明之另一實施例，本發明之抗原多肽包含SEQ ID NO:2所示之胺基酸。
在第二態樣中，本發明係關於表現於卵巢癌病人中之經分離多肽，其係由在嚴格條件下，較佳為中度嚴格條件下，更佳為高度嚴格條件下且最佳為極高度嚴格條件下，與SEQ ID NO:1所示核苷酸雜交之多核苷酸或SEQ ID NO:1之全長互補股編碼(J. Sambrook,E. F. Fritsch,and T. Maniatus,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd edition,Cold Spring Harbor,N.Y.)。溫度及離子強度條件決定雜交之「嚴格度」。初步篩選同源核酸時，可利用低度嚴格雜交條件(相當於Tm
(溶化溫度)55℃)(例如5倍SSC、0.1% SDS、0.25%牛奶且無甲醯胺，或30%甲醯胺、5倍SSC、0.5% SDS)。中度嚴格雜交條件相當於較高之Tm
(例如40%甲醯胺及5倍或6倍SSC)。高度嚴格雜交條件相當於最高之Tm
(例如50%甲醯胺及5倍或6倍SSC)SSC為0.15M NaCl、0.015M Na-檸檬酸。
在第三態樣中，本發明係關於表現於卵巢癌病人中之經分離多肽，其係為包含與SEQ ID NO:1所示核苷酸具有至少85%，較佳為至少90%，更佳為至少95%，及最佳為至少98%序列同一性之核苷酸序列之多核苷酸所編碼之多肽，其可表現於卵巢癌病人中。
根據本發明之一實施例，本發明之抗原多肽可經SEQ ID NO:1所示之核苷酸序列或其簡併序列編碼。根據本發明之另一實施例，本發明之抗原多肽可經SEQ ID NO:1所示之核苷酸序列編碼。
在第四態樣中，本發明係關於表現於卵巢癌病人中之經分離多肽，其包含SEQ ID NO:4所示多核苷酸所編碼之胺基酸片段或包含SEQ ID NO:3所示之胺基酸片段；其限制條件為該多肽序列包含於(a)、(b)或(c)中。本發明亦出乎意料地發現含有OVTA1蛋白質胺基酸片段955至1112(SEQ ID NO:3)之多肽具有較佳之免疫原活性，且亦可作為卵巢腫瘤相關抗原。上述多肽係由OVTA1基因之核苷酸2863至3336(SEQ ID NO:4)所編碼。
用於分離或選殖編碼本發明多肽之多核苷酸之技術係為此技藝中所習知，包括基因組DNA分離物、由cDNA之製備產物或其組合。可(例如)利用習知之聚合酶鏈鎖反應(PCR)或抗體篩選表現庫以偵測具共同結構特徵之選殖之DNA片段，以從基因組DNA選殖本發明多肽。亦可利用其它核酸擴增程序(例如接合酶鏈鎖反應(LCR)、接合活化之轉錄作用(LAT)及基於核苷酸序列之擴增作用(NASBA))。
可利用本領域中技藝人士熟習之方法自包含表現系統之遺傳工程化宿主細胞製備本發明之抗原多肽。是以，在另一態樣中，本發明係關於包含本發明多核苷酸之表現系統、以該表現系統遺傳工程化之宿主細胞及關於利用重組技術製備本發明之多肽。因此，本發明亦係關於包含本發明之經分離多核苷酸之核酸構築體，其中該經分離多核苷酸可操作連結至一或多個指揮編碼序列在適合該控制序列條件下於適當宿主細胞中表現之控制序列。可利用多種方法操作編碼本發明多肽之經分離多核苷酸，以提供多肽表現。於插入載體前可能需要或必須操作多核苷酸序列，此視表現載體而定。利用重組DNA方法修飾多核苷酸序列之技術係為本領域中所習知。
可將表現系統或其部分或本發明之多核苷酸併入宿主細胞中使其遺傳工程化，以製備本發明之抗原多肽。可利用揭示於許多標準實驗室手冊(Davis,et al
.,BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(1986)and Sambrook,et al
.,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))之方法將多核苷酸引入宿主細胞中。適當宿主之代表性實例包括細菌細胞(例如E. coli
細胞(JM109純系))。
可使用許多不同之表現系統製備本發明之多肽。此等載體其中包括染色體-、附加體-(episomal-)及病毒-衍生之載體。表現系統構築體可包含調控並產生表現之控制區。一般而言，適於維持、傳播或表現多核苷酸及/或於宿主中表現多肽之任何系統或載體均可用於此所述之表現。可利用許多習知且例行之技術(例如Sambrooket al
.,MOLECULAR CLONING,A LABORATORY MANUAL(suppl)所揭示者)之任何一種來將適當之DNA序列插入表現系統中。
