TWI382178B - 偵測樣品中生物分子之方法 - Google Patents

Description

偵測樣品中生物分子之方法

本發明揭示一種基於活性碳吸附式胜肽結合分析(CPBA)之高通量篩選方法。詳言之，本發明提供一種可於同一檢體中同時篩選多種生物分子之方法。

利用受體偵測配體(例如，以抗體偵測激素、抗原或致病原、以另一抗體偵測血液中之抗體或化學毒素結合)對於診斷疾病及發現有用之生物分子而言非常重要。近年來已發展出許多具有高選擇性及高靈敏性之偵測配體之快速檢驗方法，包括基於放射活性之免疫分析、基於化學發光之免疫分析、基於磁性之分析及基於螢光或比色分析之免疫分析。已知免疫分析(如酵素連結免疫吸附分析(ELISA)、酵素免疫分析(EIA)及放射免疫分析(RIA))可用於偵測配體(如激素、抗原或抗體)。上述分析法之基本原理為，結合標記(如結合酵素色原、螢光原或放射性核苷酸)之抗體藉由結合抗原而偵測抗原之存在。為偵測抗體與抗原結合後其顏色、螢光或放射活性錯合物之改變，需使用大量抗體結合至大量抗原決定位上。此外，需將經標記之抗體抗原結合錯合物分離出，以便偵測。目前已知之分離方法包括硫酸氨或抗體沉澱法、層析法、固相分析法、透析法及活性碳吸附法。

異質性免疫分析法通常包含分離游離態之分析物(或抗體)與結合態之免疫複合體之分離步驟。目前分離免疫複合物之方法包括層次性沉澱法、免疫沉澱法、管柱層析法、固相分析法、透析法及葡聚糖附著之活性碳吸附法。層次性沉澱法利用鹽或有機溶劑層次性地沉澱目標蛋白質。免疫沉澱法利用抗體與目標抗原或抗體形成不可溶之免疫複合物，進一步以離心將其沉澱。管柱層析法利用層析法依序分離分析物並將免疫複合物大量收集於收集管中。進行固相分析法時，與受體反應前，需將配體先附著於微盤或微珠上。透析法藉由分子篩膜可分離未結合之小分子與大分子免疫複合物。上述所有方法都具有許多缺點，例如過程繁複、耗時及花費昂貴等，使其於高通量分析時之應用受限。亦可使用葡聚糖附著之活性碳分離游離態之分析物及大分子免疫複合物。然而，習知之免疫分析法中所使用之葡聚糖附著之活性碳，係用於偵測血清中之小分子(如類固醇激素或胰島素)(Clinical Chemistry 25(1979)1402-1405)。目前仍無法將葡聚糖附著之活性碳應用於分析大分子抗原或對大分子抗原具專一性之抗體，其需要進一步改良。

所有基於免疫之偵測方法之要素為可結合分析物並產生可測量訊號(作為分析平台之一部分)之探針。專一性結合生物分子之胜肽探針係發展為偵測分析物之探針。可利用各種方法篩選出此等胜肽探針。例如，病原性抗原之抗原決定位或擬抗原決定位(mimotope)片段之胜肽可用來篩選受感染之抗血清。此外，可利用噬菌體呈現技術或類似之篩選方法來篩選專一性結合至抗原或抗體之胜肽。Peternko及Vodyanoy描述可偵測生物危害劑之探針之發展現況，並著重於噬菌體呈現技術(其在偵測技術領域中為新近出現的技術，專門發展可專一結合各種生物結構之分子探針)(Journal of Microbiological Methods 53(2003)253-262)。Dennis等人描述噬菌體呈現技術所篩選之胜肽(DICLPRWGCLW)，其可專一性結合血清白蛋白(The Journal of Biological Chemistry 277(38)(2002)35035-35043)。Bessette等人利用細菌呈現技術篩選可專一性結合人類血清白蛋白、抗T7抗原決定位單株抗體、人類C-反應活性蛋白質、HIV-1、GP120及鏈黴卵白素(streptavidin)之胜肽(Protein Engineering,Design & Selection 17(10)(2004)731-739)。Lu等人(Journal of Virological Methods 119(2004)51-54)及Tan等人(Journal of Clinical Virology 34(2005)35-41)發展出帶有噬菌體之胜肽，其可與B型肝炎表面抗原(HBsAg)之免疫優勢(immunodominant)區緊密結合。Lu等人及Tan等人亦揭示利用此胜肽偵測HBsAg之似ELISA方法。上述文獻指出，專一性胜肽具有作為診斷劑之可能性。

