TWI359154B

TWI359154B -

Info

Publication number: TWI359154B
Application number: TW094130541A
Authority: TW
Inventors: Shiro Kataoka; Takafumi Tomura; Noriko Otani
Original assignee: Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Priority date: 2004-09-06
Filing date: 2005-09-06
Publication date: 2012-03-01
Also published as: JP2008138004A; CN101010427B; TW200621803A; KR100918746B1; EP1801208A1; WO2006028197A1; CN101010427A; CA2579391A1; US20070141054A1; AU2005280975B2; JPWO2006028197A1; AU2005280975A1; JP4088655B2; CA2579391C; US20090299039A1; HK1105993A1; EP1801208A4; KR20070088570A; EP2145954A1; US7579187B2

Description

1359154 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明係關於一種特異性結合於A33抗原之抗A33抗體。進而本發明係關於一種以抗A33抗體作為有效成分且針對起因於表現A33之細胞的疾病之預防或治療劑，尤其是惡性腫瘤治療劑。【先前技術】癌（腫瘤）佔據日本死亡原因之第一位，且患者數量正逐年增加，業者強烈期望開發出有效性及安全性較高之藥劑或治療方法。其中，於1999年度之調查中，大腸癌占全部癌症之12.2%，其死亡率在男性中為第3位，在女性中為第 2位，近年來顯著增加，可預測今後大腸癌之罹患率或死亡率將超過胃癌。又，於1999年度之調查中，胃癌占全部癌症之17_4。/。’其死亡率在男性中為第2位，在女性中為第 1位。一直認為，使用抗體作為治療藥物，其係於各種疾病 (癌型）治療中重要且有價值之手段。藉由抗體之特異性，可將通瘤特異性抗原用於治療顯現異種細胞特性之疾病。抗體，與於細胞表面所表現之蛋白質(即腫瘤)特異性抗原相結合，有效地將如此之細胞作為標的。現在，以惡性腫瘤作為對象疾病而使用將存在於細胞膜上之受體即cd2〇作為標的之嵌合體抗體（Rituximab)、及將此2/_作為標的之人類化抗體等單株抗體，確認其治療效果。抗體具有 104697-1000825.doc -6 · 對抗原之特異性較高之特徵，作為抗腫。例如，如，由於可推定若為將腫瘤特異性抗原貝J投與之抗體聚積於腫瘤，故而可期待細胞傷害活性（CDC)或抗體依賴性細血中半衰期較長，瘤劑特別有用。命作4標的之抗體，

細胞死亡之活性之情形時，六他班珥I琢樂劑量減少，藉此於腫瘤特異性抗原上存有如誘導 F，藉由投與具有激動活性之抗體’又’於腫瘤特異性抗原與細胞增瘦及生存相關之情形時，藉由投與具有中和活性之抗體，可期待腫瘤特異性抗體聚積、及藉由抗體活性使腫瘤停止增殖或退縮^如上所述，考慮到上述特徵劑0 一般遇為適合將抗體用作抗腫瘤為推展最初之抗體製造，而使用小鼠作為對象動物。然而，因許多理由，小鼠抗體於活體内之使用受到限制。被人類伤主辨識為外來物之小鼠抗體’引起所謂"人類抗小鼠抗體•，即"HAMA"反應（參照 Schiff等，Cane. Res.(1985)， 45 ’ 879-885)。進而，小鼠抗體之Fc部分，對人類補體或細胞傷害活性之刺激並非有效。現開發有用以避免如此問題之手段之一的嵌合體技 (參照歐州專利申請120694及125023) »嵌合體抗體，包含 104697-1000825.doc 1359154 來自兩種或兩種以上抗體之一部分（小鼠抗體之可變區域及人類抗體之不變區域等如此欲合體抗體之優點是，雖然保持小鼠抗體之特徵，但因具有人類Fc故而可刺激人類補體或細胞傷害活性。但，如此之嵌合體抗體，依然會引起"人類抗嵌合體抗體"即"HACA"反應（參照Bruggemann 等 ’ J. Exp. Med，170, 2153-2157, 1989)。進而’開發有經取代之抗體中僅一部分為互補性決定區域（即"CDR")之重組抗體（英國專利GB2188638A案及美國專利第5585089號採用CDR移植技術，產生由小鼠 CDR、人類可變部架構及不變區域所構成之抗體（即"人類化抗體"）（參照Riechmann 等，Nature (1988)，332, 323- 327)。報告有關於在稱為"A33 "之I型細胞膜蛋白質中，針對 Ig超豕族之一的作為腫瘤特異性抗原的抗原之小鼠抗Am 抗體及人類化抗體（參照專利文獻丨及非專利文獻丨至5) ^眾所周知，該抗原與結腸癌及胃癌有關（參照專利文獻2、專利文獻3及非專利文獻6)。又，近年來，使用該人化A33抗體，以結腸癌患者作為對象進行j期臨床試驗（參照非專利文獻4及5)。前者之於抗體單獨投與之報告中，於可投與抗體之11名患者中之1名確認部分反應。又，後者之進行抗體與化學療法併用試驗之報告中，於可投與抗體之12 名患者之3名確認部分反應，於丨名中發現混合反應。近年來，甚至由Genentech公司所開發之AvasUn 104697-1000825.doc 1359154 (Bevacizumab ;人類化抗VEGF(血管内皮生長因子）抗體），於I期臨床試驗中，於與標準化學療法併用中，12 名中1名峰認出部分反應（Margolin K.等。J. ciin_ Oncol. (2001) 19，851-856)。亦根據此’於抗體單獨投與中，u 名中1名確認部分反應，可期待其於大腸癌中表現較高之抗腫瘤效果。然而’如上所述於I期臨床試驗中，人類化A3 3抗體表現出非常高之腫瘤反應，但兩試驗均以5 〇%以上之高概率產生人類抗人類化抗體（即"HAHA") ^饒有趣的是，關於腫瘤反應性高之患者並未確認HAHA。 [專利文獻1]美國專利第5958412號說明書 [專利文獻2]美國專利第5643550號說明書 [專利文獻3]美國專利第5160723號說明書 [非專利文獻 1] King D.J等，British J. Cancer (1995) 72, 1364-1372 [非專利文獻 2] Welt S等，J. Clinical Oncology (1994)， 12, 1561-1571 [非專利文獻3] Welt S等，J. Clinical Oncology (1996)， 14, 1787-1797 [非專利文獻4] Welt S等，Clinical Cancer Res. (2003)， 9, 1338-1346 [非專利文獻 5] Welt S等，Clinical Cancer Res. (2003)， 9, 1347-1353 104697-1000825.doc 1359154 [非專利文獻 6] Garin-Chesa P.G 等，International J. Oncology (1996), 9, 465-471 【發明内容】本發明之目的在：藉由開發一種可結合於A33，且使用藉由ADCC或CDC之免疫系統而特異性攻擊可表現A33之腫瘤細胞，進而並未產生HAHA之抗體，而提供一種以現在難以治療之實心腫瘤為代表之各種惡性腫瘤的預防或治療劑。一般認為，如上所述，將A33抗原作為標的之抗體，適用作抗腫瘤劑。且，若係並不產生HAHA之抗體，則可獲得更高之抗腫瘤效果。因此，本發明者等進行有關於針對 A33之抗體製備的銳意研究結果，成功獲得針對表現A33 之癌細胞展現抗腫瘤效果之單株抗體，進而確定該單株抗體之可變區域之序列，因而完成本發明。即，本發明如下所述。本發明，於其第一實施態樣中，提供一種藉由小鼠-小鼠融合瘤所產生之與A33結合之單株抗體，例如較好藉由 263A17、125M10AA、125M165DAAA、125M96ABA、 125N26F6AA、125Q47BA、125Q54AAAA 或 125R5AAAA 所產生之人類抗體，即單株抗體或其功能性片段。藉由 263A17、125M10AA、125M165DAAA、125M96ABA、 125N26F6AA、125Q47BA、125Q54AAAA 或 125R5AAAA 所產生之單株抗體之類型，為人類免疫球蛋白G(IgG)型。 104697-1000825.doc -10- 1359154 於上述融合瘤中，125M10AA、125M165DAAA、 125M96ABA、125N26F6AA、125Q47BA、125Q54AAAA 或125R5AAAA於2004年8月24曰分別以寄存編號：FERM BP-10107(用於識別之表示：M10)、FERM BP-10106(用於識別之表示：M165)、FERM BP-10108(用於識別之表示：M96)、FERM BP-10109(用於識別之表示：N26)、 FERM BP-10104(用於識別之表示：Q47)、FERM BP-10105(用於識別之表示：Q54)及FERM ΒΡ-1〇1〇3(用於識別之表示：R5)寄存於獨立行政法人產業技術综合研究所專利生物寄存中心（曰本國茨城縣築波市東1 丁目1番地1中央第6)。於本發明之實施形態中，本發明之抗體’係具有產生上述融合瘤之抗體的可變區域之抗體或其功能性片段。於本發明之其他實施形態中，本發明之抗體’亦含有改變亞型之抗體，其係融合瘤263A17所產生之抗體的亞型為人類IgGl、人類IgG2、人類IgG3或人類IgG4之抗體或其功能性片段，融合瘤125M10AA所產生之抗體的亞型為人類 IgGl、人類IgG2、人類IgG3或人類Ig〇4之抗體或其功能性片段，融合瘤125M165DAAA所產生之抗體的亞型為人類 IgGl、人類IgG2、人類IgG3或人類IgG4之抗體或其功能片段，融合瘤125M96ABA所產生之抗體的亞型為人類 IgGl、人類IgG2、人類IgG3或人類IgG4之抗體或其功能性片段，融合瘤125N26F6AA所產生之抗體的亞型為人類 104697-1000825.doc 1359154

