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TWI383049B - Improved lactose intolerance of lactic acid bacteria - Google Patents

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TWI383049B
TWI383049B TW096123069A TW96123069A TWI383049B TW I383049 B TWI383049 B TW I383049B TW 096123069 A TW096123069 A TW 096123069A TW 96123069 A TW96123069 A TW 96123069A TW I383049 B TWI383049 B TW I383049B
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TW
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lactic acid
strain
lactobacillus
food
acid bacteria
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TW096123069A
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TW200817508A (en
Inventor
Tadao Saitou
Haruki Kitazawa
Yasushi Kawai
Hiroyuki Itou
Original Assignee
Food Science Inst Foundation
Univ Tohoku
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Description

改善乳糖不耐症之乳酸菌
本發明係關於一種用於改善乳糖不耐症有用之乳酸菌及其利用。
「乳糖不耐症」係指，由於所攝取之乳中之乳糖消化不良，而容易產生腹瀉或腹痛等不適之消化系統症狀的體質。通常認為該乳糖不耐症通常隨著年齡增加會變得顯著，但乳幼兒期亦可見。為減輕乳糖不耐症之症狀，必須避免攝取含有乳糖之製品，但若無法攝取作為良好鈣源之乳製品，例如會提高老年人之骨質疏鬆症的危險性，於營養方面上亦成為較大障礙。骨質疏鬆症係威脅正急速向高齡化發展之日本的最大疾病之一，因此就降低老年人之骨質疏鬆症之危險性之意義方面而言，促進乳製品之積極攝取顯得尤為重要。
乳糖通常被小腸內層之細胞中生成之乳糖分解酶分解，而被吸收。另一方面，已知乳酸菌等各種微生物產生乳糖分解酶，而將乳糖分解。業者認為含有活乳酸菌或酵母之酸乳酪或者乳酸菌飲料係因乳糖之一部分被分解，故比較難以引起乳糖不耐症之症狀，進而，藉由連續性經口攝取此等，此等菌會在腸道內緩慢增殖，使腸道內之乳糖分解能力增大，結果亦會引起乳糖不耐症本身之改善。
自先前已知，乳酸菌之乳糖代謝中，有β-半乳糖酶(β-gal)及磷酸基-β-半乳糖酶(P-β-gal)之2種乳糖分解酶參 與，進而，本發明者等亦已知，亦存在乳酸菌所含之磷酸基-β-葡萄糖苷酶(P-β-glc)之第三種乳糖分解酶(非專利文獻1)。業者認為該等乳糖分解酶之活性較高之乳酸菌可有效減輕乳糖不耐症之症狀。然而，非腸道系乳酸菌中存在具有較高之乳糖分解活性者，但通常認為亦存在於人體腸道內無法生長者。如此之乳酸菌於人體腸道內無法持續生成乳糖分解酵素，可認為無法獲得經口攝取之分量以上之乳糖分解酵素活性(非專利文獻2)。因此，為藉由經口投與乳酸菌而改善乳糖不耐症，不僅需要乳糖分解酵素活性較高，而且於人體腸道內可持續分解乳糖之乳酸菌，但對於上述乳酸菌之探索未有較大進展。
然而，已知於腸道系乳酸菌中存在腸道附著性較高之菌。作為探索如此之腸道附著性較高之菌的方法，例如存在藉由測定對於人體腸道黏蛋白之結合能力，篩選適合於人體之各血型之腸道附著性較高之乳酸菌的方法(專利文獻1)。該方法係基於如下內容及報告而構建者：為使乳酸菌於人體內初期感染而定著於腸道，必不可少的是使其黏接於腸上皮細胞表面；高橋等人之使用大腸黏蛋白(RCM)之乳酸菌篩選之報告[使用塗佈有大腸黏蛋白(RCM)之聚苯乙烯珠，篩選嗜酸乳酸桿菌族乳酸菌株時，強力結合於此RCM上之源自乳酸菌株之表層蛋白質(SLP)亦結合於人體大腸黏液層之報告。非專利文獻3等]；構成人體大腸黏蛋白之糖鏈之化學結構係根據ABO型血型而有所不同的報告(例如，非專利文獻4)等。然而，尚未將該篩選方法應用於 適合於各血型之乳酸菌之探索以外的用途中。
[專利文獻1]日本專利特開2004-101249號公報
[非專利文獻1]齋藤忠夫、伊籐敞敏、館野義男、山崎由紀子、人體腸道起源之Lactobacillus gasseri(加氏菌)中之乳糖同化系統之新途徑的發現，生物工學會誌，(2001), 79(6), pp.172-173
[非專利文獻2]Marteau P, Minekus M, Havenaar R, Huis in't Veld JH、Survival of lactic acid bacteria in a dynamic model of the stomach and small intestine: validation and the effects of bile.、J Dairy Sci、(1997) 80(6)、pp. 1031-1037
[非專利文獻3]Takahashi N, Saito T, Ohwada S, Ota H, Hashiba H, Itoh T、"A new screening method for the sclection of Lactobacillus acidophilus group lactic acid bacteria with high adhesion to human colonic mucosa."、Biosci Biotechnol Biochem、(1996)、60(9)、pp. 1434-1438
[非專利文獻4]天野純子、消化管黏蛋白上之血型糖鏈結構-細菌感染機理之闡明，生化學，社團法人日本生化學會，(1999) 71(4), pp. 274~277
本發明之目的在於提供一種具有改善乳糖不耐症之能力的乳酸菌。
本發明者等為解決上述課題積極研究，結果發現：一部分乳酸桿菌屬乳酸菌中，腸道附著性及乳糖分解酶活性共同增強，基於該知識見解完成了本發明。
即，本發明包含以下內容。
[1]一種篩選具有乳糖不耐症之改善能力之乳酸菌之方法，其特徵在於：自乳酸桿菌屬乳酸菌，選出腸道附著性及乳糖分解酶活性共同增強之菌。
該方法中，更好的是篩選此菌時，使用表面電漿共振解析，測定乳酸菌對於人體A型腸道黏蛋白、人體B型腸道黏蛋白、及人體O型腸道黏蛋白中之至少一個的結合能力，將表示其結合能力之RU值為100 RU以上之菌，作為腸道附著性增強之菌進行篩選。
該方法中，被篩選之菌中增強之乳糖分解酶活性，較好的是β-半乳糖酶、磷酸基-β-半乳糖酶、及磷酸基-β-葡萄糖苷酶中之至少一個之乳糖分解酵素活性。
該方法中，進行篩選之乳酸桿菌屬乳酸菌較好的是加氏乳酸桿菌(Lactobacillus gasseri)，或者黏膜乳酸桿菌(Lactobacillus mucosae)。
[2]一種乳酸菌，其係藉由如上述[1]之方法獲得之腸道附著性及乳糖分解酶活性共同增強者。