某些快速檢測系統使用不只一種基於免疫學之技術，以增進專一性及/或靈敏性。現有之基於免疫學之快速分析可再進一步改良或併入其他系統，以增進其效果，如此可免除發展全新檢測系統之需求。用於多分析物偵測之基於陣列之免疫分析技術，其於二維固定相載體上產生由空間上可定位生物活性探針所形成之高密度陣列，且大大增進並簡化生物學研發程序。Proteomics 2006,6,1376-1384揭示一種製造用於分子免疫診斷之胜肽微陣列之方法，然而該陣列系統使用基於免疫學之分析法，故其仍具有上述缺點。

Wu與Tsai(Journal of Biomolecular Screening 11(7)(2006)836-843)揭示一種基於磁化葡聚糖附著之活性碳之應用於高通量篩選之快速轉穀胺醯胺酶分析法。此文獻僅提及利用偵測酪蛋白與1-二甲胺基萘-5-磺醯基屍胺(dansylcadaverine)之結合來篩選轉穀胺醯胺酶活性，然其並未揭示利用專一性胜肽探針偵測抗體或抗原之概念。

因此，仍需要可於同一檢體中同時偵測一種以上目標生物分子之高通量篩選方法。

本發明揭示一種於同一檢體中偵測一或多種目標生物分子之高通量篩選方法，該方法包含以下步驟：

(a)將一或多種經標記胜肽探針與含有一或多種個別探針之目標生物分子之檢體混合，其中各胜肽探針僅專一性結合其目標生物分子；

(b)將葡聚糖附著之活性碳加入反應混合物中以捕獲所有未結合之胜肽探針；

(c)利用離心或磁性沉澱作用沉澱葡聚糖附著之活性碳，以分離與生物分子結合及未與生物分子結合之胜肽探針；及

(d)收集與生物分子結合之胜肽探針複合物，並以個別偵測參數偵測標記訊號。

本發明發展一種基於活性碳吸附式胜肽結合分析(charcoal-sorbent peptide binding assay,CPBA)之高通量篩選方法，其不需使用固定相，且可於同一檢體中同時偵測多種目標生物分子。本發明之方法可達成生物分子(如抗體及抗原)之高通量篩選，且不需受限於生物分子之分子量。

本發明提供一種於同一檢體中偵測一或多種目標生物分子之高通量方法，其包含以下步驟：

(a)將一或多種經標記胜肽探針與含有一或多種個別探針之目標生物分子之檢體混合，其中各胜肽探針僅專一性結合其目標生物分子；

(b)將葡聚糖附著之活性碳加入反應混合物中以捕獲所有未結合之胜肽探針；

(c)利用離心或磁性沉澱作用沉澱葡聚糖附著之活性碳，以分離與生物分子結合及未與生物分子結合之胜肽探針；及

(d)收集與生物分子結合之胜肽探針複合物，並以個別偵測參數偵測標記訊號。

本文中之用語「包含」應理解為包含所列之元件或元件群組，而非排除任何其他元件或元件群組。

本文中之用語「胜肽」意指其中單體為胺基酸之寡聚物，其與其他胜肽以醯胺鍵連結，且亦稱作多肽。胜肽係由至少兩個胺基酸組成，且其長度通常(但並非絕對)少於50個胺基酸。胜肽為可被葡聚糖附著之活性碳吸附之小分子。欲達成本發明以葡聚糖附著之活性碳吸附胜肽之最佳吸附作用，胜肽之分子量小於10KD。

根據本發明，本文所描述之胜肽探針可為部分或完全合成的，且可包含(例如)一或多種下列基團：環化殘基或胜肽、胜肽之多聚體、標記及或其他化學基團。本發明之胜肽探針可與(但不限於)抗體或抗原(例如特定蛋白質、核酸、脂質或多醣類)交互作用。胜肽探針通常對欲偵測之目標生物分子具有專一性。例如，胜肽RLIEDICLPRWGCLWEDD及WVCTWNYWTRVTWCL分別可專一性結合HIV-1之白蛋白及CP120，胜肽TKTFTVTE及CGETGAKPHC可專一性結合HBsAg。上述胜肽可作為偵測抗原之探針，此時則不需使用專一性抗體。

