TWI362271B - Protein from photobacterium damselae and use thereof - Google Patents

Description

1362271 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種來自發光菌殺魚亞種 (Photobacterium damselae SMbsp. piscicida、的觭辕 分泌性蛋白質以及關於該蛋白質或編碼有該蛋.白質的核酸 序列用於疫苗中以對抗魚類巴斯德桿菌症 (pasteurel losi s )之用途。 【先前技術】 由發光菌殺魚亞種〔先前稱為殺魚巴斯德桿菌 (Pasteurella piscicida)〕氮染所導致的死七數造氙全 世界溫水海面養殖業最惨重的損失。該疾病（巴斯德桿菌 - 症）為日本—在日本該疾病主要影響紅苷參的養殖_以及地 ^ 中海地區_因為該疾病在海鯛和鱸魚養殖場所造成的損失- 帶來強大的經濟衝擊。抗生素療法通常沒有效率，而且係 非所欲的因其對環境的負面影響。針對該疾病的疫苗發展 报慢，這主要係由於該病原體存活於細胞内，因此通常不 由埯文到免疫保護機制的緣故。直至今日，疫苗研究係集 中於由熱或福馬林殺死的細胞所製備之菌苗上。一富含著 稱為"DI21"之細胞外產物（Ecp)的菌苗疫苗已在某些歐洲 國家上市。該等菌苗疫苗所獲得的效力程度變化很大而且 保護期往往很短。 ▲在本領域，對實現一對抗發光菌感染之價廉、易於製 造且具再現性的有效疫苗存有一尚未被滿足的需求。 【發明内容】 1362271 發明摘要 在一第一態樣中，本發明係提供一種經分離或純化之 來自發光菌殺魚亞種的55kDa細胞外蛋白質，或其衍生物 以及由該蛋白質所激起的抗體。 在一第二態樣中’本發明係提供一種經分離之編碼有 該55kDa蛋白質的核酸序列或其同源基因或其片段，或者 是一在嚴苛條件下可與該核酸序列雜交的序列。亦提供的 疋一攜帶该p5 5核酸序列的DNA表現載體以及一用該dna 表現載體來轉形的宿主細胞。 在一第三態樣中，本發明係提供一種疫苗組成物，其 包含一經分離或純化之來自發光菌殺魚亞種的55]d)a細胞 外蛋白質或其衍生物以及一藥學上可接受的載劑。 在又一態樣中，本發明係提供一種經分離或純化之來 自發光菌殺魚亞種的55kDa細胞外蛋白質或其衍生物作為 一醫樂品之用途。 在另-態樣中，本發明係提供一種經分離或純化之來 自發光菌殺魚亞種的55kDa細胞外蛋白質或其衍生物作為 一用來預防或治療魚類巴斯德桿菌症的醫藥品之用途。 在又另-態樣中，本發明係提供—種預防或治療魚類 巴斯德桿菌症的方法，該方法包含投予魚類一疫苗組成 物’ §亥疫苗組成物係包含一經分離劣只& 丄刀雊或純化之來自發光菌殺 魚亞種的55kDa細胞外蛋白質或其衍生物以及一藥學上可 接受的載劑。 製備一對抗巴斯德 在又一態樣中，本發明係提供一種 1362271 端序列。WO 01/1 0459專利申請案的55kDa Ecp複合體係於 經補充鐵的培養條件下表現，反之，本發明的55kDa蛋白 質係為一個在指數生長中期時主要的分泌性蛋白質而與鐵 在培養基中所佔濃度多寡無關。不僅如此，當使用因針對 W0 01/1 0459專利申請案之55kDaEcp複合體所激起的抗血 清來處理ECP製備物以移除該蛋白質時，經過處理的Ecp 製備物之可導致細胞凋亡（ap〇pt〇gen丨c)特性則不受影響。 吾人原本希望評估以純化的天然p55是否可以引起對 抗發光菌感染的保護性免疫反應。然而，以天然的純化形 式投予時，發現到該蛋白質對魚類具有高度毒性而會導致 魚類快速死亡。吾人使用一被動投藥的方法來證明於兔子 體内激起之針對55kDa蛋白質的抗體（其特異性地結合至 由有毒的發光菌細胞活體内所分泌的p55 )能夠使與發光菌 相關的死亡數減少至一顯著的程度（實施例3)。 主動免疫能勝過被動免疫的好處，如實施例4所證明 者’藉由主動免疫，在用比天然形式具有較低毒性的該蛋 白質衍生物免疫之後，55kDa蛋白質的抗體可由魚類本身來 激起6 一蛋白質的“衍生物”係指一 55kDa蛋白質的變化 型，相較於自然發生的（天然的）蛋白質，該變化型係具 有修改過的一級、二級及/或三級胺基酸序列；該蛋白質衍 生物包括已接受一或多個化學或物理加工步驟的天然 55kDa蛋白質’該等加工步驟可使該蛋白質對魚類的毒性減 低。該衍生物可缺少或者可包括訊息序列（第卜16號胺基 1362271 一 致免疫性的”衍生物係為一能夠誘出中和病原 體感木力及/或中介抗體_補體或抗體依賴性細胞毒殺作用 的抗體以於經免疫宿主内提供對抗巴斯德桿菌症之保護作 用者。一衍生物的致免疫性可藉由使一動物免疫並檢查來 自°亥動物的抗血清是否能夠特異性地辨別出p55 (譬如，藉 由西方墨點分析法）來測試。