[3]一種乳酸菌，其係加氏乳酸桿菌OLL2836株(寄存編號BCRC 910351)、加氏乳酸桿菌OLL2948株(寄存編號BCRC 910353)、及黏膜乳酸桿菌OLL2848株(寄存編號BCRC 910352)中之任一種。
[4]一種乳糖不耐症改善劑，其係包含至少一種之如上述[3]之乳酸菌。
作為該乳糖不耐症改善劑，更好的是至少包含加氏乳酸桿菌OLL2836株(寄存編號BCRC 910351)、加氏乳酸桿菌OLL2948株(寄存編號BCRC 910353)、及黏膜乳酸桿菌OLL2848株(寄存編號BCRC 910352)之三種乳酸菌者。
[5]一種飲料食品，其係至少包含一種如上述[3]之乳酸菌。
作為該飲料食品，更好的是至少包含加氏乳酸桿菌OLL2836株(寄存編號BCRC 910351)、加氏乳酸桿菌OLL2948株(寄存編號BCRC 910353)、及黏膜乳酸桿菌OLL2848株(寄存編號BCRC 910352)之三種乳酸菌者。
作為該飲料食品，較好的是嬰兒用食品、幼兒用食品、哺乳婦女用食品、老年用食品、患者用食品、保健功能食品、補充品、醱酵乳、或者乳酸菌飲料。
該飲料食品，尤其較好的是用作乳糖不耐症改善用之飲料食品。
根據本發明之篩選方法，可有效篩選有利於改善乳糖不耐症之乳酸菌株。又，若使用本發明之乳酸菌株，則可製造有用於改善乳糖不耐症之藥劑或各種飲料食品。
本說明書係包含成為本案之優先權主張之基礎的日本國專利申請案第2006-175897號所揭示之內容。
以下，詳細說明本發明。
1.具有乳糖不耐症之改善能力的乳酸菌之篩選方法
本發明係關於一種可藉由自乳酸桿菌屬乳酸菌，篩選腸道附著性及乳糖分解酶活性共同增強之菌，而篩選具有乳糖不耐症之改善能力之乳酸菌的方法。
於本發明之方法中，所謂供於篩選之「乳酸桿菌屬乳酸菌」，意指根據通常之分類學方法，分類為屬於乳酸桿菌屬(Lactobacillus)或乳酸桿菌屬之任一細菌種類的細菌。其分類學方法並無特別限定，包括至今用於分類已知乳酸桿菌屬菌之先前的形態學分類法或基於生理．生化學性狀之分類法，但例如關於菌種未鑑定之細菌，利用基於使用有16S rDNA序列、尤其是其V3區域之鹼基序列之同源性解析的分子系統學分類法時，可明確進行分類，故為較佳。作為屬於乳酸桿菌屬乳酸菌之細菌種之具體例，可列舉保加利亞乳酸桿菌(Lactobacillus bulgaricus，或者Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)、戴白氏乳酸桿菌(Lactobacillus delbrueckii，或者Lactobacillus delbrueckii subsp.delbrueckii)、嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus)、乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus casei)、胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)、短乳酸桿菌(Lactobacillus brevis)、布氏乳酸桿菌(Lactobacillus buchneri)、醱酵乳酸桿菌(Lactobacillus fermentum)、Lactobacillus helvelicus、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、捲曲乳酸桿菌(Lactobacillus crispatus)、溶血乳酸 桿菌(Lactobacillus johnsonii)、唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius)、加氏乳酸桿菌(Lactobacillus gasseri)、黏膜乳酸桿菌(Lactobacillus mucosae)等，但並不限定於該等。本發明之方法中，作為乳酸桿菌屬乳酸菌，較好的是腸道系乳酸菌，尤其好的是加氏乳酸桿菌及黏膜乳酸桿菌。本方法中，供於篩選之「乳酸桿菌屬乳酸菌」可為含有多種乳酸桿菌屬乳酸菌細胞之細胞集團或細胞混合物，亦可為乳酸桿菌屬乳酸菌之個別菌株的集合。
本發明中，對如上所述之乳酸桿菌屬乳酸菌測定腸道附著性及乳糖分解酶活性，以篩選彼等共同增強之菌。
於此，所謂「腸道附著性」，係指乳酸菌對於受驗體之腸上皮細胞表面的結合能力。測定本發明之乳酸菌之腸道附著性時，典型而言，可測定乳酸菌對於人體A型腸道黏蛋白、人體B型腸道黏蛋白、及人體O型腸道黏蛋白中之至少一種腸道黏蛋白的結合能力，而將所獲得之測定值用作表示腸道附著性之值。乳酸菌對於腸道黏蛋白之結合能力之測定，可藉由利用例如揭示於專利文獻1及國際申請案WO 2006/067940之表面電漿共振解析的方法進行。使用表面電漿共振解析之情形時，較好的是將表示乳酸菌對於腸道黏蛋白之結合能力的RU值為100 RU以上之菌，篩選為腸道附著性增強之菌之乳酸菌株的候補。
以下，更具體說明對於該腸道黏蛋白之結合能力之分析系統。首先，為製備血型類別之人體腸道黏蛋白，自各血型(A型、B型、及O型)之人體腸道採取表層部分，使用鹽 酸胍等可溶化劑進行凝膠過濾，以蛋白質吸收(280 nm之吸光度)及中性糖含量較高之情形為目標，採集目標之餾分，進行純化。關於該凝膠過濾純化之詳細說明，例如可參考揭示於Purushothaman S.S.et al,"Adherence of Shigella dysenteriae 1 to Human Colonic Mucin."Curr.Miorobiol.,42(6)，p.381-387(2001)之人體大腸黏蛋白之純化方法。於純化後，更好的是使用抗血型抗原抗體，確認於所製備之人體腸道黏蛋白中發現血型抗原。作為具體例，可列舉揭示於實施例之方法。作為血型抗原，可使用市售之糖鏈探針(例如，生化學工業製造)或者擬糖蛋白．Blood Group A Trisaccaride-BSA(例如，Calbiochem公司)或擬糖蛋白．Blood Group B Trisaccaride-BSA(例如，Calbiochem公司)等，將其作為抗原，可藉由當業者眾所周知之各種抗體製作法，製作抗血型抗原抗體。
本發明之篩選方法中，將人體A型腸道黏蛋白、人體B型腸道黏蛋白、人體O型腸道黏蛋白之人體腸道黏蛋白，分別作為探針而進行表面電漿共振光譜解析，藉此可測定乳酸菌對此等人體腸道黏蛋白之結合能力。進行表面電漿共振光譜解析時，可使用作為生物感測器(生物體分子間相互作用解析裝置)之BIACORE系統(BIACORE公司)，例如BIACORE1000。
所謂BIACORE系統，係基於表面電漿共振光譜(SPR)之原理，無需使用標記，就可同步監控生物體分子之相互作用(鍵結及解離)的解析裝置。具體而言，測定配位基(以 後，亦稱探針)與解析物間之分子間相互作用。於本發明中，作為解析物係使用乳酸菌，作為配位基係使用人體大腸黏蛋白(A型、B型、O型)。關於表面電漿共振之原理，出版有多本詳細的說明書。若簡單說明該裝置中所使用之原理，則係於金膜上結合/解離物質，測定其結合/解離造成之金膜上之質量變化所伴隨之反射光之折射率之變化，藉此算出金膜上所結合之物質的量。更具體而言，該裝置中，若在樣品或試劑流動之通路之途中，以曝露於其流動之方式設置有稱為感測片之貼有金膜的玻璃基板，一面使樣品等流入其通路內，一面於感測片上，利用稜鏡等使760 nm之偏光聚光成楔形，且使之於金膜上進行反射，監控其反射光的折射率，則表面電漿共振光譜之角度的變化顯示出與金膜上之物質之結合量的變化成比例。因此，BIACORE系統中，首先，使探針流入通路內，預先於感測片之金膜上固定探針，繼而阻斷未結合有探針之部位後，使欲檢查與該探針之結合/解離反應之物質(解析物)流入通路內，並且經時監控反射光之折射率，藉此，可自其變化量，算出探針與解析物之結合量。該系統中，將表面電漿共振光譜之角度0.1°之變化定義為1000共振單位(RU)，根據將共振單位設為單位之值(RU值)，表示反射光之折射率之變化。於此，1共振單位(RU)相當於感測片表面上之1 pg/1 mm2 之質量變化。即，物質與感測片上之金膜的結合量，可由物質之結合前(添加前)之時刻與結合結束時刻之RU值的差算出。若使用BIACORE系統，則可作為每1 mm2 感測片之質量變化(pg)、即Ru值，而求得探針(本發明中，各人體腸道黏蛋白)與解析物(本發明中，乳酸菌)之結合量，其結合量(RU值)相當於解析物與探針之結合能力。