根據本發明，胜肽探針係直接或間接經可偵測之標記所標定，以便偵測胜肽探針-生物分子複合物。根據本發明，標記包括(但不限於)螢光物質(fluorophore)(例如：FITC、TRITC、rhodamine、藻紅蛋白(phycoerythrin))、放射性同位素(例如：³ H、³² P、³⁵ S、¹⁴ C、¹³¹ I或¹²⁵ I)或微酵素(例如微過氧化氫酶，microperoxidase，分子量2KD)。根據本發明，可藉由直接或間接計數標記所發出之訊號來定量檢體中特定生物分子。當使用之標記為螢光物質或放射性同位素時，可直接計數標記所發出之訊號來定量生物分子。當使用之標記為微過氧化酶時，可間接測量微過氧化酶之催化活性來定量生物分子。

本文中之用語「目標生物分子」意指任何可與胜肽探針專一性標靶結合而形成結合產物之分子。此等目標生物分子包括(但不限於)抗體或抗原(如特定蛋白質、核酸、脂質或多醣類)。然而，生物分子之分子量必須大於10KD，以便其不會被葡聚糖附著之活性碳吸附。

本發明之方法可利用適當之胜肽探針而偵測任何目標生物分子。再者，本發明之方法可利用一或多種胜肽探針篩選檢體中一或多種對該胜肽探針具親和性之生物分子。根據本發明一較佳實施例，本發明之方法可利用以不同標記標誌之胜肽探針，於同一檢體中同時篩選一種以上生物分子。根據本發明，胜肽探針結合生物分子而形成結合產物。

本文中之「葡聚糖附著之活性碳」係商業上可購得或可經習知方法製備。例如，可使活性碳與葡聚糖於磷酸緩衝液中反應以製備葡聚糖附著之活性碳。接著利用離心及重新懸浮於蒸餾水純化葡聚糖活性碳複合物。或者也可向廠商(例如Bangs Laboratories,Inc.(Fishers,IN)及BioMagDextran-coated Charcoal)購買葡聚糖附著之活性碳。本發明所使用之「磁性葡聚糖附著之活性碳」係與磁性材料結合之葡聚糖附著之活性碳，其為商業上可購得(例如可購自BioMagmagnetic dextran-coated charcoal from Bangs Laboratories,Inc.,Fishers,IN)。已知葡聚糖附著之活性碳可作為獨占地且幾乎立即地吸附小分子之分子篩(Physical Biochemistry:Applications to Biochemistry and Molecular Biology. 2nd ed. San Francisco. Freeman,1982:pp 323-360)。

根據本發明，葡聚糖附著之活性碳或磁性葡聚糖附著之活性碳係用於快速分離已結合之胜肽探針與未結合之胜肽探針。由於本發明之胜肽探針分子量低，其可被葡聚糖附著之活性碳或磁性葡聚糖附著之活性碳吸附，而與目標生物分子結合之胜肽探針分子量高，故其無法為磁性葡聚糖附著之活性碳所吸附。可利用離心使與特定生物分子結合之胜肽探針與葡聚糖附著之活性碳分離。或者，若使用磁性葡聚糖附著之活性碳，則可利用磁性沉澱快速達成此分離步驟。

胜肽探針結合特定生物分子可與使用葡聚糖附著之活性碳作一結合而成為製造物件(例如套組)。套組所包含之化學藥劑可以各種結合形式存在一起，或可包裝於分離之小瓶或容器中。套組所含之物件亦可包含列出準備及使用指示之標籤及/或包裝內頁。

本發明之方法具快速、高靈敏度及便宜之特點，且不需使用固定相。特別是本發明之方法可於同一檢體中同時篩選許多生物分子，且可輕易於微盤操作。因此，本發明之方法及利用該方法之套組可取代並增進同時篩選大量生物分子之高通量篩選之免疫分析。