當兩者皆受到有毒的發光菌 激發之時，相較於注射生理食鹽水的控制組魚類，一去除 毋性的p 5 5致免疫性衍生物在投予至具感受性的魚類時可 產生一正的RPS值（相對存活百分比）。 舉例來說，一去除毒性的55kDa蛋白質致免疫性衍生 物可實質上為一同源重組變化型，其係藉由定點突變法來 設計以去除或減少該蛋白㈣魚類的毒性，但仍保留在奋 類㈣可辨別來自發光菌的抗原及可與該來自發光菌的^ 原（交又）-反應之抗體產生的能力及/或在魚類激起一免 疫反應以保護其不受該病原體感染的能力。 任擇地，邊衍生物可以是受過加熱處理、微波、照光、 K處=肖θ波振I、冷卻處理、冰;東、冰;東及解;東、冷 凍乾燥、以尿素或清潔劑變性、甲醛處理或任何習知可^ 成蛋白質的二度空間構形改變的其他處理之天然的pH或 者疋經分離或純化的ρ 5 5。 然的Ρ55衍生物可提供成一來自發光 細胞外產物的製備物的形式。吾人已發現ρ55係為 養生長至指數生長中期時主要的分泌性蛋白質，在該等而 件下佔分泌性蛋白質超㉟85%的比例（較老的細菌上清液 1362271 指數期末期至靜滯期-具有更加複雜的蛋白質分佈模式，儘 管P55亦存在其中）^本發明之一態樣係大致上關於一種 用於疫苗之經失活的富含P55之ECP製備物。較佳地，該 等ECP製備物係於平常條件的鐵中製備，亦即，該等細胞 係生長於無補充鐵亦無加入鐵螯合劑的培養基當中。培養 基的鐵濃度係較佳小於15μΜ，更佳小於1〇μΜ，更佳小於1μΜ 且最佳小於Ο.ΙμΜ。本發明之一較佳具體實例係關於一種疫 田，其包含濃縮的培養上清液，該培養上清液係來自發光 菌殺魚亞種（較佳為生長至指數生長中期者）且已失活。 才曰數生長中期表示於600nm時測得的光學密度（〇D)為 0.5-0. 7，較佳為0.55_0. 65，更佳為〇 6。上清液較佳係 於失活步驟前和細胞分離開來 視情況可將細胞培養上清 - 液》辰縮（在失活之前或之後），舉例來說，1. 5 - 2 0 0倍， 視情況可為5-150倍，舉例來說為50-1 00倍以供使用。可 利用傳統用來濃縮上清液的方法，包括離心過濾裝置、超 速離心、真空透析、硫酸銨沉澱法等等方法。實施例1指 出一種製備濃縮培養上清液的方式，實施例4則教示一使 用甲路的失活步驟。適宜的失活劑例子包括曱醛、皂柑、p-丙醇酸内酯（BPL)以及二元次乙亞胺（βει )。 在一具體實例中’衍生物係重組地表現，其具有與天 然Ρ55 (加上/減去訊息序列）相同的胺基酸序列，但由於 在一宿主細胞内重組表現的緣故，該蛋白質的摺疊、糖化 作用或其他的轉譯後處理則和天然狀態下的蛋白質所具者 不同°任何構形上或化學特性的差異可反映在對魚類減少 10 叫271 的毋性。舉例來說，用來進 ό . ηβ ,3 ^ 丁實她例4中的免疫作用之來 自大腸#函的重組表現蛋白 誤摺疊所致。 …成包涵體’這或許是錯 衍生物可為該蛋白質的— 位，舉例來說，立特由無毋Μ、片段或抗原決定 由用酵辛切… 重組表現該蛋白質，或藉 由用酵素切割及/或化學切 所贪白質及緊接著純化一該 蛋白貝的片段來製備。在—且每 λα ^ μ ^ 八體只例中’衍生物係為ρ55 的一個片段’其係藉由蛋 ,,,.*白貝刀解酵素（例如：胰蛋白酶） 扁化或以一化學藥劑（ j如.溴化氰）切割所製備。 為了現今目的，.可暗缺Μ « u ^ „ '、解，]Ρ55蛋白質的一“部分”或 方+又 係表不任柯且女K t 少6個、較佳為至少10個、更 侄為至夕I 5個、更佳為 或 乂 25個，視情況可為至少35個 或至少45個55kDa蛋白暂沾、由这 質的一“邱八”飞 冑的連續胺基酸之胜肽分子。蛋白 Τ以是完整長度的胺基酸序列。 — 經分離的”式“u 上已去除來自該蛋白Ϊ所純化的”蛋白質係定義為實質 材料或其他污毕蛋白//生自的細胞或組織來源的細胞 時， 質者，或者當該蛋白質係化學合成 , 除化學前驅物或其他化學品者。「實質上 去除細胞材料」—技—』 貫貨上 蛋白\ °。匕括蛋白質的製備，於該製備當中， 來曰貝係從可公雜山 的细 出该蛋白質或重組產生該蛋白質之細胞 材料η 纟—具體實例中，「實質上去除細胞 蛋白i二？ 於約戰以乾燥重量計)的非. 皮曰買c於本文中亦淼 質的製備，更佳A小 /亏染蛋白質」）之55kDa蛋白 ’’、夕於約20%的污染蛋白質、又更佳為少於 1362271 約10%的污染蛋白質且最佳為少於約5%的污染蛋白質之 55kDa蛋白質的製備1 55kDas自質或其生物活性部分係 重組產生時，亦較佳的是實質上去除培養基，亦即培養基 係相當於少於約20%、較佳少於約丄〇%且最佳少於約5%的蛋 白質製備物之體積。 發光菌殺魚亞種有數個；地域性分離株。對本領 域研究者而言，熟悉的菌株例子包括ΜΤ1415、ρρ3、Μτΐ375、 ΜΤ1588 、 ΜΤ1594 、 D1 21 、 Β51 、 ΕΡΟγ 88〇3_π 、 pTAVSA95 、