IgGl、人類IgG2、人類IgG3或人類IgG4之抗體或其功能性片段，融合瘤125Q47BA所產生之抗體的亞型為人類 IgGl、人類IgG2、人類IgG3或人類IgG4之抗體或其功能性片段，融合瘤125Q54AAAA所產生之抗體的亞型為人類 IgGl、人類IgG2、人類IgG3或人類IgG4之抗體或其功能性片段，或融合瘤125R5AAAA所產生之抗體的亞型為人類 IgGl、人類IgG2、人類IgG3或人類IgG4之抗體或其功能性片段。又，於本發明之其他實施態樣中，本發明提供一種包含融合瘤 263A17 、 125M10AA 、 125M165DAAA 、 125M96ABA、125N26F6AA、125Q47BA、125Q54AAAA 或125R5AAAA所產生抗體之可變區域，且與A33相結合之抗體或其功能性片段。於本發明之實施形態中，本發明之抗體係具有序列號表示為23及25的胺基酸序列之可變區域之抗體或其功能性片段。於本發明之其他實施形態中，本發明之抗體係具有序列號表示為27及29的胺基酸序列之可變區域之抗體或其功能性片段。於本發明之其他實施形態中，本發明之抗體係具有序列號表示為31及33的胺基酸序列之可變區域之抗體或其功能性片段。於本發明之其他實施形態中，本發明之抗體係具有序列號表示為35及37的胺基酸序列之可變區域之抗體或其功能性片段。於本發明之其他實施形態中，本發明之抗體係具有序列號表示為39及41的胺基酸序列之可 104697-1000825.doc •12· 1359154 變區域之抗體或其功能性片段。於本發明之其他實施形態中，本發明之抗體係具有序列號表示為43及45的胺基酸序歹J之可變區域之抗體或其功能性片段。於本發明之其他實 ·. 施形態中，本發明之抗體係具有序列號表示為47及49的胺 • 基酸序列之可變區域之抗體或其功能性片段❶於本發明之其他實施形態中，本發明之抗體係具有序列號表示為51及 53的胺基酸序列之可變區域之抗體或其功能性片段。於本 Φ 發明之其他實施形態中，本發明之抗體係具有序列號表示為87及89的胺基酸序列之全區域之抗體或其功能性片段。本發明進而於其他實施形態中，提供一種作為上述抗體或其功能性片段的抑制腫瘤（例如來自移植入裸鼠之大腸癌細胞株COLO205細胞者）增殖之抗體或其功能性片段。於抑制腫瘤時，於攜帶腫瘤之實驗動物（例如結腸癌細胞荷癌之小鼠模型等荷癌實驗動物，體重設為2〇 g)中，投與 • 本發明之抗體或其功能性片段的量，為10 μΕ/隻至100 μ§/ 隻。例如，至於投與量，可列舉1〇〇 μ§/隻或5 mg/kg，較好是 10 pg/隻或 0.5 mg/kg。於本發明之實施方式中，本發明之抗體具有下述中之任 ' 一特性。 (a)ADCC 試驗於來自正常人類末梢血液之單細胞存在下’針對表現 A33之人類癌細胞顯示抗體依賴的細胞性細胞傷害活性 (ADCC) » 104697-1000825.doc -13- 1359154 (b) CDC試驗於來自人類血清之補體存在下，對於表現A33之人類癌細胞顯示出補體依賴性細胞傷害活性（CDC) » (c) 活體内試驗對攜帶表現A33之人類癌細胞的非人類動物表現出抗腫瘤效果。 (d) 競爭試驗與嵌合體抗A33(包含融合瘤ATCC HB-8779所產生之抗體之重鏈可變區域及輕鏈可變區域、及人類IgGl之重鏈不變區域及輕鏈不變區域）(i)較強競爭（阻斷），（Π)較弱競爭 (部分阻斷）、或（iii)無競爭（非阻斷）。 (e) 免疫組織化學試驗將成人結腸癌組織、成人正常結腸組織及人類正常小腸組織加以染色。本發明進而於其他實施態樣中，提供一種宿主，其選自由可對融合瘤所具有之抗體編碼之核酸或對該抗體之功能性片段編碼之核酸、藉由該核酸所編碼之蛋白質、具有上述核酸之表現載體、具有該表現載體之大腸菌、酵母細胞、尾蟲細胞、嗔乳動物細胞及植物細胞以及哺乳動物所組成之群，上述融合瘤選自融合瘤125M10AA(寄存編號 FERM BP-10107)、125M165DAAA(寄存編號FERM BP-10106) 、 125M96ABA(寄存编號 FtRM BP-10108) 、 125N26F6AA(寄存編號FERM BP-10109)、125Q47BA(寄存 104697-1000825.doc -14· 1359154 編號FERM BP-10104)、125Q54AAAA(寄存編號FERM BP-10105)及融合瘤 125R5AAAA(寄存編號FERM BP-10103) 所組成之群。本發明進而於其他實施態樣中，提供一種抗A33單株抗體或其功能性片段之製造方法，其中包含以下步驟：使對來自選自由融合瘤 263A17、125M10AA、125M165DAAA、 125M96ABA、125N26F6AA、125Q47BA、125Q54AAAA 及融合瘤125R5AAAA所組成之群中之融合瘤的抗A33單株抗體編碼之基因予以分離，例如使重鏈胺基酸序列之可變區域編碼之基因及將輕鏈胺基酸序列之可變區域編碼之基因分離，構築具有該基因之表現載體，將該表現載體導入宿主中，培養該宿主，使之表現該單株抗體，自所獲得之宿主、宿主之培養上清液或宿主之分泌物等培養物中採取抗A33單株抗體或其功能性片段。本發明進而於其他實施方式中，提供一種膜瘤之預防、治療或診斷劑，其含有上述抗體或其功能性片段作為有效成分》至於可預防或治療之腫瘤，可列舉選自由Λ腸癌、結腸癌、直腸癌、胃癌、胰臟癌、乳癌 '黑色素瘤、腎細胞癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巢癌、食道癌、前列腺癌、睾丸癌、中皮膚癌所組成之群中之至少〆種。本發明進而於其他實施形態中，本發明之柷體或其功能性片段具有以下特徵：於移植有COLO205細胞之荷癌裸鼠 104697-1000825.doc •15- 1359154 中，腫瘤移植後，上述抗體或其功能性片段之投與量為ίο 或100 pg/kg，與載體投與群或抗DNP-IgGl抗體投與群相比，可確認有意義之腫瘤抑制。本發明進而係如下抗體：結合於識別抗原決定基之A33 的抗體，該抗原決定基與藉由融合瘤Ml 0(寄存編號： FERM BP-10107)產生之抗體所識別之抗原決定基相同；結合於識別抗原決定基之A33的抗體，該抗原決定基與藉由融合瘤M96(寄存編號；FERM BP-10108)產生之抗體所識別之抗原決定基相同；結合於識別抗原決定基之 A33的抗體，該抗原決定基與藉由融合瘤Ml 65(寄存編號：FERM BP-10106)產生之抗體所識別之抗原決定基相同；結合於識別抗原決定基之A33的抗體，該抗原決定基與藉由融合瘤N26(寄存編號：FERM BP-10109)產生之抗體所識別之抗原決定基相同；結合於識別抗原決定基之 A33的抗體，該抗原決定基與藉由融合瘤Q47(寄存編號： FERM BP-10104)產生之抗體所識別之抗原決定基相同；結合於識別抗原決定基之A33的抗體，該抗原決定基與藉由融合瘤Q54(寄存編號：FERM BP-10105)產生之抗體所識別之抗原決定基相同；以及结合於識別抗原決定基之A33的抗體，該抗原決定基與藉由融合瘤R5(寄存編號：FERM BP-10103)產生之抗體所識別之抗原決定基相同。本說明書包含作為本案之優先權基礎的曰本國專利申請 104697-1000825.doc -16- 1359154 號特願2004-259090說明書及/或揭示於圖面之内容。【實施方式】以下詳細說明本發明。關於A33，已獲得小鼠抗A33抗體及人類化抗A33抗體，亦報告有：使用小鼠抗A33抗體（參照Welt S等，】· Clinical Oncology (1994), 12，1561-1571 ; Welt S等，J. Clinical Oncology (1996), 14, 1787-1797)或人類化 A33 抗體 (參照 Welt S 等，Clinical Cancer Res. (2003)，9，1338-1346 ; Welt S等，Clinical Cancer Res. (2003)，9，1347-13 53)，實施以結腸癌患者作為對象之I期臨床試驗。然而，於抗體投與患者以非常高之確定率產生HAMA或 HAHA，並未達到其後之臨床試驗。另一方面，非常饒有趣味的是，於人類化抗A33抗體之臨床試驗中確認有腫瘤反應性之患者，並未確認有HAHA之產生。本發明之新穎人類抗A33單株抗體為完全人類抗體，已經避免在小鼠抗體或人類化抗體中成為常見問題之對於含有小鼠序列之部分所產生之抗原性。即，於上述臨床試驗報告中，因使用人類化抗體而產生HAHA，但本發明之新穎人類抗A33單株抗體為完全人類抗體，故而避免抗體之抗原性，並未產生HAHA，因此可期待其對結腸癌患者具有較高之抗腫瘤效果。至於該抗體之類型，可使用免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白E(IgE)及免疫球蛋白M(IgM)， 104697-1000825.doc -17· 1359154 較好是IgG。進而至於IgG之亞型，可使用IgGl、 IgG2、IgG3、IgG4，較好是IgGl、IgG2 及 IgG4，更好是 IgGl。以下，藉由將本發明中所使用語句之意義加以明確，而詳細說明本發明。 1.A33及其抗體本發明之抗體，係I型細胞膜蛋白質，係針對Ig超家族之一之A33之抗體。本發明中，所謂"與A33相結合之抗體”，係指對A33或其一部分具有反應性之抗體，或識別A33或其一部分之抗體。所謂"功皞性片段"，係指抗體之一部分（部分片.段），保持一個以上抗體對抗原之作用者，具體可列舉： F(ab')2、Fab'、Fab、Fv、二硫醚鍵 Fv、單鍵 Fv(scFv)、及該等之聚合物等[D.J.King.，Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies., 1998 T.J.International Ltd]。或，所謂"功能性片段"係抗體之片段，且可與抗原結合之片段。本發明中，所謂”人類抗體"，係指來自人類之抗體基因之表現產物即抗體。人類抗體可藉由如下述方式獲得：導入人類抗體基因座，且將抗原投與具有產生來自人類之抗體之能力的基因轉殖動物。至於該基因轉殖動物，可列舉小鼠，可產生人類抗體之小鼠之製作方法，例如揭示於國際公開W0 02/43478號公報。 104697-1000825.doc -18 - 1359154 至於本發明之抗體，例如可列舉：於下述實施例中所揭示之針對表現A33之癌細胞’於低濃度下顯示抗腫瘤效果之各種抗體。於本發明之抗體中，於構成抗體之重鏈及/或輕鏈之各種胺基酸序列中，亦包含由具有缺失、取代或附加有1或數個胺基酸的胺基酸序列之重鏈及/或輕鏈所構成之單株抗體。於本發明之抗體之胺基酸序列中，如上述之胺基酸之部分性改變（缺失、取代 '插入、附加），可藉由部分地改變使該胺基酸序列編碼之驗基序列而導入。該驗基序列之部分性改變可使用已知之部位特異性突變導入法（she specific mutagenesis)藉由固定方法而導入[Pr〇c Natl Acad Sci USA. ’ 1984 Vol 81 : 5662]。於此’所謂抗體，係指包含構成免疫球蛋白之重鏈可變區域及重鏈不變區域、以及輕鏈之可變區域及輕鏈之不變區域的全部區域係來自可編碼免疫球蛋白之基因的免疫球蛋白。本發明之抗體’亦包含具有任意之免疫球蛋白型及同型之抗體。可藉由如下所述之製造方法’製造本發明之抗A33抗體。即，例如將A33、其一部分或其一部分與用以提高抗原之抗原性之適當之載體物質（例如，牛血清白蛋白等）的結合物’根據需要與免疫賦活劑（Freund完全或不完全佐劑等）一併對人類抗體產生基因轉殖小鼠等非人類哺乳動物進行免疫。A33既可使用天然A33，亦可使用重組 I04697-1000825.doc -19- 1359154 A33。或者’可藉由導入可編碼a33之基因，且投與於細胞表面過度表現A33之動物細胞，而進行免疫致敏。單株抗體可藉由以下步驟獲得：將藉由使自免疫致敏動物所獲得之抗體產生細胞與無自我抗體產生能力之骨髓瘤系細胞 (骨髓瘤細胞）融合而獲得之融合瘤加以培養，選擇可將產生對於用於免疫之抗原顯示出特異性親和性之單株抗體的純系。本發明之抗體’亦包含藉由本技藝者所眾所周知之基因工學改變（例如參照歐州專利EP3 141 61號公報）而變成不同之亞型者。即，可使用可編碼本發明之抗體之可變區域的 DNA，使用基因工程方法而獲得與原來亞型不同之亞型抗體。ADCC係指.介以於巨嗟細胞、NK細胞（Natural killer cells ’自然殺手細胞）、嗜中性白血球等表面所表現之Fc 受體’與抗體不變區域相結合’藉此識別細胞，藉由識別之細胞活化而誘導之細胞傷害活性。另一方面，CDC係指：藉由抗體與抗原結合，而由活化之補體系所引起之細胞傷害活性。現已明確：已知該等活性根據抗體亞型之不同而其強弱不同，其原因在於抗體之不變區域之構造不同 (Charles A. Janeway 等 Immunobiology, 1997， Current Biology Ltd/Garland Publishing Inc.)。例如，藉由將本發明之抗體亞型變換為IgG2或IgG4，可獲得對Fc受體之結合度較低之抗體。相反，藉由將本件發明之抗體之亞型變換為IgGl或IgG3，可獲得對Fc受體之結合度較高之抗體。進 104697-1000825.doc •20- 135915.4 而，基因工程學改變本發明之抗體之不變區域之胺基酸序列，或與具有如此序列之不變區域序列相結合，藉此可改變對Fc受體之結合度（參照Janeway CA.Jr.and Travers P.(1997)，Immunobiology,第三版，Current Biology Ltd， /Garland Phulishing Inc_)，或改變對補體之結合度（參照 Mi-Hua Tao等。1993. J. Exp. Med)。例如，可編碼重鏈不變部分之EU編號系統（參照Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication Νο·91-3242)中之第331號脯胺酸（P)之序列CCC突變為可編碼絲胺酸（S)之 TCC，將脯胺酸取代為絲胺酸，藉此改變對補體之結合度。假設考慮到抗癌劑方面之情形’於抗體单獨並無誘導細胞死亡活性之情形時，期望一種抗體，其具有藉由介以 Fc受體之抗體依賴性細胞傷害活性（ADCC)或補體依賴性細胞傷害活性（CDC)的抗腫瘤活性，但於抗體單獨存有誘導細胞死亡活性之情形時，更加期望與Fc受體之結合度較低之抗體。又，考慮到免疫抑制劑之情形時，期望一種抗體，其於僅立體性阻礙T細胞與抗原提示細胞之結合之情形等時，不具有ADCC活性或CDC活性。又，於ADCC活性或CDC活性可成為毒性之原因之情形時，期望有藉由改變 Fc部分之突變或亞型而避免成為毒性原因的活性之抗體。於本發明中，於製造單株抗體時，包含下列作業步驟。即，（1)用作免疫原之生體高分子之純化及/或於細胞表面過度表現抗原蛋白質之細胞的製作、（2)藉由將抗原注射入 104697-1000825.doc -21- 1359154 動物而進行免疫後，採取血液且測^其抗體價而決定摘出脾臟等之時期’其後製備抗體產生細胞之步驟、（3)骨髓瘤細胞(骨髓瘤)之製備、(4)抗體產生細胞與骨髓瘤之細胞融合、（5)產生目的抗體的融合瘤群之篩選，（6)對單一細胞純系之分割（選殖）' (7)根據情形，培養用於大量製造單株抗體之融合瘤、或飼養移植有融合瘤之動物⑻研究以如此方式所製造之單株抗體之生理活性及其識別特異性或檢測作為標識試劑之特性等。 A33存在有多種類型，但因本發明之抗體可識別現在已知之全部A33多型而與之結合，故而即使患者所具有之 A33類型不同，含有本發明之抗體之治療、預防劑亦可有效地發揮作用。以下，按照上述步驟詳細說明抗A33單株抗體之製備方法’但該抗體之製備方法並不限定於此，例如亦可使用脾細胞以外之抗體產生細胞及骨髓瘤。 (1)抗原之純化至於抗原，亦可使用可編碼A33之DNA重組入動物細胞用表現載體中’將該表現載體導入動物細胞所獲得之轉形株。順帶說明，A3 3之蛋白質之一次構造為眾所周知 [GenBank寄存編號仰_005305，序列號12]，故而藉由本技藝者眾所周知之方法，亦可自A33之胺基酸序列化學合成肽，將其用作抗原。又’至於免疫原，將A33之全部長度導入FM3A細胞或 104697-I000825.doc •22· 1359154 L929細胞，於細胞表面過度表現A3 3之細胞亦有效。可藉由可编碼A33蛋白質之DNA重組入動物細胞用表現載體 pAEGFP-Nl(使可編碼改變 pEGFP-Nl [Becton Dickinson Bioscience Clontech公司製造]之EGFP蛋白質之區域刪除）内，而製備pAEGFP-Nl-A33。其中，可編碼A33之DNA、載體、宿主等並非限定於該等。具體而言，以pAEGFP-Nl_A33將FM3A細胞或L929細胞進行轉形而獲得轉形株予以培養，於插入有pAEGFP-Nl載體之細胞中獲得新黴素抗藥性之性狀，以使用有該性狀及小鼠A33抗體（ATCC No . HB-8779)之A33表現的確認作為指標，可製備於其細胞表面過度表現A33之FM3A細胞或 L929細胞。 (2)抗體產生細胞之製備步驟將（1)中所獲得之抗原與Fraund完全或不完全佐劑、或如硫酸鋁鉀之助劑混合，作為免疫原對實驗動物進行免疫。至於實驗動物，最合適的是使用具有產生源自人類之抗體之能力的基因轉殖小鼠，如此之小鼠揭示於富塚等人之文獻中[Tomizuka 等，Proc Natl Acad Sci USA.,2000 Vol 97:722] ° 小鼠免疫時之免疫原投與法，可使用皮下注射、腹腔内注射、靜脈内注射、皮内注射、肌肉内注射、足趾注射等中任一者，較好是腹腔内注射、足趾注射或靜脈内注射。免疫可進行一次，或適當間隔（較好是2週至4週之間隔） 104697-1000825.doc -23- 1359154 反覆進行複數次。其後，測定針對免疫動物血清中之抗原之抗體價’若將抗體價充分變高之動物用作抗體產生細胞之供給源’則可提高以後操作之效果。一般而言，較好是將源自最終免疫後3至5日後之動物的抗體產生細胞，用於其後之細胞融合。作為於此所使用之抗體價之測定法，可列舉：放射性同位7C素免疫定量法（以下稱為"RIA法"）、固相酶免疫定量法 (以下稱為"ELISA法"）、螢光抗體法.、受身血球凝集反應法等各種眾所周知之技術，但就檢測靈敏度、迅速性、正確性、及操作自動化可能性等觀點而言，更為合適的是 RIA法或ELISA法。本發明中之抗體價測定，例如可根據EUS A法藉由以下所揭示之順序實行。首先，使針對人類抗體之抗原吸附於ELISA用96孔培養皿等之固相表面，進而將並未吸附抗原之固相表面藉由與抗原無關之蛋白質、例如牛血清白蛋白（BSA)覆蓋，將該表面洗淨後，作為一次抗體使之接觸於段階稀釋之樣品(例如小鼠血清)，使樣品中之抗A”抗體、.’σ 〇於上述抗原。進而加入經酶標識之針對人類抗體之抗體作為一-人抗體，使之結合於人類抗體洗淨後添加該酶之基f測定根據基質分解之藉由發色而產生之吸光度變化等’藉此計算出抗體價。 (3)骨髓瘤之製備步驟至於骨髓瘤’可使用來自小鼠、大鼠、脉氣、倉鼠、兔 104697-1000825.doc 135915.4 或人類等哺乳動物之無自身抗體產生能力之細胞’ 一般而言，較好是使用自小鼠中所獲得之株化細胞，例如8 -氮烏嗓吟抗藥性小鼠（來自BALB/c)骨髓瘤株P3X63Ag8U.l (P3-Ul)[Yelton，D.E.等 Current Topics in Microbiology and Immunology，81，1-7(1978)]、P3/NSI/l-Ag4-l (NS-1) [Kohler, G.等-European J. Immunology, 6, 511-519 (1976)]、Sp2/〇_Agl4 (SP-2) [Shulman，M.等 Nature, 276， 269-270 (1978)]、P3X63Ag8.653 (653)[Kearney，J. F.等。 J. Immunology，123, 1548-1550 (1979)]、P3X63Ag8 (X63) [Horibata, K, and Harris, A. W. Nature, 256, 495-497 (1975)]等。該等細胞株’以適當之培養基，例如8-氮鳥嘌呤培養基[於添加有麩醯胺、2_酼基乙酵、慶大黴素 (gentamicin)及胎牛血清（以下稱作"FCS")之RPMI-1640培養基中添加有8-氮鳥°票吟之培養基]、Iscove改變Dulbecco 培養基（Iscove’s Modified Dulbecco's Medium ;以下稱為 "IMDM")、或 Dulbecco 改變 Eagle 培養基（Dulbecco's Modified Eagle Medium;以下稱為”DMEM")進行繼代培養，但於細胞融合3至4曰前，以正常培養基（例如，含有 10%FCS之DMEM培養基）進行繼代培養，確保於融合當曰細胞數為2xl07以上。 (4)細胞融合抗體產生細胞，為漿細胞、及作為其前驅細胞之淋巴球，其可自個體任意部位獲得，一般而言可自脾臟、淋巴 104697-1000825.doc -25- 1359154 節、骨髓、扁桃體、末梢血液、或適當組合該等者等中獲得，一般最常用的是脾細胞。最終免疫後，來自獲得特定之抗體價之小鼠中摘出存在抗體產生細胞之部位，例如脾臟，製備抗體產生細胞即脾細胞。其次，可使脾細胞與骨髓瘤融合。至於使該脾細胞與步驟（3)中所獲得之骨髓瘤融合之方法，現在最常用之方法係細胞毒性較少、融合操作亦簡單之使用聚乙二醇之方法。該方法包含例如以下步驟。將脾細胞與骨髓瘤以無血清培養基（例如DMEM)、或構酸緩衝生理食鹽液（以下稱為"PBS”）充分洗淨，將脾細胞與骨髓瘤以細胞數之比為5 : 1至10 : 1左右之方式混合，進行離心分離。除去上清液，將沉澱之細胞群分離後，一面攪拌一面滴下1 ml含有50%(w/v)聚乙二醇（分子量1000至 4000)之無血清培養基。其後，緩慢添加10 mL無jk清培養基後進行離心分離。再次除去上清液，將沉澱之細胞懸濁於含有適量次黃嘌呤·胺基喋呤·胸苷（以下稱為'ΉΑΤ·) 液及人類介白素-6(以下稱為"IL-6")之正常培養基（以下稱為” HAT培養基"）中，分別注入培養用培養皿（以下稱為"培養皿"）之各孔中，於5%二氧化碳氣體存在下，於37°C培養 2週左右。途中適當補充HAT培養基。 (5)融合瘤群之選擇於上述骨髓瘤細胞為8-氮烏嘌呤抗藥性株之情形時，即為次黃嘌呤.鳥嘌呤·磷酸核糖轉移酶（HGPRT)缺失株之情形時，並未融合之該骨髓瘤細胞、及骨髓瘤細胞彼此之 104697-1000825.doc -26- 1359154 融合細胞，於含有HAT之培養基中無法生存。另一方面，抗體產生細胞彼此之融合細胞、或抗體產生細胞與骨髓瘤細胞之融合瘤可生存，但於抗體產生細胞彼此之融合細胞 ‘ 有壽命限制。因此，藉由繼續含有HAT之培養基中之培 . 養，僅殘存抗體產生細胞與骨趙瘤細胞之融合細胞即融合瘤，結果可選擇出融合瘤。關於以菌落狀繁殖之融合瘤，進行自HAT培養基中除去 φ 胺基喋呤之培養基（以下稱為"HT培養基"）的培養基交換。以後，採取培養上清液之一部分，例如藉由eusa法而測定抗A33抗體價。其中，於使用上述融合蛋白質作為 ELISA用抗原之情形時，必需以下操作：以不選擇產生特異性結合於人類IgGiFc區域之抗體的純系之方式，除去該純系。例如可藉由將人類IgG之Fc區域作為抗原之 ELISA荨’確認如此之純系之有無。以上，示例使用8_氮鳥嘌呤抗藥性之細胞株之方法，但 • 亦可根據融合瘤之選擇方法使用其他細胞株，於其情形所使用之培養基組成亦產生變化。 (6)選殖步驟藉由以與(2)中之揭示相同之方法測定抗體價，而將判產生特異性抗體之融合瘤選殖入其他培養皿中，實行殖。至於該選殖法，可列舉：以於培養皿之1孔中含有個融合瘤之方式進行稀釋培養之限制稀釋法、於軟洋膠養基中培養且回收B之軟轉法、藉由顯微操作儀將胞逐個取出培養之方法、藉由細胞分類器分離一個細胞 104697-1000825.doc 1359154 "分類選殖"等，但限制稀釋法較為簡便，經常使用。關於確定抗體價之孔，例如重複2至4次藉由限制稀釋法之選殖，穩定而選擇確認抗體價者作為抗A33單株抗體產生融合瘤株。再者，本發明之人類抗A33單株抗體之產生細胞即小鼠-小鼠融合瘤 125M10AA、125M165DAAA、125M96ABA、 125N26F6AA、125Q47BA、125Q54AAAA 或 125R5AAAA 於2004(平成16)年8月24日，分別依次以寄存編號FERM BP-10107(用於識別之表示：M10)、FERM BP-10106(用於識別之表示：M165)、FERM BP-10108(用於識別之表示： M96)、FERM BP· 10109(用於識別之表示：N26)、FERM BP-10104(用於識別之表示：Q47)、FERM BP-10105(用於識別之表示：Q54)及FERM BP-10103(用於識別之表示： R5)寄存於獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物寄存中心（曰本國茨城縣築波市東1 丁目1番地1中央第6)。 (7)藉由融合瘤培養而製備單株抗體將培養基自HT培養基換成正常培養基，而培養已完成選殖之融合瘤。採用使用有大型培養瓶之旋轉培養、攪拌培養、或中空纖維系統等之培養，而進行大量培養。藉由使用凝膠過濾等該業者所眾所周知之方法，純化該大量培養中之上清液，可獲得抗A33單株抗體。又，藉由於同系統之小鼠（例如BALB/c)或nu/nu小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠或兔等腹腔内使該融合瘤增殖，可獲得含有大量抗A33單株抗體之腹水。至於純化之簡便方法，亦可利用市售之單 104697-1000825.doc -28 · 135915.4 株抗體純化組（例如，MabTrap GII組；Amersham Pharmacia Biotech公司製造）等。分離而獲得之單株抗體，對A33具有較高之抗原特異性。 (8)單株抗體之檢測可以以下之方式決定分離所獲得之單株抗體之同型及亞型。首先，至於鑒定法，可列舉：雙向免疫擴散 (Ouchterlony)法、ELISA法、或RIA法。雙向免疫擴散法較為簡便，但於單株抗體之濃度較低之情形時必需濃縮操作。另一方面，於使用ELISA法或RIA法之情形時，使培養上清液直接與抗原吸著固相反應，進而使用各種對應於免疫球蛋白同型、亞型之抗體作為二次抗體，藉此可鑒定單株抗體之同型、亞型。進而，可藉由拂林羅利一法，及自280 nm處之吸光度 [1.4(OD280)=免疫球蛋白1 mg/mL]而算出之方法等，進行蛋白質之定量。可以如下方式進行單株抗體之識別抗原決定基之鑒定。首先，製作單株抗體識別之分子之各種部分結構。於製作部分構造時，則存有使用眾所周知之寡肽合成技術而製作其分子之各種部分肽之方法；使用基因重組技術而將可編碼目的之部分肽的DNA序列重組入適合之表現質體中，於大腸菌等宿主内外生產之方法等，但為實現上述目的，一般將兩者組合使用。例如，使用本技藝者眾所周知之基因重組技術，製作自抗原蛋白質之C末端或N末端以適當之 104697-I000825.doc -29· 1359154 長度製作依次縮短之一連串多肽後，研究單株抗體針對該等之反應性，決定大致之識別部位。其後，更詳細地，使用本技藝者眾所周知之寡肽合成技術，合成各種其對應部分之寡肽、或該肽之突變體等，調查本發明之預防或治療劑作為有效成分而含有之單株抗體之對彼等肽的結合性，或調查對於該單株抗體與抗原之結合的肽之競爭阻斷活性，藉此限定抗原決定基。至於用於獲得多種寡肽之簡便方法，亦可利用市售之套組（例如： SPOTs組（Genosys Biotechnologies公司製造）、使用多中心合成法之一連串之多中心.肽合成組（Chiron公司製造）等）。又，亦可自融合瘤等之抗體產生細胞選殖可編碼人類單株抗體的基因，重組入適當之載體，將其導入宿主（例如哺乳類細胞細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆蟲細胞、植物細胞等），使用基因重組技術而製備產生之重組型抗體。 (P. J. Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY. P. Shepherd and C. Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS, J. W. Goding., Monoclonal Antibodies: principles and practice.，1993 ACADEMIC PRESS)。本發明亦包含一種核酸，其含有產生本發明之抗體之融合瘤所保有的抗體之基因序列，尤其包含一種下述本發明之融合瘤所產生之抗體的重鏈可變區域及輕鏈可變區域之核酸。於此，於核酸中含有DNA及RNA。 104697-1000825.doc -30· 1359154 自融合瘤製備可編碼單株抗體之基因，可採用藉由PCR 法等而分別製備對單株抗體之L鏈V區域、L鏈C區域、Η鏈 V區域及Η鏈C區域編碼的DNA之方法。引子，可使用抗 • A33抗體基因或自胺基酸序列所設計之寡DNA，至於模 • 板’可使用自融合瘤所製備之DNA。將該等DNA重組入一個適當之載體，而將其導入宿主使其表現，或者將該等 DNA分別重組入適當之载體，而使其共同表現。 φ 於載體中，可使用於宿主微生物中可自律增殖之噬菌體或質體。至於質體DNA，可列舉：來自大腸菌、枯草菌或酵母之質體等；至於噬菌體DNA，可列舉人噬菌體。至於使用於轉形中之宿主，若其係可表現目的之基因者’則並非特別限定者。例如可列舉：細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、動物細胞（c〇s細胞、CH〇細胞等）、昆蟲細胞。將基因導入宿主之方法，可列舉公知之任意方法（例如 • 使用約離子之方法、電穿孔法、原生質球法、醋酸鐘法、磷酸每法、脂轉染法等）。X，至於將基因$入下述動物之方法’可列舉：顯微注射法 '使用電穿孔法或脂轉染法 ·. 而將基因導入ES細胞之方法、核移植法等。於本發明中’可藉由將轉形體加以培養，且自該培養物中採取而獲得抗A33抗體。所謂"培養物"，係指（a)培養上清液、⑻培養細胞或培養菌體或其破碎物、⑷轉形體之分泌物中之任一者。於轉形體之培養中，採用使用適於所使用宿主之培養基之靜置培養法、使用轉瓶之培養法等。 104697-1000825.doc -31· 1359154 於培養後，於菌體内或細胞内生產目的蛋白質之情形時’藉由將菌體或細胞破碎而採取抗體。又，於在菌體外或細胞外生產目的抗體之情形時，直接使用培養液，或藉由離心分離等而除去菌體或細胞。其後，單獨或適當組合使用蛋白質單離純化中所使用之各種層析法的一般生化學方法，藉此自上述培養物中單離純化目的抗體。進而，亦可使用基因轉殖動物製作技術，製作將目的抗體之基因重組入内在性基因之動物宿主，例如基因轉殖牛、基因轉殖山羊、基因轉殖綿羊或基因轉殖豬，而自該基因轉殖動物所分泌之乳汁中大量獲得來自其抗體基因之單株抗體（Wright，G·，等（199l)Bi〇/TeChn〇l〇gy 9，830- 83 4)。於將融合瘤置於試管中培養之情形時，可根據培養細胞種之特性、試驗研究目的及培養方法等各種條件，使用如下營養培養基：用以使融合瘤增殖、維持及保存，於培養上清液中產生單株抗體之已知營養培養基、或自已知之基本培養基中所誘導製備之所有營養培養基。 (9)抗體之性質本發明之抗體，具有下述中之任一特性。 (a) ADCC 試驗於來自正常人類末梢血之單細胞存在下，針對表現之人類癌細胞表現出抗體依賴性細胞傷害活性（ADcc)。 (b) CDC試驗於來自人類血清之補體存在下，針對表現A33之人類癌細胞表現出補體依賴性細胞傷害活性（CDC)。 104697-1000825,doc •32· (C)活體内試驗針對擔持有表現A33之人類癌細胞之非人類動物表現出抗腫瘤效果。 (d) 競爭試驗與嵌合體抗A33(含有融合瘤ATCC HB-8779所產生之抗體之重鏈可變區域及輕鏈可變區域、及人類IgGl之重鏈不變區域及輕鏈不變區域所構成）(i)強競爭（阻斷）、（ii)弱競爭（部分阻斷）、或（Hi)無競爭（非阻斷）。 (e) 免疫組織化學試驗將成人結腸癌組織、成人正常結腸組織及人類正常小腸組織加以染色。至於如此之抗體，例如可列舉：融合瘤263A17、 125M10AA、125M165DAAA、125M96ABA、125N26F6AA、 125Q47BA、125Q54AAAA及融合瘤 125R5AAAA所產生之抗體；125M10AA、125M165DAAA、125M96ABA、 125N26F6AA、125Q47BA、125Q54AAAA 或 125R5AAAA，於2004年8月24曰，分別依次以寄存號FERM BP-10107(用於識別之表示：MiO)、FERM BP-10106(用於識別之表示：M165)、FERM BP-10108(用於識別之表示：M96)、 FERM BP-10109(用於識別之表示：N26)、FERM BP-10104(用於識別之表示：Q47)、FERM BP-10105(用於識別之表示：Q54)及FERM BP-10103(用於識別之表示：R5)寄存於獨立行政法人產業技術综合研究所專利生物寄存中心 104697-1000825.doc -33- 1359154 (曰本國茨城縣築波市東丨丁目丨番地丨中央第6)。 2.醫樂組合物又，含有本發明之人類抗A33抗體之製劑，亦包含於本發明之範圍内β如此之製劑，較好是，除抗體以外，亦含有生理學所容許之稀釋劑或載體，亦可為與如其他抗體或抗生物質之其他藥劑之混合物。於適當之載體中，含有生理性食鹽水、磷酸緩衝生理食鹽水、磷酸緩衝生理食鹽水葡萄糖液、及緩衝生理食鹽水，但並非限定於該等者。或者，將抗體凍結乾燥（冷凍乾燥），如必要時，藉由添加如上述之緩衝水溶液使其再構成而使用。相關之預防或治療劑，可以各種形態進行投與，至於該等之投與方式，可列舉：錠劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、糖漿劑等之經口投與，或注射劑、點滴劑、栓劑等之非經口投與。其技與里，根據症狀、年齡、體重等不同而不同，通常於經口才又與中’對成人為1日約0.01 mg至1〇〇〇 mg，可將該等分為一次或數次投與。又，於非經口投與中，可以皮下注射、肌肉注射或靜脈注射1次投與約〇 mg至丨〇〇〇 mg。本發明亦包含使用本發明之抗體或醫藥組合物之上述疾病之預防或治療法，進而本發明亦包含使用本發明之抗體製造上述疾病之預防或治療劑用途。藉由本發明之抗體或其功能性片段而可預防治療之腫瘤’為大腸癌、結腸癌、直腸癌、胃癌、胰臟癌、乳癌、黑色素瘤、腎細胞癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巢癌、 104697-1000825.doc •34· 135915.4 食道癌、前列腺癌、睾丸癌、中皮膚癌等，適用本發明之抗體之時的腫瘤並非限定於一種，亦可為複數種之腫瘤併發者。 3.製劑例本發明之分子，作為溶解於水或除此外之藥理學所容許之溶液的無菌性溶液或懸濁液之安瓿而供於使用。又，亦可預先將無菌粉末製劑（較好是將本發明之分子凍結乾燥者）填充入安瓿，於使用時以藥理學所容許之溶液稀釋。以下根據實施例，進一步詳細說明本發明，但本發明並非僅限定於其實施例所揭示之態樣者。實施例1小鼠抗A33抗體之製備製備小鼠抗A33抗體，作為用以使用於人類單株抗體產生融合瘤之篩選或各種實驗之陽性對照抗體。自ATCC購入產生小鼠抗A33抗體之AS33融合瘤（American Type Culture Collection(ATCC)No.HB-8779)，按照ATCC之附屬說明書，培養融合瘤。將該融合瘤凍結保存。其後，將 AS33融合瘤移植入含有10%低IgG胎牛血清（Low IgG Fetal Bovine Serum)(Hycloned ^ H eRDFig· ^ ^ M. ^ 公司製造）中。將該移植之融合瘤凍結保存。其次，以抗體純化為目的，將其一部分移植入含有牛胰島素（5 pg/ml、Gibco · BRL公司製造）、人類轉鐵蛋白（5 pg/ml、 Gibco · BRL公司製造）、乙醇胺（0.01 mM，Sigma公司製造）、亞硒酸鈉（2·5χ1(Γ5 mM，Sigma公司製造）、1%低IgG 胎牛血清（Hyclone公司製造）之eRDF培養基（極東製藥公司 104697-1000825.doc -35· 1359154 製造）中。使用燒瓶進行培養，回收培養上清液。測定2 8 Ο nm之吸光度，將1 mg/mL作為1.4 OD，而計算來自回收上清液中之融合瘤之純化抗體濃度。實施例2嵌合體抗A33抗體之製備製備重鏈及輕鏈之不變區域為人類IgGl之嵌合體抗A33 抗體，作為用以使用於人類單株抗體產生融合瘤之篩選或各種實驗之陽性對照抗體。 (1)嵌合體抗A33抗體基因之cDNA選殖與表現載體之製作將於實施例1中所購入之小鼠抗A33抗體產生融合瘤 AS33，置於含有10%胎牛血清（Hyclone公司製造）之DMEM 培養基（Gibco · BRL公司製造）中培養，使用RNA提取試劑 ISOGEN(Nippongene公司製造），根據協議，純化總RNA。其次，藉由 Olig〇texTM-dT30<Super>(TaKaRa Bio公司製造），自總RNA純化poly A+RNA。將所獲得之polyA+RNA (2.5 pg)作為材料，使用SMART RACE cDNA擴增套組 (Becton Dickinson Bioscience Clontech公司），根據其所附之說明書實施選殖實驗，獲得抗體基因可變區域之 cDNA 〇 (1)第一股cDNA之合成 polyA+RNA(2.5 pg)/3 μΐ 5，-CDS引子 1 μΐ SMART ΙΙΑ oligo 1 μΐ 將上述組成之反應液，於70°C培養2分鐘後，添加下述試劑及酶，於42°C培養1.5小時，實行cDNA之合成。 I04697-1000825.doc -36- 1359154 5X第一股缓衝液2 μΐ DTT(20 mM) 1 μΐ dNTP Mix(10 mM) 1 μΐ PowerScript逆轉錄酶 1 μΐ 反應結束後，添加100 μΐ之Tricine緩衝液，於72°C培養7 分鐘。 (2)使用PCR之重鏈基因、輕鏈基因擴增將所獲得之cDNA作為模板，將小鼠抗A33抗體之重鏈 (以下，重鏈亦稱為Η鏈）可變區域及輕鏈（以下，輕鏈亦稱為L鏈）可變區域DNA之3'末端各特異性PCR用引子（Η鏈用：GPAHvR3Nhe(5'-GCC CTT GGT GCT AGC TGA AGA GAC GGT GAC CAG AGT CCC TTG-3，)(序列號 1))、（L鏈用：GPALvR3Bsi、（5，-GTG CAC GCC GCT GGT CAG GGC GCC TG-3’）（序列號 2))之任一方、與SMART RACE cDNA擴增套組所附之UPM引子（與於合成之cDNA之5'末端所製作之共通序列互補之寡核苷酸）作為引子組使用，藉由PCR進行Η鏈讀碼序列與可變區域（以下亦稱為HV)及L鏈讀碼序列與可變區域（以下亦稱為LV)之擴增。使用K0D-Plus-DNA聚合酶（ΤΟΥΟΒΟ公司製造）而製備下列反應液，從而實施cDNA之擴增。無菌水 29.5 μΐ cDNA 2.5 μΐ KOD-Plus-緩衝液（10X) 5 μΐ dNTP Mix (2 mM) 4 μΐ 104697-1000825.doc -37 1359154