實施例 實例1：偵測特定抗體之方法

偵測抗體之方法之步驟示於圖1。為確認此方法是否可行，合成胜肽KY15以作為特定蛋白質之抗原決定位胜肽。以胜肽KY15免疫兔隻以製備抗KY15抗血清。合成FITC-標定之KY15作為偵測抗KY15抗體之胜肽探針。

材料

兔隻係購自國立台灣大學動物中心。胜肽KY15及FF15(胺基酸序列分別為：KSVGRDEREDITYTY及FEGRGYEASVDRLTF)係Unimed Healthcare Inc.(Taipei,Taiwan)所合成。N端FITC-標定之胜肽KY15(FITC-KY15)係Kelowna International Scientific Inc.(Taipei,Taiwan)所合成。弗倫氏佐劑(Freund's adjuvant)、匙孔螺血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、戊二醛、3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)液態受質及FITC-胰島素係購自Sigma-Aldrich(St. Louis,MO,USA)。山羊抗兔IgG(H+L)-HRP係購自Rockland Immunochemicals,Inc.(Gilbertsville,PA,USA)。螢光素-5-異硫氰酸屍胺(FITC-cadaverine)係購自AnaSpec,Inc.(San Jose,CA,USA)。BioMag磁性葡聚糖附著之活性碳(MD-Charcoal)濃縮物(40mg/ml，粒徑約1.5μm)係Bangs Laboratories,Inc.(Fishers,IN,USA)所提供。將MD-Charcoal濃縮物以水稀釋5倍並儲存於4℃以備後續使用。超過濾單位係購自Millipore(Bedford,MA,USA)。V96微盤(#249945)及ELISA帶(#469949)係購自Nalge Nunc International(Rochester,NY,USA)。除非有另外指出，其他化學藥品皆為分析級且皆購自Sigma-Aldrich或Merck(Darmstadt,Germany)。

抗血清之純化

胜肽KY15及FF15分別與KLH結合後用於免疫兔隻。結合反應係將各胜肽與KLH(peptide：KLH=2:1,w/w)於0.1M硼酸鹽溶液(pH 10.0，含有0.1%戊二醛)中混合。於室溫下反應1小時後，將1M甘胺酸加入混合物中再反應1小時。利用30K超過濾單位(Amicon Ultra-4)將KLH結合胜肽緩衝液移至0.1M硼酸鹽溶液(pH 8.5)中。與等量Freund's佐劑混合之KLH結合胜肽用於經皮下免疫兔隻(每隻兔隻0.3mg)。兔隻於初始注射兩週後，再注射加強劑量，並於兩週後收集血清。

MD-活性碳對於FITC-標定分子之捕獲性質

於室溫下以MD-活性碳(200μl/well)處理與等體積試劑B(2mM EDTA,0.5M Hepes-pH 8.0)混合之FITC-標定分子之等份試樣(3μM in 60μl)1、5或10分鐘。接著以磁性沉澱MD-活性碳，並直接以微盤讀取器(Plate Chameleon,Hidex Oy,Finland)以485nm激發波長及535nm發射波長讀取每孔中之螢光強度，不需將上清液移至另一新微盤。

以ELISA確認抗KY15抗血清

將溶解於PBS緩衝液(137mM NaCl,2.7mM KCl,10mM Na₂ HPO₄ ,2mM KH₂ PO₄ ,pH 7.4)之胜肽KY15(5μg/ml)置於ELISA盤之孔中(50μl/well)，於室溫反應隔夜。加入5%脫脂牛奶(200μl/well)於37℃反應30分鐘，以阻斷孔之殘餘結合力。以PBS清洗後，將抗KY15抗血清(以脫脂牛奶稀釋，1:500)加入孔中(50μl/well)，於37℃培養1小時。接著以PBS緩衝液清洗孔，加入二級抗體(山羊抗兔IgG(H+L)-HRP，以脫脂牛奶稀釋(1:2500))(50μl/well)，於37℃反應1小時後，再次以PBS緩衝液清洗孔。最後加入TMB受質溶液(100μl/well)進行呈色反應，以OD650吸光度測定結果。所有實驗之每個實驗數據點均進行3重複實驗所得，實驗數據以平均值±SD表示。