；ATCC 29690 ^ CECT (Colecci6n Espanola de Cultivos Tipo) 4780、CECT 4781、CECT 5063 以及 CECT 5〇64。該等菌株 的核酸序列及其表現的蛋白f的胺基酸序列有某種程度的 差異。使用於本發明的55kDa蛋白質並不㊣限於任何特定 的菌株來源，但發光菌的某些非毒性菌株（例如atcc ““Ο 和㈣圆-⑴可能缺少5抓蛋白質。—熟習此藝者 可輕易地藉由sds-PAGE分析法或西方墨點分析法、藉由pcR 或者複製 do Vale 等人於 Fish & SheUfish Im_i〇gy i5

(2⑽3). 129-144中所描述的細胞凋亡試驗來測出一菌株缺 )孩蛋白質。當替一地區設計疫苗時，將55kDa的變化型 與4特定地理區域内的流行菌株相配可能會有好處。 本奄月包3貫質上同源於SEQ ID NO : 1和SEQ ID N0 · 2 所刀別砰疋之序列的核酸序列與胺基酸序列衍生物。「實 質上同源」表示一序列，當相較於參考序列時，係具有至. 少50%的同源性，更㈣至少、6〇%的同源性，更佳為至少㈣ 的同源性，更佳為相較於參考序列係具有至少8⑽、8M、 12 丄邛2271 95%、98%或更多的同源性。 欲決定兩胺基酸序列或兩核酸序列的同源性百分比 ¥，該兩序列係以最佳化比較目的來比對（舉例來說，為 了和第一個胺基酸或核酸序列進行最佳化比對，可將間隙 引進第一個胺基酸或核酸序列的序列當中，而且為了比較 .. 目的’可忽視於間隙中所插入的非同源序列）。該兩序列. 亚不需要是相同長度。除非另有指明，跨越所比較的兩序 列的序列長度係為比對的全部範圍。視情況而定，供比較 目的之用所比對的參考序列長度係為該參考序列之至少 _ 3〇%，較佳為至少40%’更佳為至少5〇%，又更佳為至少6〇% 且又更佳為至少70%、80%或90%的長度。 虽第一（參考）序列的一位置被跟序列的對應位置上 相同胺基酸殘基或核柑酸所佔據時，則在該位置上的該等 ， 分子係於為同源的（亦即在該位置有一致性）^在核酸序 · 歹J比較的情況中，於兩個被比較的分子的某個位置上，包 括編碼著相同胺基酸的核柑酸之密碼子三聯體亦具有同源 性，此乃由於基因密碼之簡併性㈠以印打肛幻。 φ 兩序列之間的同源性百分比是該等序列所共享的同源 位置數量的函數（亦即：％同源性=㈤源位置的數量除以 所有位置的數量）。視情況而定，序列的比較和同源性百 . 分比的決定可使用數學演算法來完成。適宜的演算法係包 . 含於 Altschul 等人於（1 990) j. M〇1. Bi〇1 215:43〇1〇 所提出之NBLAST與XBLAST程式當中。 亦包含於本發明的核酸序列係為在嚴苛條件下可雜交 13 1362271 至參考SEQ ID NO: 1的序列。在本發明中，「嚴苛」雜交 條件的思義係疋義為該等描述於sambro〇k等人所著的 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press ( 1 989)，丨 1〇4 當中者， 亦即以lx SSC緩衝溶液和〇 1% SDS於55〇c (較佳在62〇c 且最佳在6β°〇沖洗1小時後，尤其是以〇· 2χ ssc緩衝溶 液和0. 1% SDS於55°C (較佳在62〇c且最佳在68〇c)沖洗 1小k之後仍能觀察到正向雜交訊息。 本發明之序列包括參考核酸序列的片段。55kDa蛋白質 的核酸參考序列之一「片段」係為包含至少i 0個、較佳至 少20個、更佳至少30個、更佳至少50個、視情況為至少. 75個或是至少1 〇〇個該序列之連續核柑酸的任何部分。$卯 ID N0:1片段的一個應用是巴斯德桿菌症或被有毒性的發光 菌殺魚亞種感染之診斷。舉例來說，該片段可用作為一供 診斷用PCR套組當中的DNA引子。 本發明之另一怨樣係有關包含一編碼有p55 (或其一部 分）的核酸序列之載體，較佳為表現載體。本文所使用的 載體」一詞係指一能夠運送另一連接至該載體上的核酸 之核酸分子。其中一種載體為質體，質體是指一環形雙股 DMA環圈’而額外的DNA片段可接合至質體内。另一種載體 為病毒載體，其中額外的DNA片段可接合至病毒基因組内。 某些載體能夠指揮作用性連接至該載體上的基因之表現。 該種載體在本文係指「表現載體」。一般而言，在重組DNA 技術中實用的表現載體係為質體之形式。然而’本發明係 14 1362271 欲包括其他形式的表 缺損的反轉錄病毒、 病毒載體係供用於相 現載體’例如病毒載體（譬如有複製 腺病毒以及腺病毒相關病毒），該等 等功用。 重、’且表現載體係以適合在一宿主細胞内表現 -本發明之核酸的形式包含該核酸，其係表示該重組表現 載體匕括或夕個根據供表現用的宿主細胞而選用的調控 序列4調控序列係作用性地連接至該欲被表現的核酸序 列。本發明之表現載體可以是真核表現載體，其係用於在 所㈣接受者體内表現55kDa抗原（以作為一醒疫苗） 或是原核或真核表現載體，其係用於在除了最終接受者以 外的一宿主有機體内表現（以用來製造重組抗原疫苗）。 任擇地，該重組表現載體能夠在體外被轉錄及轉譯，舉例 來說，使用T7啟動子調控序列與T7聚合酶。 在一表現載體内，「作用性連接」係欲表示所關注的 核柑酸序列係以一種考慮到該核柑酸序列之表現（譬如， 於一體外的轉錄/轉譯系統内表現或者當載體被引進一宿 主細胞時，於該宿主細胞内表現）的方式和（多個）調控 序列連接。「調控序列」係欲包括啟動子、增進子及其他 表現控制元素（譬如，聚腺柑酸訊息）^該種調控序列係 描述於，舉例來說’ Goeddel所發表之Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185， Academic Press San Diego· Calif. (1990)。調控序列包括那些在許多種 類的宿主細胞内指揮核柑酸序列之持續表現者，並且包括 那些僅在某些宿主細胞内（譬如，具組織特定性之調控序 15 1362271 列）指揮核柑酸序列之表現者。熟習此藝者將會瞭解到表 現載體之設計可取決於例如所欲轉形的宿主細胞之選擇、 所欲蛋白質之表現程度等等因素。可將本發明之表現載體 引進宿主細胞内以藉此製造由本文所描述之核酸所編碼的 蛋白質或胜肽，其包括融合蛋白質或融合胜肽（譬如，55k])a 蛋白質、p55的衍生形式、P55與一異源胜肽之融合蛋白質）。 本發明之另一態樣係有關藉由轉形作用將一本發明之 重組表現載體引進其内部之宿主細胞。宿主細胞可以是任 何原核或真核細胞（包括在多細胞真核有機體内的真核細 也），例如大腸桿菌、昆蟲細胞（使用桿狀病毒表現載體）、 酵母菌細胞或是哺乳動物細胞。其他適宜的宿主細胞係為 熟習此藝者所習知的（譬如上文引用過之G〇eddel所發表 者）。 在真核生物内表現蛋白質係最常在大腸桿菌内以含有 可才曰揮融合蛋白質或非融合蛋白質表現的持續性或誘導性 啟動子的载體來進行0融合載體將一些胺基酸加至其所編 碼的蛋白質上，通常加至該重組蛋白質的胺基端上。於融 合表現載體内’常常在融合部分和重組蛋白質的交接點引 進蛋白質剪切位置’以在純化融合蛋白質之後能將該重 組蛋白質與融合部分分開。該種酵素（及其同源辨識序列） 包括第十凝血因子（Factor Xa)、凝血酶與腸激酶。具代表 性的融合表現載體包括PGEX (Pharmacia Biotech Inc ;