MgS04(25 mM) 2 μΐ KOD-Plus-DNA聚合酶（1 unit/μΐ) 1 μΐ 通用引子（Universal primer) 5 μΐ A mix(UPM)(10X) 基因特異性引子（GSP) 1 μΐ 總量 50 μΐ 按照下列條件，實施熱循環之擴增反應。 5次循環： 94。。30秒 72°C 1分鐘 5次循環： 94〇C 30秒 70〇C 30秒 72°C 1分鐘 25次循環 94。。30秒 68°C 30秒 72°C 1分鐘擴增之PCR片段，以乙醇進行沉澱且回收後，以瓊脂糖凝膠電泳加以回收，以使用薄膜之DNA純化組即QIA quick Gel萃取套組（Qiagen公司製造）進行純化。純化之 HV及LV之擴增片段，分別於Zero Blunt TOPO PCR選殖套組（Invitrogen公司製造）之PCR 4 Blunt-TOPO載體進行次選殖，就所獲得之純系之質體DNA，解析插入DNA之鹼基 104697-1000825.doc -38 - 1359154 序列。至於用於決定DNA驗基序列之弓丨子，使用 M13FW(5’-GTA AAA CGA CGG CCA GTG-3，）（序列號3)及 M13RV(5’-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3’)(序列號 4)。於已確定之HV及LV之基因區域中，編碼之抗體之胺基酸序列，與King D. J.等人報告之小鼠抗A33抗體（Br J Cancer. 1995 Dec; 72(6); 1364-72)可變區域之胺基酸序列完全一致。 (3)製作嵌合體抗A33抗體之表現載體（N5KG1_ mVhCA33) 將含有所獲得之抗體之HV鏈之質體DNA作為模板，以附加用於與末端相連接之限制酶部位之方式使用設計之引子（用於擴增之引子組GPAHv2F5Sal(5’-AGA GAG AGG TCG ACC CAC CAT GAA CTT TGG GCT GAG CTT AGT T-3')(序列號5)及引子GPAHvR3Nhe(序列號1))，以PCR擴增小鼠抗A33抗體之HV(94°C 3分—94°C 10秒、68°C 45秒 (35次循環）—72°C 7分）。於純化HV之擴增片段後，以PCR 4 Blunt-TOPO載體進行次選殖。就次選殖，進行插入部分之DNA鹼基序列解析，選擇具有按照與作為模板之基因序列並無差異之設計的序列之質體DNA。以限制酶Sail及 Nhel將該質體DNA進行消化，以瓊脂糖凝膠電泳將約440 bp之DNA加以回收且純化。另一方面，就載體即N5KG1-Val Lark(IDEC Pharmaceuticals，N5KG1(美國專利 6001358 號案）之改變載體），同樣地以限制酶Sail及Nhel進行處理後，作為脫磷酸化處理，以鹼性磷酸酶（E. coli C75) (TaKaRa Bio公司製造）加以處理後，以瓊脂糖凝膠電泳及 104697-1000825.doc •39· 1359154 DNA純化套組回收約8.9 kb之DNA。將該等兩個片段以 DNA接合套組Ver2.1(TaKaRa Bio公司製造）進行接合反應後，導入大腸菌DH5a而獲得轉形體。篩選轉形體而選擇插入作為目的之HV之純系、N5KGl_gPA33Hv(純系#2)。為將Lv插入如此獲得之N5KGl_GPA33Hv，而依次以限制酶Bglll及BsiWI切斷原質體DNA，進而進行脫磷酸化後，純化約9_2 kb之載體DNA。另一方面，將含有小鼠抗A33 抗體之LV之質體DNA作為模板，以PCR擴增LV區域。用於擴增之引子組，使用GPALv2FBgl(5'-AGA GAG AGA GAT CTC TCA CCA TGG GCA TCA AGA TGG AGT TTC AG-3')(序列號6)及GPALvR3Bsi(序列號2)。對純化之LV之擴增片段，以PCR 4 Blunt-TOPO進行次選殖。就次純系，進行插入部分之DNA鹼基序列解析，選擇具有與作為模板之基因序列並無差異之設計的序列之質體DNA。以限制酶 Bglll及BsiWI將該DNA消化，以瓊脂糖凝膠電泳將約400 bp之DNA加以回收且純化。將該DNA接合於以限制酶Bglll 及BsiWI進行切斷處理之上述N5KG1.A33HV載體片段相，導入大腸菌而獲得轉形體。篩選轉形體，選擇插入作為目的之LV之純系、及N5KGl_GPA33HvLv(純系#2)。大量純化最終所獲得之嵌合體抗A33抗體表現質體DNA，從而確認L鏈與Η鏈之DNA片段插入片段與其插入部位周邊之 DNA鹼基序列中並無突變。以下分別表示可編碼嵌合體抗Α33之重鏈可變區域及輕鏈可變區域之DNA，以及重鏈可變區域及輕鍵可變區域之 104697-1000825.doc -40- 1359154 胺基酸序列。 <嵌合體抗A3 3重鏈核酸序列 >(序列號7)