再者，BIACORE系統中可使用之感測片中，對應固定於該感測片上之物質(探針)、固定化方法、使用目的等，存在幾個種類，例如除最標準之CM5(玻璃面上貼有金膜(典型的是50 nm)，其表面上具備羧甲基葡聚糖層(典型而言，100 nm)。經由該羧甲基葡聚糖層所具有之羧基，及配位基所具有之胺基、硫氫基、醛基或者羧基，而將配位基(探針)固定於感測片上)以外，亦存在CM4、CM3、C1、SA、NTA、L1、HPA等。
於本發明中，為使腸道黏蛋白作為探針固定於感測片，例如亦可根據BIACORE系統之廠商使用說明書而進行。固定化方法，例如可為藉由物理吸附之方法或者藉由共價鍵結之吸附。作為一例，於使用CM5(BIACORE公司)作為感測片之情形時，首先，使以1：1混合N-乙基-N'-(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)與N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)而成之混合試劑(EDC/NHS)流入通路內，使感測片上之羧甲基葡聚糖中之羧基進行活性化後，製備於固定化用乙酸緩衝液(pH值4.0)中添加有人體腸道黏蛋白溶液(各別分別使用A-HCM、B-HCM、O-HCM)之混合溶液，進而，使其流入通路內，藉由胺偶合反應，使人體腸道黏蛋白與感測片上之羧基進行共價鍵結。進而，亦較好的是使用乙醇胺鹽酸鹽-NaOH(pH值8.5)，阻斷未結合有探針之感測片上之 羧基部位，從而製成腸道黏蛋白(HCM)固定化感測片。於本發明中，於感測片之HCM固定化量並無特別限定，但較好的是1000~2000 RU。
繼而，使含有乳酸菌菌體之樣品(解析物溶液)流入通路內，算出各HCM固定化感測片上之HCM(探針)與解析物溶液中之乳酸菌菌體(解析物)之結合量。雖然並無限定，但將該解析時可使用之BIACORE1000之測定條件的一例示於如下。
電泳緩衝液：HBS-EP緩衝液(pH值7.4)
解析物溶液(樣本)之添加量：20 μl
流速：3 μl/分鐘
反應溫度：25℃
再生溶液：1 M之胍鹽酸鹽溶液5 μl
根據基於如此之測定所獲得之結合/解離曲線，將由解析物結合後之RU值減去解析物結合前之RU值的RU值，可用作作為解析物之乳酸菌與作為探針之各腸道黏蛋白之每1 mm2 之結合量(pg)、即表示其乳酸菌與腸道黏蛋白之結合能力的值。本發明中，於對人體A型腸道黏蛋白、B型腸道黏蛋白、O型腸道黏蛋白中之至少一個顯示出100 RU以上之值之情形時，乳酸菌與腸道黏蛋白之結合能力可判定為「腸道附著性有所增強」或者「腸道附著性較高」。
再者，RU值可根據BIACORE系統中之測定條件而變化。本方法中之溫度條件，例如為20~40℃，較好的是20~30℃，更好的是23~28℃。又，本方法中之解析物溶液 (樣本)之濃度較好的是0.1~0.5 mg/mL，本方法中之流速較好的是3~10 μl/分鐘。若為上述範圍，則即使改變上述諸多條件，RU值亦不會變化，因此，以「100 RU」作為標準，可判斷腸道附著性是否高。進而，即使將解析物溶液之濃度等諸多條件變為上述範圍以外之情形時，換算為上述條件中之RU值時顯示出與100 RU相同的結合能力之情形時，其乳酸菌之腸道附著性有所增強。進而，本發明之篩選方法中，可認為菌之RU值越高，腸道附著性越高，即較普通乳酸菌相比，其腸道附著性有所增強。本發明中，較好的是，將對至少一個人體腸道黏蛋白之結合能力，顯示出100 RU以上、更好的是300 RU以上、尤其好的是1000 RU以上之RU值的乳酸菌，篩選為腸道附著性增強之菌。
進而，本發明之篩選方法中，對上述乳酸桿菌屬乳酸菌測定β-半乳糖酶(β-gal)、磷酸基-β-半乳糖酶(P-β-gal)、及磷酸基-β-葡萄糖苷酶(P-β-glc)中之至少一個乳糖分解酶之乳糖分解酵素活性(乳糖分解酶活性)，篩選該活性增強之菌株。
具體而言，根據Fisher法，將冷凍乾燥菌體懸浮於0.05 M之磷酸緩衝液中，於其中添加甲苯-丙酮混液(1：9(v/v))且加以激烈攪拌，若為β-gal之乳糖分解酵素活性測定用，則於其懸浮液中添加加入鄰硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷(ONPGal)之磷酸緩衝液；若為P-β-gal之乳糖分解酵素活性測定用，則於其懸浮液中添加加入鄰硝基苯-β-D-半乳吡 喃糖苷-6-磷酸酯(ONPGal-6P)之磷酸緩衝液；或者，若為P-β-glc之乳糖分解酵素活性測定用，則於其懸浮液中添加加入鄰硝基苯-β-D-葡萄糖苷-6-磷酸酯(ONPGlc-6P)之磷酸緩衝液，於37℃下反應使之15分鐘。於反應後，添加0.5 M之碳酸鈉溶液，以使反應停止，藉由離心分離(6,000×rpm，10分鐘，4℃)去除菌體成分，使用吸光光度計(例如，Multiskan MS-UV(Labsystems，Helsinki，Finland))，測定上清液於405 nm中之吸光度。將1分鐘內游離之鄰硝基苯酚(ONP)1 μmol定義為1單位，換算為活性值。由其活性值，分別算出每1 mg菌體之活性值及每1 mg培養上清液中所含之蛋白質之活性值。
再者，於對蛋白質進行定量時，例如可使用基於BCA法之Micro BCA Protein Assay Reagent Kit(Pierce，Rockford，Illinois，U.S.A)，使之反應2小時後，使用吸光光度計(例如，Multiskan MS-UV)測定其於540 nm中之吸光度。檢量線可使用牛血清白蛋白(BSA)而製作。根據其檢量線，可算出上清液中所含之蛋白質量。
根據以上述方式而算出之關於β-gal、P-β-gal及P-β-glc之每1 mg菌體的活性值及培養上清液中所含之每1 mg蛋白質的活性值，可篩選該乳糖分解酵素活性特別高(與普通乳酸菌相比，乳糖分解酶活性有所增強)之乳酸菌。
雖然並無限定，但例如關於β-gal之乳糖分解酵素活性(本發明中，亦稱β-gal活性)，尤其好的是篩選培養上清液中之每1 mg蛋白質為15單位以上，較好的是100單位以上 之菌株。又，關於P-β-gal之乳糖分解酵素活性(本發明中，亦稱P-β-gal活性)，尤其好的是篩選培養上清液中之1 mg蛋白質每顯示出15單位以上，較好的是顯示出45單位以上之菌株。進而，關於P-β-glc之乳糖分解酵素活性(本發明中，亦稱P-β-glc活性)，尤其好的是篩選培養上清液之每1 mg蛋白質顯示出25單位以上，較好的是顯示出50單位以上之菌株。
