TWI390040B - 重組的核苷酸序列、包含其之細胞或載體、所編碼出之單鏈抗聚乙二醇膜抗體與造影套組 - Google Patents
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Description
本發明關於一種新的報告基因系統，且特別關於以編碼出重組的單鏈抗(或辨認)聚乙二醇膜抗體的核苷酸序列作為報告基因來監測基因與細胞之表現與分布情形。
發展無致免疫性(non-immunogenic)和專一性(specific)的報告基因(reporter gene)用以進行活體監測基因與細胞的表現與分布情形，對基因或細胞治療的最佳化是非常重要的。
目前針對非侵犯性的造影所開發的報告基因有兩大類：(1)外生性報告基因：此類報告基因大多來自非哺乳類系統，如疱疹病毒胸腺嘧啶核苷磷酸酶(Thymidine kinase)、細菌性胞核嘧啶去胺酶(Cytosine deaminase)、綠色螢光蛋白(Green fluorescent protein)，他們大多來自病毒或細菌，雖有專一性，但因其是外生性抗原，而這些外源性基因的產物常會引發免疫反應，導致組織的損傷、限制報告基因的持續表現和定位造影，而影響基因的長期表現，這對其臨床應用上會受到很大的限制；(2)內生性報告基因：如人類的多巴胺受器(Dopamine D2 receptor)和轉鐵蛋白受器(Transferrin receptor)，雖然這些內源性報告基因都不易引發免疫反應，但多巴胺受器和轉鐵蛋白受器廣泛地表現於正常活體中，因此限制了它們的專一性與使用性。故開發低免疫性且高專一性之報告基因將是一重要課題。抗(或辨認)聚乙二醇膜抗體屬於內生性報告基因，正符合低免疫性且高專一性之特性與條件。
本發明提供一種重組的核苷酸序列，其編碼出一重組的單鏈抗(或辨認)聚乙二醇膜抗體，包括：序列辨識號1之序列、序列辨識號2之序列、序列辨識號3或序列辨識號4之序列。
本發明另提供一種載體上述之重組的核苷酸序列。
本發明也提供一種細胞包括上述之重組的核苷酸序列。
本發明還提供一種細胞包括前述之載體。
本發明又提供一種重組的單鏈抗聚乙二醇膜抗體，包括：一第一部份，包括一輕鏈變異-Kapa保留區(VL-CK)，其胺基酸序列為序列辨識號5或序列辨識號6之序列；以及一第二部份，包括一重鏈變異-重鏈第一保留區(VH-CH1)與穿膜區，其中該第二部份之胺基酸序列包括序列辨識號7或序列辨識號8之序列，又該第一部份與第二部分以雙硫鍵連接。
本發明更提供一種前述之細胞的使用方法，包括：(a)提供一具有上述細胞的活體，其中該細胞表現該重組的單鏈抗聚乙二醇膜抗體於其細胞膜上；(b)將一聚乙二醇造影探針注入該活體中，而聚乙二醇造影探針會專一結合至該重組的單鏈抗聚乙二醇膜抗體，其中該聚乙二醇造影探針為聚乙二醇連接一造影劑所形成；以及(c)利用一造影系統觀察該活體內表現該重組的單鏈抗聚乙二醇膜抗體的區域。
為了讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，並配合所附圖示，作詳細說明如下：
第1圖顯示本發明一重組的核苷酸序列，序列辨識號：1之序列建構圖。首先以抗聚乙二醇之單株抗體融合瘤(hybridoma)的總RNA(total RNA)作為模板，並利用可以得到小鼠之所有抗體之輕鏈變異-Kapa保留區(VL-CK)基因序列的通用引子與重鏈變異-重鏈第一保留區(VH-CH1)基因序列的通用引子分別進行聚合酶鏈反應以取得抗聚乙二醇之單株抗體融合瘤之輕鏈變異-Kapa保留區(VL-CK)的基因序列(序列辨識號：9)101與重鏈變異-重鏈第一保留區(VH-CH1)的基因序列(序列辨識號：12)107。