10 20 30 ATGAACTTTG GGCTGAGCTT GATTTTCCn 70 80 90 GTGAAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCTTA 130 140 150 TGTGCAGCCT CTGGATTCGC TTTCAGTACC 190 200 210 GAGAAGAGGC TGGAGTGGGT CGCAACCATT 250 260 270 GACAGTGTGA AGGGCCGATT CACCATCTCC 310 320 330 CAAATGAGCA GTCTGAGGTC TGAGGACACG 370 380 390

GTCCCGTTTG CTTACTGGGG CCAAGGGACT 40 50 60 GTCCTAATTT TAAAAGGTGT CCAGTGTGAA 100 110 120 GTGAAGCCTG GAGGGTCCCT GAAACTCTCC 160 170 180 TATGACATGT CTTGGGTTCG CCAGACTCCG 220 230 240 AGTAGTGGTG GTAGTTACAC CTACTATTTA 280 290 300 AGAGACAGTG CCAGGAACAC CCTATACCTG 340 350 360 GCCTTGTATT ACTGTGCACC GACTACGGTA 400 410 420 CTGGTCACCG TCTCTTCAGC TAGC...... <嵌合體抗A33重鏈胺基酸序列 >(序列號8) 10 20 30 40 50 60

MNFGLSLIFL VLILKGVQCE VKLVESGGGL VKPGGSLKLS CAASGFAFST YDMSWVRQTP 70 80 90 100 110 120

EKRLEWVATI SSGGSYTYYL DSVKGRFTIS RDSARNTLYL QMSSLRSEDT ALYYCAPTTV 130 140 VPFAYWGQGT LVTVSSAS.. <嵌合體抗A33輕鏈核酸序列 >(序列號9)

10 20 30 ATGGGCATCA AGATGGAGTT TCAGACCCAG 70 80 90 GGTGTTGATG GAGACATTGT GATGACCCAG 130 140 150 GACAGGGTCA GCATCACCTG CAAGGCCAGT 190 200 210 CAACAGAAAC CAGGGCAGTC TCCTAAAACA 250 260 270 GGAGTCCCTG ATCGCTTCAC AGGCAGTGGA 310 320 330 AATGTGCAAT CTGAAGACCT GGCAGATTAT 370 380 390

ACGTTCGGCT CGGGGACAAA GTTGGAAGTA 40 50 60 GTCTTTGTAT TCGTGTTGCT CTGGTTGTCT 100 110 120 TCTCAAAAAT TCATGTCCAC ATCAGTAGGA 160 170 180 CAGAATGTTC GTACTGTTGT AGCCTGGTAT 220 230 240 CTGATTTACT TGGCCTCCAA CCGGCACACT 280 290 300 TCTGGGACAG ATTTCACTCT CACCATTAGC 340 350 360 TTCTGTCTGC AACATTGGAG TTATCCTCTC 400 AAACGT.... <嵌合體抗A33輕鏈胺基酸序列 >(序列號10) 104697-1000825.doc -41- 1359154 10 20 30 40 50 60 MGIKMEFQTQ VFVFVLLWLS GVDGDIVMTQ SQKFMSTSVG DRVSITCKAS QNVRTWAWY 70 80 90 100 110 120 QQKPGQSPKT LIYLASNRHT GVPDRFTGSG SGTDFTLTIS NVQSEDLADY FCLQHWSYPL 130 140 TFGSGTKLEV KR........ 重鏈核酸序列（序列號7)中之抗體可變區域與抗體不變區域之邊界，位於第408號之腺嘌呤（A)與第409號之烏嘌呤 (G)之間，重鏈胺基酸序列（序列號8)中之抗體可變區域與抗體不變區域之邊界，位於第136號之絲胺酸（S)與第137 號之腺嘌呤（A)之間》又，重鏈核酸序列（序列號7)中之信號序列與抗體可變區域之邊界，位於57號之胸腺嘧啶（T) 與58號之鳥嘌呤（G)之間，重鏈胺基酸序列（序列號8)中之信號序列與抗體可變區域之邊界，位於19號之半胱胺酸 (C)與20號之榖胺酸（E)之間。根據以上’喪合體抗A33抗體重鏈之可變區域之核酸序列（序列號7) ’係自58號之鳥嘌呤（G)至408號之腺嘌呤（A) 為止。又’重鍵之可變區域之胺基酸序列（序列號8)，係自 20號之榖胺酸（E)至136號之絲胺酸（S)為止。輕鏈核酸序列（序列號9)中之抗體可變區域與抗體不變區域之邊界，位於393號之腺嘌呤（A)與394號之胞嘧啶（C)之間’輕鏈胺基酸序列（序列號10)中之抗體可變區域與抗體不變區域之邊界’位於131號之離胺酸（1^及132號之精胺酸（R)之間。又’輕鏈核酸序列（序列號9)中之信號序列與抗體可變區域之邊界，位於72號之腺嘌呤（A)及73號之鳥嗓吟（G)之間’輕鏈胺基酸序列（序列號1〇)中之信號序列與 104697-1000825.doc • 42· 1359154 抗體可變區域之邊界，位於24號之鳥嘌呤（G)及25號之天冬胺酸（D)之間。根據以上，嵌合體抗A33抗體輕鏈之可變區域之核酸序列（序列號9)，係自73號之鳥嘌呤（G)至393號之腺嘌呤（A) 為止。又，輕鏈之可變區域之胺基酸序列（序列號10)，係 25號之天冬胺酸（D)至131號之離胺酸（K)為止。合成DNA之鹼基序列表示於下述表5中。將如此製備之嵌合體抗A33重組型抗體表現載體導入宿主細胞，製作重組型抗體表現細胞。於用於表現之宿主細胞中，例如可使用CHO細胞之dhfr缺失株（ATCC CRL-9096)、CHO-Ras(Katakura Y，等，Cytotechnology，31 : 103-109，1999)、HEK293T(ATCC CRL-1 1268)等。藉由電穿扎法或脂轉染法等，將載體導入宿主細胞内。電穿孔法，以限制酶將約2 pg抗體表現載體加以線狀化，使用 Bio-Rad electrophoreter，以 350 V、500 pF之條件，將基因導入4x106個CH0細胞中，且播種入96孔培養皿中。使用 Lipofect AMINE Plus(Gibco · BRL公司製造），根據指南，實施脂轉染法。於導入載體之處理後，添加對應於表現載體之選擇標記物之藥劑，繼續培養。確認菌落後，根據實施例6中所表示之方法，篩選抗體表現株。根據實施例8，進行自篩選之細胞中之抗體純化。實施例3抗原之製備為獲得於免疫原或抗體之篩選等中所使用之A33於細胞膜上過度表現之細胞，而製作A33全長胺基酸之表現質體 104697-1000825.doc -43- 1359154 載體。藉由PCR法，製作可編碼A33之DNA。 (a) 全長A33表現載體之製備為製備全長A33表現載體，而製作保持可編碼A33之 cDNA之質體載體pAEGFP-Nl-GPA33。依以下方法製作 pAEGFP-Nl-GPA33。實行用以於其5·末端附加EcoRI序列、於其3'末端附加Notl序列與終止密碼子之聚合酶連鏈反應（PCR)而修飾完全長A33 DNA(GenBank DNA NM_005814 :序列號11，蛋白質NP_005305 :序列號12)。將自 Becton Dickinson Bioscience Clontech公司所購入之 Human Colon Marathon-Ready cDNA作為模板，合成 A33-F2 S'-GCAGACGAATTCAAGACCATGGTGGGGAAGAT-S' (序列號 13)及 A33-R1 5，-CTCGAGCGGCCGCTCTGCTGCT GGCCTGTCACTGGTCGAGGTG-3，（序列號 14)作為弓I 子，使用KOD-plus DNA聚合酶（TOYOBO公司製造），進行 (94°C、15 秒；60°C、30 秒；68eC、60 秒）χ30 次循環之 PCR 反應。將合成之序列以EcoRI-Not I加以消化，製成EcoRI-Notl片段而分離，連接於以同一酶所裂解之pAEGFP-Nl-載體（削除可對改變 pEGFP-Nl [Becton Dickinson Bioscience Clontech公司製造））之EGFP蛋白質編碼之區域）。將所獲得之質體命名為PAEGFP-N1-GPA33。重組入卩厶£0??-1^1心八33之入33對977匕？之〇0^編碼。以下，實施例中全部PCR之反應溫度調節，使用9700型PCR擴增儀；（株）Perkin Elmer Japan公司製造。 (b) A33表現細胞之製作 104697-1000825.doc -44 - 1359154 將（a)中所製作之pAEGFP-Nl_GPA33導入FM3A細胞（厚生勞動省研究資源庫事業（JCRB)No. 0701)及L929細胞 (ATCC No. CCL-1)之兩個細胞株内，而製作兩種A33表現細胞。於FM3A細胞，使用電穿孔法。將20 pAEGFP-N1-A33載體，使用BTX公司製造之電穿孔法，以350 V、 950 pF之條件，將基因導入5x106個FM3A細胞，播種入6 孔培養孤。於37°C、5.0%二氧化碳下培養48小時後，以成為1 mg/mL之方式添加G418(Gibco · BRL公司製造），培養 1週。使用AS33融合瘤（ATCC No. HB-8779)之培養上清液，確認於細胞膜表面上所表現之A33抗原。實行將AS33 融合瘤培養上清作為一次抗體、將R-藻紅素標識之山羊抗小鼠Ig γ F(ab')2抗體（DACO公司製造）作為2次抗體而使用的流式細胞分選儀（FCM : Becton Dickinson公司製造）解析，於導入有基因之細胞中獲得G418抗藥性之性狀者中，選擇性篩選於細胞膜表面上表現A33之細胞。使用Trans IT-LTl(TaKaRa Bio公司製造）導入L929細胞。依據指南之方法，進行基因導入。於37°C、5.0%二氧化碳下，培養24小時後，以成為1 mg/mL之方式添加 G418(Gibco . BRL公司製造），培養1週。於F1VOA細胞之時同樣，使用AS33融合瘤之培養上清液’確認於細胞膜表面上表現之A33抗原。實行將AS33融合瘤（ATCC No. HB-8779)作為 1 次抗體、將 R-藻紅素標識之山羊抗小鼠 Ig γ F(ab，）2抗體（DACO公司製造）作為2次抗體而使用之流式細胞分選儀（FCM: Becton.Dickinson公司製造）解析’於導入 104697-1000825.doc -45- 1359154 有基因之細胞中獲得G418抗藥性之性狀者中，選擇性分選於細胞膜表面上表現A33之細胞。兩細胞株皆可獲得高表現人類全長A33抗原之單株。將高表現A33抗原蛋白質之FM3A細胞命名為FM3A/ A33，將 L929細胞命名為L929/A33。為使用於篩選免疫原或抗體時之ELISA，而製作 shA33EX-hFc蛋白質》 (c)可溶型細胞膜外A33人類Fc融合蛋白質表現載體之製備為製備可溶型細胞膜外A33人類Fc融合蛋白質表現載體 (以下表示為shA33EX_hFc)，而製作保持可編碼A33之細胞膜外區域的cDNA之質體載體pTracer-CMV-humanFc-A33EXR。以以下之方法，製作 pTracer-CMV-humanFc-A33EXR。進行用以於其5’末端附加EcoRI序列、於其3,末端附加Notl序列及終止密碼之聚合酶連鏈反應（PCR)而修飾含有分泌信號序列之細胞膜外區域A33DNA(序列號 11)。將於（a)中製作之pAEGFP-Nl-A33cDNA作為模板，合成 A33-F2(序列號 13)及 GPA-EXCRR2 5'-CTCGAGCGGCCGCCAGTTCATGGAGGGAGATCTGACG-3'(序列號15)作為引子，使用KOD-plusDNA聚合酶 (TOYOBO 公司製造），進行（94°C、15 秒；60°C、30秒； 68°C、60秒）χ30次循環之PCR反應。將合成之序列以 EcoRI-Notl加以消化，分離成EcoRI-Notl片段，連接於以同一酶所裂解之pTracer-CMV-humanFc載體（將FLAG及人類 IgGl 之 Fc 區域導入改變 pTracer-CMV[Invitrogen Life 104697-1000825.doc -46- 1359154

Technologies公司製造]之Xba I部位與Apa I部位之質體）所獲得之質體，將其命名為pTracer-CMV-humanFc-A33EXR。皆使用DNA自動合成機（型號3948 ;(株）Perkin Elmer Japan Applied Biosisy terns事業部製），根據其指南，而進行PCR用引子等之寡核苷酸之合成[參照Matteucci，M. D. 及 Caruthers, Μ. Η· (1981) J. Am. Chem. Soc. 103，3185-3191]。各寡核苷酸，於合成結束後，進行使其自支持體開裂之脫保護，將所獲得之溶液乾固後溶解於蒸餾水中，使用前凍結保存於-20°C。 (d)shA33EX-hFc蛋白質之表現及純化將於（c)中所構築之shA33EX-hFc蛋白質表現載體導入宿主細胞，製作可溶型細胞膜外A33蛋白質表現細胞。用於表現之宿主細胞，例如可使用CH0細胞之dhfr缺失株 (ATCC CRL-9096) 、 CHO-Ras(Katakura Y.等，