Smith，D. Β·與 j〇hnson，K. S. ( 1 988) Gene 67:3卜40)、 pMAL (New England Biolabs， Beverly. Mass.)及 pRIT5 16 1362271 (Pharmacia，Piscataway，N.J·)，上述载體係分別將麩胱 苷肽S-轉移酶（GST)、麥芽糖e結合蛋白或蛋白a融合至目 標重組蛋白質上。 經純化的天然P55亦包含於本發明之範疇内，且可使 用傳統的蛋白質純化流程從發光菌的細跑培養令萃取或純 化該p 5 5。 p55基因可併入一核酸疫苗（NAV)内，藉其當該nav被 一動物宿主細胞攝入時，p55基因之表現可於其細胞質内發 生。一插入DNA載體之P55基因可直接（譬如，肌肉内） 接種至魚體内’以供在魚細胞内之體内表現。因此，在本 發明之一態樣中，係提供一種包含藥學上可接受的載體及 一 DNA質體之核酸疫苗，在該DNA質體内，一編碼卩55的 核酸序列係作用性連接至一轉錄調控序列。轉錄調控序列 包括啟動子、聚腺柑酸序列及其他核柑酸序列，例如：具 有未甲基化CpG二核柑醆之促進免疫的寡核柑酸，或是編 碼有其他抗原性蛋白或輔助用細胞激素之核柑酸序列。真 核或病毒的（多個）轉錄調控序列之存在使得在魚細胞内 表現P55基因變為可行。為了製備疫苗組成物，DNA質體本 身可在細菌細胞内複製，但是通常欠缺轉錄調控序列讓 基因可在原核細胞内表現。為了要最佳化體内表現，則較 佳選擇對於欲被接種疫苗的魚來說係内生性的轉錄調控序 列。舉例來說可考慮内生性細胞激素或肌動蛋白基因啟 動子。DNA可以裸露形式存在或者可和一有助於細胞攝取的 试劑（譬如，微脂體或陽離子性脂質）共同投予。有關魚 17 1362271 的DNA接種技術係更詳細說明於美國專利第5, 780, 448號 當中，其係以參考方式併入本文中。

本發明之疫苗係欲用來投予至任何處於罹患巴斯德桿 菌症的風險當中或是正罹患巴斯德桿菌症的魚類。具感受 性的品種例子包括：紅普參、香 魚{Plecoglossus al ti velis)、 '红綱{Acanthopagrus schlegel i)、黑'織{Pagrus major)、坑琢务、{Channa macu 1 ata) ' 江點石斑{Epinephe 1 us akaara)、卵开j 單棘，舍屯 (Navodan modestus) ' 條级驢（Morone saxati 1 is')、雜交 條氣繼（Μ· saxatiIjs x M· Chrysops)、金頭海鱗（Sparus aurata)、繞免、QDicentrarchus labrax)、鯡备、（Mugi 1 sp_ )、磯尉（/7cm/ey7/?y"s· 、日本比目魚 {Paral i ch thys ol ivaceus)以 及 錄 魚{So 1 ea senega 1 ensis')。

疫苗投予的代表性途徑為注射至肌肉内（尤其是頂肌） 或腹腔膜（用於大魚）、口服餵食或將其沉浸於海水或淡 水中。一抗原性疫苗的較佳接種途徑是藉由腹膜内注射。 建議將本發明之疫苗以注射來投予至體重為至少2克、較 佳1 0克或更重的魚。因為某些品種的魚（例如金頭海鲷和 鱸魚）在年幼時最易受到巴斯德桿菌症所害，所以可能較 佳在魚體重為50克或更少時替其接種疫苗，可視情況以沉 浸方式接種。就沉浸或口服投予而言，至少2克的體重係 為較佳的。 為了預防或治療目鈞，可將本發明之疫苗投予至魚。 18 1362271 疫田的有效劑量會隨著受試者的大小與品種以及根據 ，予模式而有所變化。最佳劑量可經由獸醫或水產養殖專 豕的嘗4錯誤來決定。由於魚對疫苗產生反應而承受壓力 的緣故，疫苗較佳以單次注射疫苗之單一劑量形式來供 疫田可適宜地在單一劑量内包含介於約1μδ與100〇Mg 之間、較佳介於約1〇μδ與200gg之間、更佳介於約5〇吨 ” 1 Ο Ο 之間的重組或純化蛋白質。較佳地，一個單一劑

:單位係投予至所欲治療之魚。就注射式疫苗而言，一個 單41丨里單位的體積係適宜地為〇. 〇25至〇· 5毫升，較佳 為0.05至0.2毫升，可視情況為約毫升。 戈DNA疫苗而έ，每隻動物給予最低1 〇即之劑量至高 0 0 之劑量的質體應足夠供抗原於體内適宜地表現。

典型地，疫苗係製備成液體溶液、懸浮液或乳劑以屯 之用或經由常溫水來輸送。舉例來說，為了要加到4 2 Γ水槽、水浴或海面網籠，可製備成液體乳劑或乳狀^ 縮^。亦可製備適合在投藥之前先溶解或懸浮在液體載養 内或疋在投藥之前先和固體食物混合的固體（譬如，粉末 形式疫S可為冷凍乾燥及視情況為冷凍—乾燥者，其係2 可以無菌稀釋劑或溶劑復原之立即可用的形式。舉例身 π —冷凍乾燥疫苗可用食鹽水（視情況可提供為包裝好备 疫:產品的—部分）來復原。核酸疫苗係、尤其適用於冷 ^燥，因為核酸分子所具之穩定性與極長的保存期。本瘦 明之藥學疫苗組成物可以即刻釋放或長效釋放的形式來迟 予0 5 19 1362271 WMUlt實例中’帶有p55編碼序列的p55 或—DNA表現載體係與一藥學上可接受的載體或載劑結合在 —藥學組成物内。荦學上可杻& k & '、子 了接叉的載體或載劑包括習用的 賦形劑且可為，舉例來說，冰為丨（ ^ j术況，令劑（例如水、油）或是食鹽 水《J萄糖、苦油、嚴糖、三卡因（tricaine)、濕潤或乳 化劑、膨脹劑、糖衣、黏合劑、填充劑、崩解劑、稀釋劑、 潤’月劑pH緩衝劑’或是習用的佐劑，例如胞壁酿二肽 U— di_tides)、阿夫立定(avridine)、氫氧化紹、 油（譬如，礦物油）、矣柑、嵌段共聚合物以及其他此領 域所熟知的物質。在本發明之-較佳具體實例中，疫苗組 成物係包含經分離或純化的p55或其衍生物以及一佐劑。 較佳的佐劑為佛氏不完全佐劑。視情況而定，p55蛋白質或 衍生物係懸浮於食鹽水溶液（例如_，並且用佛氏不完 全佐劑以體積比約為1:1的比率將其乳化。 為使”，、免疫’ p55抗原或P55基因可非口服地（通常藉 由一適當的載劑以肌肉内注射）、注射至腹腔膜、口服餵 食或藉由沉浸方式來投予。本發明之較佳抗原疫苗組成物 ’、為適w以庄射或次沒投藥的形式。_之接種則係通常藉 由肌肉内注射。 在一些例子當中，可能係所欲的是將本發明的疫苗和 另-抗原《多個抗原，组合在―混合疫…包含—或多個 組成份以用於分別、連續或同時投藥的套組内，以治療或 預防發光菌殺魚亞種（先前稱為殺魚巴斯德桿菌）的感染 或魚類會受到影響的多種疾病。 “ 20 1362271 其他可與本發明之疫苗結合的抗原包括，舉例來說， 何生自下列病原體之抗原：發光菌殺魚亞種、虹彩病毒 (Iridovirus spp.)、野田病毒（N〇davirus 3卯）、弧菌 (Mr/o spp.)、愛德華氏菌⑹，加spp )、鏈球 菌spp.)、乳酸桿菌s卯） 以及土壤絲菌（爪W心· g Spp .)。 揭露為本發明之一部分的新穎抗原亦可用於發光菌抗 體的筛檢，舉例來說，可用來製備一可供測試曾接觸過該 種細菌的魚類用的診斷套組。 經純化的p55抗原所激起的抗體亦包含於本發明。可 以預期到該種抗體在疾病管理及魚類健康方面均可具有診 斷及治療應用。多株抗體及單株抗體兩者均可用於該方 面。以蛋白質來免疫一動物（譬如小鼠）以及挑選製造具 免疫原特異性的單株抗體的融合瘤之流程係為熟習此藝著 所白知（舉例來說，參閱K〇hler與Milstein所發表之（1975) Nature 256: 495-497 )。三明治試驗（sandwich assay)和 EL IS A可被提為診斷試驗的具體例子。 【實施方式】 實施例1 :來自發光菌殺魚亞種之p55的選殖與定序 發光菌細菌（MT1415菌株）係生長在22°C的胰蛋白酶 解大豆肉湯培養基（TSB)(並補充NaCI至最終濃度為1% (w/v) ’稱為TSB-1 )當中，並搖動至光學密度（6〇〇nm)約為 〇. 6 (指數生長中期）。將細菌細胞藉由離心移除且接著經 由0. 2 2 μπι孔徑的篩子過濾。已去除細胞的上清液則使用 21 1362271