編碼出寄主細胞表面蛋白酵素斷裂位(Furin-cleavage site)之核苷酸序列為序列辨識號：10之序列103，而編碼出口蹄疫病毒2A自體處理序列(2A self-processing sequence)之核苷酸序列為序列辨識號：11之序列105。
接著將序列辨識號：9-12之序列101-105依序連接起來，形成序列辨識號13之序列109，此步驟可以聚合酶鏈反應來達成。
然後再將編碼出B7穿膜區之核苷酸序列(序列辨識號14之序列)111接於序列辨識號：13之序列的3’末端，即形成本發明之重組的核苷酸序列，序列辨識號1，其編碼出一重組的單鏈抗聚乙二醇膜抗體。
在另一實施例中，可在序列辨識號：1之5’端前加上編碼出血球凝集素蛋白(HA)之核苷酸序列(序列辨識號15)，成為序列辨識號2，其也可編碼出一重組的單鏈抗聚乙二醇膜抗體。
又在另一實施例中，則可先將編碼出myc蛋白之核苷酸序列(序列辨識號：16)先接於序列辨識號13之序列的3’末端後，並且再將編碼出B7穿膜區之核苷酸序列(序列辨識號14之序列)接於序列辨識號：16之序列的3’末端形成序列辨識號：3之序列，其也可編碼出一重組的單鏈抗聚乙二醇膜抗體。
另也可將序列辨識號3之序列之5’端前加上編碼出血球凝集素蛋白之核苷酸序列(序列辨識號：15)形成序列辨識號：4之序列，其也可編碼出一重組的單鏈抗聚乙二醇膜抗體。其中含有序列辨識號：4之序列的質體(AGP3 scFab-B7etm/pLNCX Plasmid)已於民國98年8月25日寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 940572。
可將本發明重組核苷酸序列接於一待測基因之啟動子之後，做為一報告基因。藉由聚乙二醇造影探針可專一性結合至此報告基因所編碼出之重組的單鏈抗聚乙二醇膜抗體的特性，可觀察此待測基因於活體內之基因表現與分佈。而重組核苷酸序列所編碼出之重組的單鏈抗聚乙二醇膜抗體可表現於一細胞之細胞膜上。在一實施例中，上述細胞可包括幹細胞、腫瘤細胞或免疫細胞。一細胞或載體可包括本發明之重組的核苷酸序列，或一細胞可包括包含本發明之重組的核苷酸序列的或體。細胞可包括幹細胞、腫瘤細胞或免疫細胞，而載體可包括質體、病毒載體或非病毒載體。
而本發明之重組核苷酸序列在經細胞轉譯之後，2A自體處理序列會斷裂，使膜抗體胺基酸序列之重鏈與輕鏈分離，再於內質網(endoplasmic reticulum,ER)組裝成膜抗體，又於抗體之輕鏈與2A自體處理序列之間加入Furin蛋白酵素斷裂位(Furin-cleavage site)，因此在膜抗體進入高基氏體(Golgi apparatus)後，位於抗體輕鏈後端所殘餘的2A自體處理序列將被Furin蛋白酵素完全切除，使功能性的膜抗體表現於一細胞之細胞膜上。在一實施例中，上述細胞可包括幹細胞、腫瘤細胞或免疫細胞。第2圖顯示本發明之重組核苷酸序列所編碼出的重組的單鏈抗聚乙二醇膜抗體。重組的單鏈抗聚乙二醇膜抗體包括：一第一部份201，其包括一輕鏈變異-Kapa保留區(VL-CK)；以及一第二部份203，其包括一重鏈變異-重鏈第一保留區(VH-CH1)205與穿膜區207，且該第一部份201與第二部分203以雙硫鍵連接。