Cytotechnology, 31 ： 103-109，1999)、HEK293T(ATCC CRL-1 1268)等。藉由電穿孔法或脂轉染法等，將載體導入宿主細胞。電穿孔法，以限制酶將約2 pg之shA33EX-hFc蛋白質表現載體線狀化，使用 Bio-Rad electrophoreter，以 350 V、500 pF之條件，將基因導入4χ106個CHO細胞中，且播種入96 孔培養皿。使用 Lipofect AMINE Plus(Gibco · BRL 公司製造），根據指南，實施脂轉染法。於載體之導入處理後，添加對應於表現載體之選擇標記物之藥劑，繼續培養。 104697-1000825.doc -47- 1359154 以以下方法，自培養上清液中純化shA33EX-hFc蛋白質。使用 Hitrap Protein A FF(Amersham Pharmacia Biotech 公司製造），使用PBS作為吸著緩衝液，使用20 mM檸檬酸鈉、50 mM氯化鈉（pH值2.7)作為溶出緩衝液，進行親和層析法，純化含有shA33EX-hFc蛋白質之培養上清。於溶出部分中添加50 mM磷酸鈉溶液（pH值7.0)而製成pH值5.5。使用Amicon Ultra-15(Amicon公司製造），將所製備之可溶型細胞膜外A33蛋白質溶液置換為PBS，以孔徑0.22 μιη之薄膜過濾器MILLEX-GV(Millip0re公司製造）過濾滅菌，獲得純化shA33EX-hFc蛋白質。測定280 nm之吸光度，將1 mg/mL設為1.4 OD，而計算shA33EX-hFc蛋白質之濃度。實施例4人類抗體產生小鼠之製作於免疫中所使用之小鼠，於内因性Ig重鏈及κ輕鏈破壞之兩者方面，具有同型接合體之遺傳性背景，且同時保持含有人類Ig重鏈基因座之第14號染色體片段（SC20)及人類 IgK鏈基因轉殖（KCo5)。藉由具有人類Ig重鏈基因座之系統A之小鼠與具有人類IgK鏈基因轉殖之系統B之小鼠的交配，而製作該小鼠。系統A，於内因性Ig重鍵及κ輕鍵破壞之兩者方面，係同型接合體，係保持可子孫傳達之第14號染色體片段（SC20)之小鼠系統，例如於富塚等人之報告 [Tomizuka.等，Proc Natl Acad Sci USA.，2000 Vol 97 : 722]中所揭示。又，系統B，於内因性Ig重鏈及K輕鏈破壞之兩者方面，係同型接合體，係保持人類IgK鏈基因轉殖 (KCo5)之小鼠系統（基因轉殖小鼠），例如於Fishwild等人 104697-1000825.doc -48- 1359154 之報告[Nat Biotechnol，（1996)，114:845]中所揭示。將藉由系統A之雄小鼠與系統B之雌小鼠、或系統A之雌小鼠與系統B之雄小鼠交配而獲得之血清中同時檢測出人 Ig 重鏈及 κ 輕鏈之個體[Ishida & Lonberg，IBC's 11th Antibody Engineering，Abstract 2000]用於以下之免疫實驗。再者，可藉由締結契約，自KIRIN有限公司獲得上述人類抗體產生小鼠（稱為KM小鼠）。實施例5針對A33之人類單株抗體之製備根據如單株抗體實驗操作入門（安東民衛等著作，講談社發行1991)等中所揭示之一般方法，製備本實施例中之單株抗體。作為免疫原之A33，使用於實施例1中所製備之 A33表現FM3A細胞或shA33EX-hFc蛋白質。被免疫動物，使用於實施例2中製作之產生人類免疫球蛋白之人類抗體產生小鼠。以針對A33之人類單株抗體之製備為目的，於人類抗體產生小鼠中，將於實施例3中所製備之A33表現FM3A細胞 (1><107細胞/隻）於腹腔内與11181佐劑（(：〇1^&公司製造）混合，進行初次免疫。自初次免疫以後，將同細胞與RIBI佐劑進行每週8次免疫。於取得以下所述之脾臟3天前，尾靜脈投與shA33EX-hFc蛋白質20 gg /小鼠個體，及皮下投與5 pg重組體人類IL-6/小鼠個體。又，將shA33EX-hFc蛋白質10 μβ/小鼠個體與CpG佐劑 (Qiagen公司製造）混合，進行初次免疫。自初次免疫以後，以同蛋白質與CpG佐劑每2週進行2次免疫，進而於2 104697-1000825.doc -49· 1359154 週後，僅以同蛋白質免疫。於取得下述之脾臟3天前，尾靜脈投與shA33EX-hFc蛋白質10 μέ/小鼠個體。又，將shA33EX-hFc蛋白質10 μδ/小鼠個體及Α33表現卩]\43八細胞（5><106細胞/隻）與11181佐劑一併於腹腔内免疫，每2週免疫1至4次。於取得下述之脾臟之4天前，腹腔内投與shA33EX-hFc蛋白質5 pg/小鼠個體。以外科方式自被免疫之小鼠取得脾臟，置於10 mL之含有350 mg/mL碳酸氫鈉、50單位/mL青黴素、50 pg/mL鏈黴素之無血清DMEM培養基（Gibco · BRL公司製造）（以下稱為'·無血清DMEM培養基"）中，於網眼（Cell Strainer : Falcon公司製造）上，使用抹刀押碎。將通過網眼之細胞懸濁液加以離心而使細胞沉澱後，將該細胞以無血清DMEM 培養基洗淨2次後，懸濁於無血清DMEM培養基中，測定細胞數。另一方面，於含有10%FCS(Sigma公司製造）之 DMEM培養基（Gibco · BRL公司製造）（以下稱為"添加血清之DMEM培養基"）中，同樣以無血清DMEM培養基，於 37°C、5%二氧化碳存在下，洗淨以細胞濃度未超過lxl06 細胞/mL之方式進行培養之骨髓瘤細胞SP2/0(ATCC No. CRL-1581)，懸濁於無血清DMEM培養基中而測定細胞數。將回收之細胞之懸濁液與小鼠骨髓瘤懸濁液以細胞數 5 : 1加以混合，離心後完全除去上清液。於該顆粒物中，一面以吸管之前端攪拌顆粒物，一面缓慢添加1 mL作為融合劑之 50%(w/v)聚乙二醇 1500(Boehringer Mannheim 公司製造）後，分2次緩慢添加1 mL事先加溫至37°C之無血清 104697-1000825.doc -50- 1359154 DMEM培養基，進而添加7 mL無血清DMEM培養基。離心後，將除去上清液所獲得之融合細胞藉以下所揭示之限制稀釋法供與篩選。藉由於含有10%FCS、IL-6(10 ng/mL)(或10%融合瘤選殖因子（以下稱為nHCF": BIOBASE公司製造）)及次黃嘌呤（H)、胺基喋呤（A)、胸腺嘧啶（T)(以下稱為"HAT·· : Sigma公司製造）之DMEM培養基中進行培養，而進行融合瘤之選擇。進而，使用含有 HT(Sigma 公司製造）、10% FCS、IL-6(或 10%HCF)DMEM 培養基，藉由限制稀釋法製成單株。於96孔微量滴定盤 (Becton Dickinson公司製造）中進行培養。藉由以下述酶標識免疫吸著分析（ELISA)及流式細胞儀（FMC)測定，而實行產生抗A33人類單株抗體之融合瘤純系之選擇（篩選）及各融合瘤所產生之人類單株抗體之特徵附加。藉由實施例6中所述之細胞ELISA、蛋白質ELISA、以及 FMC解析，獲得大量融合瘤，其具有人類免疫球蛋白γ鏈 (hlgy)及人類免疫球蛋白輕鏈κ、且產生對Α33有特異性反應性之人類單株抗體。再者，於包含本實施例之以下任一實施例中，以及於表示實施例中之試驗結果的表或圖中，使用記號命名產生各本發明之人類抗A33單株抗體的融合瘤純系。又，於該記號前後附加"抗體”者，係指藉由各融合瘤而產生之抗體、或藉由保持自該融合瘤所分離之抗體基因（全長或可變區域）之宿主細胞而生產之重組抗體。又，於上下文所明確之範圍中，有時融合瘤純系之名稱表示抗體之名稱。以下之融合瘤純系，表示單株：263A17、 104697-1000825.doc -51 - 1359154 125M10AA 、 125M165DAAA 、 125M96ABA 、 125N26F6AA 、 125Q47BA 、 125Q54AAAA 及 125R5AAAA 。 125M10AA 、 125M165DAAA 、 125M96ABA、125N26F6AA ' 125Q47BA ' 125Q54AAAA 或125R5AAAA，於2004年8月24日，分別依次以寄存號 FERM BP-10107(用於識別之表示：M10)、FERM BP-10106(用於識別之表示：M165)、FERM BP-10108(用於識別之表示：M96)、FERM ΒΡ·1019(用於識別之表示： Ν26)、FERM ΒΡ·10104(用於識別之表示：Q47)、FERM BP-10105(用於識別之表示：Q54)及 FERM ABP-10103(用於識別之表示：R5)寄存於獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物寄存中心（曰本國茨城縣築波市東1 丁目1番地1中央第6)。實施例6具有人類免疫球蛋白γ鏈（hlgy)及人類免疫球蛋白輕鏈κ(Ικ)之人類抗A33單株抗體產生純系之選擇於細胞ELISA之情形時，以以下方式實施。於96孔培養皿（Falcon公司製造）之各孔中添加1 xlO5個實施例3中所製作之FM3A/A33後，添加融合瘤上清液，於4°C培養30分鐘。其次，以加入2% FCS之PBS洗淨2次，添加以辣根過氧化物酶標識之山羊抗人類IgG F(ab')2抗體（50 pg/孔： IBL公司製造），於4°C培養30分鐘。以添加2%FCS之PBS洗淨2次，於各孔中添加每次100 pL之TMB發色基質（DAKO 公司製造），於室溫下培養20分鐘。於各孔中添加0.5 Μ硫酸（100 μυ孔）而終止反應。以微盤分析儀（1420 ARVO多 104697-1000825.doc •52- 1359154 重標定冷光偵測技術儀：WALLAC公司製造）測定波長450 nm(參考波長570 nm)處之吸光度，選擇顯示陽性反應之抗體產生純系。此時，使用並未表現A33抗原之FM3A細胞作為陰性對照。即，選擇於FM3A/A33細胞反應、於FM3A細胞不反應之培養上清液，作為顯示陽性反應之抗體產生純系。又，於蛋白質ELISA之情形時，以以下方式實施。將於實施例3中所製備之shA33EX-hFc蛋白質製備成1 pg/ml碳酸緩衝液，pH值9.4，將其每50 μΐ添加入ELIS A用96孔微盤（Maxis orp，nunc公司製造）之各孔，於室溫培養1小時或於4°C培養一晚，使shA3 3EX-hFc蛋白質吸著於微盤上。其次，除去上清液，於各孔中添加加入有10%FCS之PBS，於 3 7°C培養1小時，阻斷shA33EX-hFc蛋白質未結合之部位。如此，製作以shA33EX-hFc蛋白質塗布各孔之微盤。於各孔中添加各個融合瘤之培養上清液（50 μΐ)，使之於室溫下反應1小時後，以含有0.1% Tween 20之PBS(PBS-T)將各孔洗淨2次。其次，以含有0.1% Tween 20之PBS(PBS-T)將以辣根過氧化物酶標識之綿羊抗人類IgK抗體（50μ1/孔、The Binding Site公司製造）稀釋2500倍，將50 μΐ如此之溶液添加至各孔中，於37°C培養1小時《將微盤以PBS-T洗淨3次後，將每100 μΐ之TMB發色基質液（DAK0公司製造）添加至各孔中，於室溫培養20分鐘。於各孔中添加0.5 Μ硫酸 (100 μΐ/孔），終止反應。以微盤分析儀（VersaMax、 Molecular Devices公司製造）測定於波長450 nm(參考波長 104697-1000825.doc •53· 1359154 570 nm)處之吸光度，選擇顯示陽性反應之抗體產生純系。進而，於FMC之情形時，以以下之方式實施。進行融合瘤培養上清液針對表現A33抗原之人類大腸癌細胞株 COLO205細胞之反應性研究。以2xl06/ml濃度，使 COLO205細胞株浮游於含有0.1% NaN3、2°/。FCS之PBS之染色緩衝液（SB)中。將細胞浮游液（50 μΐ/孔）分別注入96-孔圓底培養| (Becton Dickinson公司製造）中。添加各個融合瘤之培養上清液（50 μΐ)，於冰溫下培養3 0分鐘。陰性對照，根據各亞型，使用人類IgGl抗體（Sigma公司製造），以融合瘤培養培養基製備成2 pg/ml之濃度，添加50 μΐ後於冰溫下培養30分鐘。以SB進行2次洗淨後，添加50 μΐ RPE螢光標識山羊抗人類IgG F(ab')2抗體（Southern Biotech 公司製造），於冰溫下培養30分鐘。以SB進行1次洗淨後，懸濁於300 μΐ之FACS緩衝液中，以FACS(FACScalibur， Becton Dickinson公司製造）測定各細胞之平均營光強度。其結果，因與COLO205細胞株具有較強結合活性，故而判明其係與於細胞中所表現之A33相結合之抗體。實施例7各單株抗體培養上清液之亞型鑒定將shA33EX-hFc蛋白質製備成1 pg/ml碳酸緩衝液（以下稱為"PBS")，將其每50 μΐ添加入ELISA用96孔微盤 (Maxisorp，Nunc公司製造）之各孔中，於室溫培養1小時或於4°C培養一晚，使shA33EX-hFc蛋白質吸著於微盤上。其次’除去上清液，於各孔中添加加入有10% FCS之PBS， 104697-1000825.doc • 54· 1359154 於室溫培養1小時或於4°C培養一晚’阻斷shA3 3EX-hFc蛋白質並未結合之部位。如此’製作以shA33EX-hFc蛋白質塗布各孔之微盤。其次，以含有0.1% Tween2〇之PBS(PBS-T)洗淨2次，於各孔中分別添加以辣根過氧化物酶標識之綿羊抗人類IgGl抗體、綿羊抗人類IgG2抗體、綿羊抗人類 IgG3抗體或绵羊抗人類IgG4抗體（分別稀釋1600、6400、 25000、25000倍，50μί/孔 ’ The Binding Site公司製造）’ 於室溫下培養1.5小時。以含有0.1% Tween20之PBS(PBS-T)進行3次洗淨後’將基質緩衝液（TMB ’ 100 μΐ：/孔’ DAKO公司製造）加入各孔中，於室溫下培養20分鐘。其次，添加0.5 Μ硫酸（100 μΐ^/孔）’終止反應。以微盤分析儀（VersaMax，Molecular Devices 公司製造）測定波長 450 nm(參考波長570 nm)處之吸光度，決定各純系之亞型。人類抗A33抗體，因強調ADCC及CDC活性，故僅選擇亞型為

IgGl 者。

僅將最終所選擇之純系之結果示於表1。表1 抗體名亞型針對COLO205之反應性抗 DNP-IgGl IgGl • cA33 IgGl + 263A17 IgGl + 125M10AA IgGl + 125M165DAAA IgGl + 125M96ABA IgGl + 125N26F6AA IgGl + 104697-1000825.doc •55- 125Q47BA IgGl + 125Q54AAAA IgGl + 125R5AAAA IgGl + 1359154 實施例8各抗體之製備以以下方法’自實施例6中所獲得之融合瘤之培養上清液中，純化人類抗A33單株抗體。將含有人類抗A33單株抗體之培養上清液置於含有10%超低IgG FBS(Invitrogen& 司製邊）之SFM培養基（Invitrogen公司製造）中加以培養，將如此之培養上清液使用蛋白質A快速流動凝膠（Protein A Fast Flow gel)(Amersham Pharmacia Biotech公司製造），使用PBS作為吸著緩衝液、使用0.02 M甘胺酸緩衝液（pH值 3.6)作為溶出緩衝液進行親和層析純化。於溶出部分中添加1厘丁出化11值8.0)調整至1)11值7.2附近。將製備之抗體溶液使用Sephadex G25脫鹽管柱（NAP管柱；Amersham Pharmacia Biotech公司製造）置換為PBS，以孔徑0.22 μιη之薄膜過濾器MILLEX-GV(Millipore公司製造）過濾滅菌，獲得純化之人類抗A33單株抗體《測定280 nm處之吸光度，將1 mg/ml作為I.4 OD，計算純化抗體之濃度。實施例9針對A33表現細胞之各單株抗體純化抗體之反應試驗以FCM進行針對表現A33抗原之人類大腸癌細胞株 COLO205 細胞、LoVo細胞（ATCC No. CCL-229)、LS174T 細胞（ATCC No. CL-188)及 NCI-H508細胞（ATCC No.CCL-253)的於實施例8中所取得之各單株抗體純化抗體的反應 104697-1000825.doc •56· 1359154 性之研究。又，亦研究有作為陰性對照細胞之並不表現 A33抗原的人類大腸癌細胞株HT-29細胞（ATCC No. HTB-38)。以2xl06/ml之濃度使各細胞株浮游於含有0.1% NaN3、2%FCS之PBS之染色緩衝液（SB)中。將細胞浮游液 (50 μΐ/孔）分別注入96-孔圓底培養皿（Becton Dickinson公司製造）中。分別添加50 μΐ之以SB調整為濃度2000、400、 80、16 ng/ml之各單株抗體純化抗體，於冰溫下培養30分鐘。陰性對照，根據亞型使用人類IgGl抗體（Sigma公司製造），以SB將其製備成2000、400、80、16 ng/ml之濃度，添加50μ1後於冰溫下培養30分鐘。以SB進行2次清洗後，添加50 μΐ之FITC螢光標識山羊抗人類IgG F(ab')2抗體 (Southern Bio tech公司製造），於冰溫下培養30分鐘。以SB 進行1次洗淨後，使其懸濁於300 μΐ之FACS緩衝液中，以 FACS(FACScan，Becton Dickinson 公司製造）測定各細胞之平均螢光強度。其結果示於表2。於COLO205細胞中，將平均螢光強度半值設為90 ;於LoVo細胞中，將平均螢光強度半值設為 25 ;於LSI 74T細胞中，將平均螢光強度半值設為125 ;於 NCI-H508細胞中，將平均螢光強度半值設為125 ;達到此值之抗體濃度，於ng/ml時表示為+++，於 100<=χ<1000 ng/ml 時表示為++，於 1000<=χ<1 0000 ng/ml 時表示為+，未確認結合時，表示為-。針對表現A33抗原之任意細胞，各單株抗體純化抗體均表現出結合。 104697-1000825.doc -57- 1359154 表2 抗體名 COLO205 LoVo LS174T NCI-H508 trr on 抗 DNP-IgGl - . cA33 +++ -H-+ ++ -Η- 263A17 -Η- Ή- ++ -- 125M10AA +++ +++ +-Η- 125M165DAAA ΉΗ- -ΗΗ- Η- ++ 125M96ABA +-Η- -Η-+ -Η- ++ 125N26F6AA +++ -Η-+ -Η- -Η- 125047BA +++ +-Η- -Η- -Η- 125054AAAA +++ -Η-+ -Η- ++ 125R5AAAA -Η-+ -H-f -Η- ++ 平均螢光铱度半值90 10<=x<10ng/ml ； +++ 100c=x<1000 ng/ml : ++ 1000<=χ<1〇〇〇0 ng/ml ： + 来结合：· 平均螢光強度半偟25 1〇<*χ<100 ng/ml ； +++ lOOc^xclOOOng/ml ; ++ 1〇00<=»χ<10000 ng/ml ： + 来结合：· 平均螢光強度半值125 1(Κ=χ<10 ng/ml ； +++ 100<^<1000 ng/ml ΐ ++ 1000<=χ<10000 ng/ml ： + 未结合：- 平岣螢光強度半值125 1〇<*χ< 100 ng/ml ； +++ 100<=χ<1000 ng/ml ； ++ 1000<=χ<10000 ng/ml ； + 未结合：_ —— 實施例10各單株抗體純化抗體與小鼠抗A33抗體之競爭試驗以使用FCM之競爭實驗，研究實施例8中所取得之各單. 株抗體純化抗體，是否識別與小鼠抗A33抗體同樣之抗原決定基。以2xl06/ml之濃度使COLO205細胞株浮游於含有 0.1% NaNs、2% FCS之PBS之染色緩衝液（SB)中。將細胞籲浮游液（50 μΐ/孔）分批注入96-孔圓底培養皿（Becton Dickinson公司製造）中。於此，將以100 pg/m丨之濃度添加有實施例1中所製備之小鼠抗A33純化抗體者及未添加者， ^ 與1 pg/ml之各單株抗體純化抗體（50 μΐ)—併添加至孔中， ·· 於冰溫下培養30分鐘。使用人類igGl抗體（Sigma公司製造）以SB將未添加抗A33純化抗體之小鼠陰性對照製備成1 pg/ml之濃度，添加50 μΐ後於冰溫下培養30分鐘《以SB進 • 5S · I04697-1000825.doc 1359154 行2次洗淨後，添加50 μΐ之FITC螢光標識山羊抗人IgG F(ab’）2抗體（IBL公司製造），於冰溫下培養30分鐘。以SB 進行1次洗淨後，懸濁於300 μΐ之FACS緩衝液中，以 FACS(FACScan，Becton Dickinson公司製造）測定各細胞之平均螢光強度。根據下列式計算各單株抗體純化抗體與小鼠A33抗體之抑制率：抑制率={100-(100x小鼠A33抗體預培養後之平均螢光強度）/(無小鼠A33抗體之預培養後之平均螢光強度）}。將抑制率為25%以下者命名為"非阻斷”，將25%以上小於90%者命名為"部分阻斷"、將90%以上者命名為"阻斷"。其結果為，將263A17、125M10AA及 125M96ABA分類為"非阻斷"，將125M165DAAA及 125N26F6AA分類為"阻斷"，將 125Q47BA、125Q54AAAA 及125R5AAAA分類為"部分阻斷"。其結果示於表3。表3 抗體名抑制率(％) 分類 cA33 94.2 阻斷 263A17 3.7 非阻斷 125M10AA 5.0 非阻斷 125M165DAAA 96.0 阻斷 125M96ABA 22.8 非阻斷 125N26F6AA 98.0 阻斷 125Q47BA 64.1 部分阻斷 125Q54AAAA 46.5 部分阻斷 125R5AAAA 63.9 部分阻斷 104697-1000825.doc -59- 1359154 實施例11正常人類單細胞之獲取方法最初，根據固定方法而使用Ficoll(Ficoll-PaquePLUS : Amersham Pharmacia Biotech公司製造）製備來自正常人類末梢血液之單細胞。將於含檸檬酸鈉液作為抗凝固劑之採血袋（Terumo公司製造）中所採取之正常人類血液於Ficoll 中多層化，藉由比重離心（800G，於室溫15分鐘）分離單細胞。將中間層抽出作為單細胞，以PBS稀釋，以200G離心分離10分鐘，重複進行3次，除去殘留於上清中之血小板。以以上方法獲得來自正常人類末梢血液之單細胞（以下稱為PBMC)，用作實施例12之PBMC。進而，使用來自 PBMC之CD4+T細胞單離套組n(Milteni Biotech公司製造），根據所附之說明書，使用分離CD4+T細胞之殘留細胞群作為實施例12之PBMC。實施例12各單株抗體純化抗體中之細胞傷害性試驗以抗體介導之細胞傷害性活性，於NK細胞或嗜中性白血球等具有殺手活性之細胞與抗體之存在下，實施對目標細胞之傷害活性（抗體依賴性細胞毒活性（Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity) ，以下為 ADCC)之測定、及於補體與抗體存在下對目標細胞之傷害活性（補體依賴性細胞毒活性（Complement-Dependent Cytotoxicity)以下稱為CDC)之測定。抗體，使用於實施例8中所製備之各單株純化抗體及作為抗A33抗體之對照之cA33重組型抗體。進而，使用抗DNP IgGl抗體作為陰性對照。方法簡單而言，於目標細胞内將放射性鎘（51Cr)埋入細 104697-1000825.doc -60- 1359154 胞質内，以γ射線量測定因細胞死亡而游離於培養液中之 51Cr 量。

