TWI392498B

TWI392498B - 戊糖乳桿菌ｌｐｓ１６及其在抑制幽門螺旋桿菌之用途

Info

Publication number: TWI392498B
Application number: TW99123683A
Authority: TW
Inventors: Chin Sheng Lin; Hsing Fen Li; Jiunn Jong Wu; Po Xing Zheng
Original assignee: Synbio Tech Inc
Priority date: 2010-07-19
Filing date: 2010-07-19
Publication date: 2013-04-11
Also published as: TW201204373A

Description

戊糖乳桿菌LPS 16及其在抑制幽門螺旋桿菌之用途

本發明係關於一種乳酸菌，特別是一種具有抑制幽門桿菌(Helicobacter pylori )能力之戊糖乳桿菌LPS16。

幽門桿菌(Helicobacter pylori )為革蘭氏陰性菌，係近十年來臨床醫學發展上極具意義的重要致病菌之一，已知幽門桿菌為造成胃潰瘍(gastric)的主要因素，與多種臨床胃部疾病如胃炎(gastritis)、萎縮性胃炎(atrophic gastritis)、消化性潰瘍(peptic ulcer)，甚至是胃癌(gastritic cancer)都有直接的關係，世界衛生組織已將幽門桿菌列為第一級致癌物質；根據統計，全球人口中，50%以上已遭受幽門桿菌的感染，而台灣地區更為幽門桿菌感染之高感染率國家，多數人口在成年前即受到感染，然而，僅有10~20%的感染者出現胃潰瘍、消化道潰瘍或胃癌不等症狀，對現代人健康危害甚鉅。

臨床治療幽門桿菌的方式多採用三合一療法(triple therapy)，主要係合併兩種抗生素及一種質子孔道抑制劑(proton-pump inhibitor)進行治療，舉例說明之，目前台灣地區成功大學附設醫院對於幽門桿菌所引發之消化道疾病係採用青黴素系列抗生素(amoxicillin)及克拉黴素(clarithromycin)搭配奧美拉唑制酸劑(omeprazol)之組合進行治療；然而，利用該三合一療法治療幽門桿菌的方法成功率僅為80~95%，且多數患者仍無法免除併發消化性潰瘍的危機，並且，該三合一療法主要係以抗生素為主要作用機制，服用後易影響患者腸道中正常菌相之分佈，導致腹痛、腹瀉及脹氣等副作用之產生，再者，長期使用抗生素易引發細菌抗藥性的問題，使得該三合一療法之治癒率更加不樂觀；另外三合一療法的花費較高，往往造成患者沉重的負擔卻無法有效治癒疾病。

近年來陸續有報導指出特定的乳酸菌[如鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus )、約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii )、乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei )、加氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri )以及雷特氏B菌(Bifidobacterium lactis )等]，具有抑制幽門桿菌生長的功能；習知具有抗幽門桿菌能力之乳酸菌如中華民國公開第200530395號「具抗幽門桿菌能力之乳酸菌株及含彼之組合物」專利案係揭示一種可抑制幽門桿菌生長之糞腸球菌(Enterococcus faecium )，以應用於製造抗幽門桿菌之醫藥食品；而日本專利公開第JP2001258549A號專利案與美國專利公告第US6491956則分別係揭示一種具有抑制幽門桿菌特性之嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus )及一種可預防幽門桿菌感染之食品，該食品係含有可抑制幽門桿菌生長之一嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus HY2177)及一乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei HY2743)；上述各乳酸菌抑制幽門桿菌生長的機制皆尚未完全明瞭，可能係透過乳酸菌所分泌的代謝產物，如乳酸、抗菌胜肽(antimicrobial peptides)，菌體內的蛋白質或是競爭在胃細胞上的附著來抑制幽門桿菌的生長。

目前雖有多種習知乳酸菌已用於製備具有抑制幽門桿菌功效之商品；然而，多數商品對於幽門桿菌的抑制效果偏低，並且，可運用於商品製備之習知乳酸菌的選擇有限，無法進一步提升各商品的抑菌效果；有鑒於近年來幽門桿菌對台灣人口所造成之高威脅性及高感染率，多重性抗藥型菌株引發胃癌、十二指腸潰瘍及胃潰瘍患者之低治癒率，以及醫療成本與日俱增等問題，應開發具有較佳抑制幽門桿菌能力之新穎性菌株，以有效提升臨床醫療上對於幽門桿菌之預防及治療效果，避免抗生素的過度使用及其副作用的衍生。

