TWI378940B - Immunoglobulins - Google Patents

Description

1378940 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於免疫球蛋白，特定而言係關於可結合 NOGO並中和其活性之抗體、編碼該等抗體之多核苷酸、 含有該等抗體之醫藥調配物以及該等抗體在治療及/或預 防神經疾病’之用途自下文說明中瞭解本發明之其他 態樣、目的及優點。 【先前技術】

·· 在西方國家t風係-種引起死亡及殘疾之^要病因。除 組織纖溶酶原（t-PA)之外還沒有一種經核准之治療中風之 療法，組織纖溶酶原須在進行電腦乂射線斷層造影（ct)掃 描排除出血後於發病3小時内投予。迄今為止大部分針 對急性中風治療（即神經保護）之治療劑主要涉及乾向麵胺 酸受體·及其下游已知與急性細胞死亡有關之傳訊途徑。然 而迄今為止此等策略還未在臨床試驗中證明成功且經常與 劑量限制性副作用有關（出丨丨及Hachinski，τι^ ， 352 :(增刊ΙΠ)1(Μ4(1998))。因此需要—種針對血液流動 停止後細胞死亡之改#的㈣方法1_護係治療、預 防或改善響應於損傷或疾病過程之神經元細胞損失的能 力。此可藉由防止神經膠質細胞（包括少突神經膠質細胞） 損失直接或間接乾向神經元來達成。 中風發作後，在許多患者中觀察到—定程度之自發功能 恢復，表明大腦具有（儘管有限）修復及/或重塑損傷之能 力。因此具有增強此恢復之潛力的作用劑會允許在大腦局 116953.doc 1378940 部缺血發作後的更晚些時候（可能為數天）進行幹預。能夠 提供急性神經保護及增強功能恢復之作用劑可提供明顯優 於目前的潛在神經保護策略之優點。 阿茲海默氏症（Alzheimer's disease，AD)特徵為存在兩 種病理學診斷特徵。此等特徵為分別由聚集之澱粉樣肽 (Αβ40及Αβ42)及高度磷酸化τ蛋白構成之澱粉樣斑塊及神 經纖維纏結（Dawbarn 及 Allen 2001 Neurobiology of

Alzheimer’s disease OUP) 〇

综合研究已顯示，在患者中β-澱粉樣蛋白積聚與認知減 退之間存在緊密聯繫（Naslund等人，JAMA，2000年3月 22/29曰，283卷，No; 12，第1571-1 577頁）。此與遺傳及流 行病學研究一致，該等研究表明，APP及早老素基因中存 在一些突變會易患早期發作AD，該等突變亦可提高Αβ40 及Αβ42肽之水平，包括其比值。 ·· 對於形成β-澱粉樣肽，稱作β-及γ-分泌酶之兩種不同蛋 白酶對I型跨膜澱粉樣前體蛋白（ΑΡΡ)之剪切係必需的。β-分泌酶與天冬胺醯基-蛋白酶Asp2/BACE1之分子身份已得 到確認（Hussain 等人，Mol. Cell. Neuro Sci. 16，609-619(2000); Vassar 等人，Science(1999)，10 月 22 曰；286(5440) : 735-741)。 γ-分泌酶之性質仍為存在一定爭議之原因且可能由一高分 子量複合體構成，該高分子量複合體至少由下列蛋白組 成：早老素、Aphl、Pen2及納卡斯楚因（nicastrin)(評述於 Medina & Dotti Cell Signalling 2003 15(9) : 829-41)。 CNS内APP之加工可能在多種細胞類型（包括神經元、少 116953.doc 1378940 突神經膠質細胞、星形膠質細胞及小神經膠質細胞）中出 現。然而此等細胞中APP加工之整體速率會受到App、 BACE1/AsP2、早老素_1A_2、Aphl、Pen2及納卡斯楚因 之相對表現水平之影響。 此外，調節APP之亞細胞定位之額外因素亦會影響其加 工，如由下列研究結果所示：可阻斷其内吞作用之App細 胞質結構域中的YENP基序之突變可降低澱粉樣蛋白產 生（Perez 等人，1999 J Bi〇l Chem 274(27)18851-6)。藉由 加上KKQN滯留基序使/〇>]?_0_(：丁17在ER中滯留足以降低經 轉染細胞中澱粉樣蛋白之產生（Maltese等人，2〇〇1 j Bi〇1

Chem 276(23)20267·2〇279)β 相反地，藉由過表現 Rab5 達 成之内吞作用提高足以提高澱粉樣蛋白自經轉染細胞之分 泌（Grbovic等人，2003 JBi〇1Chem 278(33)3126l-3i268)。 與此等研究結果一致，進一步研究已顯示細胞膽固醇 (一種熟知的AD風險因素）水平之降低降低了 p_澱粉樣蛋白 •φ 之形成。此種改變取決於改變之内吞作用，如藉由使用發 動蛋白顯性負突變體（K44A)及過表現活化蛋白RN Tre之 Rab5 GTPase 所證明（Ehehalt 等人，2〇〇3 j 則〇1 16〇 ⑴ 113-123) 〇 富含膽固醇之微結構域或筏亦為P_澱粉樣蛋白產生之重 要細胞位點，且APP、BACE1及丫_分泌酶複合體之其他組 份均顯示可暫時駐留在筏内。APP&BACE1對富含膽固醇 之筏的抗體交聯能夠提高β-澱粉樣蛋白產生（Ehehalt等 人，2003 J Cell Biol 16〇(1) 113_123)。專門靶向脂筏之 116953.doc 1378940 GPI錨定BACE1之表現能夠以類似方式提高APP剪切及β-澱粉樣蛋白產生（Cordy 等人，2003 PNAS 100(20) 11735-11740)。

目前尚不知曉中風或其他神經神經損傷事件或疾病後之 功能恢復之基本機制。已提議將受損或未受損之軸突的出 芽作為一種可能之機制。然而，儘管活體内研究已顯示用 神經營養因子治療脊髓損傷或中風增強了功能恢復及軸突 出芽程度，但此等並未證明軸突出芽程度與功能恢復程度 之間有直接關聯（Jakeman等人，1998，Exp. Neurol. 154: 170-184，Kawamata等人，1997，Proc Natl Acad. Sci. USA.，94:8179- 8184，Ribotta等人，2000，J Neurosci. 20: 5144-5152)。此外， 軸突出芽需要有活力之神經元。因此在如中風等與廣泛細 胞死亡有關之疾病中，中風後由指定作用劑提供之功能恢 復之增強會藉由不同於軸突出芽之機制達成，該等機制包 括（例如）内源幹細胞之分化、冗餘途徑之活化、受體分佈 之改變或神經元或神經膠質之興奮性（Fawcett及Asher， 1999，Brain Res. Bulletin，49: 377-391，Horner及 Gage， 2000，Nature 407 963-970) ° 據認為中樞神經系統（CNS)修復下列損傷之有限能力部 分歸因於對軸突出芽（神經突生長）具有抑制作用之CNS環 境内之分子。據認為CNS髓磷脂含有抑制分子（Schwab ME 及 Caroni P (1988) J· Neurosci. 8，2381-2193)。兩種髓磷 脂蛋白即髓磷脂相關糖蛋白（MAG)及NOGO已得到選殖並 經鑑別為推定之神經突生長抑制劑（Sat0 s.等人（1989) 116953.doc 1378940

Biochem. Biophys. Res. Comm. 163， 1473-1480 ;

McKerracher L 等人（1994) Neuron 13 ，805-811 ;

Mukhopadhyay G 等人（1994)Neuron 13，757-767 ; Torigoe K及

Lundborg G (1997) Exp. Neurology 150，254-262 ; Schafer 等人 (1996) Neuron 16 > 1107-1113 ； WO 9522344 ； WO 9701352 ； Prinjha R等人(2000) Nature 403，383-384 ; Chen MS 等人（2000)Nature 403，434.439 ; GrandPre T等人（2000)Nature 403，439-444 ; US 005250414A ; WO 200005364A1 ; WO 0031235)。

已鑑別出三種形式之人類NOGO:具有1192個胺基酸殘 基之 NOGO-A(GenBank 登錄號 AJ251383) ; NOGO-B，一種 在推定之胞外結構域中缺少殘基186至1004a的剪接變體 (GenBank登錄號AJ251384)及一較短剪接變體，NOGO-C， 其同樣缺少殘基186至1004且同樣具有較小之替代胺基酸 末端結構域（GenBank登錄號 AJ25 1385)(Prinjha 等人（2000) 上述文獻）。 抑制如NOGO等CNS抑制蛋白可為改善神經元損傷及促 進神經元修復及生長從而潛在協助（例如）中風中持續存在 之神經元損傷的恢復提供一種治療手段◊該等NOGO抑制 劑之實例可包括小分子、肽及抗體。 曾有報告稱鼠類單株抗體即IN-1 (針對NI-220/250產生， 其中NI-220/2 5 0係一為神經突生長之有效抑制劑的髓鱗脂 蛋白（且隨後顯示為NOGO-A之片段））可促進軸突再生

(Caroni，P及 Schwab，ME (1988) Neuron 1 85·96 ; Schnell， L及 Schwab，ME (1990) Nature 343 269-272 ; Bregman，BS 116953.doc •10- 1378940 等人（1995) Nature 378 498-501 及 Thallmair，Μ等人（1998) Nature Neuroscience 1 124-131)。亦曾有報導稱NOGO-A係 IN-1 之抗原（Chen 等人（2000) Nature 403 434-439)。向已經 歷脊柱橫切之大鼠投予IN-1 Fab片段或人源化IN-1增強了 恢復（Fiedler，Μ 等人（2002) Protein Eng 15 93 1-941 ; Brosamle，C等人（2000) J. Neuroscience 20 8061-8068)。

可結合NOGO之單株抗體闡述於WO 04/052932及WO 2005028508_。WO 04/052932揭示一種可以高親和性結合 某些形式之人類NOGO的鼠類抗體11C7。 專利申請案WO 05/061544亦揭示高親和性單株抗體，包 括鼠類單株抗體2A10，且概括揭示其人源化變體，例如

H1L11(H1及L11之序列分別在SEQ ID NO. 33及34(僅為VH ·· 或VL序列）中提供）。揭示該等抗體可以高親和性結合人類 NOGO-A。鼠類2A10抗體（及其CDR-接枝人源化變體）特徵 為其輕鏈及重鏈可變區内具有下列互補決定區（CDR)序列 (如用 Kabat方法（Kabat 等人，（1991) "Sequences of proteins of immunological interest";第五版；US Department of Health and Human Services ; NIH 發行號 91-3242)所確 定）：

表1 :抗體2A10輕鏈CDR CDR 序列 LI RSSKSLLYKDGKTYLN(SEQ ID NO:4) L2 LMSTRAS(SEQ ID NO:5) L3 QQLVEYPLT(SEQ ID NO:6) 116953.doc 1378940

表2 :抗體2A10重鏈CDR CDR 序列 H1 SYWMH(SEQIDNO:l) H2 NINPSNGGTNYNEKFKSfSEO ID ΝΟ:2Ί H3 GQGY(SE〇 ID NO:3) WO 05/061544進一步揭示包含上述表1及表2之抗體之 CDR的"類似物"，該等"類似物"與其來源供體抗體具有相 同抗原結合待異性及/或中和能力。 _修 儘管業内提供高親和性抗NOGO抗體，但分離及開發替 代品或經改良之可結合人類N〇G〇並抑制其活性之在治療 上有用的單株抗體仍然係十分期望之目標。 神經變性過程係諸多神經疾病/病症之基礎，該等疾病/ 病症包括（但不限於）急性疾病.，例如中風（局部缺血性或出 血性）、創傷性大腦損傷及脊髓損傷；以及慢性疾病，包 括阿茲海默氏症、額顳葉癡呆（τ病變）、外周神經病、帕金 森氏病（Parkinson，s disease)、克雅氏病（Creutzfeidt jak〇b ## disease，CjD)、精神分裂症、肌萎縮性側索硬化（als)、 多發性硬化、亨庭頓氏病（Huntingt〇n，s心咖）、多發性 硬化及包涵體肌炎。因此本發明之抗N〇G〇單株抗體及諸 如此類可用於治療此等疾病/病症。本發明提供用於治療 上述疾病/病症之抗體並詳細闡述於下文。 【發明内容】 本發明提供具體重鏈可變區及包含該等具體重鏈可變區 及一輕鏈可變區之抗體或其片段，該輕鍵可變區在與該等 116953.doc •12· 1378940 重鏈可變區配對時允許Fv二聚體以高親和性結合人類 NOGO-A且從而中和人類NOGO-A之活性。 可以習用免疫球蛋白方式（例如，人類IgG、IgA、IgM 等）或以其任何其他片段或可結合人類NOGO-A之"抗體樣" 形式（例如，單鏈Fv、雙抗體、TandabsTM等（有關替代"抗 體"形式之概述參見 Holliger 及 Hudson，Nature Biotechnology， 2005，第23卷，No. 9，1126-1136))使本發明之重鏈可變區 與輕鏈可變區一起格式化，從而允許結合人類NOGO-A。

一種重鏈可變區，其包含一基本由胺基酸殘基GQGY構 成之第三CDR，其中該CDR在該GQGY核心序列内含有至 少一處取代，該等取代係選下列取代：其中第一位之G由 R、I、W或Μ取代；第二位之Q由D、I、A、L、V或S取 代；第三位之G由W、Ν、Υ、S、L或F取代；且第四位之 Υ由W取代。 在另一實施例中，第三重鏈CDR(CDR Η3)僅包含一處可 產生下列 CDR H3 之取代：RQGY(SEQ ID NO‘75)、IQGY(SEQ ID ΝΟ·76)、MQGY(SEQ ID N0.45)、GDGY(SEQ ID N0.77)、 GIGY(SEQ ID N0.78)、GSGY(SEQ ID N0.79)、GQNY(SEQ ID NO.80)、GQYY(SEQ ID N0.81)、GQSY(SEQ ID N0.62)、 GQLY(SEQ ID NO.82) ' GQFY(SEQ ID NO.83) ' GQGW(SEQ ID N0.84)、WQGY(SEQ ID NO.86)、GAGY(SEQ ID N0.87)、 GLGY(SEQ ID N0.88)、GVGY(SEQ ID N0.89)、GQWY(SEQ ID NO.90) 〇 在另一實施例中，上述重鏈可變區進一步包含表2中所 116953.doc •13· 1378940 列示之其他 CDR，即 CDR H1(SEQ ID NO. 1)及 CDR H2(SEQ ID NO.2)。 根據在ELIS A及Biacore實驗中量測之其活性，本發明之 抗體或其片段保留了包含CDR H3:GQGY之抗體的人類 NOGO結合活性，且在一些情形中此等實驗中之活性得到 增強。

含有G95M(Kabat取代編號）之人類或人源化重鏈可變區 在本發明一實施例中，本發明之重鏈可變區包含表3中 所定義之CDR(如根據Kabat所定義）： 表3 : CDR 序列 H1 SYWMH(SEQ ID ΝΟ:1) H2 NINPSNGGTNYNEKFKS(SEQ ID NO:2) H3 MQGY(SEQ ID NO:45) 在本發明一實施例中，提供一種包含表3中所列示之每 一 CDR之人類或人源化重鏈可變區。在本發明另一實施例 %% 中，提供一種在人類重鏈可變區之較大序列中包含表3中 所列示CDR的人源化重鏈可變區。在另一實施例中，人源 化重鏈可變區在構架區與鼠類2A10供體抗體重鏈可變區 (SEQ ID NO.7)具有大於40%之一致性、或大於50%、或大 於60%、或大於65%之一致性的受體抗體構架中包含表3中 所列示之CDR。 在表3之CDR均得到使用時，在一實施例中該重鏈可變 區序列係作為SEQ ID NO. 66提供之序列H98(H98 VH係H1 116953.doc -14- 1378940 乂11(8丑(）1〇1^0.3 3)之等效物，二者不同之處僅係在1^98中 CDR H3為MQGY而在HI中見到的為GQGY)。 在本發明一態樣中，該等抗體包含一具有在位置38、 40、48、67、68、70、72、74及79中一或多處進一步包含 多處取代之SEQ ID NO. 66(H98可變區）之胺基酸序列的重

鏈可變區；其中每一經取代之胺基酸殘基由SEQ ID NO 7(供體抗體2A10之重鏈可變區）中等效位置處之胺基酸殘 基取代且取代數目介於1至9之間。在其他實施例中，取代 數目係1、或2、或3、或4、或5、或6、或7、或8或9。 在此範圍内，所述取代在概念上等效於"回復突變"，其 中H98序列内具體位置之人類構架胺基酸殘基回復突變成 2A10供體抗體序列内等效位置處之胺基酸殘基。 除非在本文中有相反的具體說明，否則在本文件中提及 具體序列中所見之胺基酸殘基的數字位置時，例如"位置 12"，意欲指熟練讀者將該序列中第一個胺基酸指定為位 置” 1"且自位置1起計數並辨別位於期望位置之胺基酸，在 此實例中係該序列中第12個胺基酸殘基。熟練讀者會注意· 到此編號系統並不符合常用於定義抗體序列内胺基酸位置 之Kabat編號系統。 對於最優结合親和性，發現對於小鼠抗體2A10(用於其 之VH為SEQ ID NO. 7)之人源化而言，48位及68位之胺基 酸殘基對應分別為I及A(在其存於2A10時）或分別為μ及 V(在其存於Η98時）。預計上述發現亦與2Α10之G95M變體 的人源化有關。 116953.doc 15 1378940 下列表格包括可構成本發明之抗體一部分之三個不同重 鏈可變（VH)區的詳細資料。每一所揭示之VH係基於進一 步包含表（表4)中所提及之取代之H98 VH(SEQ ID NO. 66)，其中相關位置中之H98殘基在該位置係由2A10殘基取 代（在該表中，表示在該位置上不存在取代，且因此該 殘基按原樣保留在H98序列中）： 表4 :