本發明之方法中，以上述之方式，分別對上述乳酸桿菌屬乳酸菌(更好的是乳酸桿菌．加氏菌或者乳酸桿菌．黏膜菌)測定腸道附著性及乳糖分解酶活性，其結果為，可有效地篩選腸道附著性及乳糖分解酶活性共同增強之乳酸菌株。本發明係亦關於一種如此而篩選之乳酸菌株。如此而獲得之乳酸桿菌屬乳酸菌，可於腸道內良好地增殖、定著，且保持非常有效之分解乳糖的能力，因此，對於改善乳糖不耐症非常有用。於本發明中，所謂「乳糖不耐症之改善」，意指攝取含有乳糖之飲料食品(乳製品等)時，減少乳糖不耐症之不適消化系統症狀(腹痛、腹瀉、腹部之饑餓感等)出現的頻率，或者完全阻止發病，或者減輕症狀之嚴重程度。又，「乳糖不耐症之改善能力力」，係指乳酸菌可如此而改善乳糖不耐症的能力。
本發明中，藉由使用上述篩選方法，可實際取得腸道附著性及乳糖分解酶活性共同顯著增強之3個菌株之乳酸桿菌屬乳酸菌。彼等三種乳酸菌，係加氏乳酸桿菌OLL2836株(以後，亦稱OLL2836株)、加氏乳酸桿菌OLL2948株(以 後，亦稱OLL2948株)、及黏膜乳酸桿菌OLL2848株(以後，亦稱OLL2848株)。該等乳酸菌株係寄存於獨立行政法人製品評價技術基礎機構專利微生物寄存中心。與該等寄存有關之資訊如下。(1)寄存機關名：獨立行政法人製品評價技術基礎機構 專利微生物寄存中心(2)寄存機關之聯絡處：日本千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8(3)寄存日期(原寄存日期)：2006年6月9日(4)寄存編號及收領編號：‧ 加氏乳酸桿菌(Lactobacillus gasseri)OLL2836株：寄存編號NITE BP-241(原寄存之收領編號NITE AP-241)，‧ 加氏乳酸桿菌(Lactobacillus gasseri)OLL2948株：寄存編號NITE BP-242(原寄存之收領編號NITE AP-242)，‧ 黏膜乳酸桿菌(Lactobacillus mucosae)OLL2848株：寄存編號NITE BP-243(原寄存之收領編號NITE AP-243)。
該等乳酸菌株，進而於2007年6月4日，以下述寄存編號寄存於臺灣食品工業發展研究所(FIRDI)。
‧ 加氏乳酸桿菌OLL2836株：寄存編號BCRC 910351
‧ 加氏乳酸桿菌OLL2948株：寄存編號BCRC 910353
‧ 黏膜乳酸桿菌OLL2848株：寄存編號BCRC 910352
所寄存之該等OLL2836株、OLL2948株及OLL2848株， 具有以下表1所示之性質。
表1中之Lactobacilli MRS Broth(MRS培養基；例如， Difco,Ref.No.288160)，係可較好地用於培養該等乳酸菌株之培養基。MRS培養基之典型組成示於表2。
表1所示之三種菌株，係被認為乳糖不耐症之改善能力特別高，於本發明中，可特別有利地使用。
2.含有本發明之乳酸菌的乳糖不耐症改善劑
本發明之乳酸菌係藉由經口投與，以存活之狀態到達腸道後，定著於腸道，從而發揮強有力之乳糖分解酶活性，其結果為，可改善乳糖不耐症。又，使用本發明之乳酸菌所製造之醱酵物中，因較高之乳糖分解活性，可提高乳糖之分解率。
因此，本發明係亦關於一種乳糖不耐症改善劑，其包含使用上述篩選方法獲得之腸道附著性及乳糖分解酶活性共同顯著增強的乳酸桿菌屬乳酸菌(本發明之乳酸菌)。該本發明之乳糖不耐症改善劑，係藉由對顯示乳糖不耐症或者疑似乳糖不耐症受驗體投藥，而獲得改善乳糖不耐症之效果，即，可減少乳糖不耐症之不適消化系統症狀(腹痛、腹瀉、腹部饑餓感等)出現的頻率，或者完全阻止發病，或者減輕乳糖不耐症之症狀之嚴重程度。本發明之乳糖不耐症改善劑，亦具有預防乳糖不耐症發病之效果。
本發明之乳糖不耐症改善劑，至少包含一種(1菌株以上)本發明之乳酸菌。本發明之乳糖不耐症改善劑較好的是，作為本發明之乳酸菌，包含自加氏乳酸桿菌OLL2836株(寄存編號BCRC 910351)、加氏乳酸桿菌OLL2948株(寄存編號BCRC 910353)、及黏膜乳酸桿菌OLL2848株(寄存編號BCRC 910352)中選擇之至少一種。尤其好的實施形態中，本發明之乳糖不耐症改善劑至少包含加氏乳酸桿菌OLL2836株(寄存編號BCRC 910351)、加氏乳酸桿菌OLL2948株(寄存編號BCRC 910353)、及黏膜乳酸桿菌OLL2848株(寄存編號BCRC 910352)之三種乳酸菌。組合含有該三種乳酸菌之乳糖不耐症改善劑可結合於含有A型、B型、O型之任一血型抗原的腸道黏蛋白上，因此，對於廣泛之受驗體有效。
本發明之乳糖不耐症改善劑，可為包含本發明之乳酸菌之純化菌體的組合物，亦可為使用該乳酸菌而製造之醱酵 物、培養物，或者包含此等濃縮物的組合物。本發明之乳糖不耐症改善劑中所含之本發明之乳酸菌，可為活菌體，亦可為死菌體，可為濕潤菌，亦可為乾燥菌。然而，更好的實施形態中，本發明之乳糖不耐症改善劑係包含存活狀態之本發明之乳酸菌的組合物。本發明之乳糖不耐症改善劑並無限定，可為液體狀、凝膠狀、粉末狀、顆粒狀、固體狀、膠囊狀或者片狀等任意形態。
藉由添加適量本發明之乳糖不耐症改善劑，可賦予飲料食品或醫藥組合物以乳糖不耐症改善作用。本發明之乳糖不耐症改善劑，除包含作為有效成分之本發明之乳酸菌或其培養物、醱酵物、或者彼等濃縮物等以外，亦可包含醫藥製劑所容許之載體或添加物。作為上述載體及添加物之例，除水、醫藥上所容許之有機溶劑、膠原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、羧基乙烯基聚合物、海藻酸鈉、水溶性葡聚糖、羧甲基澱粉鈉、果膠、三仙膠、阿拉伯膠、酪蛋白、白明膠、瓊脂、甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蠟、硬脂醇、硬脂酸、人體血清白蛋白、甘露糖醇、山梨糖醇、羧甲基纖維素、容許作為醫藥添加物之界面活性劑等以外，可列舉脂質體等人工細胞構成物等。所使用之添加物，可對應製劑之劑型而適宜或組合選擇。
本發明之乳糖不耐症改善劑可經口或非經口(例如，胃內投與或腸道內投與)投與，尤其好的是經口投與。經口投與之本發明之乳糖不耐症改善劑，可為錠劑、顆粒劑、散劑、丸劑、膠囊劑等固形製劑，凝膠劑，或者液劑、懸 浮劑、糖漿劑等液體製劑等劑型。用作液體製劑之情形時，亦可供給，意在於使用本發明之乳糖不耐症改善劑時進行再溶解的乾燥物。
上述劑型中，經口用固體製劑亦可包含藥學上普遍使用之黏合劑、賦形劑、潤滑劑、崩解劑、濕潤劑等添加劑。又，經口用液體製劑亦可包含藥學上普遍使用之穩定劑、緩衝劑、矯味劑、保存劑、芳香劑、著色劑等添加劑。
本發明之乳糖不耐症改善劑之投與量根據投與對象之年齡及體重、投與途徑、投與次數而有所不同，業者可藉由酌情處理而於較為廣泛範圍內進行變更。例如，於經口投與之情形時，本發明之乳糖不耐症改善劑中所含之本發明之乳酸菌的投藥量，適當的是1~1000 mg/kg/day。本發明之乳糖不耐症改善劑，可單次投與，亦可以6~8小時之間隔反覆投與。
投與本發明之乳糖不耐症改善劑的對象並無限定，較好的是包括人、家畜、寵物、實驗(試驗)動物等在內的哺乳動物。進而，作為本發明之受驗體，較好的是，是否為乳糖不耐症或疑似乳糖不耐症的乳幼兒期、成人期、老年期之哺乳動物，又，作為投藥本發明之乳糖不耐症改善劑之受驗體，更好的是因年齡增加或疾病等導致乳糖分解能力下降之哺乳動物，或具有乳糖不耐症之遺傳原因或環境原因之哺乳動物。本發明之乳糖不耐症改善劑，其副作用之擔心較小，因此，於連續使用方面，可非常有用地使用。
3.含有本發明之乳酸菌的飲料食品
本發明係亦關於一種飲料食品，其係含有使用上述篩選方法獲得之腸道附著性及乳糖分解酶活性共同顯著增強之乳酸桿菌屬乳酸菌者。本發明之飲料食品並無限定，尤其好的是乳糖不耐症改善用之飲料食品。所謂「乳糖不耐症改善用」，意指將顯示乳糖不耐症或疑似乳糖不耐症之受驗體作為投藥對象，目的在於減少乳糖不耐症之不適消化系統症狀(腹痛、腹瀉、腹部饑餓感等)出現之頻率，或者完全阻止發病，或者減輕乳糖不耐症之症狀之嚴重程度。