在一實施例中，重組的單鏈抗聚乙二醇膜抗體是以序列辨識號：1之序列進行編碼，因此其第一部份之胺基酸序列為序列辨識號5之序列而第二部份之胺基酸序列則為序列辨識號7。
在另一實施例中，重組的單鏈抗聚乙二醇膜抗體可以序列辨識號：2之序列進行編碼，因此其第一部份之胺基酸序列為序列辨識號6之序列而第二部份之胺基酸序列則為序列辨識號7。
又在另一實施例中，重組的單鏈抗聚乙二醇膜抗體可以序列辨識號：3之序列進行編碼，因此其第一部份之胺基酸序列為序列辨識號5之序列而第二部份之胺基酸序列則為序列辨識號8。
而在一其他實施例中，重組的單鏈抗聚乙二醇膜抗體可以序列辨識號：4之序列進行編碼，因此其第一部份之胺基酸序列為序列辨識號6之序列而第二部份之胺基酸序列則為序列辨識號8。
而包含本發明之重組核苷酸序列之細胞的使用方法可包括先提供一具有上述細胞的活體，其中細胞表現該重組的單鏈抗聚乙二醇膜抗體於其細胞膜上。接著將一聚乙二醇造影探針注入活體中，而聚乙二醇造影探針會專一結合至重組的單鏈抗聚乙二醇膜抗體，其中聚乙二醇造影探針為聚乙二醇連接一造影劑所形成。最後利用聚乙二醇造影探針可結合至單鏈抗聚乙二醇膜抗體的特性，可利用一造影系統觀察活體內表現重組的單鏈抗聚乙二醇膜抗體的區域。
而上述活體可包括哺乳動物。細胞可包括上述活體之內生細胞或為外來細胞。又上述之造影劑可包括任何能接上聚乙二醇之造影劑，例如螢光造影劑、氧化鐵奈米顆粒或放射線造影劑等。
【實施例】
首先以抗聚乙二醇之單株抗體融合瘤的總RNA作為模板，並利用可以得到小鼠之所有抗體之輕鏈變異-Kapa保留區(VL-CK)基因序列的引子(順向：序列辨識號：17；逆向：序列辨識號：18)與重鏈變異-重鏈第一保留區(VH-CHl)基因序列的引子(順向：序列辨識號：
19；逆向：序列辨識號：20)分別進行聚合酶鏈反應以取得抗聚乙二醇之單株抗體融合瘤之輕鏈變異-Kapa保留區(VL-CK)的基因序列(序列辨識號：9)與重鏈變異-重鏈第一保留區(VH-CH1)的基因序列(序列辨識號：12)。
之後以序列辨識號：9與序列辨識號：12之序列分別作為第一模板與第二模板，並且以序列辨識號：21(順向)與序列辨識號22序列(逆向)作為第一模板的引子，而序列辨識號：23(順向)與序列辨識號24之序列(逆向)為第二模板之引子，進行聚合酶鏈反應，以得到序列辨識號：13之序列。其中序列辨識號：22之序列中具有整段之序列辨識號：10之序列，而序列辨識號23也具有整段之序列辨識號：11之序列，又序列辨識號：22與23具有一重疊區。
而聚合酶鏈反應之條件為：
(1)95℃，2分鐘
(2)95℃，30秒：60℃，30秒；68℃，2分鐘(循環3次)
(3)95℃，30秒，58℃，30秒，68℃，2分鐘(循環3次)
(4)95℃，30秒，56℃，30秒，68℃，2分鐘(循環3次)
(5)95℃30秒，54℃，30秒，68℃，2分鐘(循環3次)
(6)95℃，30秒，52℃，30秒，68℃2分鐘(循環3次)
(7)95℃，30秒，50℃，30秒，68℃，2分鐘(循環3次)
(8)72℃，8分鐘
(9)4℃保存
接著將序列辨識號：13之序列利用設計的限制酶切位(Sfi 1與Sal 1)轉植進入含有序列辨識號15、16與14之反轉錄病毒載體，其中將序列辨識號：13之序列位於序列辨識號15與16之間，如第3A圖所示。