新VH (SEQ ID NO. X) 奉孛to，. 38 40 ,48 67: 68 :70 ,72 -74 v •79; K.aibat編號/ 38 40v 48： :66 67 69 ；71 i73 78 2A10- ： K R h： 1K . A L'r'· V- \K %：：' :H98 ' ·： R A - M R ：,. V :M::· R r ί：；；·. H26 (47) - - I - A - - - A H27 (48), K R I K A L V K A H28 (49)： - - I K A - - - A

因此，在本發明一實施例中，本發明之重鏈可變區（VH) 係 H26 VH(SEQ ID NO. 47)、H27 VH(SEQ ID NO. 48)及 H28 VH(SEQ ID NO. 49)。 SEQ ID 47:VH人源化構造H26

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGL

EWIGNINPSNGGTNYNEKFKSRATMTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTAV

YYCELMQGYWGQGTLVTVSS SEQ ID 48:VH人源化構造H27

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWYKQRPGQGL

EWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAV

YYCELMQGYWGQGTLVTVSS SEQ ID 49:VH人源化構造H28

Q VQLVQSGAEVKKPGAS VKVSCKASGYTFTS Y WMHWVRQ A P G Q G LEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATMTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTA VYYCELMQGYWGQGTLVTVSS 116953.doc •16- 1378940 包含Gl01S(Kabat取代編號）之人類或人源化重鏈可變區 在本發明另一實施例中，提供一種包含表5中所定義之 CDR的人類或人源化重鏈可變區： 表5 : CDR 根據Kabat H1 SYWMH(SEQ ID ΝΟ:1) H2 NINPSNGGTNYNEKFKS(SEQ ID NO:2) H3 GQSY(SEQ ID NO:62)

在一實施例中，將表5之CDR併入人類重鏈可變區序列 中。在另一實施例中，人源化重鏈可變區在構架區與鼠類 2A10供體抗體重鏈可變區（SEQ ID NO.7)具有大於40%之 一致性、或大於50%、或大於60%、或大於65%之一致性 之受體抗體構架中包含表5中所列示之CDR。 在另一實施例中，將表5之CDR插入人類重鏈可變區以 得到下列序列（H99):

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAP ·· GQGLEWMGNINPSNGGTNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMEL SSLRSEDTAVYYCELGQSYWGQGTLVTVSS(SEQ ID 61: 2A10 VH人源化構造H99)。 在其他實施例中，將又一回復突變加入H99 VH序列之 位置 38、40、48、67、68、70、72、74 或 79 中任一處（由 數字殘基位置表示）；其中每一經取代之胺基酸殘基由SEQ ID NO 7(供體抗體2A10之重鏈可變區）中等效位置處之胺 基酸殘基取代且取代數目介於1至9之間。在其他實施例 116953.doc -17- 1378940 中，取代數目係1、或2、或3、或4、或5、或6、或7、或8 或9。H99 VH等效於HI VH(SEQ ID N0.33)，二者不同之 處僅為H99中CDR H3係GQSY而H1中所存在者為GQGY。 對於最優結合親和性，發現對於小鼠抗體2A10(用於其 之VH為SEQ ID NO. 7)之人源化而言，48位及68位之胺基 酸殘基對應分別為I及A(在其存於2A10時）或分別為Μ及 V(在其存於Η98時）。預計上述發現亦與2Α10之G95M變體 的人源化有關。

在一實施例中，回復突變位於下方表6中所指定的位 置，其中相關位置上之Η99殘基在該位置係由2Α10殘基取 代（在該表中意指在該位置沒有取代，且因此該殘基 按原樣保留在Η1序列中）： ··

表6 : tfVH .； (SEQ: ID NO；X)： ’ · ..- 羌義碁::: :: 編藏...:· _ ·, 1 :40: :48 : /. < 67, 68 .’70 .72. ::C _,.··· --·, L".. . i79. Kabat No； ；. · 38 ： 40, 48 66 67： 69； 1.1 73:: 78 ： 2AJ0 :亡，: :K' R/， I: K A Ί··；Ζ V ^ K At H99- [ ΑΛ： :M: R ¥：'; M： R T：v：_ Vy, HI 00 (63)： - - I - A - - - A HI 01 (64) K R I K A L V K A H102(65): - - I K A - - - A 包含人類或人源化重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體或片段 本發明之VH構造可與輕鏈配對以形成任何形式之人類 NOGO-A結合單元（Fv)，包括具有全長（FL)可變及恆定結 構域重鏈序列之習用之IgG抗體形式。包含本發明之VH構 造並使23 5及237位置（EU索引編號）處之突變失活以使抗體 116953.doc • 18 · 1378940 不被溶解的全長（FL)IgGl重鏈序列之實例係SEQ ID NO 53、54及55 ° SEQ ID 53:重鏈人源化構造H26 MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTF TSYWMHWWQAPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSRATMTRDTS TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFP LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ 88〇υΥ8Ι^8νντνΡ388Ι^Τ(^ΊΎΙ〇ΝνΝΗΚΡ8ΝΤΚν〇ΚΚνΕΡΚ^ΟΚΤ HTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK • · SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 〇 SEQ ID 54:重鏈人源化構造H27

MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTF

TSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATLTVDKS

TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFP

LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ

SSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT

HTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE

VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK

EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLT

CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP^DSDGSFFLYSKLTVDK

SRWQQGNYFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK _籲SEQ ID 55:重鏈人源化構造H28

MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTF

TSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATMTRDTS

TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFP

LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ

SSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT

HTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPE

VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK

EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQYYTLPPSRDELTKNQVSLT

CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVT.DSDGSFFLYSKLTVDK

SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 可與本發明之重鏈可變區序列形成一 Fv的輕鏈可變區序 列可為允許Fv結合人類NOGO-A的任一序列。 116953.doc •19- 1378940 在本發明一實施例中，該輕鏈可變區係2A10輕鏈（參見 WO 05/061544)，2A10輕鏈之輕鏈可變區在本文中係作為 SEQ ID NO. 8或其人源化變體提供。2A10輕鏈之人源化變 體較佳含有表1中所述接枝到人類輕鏈可變區受體構架上 之所有輕鏈可變區CDR。在一實施例中，該等人源化輕鏈 可變區係 L11(SEQ ID N0.34)、L13(SEQ ID N0.13)或 L16(SEQ ID N0.14)。在kabat位置3 7及/或45中包含具體取 代之基於L13及L16的替代輕鏈可變區在表7中提供。

表7 :

說明 SEQ ID NO· 序列 L100 (L13+Q37R) 67 DIVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFRQ RPGQSPQLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAE DVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK L101 (L13+Q45R) 68 DIVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFQQ RPGQSPRLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAE DVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK L102 (L13+Q37R/Q45R) 69 DIVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFRQ RPGQSPRLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAE DVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK L103 (L16+Q37R) 70 DIVMTQSPLSNPVTLGQPVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFRQ RPGQSPQLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAE DVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK L104 (L16+Q45R) 71 DIVMTQSPLSNPVTLGQPVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFLQ RPGQSPRLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAE DVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK L105 (L16+Q37R/Q45R) 72 DIVMTQSPLSNPVTLGQPVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFRQ RPGQSPRLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAE DVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK 在另一實施例中，全長（FL)輕鏈序列係L11FL(SEQ ID N0.36)、L13FL(SEQIDN0.17；^L16FL(SEQIDN0.18)。 在另一實施例中，該等抗體、其片段或功能等效片段包 含一選自 H26、H27、H28、H100、H101 及 H102 VH之序 • 20· 116953.doc 1378940 列；連同下列 VL序列即 Lll、L13、L16、LlOO、L101、 1^102、1^103、[104及1^105中的任一個。意欲具體揭示所 列示之重鏈可變區及輕鏈可變區的所有可能組合均（例如 H28L104等）。 在特定實施例中，該等抗體、其片段或功能等效物包含 下列可變區對：

H27L16(SEQ ID NO.48 + SEQ ID NO.14) H28L13(SEQ ID NO.49 + SEQ ID NO.13) H28L16(SEQ ID NO.49 + SEQ ID NO.14) 在另一實施例中，本發明之抗體包含下列全長序列： H27FL L16FL(SEQ ID NO. 54 + SEQ ID NO.18) H28FL L13FL(SEQ ID NO. 55 + SEQ ID NO.17) H28FL L16FL(SEQ ID NO. 55 + SEQ ID NO.18)

在一實施例中，本發明之抗體包含H27L16(SEQ ID NO.48 + SEQ ID NO.14) > 或為全長抗體 H28FL ·· L16FL(SEQ ID NO. 55 + SEQ ID NO.18) 〇

在另一實施例中，該抗體或其片段可結合相同人類 NOGO抗原決定部位，如H28L16，或與H28L16競爭結合 人類NOGO，特徵為在兩種情形中競爭性抗體或其片段並 非為鼠類抗體2A10或其包含一具有序列GQGY(SEQ ID NO_3)或一在CDR H3中含有一處胺基酸取代之序列之CDR H3的人類或人源化變體。 在特定實施例中，該等抗體、其片段或功能等效物包含 下列可變區對： 116953.doc -21 - 1378940 H100L16(SEQ ID NO.63 + SEQ ID NO.14) H101L13(SEQ ID NO.64 + SEQ ID NO.13) H102L16(SEQ ID NO.65 + SEQ ID NO.14)

抗原決定部位作圖及可結合相同抗原決定部位之更多抗體 在另一實施例中，提供一種在ELISA分析中能夠結合人 類NOGO蛋白或其片段（例如GST-NOGO-A56蛋白（SEQ ID NO.32)形式）之抗體或其片段，其中該抗體或其片段在 ELISA分析中與人類NOGO蛋白或其片段之結合在具有下 列序列即VLPDIVMEAPLN(SEQ ID NO. 60)之肽存在下降 低，且在無關肽（例如來自不與SEQ ID NO.60重疊之人類 NOGO 的肽（例如 SEQ ID NO. 85，YESIKHEPENPPPYEE) 存在下並未降低，其特徵為該抗體或其片段並非為包含一 重鏈可變結構域（其具有一由胺基酸殘基GQGY或其在CDR H3中具有一處胺基酸取代之類似物構成之CDR H3)的抗 體。另一選擇為，競爭性肽係TPSPVLPDIVMEAPLN(SEQ ·· ID NO· 73)或 VLPDIVMEAPLNSAVP(SEQ ID NO. 74)。此 外，可作為抗體或其片段結合同一抗原決定部位之抗體可 為不含表1及表2中所列示之所有CDR之抗體、或為包含一 組與表1及表2組合或表1或表2單獨列示之CDR具有80%或 更高同源性之CDR的任一抗體。 在本發明另一實施例中，提供一種能夠在ELISA分析中 結合由多肽序列VLPDIVMEAPLN(SEQ ID NO. 60)構成之 人類NOGO蛋白之區域的抗體或其片段，其特徵為該抗體 或其片段並非為包含一可變重鏈結構域（其具有由胺基酸 116953.doc 22· 1378940 殘基GQGY或其在CDR H3中具有一處胺基酸取代之類似物 構成之CDR H3)的抗體。另一選擇為，該抗體或其片段能 夠結合 TPSPVLPDIVMEAPLN(SEQ ID NO. 73)或 VLPDIVMEAPLNSAVP(SEQIDNO. 74)。此外，可作為抗體 或其片段結合同一抗原決定部位之抗體可為不含表1及表2 中所列示之所有CDR之抗體、或為包含一組與表1及表2組 合或表1或表2單獨列示之CDR具有80%或更高同源性之 CDR的任一抗體。

在本發明另一實施例中，提供一種獲得一可結合人類 NOGO抗原決定部位即 VLPDIVMEAPLN(SEQ ID NO. 60) 之抗體或其結合片段的方法，該方法包括用該肽免疫哺乳 動物並分離能夠產生可結合該肽之抗體的細胞。在本發明 另一實施例中，提供一種獲得一可結合人類NOGO抗原決 定部位即VLPDIVMEAPLN(SEQ ID NO. 60)之經分離之抗 體或其結合片段的方法，該方法包括篩選包含複數個抗體 或其結合片段之文庫，每一個均可藉由該抗體或其結合片 段與NOGO抗原決定部位即VLPDIVMEAPLN(SEQ ID NO. 60)之結合連同編碼該抗體或其結合片段之核苷酸序列一 起自文庫中分離出來。 醫藥組合物 本發明又一態樣提供一種包含本發明之抗NOGO抗體或 其功能片段或等效物連同一醫藥上可接受之稀釋劑或載劑 的醫藥組合物。 在又一態樣中，本發明提供一種在人類中治療或預防中 116953.doc -23· 1378940 風（尤其為缺血性中風）及其他神經疾病（特定而言為阿兹海 默氏症）及治療患有CNS機械性創傷（例如脊柱損傷）之患者 的方法，該方法包括向需要其之該人類投予有效量之本發 明抗NO GO抗體或其功能片段。 在另一態樣_，本發明提供本發明之抗n〇g〇抗體或其 功此片&在製備用於治療或預防中風（尤其為缺灰性中風） 及其他神經疾病（特定而言為阿兹海默氏症）及治療患有 籲籲CNS機械性創傷（例如脊柱損傷）之患者之藥物中的用途。 在又-態樣中’本發明提供一種在遭受或處於形成中風 (尤其為缺血性中風)或其他神經疾病(特定而言為阿兹海默 氏症）之風險中之人類患者中抑制神經變性及/或促進功能 恢復及治療患有CNS機械性創傷（例如脊柱損傷）之患者的 方法’該方法包括向需要其之該人類投予有效量之本發明 抗NO GO抗體或其功能片段。 在又一態樣中，本發明提供本發明之抗N〇G〇抗體或其 ··功旎片段在製備用於在遭受或處於形成中風及其他神經疾 病（特定而s為阿茲海默氏症）之風險中之人類患者中抑制 神經變性及/或促進功能恢復及治療患有CNs機械性創傷 (例如脊柱損傷）之患者之藥物中的用途。 本發明之其他態樣及優點進一步在具體實施方式及其較 佳實施例中加以閣述。 【實施方式】 π可將本發明之重鏈可變區格式化成天然抗體或其功能片 段或等效物之結構。因此該抗體在與適宜輕鏈配對時可包 H6953.doc •24· 1378940

含格式化成全長抗體、（Fabj2片段、Fab片段、或其等效 物（例如scFV、雙鏈-、三鏈-或四鏈抗體、Tandab)之本發 明VH區。該抗體可為Ig(3i、IgG2、IgG3或IgG4 ;或IgM ; IgA、IgE或IgD或其經修飾之變體。可相應選擇抗體重鏈 之恆定結構域。輕鏈恆定結構域可為 <或λ恆定結構域。此 外’該抗體可包含所有類別之修飾，例如IgG二聚體，不 再結合Fc受體或調節ciq結合之Fc突變體。該抗體亦可為 WO 86/01533中所述類型之嵌合抗體，其包含一抗原結合 區及一非免疫球蛋白區。 根據所需功能選擇恆定區。正常情況下，IgG1會藉由與 補體結合展現溶解能力及/或會調介ADCC(抗體依賴性細 胞毒性）。若需要非細胞毒性阻斷抗體，則IgG4較佳。然 而’ IgG4抗體會在產生中展現不穩定性且因此對於修飾一 般更穩定之IgG 1而言其會更佳。建議修飾闡述於歐洲專利 第0307434號’較佳修飾包括在位置235及237。因此，本 φφ 發明提供本發明抗體之溶解或非溶解形式。 因此在較佳形式中，本發明之抗體係一具有本文所述重 鏈可變區之全長（即H2L2四聚體）非溶解IgGl抗體。 在又一態樣中，本發明提供編碼本文所述重鏈可變區之 多核苷酸。 "NOGO"係指任何NOOO多肽，包括變體形式。此包括 (但不限於）具有1192個胺基酸殘基之NOGO-A(GenBank登 錄號AJ251383) ; NOGO-B，一在推定之胞外結構域中缺少 殘基186至1004之剪接變體（GenBank登錄號AJ251384)及一 116953.doc •25- 1378940 較短剪接變體’即NOGO-C，其同樣缺少殘基186至1〇〇4且 同樣具有較小替代胺基末端結構域（GenBank登錄號 AJ25 1385)(Prinjha等人（2000)上述文獻）。除非具體說明， 否則應將本文對”NOGO"之所有提及理解為包括所述的任 何及所有NOGO(例如NOGO-A)變體形式及剪接變體。 "中和"及其語法變化形式係指NOGO功能（包括其與神經 元之結合）之整體或部分抑制及神經突生長之抑制。

術語Fv、Fc、Fd、Fab、或F(ab)2可以其標準含義使用 (例如參見 Harlow等人，Antibodies A Laboratory Manua卜 Cold Spring Harbor Laboratory，（1988))。 "嵌合抗體"係指一類包含與源自受體抗體之輕鏈及重鍵 怪定區締合之源自供體抗體之天然存在之可變區（輕鏈及 重鏈）的經改造抗體。 "人源化抗體"係指一類其CDR源自非人類供體免疫球蛋 白且該分子的其餘源自免疫球蛋白部分源自一（或多個）人 φφ 類免疫球蛋白之經改造抗體。此外，構架支撐殘基可經改 造以保留結合親和性（例如參見Queen等人，pr〇c Nati