本發明之主要目的係提供一種抑制幽門桿菌之戊糖乳桿菌，具有限制幽門桿菌生長之能力。

本發明之次一目的係提供一種抑制幽門桿菌之戊糖乳桿菌，可針對幽門桿菌之臨床抗藥性菌株具有抑制效果。

本發明之再一目的係提供一種戊糖乳桿菌之用途，係將戊糖乳桿菌應用於製備用以抑制幽門桿菌感染之食品或藥物化合物。

為達到前述發明目的，本發明所運用之技術手段包含有：一種抑制幽門桿菌之乳酸菌，係屬戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus )，寄存編號為BCRC910467。

一種乳酸菌之用途，係將如上所述之戊糖乳桿菌，應用於製備用以抑制幽門桿菌感染之食品或藥物化合物

為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：本發明一種抑制幽門桿菌之戊糖乳桿菌LPS16(Lactobacillus pentosus LPS16)，係自一醃製食品中選殖而得，寄存編號為BCRC910467；該戊糖乳桿菌LPS16係具有幽門桿菌之殺菌能力，而過去係從未有抑制幽門桿菌生長之戊糖乳桿菌的相關報導，相較目前已開發應用之習知乳酸菌，該戊糖乳桿菌LPS16具有較佳之抑菌能力及抑菌效果，可應用於治療或預防消化道潰瘍之商品的製備。

請參照第1圖所示，本發明之戊糖乳桿菌LPS16係經由以下各方式處理而獲得，包含：乳酸菌之培養S1、乳酸菌之篩選與鑑定S2及乳酸菌之保存S3：

該乳酸菌之培養S1 ，係分離市售加工食品中所含有之乳酸菌，進行培養。取樣自一醃漬食品(如筍乾)，置於一培養液進行增殖培養(enrichment culture)，待適當培養時間後將該培養液進行序列稀釋，另接種至一培養基，挑選可生長之菌株。本實施例之增殖培養係將該醃漬食品以1:50之體積比例接種於一液態MRS培養基(MRS Broth)，以37℃培養20小時，得一增殖培養菌液，再以序列稀釋該增殖培養菌液，將稀釋後之聚積培養菌液以塗抹法接種一固態MRS培養基(MRS Agar)，挑選可生長之菌株；該液態MRS培養基與固態MRS培養基之配方如下表所示。

該乳酸菌之篩選與鑑定S2 ，係由所分離之數乳酸菌菌株中挑選對幽門桿菌具有抑制能力之菌株。將所分離之數菌株以紙錠擴散法進行抑菌(幽門桿菌)能力的測試，挑選抑制能力較為顯著的菌株，即為本發明之乳酸菌；該乳酸菌係依照其物理型態、生理特性或分子特徵等判斷其菌種分類。本實施例係將該乳酸菌進行格藍氏染色、觸酶反應及16SrDNA之分子鑑定，由該乳酸菌之染色圖(革蘭氏染色陽性)、16SrDNA部分序列及觸酶反應試驗(反應呈陰性)等鑑定結果確定本發明之乳酸菌係為一戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus )，命名為LPS16，寄存編號為BCRC910467，該戊糖乳桿菌之生化測試結果中，GLY、LARA、RIB、DXYL、GAL、GLU、FRU、MNE、RHA、DUL、MAN、SOR、MDG、NAG、AMY、ARB、ESC、SAL、CEL、MAL、LAC、MEL、SAC、TRE、MLZ、RAF、GEN、TUR、DARL及GNT試驗為正反應，ERY、DARA、LXYL、ADO、MDX、SBE、INO、MDM、INU、AMD、GLYG、XLT、LYX、TAG、DFUC、LFUC、LARL、2KG及5KG試驗為負反應，其詳細鑑定結果如第4及5圖所示。

該乳酸菌之保存S3 ，係使該戊糖乳桿菌LPS16可以穩定於低溫環境下長久存放，以便後續使用。將本發明之戊糖乳桿菌LPS16接種至該固態MRS培養基，以37℃培養48小時後挑選單一菌落轉殖至一BHI培養液(配方如第3表所示)，以進行冷凍保存；該BHI培養液中較佳係混合30%之抗凍劑(如甘油)，暫存於-80℃之恆溫保存室，待後續使用。