真核細胞重組表現系統中，適當之分泌訊號可併入表現之多肽中，以使轉錄之蛋白質分泌至內質網腔、周質區域或細胞外環境。此等訊號可能對於多肽為內生性或可能為異質性訊號。
經表現之本發明抗原多肽亦可作為用於例行抗體篩選之試驗之標的抗原，其中本領域中技藝人士可輕易進行此等試驗。
本發明提供一種專一性結合至一種至少包含位於本發明抗原多肽C末端之一致序列(consensus sequence)：X1
-P-H-X2
-Y-X3
-X4
之序列之抗體，其中X1
、X2
、X3
及X4
可為任何胺基酸。X1
較佳可為Q、N、S、T、V、W、A或L，X2
較佳可為H、S、G或N，X3
較佳可為S、P、M、F、A或K，且X4
較佳可為L、H、K、F、M、S或R。該一致基元(consensus motif)更加具有胺基酸序列Thr-Pro-His-Gly-Tyr-Ala-His(SEQ ID NO:5)。本發明發現抗原多肽含有一致基元：X1
-P-H-X2
-Y-X3
-X4
，其為抗體之高度免疫原性抗原決定基。根據本發明之一較佳實施例，本發明之抗體專一性結合至本發明之抗原多肽。更佳地，本發明之抗體專一性結合至本發明之SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。
可使用本領域中習知之方法輕易地以單株抗體或多株抗血清形式，或以設計成具所欲性質之遺傳工程免疫球蛋白形式，產生專一性結合至本發明之抗原多肽之一致序列之抗體。可視情況結合已知之純化方法(如鹽析法、離子交換層析法、親和性層析法及類似者)純化所得之抗血清，以製備本發明之多株抗體。可利用以下方式獲得本發明抗體。自經免疫之動物收集產生抗體之細胞(例如脾細胞、淋巴細胞或類似者)，使其與骨髓瘤細胞或類似者融合，利用習知方法(其使用聚乙二醇、仙台病毒(Sendai virus)、電脈衝或類似者)使其成為融合瘤細胞。之後，選擇並培養可產生結合本發明抗原多肽一致序列之抗體之純系，自所得之細胞培養上清液純化所欲之單株抗體。可視情況組合已知之純化方法(如鹽析、離子交換層析法、親和性層析法及類似者)進行純化作用。亦可利用遺傳工程技術製備該新穎抗體。亦即，自經本發明抗原多肽一致序列免疫之動物之脾細胞或淋巴細胞，或自可產生對本發明抗原多肽一致序列具專一性之單株抗體之淋巴瘤細胞純化mRNA，並利用該經分離之mRNA製備cDNA庫。之後，自cDNA庫篩選出可產生與本發明抗原多肽一致序列反應之抗體之純系，並培養該純系以獲得細胞培養上清液，組合習知之方法自該細胞培養上清液中純化所欲之抗體。例如，為說明而非限定，抗體可包含可用於偵測本發明OVTA1之重組IgGs、具有衍生自免疫球蛋白之序列之嵌合融合蛋白質或人類化抗體。
本發明亦提供用於診斷卵巢癌之包含本發明之經分離抗原多肽或結合至至少包含本發明抗原多肽一致序列之序列之抗體之套組。是以，該套組包含本發明之經分離抗原多肽，或包含專一性結合至至少包含本發明抗原多肽一致序列之序列及/或與該序列形成複合物之抗體。本發明抗原多肽更佳具有本發明SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示之胺基酸序列，且本發明抗體更佳係專一性結合至本發明之SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。抗體(如單株、多株、人類、人類化等)之結合作用係用於診斷個體之卵巢癌。本發明之套組經適當包裝，並視情況提供額外組份(例如用於判定與至少包含本發明抗原多肽一致序列之序列之結合作用之緩衝液及操作指示，如捕捉劑、顯影劑、標記、反應表面、偵測方法、對照組樣品及說明資訊。操作指示可用於任何抗原結合(包含，但不限於本文中所述之分析方法)之測量。在某些實施例中，提供上述試劑以便進行多重測量，例如，於同一個體內進行一段期間之測量或於多個個體中進行測量。可利用(該套組亦提供)任何適當之方法(例如經標記之抗人類抗體，其中該標記可為酵素、螢光團、化學發光材料放射性同位素或輔酶)偵測抗體之結合作用。
本發明提供一種診斷罹患卵巢癌之個體之方法，其包含於足以偵測該表現之條件及時間下，偵測取自個體之生物檢體中本發明抗原多肽之表現。
本發明亦提供一種診斷個體罹患卵巢癌之方法，其包含於足以偵測抗體結合至一致序列之結合作用之條件及時間下，使取自個體之生物檢體與至少一種專一性結合至至少包含位於本發明抗原多肽C末端之一致序列：X1