Vivaf low 200 濃縮儀（Sartorius AG，Goettingen)濃縮 100 倍’並以 20mM 的 Tris-HCI (pH 8. 0)透析。 將濃縮的培養上清液以SDS-PAGE分析。以考馬斯藍 (Coomassie-blue)染色之後，將55kDa區帶從膠上切下 來。進行經純化蛋白質之原位胰蛋白酶解消化作用以及用 HPLC純化的兩段胜肽之愛德曼降解反應。 該等片段帶有下列序列：NNDKPDASDDKYADYVVP和 YTAAATEYTVIDALFHSPTFR。劃底線的區段係分別用來設計簡 併引子A1及β。全部的細菌DNA係根據習用技術由MT1415 菌株所製備且將其用作為利用A1引子及B引子之PCR擴增 的模板。依照製造商的使用說明將具有2〇〇個鹼基的擴增 片段從環脂凝膠上切下來’用QIAqUick Gel萃取套組 (Qiagen)將其純化，將其選殖到pGEM-TEasy Vector載體 (Promega)當中並且定序，以確認該片段係符合所欲的片 段。 上述之PCR所衍生的具有200個鹼基的片段係以

AlkPhos Direct .(Amersham Biosciences)做標記，並用作 為分析由限制酶所分解之所有來自MT1415菌株的DNA之 南方墨點分析法的探針。來自含有相對反應片段之瓊脂切 片的DNA係使用QlAquick Gel萃取套組（Qiagen)來萃 取。將一段具有3100個鹼基的Hindi 11-Hindi 11片段插入 pBluescript II KS (Stratagene)當中；將一段具有 4100 個驗基的Nco卜BamHI片段選殖到pET-32b (Novagen)裡。 作形株係使用A1引子及B引子藉由PCR來挑選並定序。 22 1362271 另一個DNA探針係使用含有該具有40〇〇個鹼基的 Ncol-BamHI 片 段以及 P4 引 子 (5’-GGCCATGATGAATCTGAAGG-3’ ） 與 T7 引子 (5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC -3’）的重組質體藉由 pCR 產 生。依照以上描述的流程，該DNA片段係用作為Mn415總 DNA之南方墨點分析法的探針。將含有一具有1 〇〇〇個鹼基 之Hindi 11-Hindi 11反應片段的瓊脂凝膠區段切下來，使 用QIAquick Gel萃取套組（Qiagen)來萃取並選殖到 pBluescript II:KS vector (Stratagene)裡。具有所欲的 構築質體的轉形株係使用P4引子及T7引子以pcr辨認。 P55的完整DNA序列係展示於第1圖（SEq ID N〇:丨）， 推論出來的一級結構則展示於第2圖（SEQ ID N〇:2)。該蛋 白質係為513個胺基酸長度且展現一典型為非膜蛋白的親 水性行為數據圖（hydropathic pr0file)e使用 式第 1·1 版（WWW.cbS.dtU.dk/Services/signalp)分析胺 基酸序列顯示有一個介於第16個和第17個胺基酸殘基之 間的推定訊息胜肽的存在。意外地，藉由將來自p55的肤 蛋白酶解胜肽進行愛德曼降解反應所獲得的序列其中之一 係開始於第17個胺基酸：天門冬醯胺。考慮到騰蛋白並不 會切掉丙胺酸（第16個殘基）缓酸端的胜肽鍵，故可推斷 出天門冬酿胺17係代表該成熟蛋白質的_。該蛋白質成 熟形式的預測分子量（56· i 85 kDa)符合SDS_pAGE所估計的 大小P55的-級結構搜尋資料庫顯示出p55的前34〇 個胺基酸殘基跟來自大腸桿_的—個未知功能、推定為 23 1362271 原噬菌體蛋白質之間有若干同源性。 實施例2 : p55於大腸桿菌中表現 將含有完整長度的p55基因之PC R片段選殖到兩個不 同的表現载體内：pET-28a( + ) (Novagen)與 pQE-31 (Qiagen) 以幺別產生重組質體pETp55與pQEp55。大腸桿菌細胞係以 習用方法轉形，轉形株係生長於37〇c並使BL21大腸桿菌 (pET-28 ( + )載體）及M15大腸桿菌（pQE_31載體）分別 在補充有5(^g/ml康那黴素或是5〇μβ/πη康那黴素加上 200pg/ml安比西林的，LB培養液（LB)中搖動8小時。該等培 養係以新鮮LB及各自的抗生素稀釋1〇〇倍，並在37〇c下搖 動生長3小時。然後將IPTG加入至最終濃度為lmM，並在 3 7 C下繼續生長5小時。藉由離心讓經I pTG誘導的細胞成 為丸狀。 以SDS PAGE分析攜帶有pETp55質體的大腸桿菌細胞 顯示出一個非可溶性（出現在包涵體部分）的57kDa蛋白 質有很強的表現。使用針對p55的抗體（說明於實施例3) 以西方墨點分析法分析該等細胞確定了該蛋白質的身份。 忒蛋白質的表面上分子量比真正的p55所展現的分子量大 2kDa表示在6玄等大腸桿菌細胞β前體形式的訊息序 列並沒有被切掉。該不可溶的57kDa蛋白質並沒有可導致 細胞凋亡的活性。 使用針對p55的抗體（說明於實施例3 )以西方墨點分 析法刀析帶有pQEp55表現載體的大腸桿菌m15細胞顯示 P55的低度表現。但是，由該等重組細胞所製造的展現 24 丄 出正確的分子量（以SDS-PAGE估得）。不僅如此，該表現 蛋白質係被發現存在於將被聲裂的細胞離心之後所獲得的 可溶性部分當中，暗示在該等細胞内所製造的p55係為正 確摺疊者。當該等可溶性萃取物被注射進鱸魚時，則在注 射之後6小時，可在腹腔膜内觀察到數量很多的凋亡細胞。 ·· 忒重組蛋白質所帶來的細胞凋亡效應在形態上和該等經注 射，’先化的天然p55所見者係難以區別。純化的天然p55係 藉由將發光菌的濃縮培養上清液以2倍的原狀態_聚丙烯醯 胺膠體電泳（native_PAGE)用緩衝溶液（與SDS_pAGE樣品 _ 緩衝溶液的組成相同，除了不包括任何SDS並將β_酼基乙 醇的濃度降低到5mM)稀釋1 : 1及隨後藉由1〇%的原狀態_ ♦丙烯醯胺膠體電泳分離而製備。把凝膠最側邊的區帶切 下，用考馬斯藍染色，以用來找出主要蛋白質區帶的所在 * 位置。