本發明戊糖乳桿菌LPS16係具有吸附於宿主消化道細胞的特性，主要透過所分泌的殺菌物質而達到抑制幽門桿菌的效果。請參照第2圖所示，係將本發明之戊糖乳桿菌LPS16以螢光標定後吸附兩組胃上皮細胞後，以流式細胞儀測定該胃上皮細胞所顯示之螢光強度；本實施例係依照Sheu等人於2007年所發表之方式進行試驗，係利用一螢光處理套組(PKH2 Green Fluorescence Cell Linker Kit；Sigma,Missouri,USA)進行戊糖乳桿菌LPS16之螢光標定，所標定的戊糖乳桿菌LPS16可產生綠色螢光，將定量之戊糖乳桿菌LPS16分別針對兩組胃上皮細胞(包含人類胃上皮細胞腺腫瘤細胞株AGS與MKN45)進行吸附試驗，其較佳感染濃度係MOI=100，即以5×10⁷ CFU之戊糖乳桿菌LPS16感染5×10⁵ 顆胃上皮細胞，本實施例所選用之人類胃上皮細胞腺腫瘤細胞株AGS與MKN45，係分別購自台灣食品工業發展研究所及日本HS研究資源銀行 (Health Science Research Resources Bank)，詳細感染情形紀錄於第4表：

由第2圖結果，其中，該螢光測量之背景值(2C)係為3左右，而螢光標定之戊糖乳桿菌LPS16在吸附AGS細胞株後，該AGS細胞所表現之螢光強度明顯增強，其螢光強度最高峰(Gmean)約為15，顯示該戊糖乳桿菌LPS16具有吸附至AGS細胞株的能力，另外，該戊糖乳桿菌LPS16在吸附MKN45細胞株後，該MKN45細胞所表現之螢光強度同樣有顯著的增強趨勢，其螢光強度最高峰(Gmean)約為13，顯示該戊糖乳桿菌LPS16具有吸附至MKN45細胞株的能力；由上可知，本發明之戊糖乳桿菌LPS16確實具有吸附人類胃上皮細胞的特性，可長時間停留在人體消化道進行殺菌作用，因此，本發明之戊糖乳桿菌LPS16可以長時間於宿主消化道細胞上發揮其抑制幽門桿菌的能力。

請參照第3圖所示，係該戊糖乳桿菌LPS16之無菌上清液與一幽門桿菌共同培養後的菌量計數圖；本實施例係取樣自隔夜培養之戊糖乳桿菌菌液(即本發明戊糖乳桿菌LPS16之菌液)，以一離心沉澱的方式(較佳係以3500 rpm 之轉速)使菌體沉澱以便分離，收集所得之上清菌液，以過濾方式除去該上清菌液殘留的菌體部分，較佳以0.22微米(μm)之濾膜進行過濾，以獲得完全不含菌體之培養液，該培養液較佳係調整為適當濃度[如300奈克/微升(ng/μl)]以利於後續試驗之進行。

本實施例係將蛋白質濃度為300奈克/微升(ng/μl)之培養液(即戊糖乳桿菌LPS16之無菌上清液)與該幽門桿菌共同培養，並且，於不同時間以塗盤計數方式進行幽門桿菌的存活菌量分析，結果紀錄於第3圖(即3A)；而對照組(3B)則係以該MRS液態培養基取代本發明之培養液進行試驗。該幽門桿菌係購自台灣食品工業發展研究所，取一定菌量之幽門桿菌(如1x10⁸ CFU)於該培養液中共同培養，以進行計數試驗。

由第3圖結果，本發明戊糖乳桿菌LPS16之培養液與該幽門桿菌共同培養15分鐘後，該幽門桿菌的菌量則大量減少，由1×10⁸ CFU下降至1×10^1.5 CFU左右(由3A結果)，且於30~45分鐘下降至1×10⁰ CFU；相較於對照組(3B)，幽門桿菌的菌量於共同培養15~45分鐘後完全沒有減少的趨勢。由此結果顯示，該戊糖乳桿菌LPS16在培養的過程中可產生殺菌物質，殺死幽門桿菌；因此，本發明之戊糖乳桿菌LPS16係長時間吸附於宿主消化道細胞以所分泌的殺菌物質達到幽門桿菌抑制的效果。