於本發明中，所謂「飲料食品」並無限定，包括飲料、食品及功能性食品在內之含有本發明之乳酸菌的飲料食品之種類並無特別限定。例如，作為含有本發明之乳酸菌的飲料，可例示醱酵乳(酸乳酪等)、乳酸菌飲料、乳飲料(咖啡牛奶、水果牛奶等)、茶系飲料(綠茶、紅茶及烏龍茶等)、水果．蔬菜系飲料(含有橙、蘋果、葡萄等之果汁，或番茄、胡蘿蔔等之蔬菜汁的飲料)、酒精性飲料(啤酒、氣泡酒、葡萄酒等)、碳酸飲料及軟飲料等飲料。關於各種飲料之製造法等，可參考現有之參考書，例如「最新．軟飲料」(2003)(光琳股份有限公司)等。
含有本發明之乳酸菌的食品並無特別限定，可為生鮮食品，亦可為加工食品，作為尤其好的食品，可列舉可使本發明之乳酸菌以生存狀態到達腸道之醱酵乳或乳酸菌飲料。含有本發明之乳酸菌的食品，可為酸乳酪或乳酪等乳製品．醱酵乳之製造用酵母。
又，作為含有本發明之乳酸菌的飲料食品，尤其好的是 功能性食品。本發明之「功能性食品」，意指對於生物體具有特定功能性之食品，例如包括含有特定保健用食品(包含附條件之特保[特定保健用食品])及營養功能食品之保健功能食品、特別用途食品、營養輔助食品、健康輔助食品、補充品(例如，錠劑、包衣錠、糖衣錠、膠囊及液劑等各種劑型者)及美容食品(例如，減肥食品)等所謂健康食品之全部。本發明之功能性食品，又，包括基於Codex(FAO/WHO合同食品規格委員會)之食品規格的健康訴求(Health claim)所適用之健康食品。
作為本發明之功能性食品較好的更具體之例子，有患者用食品、孕產婦．哺乳婦女用粉乳、嬰兒用調製粉乳、老年用食品等特別用途食品。本發明之乳酸菌，係藉由溫和作用緩慢改善腸道內環境，以提高腸道內之乳糖分解能力，改善乳糖不耐症，亦可減輕其症狀，因此尤其好的是用以治療體力較弱之乳幼兒之乳糖不耐症的乳幼兒用製備粉乳或液體調製乳之用途(例如，可添加至通常之乳幼兒用調製乳之原料中)，或者哺乳婦女用粉乳等孕婦用或哺乳婦女用食品，以及用以治療體力降低之老年人或患者之乳糖不耐症的老年用食品及患者用食品之用途。
作為本發明之較好的功能性食品，進而可列舉用以治療由於先天性或後天性原因而顯示乳糖不耐症之受驗體的乳幼兒用補充品，孕產婦．哺乳婦女用補充品，老年人用補充品及患者用補充品。
作為含有本發明之乳酸菌的功能性食品之較好的例子， 可列舉保健功能食品。保健功能食品製度，根據國內外動向、及與自先前之特定保健用食品製度之整合性，不僅以普通食品，而且以製成錠劑、膠囊等形狀之食品作為對象而進行設計。於該製度下，保健功能食品包含特定保健用食品(個別許可型)及營養功能食品(規格標準型)之兩種類型。進而，亦包含附條件之特保[特定保健用食品]等新穎類型。
本發明之功能性食品，較好的是將本發明之乳酸菌導入腸道內使之定著，以提高腸道內之乳糖分解能力(較好的是持續提高)，其結果為，具有乳糖不耐症改善效果。本發明之功能性食品，亦可為將改善乳糖不耐症以外之用途設為第一目的者。本發明之功能性食品(較好的是特定保健用食品或附條件之特保[特定保健用食品])，亦可為揭示或顯示提高腸道內之乳糖分解能力，藉此改善乳糖不耐症或其症狀之效果者。如此之揭示或顯示，亦可為基於保健功能食品製度中所定之規定而承認顯示者。例如，本發明之功能性食品中，可考慮「適合於欲調整腹部情況的人」「良好地保持腹部情況」「調整腸道內環境」「適合於不適合飲用牛奶的人」等揭示，但並不限定於該等。
本發明之功能性食品，可為錠劑、顆粒劑、散劑、丸劑、膠囊劑等固體製劑，液劑、懸浮劑、糖漿劑等液體製劑，或者凝膠劑等製劑形狀，亦可為普通飲料食品之形狀(例如，醱酵乳、飲料、粉狀茶葉、點心等)。
飲料食品中本發明之乳酸菌的添加量並無特別限定，可 應情況而定。具體添加量，可於業者考慮飲料食品之種類或要求之味道或口感後，適當決定。然通常較好的是，本發明之乳酸菌之總量成為0.001~100重量%，尤其好的是成為0.1~100重量%的添加量。
本發明之乳酸菌，可藉由業者可利用之任意適當方法，而包含於飲料食品中。例如，可將本發明之乳酸菌，直接混合於飲料食品之原料中。本發明之乳酸菌，亦可塗佈、覆蓋、浸透或噴附於飲料食品上。本發明之乳酸菌，可均勻分散至飲料食品中，亦可不均勻分散於飲料食品中。亦可調製成加入有本發明之乳酸菌的膠囊等。亦可以可食膜或食用包衣劑等，包覆本發明之乳酸菌。又，於本發明之乳酸菌中，添加適當之賦形劑等後，亦可成形為錠劑等形狀。含有本發明之乳酸菌的飲料食品，亦可進一步進行加工，上述加工品亦包含於本發明之範圍內。進而，尤其好的是包含使用本發明之乳酸菌製造之乳醱酵物的飲料食品。總之，本發明之飲料食品並無限定，尤其好的是含有存活狀態之本發明之乳酸菌。
製造本發明之飲料食品時，亦可使用如飲料食品中慣用之各種添加物。作為添加物，並無限定，可列舉顯色劑(亞硝酸鈉等)、著色料(黃梔子色素、紅102等)、香料(橙香料等)、甜味料(甜菊、阿司巴甜等)、保存料(乙酸鈉、山梨酸等)、乳化劑(硫酸軟骨素鈉、丙二醇脂肪酸酯等)、抗氧化劑(乙二胺四乙酸二鈉、維生素C等)、pH值調整劑(檸檬酸等)、化學調味料(肌苷酸鈉等)、增黏劑(三仙膠 等)、膨脹劑(碳酸鈣等)、消沫劑(磷酸鈣)等、接著劑(聚磷酸鈉等)、營養強化劑(鈣強化劑、維生素A等)等。進而，亦可進而添加亞洲人蔘萃取物、西伯利亞人蔘萃取物、桉樹萃取物、杜仲茶萃取物等功能性原材料。
本發明之飲料食品，至少包含一種(1菌株以上)本發明之乳酸菌。本發明之飲料食品，較好的是，作為本發明之乳酸菌，包含自加氏乳酸桿菌OLL2836株(寄存編號BCRC 910351)、加氏乳酸桿菌OLL2948株(寄存編號BCRC 910353)、及黏膜乳酸桿菌OLL2848株(寄存編號BCRC 910352)中選擇之至少一種。於尤其好的實施形態中，本發明之飲料食品至少包含加氏乳酸桿菌OLL2836株(寄存編號BCRC 910351)、加氏乳酸桿菌OLL2948株(寄存編號BCRC 910353)、及黏膜乳酸桿菌OLL2848株(寄存編號BCRC 910352)之三種乳酸菌。組合含有該三種乳酸菌之飲料食品，可與含有A型、B型、O型之任一血型抗原的腸道黏蛋白結合，因此對廣泛之受驗體有效。
攝取或投藥本發明之飲料食品的受驗體並無限定，但較好的是包括人、家畜(豬、馬等)、寵物(狗、貓等)、實驗(試驗)動物(小鼠、大鼠等齧齒動物或兔子等)在內的哺乳動物。進而，作為本發明之受驗體，較好的是，是否為乳糖不耐症或疑似乳糖不耐症之乳幼兒期、成人期、老年期之哺乳動物，又，作為攝取或投藥本發明之飲料食品之受驗體，更好的是因年齡增加或疾病等導致乳糖分解能下降之哺乳動物，或具有乳糖不耐症之遺傳原因或環境原因之 哺乳動物。
[實施例]
以下，使用實施例，對本發明進行更具體說明。但是，本發明之技術範圍並不限定於該等實施例。
[實施例1]供試乳酸菌之培養及製備
作為以下使用之供試乳酸菌，使用明治乳業股份有限公司提供之源自人體之乳酸菌株，自美國American Type Culture Collection(ATCC)、理化學研究所微生物系統保存設施(JCM)、農林水產省畜產試驗場(NIAI)、及英國National Collections of Food Bacteria(NCFB)購入之乳酸菌株，以及本發明者等人使用改良LBS培養基自幼兒糞便分離之乳酸菌株，總計104株。該等供試乳酸菌中，除包含屬於保加利亞乳酸桿菌(Lactobacillus bulgaricus)、嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、加氏乳酸桿菌(Lactobacillus gasseri)、捲曲乳酸桿菌(Lactobacillus crispatus)、溶血乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)、及黏膜乳酸桿菌(Lactobacillus mucosae)之各種菌株以外，亦包含菌種未鑑定之株。再者，菌株名中揭示為OLL或MEP之菌株，表示明治乳業股份有限公司所保有之菌株。