具體而言，作為目標細胞將1〇6個大腸癌細胞株 COLO205(ATCC No. CCL-86)及 NCI-H508細胞（ATCC No. CCL-253)懸濁於15 μΐ：胎牛血清（FCS)中，且添加50 pL(37 MBq/mL)之51 Cr標記之鉻酸納（Perkin Elmer公司製造：以下寫為51Cr)，於37°C培養1小時。其次，添加1〇 mL培養基，重複3次離心而捨棄培養基之操作，藉此除去未包埋入細胞内之51Cr。 ADCC分析，相對於5000個51Cr標記之目標細胞，將 5 00000個以實施例1 1所揭示方法所獲得之健康人類末梢血液單細胞，置於V底96孔培養皿（Costar公司製造）中，全體容量為200 μι，根據各抗體濃度於37°C、5%C02存在下，培養4小時。

CDC分析，相對於5000個51Cr標記之目標細胞，將最終濃度為5%之來自人血清之補體（Sigma公司製造）置於V底96 孔培養皿中，全體容量為200 μί，根據各抗體濃度於37°C 5°/〇C〇2存在下培養4小時。與ADCC . CDC分析同時進行培養後，將培養皿離心而將細胞沉澱後，將各單株抗體純化抗體調製成0.4-500 ng/ml，將50 pL移入含有粉末閃爍體之96孔培養皿 (Lumaplate TM-96 : Packard 公司製造）中，於55°C乾燥 1.5 小時。確認乾燥後，以專用蓋（TopSeal TM-A : 96-孔微盤：Packard公司製造）覆蓋培養皿，以閃爍計數器（Top- 104697-1000S25.doc •61 - 1359154

Count : Packard公司製造）測定γ線量。其結果表示於圖1Α至圖ID、表4。ADCC，於COLO205 細胞之情形時，將特異性溶解率半值設為15%，於達到其之抗體濃度為1<=x<1〇 ng/ml時表示為+++，於10<=x<100 ng/ml時表示為++，於100<=χ<1000 ng/ml時表示為+，於並未確認特異性溶解率之情形表示為-。又，於NCI-H508 細胞之情形時，將特異性溶解率半值設為15%，達到其之抗體濃度，於l<=x<l〇ng/ml時表示為+++，於10<=x<100 ng/ml時表示為++，於100<=x<1000 ng/ml時表示為+，於並未確認特異性溶解率之情形表示為-。於CDC中，於COLO205細胞之情形時，將特異性解率半值設為10%，達到其之抗體濃度於10<=x<100 ng/ml時表示為 +++，於 100<=x<1000 ng/ml 時表示為 ++，於 x>=1000 ng/ml時表示為+，於並未確認特異性溶解率之情形表示為-。又，於NCI-H508細胞之情形時，將特異性溶解率半值設為25%，達到其之抗體濃度於10<=x<100 ng/ml時表示為 +++，於 100<=x<1000 ng/ml 時表示為 ++，於 x > =1000 ng/ml時表示為+，於並未確認特異性溶解率之情形表示為-。於ADCC中，cA33及125Q54AA表現出較高之傷害活性。另一方面，於CDC中，125M10AAAA表現較高之傷害活性。 104697-1000825.doc -62- 1359154 表4 細胞名 COLO205 NCI-H508 抗體名 ADCC CDC ADCC CDC 抗 DNP-IgGl - CA33 +-H- - -m- 263A17 125M10AA ++ Ή- -HH- +++ 125165DAAA ++ + H-H- 4-H- +++ +4· 125M96ABA + ++ -Η- + 44· 125N26F6AA -H- - -Η- 125Q47BA -H- ++ 4 丨，4· + 125Q54AAAA -HH- ++ — 125R5AAAA Ή- T t T +++ -- 一 -K- 特異性溶解率半值丨5% 特異性溶解率半值丨0% 特異性溶解率半 10<=x<100 ng/ml ； ++ 100<=x<1000ng/ml ； + 無特異性溶解；· 100<=x<1000 ng/ml ； x>=1000 ng/ml ； + 無特異性溶解；- ^^<=x<IOO ng/ml ； ++ 100<=x<l〇〇〇 ng/ml; x>==100〇 ng/ml ； + 無特異性溶解；- 10<=χ<100 ng/ml; ++ l〇0<=x<l〇〇〇ng/ml ； + 無特異性溶解；·

63 · 104697-1000825.doc 1359154 實施例13可對各單株抗鱧编碼之基因之製備 (1)各單株抗體之cDNA合成將融合瘤 263A17、125M10AA、125M165DAAA、 125M96ABA ' 125N26F6AA ' 125Q47BA ' 125Q54AAAA 及 125R5AAA置於含有 10 ng/mL IL-6或 10% HCF(BIOBASE 公司製造）、10%胎牛血清（Hyclone公司製造）之DMEM培養基（Gibco · BRL公司製造）中培養，藉由離心分離收集細胞後添加ISOGEN(曰本基因（Nippongene)公司製造），根據使用說明書提取Total RNA。使用SMART RACE cDNA擴增套組（Becton Dickinson Bioscience Clontech公司製造），根據附加說明書，進行抗體cDNA之可變區域之選殖。將5 pg之total RNA作為模板，製作第一股cDNA。第一股cDNA之合成 Total RNA 5 pg/3 μΐ 5'CDS 1 μΐ SMART oligo 1 μΐ 將上述組成之反應液於7〇°C培養2分鐘後，添加 5x緩衝液2 μΐ DTT 1 μΐ DNTP mix 1 μΐ

Power Script逆轉錄酶 Ιμΐ 於42°C培養1.5小時。進而，添加100 μΐ之Tricine緩衝液後，於72°C培養7分鐘，取得第一股cDNA » 104697-1000825.doc -64 - 1359154 (2)利用PCR對重鏈基因、輕鏈基因之擴增及鹼基序列的確認 (2)-1 ;使用KOD-Plus-DNA聚合酶（TOYOBO公司製造）製備下列反應液，實施融合瘤263A17之使用PCR之重鏈基因、輕鏈基因之擴增cDNA之擴增。無菌水 29.5 μΐ cDNA 2.5 μΐ KOD-Plus-缓衝液（10X) 5 μΐ dNTP Mix(2 mM) 4 μΐ MgS〇4(25mM) 2 μΐ KOD-Plus-(l unit/μΐ) 1 μΐ 通用引子 A mix(UPM)(10X) 5 μΐ 基因特異性引子（GSP) 1 μΐ 總量 50 μΐ 將上述組成之反應液以再蒸餾水調整最終容量為50 μΐ，供與PCR。 263A17之重鍵基因之擴增’使用SMART RACE cDMA 擴增套組附屬之UPM引子及IgGlp引子（5'-TCTTGTCCACCTTGGTGTTGCTGGGCTTGTG-3，)（序列號 16)，重複30次之98°C 1秒、68°C30秒之循環》另一方面， 263A17之輕鏈基因之擴增，使用UPM引子及hk-2P-GTT GAA GCT CTT TGT GAC GGG CGA GC-3’）（序列號 17)引子，重複30次之98t 1秒、68°C 30秒之循環進行擴增。 (2)-2 ;融合瘤 125M10AA、125M96ABA、125Q47BA、 104697-1000825.doc -65- 1359154 125Q54AAAA及125R5AAAA之藉由PCR之重鏈基因、輕鏈基因之擴增以與（2)-1相同之反應條件進行。125M10AA、 125M96ABA、125Q47BA、125Q54AAAA 及 125R5AAAA 之重鏈基因之擴增，使用UPM引子及IgGlp引子（序列號 16)，重複30次之98°C 1秒、68°C 3 0秒之循環。進而，將1 μΐ該反應液作為模板，使用NUPM引子（SMART RACE cDNA擴增套組；Becton Dickinson Bioscience Clontech公司製造）及 IgG2p/G134 引子（5，-TGC ACG CCG CTG GTC AGG GCG CCT GAG TTC C-3，）（序列號 18)，重複20次之 98〇C 1秒、68°C 30秒之循環》另一方面，125M10AA、 125M96ABA、125Q47BA、125Q54AAAA 及 125R5AAAA 之輕鏈基因之擴增，使用UPM引子及hk-2引子（序列號17)，重複30次之98°C 1秒、68°C 30秒之循環而進行擴增。進而，將1 μΐ該反應液作為模板，使用NUPM引子及hk-5引子 (5'-AGG CAC ACA ACA GAG GCA GTT CCA GAT TTC-3·)(序列號19)，重複20次之98t： 1秒、68°C 30秒之循環。 (2)-3 ;融合瘤 125M165DAAA及 125N26F6AA之藉由 PCR 之重鏈基因、輕鏈基因之擴增以與（2)-1相同之反應條件進行》125M165DAAA及 125N26F6AA之重鏈基因之擴增，使用UPM引子及hh-2引子（5，-GCT GGA GGG CAC GGT CAC CAC GCT G-3')(序列號20)，重複30次之98°C 1秒、68°C 30秒之循環。進而，將該反應液1 μΐ作為模板，使用NUPM引子及hh-4引子（5·- 104697-1000825.doc -66- 1359154 GGT GCC AGG GGG AAG ACC GAT GG-3')(序列號21)，重複20次之98°C 1秒、68°C 30秒之循環。另一方面’ 125M165DAAA及125N26F6AA之輕鏈基因之擴增，使用 UPM弓|子及hk-2弓|子（序列號17)，重複30次之98〇C 1秒、 68°C 30秒之循環而進行擴增。進而，將1 μΐ該反應液作為模板，使用NUPM引子及hk-5引子（序列號19)，重複20次之98°C 1秒、68°C 30秒之循環。將以以上方式所擴增之各個重鏈及輕鏈之PCR片段，以乙醇將其沉澱而回收後，以瓊脂糖凝膠電泳加以回收，以使用薄膜之DNA純化套組即QIA快速凝膠萃取套組（quick Gel Extraction Kit)(Qiagen公司製造）進行純化。純化之HV 擴增片段或LV擴增片段，分別於Zero Blunt TOPO PCR選殖套組（Cloning Kit)(Invitrogen_公司製造）之 PCR 4 Blunt-TOPO載體中進行次選殖，就所獲得之純系之質體DNA，解析插入DNA之鹼基序列。使用Ml3FW(序列號3)及 M13RV(序列號4)作為用於確定DNA鹼基序列之引子。以下分別表示將263 A17之重鏈可變區域及輕鏈可變區域編碼之DN A、以及重鏈可變區域及輕鏈可變區域之胺基酸序列。 <263A17重鏈核酸序列 >(序列號22) 10 20 30 40 50 60 ATGGAGTTTG GGCTGAGCTG GCTTTTTCTT GTGGCTATTT TAAAAGGTGT CCAGTGTGAG 70 80 90 100 110 120 GTGCAGTTGT TGGAGTCTGG GGGAGGCTTG GTACAGCCTG GGGGGTCCCT GAGACTCTCC 130 140 150 160 170 180 TGTGCAGCCT CTGGATTCAC CTTTAGCAGC TATGCCATGA GCTGGATCCG CCAGGCTCCA 190 200 210 220 230 240 104697-1000825.doc •67· GGGAAGGGGC TGGAGTGGGT 250 260 GACTCCGTGA AGGGCCGGTT 310 320 CAAATGAACA GCCTGAGAGC 370 380 GTGGGAGCTA CGAACTACTA 430 440 GTCTCCTCAG CTAGC..... CTCAGCTATT 270 CACCATCTCC 330 CGAGGACACG 390 CTACGGTATG 450 AGTGCTAGTG GTGGTAGCAC ATACTACGCA 280 290 300 AGAGACAATT CCAAGAACAC GCTGTATCTG 340 350 360 GCCGTATATT ACTGTGCGAA AGATCGGATA 400 410 420 GACGTCTGGG GCCAAGGGAC CACGGTCACC 460 470 480 <263A17重鏈胺基酸序列 >(序列號23) 10 20 30 40 50 60 MEFGLSWLFL VAILKGVQCE VQLLESGGGL VQPGGSLRLS CAASGFTFSS YAMSWIRQAP 70 80 90 100 110 120 GKGLEWVSAI SASGGSTYYA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AVYYCAKDRI 130 140 150 160 170 180 VGATNYYYGM DVWGQGTTVT VSSAS..... <263A17輕鏈核酸序列>(序列號24) 10 20 30 40 50 60 ATGGACATGA GGGTCCCCGC TCAGCTCCTG GGGCTCCTGC TGCTCTGGTT CCCAGGTTCC 70 80 90 100 110 120 AGATGCGACA TCCAGATGAC CCAGTCTCCA CCTTCCGTGT CTGCATCTGT AGGAGACAGA 130 140 150 160 170 180 GTCACCATCA CTTGTCGGGC GAGTCAGGGT ATTAGCAGCT GGTTAGCCTG GTATCAGCAT 190 200 210 220 230 240 AAACCAGGGA AAGCCCCAAA GCTCCTGATC TATGGTGCAT CCAGTTTGCA AAGTGGGGTC 250 260 270 280 290 300 CCATCAAGGT TCAGCGGCAG TGGATCTGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGCAGCCTG 310 320 330 340 350 360 CAGCCTGAAG ATTTTGCAAC TTACTATTGT CAACAGGCTA ATAGTTTCCC TATCACCTTC 370 380 390