同時以類似之方式建構於載體中之單鏈抗丹磺醯抗體核苷酸序列(控制組)，如第3B圖所示。
將含有本發明單鏈抗聚乙二醇膜抗體核苷酸序列(序列辨識號：4)之載體(pLNCX)與單鏈抗丹磺醯抗體核苷酸序列(序列辨識號：25)之載體(pLNCX)(控制組)分別轉殖表現於Balb-3T3細胞。經由西方點墨法來確認轉譯時重鏈與輕鏈是否分離。第4A圖顯示以抗HA抗原單株抗體進行西方點墨法以偵測單鏈膜抗體之輕鏈，而第4B圖顯示以抗myc抗原單株抗體偵測單鏈膜抗體之重鏈。而由第4A與4B圖確實證實兩種膜抗體報告基因在細胞轉譯之後，FMDV 2A自體處理序列會斷裂，使膜抗體序列之重鏈與輕鏈分離，再於內質網組裝成功能性的膜抗體；而由於膜抗體之輕鏈呈現正確的分子量，證實膜抗體輕鏈後端所殘餘的2A自體處理序列，確實被高基氏體內Furin蛋白酵素完全切除；最後藉由分離細胞膜與細胞質之蛋白質，並以西方點墨法進一步證實表現於細胞膜上的單鏈膜抗體是組裝完整的功能性抗體，而非FMDV 2A peptide未斷裂的不成熟蛋白質。
將含有本發明單鏈抗聚乙二醇膜抗體核苷酸序列(序列辨識號：4)之載體(pLNCX)與單鏈抗丹磺醯抗體核苷酸序列(序列辨識號：25)之載體(pLNCX)(控制組)分別轉殖表現於EJ細胞，並以流式細胞儀於in vitr
o與in vivo
分析聚乙二醇-螢光量子點(PEG-Quantum dot)追蹤劑對抗聚乙二醇單鏈抗體表現細胞之結合力。第5A左圖顯示於in vitro
時，聚乙二醇-螢光量子點對表現抗聚乙二醇單鏈抗體細胞(EJ/PEG scFab)具有專一性的結合能力，而第5B左圖顯示於in vivo
時，聚乙二醇-螢光量子點對分離自活體腫瘤且表現抗聚乙二醇單鏈抗體細胞(EJ/PEG scFab)也具有相同的結合能力。由5A與5B圖可看出聚乙二醇-螢光量子點(PEG-Quantum dot)追蹤劑於in vitr
o與in vivo
均可等量的結合至表現抗聚乙二醇單鏈抗體的細胞，證實單鏈抗體於活體內外均可穩定的表現。相似的結果亦顯示於控制組之鏈抗丹磺醯膜抗體表現細胞(第5A右圖與第5B右圖)。
將聚乙二醇修飾之螢光造影劑(PEG5000
-NIR797)(第6A圖)當作造影探針，以不同濃度(0.5μM、0.1μM與0.02μM)與表現單鏈抗聚乙二醇膜抗體的細胞(EJ/PEG scFab)或表現控制組單鏈抗丹磺醯膜抗體細胞(EJ/DNS scFab)作用後，利用IVIS活體影像系統(Xenogen IVIS Imaging System 50 Series)分析後數據化，結果如第6B圖所示。由第6B圖可得知聚乙二醇-螢光造影劑可專一性的結合至表現抗聚乙二醇單鏈膜抗體的細胞上，而非控制組細胞。
將聚乙二醇-螢光造影劑(PEG5000
-NIR797)由靜脈注入帶有表現抗聚乙二醇膜抗體腫瘤701(EJ/PEG scFab)及對照組腫瘤703(EJ/DNS scFab)之老鼠，老鼠在不同時間點以IVIS活體影像系統造影，結果如第7圖所示。第7圖顯示聚乙二醇-螢光造影劑在48小時內皆可專一性結合至表現抗聚乙二醇膜抗體之腫瘤，而非對照組腫瘤。
第8圖顯示將不同濃度的聚乙二醇-氧化鐵奈米顆粒(T2照影劑)與表現抗聚乙二醇單鏈抗體的細胞(EJ/PEG scFab)或控制組細胞(EJ/DNS scFab)作用後，利用核磁共振影像系統(MRI)造影的結果。由第8圖顯示不同濃度(48μM、24μM、12μM與6μM)的聚乙二醇-氧化鐵奈米奈米顆粒可專一性的結合至表現抗聚乙二醇單鏈抗體的細胞上(訊號變暗表示聚乙二醇-氧化鐵奈米顆粒有結合上表現抗聚乙二醇單鏈抗體的細胞)，而非控制組細胞。