將各供試乳酸菌之菌體，分散於經滅菌之10%(w/v)脫脂乳培養基(雪印乳業股份有限公司，劄幌)中，於冷藏室中以-80℃保存至使用為止。
培養時，各菌株係藉由MRS培養基(Difco、Detroit,MI, USA)繼代培養(37℃，24小時)3次後，再藉由MRSL培養基(將2%葡萄糖置換為乳糖之MRS培養基)繼代培養(37℃，24小時)2次。繼而，將所獲得之菌體培養液1%接種於重新製備之MRSL培養基中，其後，於37℃下培養18小時。將離心分離如此製備之本培養液(6,000×g，20分鐘，4℃)而集菌之菌體，以0.05 M磷酸緩衝液(pH值6.8)清洗後，使其懸浮於蒸餾水中，其後進行冷凍乾燥。
[實施例2]腸道附著性株之篩選
自上述供試乳酸菌株中，使用藉由本發明者等人開發之檢查對腸道黏蛋白之結合能力的分析系統，篩選腸道附著性較高(RU值為100以上)之菌株。關於所使用之分析系統，於國際申請案WO2006/067940中亦有詳細揭示。
具體而言，使用生物感測器BIACORE1000(BIACORE公司)進行表面電漿共振光譜解析，藉此測定乳酸菌分別對於人體A型腸道黏蛋白、人體B型腸道黏蛋白、人體O型腸道黏蛋白之結合能力。
1.解析物溶液之製備
首先，使各菌株，於起菌後，藉由MRS培養基繼代培養3次，於37℃下培養12小時後，將500 μl分注於1.5 ml容積之管內。將該培養液進行離心分離(6,000 rpm，4℃，10分鐘)，將去除上清液而獲得之菌體，以PBS緩衝液(pH值7.2)中清洗2次後，懸浮於蒸餾水中，進行冷凍乾燥。使用HBS-EP緩衝液(0.01 M HEPES(pH值7.4)、0.15 M NaCl、3 mM EDTA、0.005% Surfactant P20)將本菌體調製為0.1 mg/ml濃度，以製成解析物溶液。
2.人體腸道黏蛋白(HCM)之製備及HCM固定化感測片之製作
製備人體腸道黏蛋白且固定化為感測片。人體A型腸道(源自血型A型人體之大腸)、人體B型腸道(源自血型B型人體之大腸)、及人體O型腸道(源自血型O型人體之大腸)，係自日本東北大學大學院醫學系研究科，作為標本採取樣品分別購買。再者，該樣品採取係經由日本東北大學大學院醫學系研究科之倫理委員會實施，且獲得患者同意。此彼等腸道之大腸正常部位，藉由表層刮取法採集黏液黏蛋白層。黏液黏蛋白層係藉由Folch溶劑(氯仿-甲醇混液(2：1(v/v))；J.Folch et al.,：J.Biol.Chem.(1957)226,p.497-500)及二乙醚脫脂後，進行乾燥，藉由4 M鹽酸胍溶液，37℃下萃取2小時。繼而，藉由凝膠過濾對該萃取物進行純化。凝膠過濾純化法，係基於揭示於Purushothaman S.S.et al,"Adherence of Shigella dysenteriae 1 to Human Colonic Mucin."Curr.Miorobiol.,42(6),p.381-387(2001)之人體大腸黏蛋白之純化方法而實施。移動層係使用4 M鹽酸胍溶液，凝膠過濾色譜法用之管柱係使用Toyopearl HW-65F(90 cm×2.6 cm,Tosoh.Tokyo.Japan)。對於所獲得之管柱萃取液，藉由苯酚硫酸法測定中性糖(反應後，測定490 nm之吸光度)，對蛋白質測定280 nm之吸光度，其結果存在蛋白質吸收(280 nm之吸光度)，且，選擇中性糖含量最高之峰值，進而，以凝 膠過濾色譜法中之分子量約200萬以上作為標準，分別提取大腸黏蛋白餾分。將如此獲得之純化物，對應於源自人體之血型，分別設為人體A型腸道黏蛋白、人體B型腸道黏蛋白、人體O型腸道黏蛋白。以下，於此等人體腸道黏蛋白(human colon mucin：HCM)中，有時將A型腸道黏蛋白稱為A-HCM，將B型腸道黏蛋白稱為B-HCM，將O型腸道黏蛋白稱為O-HCM。對於所獲得之各HCM，分別藉由抗原抗體反應，而確認血型之人體血型基質抗原性。
如上所述獲得之各HCM向BIACORE用感測片之固定化，係於生物感測器BIACORE1000(BIACORE公司)中，藉由胺基偶合法而進行。首先，預先對導入有羧甲基葡聚糖基之感測片CM5(BIACORE公司)，流入混合有75.0 mg/ml之N-乙基-N'-(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)50 μl及11.5 mg/ml之N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)50 μl的混合試劑(EDC/NHS)，使羧甲基葡聚糖中之羧基活性化。繼而，製備加入有30 μl之上述經純化之任一HCM溶液(A-HCM、B-HCM、O-HCM)的混合溶液，將其流入120 μl之固定化用乙酸緩衝液(10 mM，pH值4.0)中，藉由胺偶合反應，使HCM與感測片上之羧基進行共價鍵結。進而，使用1 M乙醇胺鹽酸鹽-NaOH(pH值8.5)，以阻斷探針未結合之感測片上之部位的殘存活性基。作為電泳緩衝液，使用HBS-EP緩衝液。以EDC/NHS導入前與乙醇胺溶液添加後之報告點之差而顯示的HCM固定化量，係設為1000~2000 RU。將如此而獲得之HCM固定化感測片，繼而用於上述解析物溶 液之試驗中。
3.表面電漿共振光譜解析
進而使用生物感測器BIACORE1000(BIACORE公司)，解析各HCM固定化感測片上之HCM與上述解析物溶液中之乳酸菌菌體之結合量。以下，表示用於該解析之BIACORE1000之測定條件。
電泳緩衝液：HBS-EP緩衝液(pH值7.4)
解析物溶液(樣本)之添加量：20 μl
流速：3 μl/分鐘
反應溫度：25℃
再生溶液：1 M胍鹽酸鹽溶液5 μl
於藉由BIOACORE系統之解析中，解析物與探針之結合量(相互作用)係以將共振單位(RU)作為單位之值進行表示。所謂1共振單位(RU)，意指感測片之表面上每1 mm2 中結合有物質1 pg。即，根據該解析中獲得之結合/解離曲線，由結合後之RU值減去結合前之RU值的值，相當於作為解析物之各乳酸菌與作為探針之各腸道黏蛋白之每1 mm2 之結合量。該結合量相當於其乳酸菌與各腸道黏蛋白之結合能力。
該解析之結果，自供試乳酸菌104株中，篩選作為對於至少一種腸道黏蛋白之結合能力表示100 RU以上之值的菌株。所篩選之菌株中，可認為腸道附著性較其他平均性乳酸菌株有所增強(腸道附著性較高)。將所篩選之菌株之代表例及其解析結果示於圖1~3。
[實施例3]用於測定P-β-glc活性之ONPGlc-6P之合成及純化
以下，嘗試進而篩選腸道附著性較高，且具有較高之乳糖分解酶活性的菌株。因此，於實施例中，首先，製備用於測定其活性之ONPGlc-6P。
1. ONPGlc-6P之化學合成
用於測定磷酸基-β-葡萄糖苷酶(P-β-glc)活性的鄰硝基苯-β-D葡萄糖苷-6-磷酸酯(o-Nitrophenyl-β-D-glucopyranoside 6-phosphate；ONPGlc-6P)，係藉由Hengstenberg與Morse之合成方法(Hengstenberg,W.and M.L.Morse、Synthesis of o-Nitrophenyl-beta-D-galactopyranoside 6-phosphate；Carbohydr.Res、10、pp.463-465(1969))之改良法進行化學合成。具體而言，首先，將0.9 g之鄰硝基苯-β-D-葡萄糖苷(ONPGlc、Sigma、St.Louis、USA)，溶解於預先冰上冷卻後再混合之含有54 μl蒸餾水與840 μl之磷醯氯的磷酸三甲酯7.5 ml中。繼而，將本混合液，一面於冰上攪拌5小時，一面使之反應。反應後，加入冰片(蒸餾水)，一面滴加濃氨水，一面使用pH計，以對溶液進行中和(pH值7.0)，從而使反應停止。