以活性碳吸附式胜肽結合分析(CPBA)測定抗KY15抗體

以PBS緩衝液(137mM NaCl,2.7mM KCl,10mM Na₂ HPO₄ ,2mM KH₂ PO₄ ,pH 7.4)2倍連續稀釋微盤中之兔血清(30μl/well)。於每個孔中加入30μl新配製之試劑A(6μM FITC-KY15,100mM Hepes-pH 7.5及2mM EDTA)後，使微盤於37℃反應50分鐘。接著於每個孔中加入60μl試劑B(0.5M Hepes-pH 8.0及2mM EDTA)，以調整pH值至8.0，使螢光偵測之效果最佳化。為移除所有游離之螢光胜肽，加入MD-活性碳懸浮液(每孔200μl)，並使混合物於室溫下培養5分鐘。以磁鐵沉澱MD-活性碳1分鐘後，以微盤讀取器(Plate Chameleon,Hidex Oy,Finland)在485nm激發波長及535nm發射波長(Ex485/Em535)Gain 35下測量每孔中之螢光強度。由於沉澱之MD-活性碳不影響上層液螢光強度之測量結果，故不需將上層液移至新微盤測量螢光(J. Biomol. Screen. 11(7),836-843)。抗血清結合螢光胜肽探針之結合力係以每孔之螢光強度表示。所有實驗之每個實驗數據點均進行3重複實驗所得，實驗數據以平均值±SD表示。

結果

MD-活性碳對於FITC-標定分子之捕獲率總結於表1中。絕大部分(>99%)FITC標定分子在5分鐘內即被MD-活性碳捕獲。此結果顯示小胜肽在數分鐘內即可被MD-活性碳快速移除。如圖2A所示，抗KY15抗血清對於胜肽KY15之專一性已經ELISA證實。利用可偵測抗體之CPBA法(圖2B)，抗KY15抗體可被胜肽探針FITC-KY15偵測。此結果顯示，本發明之方法較ELISA法更具優勢。

如表1所示，使各種FITC-標定分子(60μl中含3μM)分別與等體積試劑B(2mM EDTA,0.5M Hepes-pH 8.0)於微盤孔中混合，不以MD活性碳處理或以MD-活性碳(200μl)處理1、5或10分鐘。以磁鐵沉澱MD-活性碳後，於Ex485/Em535，Gain 35測量每孔之螢光。以單因子ANOVA及Turkey-HSD多重區間檢定分析實驗數據，結果以平均值±SD(n=3)表示。不同的連續上標表示於p<0.05有顯著差異。空孔之背景值作為空白組。

實例2：偵測特定抗原之方法 材料

N端FITC-標定胜肽RD18及KY15(胺基酸序列分別為：RLIEDICLPRWGCLWEDD及KSVGRDEREDITYTY)係Kelowna International Scientific Inc.(Taipei,Taiwan)所合成。人類血清白蛋白(HSA，#A3782，基本上不含脂肪酸及球蛋白，純度99%)及卵白蛋白(#A5503，來自雞蛋蛋白，純度99%)係購自Sigma-Aldrich(St. Louis, MO,USA)。牛gamma球蛋白(BGG;#A23212)係購自Pierce Biotechnology(Rochford,IL,USA)。BioMag磁性葡聚糖附著之活性碳(MD-Charcoal)濃縮物(40mg/ml，粒徑約1.5μm)係Bangs Laboratories,Inc.(Fishers,IN,USA)所提供。將MD-Charcoal濃縮物以水稀釋5倍並儲存於4℃以備後續使用。V96 microplate(#249945)係購自Nalge Nunc International(Rochester,NY,USA)。除非有另外指出，其他化學藥品皆為分析級且皆購自Sigma-Aldrich或Merck(Darmstadt,Germany)。