將聚乙二醇-氧化鐵奈米顆粒(PEG-Fe3
O4
nanoparticle)(第9A圖)由靜脈注入帶有表現抗聚乙二醇膜抗體腫瘤901(EJ/PEG scFab)及對照組腫瘤903(EJ/DNS scFab)之老鼠，老鼠在不同時間點以T2核磁共振影像系統(T2 MRI)，結果如第9B圖所示。第9B圖顯示聚乙二醇-氧化鐵奈米顆粒可專一性結合至表現抗聚乙二醇膜抗體報告基因之腫瘤(訊號變暗表示聚乙二醇-氧化鐵奈米顆粒有結合上表現抗聚乙二醇單鏈抗體的腫瘤)，而非對照組腫瘤。
第10圖顯示將不同濃度的聚乙二醇-131
碘與表現抗聚乙二醇單鏈抗體的細胞(EJ/PEG scFab)或控制組細胞(EJ/DNS scFab)作用後，利用伽瑪計數器(gamma counter)偵測的結果。由第10圖顯示不同濃度(1、0.2、0.04與0.08μCi/50μl/well)的聚乙二醇-131
碘可專一性的結合至表現抗聚乙二醇單鏈抗體的細胞上(放射線強度隨聚乙二醇-131
碘濃度增加而增強)，而非控制組細胞。
將聚乙二醇-124
碘(PEG-124
Iodine)由靜脈注入帶有表現抗聚乙二醇膜抗體腫瘤701(EJ/PEG scFab)及對照組腫瘤703(EJ/DNS scFab)之老鼠，老鼠在不同時間點以微型正子斷層攝影系統(micro-PET)造影，結果如第11圖所示聚乙二醇-124
碘可專一性結合至表現抗聚乙二醇膜抗體報告基因之腫瘤(聚乙二醇-124
碘放射線強度增強)，而非對照組腫瘤。
雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
101．．．序列辨識號：9之序列
103．．．序列辨識號：10之序列
105．．．序列辨識號：11之序列
107．．．序列辨識號：12之序列
109．．．序列辨識號：13之序列
111．．．序列辨識號：14之序列
201．．．第一部份
203．．．第二部份
205．．．重鏈變異-重鏈第一保留區(VH-CHl)
207．．．穿膜區
701、901、1101．．．表現單鏈抗聚乙二醇膜抗體之腫瘤
703、903、1103．．．表現單鏈抗丹磺醯膜抗體之腫瘤
第1圖顯示本發明一重組的核苷酸序列，序列辨識號：1之序列建構圖。
第2圖顯示本發明之重組核苷酸序列所編碼出的重組的單鏈抗聚乙二醇膜抗體結構圖。
第3圖(A)部分顯示本發明(編碼出單鏈抗聚乙二醇膜抗體)一重組的核苷酸序列，序列辨識號：4之序列建構圖；(B)部分顯示編碼出單鏈抗丹磺醯膜抗體(控制組)之核苷酸序列的建構圖。
第4A圖顯示以抗HA抗原單株抗體進行西方點墨法以偵測單鏈膜抗體之輕鏈表現與分子量大小。
第4B圖顯示以抗myc抗原單株抗體進行西方點墨法以偵測單鏈膜抗體之重鏈表現與分子量大小。
第5A圖顯示in vitro
聚乙二醇-螢光量子點對表現抗聚乙二醇單鏈抗體細胞的專一性測試。
第5B圖顯示in vivo
聚乙二醇-螢光量子點對表現抗聚乙二醇單鏈抗體細胞的專一性測試。
第6A圖顯示聚乙二醇修飾之螢光造影劑(PEG5000
-NIR797)的結構。
第6B圖顯示以聚乙二醇-螢光造影劑對不同濃度表現單鏈抗聚乙二醇膜抗體的細胞或表現控制組單鏈抗體細胞作用後，利用IVIS活體影像系統分析數據化之結果。