2. ONPGlc-6P之純化
使用旋轉蒸發器(東京理科機械，東京)，於40℃下對上述停止反應之溶液反覆進行濃縮乾燥，藉此去除反應中所生成之鄰硝基苯(ONP)。繼而，將濃縮之反應液與活性碳(50 g)混合，於4℃下放置2小時，藉此使化學合成之ONPGlc-6P及未反應之ONPGlc吸附於活性碳後，將其以20 倍量之蒸餾水(2 L)清洗，進行脫鹽。吸附於活性碳之ONPGlc-6P之溶出，係使用吡啶：水：乙醇混液(1：1：1(v/v)，600 ml)進行。溶出液係於40℃下之旋轉蒸發器中反覆進行濃縮，而去除吡啶。繼而，供於濾紙層析法(PPC)。即，於PPC用濾紙(Whatman、3 MM、46×57 cm、Maidstone、England)上，使用100 μl微量吸液管直線狀塗佈上述粗純化ONPGlc-6P，使用丁醇：吡啶：水(6：4：3(v/v/v))作為顯影溶劑，藉由上升法進行單展開。於需要2天之展開結束後，於通風室內使此濾紙乾燥後，使用UV紫外光燈箱(302 nm，舟越，東京)確認ONPGlc-6P及ONPGlc之帶，僅剪取ONPGlc-6P之帶。將所剪取之濾紙浸於蒸餾水中，於4℃下攪拌一晚，藉此萃取ONPGlc-6P。萃取後，去除濾紙，藉由旋轉蒸發器濃縮水層後，藉由使用有以蒸餾水作為移動相之TOYOPEARL HW40S管柱(2.6Φ×90 cm、TOSOH，東京)的凝膠過濾，去除混入之反應副產物。於凝膠過濾後，使用薄層色譜法(TLC、Silicagel 60、10×10 cm、Merck、Darmstadt、Germany)，回收各溶出餾分中之ONPGlc-6P餾分。TLC之展開溶劑，係使用丁醇：2-丙醇：水(3：12：4(v/v/v))進行單展開。於風乾後，將5%(v/v)硫酸-甲醇溶液均勻噴霧於薄層板上，於加溫至150℃之乾燥器(Yamato，東京)內加熱3分鐘，進行檢測。對所回收之ONPGlc-6P餾分進行冷凍乾燥，以製成純化ONPGlc-6P。藉由TLC確認該純化品之純度，且藉由1 H-NMR確認其結構。
[實施例4]β-gal、P-β-gal及P-β-glc活性之測定
針對實施例1中製備之供試乳酸菌104株，使用Fisher法，測定β-gal、P-β-gal及P-β-glc之乳糖分解酵素活性。即，針對各菌株，將0.5 mg之冷凍乾燥菌體懸浮於0.05 M磷酸緩衝液(pH值6.8)1.0 ml中，添加50 μl之甲苯-丙酮混液(1：9(v/v))，激烈攪拌3分鐘。於25 μl該懸浮液中，添加包含鄰硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷(ONPGal)、鄰硝基苯-β-N-半乳吡喃糖苷-6-磷酸酯(ONPGal-6P)或者上述製備之鄰硝基苯-β-D-葡萄糖苷-6-磷酸酯(ONPGlc-6P)的0.05 M磷酸緩衝液(pH值6.8)100 μl，於37℃下反應15分鐘。於反應後，添加125 μl之0.5 M碳酸鈉溶液，以使停止反應，藉由離心分離(6,000×rpm，10分鐘，4℃)去除菌體成分，使用Multiskan MS-UV(Labsystems、Helsinki、Finland)測定上清液於405 nm中之吸光度。將1分鐘內游離之鄰硝基苯酚(ONP)1 μmol定義為1單位，將該單位作為單位，分別算出每1 mg菌體的活性值及每1 mg培養上清液中所含之蛋白質的活性值。
再者，蛋白質之定量，係使用基於BCA法之Micro BCA Protein Assay Reagent Kit(Pierce，Rockford，Illinois，U.S.A)，反應2小時後，再使用Multiskan MS-UV測定540 nm中之吸光度，而進行測定。檢量線係使用牛血清白蛋白(BSA)而製作，於此算出蛋白質量。圖1~3中，表示有對於實施例2中篩選之菌株之代表例的乳糖分解酵素進行活性測定的結果。
[實施例5]乳酸菌株之篩選
根據上述實施例中表示之腸道附著性及β-gal、P-β-gal及P-β-glc活性之測定結果，篩選腸道附著性較高，且乳糖分解酵素活性亦高之乳酸菌株。其結果為，作為腸道附著性較高，且對於β-gal、P-β-gal及P-β-glc中任一乳糖分解酵素顯示出顯著之較高活性的菌株，篩選出三個乳酸菌株(OLL2836株、OLL2948株、及OLL2848株)(圖1~3)。另一方面，乳糖分解酵素活性比較高之乳酸菌株之大部分，其腸道附著性較低(對於A型、B型、O型之任一人體腸道黏蛋白，RU值亦未達100 RU)，因此，結果被排除。
如圖1~3所示，OLL2836株表示46.576單位/mg蛋白質之P-β-gal活性，OLL2948株表示50.194單位/mg蛋白質之P-β-glc活性，OLL2848株表示107.090單位/mg蛋白質之β-gal活性，但該等活性值係即使與腸道附著性較高之其他乳酸菌株相比，亦分別為非常高的值。並且，該等菌株係關於表示腸道附著性之RU值，亦顯示出非常高之值。具體而言，OLL2836株相對於人體B型腸道黏蛋白及人體O型腸道黏蛋白顯示出特別強之結合能力，且OLL2948株及OLL2828株對於人體A型腸道黏蛋白顯示出特別強之結合能力。
由以上結果顯示，對於該等乳酸菌株，除可期待分別單獨定著於腸道內，持續分解乳糖之效果以外，亦可藉由組合使用該3菌株，而於任一血型之受驗體中亦可獲得較高之乳糖分解效果。
進而對OLL2836株、OLL2948株及OLL2848株進行菌種鑑定試驗，作為屬於加氏乳酸桿菌(Lactobacillus gasseri)之菌係鑑定OLL2836株及OLL2948株，作為屬於黏膜乳酸桿菌(Lactobacillus mucosae)之菌係鑑定OLL2848株(參照下述實施例)。關於該三種乳酸菌株，於2006年6月9日(原寄存日)，向獨立行政法人製品評價技術基礎機構專利微生物寄存中心(日本千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8)寄存申請，並被接受寄存。該寄存申請之收領編號為，OLL2836株為NITE AP-241，OLL2948株為NITE AP-242，OLL2848株為NITE AP-243，又，寄存號分別為NITE P-241、NITE P-242、NITE P-243。該等寄存菌株係於2007年3月27日，移交至基於布達佩斯條約之寄存(國際寄存)進行保管，以2006年6月9日作為原寄存日被接受寄存。此等之國際寄存號為，OLL2836株為NITE BP-241，OLL2948株為NITE BP-242，OLL2848株為NITE BP-243。又，該等乳酸菌株係亦於2007年6月4日寄存於臺灣食品工業發展研究所(FIRDI)，OLL2836株之寄存編號為BCRC 910351，OLL2948株之寄存編號為BCRC 910353，OLL2848株之寄存編號為BCRC 910352。該等菌株之菌類學性質確認為上述表1所述。