GGCCAAGGGA CACGACTGGA GATTAAACGT <263A17輕鏈胺基酸序列 >(序列番25) 10 20 30 40 50 60

MDMRVPAQLL GLLLLWFPGS RCDIQMTQSP PSVSASVGDR VTITCRASQG ISSWLAWYQH 70 80 90 100 110 120

KPGKAPKLLI YGASSLQSGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC QQANSFPITF 130 重鏈核酸序列（序列號22)中之抗體可變區域與抗體不變區域之邊界，位於第429號腺嘌呤（A)與第430號之鳥嘌呤 104697-1000825.doc • 68 · 1359154 (G)之間；重鏈胺基酸序列（序列號23)中之抗體可變區域與抗體不變區域之邊界，位於第143號絲胺酸（s)與第144號丙胺酸（A)之間。又，重鏈核酸序列（序列號22)中之信號序列與抗體可變區域之邊界，位於第57號之胸腺嘧咬（τ)與第58號之烏嘌呤（G)之間；重鏈胺基酸序列（序列號23)中之信號序列與抗體可變區域之邊界，位於第19號之半胱胺酸 (C)及第20號之穀胺酸（E)之間。根據以上，263A17抗體重鏈之可變區域之核酸序列（序列號22)，係自第58號之鳥嘌呤（G)至第429號之腺嘌呤（A) 為止。又，重鏈之可變區域之胺基酸序列（序列號23)，係自第20號之穀胺酸（E)至第143號之絲胺酸（S)為止。. 輕鏈核酸序列（序列號24)中之抗體可變區域與抗體不變區域之邊界，位於第387號之腺嘌呤（A)與第388號之胞嘧啶（C)之間；輕鏈胺基酸序列（序列號25)中之抗體可變區域與抗體不變區域之邊界，位於第129號之離胺酸（K)與第 130號之精胺酸（R)之間。又，輕鏈核酸序列（序列號24)中之信號序列與抗體可變區域之邊界，位於第66號之胞嘧啶 (C)與第67號之鳥嘌呤（G)之間；輕鏈胺基酸序列（序列號 25)中之信號岸列與抗體可變區域之邊界，位於第22號之半胱胺酸（C)與第23號之天冬胺酸（D)之間。根據以上，263A1 7抗體輕鏈之可變區域之核酸序列（序列號24)，係自第67號之鳥嘌呤（G)至第387號之腺嘌呤（A) 為止。又，輕鏈之可變區域之胺基酸序列（序列號25)，係自第23號之天冬胺酸（D)至第129號之離胺酸（K)為止。 104697-1000825.doc •69- 以下分別表示將125M10AA之重鏈可變區域及輕鏈可變區域編碼之DNA、以及重鏈可變區域及輕鏈可變區域之胺基酸序列。 <125M10AA重鏈核酸序列 >(序列號26) 10 20 30 40 50 60 ATGGATCTCA TGTGCAAGAA AATGAAGCAC CTGTGGTTCT TCCTCCTGCT GGTGGCGGCT 70 80 90 100 110 120 CCCAGATGGG TCCTGTCCCA GCTGCAGGTG CAGGAGTCGG GCCCAGGACT GGTGAAGCCT 130 140 150 160 170 180 TCGGAGACCC TGTCCCTCAT CTGCACTGTC TCTGGTGGCT CCATCAGGAC CAGTGGTTAC 190 200 210 220 230 240 TACTGGGGCT GGTTCCGCCA GCCCCCAGGG AAGGGACTGG AGTGGATTGG GACTAGTCAT 250 260 270 280 290 300 AATAGTGGGA GCACCTACTA CAACCCGTCC CTCAAGAGTC GAGTCACCAT ATCCGTAGAC 310 320 330 340 350 360 ACGTCCAAGA ACCAGTTCTC CCTGAAGCTG AACTCTGTGA CCGCCGCAGA CACGGCTGTG 370 380 390 400 410 420 TATTACTGTG CGAGACAAGG TTACGATTTT AAAGTCAATA TAGACGTCTG GGGACAAGGG 430 440 450 ACCACGGTCA CCGTCTCCTC AGCTAGC... <125M10AA重鏈胺基酸序列 >(序列號27) 10 20 30 40 50 60

MDLMCKKMKH LWFFLLLVAA PRffVLSQLQV QESGPGLVKP SETLSLICTV SGGSIRTSGY 70 80 90 100 110 120

YWGffFRQPPG KGLEWIGTSH NSGSTYYNPS LKSRVTISVD TSKNQFSLKL NSVTAADTAV 130 140 150 YYCARQGYDF KVNIDVWGQG TTVTVSSAS. <125^110八入輕鏈核酸序列>(序列號28) 10 20 30 40 50 60

ATGGAAGCCC CAGCTCAGCT TCTCTTCCTC CTGCTACTCT GGCTCCCAGA TACCACCGGA 70 80 90 100 110 120

GAAATTGTGT TGACACAGTC TCCAGCCACC CTGTCTTTGT CTCCAGGGGA AAGAGCCACC 130 140 150 160 170 180

CTCTCCTGCA GGGCCAGTCA GAGTGTTAGC AGCTACTTAG CCTGGTACCA ACAGAAACCT 190 200 210 220 230 240

GGCCAGGCTC CCAGGCTCCT CATCTATGAT GCATCCAACA GGGCCACTGG CATCCCAGCC 250 260 270 280 290 300

AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC TGGGACAGAC TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTAGAGCCT 104697-1000825.doc -70- 310 320 330 340 350 360 GAAGATTTTG CAGTTTATTA CTGTCAGCAG CGTAGCAACT GGCCGCTCAC THCGGCGGA 370 380 390 GGGACCAAGG TGGAGATCAA ACGA...... <1251^10八八輕鏈胺基酸序列>(序列號29) 10 20 30 40 50 60 MEAPAQLLFL LLLWLPDTTG EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP 70 80 90 100 110 120 GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAWYCQQ RSNWPLTFGG 130 GTKVEIKR.. 重鏈核酸序列（序列號26)中之抗體可變區域與抗體不變區域之邊界，位於第441號之腺嘌呤（A)與442號之烏嘌呤 (G)之間；重鏈胺基酸序列（序列號27)中之抗體可變區域與抗體不變區域之邊界，位於第147號之絲胺酸（S)與148號之丙胺酸（A)之間。又，重鏈核酸序列（序列號26)中之信號序列與抗體可變區域之邊界，位於第78號之胞嘧啶（C)與 79號之胞嘧啶（C)之間；重鏈胺基酸序列（序列號27)中之信號序列與抗體可變區域之邊界，位於第26號絲胺酸（S)與 27號之麩醯胺（Q)之間。根據以上，125M10AA抗體重鏈之可變區域之核酸序列 (序列號26)，係自第79號之胞嘧啶（C)至第441號之腺嘌呤 (A)為止。又，重鏈之可變區域之胺基酸序列（序列號27)，係自第27號之麩醯胺（Q)至第147號之絲胺酸（S)為止。輕鏈核酸序列（序列號28)中之抗體可變區域與抗體不變區域之邊界，位於第381號之腺嘌呤（A)與第382號之胞嘧啶（C)之間；輕鏈胺基酸序列（序列號29)中之抗體可變區域與抗體不變區域之邊界，位於第127號之離胺酸（K)與第 104697-1000825.doc -71 - 1359154 128號之精胺酸（R)之間。又，輕鏈核酸序列（序列號28)中之信號序列與抗體可變區域之邊界，位於第60號之腺嘌呤 (A)與第61號之鳥嘌呤（G)之間；輕鏈胺基酸序列（序列號 29)中之信號序列與抗體可變區域之邊界，位於第20號之甘胺酸（G)與第21號之穀胺酸（E)之間。根據以上，125M10AA抗體輕鏈之可變區域之核酸序列 (序列號28)，係自第61號之鳥嘌呤（G)至第381號之腺嘌呤 (A)為止。又，輕鏈可變區域之胺基酸序列（序列號29)，係自第21號之榖胺酸（E)至第127號之離胺酸（K)為止。以下分別表示可對125M165DAAA重鏈可變區域及輕鏈可變區域編碼之DN A、以及重鏈可變區域及輕鏈可變區域之胺基酸序列。〈125M165DAAA重鏈核酸序列 >(序列號30) 10 20 30 40 50 60

ATGGAGTTTG GGCTGAGCTG GGTTTTCCTC GTTGCTCTTT TAAGAGGTGT CCAGTGTCAG 70 80 90 100 110 120

GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCGTG GTCCAGCCTG GGAGGTCCCT GAGACTCTCC 130 140 150 160 170 180

TGTGCAGCGT CTGGATTCAC CTTCAGTTAT TATGGCATGC ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA 190 200 210 220 230 240

GGCAAGGGGC. TGGAGTGGGT GGCAGTTATA TGGTATGATG GAAGTAATAA ATACTATGCA 250 260 270 280 290 300

GACTCCGTGA AGGGCCGATT CACCATCTCC AGAGACAATT CCAAGAAAAC GCTGTATCTG 310 320 330 340 350 360

CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACACG GCTGTGTATT ACTGTGCGAG AGATGGGCAT 370 380 390 400 410 420

AGCAGTGGCT GGGGGGACTT CCAGCACTGG GGCCAGGGCA CCCTGGTCAC CGTCTCCTCA 430 GCTAGC.... <125M165DAAA重鏈胺基酸序列 >(序列號31) 10 20 30 40 50 60

MEFGLSWVFL VALLRGVQCQ VQLVESGGGV VQPGRSLRLS CAASGFTFSY YGMHWVRQAP 104697-1000825.doc -72- 1359154 70 80 90 100 110 120

GKGLEWVAVI WYDGSNmA DSVKGRFTIS RDNSKKTLYL QMNSLRAEDT AVYYCARDGH 130 140 150 SSGWGDFQHW GQGTLVTVSS AS........ <125肘1650人八八輕鏈核酸序列>(序列號32) 10 20 30 40 50 60

CTCTCCTGCA GGGCCAGTCA GAGTGTTAGC AGCTCCTTAG CCTGGTACCA ACAGAAACCT 190 200 210 220 230 240

GGCCAGGCTC CCAGGCTCCT CATCTATGAT GCATCCAACA GGGCCACTGG CATCCCAGCC

250 260 270 280 290 300

AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC TGGGACAGAC TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTAGAGCCT 310 320 330 340 350 360

GAAGATTTTG CAATTTATTA CTGTCAGCAG CGTAGCAACT GGCCTCCGAC GTTCGGCCAA 370 380 390 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGA...... <125M165DAAA輕鏈胺基酸序列 >(序列號33) 10 20 30 40 50 60

MEAPAQLLFL LLLWLPDTTG EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SSLAWYQQKP 70 80 90 100 110 120

GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAIYYCQQ RSNWPPTFGQ 130 GTKVEIKR..

重鏈核酸序列（序列號30)中之抗體可變區域與抗體不變區域之邊界，位於第420號之腺嘌呤（A)與第421號之鳥嘌呤（G)之間；重鏈胺基酸序列（序列號31)中之抗體可變區域與抗體不變區域之邊界，位於第140號之絲胺酸（S)與第 141號之丙胺酸（A)之間。又，重鏈核酸序列（序列號30)中之信號序列與抗體可變區域之邊界，位於第57號之胸腺嘧啶（T)與第58號之胞嘧啶（C)之間；重鏈胺基酸序列（序列號 31)中之信號序列與抗體可變區域之邊界，位於第19半胱 104697-1000825.doc -73- 1359154 胺酸（C)與第20之麩醯胺（Q)之間。根據以上，125M165DAAA抗體重鏈之可變區域之核酸序列（序列號30)，係自第58號之胞嘧啶（C)至第420號之腺嘌呤（A)為止。又，重鏈之可變區域之胺基酸序列（序列號 31)，係自第20號之麩醯胺（Q)至第140號之絲胺酸（S)為止》輕鏈核酸序列（序列號32)中之抗體可變區域與抗體不變區域之邊界，位於第381之腺嘌呤（A)與第382號之胞嘧啶 (C)之間；輕鏈胺基酸序列（序列號33)中之抗體可變區域與抗體不變區域之邊界，位於第127號之離胺酸（K)與第128 號之精胺酸（R)之間。又，輕鏈核酸序列（序列號32)中之信號序列與抗體可變區域之邊界，位於第60號之腺嘌呤（A) 與第61號之鳥嘌呤（G)之間；輕鏈胺基酸序列（序列號33)中之信號序列與抗體可變區域之邊界，位於第20號之甘胺酸 (G)與第21號之榖胺酸（E)之間。根據以上，125M165DAAA抗體輕鏈之可變區域之核酸序列（序列號32)，係自第61號之鳥嘌呤（G)至第381號之腺嘌呤（A)為止。又，輕鏈之可變區域之胺基酸序列（序列號 33)，係自第21號之穀胺酸（E)至第127號之離胺酸（K)為止。以下分別表示可對125M96ABA重鏈可變區域及輕鏈可變區域編碼之DNA、以及重鏈可變區域及輕鏈可變區域之胺基酸序列。 <125M96ABA重鏈核酸序列 >(序列號34) 104697-1000825.doc -74- 1359154

10 20 30 ATGAAGCACC TGTGGTTCn CCTCCTGCTG 70 80 90 CTGCAGCTGC AGGAGTCGGG CCCAGGACTG 130 140 150 TGCACTGTCT CTGGTGGCTC CATCAGCACT 190 200 210 CCCCCCGGGA AGGGCCTGGA ATGGATTGGG 250 260 270 AGCCCGTCCC TCAAGAGTCG AGTCAGTATA 310 320 330 CTGAAGCTGA GCTCTGTGAC CGCCGCAGAC 370 380 390 TACGATATTA AAATCAATAT AGACGTCTGG 430 GCTAGC. · ·· 40 50 60 GTGGCGGCTC CCAGATGGGT CCTGTCCCAA 100 110 120 GTGAAGCCTT CGGAGACCCT GTCCCTCACC 160 170 180 AGTAGTTACT ACTGGGGCTG GATCCGCCAG 220 230 240 ACTATCTATT ATAATGGGAG CACCTACTAC 280 290 300 TCCGTAGACA CGTCCAAGAA CCAGTTCTCC 340 350 360 ACGTCTGTGT ATTACTGTGC GAGACAAGGT 400 410 420

GGCCAAGGGA CCACGGTCAC CGTCTCCTCA <125M96ABA重鏈胺基酸序列 >(序列號35) 10 20 30 40 50 60 MKHLWFFLLL VAAPRWVLSQ LQLQESGPGL VKPSETLSLT CTVSGGSIST SSYYWGWIRQ 70 80 90 100 110 120 PPGKGLEWIG TIYYNGSTYY SPSLKSRVSI SVDTSKNQFS LKLSSVTAAD TSVYYCARQG 130 140 150 YDIKINIDVW GQGTTVTVSS AS........ <1251^96八3人輕鏈核酸序列>(序列號36) 10 20 30 40 50 60

ATGGAAGCCC CAGCTCAGCT TCTCTTCCTC CTGCTACTCT GGCTCCCAGA TACCACCGGA 70 80 90 100 110 120 GAAATTGTGT TGACACAGTC TCCAGCCACC CTGTCTTTGT CTCCAGGGGA AAGAGCCACC 130 140 150 160 170 180 CTCTCCTGCA GGGCCAGTCA GAGTGTTAGC AGCTACTTAG CCTGGTACCA ACAGAAACCT 190 200 210 220 230 240 GGCCAGGCTC CCAGGCTCCT CATCTATGTT GCATCCAACA GGGCCACTGG CATCCCAGCC 250 260 270 280 290 300 AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC TGGGACAGAC TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTAGAGCCT 310 320 330 340 350 360 GAAGATTTTG CAGTTTATTA CTGTCAGCAG CGTAGCAACT GGCCGCTCAC TTTCGGCGGA 370 380 390 GGGACCAAGG TGGAGATCAA ACGA...... <125M96ABA輕鏈胺基酸序列 >(序列號37) 10 20 30 40 50 60

MEAPAQLLFL LLLWLPDTTG EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP 104697-1000825.doc -75- 1359154 70 80 90 100 110 120 GQAPRLLIYV ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPLTFGG 130 GTKVEIKR.. 重鏈核酸序列（序列號34)中之抗體可變區域與抗體不變區域之邊界，位於第420號之腺嘌呤（A)與第421號之鳥嘌呤（G)之間；重鏈胺基酸序列（序列號35)中之抗體可變區域與抗體不變區域之邊界，位於第140號之絲胺酸（S)及第 141號之丙胺酸（A)之間。又，重鏈核酸序列（序列號34)中之信號序列與抗體可變區域之邊界，位於第57號之胞嘧啶 (C)及第58號之胞嘧啶（C)之間；重鏈胺基酸序列（序列號 35)中之信號序列與抗體可變區域之邊界，位於19號之絲胺酸（S)及20號之麩醯胺（Q)之間。根據以上，125M96ABA抗體重鏈之可變區域之核酸序列（序列號34)，係自第58號之胞嘧啶（C)至第420號之腺嘌呤（A)為止。又，重鏈之可變區域之胺基酸序列（序列號 3 5)，係自第20號之麩醯胺（Q)至140號之絲胺酸（S)為止。輕鏈核酸序列（序列號36)中之抗體可變區域與抗體不變區域之邊界，位於第381號之腺嘌呤（A)及第382號之胞嘧啶（C)之間；輕鏈胺基酸序列（序列號37)中之抗體可變區域與抗體不變區域之邊界，位於第127號之離胺酸（K)與第 128號之精胺酸（R)之間。又，輕鏈核酸序列（序列號36)中之信號序列與抗體可變區域之邊界，位於第60號之腺嘌呤 (A)與第61號之烏嘌呤（G)之間；輕鏈胺基酸序列（序列號 3 7)中之信號序列與抗體可變區域之邊界，位於第20號之甘胺酸（G)與第21號之穀胺酸（E)之間。 104697-1000825.doc -76- 1359154 根據以上，125M165DAAA抗體輕鏈之可攣區域之核酸序列（序列號36)，係自第61號之鳥嘌呤（G)至第381號之腺嘌呤（A)為止。又，輕鏈之可變區域之胺基酸序列（序列號 37)，係自第21號之榖胺酸（E)至第127號之離胺酸（K)為止。以下分別表示可對125N26F6AA重鏈可變區域及輕鏈可變區域編碼之DNA、以及重鏈可變區域及輕鏈可變區域之胺基酸序列。