Acad Sci USA，86:10029-10032(1989)，Hodgson等人，

Bio/Technology，9:421(1991))。適宜人類受體抗體可為一 根據與供體抗體（在此情形中為鼠類供體抗體2ai〇)之核;g： 酸及胺基酸序列之同源性選自習用資料庫（例如，KABAT㊣ 資料庫、Los Alamos資料庫及Swiss蛋白資料庫）之抗體。 根據與供體抗體之構架區的同源性（基於胺基酸）表徵之人 類抗體會適合提供一重鏈恆定區及/或一用於插入供體 116953.doc • 26- 1378940 CDR之重鏈可變構架區（對於用於插入受體構架之2ai〇 CDR參見表1)。可以類似方式選擇能夠提供輕鏈恆定或可 變構架區之適宜受體抗體。應注意，不需要受體抗體重鏈 及輕鏈來源於相同受體抗體。先前技術闡述若干用於產生 該等人源化抗體之方法_例如參見歐洲專利第Ερ·Α_ 0239400號及第 ΕΡ-Α-05495 1 號。

術語"供體抗體"係指非人類抗體，其向人源化抗體提供 其"Τ變£、CDR或其其他功能片段或類似物之胺基酸序 列’且從而k供具有供體抗體之抗原特異性及中和活性特 徵之人源化抗體。 術語"受體抗體"係指與供體抗體異源之抗體，其向人源 化抗體提供其重鏈及/或輕鍵構架區及/或其重鏈及/或輕鏈 恆定區之胺基酸序列。該受體抗體可源自任何哺乳動物， 只要其在人類體内不具免疫原性即可。較佳地，該受體抗 體係一人類抗體。 另一選擇為，人源化可藉由一 ”鑲飾"過程來達成。獨特 人類及鼠類免疫球蛋白重鏈與輕鏈可變區之統計學分析揭 示，暴露殘基之精確模式在人類與鼠類抗體中不同，且大 部分單獨表面位置對少數不同殘基具有很強偏愛（參見

Padlan Ε·Α.等人；（1991) Mol. Immunol. 28，489-498 及 Pedersen J.T.等人（1994) J. Mol. Biol. 235; 959-973)。因 此’藉由置換其構架區中不同於彼等人類抗體中常見者之 暴露殘基可能會降低非人類Fv之免疫原性。由於蛋白抗原 性會與表面可達性有關，故表面殘基之置換會足以使人類 116953.doc •27- 1378940 免疫系統"看不見"小鼠可變區（亦參見Mark G.E.等人（1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113 卷:The pharmacology of monoclonal Antibodies > Springer-Verlag，第 105-134頁）。此人源化程序稱作"鑲飾"，此乃因僅改造抗 體表面，支撐殘基保持原狀。進一步替代方法列示於WO 04/006955 中 °

將"CDR"定義為抗體之互補決定區胺基酸序列，彼等係 免疫球蛋白重鏈及輕鏈之超變區。例如參見Kabat等人 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 4版， ·· U.S. Department of Health and Human Services，National Institutes ofHealth (1987)。在免疫球蛋白可變部分有三個 重鏈CDR及三個輕鏈CDR(或CDR區）。因此，本文所用 "CDR"係指所有三個重鏈CDR或所有三個輕鏈CDR(或適宜 時指所有重鏈CDR與所有輕鏈CDR)。抗體之結構及蛋白 折疊可意指將其他殘基視作抗原結合區的一部分且熟練技 術者會如此對其加以理解。例如參見Chothia等人，（1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions ； Nature 342 > 第 877-883 頁。 雙特異性抗體係對至少兩個不同抗原決定部位具有結合 特異性之抗體。製備該等抗體之方法為業内已知。傳統 上，雙特異性抗體之重組產生係基於共表現兩個免疫球蛋 白Η鏈-L鏈對，其中兩個Η鏈具有不同結合特異性，參見

Millstein 等人，Nature 305 537-539(1983)、WO 93/08829 及

Traunecker等人，EMBO，10，1991，3655-3659。由於Η 116953.doc -28- 1378940

鏈及L鏈之隨機分配，可產生十個不同抗體結構之潛在混 合物，其中僅有一個具有期望之結合特異性。替代方法涉 及將具有期望之結合特異性的可變結構域融合至包含鉸鏈 區、CH2及CH3區中至少一部分的重鏈恆定區上。較佳 地，在至少一個融合體中具有含有輕鏈結合所必需位點之 CH1區。將編碼此等融合體且若需要編碼L鏈之DNA插入 不同表現載體且隨後將其共轉染入適宜宿主生物體中。有 可能藉助將兩個或所有三個鏈之編碼序列插入一個表現載 體。在一較佳方法中，雙特異性抗體係由在一個臂上具有 第一結合特異性之Η鏈及在另一個臂上提供第二結合特異 性之Η-L鏈對構成，參見WO 94/04690。亦參見Suresh等 人，Methods in Enzymology 121，210，1986。 在本發明一實施例中，提供一種雙特異性治療用抗體， 其中該抗體的至少一種結合特異性係在SEQ ID NO. 60中 所述之抗原決定部位處結合人類NOGO。在本發明另一實 施例中，該雙特異性抗體包含重鏈可變區CDR Η3序列 MQGY(SEQ ID NO· 45)。在另一實施例中，雙特異性抗體 包含下列重鏈與輕鏈可變區對：H27L16(SEQ ID N0.48 + SEQ ID NO.14) ' H28L13(SEQ ID NO.49 + SEQ ID NO.13) 或 H28L16(SEQ ID N0.49 + SEQ ID N0.14)。 本發明之抗體可藉由用包含本發明之抗體之編碼序列的 表現載體轉染宿主細胞來產生。表現載體或重組質粒係藉 由以可操作方式將抗體的此等編碼序列與能夠控制宿主細 胞中複製及表現及/或自宿主細胞分泌的習用調節控制序 116953.doc -29- 1378940 列相連來產生。調節序列包括可源自其他已知抗體之啟動 子序列（例如’ CMV啟動子）及信號序列。類似地，可產生 具有編碼互補抗體輕鏈或重鏈之DNA序列的第二表現載 體。較佳地’除了在编碼序列及可選擇標記方面以外此第 二表現載體與第一表現載體皆相同，以確保每一多肽鏈均 儘量在功能上受到表現。另一選擇為’經改造抗體之重鏈 與輕鏈編碼序列可存於單一載體上。

藉由習用技術用第一及第二載體共轉染所選宿主細胞 (或僅用單一載體轉染）以形成包含重組或合成之輕鏈及重 鏈二者的本發明之經轉染宿主細胞。然後藉由習用技術培 養經轉染細胞以產生本發明之經改造抗體。藉由適宜分析 (例如ELISA或RIA)自培養物中篩選包含重組重鏈及/或輕 鏈二者組合之抗體。可採用類似習用技術構建其他經改造 之抗體及分子。 一種有用之表現系統係麩胺酸合成酶系統（例如由[onza φφ Bl〇1〇g1CS出售者），尤其在宿主細胞系CH〇或NS〇之情形下 如此（參見下文）。編碼抗體之多核苷酸容易用習用程序（例 如募核苷酸探針）分離及定序。可使用之載體包括質粒、 病毒、噬菌體、轉座子、微型染色體，其中質粒為一典型 實施例。-般而言，該等載體進一步包括以可操作方式連 至輕鏈及/或重鏈多核苷酸上以促進表現的一信號序列、 複製起始點、一或多個標記基因、一增強子、一啟動子及 轉錄終止序列。可將編碼輕鍵及重鍵之多核势酸插入分開 之載體並將載體導入(例如藉由電穿孔)相同宿主細胞，或 116953.doc -30· 1378940 若需要可將重鏈及輕鏈二者插入用於轉染入宿主細胞之相 同載體中。因此’根據本發明一實施例，提供一種構建編 碼本發明治療用抗體或其抗原結合片段之輕鏈及/或重鏈 之載體的方;^ 0亥方法包括將編碼本發明治療用抗體之輕 鍵及/或重鏈的多核普酸插入—載體。 在另-實施例t，提供-種編碼具有seqidn〇:仏 48或49中所列示之序列之人源化重鏈可變區的多核普酸。 φφ 在另一實施例中’提供一種編碼具有SEQ.I.D.NO: 53、 54或55中所列示之序列之人源化重鏈的多核苷酸。 熟習此項技術者會立即明瞭，由於遺傳密碼之冗餘性， 可使用編碼本發明之多肽的本文所揭示之多核苷酸的替代 多核苷酸》 熟習此項技術者可對本發明之方法及組合物構建中所採 用之用於選殖及亞選殖步驟之適宜載體加以選擇。例如， 可使用習用的Puc系列選殖載體。一載體mpUC19可自供 ··應公司（例如 Amersham(Buckinghamshire，United Kingdom)或 Pharmacia(Uppsala，Sweden))購得。此外，任何能夠容易 複製、具有豐富的選殖位點及選擇基因（例如，抗生素抗 性）且易於操作之載體均可用於選殖。因此，選殖載體之 選擇並非為本發明之限制因素。其他較佳載體序列包括一 P〇ly Α信號序列（例如來自牛生長素（BGH))及ρ球蛋白啟動 子序列（Pglopro)。本文中可用表現載體可藉由熟習此項技 術者熟知之技術合成。典型選擇基因編碼（a)賦予抗抗生素 或其他毒素（例如氨苄青黴素、新黴素、胺甲嗓呤或四環 116953.doc •31 · 素）之抗性或（b)互補營養缺陷型缺陷或補充複合培養基中 不可取得之營養物質的蛋白。選擇方案會涉及阻止宿主細 長因具有（例如）選擇標記所賦予之藥物抗性，故已 用、為碼本發明之治療用抗體之基因成功轉化的細胞會存 另實例係所謂DHFR選擇標記，其中在胺甲喋呤存 在下培養轉化子。對於DHFR選擇，ch〇細胞系特別有用 之細胞系。選擇經轉化宿主細胞及擴增轉基因之細胞拷貝 φφ數之方法包括使用DHFR系統，參見Kaufman R.J.等人，j. M〇l· Biol. (1982) 159 ’ 601-621，有關評述參見 Werner W K〇PP κ，Schluter Μ，"Appropriate mammalian expression systems for biopharmaceuticals" > Arzneimittel-Forschung 〇 48(8) . 870-80 ’ 1998年8月。另一實例係麵胺酸合成酶表現 系統（L〇nzaBi〇i〇gics)。用於酵母之適宜選擇基因係by基 因，參見 Stinchcomb等人，Nature 282，38，1979。 該等載體之組件（例如複製子、選擇基因、增強子、啟 ##料、信號序列及諸如此類）可自，f或天然來源獲得或 可藉由用於指導重組DNA產物在所選宿主中表現及/或分 泌之已知程序合成。亦可就此目的選擇其中多數類型在業 内已知可用於哺乳動物、細菌、昆蟲、酵母及真菌表狀 其他適宜表現載體。 本發明亦涵蓋—種用含有本發明之抗體或等效物之編碼 序列之重組質粒轉染的細胞系。可用於此等選殖載體之選 殖及其他操作的宿主細胞亦係習用者。然而，最期望者 為將來自各種大腸杯菌菌株之細胞用於選殖載體之複製 116953.doc -32- 1378940 及構建本發明之經改造抗體的其他步驟。

用於表現本發明之抗體的適宜宿主細胞或細胞系較佳為 哺乳動物細胞，例如NS0、Sp2/〇、CHO(例如DG44)、 c〇S、成纖維細胞細胞（例如，3T3)及骨趙瘤細胞，且更佳 為CHO或骨髓瘤細胞。可使用人類細胞，從而能夠用人類 糖基化模式修飾該分子。另一選擇為，可採用其他真核細 胞系。適宜哺乳動物宿主細胞的選擇及用於轉化、培養、 擴增、篩選及產物產生以及純化的方法為業内已知。例如 參見Sambrook等人，上述引用文獻。 細菌細胞證明可用作適合表現本發明之抗體或其片段 (例如重組Fab或ScFv)之宿主細胞（例如參見Pltickthun， A.，Immunol. Rev.，130:151-188(1992))。然而，因細菌

細胞所表現之蛋白趨向於呈未經折疊或未經正確折疊之形 式或非糖基化形式，故細菌細胞中所產生之任何重組片段 均須接受有關保留抗原結合能力之進一步篩選。若細菌細 胞表現之分子係以正確折疊形式產生，則細菌細胞會係一 期望之宿主。例如，用於表現之各種大腸桿菌菌株作為宿 主細胞為生物技術領域所熟知。在此方法中亦可採用枯草 芽抱桿菌、鍵徽菌、其他芽孢桿菌及諸如此類的各種菌 株。 需要時，熟習此項技術者已知之酵母細胞菌株以及昆蟲 細胞（例如果繩及鱗翅類）及病毒表現系統亦可作為宿主細 胞獲得。例如參見 Miller 等人，Genetic Engineering，8:277- 298 ’ Plenum Press(1986)及其中所引用之參考文獻。 116953.doc -33·

可構建載體之一般方法、產生本發明之宿主細胞所需要 的轉染方法及自該宿主細胞產生本發明之抗體所必需的培 t方法均為習用技術。通常，本發明之培養方法係一無血 月。養方法，通常藉由無血清懸浮細胞來達成。同樣，一 產生即可根據業内標準程序（包括硫酸銨沉澱、親和 ^主、管柱層析、凝膠電泳及諸如此類）自細胞培養内 、中、屯化本發明之抗體。此等技術為熟習此項技術者所 去且並非限制本發明。例如，抗體之製備闡述於W0 99/58679及 W0 96/16990 中。 表現抗體之又一其他方法可利用轉基因動物中之表現， 例如美國專利帛4,873,316號巾所述者。該專利案係關於使 用動物酪蛋白啟動子之表現系統，在將其以轉基因方式導 入哺乳動物時會允許雌性動物纟其乳汁中I生期望之重組 蛋白。 、在本發明又一態樣中，提供一種產生本發明之抗體的方 • •法’該方法包括培養用 編碼本發明之抗體之輕鏈及/或重 鍵的載體轉化或轉染之宿主細胞並從中回收所產生之抗體 的步驟。 用於選殖或表現編碼本發明抗體之載體之適宜宿主細胞 系原核帛母或面等真核細胞。適宜原核細胞包括真細菌 類，例如腸桿菌科，例如埃希氏菌屬，例如大腸桿菌 (£.CW)(例如 ATCC 31 446 ; 3 1 537 ; 27 325);腸桿菌 屬’歐文氏菌；克雷白氏桿菌屬；變形桿菌屬；沙門氏菌 屬，例如氤傷寒沙門菌（Saim〇neUa typhimurium) ·’沙雷菌 116953.doc •34· 1378940 屬，例如黏質沙雷菌（《Serran'a 及志賀菌屬以及 芽孢桿菌，例如枯草芽孢桿菌及地衣芽孢桿菌 (5./zc/zem；/brmzi)(參見DD 266 710);假單胞菌，例如钢綠 假單胞菌（户.aerwg/woia)及鏈黴菌。亦涵蓋酵母宿主細胞， 酿酒酵母菌（《Sacc/jfarowycei cerev/i/fle)、粟酒裂殖酵母菌