如上所述，藉由使用本發明之篩選方法，可取得腸道附著性較高，且乳糖分解酵素活性亦較高之乳酸菌株。進而，對β-gal、P-β-gal及P-β-glc測定乳糖分解酵素活性，篩選出分別對此3種乳糖分解酶顯示出顯著較高之活性的 菌株，藉由組合所獲得之菌株，亦可取得可適用於廣泛被驗者之非常有用之乳酸菌之組合。可認為，以本發明之方法而獲得之乳酸菌株，係作為定著於腸道內，可持續減低乳糖之有用之益生菌乳酸菌株，其可有效地改善乳糖不耐症。
[實施例6]菌種鑑定
對實施例5中篩選之三種乳酸菌株OLL2836株、OLL2948株及OLL2848株進行菌種鑑定。鑑定係藉由基於V3區域之擴增．序列測定之16S rDNA鹼基序列解析而進行。以下，作為例子，揭示OLL2848株及OLL2948株中所進行之鑑定試驗，對於OLL2836株亦以大致相同之方式進行鑑定。
1.直接藉由PCR法之篩選株之16S rDNA片段之檢測
將OLL2848株及OLL2948株，藉由MRS培養基如上所述進行繼代培養後，直接進行PCR。0.6 ml容積之微管中，每管分別注入4 μl之超純水，此處，分別使以滅菌牙籤刮取之菌體懸浮。於該懸浮液中，添加Taq DNA聚合酶(TaKaRa，京都)、10×PCR緩衝液、dNTP Mix(TaKaRa，京都)、一組引物，製成PCR反應液。作為一組引物，使用通用引物27F(5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，序列號1)，及518R(5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'，序列號2)。PCR條件係以〔95℃10分鐘，55℃3分鐘，72℃1分鐘〕作為1個循環，〔95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒〕作為39循環，及〔72℃1分鐘〕作為1個循環而進行。
2.瓊脂糖凝膠電泳
將藉由上述PCR反應擴增之DNA片段，繼而進行電泳。電泳之電泳凝膠係使用2%瓊脂糖凝膠，電泳緩衝液係使用1×TBE緩衝液(90 mM之三硼酸，2 mM EDTA，pH值8.0)，100 V之恆定電壓下進行。泳動裝置係使用Mupid-2(COSMOBIO，東京)。分子量標記物係使用100b DNA梯形(TaKaRa，京都)。電泳後之凝膠染色，係藉由於溴化乙錠(EB)溶液(0.5 μg/ml)中浸漬10分鐘而進行。
3.來自瓊脂糖凝膠之DNA萃取
以UV紫外光燈箱TRANSILLMINATOR TM-20(舟越藥品股份有限公司，東京)，對瓊脂糖凝膠電泳及染色後之凝膠照射UV，確認目標之DNA片段，將其剪取。藉由DNA片段純化套組MagExtractor(TOYOBO，大阪)，萃取DNA。即，將所剪取之瓊脂糖凝膠移至1.5 ml容積之管內之後，添加400 μl之吸附液，加溫至55℃，使之完全溶解。繼而，於此反應液中添加15 μl之磁珠進行攪拌後，於室溫下放置1分鐘。進行離心分離(6,000 rpm，5秒，4℃)後，去除上清液，添加500 μl之清洗液進行攪拌。再次，進行離心分離(6,000 rpm，5秒，4℃)後，添加1 ml之75%乙醇進行攪拌，進行離心分離(15,000 rpm，1分鐘，4℃)後，去除上清液。添加15 μl之蒸餾水進行攪拌後，將藉由離心分離(15,000 rpm，1分鐘，4℃)回收之上清液作為純化DNA溶液。
4.DNA序列之決定及同源性解析
使用引物27F(5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，序列 號3)，對經純化之DNA進行鹼基序列測定。鹼基序列測定係由Operon Biotechnology股份有限公司進行。如此，將對於OLL2848株所測定之16S rDNA之V3區域的鹼基序列表示為序列號4，將對於OLL2948株所測定之16S rDNA之V3區域的鹼基序列表示為序列號5。於日本DNA資料庫(DDBJ)之網上，藉由程式BLASTN，對該等鹼基序列進行同源性解析。
其結果為，OLL2848株之V3區域之鹼基序列與黏膜乳酸桿菌(Lactobacillus mucosae)之V3區域的序列之間顯示出99.6%之同源性，另一方面，OLL2948株之V3區域之鹼基序列與加氏乳酸桿菌(Lactobacillus gasseri)之V3區域的序列之間顯示出99.2%之同源性。由該情況可鑑定出，OLL2848株屬於黏膜乳酸桿菌之乳酸菌，OLL2948株係屬於加氏乳酸桿菌之乳酸菌。
[產業上之可利用性]
本發明之方法係可用於有效地篩選對於改善乳糖不耐症有用之乳酸菌株。藉由本發明之方法而獲得之乳酸菌株係可向患者簡單投藥，且可有利地用作可持續改善乳糖不耐症之藥劑或功能性食品等之有效成分。
[序列表自由內容]
序列號1~3之序列係引物。
將本說明書中引用之所有發行物、專利及專利申請案之全文，作為參照摘錄入本說明書中。
<110> 財團法人糧食研究會 國立大學法人東北大學
<120> 改善乳糖不耐症之乳酸菌
<130> PH-3099TW
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<151> 2006-06-26
<160> 5
<170> PatentIn Ver.2.1
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列類型：引物
<220>
<223> 發明者：Saito,Tadao；Kitazawa,Haruki 發明者：Kawai,Yasushi；Itoh,Hiroyuki
<400> 1
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列類型：引物
<400> 2
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列類型：引物
<400> 3
<210> 4
<211> 559
<212> DNA
<213> 黏膜乳酸桿菌
<400> 4
<210> 5
<211> 524
<212> DNA
<213> 加氏乳酸桿菌
<400> 5
圖1係表示針對腸道附著性較高之代表性菌株之P-β-gal活性試驗的結果。
圖2係表示針對腸道附著性較高之代表性菌株之P-β-glc活性試驗的結果。
圖3係表示針對腸道附著性較高之代表性菌株之β-gal活性試驗的結果。
(無元件符號說明)

Claims (6)

  1. 一種腸道附著性及乳糖分解酶活性共同增強之乳酸菌，其為加氏乳酸桿菌OLL2836株(寄存編號BCRC 910351)、加氏乳酸桿菌OLL2948株(寄存編號BCRC 910353)、及黏膜乳酸桿菌OLL2848株(寄存編號BCRC 910352)中之任一種。
  2. 一種乳糖不耐症改善劑，其至少包含一種如請求項1之乳酸菌。
  3. 如請求項2之乳糖不耐症改善劑，其包含加氏乳酸桿菌OLL2836株(寄存編號BCRC 910351)、加氏乳酸桿菌OLL2948株(寄存編號BCRC 910353)、及黏膜乳酸桿菌OLL2848株(寄存編號BCRC 910352)之三種乳酸菌。
  4. 一種飲料食品，其至少包含一種如請求項1之乳酸菌。
  5. 如請求項4之飲料食品，其至少包含加氏乳酸桿菌OLL2836株(寄存編號BCRC 910351)、加氏乳酸桿菌OLL2948株(寄存編號BCRC 910353)、及黏膜乳酸桿菌OLL2848株(寄存編號BCRC 910352)之三種乳酸菌。
  6. 如請求項4或5之飲料食品，其係自嬰兒用食品、幼兒用食品、哺乳婦女用食品、老年用食品、患者用食品、保健功能食品、補充品、醱酵乳及乳酸菌飲料所成群中選擇者。
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