-P-H-X2
-Y-X3
-X4
(較佳為Thr-Pro-His-Gly-Tyr-Ala-His)之序列之抗體接觸，以測定生物檢體中本發明抗原多肽之存在，並藉此偵測卵巢癌或卵巢癌轉移。該抗原多肽表現代表罹患卵巢癌，而該抗原多肽過度表現代表不僅罹患卵巢癌，且卵巢癌已轉移。
根據本發明，可於取自個體或生物來源之生物檢體中偵測本發明之抗原多肽。可取得來自個體或生物來源之血液檢體、組織切片標本、組織外植體、器官培養、生物液或任何其他組織或細胞製備物，以提供生物檢體。個體或生物來源可為人類或非人類動物、初級細胞培養或包含(但不限於)可能含有插入染色體或附加體形式之核酸序列之遺傳工程細胞株之細胞培養適應細胞株、永生或可永生化之細胞株、體細胞雜合細胞株、經分化或可分化細胞株、轉型細胞株或類似者。本發明某些較佳實施例中，個體或生物來源可能為疑似罹患或有罹患卵巢癌之風險，且本發明某些其他較佳實施例中，個體或生物來源可能為已知未罹患或未有罹患此疾病之風險。根據本發明，生物檢體係選自由以下所組成之群：卵巢組織、卵巢細胞、血液、血清、血漿、腹水及腹膜液。
根據本發明，過度表現本發明抗原多肽或OVTA1蛋白質可顯著增加卵巢癌細胞增生及遷移。因此，偵測本發明抗原多肽表現量可用以診斷卵巢癌及其轉移。
進一步進行基因失活(knockdown)實驗後，本發明發現OVTA1基因失活可顯著降低細胞生長及細胞遷移以及腫瘤生長速率。使本發明抗原多肽或OVTA1基因失活有益於防止及/或治療卵巢癌並抑制卵巢癌轉移。是以，本發明提供一種預防及/或治療卵巢癌之方法，其包含抑制本發明抗原多肽或OVTA1表現之步驟。
OVCAR-3、SKOV-3、及TOV-112D卵巢癌細胞株及HeLa係購自American Type Culture Collection(Rockville,MD)。以含有10%胎牛血清(FBS)、青黴素(100units/ml)/鏈黴素(100μg/ml)、0.1mM非必需胺基酸及1mM丙酮酸鈉(Invitrogen)之DMEM及Ham's F-12培養基(1：1)(Invitrogen,Carlsbad,CA)培養OVCAR-3及SKOV-3細胞。以添加15% FBS、青黴素及鏈黴素之MCDB105及Media 199(1：1)(Sigma,St. Louis,MO)培養TOV-112D細胞。以含有10% FBS之DMEM培養HeLa細胞。
國家衛生研究院人體試驗委員會許可下，收集12個腹水檢體及36個組織切片檢體。腹水檢體之組織學亞型分別為10個漿液性、1個亮細胞及1個黏液性亞型，而組織檢體包含16個漿液性、9個類子宮內膜、6個亮細胞、4個黏液性及1個類子宮內膜/亮細胞混合亞型。對照組血清係收集自10個年齡符合之健康女性。以固定式A/G(Pierce,Rockford,IL)並遵照廠商說明書指示純化受試者之腹水及血清檢體之免疫球蛋白G(IgG)。
利用Ph.D.-7噬菌體呈現肽系統(New England BioLabs,Beverly,MA)進行呈現卵巢癌病人惡性腹水抗體所辨識之肽之噬菌體純系之血清學選擇。根據廠商之說明書指示做些許改良，進行生物親和性篩選(bio-panning)程序。簡言之，以健康對照組IgG混合物將非專一性結合物移除後，使噬菌體(1011
pfu)與預先塗覆於96孔盤之純化自32個卵巢癌病人之IgG抗體(100μg/ml)於室溫下反應2小時。以TBST溶液(50mM Tris-HCl(pH 7.5)、150mM NaCl、0.1%Tween-20)洗滌10次，以移除未結合之噬菌體。以溶離緩衝液(0.2M Glycine-HCl(pH 2.2)、1mg/ml BSA)溶離結合之噬菌體，並於37℃強力振盪4至5小時，以感染E. coli
宿主細胞(純系ER 2738)並使噬菌體增殖。之後離心並丟棄細胞。添加1/6體積之PEG/NaCl溶液(20%(w/v)聚乙二醇-8000、2.5M NaCl)至上清液並以16,000xg於4℃離心15分鐘，以收集擴增之噬菌體。以TBS(50mM Tris-HCl(pH 7.5)，150mM NaCl)將所得之噬菌體重新懸浮，並利用LB/IPTG/Xgal盤依照說明書所提供之方法測定噬菌體之效價。上述生物親和性篩選程序重複3次以上，以增加抗體結合之噬菌體純系。
以直接DNA定序定出結合之噬菌體所呈現之肽序列。從15個藍色溶菌斑中隨機選擇噬菌體，使其於E. coli