將含有p55蛋白質的切片割出來並切成小塊以供萃 ， 取之用，該萃取係藉由使用20mM Tris.-HCI (pH 8.0)作為 沖提緩衝溶液之擴散作用（在4°C下溫和振盪）。 實施例3 :使用發光菌55kDa蛋白質的兔子抗血清之被 · 動免疫作用（分別進行三次實驗） …、.體重約100克的歐洲尖吻驢（刀化己刀力 係養育於裝有經由一循環系統内的生物過濾器所 供應之經UV滅菌的海水的玻璃水瓶裡。水溫固定為23±i 〇c 且鹽度為35%。。 免疫血清之製造：針對5 5kDa蛋白質的超免疫血清係 以3劑經佛氏不完全佐劑乳化的純化蛋白質在兔子體内激 25 1362271 起。純化的P55蛋白質係如下所製備。如以上實施例】所 描述而製備之來自MT1415菌株的濃縮培養上清液係受考馬 斯藍SDS-PAGE分析。經電泳分離後，將55k])a區帶從膠I 切下來，在沖提缓衝溶液（0.02% SDS，1〇mM β_巯基乙醇， 34 mg/ml PMSF)内切成小塊以及在4〇c下搖動培育過夜。 然後使丙烯醯胺懸浮液在4°C下以3000g離心15分鐘。將 上清液收集並以相同上清液條件再次離心。將上清液收 集、冰凍於-80°C以及冷凍乾燥。然後將經冷凍乾燥的蛋白 質再懸洋於2毫升蒸餾水當中並用丙酮（9〇% v/v)使該蛋白 質於-20oC下沉澱一夜。該沉澱蛋白質係藉由在4〇c以3〇〇〇g 離心10分鐘來復原：，以90% (v/v)丙酮沖洗，在室溫下乾 燥過夜並在PBS内再懸浮❶兔子在最終免疫的一星期之後 被採血。控制組血清係為來自同隻兔子的免疫前血清。 激發：將發光菌殺魚亞種PTAVSA95菌株解凍並培育在 含有1% NaCI的胰蛋白腺大豆洋菜（TSA_1：)當中。讓培養生 長過夜，然後再懸浮於含有1% NaCI的胰蛋白腺大豆肉湯 洋菜(TSB-1)當中。細菌密度係由分光光度法（― DU-65)於600nm測量’並稀釋直到達到藉由先前所測定的 吸收度/CFU曲線所預測之預期菌落形成單位（CFU)數目。用 作為激發劑量的實際CFU係由稀釋於TSB_卜塗在TSA_i培 養盤上及在24。(：下培育48小時之後所發育的總數來檢查。 將激發接種體吸入針筒内，藉由腹膜内（i p.)注射ι〇〇μΐ 至母條魚。為了確認死亡原因，病原體係藉由培養於 上而從頭腎及/或死魚中再分離出來。 26 1362271 在接種與激發之前，所有的魚係麻醉於〇. 003 %(v/v) 的乙一辱單齡謎當中。 實驗1 藉由腹膜内注射使8條魚一組中的每條魚接受i〇〇w 兔子為針對55kDa蛋白質被激起的抗血清之—次採血。8條 魚一組中的每條魚以相同方式接受3〇〇μ1兔子抗血清的一 次採血。最後一組8條魚的控制組中的每條魚接受3〇〇μ1 正常兔子血清。由於發光菌感染所導致之極為獨特的死亡 率的緣故，並不需要任何負向控制組。來自各個測試組的 魚係養育在分開的水槽裡。於接種後不久仍處於麻醉狀態 時，讓每條魚接受一劑有2_ 24 X 1〇7發光菌菌落形成單= (CFUs)的激發劑。 實驗2 藉由i · ρ·注射使一組8條魚中的每條魚接受3〇〇μ1兔 子為針對55kDa蛋白質被激起的抗血清的一次採血。一組8 條魚中的每條魚接受SOOpi兔子抗血清的二次採血。一組8 條魚的控制組中的每條魚接受3 〇 〇 μ 1正常兔子血清。來自 各個測試組的魚係養育在分開的水槽裡。於接種後不久仍 處於麻醉狀態時，讓每條魚接受一劑有187χ 1〇7發光菌菌 洛形成早位（CFUs)之激發劑量。 實驗3 藉由1. ρ·注射使一組8條魚中的每條魚接受3〇〇μ1兔 子為針對55kDa蛋白質被激起的抗血清的二次採血。一組8 條魚的控制組中的每條魚接受30〇μι的正常兔子血清。來 27 1362271 自各個測試組的魚係養育在分開的水槽裡。於接種後不久 仍處於麻醉狀態時，讓每條魚接受一劑有2. 24x 1 07發光菌 菌落形成單位（CFUs )的激發劑。 首批死亡出現在激發後的第1天，最末批死亡則出現 在第5天。之後連續8天不再出現死亡，所以試驗係終止 於免疫與激發後的第15天。 結果 雖然本研究只是一個小規模研究，但已顯示出針對來 自發光菌ECP之55kDa蛋白質的抗體可有效地對抗一實驗 性的激發作用（表1 )。該保護性效應係為顯著的，特別是 考量到兔子的免疫球蛋白被認為並不能活化硬骨魚的補體 串連反應。不僅如此，魚會對兔子的免疫球蛋白發動免疫 反應，使抗體的數量降低，因此讓其效力進一步地降低。 因此，在本研究中所顯示出的保護作用程度係極為顯著的 且令55kDa蛋白質成為用來發展對抗此經濟上重要疾病之 疫苗的關鍵性潛在目標。 表1 實驗 疫苗 累積死亡率（％) RPS 所計算之RPS係相較於： 1 免疫血清 ΙΟΟμΙ/—次血 63 17 控制組兔子正常血清 1 免疫血清 300μΙ/— 次血 38 50 控制組兔子正常血清 1 正常血清 300μ1 75 — n/a 2 免疫血清 300μ1/—次血 25 50 控制組兔子正常血清 2 免疫血清300μ1/二 次血 0 100 控制組兔子正常血清 2 正常血清 300μ1 50 n/a 28 1362271 3 免疫血清300μ1/二 次血 13 67 控制組兔子正常血清 3 正常丘清 300μ1 38 - n/a 實施例4 : P55包涵體與經福馬林失活的ECPs之接種 魚：在接種當時體重約25克的歐洲尖吻鱸 以）魚苗係養育在26±1 〇c、裝有經由 一揭環系統内的生物過濾器所供應之經UV滅菌，及當必要 日可以臭氧滅菌的鹽水（3〇%。）裡。 疫田·泛⑪一包涵體'以pETp55質體（見實施例2) 轉形的BL21大腸桿菌菌株係生長在補充有5〇μ£/ιη丨康那黴 素的LB培養液（LB)裡且振盪過夜。然後將該培養用來接種 在補充有50Mg/ml康那黴素的新鮮lb ( 1 : 1〇〇)當中並在 下搖動生長2小時。藉由添加ιρκ至最終濃度為〇.imM 以誘導細胞且如同上述再繼續生長3小時。藉由離心（15 分鐘，5000 rpm)讓經IPTG誘導的細胞成為丸狀、再次懸 浮在 l〇ml 的緩衝溶液 A(pH7 2 的 1〇mMNaP〇4、〇 2MNa(：I、