Oc/n’zc^acc/iotrowyca 、克魯維酵母屬（例如 ATCC

16,045 ; 12,424 ; 24178 ; 5 6,500)、解脂耶氏酵母屬（歐洲 專利第402,226號）、甲醇酵母菌（尸/(/^(2尸<315/〇广以）（歐洲專利 第 183,070號，亦參見 Peng等人，J. Biotechnol. 108 (20〇4) 18 5-192)、念珠菌屬、裏氏木黴菌以以化)（歐 洲專利第244,234號）、青黴菌、彎頸黴屬及曲黴菌屬宿 主，例如構巢麴菌及黑黴菌（J.m'ger)。 儘管本發明明確涵蓋原核及酵母宿主細胞，但本發明之 宿主細胞通常為脊椎動物細胞。適宜脊椎動物宿主細胞包 括哺乳動物細胞，例如COS-l(ATCC No.CRL 1650)COS- φφ 7(ATCC CRL 1651)、人類胚腎細胞系293、幼仔倉鼠腎細 胞（BHK)(ATCC CRL.1632)、BHK570(ATCC NO: CRL 10314)、293(ATCC NO.CRL 1573)、中國倉鼠卵巢細胞 CHO(例如 CHO-K1、ATCC NO: CCL 61、DHFR-CHO細胞 系，例如DG44(參見 Urlaub等人，（1986) Somatic Cell Mol. Genet. 12，555-556))，尤其為彼等適用於懸浮培養之CHO 細胞系、小鼠Sertoli細胞、猴腎細胞、非洲綠猴腎細胞 (ATCC CRL-1 587)、HELA 細胞、犬腎細胞（ATCC CCL 34)、人類肺細胞（ATCC CCL 75)、Hep G2及骨髓瘤或淋巴 116953.doc •35· 1378940 瘤細胞，例如NS0(參見美國專利第58〇77i5號） 、 γ〇 〇 因此’在本發明—實施例中，提供—種包含編碼本文所 述治療用抗體或其抗原結合片段之重鏈及/或輕鏈之載體 的經穩定轉化之宿主細胞。通常’該等宿主細胞包含一編 碼該輕鏈之第一載體及一編碼該重鏈之第二載體。 可藉由熟習此項技術者已知的任何方法培養用編碼本發 =治療用抗體或其抗原結合片段之載體轉化之宿主細胞。 伤主細胞可在旋轉培養航、滾瓶或中空纖維系統中培養， 但對於大規模生產而言較佳係使用攪拌罐反應器，對於懸 浮培養尤其如此。通常該等攪拌罐適合用（例如）分佈器、 撐流板或低剪切力葉輪來通氣。肖於泡罩塔及氣升式反應 器可採用直接用空氣或氧氣泡通氣。在將宿主細胞培養於 無血清培養基之情形中，較佳係培養基補充有細胞保護劑 (例如普盧蘭尼克F-68)以有助於防止細胞因通氣過程而受 •φ 損。根據宿主細胞特徵，可使用微載體作為用於錨定依賴 性細胞系之生長基質，或使細胞會適應懸浮培養（典型方 式）。伤主細胞（尤其為脊椎動物宿主細胞）之培養可採用多 種作業方式，例如批次補料、反覆分批加工（參見Drapeau 等人（1994)Cyt〇techn〇l〇gy 15: 103-109)、擴展批次過程或 灌’i培養。儘管可將以重組方式轉化之哺乳動物宿主細胞 培養在含有金清之培養基（如含有肽牛血清（FCS)之培養基） 中，但較佳係將該等宿主細胞培養在合成的無血清培養基 (例如 Keen 等人（1995)Cytotechnology 17:153-163 中所揭示 U6953.doc •36· 1378940 者）或市售培養基（例如ProCHO-CDM或UltraCHOTM(Cambrex NJ，USA))中，必要時該等培養基中補充有能量來源（例如 葡萄糖）及合成的生長因子（例如重組胰島素）。宿主細胞之 無血清培養會需要使該等細胞適應在無血清條件下生長。 一種適應方法係在含有血清之培養基中培養該等宿主細胞 並重複將80%之培養基更換為無血清培養基以使宿主細胞 逐漸適應無血清條件（例如參見Scharfenberg尺等人， Π995) in Animal Cell technology： Developments towards 以w^Beuvery E.C.等人編輯），第 619 623 頁， Kluwer Academic 出版公司）β 可使用多種技術自培養基中回收及純化分泌至培養基中 的本發明之抗體以達到適用於預期用途之純度。例如，使 用本發明之’/台療用抗體治療人類患者時與包含該等治療用 抗體之培養基相比通常需要達至少95%之純度、更通常為 98%或99%之純度。在第一種情形中，通常利用離心然後 用（例如）微量過濾、超濾及/或深度過濾進行上清液之澄清 步驟去除來自培養基之細胞碎片。如透析及凝膠電泳以及 層析技術（例如羥磷灰石層析（ΗΑ)、親和層析（視情況涉及 親和加標籤系統，例如聚組胺酸）及/或疏水性相互作用層 析（HIC，參見美國專利第5,429,746號））等多種其他技術均 可用在一實施例中’經歷各種澄清步驟後用蛋白質a或 G親和層析隨後進一步用層析步驟（例如離子交換及/或只八 層析、陰離子或陽離子交換、尺寸排除層析及硫酸銨沉 澱）來捕獲本發明之抗體。通常，亦採用各種病毒去除步 I16953.doc •37· 1378940 驟（例如使用（例如）DV-20過濾器進行之奈米過濾卜此等不 同步驟後’得到包含至少75毫克/毫升或更多（例如1〇〇毫克/ 亳升或更尚）本發明之抗體或其抗原結合片段之純化（通常 為單株）製劑且從而形成本發明一實施例。適當地，該等 製劑實質不含聚集形式之本發明抗體。 根據本發明，提供一種產生可特異結合並中和人類 NOGO-A之活性之本發明抗N〇(J〇抗體的方法該方法包 括如下步驟：

(a) 提供一編碼一抗體重鍵之第一載體； (b) 提供一編碼抗體之輕鏈的載體； (c) 用該等第一及第二載體轉化一哺乳動物宿主細胞（例 如CHO); (d) 在有助於抗體自該宿主細胞中分泌至該培養基中之 條件下培養步驟（c)之宿主細胞； (e) 回收步驟（d)之分泌之抗體。 由期望之方法表現後，可藉助適宜分析檢查抗體之活體 外活性。採用目前習用之ELISA分析形式來評定抗體對 NOGO之定性及定量結合。此外，在實施用來評估抗體在 體内之持續性（儘管存在通常清除機制）的後續人類臨床研 究之前’亦可利用其他活體外分析確認中和效力。 本發明之抗體的其他改變形式包括本發明之抗體的糖基 化變體。已知位於抗體恆定區内保守位置處之抗體糖基化 對抗體功能具有深遠影響，尤其為效應功能，例如彼等上 文所述者，例如參見，Boyd等人（1996)，Mol. Immunol. 116953.doc •38- 1378940 32，1311-1318。本發明涵蓋本發明之治療用抗體或其抗 原結合片段的糖基化變體，其中加入、取代、刪除或修飾 一或多個糖部分。天冬醯胺-X-絲胺酸或天冬醯胺-X-蘇胺 酸基序之引入形成了一潛在的用於糖部分酶促附著之位點 且因此可用於操作抗體之糖基化。在Raju等人 (2001) Biochemistry 40，8868-8876 中，經由使用 β-1，4-半

乳糖基轉移酶及/或α，2,3唾液酸轉移酶進行之重新半乳糖 基化作用及/或重新唾液酸化作用的過程TNFR-IgG免疫黏 合素之末端唾液酸化作用得到增強。據認為增強末端唾液 酸化作用可延長免疫球蛋白半衰期。與大部分糖蛋白一 樣’天然情況下抗體通常作為糖型混合物產生。當抗體在 真核細胞尤其為哺乳動物細胞中產生時此混合物特別明 顯。業已開發出多種製造指定糖型之方法，參見Zhang等 人 ’ Science(2004) ’ 303，371 ; Sears等人，Science，（2001) 291 ’ 2344 ; Wacker 等人（2002) Science，298 1790 ; Davis 等人 ·· (2002) Chem. Rev. l〇2，579 ; Hang等人（2001) Acc· Chem. Res 34 ’ 727。因此本發明係關於複數個如本文所述之治療用 (通常為單株）抗體（其可屬於IgG同種型，例如IgG1)，其包 含指定數目（例如7個或更少、例如5個或更少，例如兩個 或一個）之該等抗體或其抗原結合片段之糖型。 本發明之治療劑可作為預防劑或在中風事件/臨床症狀 發作後或否則在需要時投予。治療之劑量及持續時間與本 發明之力子在人類循環系統中之相對持續時間有關，且可 由熟S此項技術者根據擬治療之病症及患者之一般健康狀 116953.doc -39- U/8940 況加以調整。預計欲達成最大療效會需要長時間内（例如 四至六個月）之重複投予（例如每週—次或每兩週一次）。 本發明之治㈣的衫模切為適合㈣ 宿主之任何適宜途徑。本發明之J又予，。 个知月之抗體及醫藥組合物尤其可 用於非經腸投予，即，古丁广。、 丨 皮下（s.c.)、鞘内 '腹膜腔内 (i.P.)’肌内（i.m·)、靜脈内（i.v)或鼻内（in)。 可將本發明之治療劑製備成含有存於醫藥上可接受之載 劑中作為活性成份之有效量之本發明抗體的醫藥組合物。 ·· 在本發明之預防劑中，較佳者為呈注射即用形式之含有唾 改造之抗體的水性懸浮液或溶液，較佳地將其緩衝至生理 PH。用於非經腸投予之組合物通常會包含本發明之抗體的 d或本發明之抗體溶於醫藥上可接受之載劑（較佳為水 性載劑)之混合劑。可採用多種水性載劑，例如，〇.9%鹽 水〇·3%甘胺酸、及諸如此類。此等溶液係無菌的且一般 而言不含顆粒物質。可藉由習用、熟知滅菌技術（例如， 過遽）對此等溶液進行滅菌。該等組合物可含有接近生理 條件所需之醫藥上可接受之辅助物質，例如pH調節劑及緩 衝劑等。本發明之抗體在此醫藥調配物中的濃度會大範圍 變化’即’自少於約〇 5重量％(通常為或至少為約^重量％) 自b重量％或20重量％，且可主要基於流體體積、黏度等 根據所選特&投予模式對其加以選擇。 因此’可製備含有1毫升無菌緩衝水及約1奈克至約10〇 (Ή如趵5 0不克至約3 〇毫克或更佳約5毫克至約Μ毫克） 之本發明抗體的用於肌内注射之本發明醫藥組合物。類似 116953.doc 1378940 地，用於靜脈輸注之本發明醫藥組合物含有約250毫升之 無菌林格氏溶液，及約1毫克至約30毫克且較佳為5毫克至 約25毫克之本發明經改造之抗體/毫升林格氏溶液。用於 製備可非經腸投予之組合物的實際方法為熟習此項技術者 所熟知或顯見並更詳細地闡述於（例如）Remington's Pharmaceutical Science > 第 15版，Mack Publishing公司，

Easton，Pennsylvania。有關可靜脈内投予之本發明抗體調

配物的製備參見 Lasmar U及 Parkins D" The Formulation of Biopharmaceutical products"，Pharma. Sci. Tech.today，第 129-137 頁，第 3 卷（2000年 4 月 3 曰），Wang，W "Instability， stabilisation and formulation of liquid protein pharmaceuticals" » Int. J.

Pharm 185(1999)129-188 > Stability of Protein Pharmaceuticals Part A

and B ed Ahern T.J.，Manning M.C.，New York，NY: Plenum Press(1992) > Akers, M.J. "Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations"，J_ Pharm Sci 91 (2002) 2283-2300，Imamura，K等人， "Effects of types of sugar on stabilization of protein in the dried state" » J Pharm Sci 92 (2003) 266-274 » Izutsu, Kkojima, S. "Excipient crystalinity and its protein-structure-stabilizing effect during freezedrying" > J Pharm. Pharmacol j 54 (2002) 1033-1039 > Johnson, R » "Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulation for protein lyophilization"，J. Pharm. Sci，91 (2002) 914-922 o

Ha » E Wang W > Wang Y.j. "Peroxide formation in polysorbate 80 and protein stability"，J. Pharm Sci， 91，2252-2264，（2002)，上述文獻之完整内容均 116953.doc -41 - 1378940 以引用方式併入本文中且項者可明確香閱。 較佳係本發明之治療劑在呈醫藥製劑形式時可以單位劑 量形式出現。熟習此項技術者可容易確定適宜治療有效劑 量。為有效治療人類中風及其他神經疾病，預計一範圍在 700毫克至3500毫克/70公斤體重之本發明之抗體内之劑量 可非經腸投予，較佳地s.c.、Lv.或im(肌内）投予。必要 時，可以適當時醫師選擇之適宜時間間隔重複此劑量。 本文所述抗體可經凍乾儲存並在使用前於適宜載劑中重 ^ 構。此技術已顯示對習用免疫球蛋白有效且可採用業内已 知的凍乾及重構技術。 在另一態樣中，本發明提供一種包含本發明之抗N〇G〇 抗體或其功能片段及一醫藥上可接受之載劑用於治療或預 防中風及其他神經疾病的醫藥組合物。 在又一態樣中，本發明提供一種包含本發明之抗N〇G〇 抗體或其功能片段及一醫藥上可接受之載劑用於在患有或 φφ處於形成中風或其他神經疾病之風險中的人類患者中抑制 神經變性及/或促進功能恢復的醫藥組合物。 本發明進一步提供一種在人類中治療或預防中風（尤其 為缺血性中風）及其他神經疾病/病症（特定而言為阿茲海默 氏症）的方法，該方法包括向需要其之該人類投予有效量 之本發明之抗NOGO抗體或其功能片段。除在人類患者中 治療確認疾病外（或作為替代方式），本發明之抗體亦可用 於減緩或停止阿茲海默氏症加劇及/或發作之治療方法。 本發明進一步提供本發明之抗N〇G〇抗體或其功能片段 H6953.doc -42- 1378940 j製備用於治療或預防中風及其他神經疾病/病症（特定而 言為阿兹海默氏症）之藥物中的用途。 本發明亦提供一種在患有或處於形成中風或其他神經疾 病/病症（特定而言為阿兹海默氏症）之風險的人類患者中抑 制神經變性及/或促進功能恢復的方法，該方法包括向需 要其之該人類投予有效量之本發明之抗N〇G〇抗體或 能片段。 此外，本發明提供本發明之抗NOGO抗體或其功能片段 在製備用於在遭受或處於形成中風及其他神經疾病/病： (特定而言為阿兹海默氏症)之風險中的人類患者中抑制神 經變性及/或促進功能恢復之藥物中的用途。 本發明進—步提供—種在人類巾治療或預"風或其他 神經疾病/病症（特定而言為阿兹海默氏症）的方法，該方法 包括非經腸投予治療有效量之本發明之抗刪〇抗體的步 驟。較佳地，靜脈内投予該抗NOGO抗體》 ·· 本文所用神經疾病或病症包括(但不限於)創傷性大腦損 傷、脊髓損傷、額顳葉癡呆(τ病變)、外周神經病、帕金森 氏病、亨庭頓氏病且特定而言為阿兹海默氏症、多發性硬 化或肌萎縮性侧索硬化（ALS)。 本發明亦提供—種促進㈣出芽的方法，該方法包括使 人類轴突與本發明之抗N〇G〇抗體接觸之步驟。該方法可 在活體外或活體内實施，較佳地該方法在活體内實施。 因此，在又—態樣中，提供-種在人類患者中治療中風 (為缺▲性中風）、腦損傷、脊髓損傷、額顳葉癡呆（τ 116953.doc • 43· 1378940 病變）、外周神經病、帕金森氏病、亨延頓氏病、多發性 硬化且特疋而S為阿茲海默氏症的方法，該方法包括靜脈 内投予治療有效量之本發明之抗NOGO抗體。 在本發明又一態樣中，提供一種促進類受試者（例如患 者）中樞神經系統内神經元軸突出芽之方法，該方法包括 才又予（例如靜脈内投予）治療有效量之本發明之抗N〇G〇抗 體。

在本發明又一態樣中，提供本發明之抗NOGO抗體（例如 包含本文所示CDR之抗N0G0抗體）在製造用於在人類患者 中治療中風（尤其為缺企性中風）、腦損傷、脊髓損傷、額 顳葉癡呆（τ病變）、外周神經病、帕金森氏病、亨延頓氏病 且特定而言為阿茲海默氏症、多發性硬化或肌萎縮性側索 硬化（ALS)之可靜脈内投予之藥物中的用途。 ·· 在本發明又一態樣中，提供一種在遭受（或易患）中風（尤 其為缺金性争風）、腦損傷、脊髓損傷、額顳葉癡呆（τ病 變）、外周神經病、帕金森氏病 '亨延頓氏病，多發性硬 化且特定而言為阿茲海默氏症人類患者中再生中樞神經系 >·先神.、ΐ元内軸犬的方法，該方法包括投予（例如靜脈内）治 療有效量之本發明之抗N〇g〇抗體的步驟。 在本發明又一態樣中，提供本發明之抗N〇G〇抗體在製 3*用於在遭文（或易患）中風（尤其為缺血性中風）、腦損 傷、脊髓損傷、額顳葉癡呆（τ病變）、外周神經病、帕金森 氏病、予延頓氏病、多發性硬化且特定而言為阿茲海默氏 症之人類患者中再生中樞神經系統神經元内轴突之可靜脈 H6953.doc •44· 内投予之醫藥組合物中的用途。 在本發明又一態樣中，提供一種調節促澱粉樣變肽產生 之方法，該方法包括使表現促澱粉樣變肽源自其中之前體 及NOGO多肽（例如人類N〇G〇_A)的細胞與本發明之抗 NOGO抗體接觸。在典型實施例中，該前體係App。在進 一步典型實施例中，該促澱粉樣變肽係Ap，最佳為 Αβ40、Αβ42或二者之組合。 一 本文所用，術語"功能恢復"係指受試者中（例如）局部缺 血事件或損傷或臨床症狀發作後之運動及/或感覺及/或行 為改善。人類中之功能恢復可藉由經設計用於量測基本神 經功能（例如運動強度、感覺及協調、認知功能，例如記 憶、語言及遵守指導之能力以及職能性能力，例如日常生 活之基本活動或工具性活動）之工具來評估。。基本神經 功能之恢復可用如ΝΙΗ中風評估表（NIH Str〇ke Scale， NIHSS)等工具量測，認知功能之恢復可用如波士頓命名測 ··試（Boston Naming Test)、連線測驗（Trail-making Tests)及 加利福尼亞言語學習測驗（California Verbal Learning Test) 等神經心理學測驗量測，且日常生活之活動可用如 ADCS/ADL(阿茲海默氏症臨床研究/日常生活之活動評估 表（Alzheimer’s Disease Clinical Studies/Activities of Daily Living Scale)或日常生活之Bristol活動評估表（Bristol Activities of Daily Living Scale)等工具量測，所有測驗及 评估表均為業内已知。 下列實例用於舉例說明本發明但並非限制本發明。 116953.doc -45- 1378940 it钒\ ·.人源化抗NOGO抗體之構建及表現.