宿主細胞內增殖，並依上述沉澱及離心步驟收集。將所得之離心顆粒重新懸浮於100μl之碘緩衝液(10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA,4M NaI)中，並加入250μl之乙醇。培養10分鐘後，單股噬菌體DNA會優先沉澱出來，之後將其溶解於30μl TE緩衝液(10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA)中。以自動DNA定序儀ABI 8700直接定序編碼所呈現肽之DNA插入片段。
序列分析結果顯示，87%(13/15)之所選擇之噬菌體純系呈現一個一致基元(consensus motif)X1
-P-H-X2
-Y-X3
-X4
。將純化之抗體塗覆於孔中進行ELISA分析，以測定含有肽#10之噬菌體與純化自12個卵巢癌病人之個別抗體之結合。洗滌後，以辣根過氧化酶(HRP)結合之抗-M13抗體(1:2000)偵測結合之噬菌體，並與ABTS過氧化酶受質(KPL,Caithersburg MD)反應以顯現結果。對照組孔則以10μg/ml BSA或100μg/ml純化之IgG混合物或取自健康受試者之血清。不呈現任何肽之M13噬菌體作為負對照組。
以FJ10213質體作為本實驗中編碼KIAA0999蛋白質之模板。以Sal I及Not I酵素切割基因插入片段，將其鈍化(blunted)並次選殖入pcDNA3.1質體之EcoR V位置，稱為pcDNA-FJ10213。基於NCBI GenBank所提供之FJ10213基因序列(編號：AB023216)，藉由將FJ10213純系之核苷酸2278至3336選殖入pBlueScript質體EcoRI切位，以建構myc-標記質體(稱為myc-CT-OV1)。該DNA插入片段編碼具有353個胺基酸之OVTA1 C端部份蛋白質，包含噬菌體純系辨認之一致基元TPHGYAH。利用一對下列引子以定點突變誘發產生缺乏該一致序列之質體myc-CT-OV1 del-7mer。
前置引子：5'-GCT TCC TCA CCC ACC CCG CAG CCG GCA CTG ATG CAT-3'(SEQ ID NO:6)；
反置引子：5'-ATG CAT CAG TGC CGG CTG CGG GGT GGG TGA GGA AGC-3'(SEQ ID NO:7)。
為產生專一性結合至OVTA1之抗血清，將核苷酸2863至3336(SEQ ID NO:4)選殖入pGEX-KG質體之5'-Xba I及3'-Xho I切位，並使其於E. coli(JM109純系)表現。接著依先前實驗(Clinical Cancer Research,2006 Oct 1;12(19):5746-5754)所述方法純化GST-標記重組蛋白，以該重組蛋白作為施打於兔或鼠之免疫抗原。以Melon膠IgG純化系統(Pierce Biotechnology,Inc.,IL,U.S.A.)依照廠商之說明書指示純化所得之抗血清。為進行細胞內之功能性研究，將具有核苷酸438至4229(SEQ ID NO:1)之全長OVTA1基因建構至載體(pcDNA3-myc)，並表現Myc-OVTA1重組蛋白質。另外，自Open Biosystems(Huntsville,AL,U.S.A.)購得表現小片段干擾RNA以降低OVTA1表現之質體(稱為pshOVTA1(純系編號：RHS3979-9604860))以及其擾亂對照(scramble control)pLKO.1。OVCAR-3細胞內OVTA1基因表現穩定增加，同時，以pshOVTA1轉染SKOV-3細胞可削弱其表現。
嘗試選擇更多可被純化自卵巢癌病人腹水之自體抗體辨識之免疫原性腫瘤相關抗原。利用7-聚體隨機肽噬菌體呈現庫進行篩選。圖1之圖表說明本篩選之生物親和性篩選實驗。使庫預吸附純化自30位健康供給者之總免疫球蛋白G(IgG)，以遮蔽IgG辨識之肽抗原決定位。接著，利用各個純化自32位卵巢癌病人之腹水IgG來選擇呈現潛在腫瘤相關肽之噬菌體。經過4次生物親和性篩選增強循環後，15個噬菌體純系中有13個呈現如下表1所示之一致性xPHxYxx序列。
直接定序插入之編碼所呈現肽之核苷酸序列，以顯示抗體結合噬菌體所呈現之肽。經過第4次生物親和性篩選後之15個隨機選擇之抗體結合噬菌體所呈現肽序列示於表1。有趣的是，由此等所呈現之肽序列可得到一致基元X1
PHX2
YX3
X4