以CPBA法測定HSA

取HSA、卵白蛋白及BGG原液以HBS緩衝液(10mM Hepes-pH 7.0及0.15M NaCl)將其配製成125μg/ml之溶液。於每個孔中加入30μl新配製之試劑A(6μM FITC-RD18/FITC-KY15、100mM Hepes-pH 7.5及2mM EDTA)後，使微盤於37℃反應30分鐘。接著於每個孔中加入60μl試劑B(0.5M Hepes-pH 8.0及2mM EDTA)，以調整pH值至8.0，使螢光偵測之效果最佳化。為移除所有游離之螢光胜肽，加入MD-活性碳懸浮液(每孔200μl)，並於室溫下培養5分鐘。以磁鐵沉澱MD-活性碳1分鐘後，以微盤讀取器(Plate Chameleon,Hidex Oy,Finland)在485nm激發波長及535nm發射波長(Ex485/Em535)、Gain 35下測量每孔中之螢光強度。由於沉澱之MD-活性碳不影響上層液螢光強度之測量結果，故不需將上層液移至新微盤測量螢光。將蛋白質檢體置換為HBS緩衝液，並測量其螢光強度，作為螢光強度背景值。抗原結合螢光胜肽探針之結合力係以每孔之淨螢光強度表示。所有實驗之每個實驗數據點均進行3重複實驗所得，實驗數據以平均值±SD表示。

結果

白蛋白對FITC-RD18之結合專一性示於圖4中。對照組胜肽FITC-KY15對白蛋白無親合性。相較於對照組胜肽、卵白蛋白及牛gamma球蛋白，RD18對白蛋白具高度專一性。上述結果顯示，圖3所揭示之本發明方法具可行性且較其他傳統分析法更優異。

實例3：於單一檢體中偵測多種抗體及抗原之方法

本技術可用於單一檢體中分析多種抗體及抗原。為達此目的，使用不同胜肽探針之混合物於單一檢體中分析多種抗體及抗原。每種探針針對其個別之目標抗體或抗原皆具有高度親合力。用於結合不同結合標的之胜肽探針都以可區別之訊號分子(例如螢光染劑或同位素(如³ H、³² P、³⁵ S、¹⁴ C、¹³¹ I或¹²⁵ I)標定。使胜肽探針與檢體反應後，藉由偵測各種訊號分子以評估各結合複合物。分析流程圖示於圖5中。

圖1揭示抗體偵測法之流程圖。圖1A為此分析法之基本原理。混合血清檢體與合成之經標定之基於抗原決定位(或擬抗原決定位)之胜肽，藉此使特定抗體與胜肽探針混合。上述混合物反應後，加入磁性葡聚糖附著之活性碳(MD-Charcoal)，以自免疫複合物中快速移除未結合之胜肽。之後以磁性沉澱MD-Charcoal。留在上層液之結合複合物之訊號可直接測量。圖1B為本分析法之基本步驟。於4℃將血清檢體(30μl/well)分別加入微盤孔中(步驟1)。加入專一性胜肽探針(30μl/well)後(步驟2)，於37℃反應指定時間，以進行結合反應(步驟3)，之後加入200μl MD-Charcoal終止反應(步驟4)。將微盤靜置於室溫下5分鐘，以移除所有未結合胜肽(步驟5)。最後，以磁鐵沉澱MD-Charcoal(步驟6)，之後測量上層液中結合複合物之訊號(步驟7)。進行步驟6時應注意，如果胜肽探針係以螢光染劑標定，由於沉澱之MD-Charcoal所捕獲之探針不具螢光性質，故不需將上層液移至另一微盤測量螢光；否則，需將每孔中之上層液分別移至另一微盤測量。

圖2揭示偵測抗KY15抗體。圖2A利用ELISA確認抗KY15抗血清之製備。利用經胜肽KY15或脫脂牛奶(對照組)塗覆之微盤證明抗KY15抗血清之特性。圖2B顯示利用CPBA法分析FITC-KY15與抗KY15抗體之專一性結合作用。對照組血清、抗FF15抗血清及未經免疫之兔血清對FITC-KY15胜肽探針不具親合力。本實驗詳述於實例1。每個實驗數據點代表平均值±SD(n=3)。