藉由組裝包括用於選殖入Rid及Rln哺乳動物表現載體 (或用於在哺乳動物細胞中表現蛋白之任何其他適宜表現 載體）之限制酶切位點以及人類信號序列在内之重疊寡核 苷酸來從頭製備人源化VH及VL構造。將Hind III及Spe I限 制酶切位點引入含有用於選殖入含有人類γΐ突變恆定區之 Rid以防止ADCC及CDC活性的CAMPATH-1H信號序列之VH 結構域框内（L235A及G237A-EU索引編號系統）。將Hind III及BsiWI限制酶切位點引入含有用於選殖入含有人類κ恆 定區序列之Rln之CAMPATH-1H信號的VL結構域框内。 CAMPATH-1H信號序列：MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ.ID.NO:31) ❿· 產生編碼人類IgG重鏈胺基酸序列之質粒，其中該等 CDR闡述於表2中。自彼等現存之早期質粒產生使用 Quickchange套組（Stratagene)藉由引入單個點突變即 G95M(Kabat編號）來產生編碼人類IgG重鏈胺基酸序列之質 粒，其中該等CDR係彼等闡述於表3者。 下列表格揭示置於質粒載體中之全長重鏈蛋白序列及與 其配對之序列，在此意義上配對全長（FL)重鏈序列之胺基 酸序列中僅有之差異係可變區CDR H3内之G95M(kabat編 號）處的取代： 116953.doc •46· 1378940 表8 · 如表2中所定義之CDR G95M取代(以形成表3之CDRH3) HI FL(SE〇 ID NO. 35) 未進行 H6 FL(SE〇IDNO. 15) H26FL(SEQIDNO. 53) H16FL(SE〇 ID NO. 16) H27FL(SEQIDNO. 54) H20 FL(SE〇 ID NO. 42) H28FL(SEQIDNO. 55)

然後將編碼重鏈之質粒與下列全長輕鏈序列之一共轉染 入CHO細胞（有關細節參見實例2) : Lll FL(SEQ ID NO. 36)、L13 FL(SEQ ID NO. 17)或 L16 FL(SEQ ID NO. 18)。

同時產生稱作HcLc之嵌合體（其為2A10(SEQ ID NO. 9及 10之嵌合體-包含2A10鼠類VH(SEQIDNO. 7)及VL(SEQ 1〇]^0.8)及人類以〇恆定區之全長鏈））。 實例2 : CHO細胞中之抗體表現 將分別編碼重鏈及輕鏈之Rid及Rln質粒（或適用於哺乳 動物細胞之其他載體）瞬時共轉染入CHO細胞並小規模或 大規模表現以產生抗體。另一選擇為，藉由電穿孔將相同 質粒共轉染入DHFR-CHO細胞並使用含有核苷之培養基選 擇出表現適宜抗體之穩定多株細胞群體（Rid含有DHFR基 因’ Rln含有新黴素選擇標記）。在一些分析中，直接自組 織培養上清液評定抗體。在其他分析匯中，回收重組抗體 並藉由親和層析在蛋白質A瓊脂糖上對其進行純化。

實例3 ··人源化抗n〇GO抗髏可結合NOGO 將0.05微克/毫升至1微克/毫升存於PBS之GST-人類 NOGO-A56(參見實例 5)塗覆至 Nunc Immunosorp 盤上（1 〇〇 116953.doc • 47- 1378940

微升/孔），於4°C下過夜。用TBS + 0.05% Tween(TBST)將各 孔漂洗一次’隨後在室溫與存於TBST之2% BSA—起培育 1小時以封阻非特異性結合位點。將抗體在tbst+2% bsa 中稀釋至10微克/毫升並由此製備1/2稀釋液。將抗體加入 各孔一重複’並在室溫培育1小時。將各孔用TBST洗滌三 次隨後與抗人類κ過氧化物酶連結物（1j000)一起培育i小 時。將各孔用TBST洗滌三次且隨後與100微升〇PD過氧化 物酶底物（Sigma)/孔一起培育10分鐘。藉由加入25微升濃 Ηβ〇4終止顏色反應。使用盤讀數器量測49〇奈米處之光密 度。扣減自不含抗體之各孔讀取之背景數值。 圖1至圖4以在ELISΑ分析說明人源化抗體與嵌合體（稱作

HcLc’其為2A10之嵌合體（包含2A10鼠類VH(SEQ ID NO. 7)及VL(SEQ ID ]^0.8)及人類1§(}恆定區））之對（}81'-人類 NOGO-A56之劑量依賴性結合的比較（有關細節參見實例 5)。Y軸顯示量測之490奈米處光密度（〇D), 一各孔中捕獲 ·· 之抗體的定量量度。X軸顯示每一數據點處每孔所用抗體 之濃度（微克/毫升）。 圖1至圖4中所用抗體材料係由多株表現系統或大規模瞬 時轉染產生之純化抗體。在此等情形中，IgG水平藉由 ELISA及光密度定量。 來自圖1至圖4中所示實驗之結果表明納入G95M突變改 善了抗體性能。圖3及圖4中所示H27L丨6係僅有的例外情 況，其性能極差》我們認為此數據係因H27L16分析中之 不明技術問題所致，乃因H27L16在其他分析（圖i及圖2中 116953.doc -48 - 1378940 所示ELIS A及BIAco re分析（表9及10))中原本一直實施良 好。H27L16亦已在後續實驗中顯示性能極佳（參見圖11及 圖 12) 〇 實例4 :抗艎定量方案 用2微克/毫升存於碳酸氫鹽緩衝液（Sigma #C3041)之山 羊抗人類IgG鏈捕獲抗體（Sigma #13382)塗覆Nunc Immunosorp盤並在4°C下培育過夜。將各盤用含有0.05%

··

Tween20之TBS(TBST)洗滌兩次並用200微升含有2%(或1〇/〇 至3%)BSA之TBST(封阻緩衝液）在室溫下封阻1小時。將各 盤用TBST洗滌兩次。以2倍稀釋步驟將含有抗體之組織培 養上清液滴加至整個盤之封阻緩衝液中並在室溫培育1小 時。將各盤用TBST洗滌三次。將HRP偶聯抗體H23(山羊 抗人類κ鏈，Sigma #A7164)按1:2000在TBST中加以稀釋並 在每孔中加入100微升。將各盤在室溫下培育1小時。將各 盤用TBST洗滌三次並用1〇〇微升Fast-OPD底物（Sigma #P9187)顯色。顯色5分鐘至1〇分鐘，此段時間後用25微升 3 M H2S04終止ELISA。讀盤以讀取490奈米處吸光度並參 照標準曲線確定抗體濃度。

實例S : NOGO-A 片段(NOGO-A56，SEQ,ID.NO:32> 之產生 藉由將編碼人類NOGO-A之胺基酸586至785的cDNA選 殖入PGEX-6P1之BamHI-XhoI位點以形成加有GST標籤之 融合蛋白（稱作GST-人類-NOGO-A56)來構建編碼一包含人 類NOGO-A之胺基酸586至785及一 GST標籤 (SEQ.I.〇.NO:32)之多肽的 cDNA序列。在用 0.5 mM IPTG 116953.doc •49- 1378940 在37°C下誘導3小時後’在存於含有ι〇〇微克/毫升氨苄青 黴素之2χΤΥ培養基的BL21細胞中表現質粒。藉由超聲處 理溶解細胞顆粒並根據製造商說明書使用谷胱甘肽-瓊脂 糖（Amersham Pharmacia)純化融合蛋白。使用還原谷胱甘 肽溶洗純化蛋白並對PBS大量透析，且使用bsΑ標準品及 基於蛋白分析之BioRad考馬斯定量且隨後等份儲存於_80 °C。

實例6 :人源化抗NOGO單株抗體之Biac〇re分析 使用Biacore3000生物感測器或BIAcore T100分析抗 NOGO單株抗體（mAb)對重組表現之GST-人類NOGO-A之結 合動力學。如下製備hNOGO-A晶片： 方法 藉由一級胺偶聯使用經設計用於乾定固定化水平之

Biacore Wizard程式將GST-人類NOGO-A56固定至CM5晶片 上。藉由使50 mM N-羥基-琥珀酸亞胺（NHS)與200 mM N-乙基-Ν'-二甲基胺基丙基碳化物（EDC)之溶液流過來活化 CM5感測器表面。然後，使存於乙酸鈉緩衝液（ρη5.0或pH 4.5)之GST-人類NOGO-A56流過晶片並固定。固定完成 後，藉由注射1 Μ乙醇胺氫氯酸鹽（pH 8.5)來封阻任何活化 之醋。

將抗 NOGOmAb 在 HBS-EP(10 mM HEPES，pH 7.4，150 mMNaC卜3mMEDTA及 0,005%P-20表面活性劑）中加以 稀釋以用於81八〇〇代3000或在丁100之情形中稀釋於1^8-EP + (10 mM HEPES，pH 7.4，150 mM NaC卜 3 mM EDTA 116953.doc -50· 1378940 及0.05% P-20表面活性劑）中，並在指定抗體濃度範圍下實 施結合研究。所有作業均以空白感測器表面（已如先前所 述受到活化及封阻但未加入配體之表面）作為參照。使用 用於BIAcore 3000之BIA評估動力學分析軟體版本4.1及 T100動力學分析軟體版本1.0實施結合之分析。本發明之 其他抗體之Biacore分析基本上遵循與本文所述者相同之方 案。除非另有說明，否則BIAcore實驗在25°C下實施。

在下列結果部分中，每一數據表代表自單獨實驗獲得之 結果。 結果-表9 抗體 ka (1/Ms) kd (1/s) KD(pM) HcLc 3.19E6 2.49E-3 779 H27L13 6.2E6 1.8E-3 291 H26L13 3.23E6 3.11E-3 963 H28L13 7.26E6 3.3E-3 454 H27L16 6.24E6 1.21E-3 194 H28L16 7.25E6 2.14E-3 296 結果-表10 抗體 ka (1/Ms) kd (1/s) KD(nM) HcLc (25〇C) 2.66E6 3.13E-3 1.18 HcLc (37〇C) 5.08E6 7.74E-3 1.46 H16L16(25〇C) 3.43E6 3.72E-3 1.08 H16L16(37〇C) 5.31E6 6.16E-3 1.16 H20L16(25〇C) 4.69E6 5.42E-3 1.16 H20L16 (37〇C) 7.17E6 1.08E-3 1.51 H27L16(25〇C) 3.94E6 1.50E-3 0.380 H27L16(37〇C) 7.18E6 3.06E-3 0.426 H27L13 (25〇C) 3.50E6 2.13E-3 0.606 H27L13 (37〇C) 6.58E6 4.22E-3 0.641 116953.doc -51 - 1378940 H28L16(25〇C) 4.33E6 2.64E-3 0.610 H28L16(37〇C) 7.73E6 5.24E-3 0.678 H28L13 (25°C) 4.16E6 3.89E-3 0.936 H28L13 (37°〇 7.43E6 7.59E-3 1.02 結果-表11 抗體 ka (1/Ms) Kd (1/s) KD(nM) HcLc 3.17E6 2.33E-3 0.74 H26L13 3.45E6 2.88E-3 0.87 H27L13 6.58E6 1.83E-3 0.28 H28L13 6.97E6 3.17E-3 0.45 H28L16 6.89E6 1.95E-3 0.28

實例7 :利用解離速率分級進行之人源化抗NOGO單株抗體 BiaCore 分析 如對動力學分析所述製備GST-人類NOGO-A56晶片。直 接由CHO-K1細胞之瞬時轉染獲得細胞上清液。使此等上 清液直接流過感測器表面並量測相互作用。模擬轉染細胞 上清液用於雙重參照以排除因組織培養基所引起的任何假 相。所有作業均以空白感測器表面（已如先前所述受到活 化及封阻但未加入配體之表面）作為參照。使用BIA評估動 力學分析軟體版本4.1實施結合之分析。 實例8 :肽囷譜分析 得到覆蓋GST-人類NOGO-A56結構域（SEQ ID NO. 32)之 NOGO-A56部分的47個重疊肽（來自Mimotope™)。該等肽 長度為16個胺基酸，其中12個胺基酸與鄰接肽（每一肽進 一步在N末端包含一生物素-SGSG序列）重疊，但在C末端 具有一 GSG-生物胞素標籤之第一個肽除外。該等肽用於 116953.doc -52- 1378940 2A10及H28L16之結合位點的抗原決定部位作圖。 用於抗原決定部位作圖之方法： 將5微克/毫升存於無菌水之抗生蛋白鏈菌素塗覆至Nunc immunosorp盤（100微升/孔）上，在37°C下過夜。將各盤用 含有0.05% Tween之PBS(PBST)漂洗3次然後用3%存於

PBST之BSA在代下過夜封阻。將各盤用PBST洗滌3次。 然後將肽加入各孔中，濃度為約1〇微克/毫升（稀釋於3%存 於PBST之BSA)並在室溫培育1小時。將各盤用PBST洗滌3 次隨後與在3%存於PBST之BSA中稀釋成5微克/毫升的抗 NOGO抗體一起培育1小時。將各盤用PBST洗滌3次隨後與 抗人類或抗小鼠κ過氧化物酶連結物（1:1000，於3%存於 PBST之BSA中稀釋）一起培育1小時。將各盤用PBST洗滌3 次且隨後與1 00微升OPD過氧化物酶底物（Sigma)/孔一起培 育10分鐘。藉由加入50微升3莫耳H2S〇4終止顏色反應。使 用讀盤器在490奈米處量測吸光度。 ·· 結果示於圖5(使用H28L16進行之抗原決定部位作圖）、 圖6(使用2A10進行之抗原決定部位作圖）中。圖5及圖6分 別顯示2A10與H28L16之抗原決定部位作圖結果。所示數 據表明2A10及H28L16可結合肽6及7，該等肽之NOGO特異 性部分分別在SEQIDN0.73與SEQIDN0.74中給出，二者 均含有序列VLPDIVMEAPLN。 此等結果表明， VLPDIVMEAPLN(SEQ ID 肌60)包含2八10與11281^16之結 合抗原決定部位。 實例9 : HcLc與含有CDR HS之G95M突變之HcLc的比較 116953.doc •53· 1378940 由現有表現質粒使用Quikchange套組（Stratagene)藉由引 入單個點突變即G95M(Kabat編號）構建經修飾之HcLc變 體。可變重鏈結構域Hc(G95M)蛋白之蛋白序列在SEQ ID 59中給出。

如先前所述在CHO細胞中表現Hc(G95M)Lc。如實例4中 所述定量抗體。圖7及圖8顯示將0.05微克/毫升（圖7)及1微 克/毫升（圖8)之NOGO塗覆至Nunc immunosorp盤上，使用 結合人類NOGO-A ELISA比較之Hc(G95M)Lc及HcLc之結 合活性的比較。下表顯示Hc(G95M)Lc及HcLc之結合親和 性的比較。 表12:基於一個實驗之藉由B iacore分級量測之解離速率 杭體 重鏈可變區之序列ID 解離速率kd(l/s) H6L13 11 1.38E-2 H6(G95M)L13 47 4.31E-3 HcLc 7 2.66E-3 Hc(G95M)Lc 59 6.14E-4 數據表明，CDR H3内之G95M取代不僅可增加人源化抗 體（H6L13)之結合活性，而且亦可增加鼠類供體抗體 2A10(HcLc)之結合活性。 實例10 :在CDRH3内含有取代之NOGO抗體的構建及測試 藉由CDR H3或前方白胺酸中所含殘基内之單個點突變 構建一組90個重鏈可變區。具體而言，使編碼重鏈（基於 H6FL，SEQ ID NO. 15)之載體編碼重鏈可變區，其中用所 有其他天然存在之胺基酸（半胱胺酸除外）取代CDR H3或前 方白胺酸内每一胺基酸殘基（使用Quikchange套組 116953.doc •54- 1378940 (Stratagene))，並與輕鏈（L13FL，SEQ ID NO. 17)—同表 現以得到90個不同抗體。在ELIS A及Biacore實驗中分析此 等抗體對NOGO之結合。 圖9及圖10顯示H6FL變體與H6FL L13FL之結合活性的比 較。表14及表15顯示由Biacore量測之解離速率動力學的比 較-僅顯示彼等在Biacore分析中具有可量測之解離速率 且在ELISA中具有可比擬於H6L13之結合活性之抗體的結 果。

表14 母抗體 VHCDR3 kd(l/s) H6L13 MQGY 4.85E-03 HcLc GQGY 5.58E-03 H6L13 GQNY 9.66E-03 H6L13 GQLY 1.32E-02 H6L13 IQGY 1.72E-02 H6L13 RQGY 1.75E-02 H6L13 G〇SY 1.86E-02 H6L13 GQGY 1.98E-02 H6L13 GSGY 2.07E-02 H6L13 GDGY 2.12E-02 H6L13 GQGW 2.16E-02 H6L13 GIGY 2.57E-02 H6L13 GQYY 3.28E-02 H6L13 GQFY 3.35E-02 H6L13 WQGY 1.98E-02 H6L13 GAGY 3.15E-02 H6L13 GLGY 1.90E-02 H6L13 GVGY 1.78E-02 H6L13 GQWY 1.77E-02 結論 結果表明保留鼠類2A10及含有GQGY之抗體H6L13之結 合特性的抗體係彼等含有下列CDR H3之抗體' RQGY、 116953.doc -55- 1378940 IQGY、MQGY、GDGY、GIGY、GSGY、GQNY、 GQYY、GQSY、GQLY、GQFY、GQGW、WQGY、 GAGY、GLGY、GVGY、GQWY。 實例11 :含有GQGY之mab(H20L16)與 G95M變髖mab(H27L16 及H28L13及H28L16)的比較 如上所述製造表I5中所列示之抗體。 表15 -給出完整抗體（2x重鏈+ 2x輕鏈）之回復突變總數 的人源化2A10抗Nogo-A抗體。 Μέ-'Β·"：- 每姻克整抗體y两聚韙中回度突變之滅也:〆:"ό:::二丨 H20L16 22 H28L16 22 H28L13 16 H27L16 32 活體外結合特徵