為證實本發明之戊糖乳桿菌LPS16係具有較佳之抑菌能力，係分別測試該戊糖乳桿菌LPS16相較於其他習知乳酸菌之殺菌能力，以及該戊糖乳桿菌LPS16針對幽門桿菌之臨床抗藥性菌株所表現之抑制效果，觀察其殺菌結果。

請參考下方第5表所示，本實施例係自習知乳酸菌中節選數株已商品化之優酪乳酸菌株，以便進行試驗，該優酪乳酸菌株係包含一雷特氏B菌(Bifidobacterium lactis )、一嗜乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus )及一保加利亞桿菌(Lactobacillus bulgaricus )，係分別取定量之濃縮菌液(包含習知乳酸菌及本發明戊糖乳桿菌LPS16之菌液)以紙錠擴散試驗的方式針對數株幽門桿菌進行殺菌效果之比較。於本實施例中所採用之幽門桿菌(No.1~3)係分別購自台灣食品工業發展研究所等地。

本實施例係取樣自隔夜培養之乳酸菌菌液(包含習知乳酸菌及本發明戊糖乳桿菌LPS16之菌液)，以3500 rpm之轉速將菌體沉澱且分離，所得之上清菌液再以0.22微米(μm)之濾膜過濾，以獲得完全不含菌體之培養液，該培養液以冷凍乾燥法濃縮至蛋白質濃度為2500奈克/微升(ng/μl)，滴入商用紙錠(BBL，Becton，Dickinson System)以製成數試驗紙錠。將該試驗紙錠貼於幽門桿菌之培養基，以適當環境培養2天，觀察該試驗紙錠所呈現之抑菌圈大小；其中，該培養環境係依照習知乳酸菌或本發明戊糖乳桿菌LPS16之培養條件而有不同，舉列說明之，本發明戊糖乳桿菌LPS16所製成之試驗紙錠較佳係培養在37℃之微需氧環境。

^a 本實施例所紀錄之抑制圈大小，係為三次紙錠擴散試驗後所得之平均抑菌圈大小。

由第5表結果，本發明之戊糖乳桿菌LPS16相較於其他習知乳酸菌，其對於幽門桿菌的抑制效果較佳，所呈現之抑制圈約為14.7~16mm，較其他乳酸菌所呈現之抑制圈(僅13~7mm左右)明顯為大；由此可證實，本發明之戊糖乳桿菌LPS16確實具有抑制幽門桿菌的能力且其抑菌效果較佳。

請參照第6表所示，係該戊糖乳桿菌LPS16施用於數株幽門桿菌臨床致病菌株的抑菌效果；該幽門桿菌致病菌株係篩選自台灣的醫療單位，挑選具有多重抗藥性或能引發胃癌、十二指腸潰瘍等消化道疾病之致病菌株共20株以進行紙錠擴散試驗。本實施例係收集成大醫院所分離之數幽門桿菌，依照分離患者的病歷資料將該幽門桿菌予以分群，如胃炎(Gastritis)為G群，胃潰瘍為(Gastric ulcer)為GU群，胃癌(Gastric cancer)為GC群，而十二指腸潰瘍(Duodenal ulcer)則歸為DU群；該幽門桿菌遵照標準操作流程(Clinical and Laboratory Standards Institute；CLSI)之程序進行抗生素抗藥性的試驗，分別測量該幽門桿菌對青黴素系列抗生(amoxicillin)、克拉黴素(clarithromycin)、甲硝唑(metronidazole)、與環丙氟哌酸(ciprofloxacin)等抗生素的最小抑菌濃度，若其最小抑菌濃度超過抗生素的臨界濃度，則定義為抵抗型，舉例說明之，若該幽門桿菌對青黴素系列抗生素之最小抑菌濃度超過0.5微克/毫升(μg/ml)，則定義為青黴素系列抗生素(amoxicillin)抵抗型，而可以抵抗超過一種以上抗生素，則定義為多重性抗藥型(multiple drug-resistant strain)，該幽門桿菌之詳細分類結果如第6表。