第7圖顯示將聚乙二醇-螢光造影劑由靜脈注入帶有表現抗聚乙二醇膜抗體腫瘤(EJ/PEG scFab)及對照組腫瘤(EJ/DNS scFab)之老鼠，老鼠在不同時間點以IVIS活體影像系統造影的結果。
第8圖顯示將不同濃度的聚乙二醇-氧化鐵奈米顆粒與表現抗聚乙二醇單鏈抗體的細胞(EJ/PEG scFab)或控制組細胞(EJ/DNS scFab)作用後，利用核磁共振影像系統(MRI)造影的結果。
第9A圖顯示聚乙二醇-氧化鐵奈米顆粒(PEG-Fe3
O4
nanoparticle)的結構。
第9B圖顯示將聚乙二醇-氧化鐵奈米顆粒由靜脈注入帶有表現抗聚乙二醇膜抗體腫瘤(EJ/PEG scFab)及對照組腫瘤(EJ/DNS scFab)之老鼠，老鼠在不同時間點以核磁共振影像系統(MRI)造影的結果。
第10圖顯示將不同濃度的聚乙二醇-131
碘與表現抗聚乙二醇單鏈抗體的細胞(EJ/PEG scFab)或控制組細胞(EJ/DNS scFab)作用後，利用伽瑪計數器(gamma counter)偵測的結果。
第11圖顯示將聚乙二醇-124
碘由靜脈注入帶有表現抗聚乙二醇膜抗體腫瘤(EJ/PEG scFab)及對照組腫瘤(EJ/DNS scFab)之老鼠，老鼠在不同時間點以微型正子斷層攝影系統(micro-PET)造影的結果。
101．．．序列辨識號：9之序列
103．．．序列辨識號：10之序列
105．．．序列辨識號：11之序列
107．．．序列辨識號：12之序列
109．．．序列辨識號：13之序列
111．．．序列辨識號：14之序列
Claims (12)
- 一種重組的核苷酸序列，其編碼出一重組的單鏈抗聚乙二醇膜抗體，包括：序列辨識號1之序列、序列辨識號2之序列、序列辨識號3或序列辨識號4之序列。
- 如申請專利範圍第1項所述之重組的核苷酸序列，其中該重組的核苷酸序列做為一報告基因。
- 如申請專利範圍第1項所述之重組的核苷酸序列，其中該重組的單鏈抗聚乙二醇膜抗體表現於一細胞之細胞膜上。
- 如申請專利範圍第1項所述之重組的核苷酸序列，其中該細胞包括幹細胞、腫瘤細胞或免疫細胞。
- 一種載體包括如申專利範圍第1項所述之重組的核苷酸序列。
- 一種細胞包括如申專利範圍第1項所述之重組的核苷酸序列。
- 一種細胞包括如申專利範圍第5項所述之載體。
- 一種重組的單鏈抗聚乙二醇膜抗體，包括：一第一部份，包括一輕鏈變異-K保留區(VL-CK)，其胺基酸序列為序列辨識號5或序列辨識號6之序列；以及一第二部份，包括一重鏈變異-重鏈第一保留區(VH-CH1)與穿膜區，其中該第二部份之胺基酸序列包括序列辨識號7或序列辨識號8之序列，又該第一部份與第二部分以雙硫鍵連接。
- 如申請專利範圍第8項所述之重組的單鏈抗聚乙二醇膜抗體，其中該重組的單鏈抗聚乙二醇膜抗體表現於一細胞之細胞膜上。
- 如申請專利範圍第9項所述之重組的單鏈抗聚乙二 醇膜抗體，其中該細胞包括幹細胞、腫瘤細胞或免疫細胞。
- 一種造影套組，包括：如申請專利範圍第6項所述之細胞，其中該細胞表現該重組的單鏈抗聚乙二醇膜抗體於其細胞膜上；以及一聚乙二醇造影探針，其中該聚乙二醇造影探針為聚乙二醇連接一造影劑所形成。
- 如申請專利範圍第11項所述之造影套組，其中該造影劑包括螢光造影劑、氧化鐵奈米顆粒或放射線造影劑。
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