在將抗體分級之嘗試中，在一定範圍之分析（包括 ELISA、反向形式ELISA、競爭式ELISA、Biacore及流式 ·· 細胞術）中研究抗體之結合特性。 11.1 ELISA中對重組人類NOGO-A之結合 藉由各種相關ELISA分析（以與實例3中所述者相關但稍 有不同之方案實施）研究抗體結合重組人類Nogo-A(GST-人 類Nogo-A 56)之能力。在第一個分析中，直接將重組 Nogo-A以不同抗原濃度塗覆至盤上。以置入1微克/毫升或 〇_〇5微克/毫升抗原之直接結合ELISA的結果分別示於圖 11A及圖11B中。數據確認，在與母抗體（HcLc)之嵌合形式 116953.doc •56- 1378940 比較時所有抗體均顯示出可比擬之對重組人類Nogo-A的結 合活性。在較高抗原塗覆濃度下，所有抗體均產生類似 EC5 0值。相比之下，在較低抗原塗覆濃度下，該分析能夠 區分各個抗體。儘管未得到飽和曲線，但各條線上之趨勢 分析揭示下列等級次序：H27L16>H28L16、H28L13、 H20L16 。

在一平行實驗中，分析形式係相反的。在該形式中，其 係將抗體捕獲至盤上並使用GST標籤檢測重組人類Nogo-A(GST-人類Nogo-A-56)之結合。反向形式ELISA之結果示 於圖12中。數據證實，在與嵌合形式之母抗體（HcLc)相比 較時所有抗體均顯示出對重組人類Nogo-A的相當結合活 性。此形式之結合ELISA未能區分各抗體。

11.2 競爭式ELISA ·· 使用競爭式ELISA評定抗體與母抗體直接競爭人類 Nogo-A上相同抗原決定部位之能力。將重組人類Nogo-A(GST-人類Nogo-A 56)塗覆至各盤上。母抗體2A10及人源 化抗體在加至各盤上之前預先混合。使用抗小鼠IgG-HRP 連結物（Dakocytomation，#P0260)定量 2A10之結合。圖 13 中所示結果證實，所有四個抗體均可與2A10競爭。此表明， 人源化抗體及母抗體可識別人類Nogo-A上之重疊抗原決定部 位。此外，人源化抗體之活性係相當或優於嵌合體HcLc。結 果表明，H27L16、H28L16及H28L13較H20L16更有效。 11.3 Biacore親和性量測 使用Biacore，藉助兩種不同方法而測定親和性並排序抗 116953.doc -57- 1378940 體。在第一個方法中，將重組Nogo-A偶聯至晶片表面並使 抗Nogo-A抗體流過該表面。在第二個方法中，使用蛋白a 將抗體捕獲至晶片表面上，其中使重組GST-人類Nogo-A56流過該表面。表16中所示結果係藉由將抗原偶聯至該 表面上獲得’且其證實，所有四個抗體均顯示出相當/優 於母抗體（HcLc)之親和性。基於六次獨立作業之平均值， 根據整體親和性，該等抗體係以下列次序排序：

H27L16>H28L16>H28L13>H20L16，與直接結合 ElisA 之 等級次序一致（圖11B)。在H27L16及H28L16之情形中，人 源化抗體展示出較母抗體（HcLc)高2倍至3倍之親和性。 表16 -使用Biacore T100所測定之抗Nogo-A人源化抗體 對重組人類Nogo-A(GST-人類Nogo-A 56)之結合動力學。藉 由一級胺偶聯使抗原結合至CM5晶片上。使抗體流經各種 濃度（0.125 nM至8 nM)。數值顯示以二重複實施之六次獨 立作業之平均值及標準偏基（括號內）。獨立分析每一完整 φφ 數據集，然後計算平均值及標準偏差。**對於H2QL16僅有 11組分析數據，因其中有1組無法分析。 抗體」::: ·. · • . · -Ka 、 ' ： . < r kd KD(nM) H20L16** 5.37Ε6 (7.65Ε5) 9.70E-3 (2.65E-3) 1.80 (0.31) H27L16 3.96Ε6 (9.93Ε5) 2.30E-3 (1.11E-3) 0.56 (0.15) H28L13 8.13Ε6(1.35Ε6) 9.10E-3 (2.65E-3) 1.11 (0.18) H28L16 6.97Ε6 (6.62Ε5) 4.43E-3 (1.18E-3) 0.64 (0.15) HcLc 3.80Ε6 (7.11Ε5) 7.09E-3 (2.22E-3) 1.86(0.32) 以類似於ELISA之方式，亦以反向形式評定抗體結合重 116953.doc • 58 - 1378940 組人類Nogo-A(GST-人類Nogo-A 56)之動力學（參見實例 11.1)。在此分析中，藉由蛋白質A將人源化抗體捕獲至 CM5晶片上。六次獨立作業之平均結果示於表17中。與反 向形式ELISA —致’所有人源化Nogo-A抗體在反向形式 Biacore中均顯示出類似於嵌合體（HcLc)之結合動力學。

表-使用Biacore T100所測定之抗Nogo-A人源化抗體 對重組人類Nogo-A(GST Nogo-A 5 + 6)之反向形式結合動力 學。藉由一級胺將蛋白質A固定至約4000 RU並用於捕獲 200 RU至300 RU之樣品抗體。使重組人類Nogo-Α以各種濃 度（0.125 nM至8 nM)流過。數值表示以二重複形式實施之 三次獨立作業的平均值及標準偏差（括號内）。獨立分析每 一數據集，然後計算平均值及標準偏差。 \抗體v Kd kd ： KD (nM) H20L16 1.01E6(1.35E5) 3.13E-4(2.79E-5) 0.31(0.036) H27L16 9.93E5(2.02E4) 3.04E-4(1.83E-5) 0.31(0.019) H28L13 1.12E6(1.21E5) 3.84E-4(3.24E-5) 0.34(0.015) H28L16 1.18E6(8.32E4) 4.01E-4(2.48E-5) 0.34(0.032) HcLc 1.38E6(3.70E5) 5.69E-4(1.54E-4) 0.41(0.062)

11.4 結合天然人類NOGO 為證明人源化抗體能夠以可比擬於母抗體之特性結合天 然人類Nogo-A，開展了兩個基於流式細胞術之分析。在第 一個分析中，形成在細胞表面上表現人類Nogo-A胞外結構 域之基於CHO-K1之細胞系。藉由流式細胞術使用PE標記 之抗人類IgG(Sigma，#P8047)評定人源化抗Nogo-A抗體之 結合》下文圖14顯示CHO-Nogo-A細胞系上抗Nog〇-A抗體 116953.doc -59- 1378940 之典型特性。儘管該分析靈敏度不足以區分抗體，但結果 證實’所有四個抗體均可以比擬於嵌合體之水平識別細胞 表面表現之人類Nogo-A。沒有抗體能夠識別親本細胞系 (CHO-K1-數據未顯示）。

在第二個分析中’使用人類成神經細胞瘤細胞系_IMR32 評定人源化抗體結合天然Nogo-A之能力。此細胞系特徵為 胞内Nogo-A蛋白水平高/細胞表面Nogo-A蛋白水平低。在 一增加結合信號之嘗試中，安排該分析以檢測胞内Nogo_ A(ER-滯留）》滲透並固定IMR32細胞，然後用抗N〇g〇_A人 源化抗體染色。使用抗人類IgG_PE標記之二級抗體 (Sigma，#P8047)檢測抗體對Nogo-A之結合。下文圖15中 ·· 所示結果證實，所有抗體均以可比擬於或高於母抗體HcLc 之水平結合胞内Nogo-A。此等數據連同來自CH〇_N〇g〇_A 細胞系之結果證實，人源化抗體可以可比擬於或優於嵌合 體HcLc之水平識別更多天然形式之N〇g〇_A蛋白。該等分 析之靈敏度不足以對該抗體組加以分級。 11.5神經突生長分析 在基於如先前所述定量N0之分析中測試人源化抗N〇g〇_ A抗體中和Nogo_A之神經突生長（N〇)抑制性活性的能力。 基於其對Nogo.A之結合動力學選擇該分析中所測試之抗 體。就N〇g0-A中和作用測試高親和性人源化抗體即 H28L16、„2几16、H2〇L16及其用作參照之母抗體 2A10(小a單株）及HcLc(人則、鼠嵌合體）。㈣行比較， 在該分析中亦測試抗體11C7(參見實例13)。 116953.doc -60- 1378940

為測S式所選人源化抗體之中和活性，各孔塗覆上人類重 組GST-人類N〇g〇_A56並用各種濃度抗體在37〇c 丁處理B 時’之後加入小腦顆粒神經元（CGN)。對照孔用HBSS處 理。量測每扎中每一神經突之平均神經突長度。圖16顯示 該分析中所測試在之人源化抗體的結果。使用一組對照抗 體（對照IgG，純化之小鼠igG ; Campath及另一無關的人源 化抗體）來確認活性之特異性。作為進一步對照，將相同 人源化抗體逐步滴加至塗有GST之各盤上。結果證實， ·· H2 8LI 6、H27L16及H20L16將Nogo-A調介之神經突生長的 抑制逆轉至類似於母抗體（2A10及HcLc)之程度。該等作用 似乎係強勁且穩定穩定的且在用H28L16進行之丨丨個神經突 生長實驗中的8個中觀察到該等作用。相比之下，人源化 抗體並未增加塗有GST各盤上之神經突生長且對照抗體組 未顯示出抑制的任何劑量依賴性逆轉，從而證實人源化抗 體之作用對Nogo-A調介之抑制具特異性。對於神經突生長 所呈現之數據係選自多個重複實驗。儘管未顯示之許多重 複在天然狀態下似乎有所變化，但認為所示數據可反映本 發明之抗體在神經突生長分析中降低N〇G〇之抑制性作用 的真實活性。

繁例12 ·，H28L16之進一步表徵 12,1結合全長重組Nog〇-A 藉由直接结合ELISA分析研究抗體結合全長胞外結構域 重組人類N〇g〇-A(GST-人類N〇g〇_A_ECD)之能力。在此情 形中，ECD係一煎接變體，其近似位於人類Ν〇〇〇 a之 116953.doc •61 1378940 位至1004位之區域内（起始部分為DETFAL(SEQ ID NO.95) 且終止部分為 ELSKTS(SEQ ID ΝΟ·96)。 將重組GST-人類Nogo-A-ECD以1微克/毫升直接塗覆至 盤上。圖17中所示數據證實，H28L16可以可比擬於或優 於親本（HcLc)或H20L16之水平識別GST-人類Nogo-A-ECD 。 12.2 Fc功能性之抑制

·· 未改善候選物之安全特性，使重鏈恆定區之CH2結構域 内的殘基L235及G237(EU索引系統）突變成丙胺酸殘基， 從而降低引發抗體調介之免疫效應功能的可能性。人類 C 1 q結合之降低係用作Fc功能性之抑制的替代指標。下文 圖18顯示，與Campath-IgGl(野生型）相比H28L16已顯著降 低了 Clq結合活性，且可比擬於帶有相同突變（Fc突變之抗 體（Fc-))之 Campath IgGl構造及Campath IgG4。此等數據 表明，H28L16中所存在之CH2-結構域突變會顯著降低引 發Fc調介之效應功能的可能性。 12.3直向同源物結合 為證實H28L16可表現出對Nogo-A之各種直向同源物之 結合活性（可比擬於母抗體（HcLc)之結合活性），實施一系 列結合分析。下文19A至D顯示分別來自大鼠（SEQ ID N0.94)、食蟹猴（SEQ ID NO. 92)、狨（SEQ ID NO. 93)及 松鼠猴（SEQ ID NO. 91)之重組 NOGO(GST-人類 Nogo-A 56) 之直接結合ELISA的結果。在所有情形中，H28L1 6均顯示 出可比擬於或優於嵌合抗體（HcLc)之活性。經計算之EC50 116953.doc •62- 1378940 值極其類似於對結合人類重組N〇g〇_A所計算2Ec5〇值。 使用Biacore測定與HcLcA UC7相比較的扣乩16對 Nogo-A之各種直向同源物之結合的動力學。下文表18及表 19顯示兩種不同分析形式中的結合動力學。在重組N〇g〇A 直接偶聯至CM5晶片上之情形中（表18)，大鼠、食蟹猴、 松鼠猴及狨之結合動力學極其類似於對人類之結合（範圍 =0.33 nM至0·67 nM)。在該分析之形式逆轉且利用蛋白質 籲 A將抗體捕獲至晶片（表19)時，H28L16對大鼠N〇g〇 A之結 合親和性大約較人類Nogo-A低4倍。對於食蟹猴Nogo_ A(親和性較人類低8.5倍）及其他靈長類直向同源物（親和性 較人類低12倍至17倍）觀察到類似趨勢。在兩種分析取向 中’嵌合抗體HcLc對Nogo-A直向同源物均顯示出類似結 合特性。由於尚不清楚哪種分析形式可最佳代表活體内情 況’故可由此研究得出之初步結論係丨）H28L16已保留了 與欣合抗體HcLc有關之直向同源物交又反應特性及2) φφ HcLc^+大鼠及食蟹猴Nogo-A之親和性係對人類Nog〇_A2 親和性的4倍至8.5倍且在某些情形中會及其類似。 表18 -使用T100所測定之H28L16、11C7及HcLc對人類 Nogo-A之重組直向同源物的結合動力學。藉由一級胺偶聯 將約140RU至180RU之各種Nogo-A直向同源物捕獲至（：]^5 晶片上。使抗體流經各種濃度（〇. i 2 5 nM至8 nM)。數值顯 示以二重複實施之1至2次獨立作業之平均值及標準偏差（括 號内）’其中獨立分析每一數據集，然後計算平均值及標準 偏差。*因抗體11C7之曲線無法解釋故放棄一組曲線。 116953.doc -63- 1378940 H28L16 11C7 HcLc 直向同源物 Ka Kd KD (nM) Ka Kd KD (nM) Ka Kd KD (nM) 食蟹猴 (2次作業)* 4.65Ε6 (7.47Ε5) 3.07E-3 (2.37E-4) 0.67 (0.06) 1.47E6 (1.67E5) 3.40E-4 (4.45E-5) 0.23 (0.01) 2.94E6 (7.13E5) 4.78E-3 (6.34E-4) 1.68 (0.35) 大鼠 (2次作業） 4.64Ε6 (2.34Ε5) 1.54E-3 (3.06E-5) 0.33 (0.01) 8.36E5 (5.58E5) 1.20E-4 (2.14E-5) 0.11 (0.03) 2.53E6 (5.32E4) 2.83E-3 (2.30E-5) 1.12 (0.03) 狨 (1次作業） 4.2Ε6 (2.47Ε4) 3.02E-3 (5.09E-5) 0.626 (0.000) 1.16E6 (5.37E4) 2.80E-4 (6.15E-6) 0.24 (0.006) 3.13E6 (2.76E4) 4.44E-3 (1.41E-4) 1.419 (0.03) 松鼠猴 (1次作業） 4.46Ε6 (6.08Ε4) 2.73E-3 (4.95E-6) 0.61 (0.000) 1.10E6 (3.25E4) 2.86E-4 (1.87E-5) 0.26 (0.010) 3.04E6 (1.64E5) 4.68E-3 (2.11E-4) 1.54 (0-15) 人類 6.97Ε6 (6.62Ε5) 4.43E-3 (1.18E-3) 0.64 (0.15) 1.58E6 (6.42E5) 2.64E-4 (5.57E-5) 0.19 (7.96E-2) 3.80E6 (7.11E5) 7.09E-3 (2.22E-3) 1.86 (0.32) 表19 -在T100上所測定之H28L16、11C7及HcLc對人類 Nogo-A之重組直向同源物之反向形式結合動力學。將約 4000 RU蛋白質A固定在表面上且捕獲約300 RU至400 RU 之抗Nogo-A抗體。使各種濃度（0.125 nM至64 nM)之重組 蛋白（GST-NOGO-A56)流過，濃度取決於構造。所有作業 均一式兩份進行。數值顯示1至3次獨立作業之平均值及標 準偏差（括號内），其中每一作業按一式兩份實施且獨立分 子每一數據集，然後計算平均值及標準偏差。 H28L16 11C7 HcLc 直向同源物 Ka Kd KD (nM) Ka Kd KD(nM) Ka Kd KD (nM) 食蟹猴 (3次作業)* 3.26E5 (4.06E3) 1.11E-3 (2.23E-5) 3.41 (0.05) 4.02E5 (6.85E4) 2.97E-4 (1.11E-5) 0.76 (0.12) 3.03E5 (4.58E3) 1.41E-3 (2.84E-5) 4.66 (0.08) 大鼠 (3次作業） 3.80E5 (5.68E3) 6.69E-4 (1.24E-5) 1.76 (0.03) 2.83E5 (4.66E4) 1.77E-4 (1.34E-5) 0.64 (0.09) 5.47E5 (1.20E4) 1.10E-3 (2.86E-5) 2.01 (0.07) 拭 (1次作業） 2.22E5 (3.61E3) 1.09E-3 (7.35E-5) 4.89 (0.25) 1.91E5 (2.90E3) 2.54E-4 (3.46E-6) 1.33 (0.00) 3.02E5 (9.90E2) 1.36E-3 (7.92E-5) 4.51 (0.28) 松鼠猴 (1次作業） 1.57E5 (2.69E3) 1.08E-3 (5.02E-5) 6.86 (0.20) 1.03E5 (2.12E3) 2.78E-4 (3.61E-6) 2.69 (0.02) 1.74E5 (2.19E3) 1.29E-3 (7.64E-5) 7.45 (0.34) 人類 (1次作業） 1.20E6 (8.49E4) 4.75E-4 (9.97E-6) 0.40 (0.02) 2.64E5 (3.32E3) 1.49E-4 (1.61E-5) 0.57 (0.07) 1.32E6 (2.71E5) 7.00E-4 (3.18E-5) 0.54 (0.09) 12.4物理特性 藉由 SEC-HPLC及 SDS-PAGE評定 H2 8L16 及 H20L16 之物 •64· 116953.doc 1378940 理化學特性。以1.0毫升/分鐘使用100 mM磷酸鈉、400 mM氯化鈉pH 6.8及TSK G3000 SWxl 30公分x7.8毫米不銹 鋼管柱實施SEC-HPLC，其中在214奈米及280奈米處檢 測。在4%至20% Novex Tris-HCL凝膠上實施SDS-PAGE， 其中上樣10微克產物並用Sypro Ruby染色。在Beckman MDQ上使用pH 3.5至10之安福靈（ampholine)實施C-IEF。 得到下列結果：