圖3揭示抗原偵測法之流程圖。圖3A為此分析法之基本原理。於37℃混合血清檢體與合成之經標定之胜肽探針，藉此使特定抗原與胜肽探針混合。上述混合物反應後，加入磁性葡聚糖附著之活性碳(MD-Charcoal)，以自抗原胜肽複合物中快速移除未結合之胜肽。之後以磁性沉澱MD-Charcoal。留在上層液之抗原胜肽複合物之訊號可直接測量。圖3B為本分析法之基本步驟。於4℃將血清檢體(30μl/well)分別加入微盤孔中(步驟1)。加入專一性胜肽探針(30μl/well)後(步驟2)，於37℃反應指定時間，以進行結合反應(步驟3)，之後加入200μl MD-Charcoal終止反應(步驟4)。將微盤靜置於室溫下5分鐘，以移除所有未結合胜肽(步驟5)。最後，以磁鐵沉澱MD-Charcoal(步驟6)，之後測量上層液中抗原胜肽複合物之訊號(步驟7)。進行步驟6時應注意，如果胜肽探針係以螢光染劑標定，由於沉澱之MD-Charcoal所捕獲之探針不具螢光性質，故不需將上層液移至另一微盤測量螢光；否則，需將每孔中之上層液分別移至另一微盤測量。

圖4顯示人類血清白蛋白(HSA)之專一性偵測。利用白蛋白專一性胜肽探針FITC-RD18進行HSA偵測。FITC-RD18進行HSA之專一性結合作用呈線性劑量效應依隨。胜肽FITC-KY15作為負對照組。卵白蛋白(Ovalb)或牛gamma球蛋白(BGG)不與FITC-RD18產生交互作用。本實驗詳述於實例2。每個實驗數據點代表平均值±SD(n=3)。

圖5顯示於單一檢體中偵測多種抗體及抗原之結合分析法。使血清檢體與經各種不同標記標定之合成胜肽探針反應，以進行抗體及抗原與其對應專一性胜肽探針之結合作用。上述混合物反應後，加入磁性葡聚糖附著之活性碳(MD-Charcoal)，以自結合複合物中快速移除未結合之胜肽。之後以磁性沉澱MD-Charcoal。留在上層液之各種經標定之物質之訊號可直接於特定之激發/發射波長測量。

(無元件符號說明)

Claims (10)

1. 一種於同一檢體中偵測至少兩種目標生物分子之高通量方法，其包含以下步驟：(a)將至少兩種經不同螢光物質標記之胜肽探針與含有至少兩種該個別探針之目標生物分子之檢體混合，其中各胜肽探針僅專一性結合其個別目標生物分子；(b)將葡聚糖附著之活性碳加入反應混合物中以捕獲所有未結合之螢光物質標記之胜肽探針，藉此吸附該未結合之螢光物質標記之胜肽探針，並使該未結合之螢光物質標記之胜肽探針不表現螢光性質；(c)利用離心或磁性沉澱作用沉澱葡聚糖附著之活性碳，以使未與生物分子結合之螢光物質標記之胜肽探針與上清液分離；及(d)以個別偵測參數偵測上清液中之螢光物質訊號，其中未結合之螢光物質標記之胜肽探針與上清液仍存在於同一容器中；其中該至少兩種目標生物分子為無法被葡聚糖附著之活性碳吸附之大分子，且具有大於約10KD之分子量，及個別探針為可被葡聚糖附著之活性碳吸附之小分子，且包含不多於18個胺基酸；及其中步驟(c)中之活性碳沈澱後，不需將生物分子-胜肽探針複合物轉移至新容器中偵測螢光。
2. 如請求項1之方法，其中該螢光物質直接或間接標定至 胜肽探針上。
3. 如請求項1之方法，其中該螢光物質為FITC、TRITC、rhodamine或藻紅蛋白(phycoerythrin)。
4. 如請求項1之方法，其中該目標生物分子為抗體、抗原、酵素、致病原、特定蛋白質、核酸、脂質或多醣類。
5. 如請求項1之方法，其中該葡聚糖附著之活性碳係利用離心沉澱。
6. 如請求項1之方法，其中該葡聚糖附著之活性碳為磁性葡聚糖附著之活性碳。
7. 如請求項6之方法，其中該磁性葡聚糖附著之活性碳係利用磁鐵沉澱。
8. 如請求項1之方法，其中該生物分子可經由計數標記之訊號而定量。
9. 一種套組，其係用於在單一檢體中高通量偵測一或多種目標生物分子，其包含如請求項1所述之胜肽探針及葡聚糖附著之活性碳。
10. 如請求項9之套組，其另外包含列出使用指示之標籤及/或包裝內頁。