ImM EDTA、50 mg/ml 的 PMSF 稀釋 1 : 1 000、1 :ΐ〇〇〇〇β_巯基 乙醇）當中，並在冰裡以聲裂各25秒3次（間隔1分鐘）。 在轉移到微量離心管（每管1 m 1)及離心（15分鐘，13〇〇〇g) 之後’將上清液丟棄並加入1 m 1緩衝溶液A至每管中。然 後藉由在冰裡聲裂各1 〇秒4次（間隔1分鐘）使該沉澱丸 再次懸浮並在離心（15分鐘，13〇〇〇g)後將上清液丟棄。 藉由加入lmi緩衝溶液B (=緩衝溶液a + 1%非離子性界 面活性劑（Triton X-ioo))使沉澱丸再次懸浮且在冰裡聲 裂各1 0秒4次（間隔1分鐘）^在如同上述離心後將上清 29 1362271 液丢棄，藉由在冰裡聲裂各ι〇秒4次（間隔！分鐘）使沉 殿丸再-人懸汗於lml緩衝溶液B當中。該等包涵體係藉由 離。來收集、如同上述再次懸浮於pBs内（pH的最終濃度 為1 mg/ml)並以！ ： ！的佛氏不完全佐劑乳化。 ECPs-來自生長指數中期的發光菌殺魚亞 種的富含55kDa蛋白質（>85%)之細胞外產物（ECps)係同實·· 把例1中所描述者製備。在免疫之前，將Ecps稀釋到每w 有2pg蛋白貝並加入〇·5% (v/v)曱醛（福馬林溶液，

Sigma)於4。(；下24小時使其失去活性。任何殘存的福馬林 * 係藉由加入〇.〇4%〇/幻的2M硫代硫酸鈉來中和◊然後富含 5 5kDa的ECPs係以1 : 1的佛氏不完全佐劑乳化。 接種.藉由1. ρ·注射使一組54條魚中的每條魚接受 5〇μ1的包涵體疫苗。一組43條魚中的每條魚以相同方式接 受50μ1之富含55kDa蛋白質的ECPs疫苗。一組42條魚的 . 技制組（佐劑控制組）中的每條魚藉由i. p.注射接受5 〇 ^工 以1: 1佛氏不完全佐劑乳化的PBS，另一組26條魚（未注 射控制組）則不做任何處理❹來自各個測試組的魚係養育 _ 在分開的水槽裡。 激發：同樣的菌株與如同實施例3描述的流程係用來 製備激發接種體，除了激發劑量改為每條魚的5〇μ1内有5. 2 ' X 106 CFUs。在接種之後於650。D進行激發。為了確認死 亡原因’病原體係藉由培養於TSA-1上而從垂死及/或死魚 的頭腎中再分離出來。 首批死亡出現在激發後的第2天，最末批死亡則出現 30 1362271 8天不再出現死亡，所以試驗係終止 在第8天。之後連續 於激發後的第1 5天。 結果 、=(展示於表2)清楚地指出邮包涵體疫苗以及經 之杏含、p55❸ECP疫苗係均有效於保護魚對抗發光菌 貝/生感染。達到類似程度之保護作用的事實暗示p55— :不是任何其他的污染發光菌或大腸桿菌的蛋白質—是保 表2 疫苗 P55包涵體 累積死亡牟（％) 24 RPS (相較於佐劑控制組） R1 RPS~~· > (相較於未注射控制组） 富含 ECPs 19 01 70 63 Π2 佐劑控制組 62 n/a 5 受注射控制組 65 -6 n/a 實施例5 :以P55包涵體接種以證實對抗日本發光菌菌 株之保護作用。 · ”·、.在接種當時體重約7_1〇克的歐洲尖吻驢 魚苗係養育在 22±l0CoC、裝有經 由一循環系統内的生物過濾器所供應之經UV滅菌，及當必 要時以臭氧滅菌的鹽水（30%。）裡。 疫苗：£_5j包涵體-以pETp55質體（見實施例2) 轉^的BL 21大腸桿菌菌株係生長在補充有5〇 pg/π) 1康那徽 素的LB培養液（LB)裡且振盪過夜。然後將該培養用來接種 在補充有50pg/ml康那黴素的新鮮LB ( 1 : 100 )當中並在 3?°C下搖動生長2小時。藉由添加IPTG至最終濃度為O.lmM 以誘導細胞且如同上述再繼續生長3小時。藉由離心（15 31 1362271 刀鐘’ 5000 rpm ’ SORVAL公司之GS-3旋轉器）讓經iptg