。含有上述所呈現肽序列之推定蛋白質(於NCBI蛋白質資料庫所搜尋到)示於表1之右欄中。其中，一含有肽#10之新穎人類基因暫時命名為OVTA1基因，其經鑑定為KIAA0999序列的一部份。由KIAA0999編碼之推定多肽含有Pro-His-Gly-Tyr-Ala-His序列。因此，此結果顯示，上述噬菌體所呈現之肽序列可能與腫瘤抗原有關。此外，圖2之數據顯示呈現TPHGYAH肽之噬菌體純系可強力結合至純化自卵巢癌病人11(CA502)之腹水抗體。
為確認本發明之抗原多肽為病人11(CA502)腹水抗體之免疫原性標的，將編碼40kDa含有Pro-His-Gly-Tyr-Ala-His序列之Myc-標記多肽之OVTA1基因之推定3'-編碼區自SK-OV3細胞選殖出。HeLa細胞(其過度表現以myc序列標記並以純化之病人11抗體或抗Myc抗體為探針之推定C端OVTA1基因)之西方墨點分析結果(見實例2)顯示，含有本發明C端之肽#10確實為病人11腹水自體抗體之免疫原性標的(圖3A)。為進一步確認Pro-His-Gly-Tyr-Ala-His序列是否為該抗體之主要免疫原性抗原決定位，產生缺乏此選殖之噬菌體所呈現之特定序列之缺失突變。有趣的是，若將該序列移除，會徹底破壞病人自體抗體辨認本發明抗原多肽(圖3B)，此結果顯示，本發明抗原多肽所含之該特定序列為用於腫瘤免疫監控之高度免疫原性抗原決定位。
利用先前研究(BMC Molecular Biology 2007,8:72 pp. 1-15)所述方法製備胞溶物。在廠商說明書指示下，利用脂質轉染胺(Invitrogen Co.,CA,U.S.A.)以編碼野生型、突變KIAA0999基因之質體或對照組載體轉染HeLa細胞或利用脂質轉染胺2000轉染試劑以編碼野生型、突變KIAA0999基因之質體或對照組載體轉染OVCAR-3及SKOV-3細胞。轉染24小時後，以細胞溶解緩衝液(20mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.1% SDS、5mM MgCl2
、10%甘油、0.5% NP-40、100mM NaF、1M Na3
VO4
及蛋白酶抑制劑混合物(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN,U.S.A.))溶解細胞。利用BCA蛋白質分析法(Pierce)定量蛋白質濃度。取約15或150μg之每個樣本以7.5至10% SDS-PAGE分離，並轉漬至硝化纖維膜，之後以專一性結合至myc-tag(稀釋倍數1:10,000)、GST-tag(稀釋倍數1:1,000)(Pierce)、OVTA1(稀釋倍數1:1,000)之抗體或CA502經純化之腹水抗體(32μg/ml)進行墨點。以利用結合HRP之抗-小鼠、-兔或-人類IgG(Jackson ImmunoResearch,Cambridgeshire,UK)探測法來偵測免疫複合物，並利用SuperSignal化學發光偵測系統(Pierce,Rockford,IL)顯像結果。
進行北方及西方點分析，以確認卵巢細胞中OVTA1天然轉錄物及其所編碼之多肽之確實大小。利用包含編碼7-聚物肽之序列之反義探針進行北方墨點分析，結果顯示，SK-OV3及TOV-112D細胞之約4.5kb條帶為其OVTA1基因之主要對應轉錄物，而OVCAR3細胞之轉錄物表現量則明顯較低(圖4)。同時，建構與GST標記序列融合之重組CT-OVTA1基因，並表現及純化該重組抗原，用以產生專一性結合OVTA1之兔抗血清。以西方墨點法分析表現myc-標記CT-OVTA1基因或對照組載體之HeLa細胞，以確認該抗血清之專一性(資料未顯示)。如先前一貫之結果，SK-OV3及TOV-112D細胞之主要免疫反應性蛋白質之分子量為約150KDa，但OVCAR3細胞則幾乎未偵測到(圖5)。利用活體外轉錄物及轉譯偶合系統之實驗結果顯示，NCBI資料庫公開之推定KIAA0999序列(編號：AB023216)上的編碼基因(即本發明之OVTA1基因)可被轉錄成150KDa多肽鏈(圖5)，且對於OVTA1抗血清具免疫反應性(資料未顯示)。綜上所述，上述結果明確指出，OVTA1基因為功能性對偶基因並編碼一卵巢癌細胞之150KDa蛋白質。