表20 -抗Nogo-A抗體之尺寸排除層析（SEC)HPLC分 析。所示數值係每一分配給三個不同物質中每一個之抗體 的百分比。 .k镇. .聚集％:: :單體％ . V V 片段％ . H28L16 0.50 99.50 0.00 H20L16 14.21 85.75 0.05 表21 -抗Nogo-A抗體之SDS-PAGE分析。所示數值係主 帶中所見抗體之百分比。 ·· 抗翘/ : . 非還原 還原. : '厂 H28L16 82.4% HC:67.2% LC:27.7% H+L: 94.9% H20L16 84.6% HC: 69.3% LC: 26.4% H+L: 95.7% SEC-HPLC數據表明H20L16較H28L16(H2 8L16)更易於聚 集。若此處所報告數據係大規模重複，則此會影響產生具 有臨床應用可接受品質之材料之製造過程的能力（>95%單 體）。SDS-PAGE數據顯示兩種候選物均可接受，二者均表 116953.doc -65- 1378940 現出典型特性。 實例: H28LI6與IIC7之比較 稱作11C7之鼠類抗Nogo-A抗體闡述於WO 2004052932 中，其係針對肽抗原決定部位產生。基於WO 2004052932

中提供之序列資訊產生嵌合11C7。為比較2A10與11C7之 結合抗原決定部位，建立一競爭式ELISA以研究11C7及 2A10是否可識別Nogo-A上之重疊抗原決定部位。如下文 圖20中所示，HcLc(2A10之嵌合形式）能夠與2A10競爭結 合人類重組Nogo-A，而11C7未顯示出與2A10競爭，即使 在面至100微克/毫升之濃度下，亦如此。

章钒·.證明肽與人類NOGO-5+6直接競爭結合NOGO H28L16之能力的競爭式ELISA 競爭式ELISA之方法 使用競爭式ELISA評定肽與NOGO-A(GST-人類Nogo-A56)直接競爭結合NOGO H28L16之能力。將5克/毫升存於 φφ 碳酸氫鹽緩衝液之兔抗人類IgG(Sigma，#1-9764)塗覆至 Nunc immunosorp盤上（100微升/孔），4°C下過夜。將各盤 用含有0.05% Tween(TBST)之TBS漂洗3次，然後用1%存於 TBST之BSA在室溫下封阻1小時。然後將H28L16捕獲至盤 上（1微克/毫升，在1%存於TBST之BSA中稀釋，50微升/ 孔）’室溫下1小時。將各盤用TBST洗滌3次。預先混合肽 (〇克/毫升至100克/毫升）及GST-人類NOGO-A56(濃度為1微 克/毫升，在1%存於TBST之BSA中稀釋），然後將其加至各 孔中並在室溫培育1小時》將各盤用TBST洗滌3次，隨後 116953.doc -66- 1378940 與兔抗GST過氧化物酶連結物（Sigma，#A7340，1:2000， 在1%存於TBST之BSA中稀釋）一起培育1小時。將各盤用 TBST洗滌3次且隨後與50 1 OPD過氧化物酶底物（Sigma)/ 孔一起培育10分鐘。藉由加入25 1濃H2S04終止顏色反應。 使用讀盤器在490奈米處量測吸光度。

圖21中所示結果證實在抗原決定部位作圖ELIS A(實例8) 中呈陽性之肽6及7可與GST-人類NOGO-A56競爭結合 H2 8L16。此表明在抗原決定部位作圖研究中呈陽性之肽 含有用於H28L1 6結合之抗原決定部位。不含有所提議之 抗原決定部位的肽16及17(含有NOGO肽，但不與肽6或7重 疊）未與NOGO-5 + 6競爭。 章例15 ·.基於NOGO抗體變體G101S/Q37R之人源化抗 NOGO單株抗體的ELISA分析 藉由如上所述在CDR H3中引入單取代即G101S(Kabat編 ··

號）來形成 G101S(亦稱作 H100(SEQ ID N0.63))，其係一 H6 重鏈可變區之經修飾之變體（SEQ ID NO.ll)。類似地，藉 由在構架區中引入單取代（Kabat編號Q37R)(以形成L100) 來形成Q37R，其係一L13輕鏈可變區之經修飾之變體（SEQ ID NO. 13)。可變輕鏈結構域Q37R之蛋白序列在SEQ ID NO. 67中給出。 如先前所述在CHO細胞中表現編碼含有G101S/Q37R取 代之重鏈及輕鏈之全長形式的基因並在如先前所述之直接 結合ELISA中加以分析。 以0.05微克/毫升上樣抗原時的直接結合ELISA之結果示 116953.doc -67- 1378940 於圖22中。數據證實，抗體H100L100在與H27Ll6比^時 顯示出可比擬於重組GST-人類NOGO-A56之結合 σ 性’且 出00!^100在與1161>13比較時具有一改良之結合牲从 Q付性。相應 EC50值示於中下表中： 表H G101S/Q37R變體與H6L13及H27L16相比較之£(：5〇 量測值 抗體 CC50^~~ H6L13 〇·〇86 H27L16 0059-- H100/TJ00 O04R ------ f例16··基於CDR H3隻後G101S之人源化抗NOGO單株抗後的 BiaCore 分析 藉由在CDR H3中引入單取代即G101S(Kabat編號）來形 成Η1 〇〇，其係一 H6重鍵可變區之經修飾之變體（SEQ ID NO.ll)。可變重鏈結構域！^100蛋白之蛋白序列示於8£(^ ID NO.63中。類似地，藉由在構架區内引入單取代（Kabat ## 編號分別為Q37R及Q45R)來形成L100及L101(L13輕鏈可變 區之經修飾之變體（SEQ ID NO. 13)。可變輕鏈結構域L100 及1^1〇1蛋白之蛋白序列分別示於8£〇1〇]^0.67及8£(^10 N0.68 中。 在CHO細胞中如先前所述表現H100L100及H100L10之全 長形式。表23顯示H6L13與H100L100及H100L101之結合 親和性的比較並表明H100L100及H100L101在與H6L13比 較時具有改良之結合親和性。在本實例中，實施方法基本 116953.doc -68 - 1378940 上同實例6中所述者，其中藉由使NHS及EDC溶液以5微升/ 毫升在7分鐘内流過晶片來活化CM5晶片且將NOGO懸浮於 10 nM乙酸鈉緩衝液（pH 4.5)中，然後使其流過晶片。 表23-H6可變重鏈之G101S變體連同L13可變輕鏈變體與 H6L13相比較之Biacore量測值 L·»- BA 杭體 締合速率kaO/Ms) 解離速率kd(l/s) 親和性CKD，nM) H6L13 1.04E+06 _7.22E-03 6.97 H100L100 1.28E+07 5.07E-03 0.396 H100L101 1.30E+07 4.29E-03 0.329 NOGO抗體序列歸納（表24) 說明 ~~ 序列標識符(SEQ.I.D.NO) 胺基酸序列 多核苷酸序列 2A10，CDR-H1 1 - 2A10 » CDR-H2 ' 2 - 2A10 ’ CDR-H3 ' 3 - 2A10，CDR-L1 ' 4 - 2A10，CDR-L2 5 - 2A10，CDR-L3 ' 6 喝 2A10，VH(鼠類） 一— 7 19 2A10，VL(鼠類） 8 20 嵌合重鏈He 9 21 嵌合輕鏈Lc 10 22 2A10 VH人源化構造H6 11 23 2A10 VH人源化構造H16 12 24 2A10 VL人源化構造L13 13 25 2A10 VL人源化構造L16 14 26 2 A10重鏈人源化構造H6 15 27 116953.doc •69· 1378940

2A10重鏈人源化構造H16 16 28 2A10輕鏈人源化構造L13 17 29 2A10輕鏈人源化構造L16 18 30 Campari前導序列 31 - 與GST融合之人類NOGO A(NOGO-A56) 32 - 之胺基酸586至785 2A10VH人源化構造H1 33 37 2A10VL人源化構造L11 34 38 2A10重鏈人源化構造H1 35 39 2A10輕鏈人源化構造L11 36 40 2A10 VH人源化構造H20 41 43 2A10重鏈人源化構造H20 42 44 2A10，CDR-H3(G95M) 45 狨NOGO-A片段之序列 46 VH人源化構造H26 47 50 VH人源化構造H27 48 51 VH人源化構造H28 49 52 重鍵人源化構造H26 53 56 重鏈人源化構造H27 54 57 重鏈人源化構造H28 55 58 嵌合重鏈Hc(G95M) 59 抗原決定部位 60 2A10 VH人源化構造H99 61 CDR(GIOIS) 62 VH人源化構造H100 63 VH人源化構造H101 64 VH人源化構造H102 65 VH人源化構造H98 66 L100(L13+Q37R) 67 L101(L13+Q45R) 68 L102(L13+Q37R/Q45R) 69 L103(L16+Q37R) 70 116953.doc -70- 1378940

Clq，對照組抗體係 Campath IgGl、Campath IgG4 及 Campath IgGl Fc- ° 圖19係H28L16、HcLc及11C7對來自A)大鼠、B)食蟹 猴、C)狨及D)松鼠猴之GST-NOGO-A56的直接結合 ELISA，其是以HcLc作為參照，以一無關的抗體作為陰性 對照組，曲線圖表示來自三個獨立分析之代表性圖式。

圖20係比較H28L16及11C7之結合抗原決定部位之競爭 式ELISA，其是將重組人類Nogo-A(GST-Nogo-A 5 + 6)塗覆 至各盤上，將2A10與11C7或H28L16預先混合並用抗小鼠 IgG-HRP 連結物（Dakocytomation，#P0260)測定 2A10 之結 合，以Robosage推導IC50值，曲線圖表示來自三個獨立分 析之代表性圖式。 圖2 1係比較NOGO-5 + 6(GST-Nogo-A 5 + 6)及肽片段對 H28L16之結合之競爭式ELISA，曲線圖表示來自兩個獨立 分析之代表性圖式。 ·· 圖22係〇1018/卩3 711變體與1161^13及11271^6相比較之£1^8八 數據。 116953.doc -75- 1378940

AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGA

GCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAA

TGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCA

TCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAT

GAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATC

GCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCT

GGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCA

GGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAG

CCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA

SEQ ID NO· 22:编碼嵌合輕鏈Lc SEQ ID: 10之PN

ATGAGGTGCTCTCTTCAGTTTCTGGGGGTGCTTATGTTCTGGATCTCTGGAGTCAGTGGGGATA

TTGTGATAACCCAGGATGAACTCTCCAATCCTGTCACTTCTGGAGAATCAGTTTCCATCTCCTG

CAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCTGCAGAG

ACCAGGACAATCTCCTCAGCTCCTGATCTATTTGATGTCCACCCGTGCATCAGGAGTCTCAGA

CCGGTTTAGTGGCAGTGGGTCAGGAACAGATTTCACCCTGGAAATCAGTAGAGTGAAGGCTG

AGGATGTGGGTGTGTATTACTGTCAACAACTTGTAGAGTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGA

CCAAGCTGGAGCTGAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATG

AGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGG

CCAAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACA

GAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGA

CTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCAC

AAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG

SEQ ID NO. 23:编碼2A10 VH人源化構造H6 SEQ ID: 11 之PN

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTC

CTGCAAGGCATCTGGATACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGG

ACAAGGGCTTGAGTGGATCGGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGA

AGTTCAAGAGCAGAGCCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTG

AGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGAACTGGGACAGGGCTACTGGGG

CCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCA

SEQ ID NO. 24:编碼2A10 VH人源化構造H16 SEQ ID: 12之PN

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTC

CTGCAAGGCATCTGGATACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAACAGCGACCTGG

ACAAGGGCTTGAGTGGATCGGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGA

AGTTCAAGAGCAAAGCCACCCTCACCGTCGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTG

AGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGAACTGGGACAGGGCTACTGGGG

CCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCA

SEQ ID NO. 25:编碼2A10 VL人源化構造L13 SEQ ID: 13之PN

GATATTGTGATGACCCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCT

CCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCAGC

AGAGGCCAGGCCAATCTCCACAGCTCCTAATTTATTTGATGTCCACCCGTGCATCTGGGGTCC

CAGACAGATTCAGCGGCGGTGGGTCA 79· 116953.doc 1378940

GGCACTGATTTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCCAACAACTT

GTAGAGTATCCGCTCACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA

SEQ ID NO. 26:编碼2A10VL人源化構造L16SEQID:14之PN

GATATTGTGATGACCCAGTCTCCACTCTCCAACCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGTCTCCATCTCCTGCAGG

TCTAGTAAGAGTCTCCTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCTCCAGAGGCCAGGCCAATCT

CCACAGCTCCTAATTTATTTGATGTCCACCCGTGCATCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCGGTGGGTCA

GGCACTGATTTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCCAACAACTT

GTAGAGTATCCGCTCACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA

SEQ ID NO. 27:編碼2A10重鏈人源化構造H6SEQID: 15之PN

ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTG

CAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTC

ACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATCGGAAATATTAATCCT

AGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAGAGCCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGC

ACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGAACTGGGACAGGGC

TACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCA

CCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCG

GTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCA

GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC

GTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACA

TGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGAC

ACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC

AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAAC

AGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC

AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA

CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTC

AAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC

ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG

CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC

TCCCTGTCTCCGGGTAAATGA

SEQ ID NO. 28:編碼2A10重鏈人源化構造H16SEQID:16之PN

ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTG

CAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTC

ACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAACAGCGACCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATCGGAAATATTAATCCT

AGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAAGCCACCCTCACCGTCGACAAATCCACGAGC

ACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGAACTGGGACAGGGC TACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCA 116953.doc •80· 1378940

CCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCG

GTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCA

GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC

GTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACA

TGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGAC

ACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC

AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAAC

AGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC

AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA

CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTC

AAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC

ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG

CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC

TCCCTGTCTCCGGGTAAATGA

SEQ ID NO. 29:编碼2A10輕鏈人源化構造L13SEQID:17之PN

ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGATATTGTGATGACC

CAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTC

CTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCTCCACAGCTCCTAATT

TATTTGATGTCCACCCGTGCATCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCGGTGGGTCAGGCACTGATTTCACA

CTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCCAACAACTTGTAGAGTATCCGCTC

ACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCA

TCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCC

AAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGC

AAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTAC

GCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG

SEQ ID NO· 30:編碼2A10輕鏈人源化構造L16SEQID:18之PN

ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGATATTGTGATGACC

CAGTCTCCACTCTCCAACCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGTCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTC

CTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCTCCAGAGGCCAGGCCAATCTCCACAGCTCCTAATT

TATTTGATGTCCACCCGTGCATCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCGGTGGGTCAGGCACTGATTTCACA

CTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCCAACAACTTGTAGAGTATCCGCTC

ACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCA

TCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCC

AAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGC

AAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTAC

GCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG -81· 116953.doc 1378940

SEQ ID NO. 38:编碼2A10VL人源化構造L11SEQID:34之PN

GATATTGTGATAACCCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGG

TCTAGTAAGAGTCTCCTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCT

CCACAGCTCCTAATTTATTTGATGTCCACCCGTGCATCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCGGTGGGTCA

GGCACTGATTTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCCAACAACTT

GTAGAGTATCCGCTCACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA

SEQ ID NO. 39:编碼2A10人源化重鍵 H1SEQID:35之PN

ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTG

CAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTC

ACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAATATTAATCCT

AGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAGAGTCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGC

ACAGTCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGAACTGGGACAGGGC

TACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCA

CCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCG

GTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCA

GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC

GTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACA

TGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGAC

ACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC

AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAAC

AGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC

AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA

CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTC

AAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC

ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG

CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC ··

TCCCTGTCTCCGGGTAAATGA

SEQ ID NO_ 40:編碼2A10人源化輕鏈構造L11SEQID:36之PN

ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGATATTGTGATAACC

CAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTC

CTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCTCCACAGCTCCTAATT

TATTTGATGTCCACCCGTGCATCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCGGTGGGTCAGGCACTGATTTCACA

CTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCCAACAACTTGTAGAGTATCCGCTC

ACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCA

TCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCC

AAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGC

AAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTAC

GCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG -83 - 116953.doc 1378940

CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC

TCCCTGTCTCCGGGTAAATGA

SEQ ID NO. 45: 2A10 CDR-H3 (G95M) MQGY SEQ ID NO. 46:狨NOGO-A片段之胺基酸序列

VQDSLCPVAQLCPSFEESEATPSPVLPDIVMEAPLNSAVPSAGASAVQPSSSPLEASSVNFESVKHEPENPP

PYEEAMNVSRKKVSGIKEEIKEPESINAAVQETEAPYISIACDLIKETKLSAEPTPDFSSYSEMAKVEQPLP ϋΗ3ΕΙίνΕϋ35Ρϋ3ΕΡνϋΙίΡ30ϋ5ΙΡ〇νΡ〇Κ(ί〇ΕΑνΐυνΚΕΤΙ/ΓΕΤ3ΡΕ3ΜΙΕΗΕΝΚ SEQ ID NO. 47: VH 人源化構造 H26

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSRATMTR

DTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO. 48: VH 人源化構造 H27

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHVA7KQRPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATLTV

DKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO. 49: VH 人源化構造 H28

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATMTR

DTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO. 50:編碼 VH 人源化構造 H26SEQID:47 之 PN

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCA

TCTGGATACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATC

GGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAGAGCCACCATGACCAGG

GACACGTCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGT

GAACTGATGCAGGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCA

SEQ ID NO· 51:編碼 VH 人源化構造 H27 SEQ ID: 48 之 PN

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCA

TCTGGATACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAACAGCGACCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATC

GGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAAGCCACCCTCACCGTC

GACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGT

GAACTGATGCAGGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCA

SEQ ID NO. 52:編碼 VH 人源化構造 H28SEQID:49 之 PN

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCA

TCTGGATACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATC -85 - 116953.doc 1378940

GTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCA

GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC

GTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACA

TGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGAC

ACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC

AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAAC

AGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC

AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA

CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCIXSACCTGCCTGGTC

AAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC

ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG

CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC

TCCCTGTCTCCGGGTAAATGA

SEQ ID NO· 57:編碼重鏈人源化搆造H27SEQID:54之PN

ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTG

CAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTC

ACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAACAGCGACCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATCGGAAATATTAATCCT

AGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAAGCCACCCTCACCGTCGACAAATCCACGAGC

ACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGAACTGATGCAGGGC

TACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCA

CCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCG

GTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCA

GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC

GTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACA

TGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGAC

ACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC

AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAAC

AGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC

AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA

CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTC

AAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC

ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG

CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC

TCCCTGTCTCCGGGTAAATGA

SEQ ID NO. 58:編碼重鏈人源化構造H28 SEQ ID: 55之PN

ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTG cagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttc •87、 116953.doc 1378940 SEQ ID NO. 63: VH人源化構造H100

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSRATMTR

DTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCEIiGQSYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO. 64: VH人源化構造H101

QVQL·VQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGL·EWIGNINPSNGGT^rYNEKFKSKATLTV

DKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELGQSyWGQGTLVTVSS SEQ ID NO. 65: VH人源化構造H102

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATMTR

DTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELGQSYWGQGTLVTVSS r· SEQ ID NO. 66 2A10 VH 人源化構造 H98

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGNINPSNGGTNYNEKFKSRVTMTR

DTSTSTVYMEIiSSLRSEDTAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO. 67 ϋΐνΜΤΟεΡΙ^ΙιΡνΤΙιΟΟΡΑβΙΒα^ΚΒΙιΙϋΥΚΟΟΚΤΥΙιΝνίΡΙ^ΡαοεΡΟΙΛΙΥΙιΜβΤΗΑΒΟνΡΟΪ^Οσαβ

GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQIiVEYPIjTFGQGTKLEIK SEQ ID NO. 68

DIVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFQQRPGQSPRLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGS

GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK SEQ ID NO. 69 ϋΐνΜτς^ρΐ^ρντι^οΡΑβιβα^κβι^γκϋοκτγΐϋΝν/ρκοκρσζ^ρΐιι^ΐΥΐιΜβτκΑβανιωι^οσοΒ

GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK

SEQ ID NO. 70

DIVMTQSPLSNPVTLGQPVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFRQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGS

GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK SEQ ID NO. 71

GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK SEQ ID NO. 72 οινΜΤζ^ρΐ^ΝΡντι^ορνείΒα^κεΐίΐιΥκοοκτγΐίΝΗΡί^κραζ^ΡίαΛίΥΐιΜετΗΑβανίΌΐ^αασΒ

GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK 89- 116953.doc 1378940

SEQ ID NO. 73 TPSPVLPDIVMEAPIjN

SEQ ID NO. 74 VLPDIVMEAPLNSAVP

SEQ ID NO.75 RQGY

SEQ ID NO.76 IQGY

SEQ ID NO.77 GDGY

SEQ ID NO.78 GIGY

SEQ ID NO.79 GSGY

SEQ ID NO.80 GQNY

SEQ ID NO.81 GQYY

SEQ ID NO.82 GQLY

SEQ ID NO.83 GQFY

SEQ ID NO.84 GQGW

SEQ ID NO.85 YESIKHEPENPPPYEE •90- 116953.doc 1378940 SEQ ID NO.86

WQGY

SEQ ID NO.87 GAGY

SEQ ID NO.88 GLGY

SEQ ID NO.89 GVGY

SEQ ID NO.90 GQWY SEQ ID NO. 91

MSPILGYWKIKGLVQPTRIjLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAII

RYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLN

GDHVTHPDFMLYDALDWLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHP ΡΚΒΒΙϋΕνί^ζ^ΡΙ^ΜΟΕεί^ΥΡνΑΟΙιΟΡβΡΕΕΒΕΑΤΡΒΡνί^ϋΐνΜΕΑΡΙιΝβΑνΕ^ΑνΜΑνΟΡβΙ^ΡΙιΕΑε

SVNYESVKHEPENPPPYEEAMNVSLKKVSGIKEEIKEPESIKAAVQETEAPYISIACDLIKETKLSAEPTPD

FSNYSEMAKVEQPLPDHSEIVEDSSPDSEPVDLFSDDSIPDVPQKQDEAVILVKENLTETSFESMIEHENKL

ERPHRD SEQ ID NO. 92

MS PILGYWKIKGLVQPTRLLLE YLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAII RYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRIjCHKTYLN GDHVTHPDFMLYDALDWLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHP ΡΚβϋΙ^νΐ^ζ^ΡΙ^ΚΜϋΙΛ/ΟΤβΕνΜΟΕΒΙϋΥΡΑΑΟΙ^ΡεΡΕΕΒΕΑΤΡεΡνί^ΡΟίνΜΕΑΡΙαΝΞΑνΡΒΑΟΑβΑν QPSSSPLEASSVNYESIIHEPENPPPYEEAMSVSLKKVSGIKEEIKEPESINAAVQETEAPYISIACDLIKE TKLSAEPTPDFSDYSEMAKVEQPVPDHSELVEDSSPDSEPVDLFSDDSIPDVPQKQDEAVMLVKENLPETSF ESMIEHENKEKLSALPPEGGSSGRIVTD SEQ ID NO. 93

MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAII

RYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLN σϋΗνΤΗΡϋΡΜΙίΥϋΑΙ^ννίίΥΜΟΡΜαΛΑΕΡΚΙΛ^ΚΚΗΙΕΑΙΡΟΙϋΚΥΙιΚββΚΥΙΑνίΡΙ^ΟνίΟΑΤΡΟσσΟΗΡ

PKSDLEVLFQGPLGSVQDSLCPVAQLCPSFEESEATPSPVLPDIVMEAPLNSAVPSAGASAVQPSSSPLEAS

SVNFESVKHEPENPPPYEEAMNVSRKKVSGIKEEIKEPESINAAVQETEAPYISIACDLIKETKLSAEPTPD

FSSYSEMAKVEQPLPDHSELVEDSSPDSEPVDLFSDDSIPDVPQKQDEAVILVKETLTETSFESMIEHENKL

ERPHRD -91 - 116953.doc 1378940 SEQ ID NO. 94

MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAII

RYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLN αϋΗνΤΗΡϋΡΜυΥϋΑΙίϋννίίΥΜϋΡΜα^ΑΡΡΚΙΛ^ΤΚΚΗΙΕΑΙΡςίϋΚΥΒΚ^ΚΥΙΑνίΡΙ^ν^ΑΤΓΟΟΟΒΗΡ ΡΚβϋΙ^ΕνίιΡζ^ΡΙ^ΙΟΕείϋΥΡΤΑΟΙ^ΡβΡΕΕΑΕΑΤΪ^Ρνί^ΡϋΐνΜΕΑΡΙ^Ι^ΡβΑσΑβννΟΡβνβΡυΕΑΡ

PPVSYDSIKLEPENPPPYEEAMNVALKALGTKEGIKEPESFNAAVQETEAPYISIACDLIKETKLSTEPSPD

FSNYSEIAKFEKSVPEHAELVEDSSPESEPVDLFSDDSIPEVPQTQEEAVMLMKESLTEVSETVAQHKEERL

SEQ ID NO.95 DETFAL

SEQ ID NO.96 ▲ ELSKTS r· 92· 116953.doc

Claims (1)

1378940 馕正替換 ί〇1年气月【〇日 頁 第095146890號專利申請案 中文申請專利範圍替換本(101年9月） 十、申請專利範圍： 1. 一種可結合人類NOGO-A之經分離之抗體或其片段，其 包含具有如SEQ ID NO:49所示之胺基酸序列之重鏈可變 區及具有如SEQ ID NO: 14所示之胺基酸序列之輕鏈可變 區。 2. 如請求項1之經分離之抗體或其片段，其具有'具有如SEQ ID NO: 55所示之胺基酸序列之重鏈及具有如SEQ ID ΝΟ:1 8所示之胺基酸序列之輕鏈。

3. —種表現載體，其包含編碼如請求項1或2之抗體或其片 段之序列之多核苷酸。 4. 一種宿主細胞，其包含如請求項3之表現載體。 5. 如請求項4宿主細胞，該細胞包含編碼輕鏈之第一載體 及編碼重鏈之第二載體。 6. —種製備可結合人類NOGO-A之抗體之方法，該方法包 含以下步驟：以包含編碼具有如SEQ ID NO:49所示之胺 基酸序列之重鏈可變區之第一多核苷酸的表現載體、及 包含編碼具有如SEQ ID ΝΟ:14所示之胺基酸序列之輕鏈 可變區之第二多核苷酸的表現載體轉染宿主細胞，並在 有助於抗體自該宿主細胞中分泌至培養基中之條件下培 養該宿主細胞。 7. 如請求項6之方法，另包含自培養基回收經分泌抗體之 步驟。 8.如請求項6或7之方法，其中該第一及第二多核苷酸係含 於單一表現載體。 116953-1010918.doc 1 1378940 •一種醫藥組合物，其包含如請求項1或2之抗NOGO抗體 或其片段，連同醫藥上可接受之稀釋劑或載劑。 10. —種如請求項1或2之抗NOGO抗體或其片段的用途，其 係用於製備治療或預防中風及其他神經疾病/病症或治療 中極或外周神經系統遭受機械性創傷之患者的藥物。 11. 如請求項丨或2之抗N〇G〇抗體或其片段，其係用於治療 或預防中風及其他神經疾病/病症或治療中掩或外周神 經系統遭受機械性創傷之患者。 1169S3-1010918.doc 1378940 第095146890號專利申請案 中文圖式替換本（96年6月） 十一、圖式：

Ecomso

抗體濃度（微克/毫升）

•H1L11 -H6L13 -HcLc -H20L16 -H27L16 -H28L13 -H28L16 EC0IO

-H1L11 -H6L13 -HcLc -H20L16 -H27L16 -H28L13 -H28L16 抗體濃度（微克/毫升） 圖2 116953-960612-fig.doc 1378940

116953-960612-fig.doc

-H1L11 -H6L13 -HcLc H16L16 —〇— -H20L16 -H20L13 -··△·· H26L13 -··〇 -H27L13 -*·〇-· -H27L16 —〇 — -H28L13 —6— -H28L16 抗體濃度（微克/毫升）

抗體濃度（微克/毫升） 圖4 -2- —H1L11 —H6L13 —a—HcLc -κ—H16L16 —ο—H20L16 …χ·.· H20L13 H26L13 .··〇··· H27L13 ·.·〇··· H27L16 —ο—H28L13 —ώ—H28L16 1378940 I 05 sqv 9 11 13 15 17 « 21 2 25 27 2 31 3 35 37 3 41 4 45 47 4 肽數目

116953-960612-fig.doc 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 肽數目 圖6 1378940 -HcLc -Hc(G95M)Lc —A- -H6(G95M)L13 -X- -H6L13 — -H27L16

Ο 0.0001 0.001 0Ό1 0.1 [NOGO Ab變體]微克/毫升 量7 % 4- 116953-960612-fig.doc 1378940

—ο— -HcLc -Hc(G95M)Lc —A- -H6(G95M)L13 -H6L13 —Δ- -H27L16 Ο 0.0001 0.001 0.01 0.1[NOGO Ab變體]微克/毫升

116953-960612-fig.doc 1378940 ECO?

0.001 0.01 0.1 1 [NOGO變體]微克/毫升 ---MQGY IQGY -Δ—RQGY -〇—GDGY -O—GSGY GIGY —GQNY GQYY GQSY -〇—GQLY —I—GQFY -A—GQGW H6L13 圖-9

WQGY -〇—GAGY -A—GLGY ---GVGY GQWY -5K—H6L13

0.0001 0.001 0.01 0.1 1 [NOGO Ab變體]微克/毫升 圖10 116953-960612-fig.doc -6- 1378940 EC OSA

[NOGO Ab變體]微克/毫升 -A—HcLc H28L16 -•-H27L16 -θ—H28L13 -Q-H20L16 一陰性 Φ B °·6 Ευ 〇6寸 sqv

0.2

0.00001 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 1[NOGO Ab變體]微克/毫升 圖11 —A— HcLc H28L16 H27L16 H28L13 H20L16 陰性 116953-960612-fig.doc 1378940 % % IUUQ6 寸Men/

-H28L16 —ο- -H28L13 -H27L16 —a- -H20L16 -k- -HeLe -陰性

0.001 0.01 0.1 1 _ [NOGOAb]微克λ毫升… 圖12 116953-960612-fig.doc 1378940

116953-960612-fig.doc

0.1 1 10 [競爭Ab]微克/毫升 100 ♦—H28L16 o—H28L13 H27L16 H20L16 HcLc 圖13 9- 1378940 陰性對照 HcLc H28L16

H20L16 H27L16

% 116953-960612-fig.doc • 10· 1378940 i 1200· 1100· 1000· 900· 800· 700- 60〇H 500· 400· 300- 200_ 100« 0·

10 -ve Ab HcLc H20L16 H28L13 H27L16 H28L16 100 _濃岌_(_微克/毫升乂 圖15

116953-960612-fig.doc 1378940 >ra.i3lh:.$j 一 •πζίιϋϊζι -:^5¾^ • 丁-^15^.含>:;一 j ' ρ^..:·-ν·--'^-.»·>•1-'.:.^· _ > {y,'''1f:1」i,il*^'f,". '^.UH1"..1-1'11-— N/IN -5-5 十,5iEsi— I I,;!i-'1§SS3S^I *s?ss5i -K-...-d- ^1-1"'-·.- ." \ - ' ,.v -·-" -A' f ,% "- H27L15 H28L16 -E # '- 700^^4.00¾¾^1¾ ΝΠΝΙ i;la.l J-D rh 士-彳-:条1-1.::15811-1-.? 力： " ", "(KIlf-''^srJ --'.'•-;mrt:Ei- fsrfeitt.vl ;--;·:-:'-κ ΝΠΝ 0>v '-V >ι^ϋ \v.'-/- "lfclla^^ ·- 厂 -¾¾¾ A H20L16 11C7 士...,151½¾^.¾^1^ " <' T^- - Control IgG 對照IgG ni+旬 v-'xv;:-:Kx:-'-x:/-丨 4«Μ _.二 I·-2--J ' ' ΝΠΝ I 心： +-ii \ '% " '广 - \ / / - i p a t h control antibody Campath對明、托體 ¥,i I --F)__ '"> 圖16 116953-960612-llg.doc 1378940 % % IUU 〇β寸 SCIV

[NOGOAb變體]微克/毫升 圖--1-7'

116953-960612-fig.doc -13· 1378940

10 7.5 5 2.5 1 [clq]微克/毫升

—X — Cannpath lgG1 ---Campath lgG4 NOGO H28L16 Campath lgG1 Fc- 0.5 圖18 116953-960612-fig.doc 14- 1378940 A B

圖19

116953-960612-fig.doc 15- 1378940

116953-960612-fig.doc +-H28L16 -Δ—11c7 0.1 1 10 [競爭Ab]微克/毫升 100 圖20 16- 1378940 %

0.2 0.1—— 0 0.001 6 5 4 3 0·0·0·0· EC 09

0.01 0.1 1 [肽]微克/亳升 100 —〇—肽 6 -·—肽 7 —狀 16 -4—肽 17 —陰性對照 圖—21 116953-960612-fig.doc 17- 1378940 ευ06 寸 SCK

[抗體]微克/毫升圖22 -0—H27L16 H6L13 -—陰性對照 G101S/Q170R 116953-960612-fig.doc 18-