誘導的細胞成為丸狀、每公升培養液以2〇ml的緩衝溶液A (pH 7. 2 的 10mM NaP〇4、0. 2M NaCI、lmM EDTA ' 50 mg/ml 的PMSF稀釋1 : 1 000、1 : 1 0000 β_酼基乙醇）將所得沉澱丸 再次懸浮、轉移到SORVAL SS-34管内（每管i〇mi)並在冰 裡以聲裂各3 0秒3次（間隔1分鐘）。在離心（1 $分鐘， 1 3 000g)之後，將上清液丟棄並加入1〇ml緩衝溶液a至每 管中。然後藉由在冰裡聲裂各30秒4次（間隔丨分鐘）使 s玄沉殺丸再次懸浮並在離心（丨5分鐘，丨3〇〇)後將上清 液丟棄。藉由加入10ml緩衝溶液B (=緩衝溶液A + 1%非 離子性界面活性劑（Triton X-1 〇〇))使沉澱丸再次懸浮且 在冰裡聲裂各3 0秒4次（間隔1分鐘）。在如同上述離心 、 後將上清液丟棄，藉由在冰裡聲裂各30秒3次（間隔i分 鐘）使沉澱丸再次懸浮於lml緩衝溶液B當中。該等包涵 體係藉由離心來收集、如同上述再次懸浮於pBS内並貯存 於- 20〇C直到使用。 ^包涵體的1)55含量係使用牛血清白蛋白（BSA)做為指標 藉由光密度測定法分析一 SDS_PAGE凝膠來測定。p55包涵 體係於PBS内稀釋到所需濃度並以。1的佛氏不完全佐劑 礼化以得到一個使每一劑含有重組p55蛋白質為大約25 毫克的最終濃度。 接種.就接種組而言，有兩組重複的處理（分別為63 ^ 65條魚）以及__組（7()條魚）作為控制組。接種組中的 母條魚係藉由i.p.注射接受1〇〇μ1的包涵體疫苗。每條作 32 1362271 為控制組的魚則藉由i · P.注射接受1 〇〇μ1以i : i的佛氏不 元全佐劑乳化的PBS。來自各個測試組的魚係養育在分開的 水槽裡。 激發：激發接種體係如實施例3所描述者製備，但使 用的發光菌是曰本菌株PP3且激發劑量係每條魚的1〇〇μ1 裡有5· Ο X 1〇3 CFUs。為了確認死亡原因’病原體係藉由 培養於TSA-1上而從垂死及/或死魚的頭腎中再分離出來。 首批死亡出現在激發後的第3天’最末批死亡則出現 在第7天（接種組）及第11天（控制組）。之後連續19 天不再出現死亡’所以試驗係終止於激發後的第3〇天。 結果 結果（展示於表2 )清楚地指出p55包涵體疫苗係有效 ^ f保護魚對抗發光菌PP3日本菌株之實驗性感染。 表3

疫苗 累積死亡率(％) 相較於佐劑控制組所計 算之RPS P55包涵體 18 62 佐劑控制組 (PBS/FIA) 49 N/A 【圖式簡單說明】 第1圖（SEQ ID N0:1)展示從MT1415菌株（發光菌殺 •氧亞種的一株毒性菌株）所辨識到的p55蛋白質之DNA序 列。 第2圖（SEQ Π) N0:2)展示p55的推論胺基酸序列；可 從完整蛋白質上切下來的1 6個胺基酸訊息序列以陰影做記 號0 33

Claims (1)

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公告本_申請專利範 •^\ •年^修(更)正本 100年12月今日修正替換頁 1.綠發先風敌兔、泛後 ^ph〇t〇bacteriuin damselae subsp. pkc/c/心）之經分離或純化的55kDa細胞外蛋白 質，該55kDa細胞外蛋白質具有可導致細胞凋亡的特性， 其中該55kDa細胞外蛋白質包含SEQ ID N〇:2之胺基酸序 列0 2. —種包含SEQ ID NO :2之經分離的胺基酸序列。 3. —種包含SEQ ID NO: 1之經分離的核酸序列或是在 高度嚴苛條件下可與該核酸序列雜交的核酸序列，其中該 尚度嚴苛條件為以lx SSC緩衝溶液和〇. 1% SDS於55〇c沖 洗1小時。 4. 如申呀專利範圍第3項之核酸序列，其編碼seq N0:2。 5. —種疫苗’其包含如申請專利範圍第2項之胺基酸 序列以及藥學上可接受的載體。 6· 士申明專利範圍第5項之疫苗，其中該胺基酸序列 係重組表現蛋白質。 7. 種如申晴專利範圍第2項之胺基酸序列的用途， 其係供作為醫藥品。 8. 種如申請I利範圍帛2項之胺基酸序列的用途， 其係供一製〜造用步as 來預防或治療魚類巴斯德桿菌症 (pasteureii〇sis)之醫藥品。 種為由如申請專利範圍第2項之經分離的胺基酸 序列引起的抗體。 1362271 WO年12月^日修正替換頁 10. —種包含如申請專利範圍第3項之核酸序列的DNA 表現载體，其中該核酸序列係作用性地連接至轉錄調控序 列。 11. 一種以如申請專利範圍第1〇項之dna表現載體來 轉形的宿主細胞。 12. —種疫苗，其包含如申請專利範圍第ι〇項之 表現載體以及藥學上可接受的載體。 如申請專利範圍第5項之疫苗，其係供在易被巴斯 德桿菌症傷害之魚内用來預防或治療該疾病。 14. -種疫苗組成物，其包含富含如申請專利範圍第^ 項之55kDa細胞外蛋白f之經失活的細胞培養上清液或細 胞外蛋白質製備物。 15•如申請專利範圍帛14項之疫苗組成物，其中該經 失活的細胞培養上清液或細胞外蛋白質製備物係該疫苗組 成物之唯一的致免疫性成分。 16_如申請專利範圍第14或15項之疫苗組成物，其中 该細胞已於無補充鐵且沒有鐵螯合劑下培養。 17. 如申凊專利範圍第丨6項之疫苗組成物，其中該細 胞已培養於含有少於15μΜ鐵的培養基當中。 18. 如申請專利範圍第14項之疫苗組成物，其中該細 胞培養上清液係由生長至指數生長中期的細胞培養物所製 備。 19. 如申請專利範圍第14項之疫苗組成物，其可藉由 如包3下列步驟的方法所獲得， 1362271 100年丨2月^日修正替換頁 (a) 使發光菌殺魚亞種細胞在培養中生長； (b) 將上清液自細胞分離； (c )視情況可濃縮該上清液；以及 (d)用失活劑使該上清液失活。 20. —種如申請專利範圍第2項之經分離的胺基酸序列 的用途，其係供製造用於在魚類中診斷發光菌殺魚亞種感 染或巴斯德桿菌症感染的檢驗劑。 21. —種診斷檢驗套組，其包含被固定至基質上之如申 請專利範圍第2項之經分離的胺基酸序列。 22. —種如申請專利範圍第3項之核酸序列的用途，其 係供製造用於在魚類中診斷發光菌⑬魚亞種感染或巴斯德 桿菌症感染的檢驗劑。 23· —種診斷檢驗套組，其包含被固定至基質上之如申 請專利範圍第3項之核酸序列。 24. —種如申請專利範圍第9項之抗體的用途，其係供 裝这用於在魚類中診斷發光菌殺魚亞種感染或巴斯德桿菌 症感染的檢驗齊|J 0 25. —種診斷檢驗套組，其包含被固定至基質上之如申 請專利範圍第9項之抗體。 十一、圖式： 如次頁 3