利用兩對位於OVTA1基因3'-編碼區及-非轉譯區之基因專一性引子進行來自12位正常人類組織之cDNA庫之聚合酶鏈鎖反應(PCR)，以確認OVTA1於各種組織中之基因表現。圖6之巢式PCR分析結果顯示，OVTA1普遍存在於多種組織中，唯其於各組織表現量明顯不同。其於肺、心及睪丸表現量較高，而於腦及卵巢表現量則明顯偏低。
建立OVCAR3穩定純系：
利用RT-PCR(正義：5'-CGG GAA TTC TCT CAG CAA CAT GCC AGG C-3'(SEQ ID NO:23)；反義：5'-AAT GAA TTC TCA GTT GAT TAG GGC AGA-3'(SEQ ID NO:24))自SK-OV3卵巢癌細胞建構OVTA1基因。利用下列專一性引子建構pcDNA-OVTA1質體：5'-CGC CAG TGT GCT GGA ATT CTG CTG TCC GGC GCG AGC-3'(SEQ ID NO:25)；反義：5'-GCA TGC TCG AGC GGC CGC TTA CAC GCC TGC CTG CTC CAT-3'(SEQ ID NO:26)。以1μg pcDNA-OVTA1質體轉染OVCAR3細胞，以建立OVTA1穩定純系，或以pcDNA3.1轉染，作為載體對照組。4週後從含有400μg/ml G418之培養基中選出穩定純系。以RT-PCR及西方墨點分析確認表現量。
已知SK-OV3細胞相較於OVCAR3細胞具有較高之活體外增生速率。以pLKO.1-shOVTA1轉染SK-OV3細胞或以pLKO.1載體轉染作為模擬對照組，以研究OVTA1是否與卵巢腫瘤發生有關。同時，以pcDNA或pcDNA-OVTA1載體轉染OVCAR3細胞。RT-PCR及西方墨點結果顯示，pcDNA-OVTA1轉染之OVCAR3細胞之OVTA1 mRNA及蛋白質表現量增加(圖7)。
利用活體外細胞穿透分析進行細胞遷移實驗。使5x104
細胞重新懸浮於不含血清之培養基中，並將其種於含有8μm孔徑膜之細胞培養盤內槽(Costar,Cambridge,MA,USA)。將細胞培養盤內槽置於預先填注含有10%FBS之M199培養基之孔後，將細胞於37℃培養6小時。依廠商說明書(Costar)之指示計數因趨化作用而從細胞培養盤內槽上腔室遷移至下側之細胞數。
OVCAR3細胞中過度表現OVTA1會使其細胞增生速率(圖8A)及細胞遷移(癌轉移)(圖8B)較對照組顯著增加2.75至3.1倍。
製備含有
5'-CCGGGCCAGGCTTTATCTTATCAAACTCGAGTTTGATAAGATAAAGCCTGGCTTTTTG(SEQ ID NO:27)之pLKO.1-shOVTA1載體及pLKO.1對照組載體(Open Biosystems)。以1μg pLKO.1-shOVTA1轉染SK-OV3細胞或以1μg pLKO.1轉染SK-OV3細胞作為對照組。以2.5μg/ml嘌呤黴素選擇穩定純系歷時4週，並利用RT-PCR及西方墨點分析干擾效率。RT-PCR及西方墨點分析結果顯示，降低表現實驗中，以pLKO.1-shOVTA1轉染之SK-OV3細胞之OVTA1 mRNA及蛋白質表現受到抑制(圖9)。結果，抑制SK-OV3細胞之OVTA1表現明顯抑制細胞增生速率(圖10A)及細胞遷移(圖10B)。綜上所述，上述結果顯示，OVTA1之高表現量可能會促進人類卵巢癌細胞增生及遷移。
自台灣花蓮慈濟大學購得5至6週大之SCID小鼠。於特定無病原菌條件下飼養動物，並提供其無菌食物及水。使小鼠適應至少6天。以SK-OV3及含有pLKO.1-shOVTA1或對照組載體之轉染物經皮下注射小鼠(每隻小鼠於無菌條件下注射溶於0.1ml磷酸鹽緩衝之鹽溶液之1x106
個細胞)。每週觀察並以測徑規(caliper)測量腫瘤長寬以記錄腫瘤大小。腫瘤體積係由腫瘤長寬之測量值計算如下：腫瘤體積=長x寬2
xπ/6(參考)。
以經pLKO.1-shOVTA1或對照組載體轉染之SK-OV3細胞經皮下注射SCID小鼠，以進一步研究OVTA1於活體內所扮演角色。每週監測每隻小鼠內之腫瘤生長狀況。細胞接種後總共測量腫瘤大小8週。經皮下注射SK-OV3細胞之所有小鼠均長出腫瘤，而接種SK-OV3/shOVTA1細胞之小鼠則否(圖11A)。降低OVTA1表現則會降低NOD-SCID小鼠之腫瘤生長速率(圖11B)。上述結果顯示OVTA1於腫瘤發展扮演關鍵角色。