^a R係指該幽門桿菌為多重性抗藥型菌株^b 本實施例所紀錄之抑制圈大小，係為三次紙錠擴散試驗後所得之平均抑菌圈大小。

由第6表結果，本發明之戊糖乳桿菌LPS16對於20株幽門桿菌之臨床致病菌株具有良好的抑制效果，可呈現10~15mm左右之抑制圈；其中，該戊糖乳桿菌LPS16分別對於臨床上引起十二指腸潰瘍(6-16~6-20，6-12，6-14)、胃炎(6-15)及胃癌(6-1~6-5)的幽門桿菌具有不同程度的抑菌效果，其表現之抑菌圈大小為13.4~16mm，10.5mm及12~13.7mm左右；另外，對於具有多重抗藥性的幽門桿菌，該戊糖乳桿菌LPS16仍可表現顯著的殺菌效果(由6-6~6-15結果所示)，其抑菌圈大小為9.7~16mm；因此，本發明之戊糖乳桿菌LPS16具有抑制幽門桿菌的能力，即使是對於具有多重性抗藥型之幽門桿菌菌株，或常見引起十二指腸潰瘍、胃癌等消化道疾病之臨床菌株皆具有良好的殺菌效果。

由上所述，本發明之戊糖乳桿菌LPS16可以吸附於宿主消化道細胞，於宿主體內釋放殺菌物質以產生抑菌能力；該戊糖乳桿菌LPS16具有優於市售發酵乳品的抑菌效果，可有效抑制臨床上多重性抗藥型之幽門桿菌，或其他常見引起消化道潰瘍之幽門桿菌；因此，該戊糖乳桿菌LPS16可應用於各種商用治療或預防幽門桿菌感染之藥用產品或食品的製備，如保健食品、醫用製劑或加工食品等，該戊糖乳桿菌LPS16可以單獨使用或與其他所需成分(如載劑、佐劑、溶劑及其他營養成分等)混合加工，製成各種產品形式，如錠劑、膠囊、飲品、粉末或滴劑等，可以依照產品形式之不同以各種方式給予個體，如口服、注射、吸入或塗抹等，以有效控制幽門桿菌之感染及其所引發之消化道疾病。

本發明一種抑制幽門桿菌之戊糖乳桿菌LPS16，係可以長時間於宿主胃壁細胞分泌殺菌物質，限制幽門桿菌於宿主消化道之生長，具有殺死幽門桿菌之功效。

本發明一種抑制幽門桿菌之戊糖乳桿菌LPS16，可有效抑制幽門桿菌之臨床抗藥性菌株，以及臨床上引發十二指腸潰瘍、胃癌等之致病菌株，具有良好的幽門桿菌抗性，為本發明之功效。

本發明一種戊糖乳桿菌LPS16之用途，係將如上所述之一種抑制幽門桿菌之戊糖乳桿菌LPS16應用於商用抑菌產品的製備，以進一步控制幽門桿菌感染，為本發明之功效。

雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

第1圖：本發明戊糖乳桿菌LPS16之處理流程圖。

第2圖：本發明戊糖乳桿菌LPS16之胃細胞吸附能力示意圖。

第3圖：本發明戊糖乳桿菌LPS16之殺菌效果示意圖。

第4圖：本發明戊糖乳桿菌LPS16之菌種鑑定結果。

第5圖：本發明戊糖乳桿菌LPS16之菌種鑑定結果。

Claims

一種抑制幽門桿菌之乳酸菌，係一種經分離之戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus )，寄存編號為BCRC910467，該戊糖乳桿菌之生化測試結果中，GLY、LARA、RIB、DXYL、GAL、GLU、FRU、MNE、RHA、DUL、MAN、SOR、MDG、NAG、AMY、ARB、ESC、SAL、CEL、MAL、LAC、MEL、SAC、TRE、MLZ、RAF、GEN、TUR、DARL及GNT試驗為正反應，ERY、DARA、LXYL、ADO、MDX、SBE、INO、MDM、INU、AMD、GLYG、XLT、LYX、TAG、DFUC、LFUC、LARL、2KG及5KG試驗為負反應。
一種乳酸菌之用途，係將依申請專利範圍第1項所述之戊糖乳桿菌或其代謝產物，應用於製備用以抑制幽門桿菌感染之食品或藥物化合物。