經福馬林固定、石蠟包埋之組織樣品係來自合作醫院，利用習知方法以抗GST對照組抗體或對CA125(Dako,Carpinteria,CA)或OVTA1具專一性之抗體將樣品染色。將切片依序除蠟、復水並以PBS洗滌。經過20分鐘於10mM檸檬酸鈉(pH6.0)中進行之熱介導抗原回復(antigen retrieval)過程後，以洗滌緩衝液(10mM Tris-HCl(pH 7.4)及150mM氯化鈉)沖洗切片3次，隨後以3%過氧化氫處理5分鐘以阻斷內生性過氧化酶。經PBS洗滌後，使樣品與經稀釋之一級抗體(CA125之稀釋倍數1:20、OVTA1兔抗血清之稀釋倍數1:4000或自製兔抗-GST抗血清之稀釋倍數1:2000)於室溫下反應1小時或於4℃反應隔夜。利用LSAB套組(Dako)偵側一級抗體，並以蘇木清複染切片。OVTA1及CA125之表現狀態係在最終放大倍率200x下經兩位病理學家獨立地在盲蔽條件下評估及分級。以顯微鏡解析矛盾得分(conflicting score)。
準備40個取自非癌卵巢之組織切片及39個取自卵巢癌組織之切片，並利用抗OVTA1或習知抗CA-125抗體研究其OVTA1及CA-125表現情況。免疫組織化學結果明確顯示，相較於正常卵巢組織或子宮腺肌症組織，OVTA1於卵巢癌組織過度表現。相反的，可於卵巢癌組織及子宮腺肌症組織偵測到CA-125抗原。圖12顯示代表性結果。統計結果總結於下表2。表2結果顯示，OVTA1抗原僅於卵巢癌組織中偵測到而非癌組織則否。綜上結果，OVTA1抗原相較於CA-125(其常規使用於偵測卵巢癌)為較佳之診斷性標的。
圖1顯示卵巢癌腫瘤相關肽之血清學鑑定。卵巢腫瘤相關肽之血清學鑑定係利用經修飾之噬菌體呈現技術進行。應用其中每個噬菌體呈現不同7聚體隨機肽之M13噬菌體庫。使該庫預先吸附純化自30位健康捐贈者(包括15位男性及15位女性)之免疫球蛋白IgGs，以遮蔽並移除該正常抗體所辨識之免疫原性抗原決定位。接著，使未結合之噬菌體以自32位卵巢癌病人所純化之抗體親和性篩選。增加呈現腫瘤相關肽之噬菌體之生物親和性篩選圖示於圖1中。於ELISA盤每一孔中分別塗覆純化之腹水或血清抗體，以自所得之庫中篩選潛在之腫瘤相關肽。
圖2顯示ELISA試驗中含有肽#10之噬菌體與純化自11位卵巢癌病人之抗體結合(1-12：以純化自12位病人之Ig作為偵測噬菌體#10之塗覆抗原；11c：以純化自病人11之Ig作為偵測M13噬菌體之塗覆抗原，作為對照組；nIg：以純化自30位正常個體之Ig作為偵測噬菌體#10之塗覆抗原；及nS：以正常血清作為偵測噬菌體#10之塗覆抗原)。將純化之抗體塗覆於每一孔中以進行ELISA試驗。以專一性結合至M13噬菌體之抗體偵測結合之噬菌體，並與ABTS(本試驗中之HRP受質)反應顯像結果。將純化或未純化之血清抗體或牛血清白蛋白塗覆於分開之孔中以作為背景對照組。另外，不現任何肽之M13噬菌體作為負對照組。結果顯示，具有肽#10之噬菌體專一性地結合至純化自病人11之抗體(CA502)。
圖3顯示確認OVTA1為CA502抗體之抗原性標的。為確認OVTA1為CA502抗體之抗原性標的，自人類胎腦cDNA庫選殖出推定基因之C末端(CT)，使其於HeLa細胞中以myc-標記蛋白質表現，並以CA502抗體探測。圖3A之西方墨點分析結果明確指出CA502抗體與含有肽#10序列TPHGYAH之C末端之陽性免疫反應性。以定點缺失突變進一步研究該肽是否為CA502抗體之免疫原性抗原決定位。將該肽自C末端刪除導致與CA502抗體之免疫反應性喪失(圖3B)，此結果顯示，隨機-肽噬菌體呈現系統為篩選抗原之免疫原性抗原決定位之有效工具。
圖4顯示測定卵巢癌細胞之OVTA1基因轉錄物大小。以北方墨點分析卵巢癌細胞以測定OVTA1基因轉錄物大小。將萃取自SK-OV-3、OVCAR3及TOV-112D細胞之總RNAs以含甲醛之變性凝膠解析。以[α-32 P]dATP放射性標定專一性結合至OVTA1基因轉錄物之反義序列，並使其與該等細胞萃取之RNA雜交。圖4中，共偵測到4條放射性標定之條帶，而4.5kb之轉錄物為所有受測試之卵巢癌細胞株中主要者。
圖5顯示揭示於NCBI資料庫之推定之KIAA0999基因可轉錄為150KDa多肽鏈。使用以OVTA1 C末端製得之兔抗血清進行西方墨點分析，結果顯示卵巢癌細胞持續表現4個蛋白質條帶(圖5)。所有細胞均發現有約150KDa之主要蛋白質，此結果顯示，OVTA1基因之編碼序列約為4.0Kb。
圖6顯示OVTA1普遍存在於多種組織中。
圖7顯示OVTA1於OVCAR-3細胞中過度表現。
圖8顯示OVTA1過度表現顯著增加OVCAR3細胞增生及細胞遷移。圖8A及8B顯示OVCAR3中OVCA1過度表現使細胞增生率及細胞遷移(轉移)相較於對照組分別顯著增加約2.75至3.1倍(圖8B)。
圖9顯示使SKOV-3細胞中OVTA1表現減少。
圖10顯示OVTA1表現減少顯著降低SKOV-3細胞生長及細胞移動。圖10A及10B分別顯示抑制SKOV-3之OVTA1表現會顯著抑制細胞增生率及細胞移動(轉移)。
圖11顯示OVTA1表現與腫瘤發展相關。圖11A顯示經皮下注射SK-OV3細胞之所有小鼠均長出腫瘤，而接種SK-OV3/shOVTA1細胞之小鼠則否。圖11B顯示降低OVTA1表現則會降低NOD-SCID小鼠之腫瘤生長速率。
圖12顯示免疫組織化學結果，其明確揭示，相較於正常卵巢組織(a)或子宮腺肌症組織(c)，OVTA1於卵巢癌組織(e)過度表現。相反的，可於卵巢癌組織(f)及子宮腺肌症組織(d)偵測到CA-125抗原。(b)顯示作為偵測CA-125抗原之對照組織正常卵巢組織。
(無元件符號說明)
Claims (15)
- 一種表現於卵巢癌個體內之經分離抗原多肽，其係由SEQ ID NO：4所示多核苷酸所編碼之胺基酸片段或由SEQ ID NO：3所示胺基酸片段所組成。
- 如請求項1之經分離抗原多肽，其係由SEQ ID NO：4所示之核苷酸序列組成之多核苷酸所編碼。
- 如請求項1之經分離抗原多肽，其係由SEQ ID NO：3所示之胺基酸序列組成。
- 一種多核苷酸，其編碼如請求項1之經分離抗原多肽。
- 如請求項4之多核苷酸，其係由SEQ ID NO：4所示之核苷酸序列組成。
- 如請求項4之多核苷酸，其中該編碼胺基酸片段之核苷酸序列係如SEQ ID NO：3所示。
- 一種抗體，其專一性結合至如請求項1之抗原多肽。
- 如請求項7之抗體，其中該抗原多肽C末端具有胺基酸序列Thr-Pro-His-Gly-Tyr-Ala-His。
- 如請求項7之抗體，其專一性結合至SEQ ID NO：3。
- 如請求項7之抗體，其為多株抗體。
- 如請求項7之抗體，其為單株抗體。
- 一種用於檢測個體卵巢癌之套組，其包含如請求項1之抗原多肽或如請求項7之抗體。
- 一種診斷個體罹患卵巢癌之方法，其包含：於足以偵測該表現之條件及時間下，偵測取自個體之生物檢體中之下列抗原多肽之表現： (a)一種包含與SEQ ID NO：2具有至少85%序列同一性之胺基酸序列之多肽；(b)由在高度嚴格條件下與SEQ ID NO：1雜交之多核苷酸或SEQ ID NO：1之全長互補序列所編碼之多肽；(c)包含與SEQ ID NO：1具有至少85%序列同一性之核苷酸序列之多核苷酸所編碼之多肽；及(d)一種含有SEQ ID NO：4所示多核苷酸所編碼之胺基酸片段或含有SEQ ID NO：3所示胺基酸片段之多肽；其限制條件為該多肽序列包含於(a)、(b)或(c)中；其中該抗原多肽表現代表罹患卵巢癌，且相較於罹患卵巢癌之個體，該抗原多肽之表現量增加代表其不但罹患卵巢癌且卵巢癌已轉移。
- 一種診斷個體罹患卵巢癌之方法，其包含：於足以偵測抗體與該一致序列結合之條件及時間下，使取自個體之生物檢體與如請求項7之抗體接觸，以測定該生物檢體中是否存在如請求項1之抗原多肽，其中該結合代表罹患卵巢癌。
- 如請求項13或14之方法，其中該生物檢體係選自由以下所組成群：卵巢組織、卵巢細胞、血液、血清、血漿、腹水及腹膜液。
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Non-Patent Citations (1)
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| NCBI GenBank Accession number : Q9Y2K2 (version 57), 2008/07/22 Petroziello, J et al., "Suppression subtractive hybridization and expression profiling identifies a unique set of genes overexpressed in non-small-cell lung cancer", ONCOGENE, Vol.23, No.46, p. 7734-7745, 2004/08/30 * |
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