<125N26F6AA重鏈核酸序列 >(序列號38) 10 20 30 40 50 60

GTGCAGTTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCGTG GTCCAGCCTG GGAGGTCCCT GAGACTCTCC 130 140 150 160 170 180

TGTGCAGCGT CTGGATTCAC CTTCAGTCAC TATGGCATGC ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA 190 200 210 220 230 240

GGCAAGGGGC TGGAGTGGGT GGCACTTATA TGGTATGATG GAAGTAATAA ATACTATGCA 250 260 270 280 290 300

GACTCCGTGA AGGGCCGATT CACCATCTCC AGAGACAATT CCAAGAACAC GCTGTATCTG 310 320 330 340 350 360

CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACACG GCTGTGTATT ACTGTGCGAG AGATCCCTTA

370 380 390 400 410 420

GCAGCTGGTA CGTCCTACTT TGACTACTGG GGCCAGGGAA CCCTGGTCAC CGTCTCCTCA 430 GCTAGC·. ♦ · <125N26F6AA重鏈胺基酸序列 >(序列號39) 10 20 30 40 50 60

MEFGLSWVFL VALLRGVQCQ VQLVESGGGV VQPGRSLRLS CAASGFTFSH YGMHWVRQAP 70 80 90 100 110 120

GKGLEWVALI WYDGSNKYYA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AVYYCARDPL 130 140 150 AAGTSYFDYW GQGTLVTVSS AS........ 〈125N26F6AA輕鏈核酸序列 >(序列號40) 10 20 30 40 50 60 104697-1000825.doc -77- 1359154 ATGTCGCCAT CACAACTCAT TGGGnTCTG CTGCTCTGGG TTCCAGCCTC CAGGGGTGAA 70 80 90 100 110 120 ATTGTGCTGA CTCAGTCTCC AGACTTTCAG TCTGTGACTC CAAAGGAGAA AGTCACCATC 130 140 150 160 170 180 ACCTGCCGGG CCAGTCAGAG CATTGGTAGT AGCTTACACT GGTACCAGCA GAAACCAGAT 190 200 210 220 230 240 CAGTCTCCAA AGCTCCTCAT CAAGTATGCT TCCCAGTCCT TCTCAGGGGT CCCCTCGAGG 250 260 270 280 290 300 TTCAGTGGCA GTGGATCTGG GACAGATTTC ACCCTCACCA TCAATAGCCT GGAAGCTGAA 310 320 330 340 350 360 GATGCTGCAG CGTATTACTG TCATCAGAGT AGTAGTTTAC CATTCACTTT CGGCCCTGGG 370 380

ACCAAAGTGG ATATCAAACG A <125N26F6AA輕鏈胺基酸序列 >(序列號41) 10 20 30 40 50 60 MSPSQLIGFL LLWVPASRGE IVLTQSPDFQ SVTPKEKVTI TCRASQSIGS SLHWYQQKPD 70 80 90 100 110 120 QSPKLLIKYA SQSFSGVPSR FSGSGSGTDF TLTINSLEAE DAAAYYCHQS SSLPFTFGPG 130 TKVDIKR... 重鏈核酸序列（序列號38)中之抗體可變區域與抗體不變區域之邊界，位於第420號之腺嘌呤（A)與第421號之鳥嘌呤（G)之間；重鏈胺基酸序列（序列號39)中之抗體可變區域與抗體不變區域之邊界，位於第140號之絲胺酸（S)與第 141號之丙胺酸（A)之間。又，重鏈核酸序列（序列號38)中之信號序列與抗體可變區域之邊界，位於第57號之胸腺嘧啶（T)與第58號之胞嘧啶（C)之間，重鏈胺基酸序列（序列號 3 9)中之信號序列與抗體可變區域之邊界，位於第19號之半胱胺酸（C)與第20號之麩醯胺（Q)之間。根據以上，125M96ABA抗體重鏈之可變區域之核酸序列（序列號38)，係自第58號之胞嘧啶（C)至第420號之腺嘌呤（A)為止。又，重鏈之可變區域之胺基酸序列（序列號 104697-1000825.doc -78 · 1359154 39)，係自第20號之麩醯胺（Q)至第140號之絲胺酸（S)為止。輕鏈核酸序列（序列號4〇)中之抗體可變區域與抗體不變區域之邊界，位於第388號之腺嘌呤（A)與第389號之胞嘧啶（C)之間；輕鏈胺基酸序列（序列號41)中之抗體可變區域與抗體不變區域之邊界’位於第126號之離胺酸（K)與第 127號之精胺酸（R)之間。又’輕鏈核酸序列（序列號40)中之信號序列與抗體可變區域之邊界，位於第57號之胸腺嘧啶（T)與第58號之鳥嘌呤（G)之間，輕鏈胺基酸序列（序列號 41)中之信號序列與抗體可變區域之邊界，位於第19號之甘胺酸（G)與第20號之榖胺酸（E)之間。根據以上，125M96ABA抗體輕鏈之可變區域之核酸序列（序列號40)，係自第58號之鳥嘌呤（G)至第388號之腺嘌呤（A)為止。又，輕鏈之可變區域之胺基酸序列（序列號 41)，係自第20號之穀胺酸（E)至第126號之離胺酸（K)為止。以下分別表示可對125Q47BA之重鏈可變區域及輕鏈可變區域編碼之DNA、以及重鏈可變區域及輕鏈可變區域之胺基酸序列。 <125Q47BA重鏈核酸序列 >(序列號42) 10 20 30 40 50 60

ATGGAGTTTG GGCTGAGCTG GCTTTTTCTT GTGGCTATTT TAAAAGGTGT CCAGTGTGAG 70 80 90 100 110 120

GTGCAGCTGT TGGAGTCTGG GGGAGGCTTG GTACAGCCTG GGGGGTCCCT GAGACTCTCC 130 140 150 160 170 180

TGTGCAGCCT CTGGATTCAC CTTTAGCAGC TATGCCATGA GCTGGGTCCG CCAGGCTCCA 190 200 210 220 230 240 104697-1000825.doc -79- GGGAAGGGGC TGGAGTGGGT CTCAGATATT 250 260 270 GACTCCGTGA AGGGCCGGTT CACCATCTCC 310 320 330 CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACACG 370 380 390 GGTTCGGGGA GHATTCCCC TGACTCCTGG 430 GCTAGC.... AGTGGTAGTG GTGGTTACAC ATACTACGCA 280 290 300 AGAGACAAH CCAAGAACAC GCTGTATCTG 340 350 360 GCCGTATATT ACTGTGCGAA AACAGGCGAT 400 410 420

GGCCAGGGAA CCCTGGTCAC CGTCTCaCA <125Q47BA重鏈胺基酸序列 >(序列號43) 10 20 30 40 50 60

MEFGLSWLFL VAILKGVQCE VQLLESGGGL VQPGGSLRLS CAASGFTFSS YAMTWVRQAP 70 80 90 100 110 120

GKGLEWVSDI SGSGGYTYYA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AVYYCAKTGA 130 140 150 GSGSYSPDSW GQGTLVTVSS AS........ 〈125Q47BA輕鏈核酸序列 >(序列號44) 10 20 30 40 50 60

ATGGACATGA GGGTCCTCGC TCAGCTCCTG GGGCTCCTGC TGCTCTGTTT CCCAGGTGCC 70 80 90 100 110 120

AGATGTGACA TCCAGATGAC CCAGTCTCCA TCCTCACTGT CTGCATCTGT AGGAGACAGA 130 140 150 160 170 180

GTCACCATCA CTTGTCGGGC GAGTCAGGGT ATTAGCAGCT GGTTAGCCTG GTATCAGCAG 190 200 210 220 230 240

AAACCAGAGA AAGCCCCTAA GTCCCTGATC TATGCTGCAT CCAGTTTGCA AAGTGGGGTC 250 260 270 280 290 300

CCATCAAGGT TCAGCGGCAG TGGATCTGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGCAGCCTG 310 320 330 340 350 360

CAGCCTGAAG ATTTTGCAAC TTATTACTGC CAACAGTATA ATAGTTACCC GTACACTTTT 370 380 390

GGCCAGGGGA CCAAGCTGGA GATCAAACGA <125卩478八輕鏈胺基酸序列>(序列號45) 10 20 30 40 50 60

MDMRVLAQLL GLLLLCFPGA RCDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQG ISSWLAWYQQ 70 80 90 100 110 120

KPEKAPKSLI YAASSLQSGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC QQYNSYPYTF 130

GQGTKLEIKR 重鏈核酸序列（序列號42)中之抗體可變區域與抗體不變 104697-1000825.doc -80 - 1359154 區域之邊界，位於第420號之腺嘌呤（A)與第421號鳥嘌呤 (G)之間；重鏈胺基酸序列（序列號43)中之抗體可變區域與抗體不變區域之邊界，位於第140號之絲胺酸（S)與第141 號之丙胺酸（A)之間。又，重鏈核酸序列（序列號42)中之信號序列與抗體可變區域之邊界，位於第57號之胸腺嘧啶 (T)與第58號之鳥嘌呤（G)之間；重鏈胺基酸序列（序列號 43)中之信號序列與抗體可變區域之邊界，位於第19號之半胱胺酸（C)與第20號之穀胺酸（E)之間。根據以上，125Q47BA抗體重鏈之可變區域之核酸序列 (序列號42)，係自第58號之鳥嘌呤（G)至第420號之腺嘌呤 (A)為止。又，重鏈之可變區域之胺基酸序列（序列號43)，係自第20號之榖胺酸（E)至第M0號之絲胺酸（S)為止。輕鏈核酸序列（序列號44)中之抗體可變區域與抗體不變區域之邊界，位於第387號之腺嘌呤（A)與第388號之胞嘧啶（C)之間；輕鏈胺基酸序列（序列號45)中之抗體可變區域與抗體不變區域之邊界，位於第129號之離胺酸（K)與第 130號之精胺酸（R)之間。又，輕鏈核酸序列（序列號44)中之信號序列與抗體可變區域之邊界，位於第66號之胸腺嘧啶（T)與第67號之鳥嘌呤（G)之間；輕鏈胺基酸序列（序列號 45)中之信號序列與抗體可變區域之邊界，位於第22號之半胱胺酸（C)與第23號之天冬胺酸（D)之間。根據以上，125Q47BA抗體輕鏈之可變區域之核酸序列 (序列號44)，係自第67號之鳥嘌呤（G)至第387號之腺嘌呤 (A)為止。又，輕鏈之可變區域之胺基酸序列（序列號45)， 104697-1000825.doc -81- 1359154 係自第23號之天冬胺酸（D)至第129號之離胺酸（K)為止。以下分別表示可對125Q54AAAA之重鏈可變區域及輕鏈可變區域編碼之DNA、以及重鏈可變區域及輕鏈可變區域之胺基酸序列。 <125Q54AAAA重鏈核酸序列 >(序列號46) 10 20 30 40 50 60 ATGGAGTTTG GGCTGAGCTG GCTTTTTCTT GTGGCTATTT TAAAAGGTGT CCAGTGTGAG 70 80 90 100 110 120 GTGCAGCTGT TGGAGTCTGG GGGAGGCTTG GTACAGCCTG GGGGGTCCCT GAGACTCTCC 130 140 150 160 170 180

TGTGCAGCCT CTGGATTCAC CTTTAGCAGC TATGCCATGA GCTGGGTCCG CCAGGCTCCA 190 200 210 220 230 240 GGGAAGGGGC TGGAGTGGGT CTCAGATATT AGTGGTAGTG GTGGTTACAC ATACTACGCA 250 260 270 280 290 300 GACTCCGTGA AGGGCCGGTT CACCATCTCC AGAGACAATT CCAAGAACAC GCTGTATCTG 310 320 330 340 350 360 CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACACG GCCGTATATT ACTGTGCGAA AACAGGCGAT 370 380 390 400 410 420 GGTTCGGGGA GTTATTCCCC TGACTCCTGG GGCCAGGGAA CCCTGGTCAC CGTCTCCTCA 430 GCTAGC.... C125Q54AAAA重鏈胺基酸序列 >(序列號47) 10 20 30 40 50 60

MEFGLSWLFL VAILKGVQCE VQLLESGGGL VQPGGSLRLS CAASGFTFSS YAMSWVRQAP 70 80 90 100 110 120 GKGLEWVSDI SGSGGYTYYA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AVYYCAKTGD 130 140 150 GSGSYSPDSW GQGTLVTVSS AS........ <125Q54AAAA輕鏈核酸序列 >(序列號48) 10 20 30 40 50 60 ATGGACATGA GGGTCCTCGC TCAGCTCCTG GGGCTCCTGC TGCTCTGTTT CCCAGGTGCC 70 80 90 100 110 120 AGATGTGACA TCCAGATGAC CCAGTCTCCA TCCTCACTGT CTGCATCTGT AGGAGACAGA 130 140 150 160 170 180 GTCACCATCA CTTGTCGGGC GAGTCAGGGT ATTAGCAGGT GGTTAGCCTG GTATCAGCAG 190 200 210 220 230 240

AAACCAGAGA AAGCCCCTAA GTCCCTGATC TATGCTGCAT CCAGTTTGCA AAGTGGGGTC 104697-1000825.doc -82- 1359154 250 260 270 280 290 300

CAGCCTGAAG ATTTTGCAAC TTATTACTGC CAACAGTATA ATAGTTACCC GTACACTTTT 370 380 390

GGCCAGGGGA CCAAGCTGGA GATCAAACGA <125Q54AAAA輕鏈胺基酸序列 >(序列號49) 10 20 30 40 50 60

MDMRVLAQLL GLLLLCFPGA RCDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQG ISRffLAWYQQ 70 80 90 100 110 120

KPEKAPKSLI YAASSLQSGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC QQYNSYPYTF 130

GQGTKLEIKR 重鏈核酸序列（序列號46)中之抗體可變區域與抗體不變區域之邊界，位於第420號之腺嘌呤（A)與第421號之鳥嘌呤（G)之間；重鏈胺基酸序列（序列號47)中之抗體可變區域與抗體不變區域之邊界，位於第140號之絲胺酸（S)與第 141號之丙胺酸（A)之間。又，重鏈核酸序列（序列號46)中之信號序列與抗體可變區域之邊界，位於57號之胸腺嘧啶 (T)與58號之鳥嘌呤（G)之間，重鏈胺基酸序列（序列號47) 中之信號序列與抗體可變區域之邊界，位於第19號之半胱胺酸（C)與第20號之榖胺酸（E)之間。根據以上，125Q54AAAA抗體重鏈之可變區域之核酸序列（序列號46)，係自第58號之鳥嘌呤（G)至第420號之腺嘌呤（A)為止。又，重鏈之可變區域之胺基酸序列（序列號 47)，係自第20號之穀胺酸（E)至第140號之絲胺酸（S)為止。輕鏈核酸序列（序列號48)中之抗體可變區域與抗體不變區域之邊界，係自第387號之腺嘌呤（A)與第3 88號之胞嘧 104697-1000825.doc -83 - 1359154 啶（C)之間；輕鏈胺基酸序列（序列號49)中之抗體可變區域與抗體不變區域之邊界，位於第129號之離胺酸（K)與第 130號之精胺酸（R)之間。又，輕鏈核酸序列（序列號48)中之信號序列與抗體可變區域之邊界，位於第66號之胸腺嘧啶（T)與第67號之鳥嘌呤（G)之間；輕鏈胺基酸序列（序列號 49)中之信號序列與抗體可變區域之邊界，位於22號之半胱胺酸（C)與第23號之天冬胺酸（D)之間。根據以上，125Q54AAAA抗體輕鏈之可變區域之核酸序列（序列號48)，係自第67號之烏嘌呤（G)至第387號之腺嘌呤（A)為止。又，輕鏈之可變區域之胺基酸序列（序列號 49)，係自第23號之天冬胺酸（D)至第129號之離胺酸（K)為止。以下分別表示可對125R5AAAA之重鏈可變區域及輕鏈可變區域編碼之DNA、以及重鏈可變區域及輕鏈可變區域之胺基酸序列（P68L3-4)。 <125R5AAAA重鏈核酸序列 >(序列號50) 10 20 30 40 50 60

TGTGCAGCCT CTGGATTCAC CTTTAGCAGC TATGCCATGA GCTGGGTCCG CCAGGCTCCA 190 200 210 220 230 240

GGGAAGGGGC TGGAGTGGGT CTCAGATATT AGTGGTAGTG GTGGTTACAC ATACTACGCA 250 260 270 280 290 300

GACTCCGTGA AGGGCCGGTT CACCATCTCC AGAGACAATT CCAAGAAAAC GCTGTATCTG 310 320 330 340 350 360

CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACACG GCCGTATATT ACTGTGCGAA AACAGGCGAT 370 380 390 400 410 420

GGTTCGGGGA GTTATTCCCC TGACTACTGG GGCCAGGGAA CCCTGGTCAC CGTCTCCTCA 104697-1000825.doc -84- 1359154 430 GCTAGC.... <125R5AAAA重鏈胺基酸序列 >(序列號51) 10 20 30 40 50 60 MEFGLSWLFL VAILKGVQCE VQLLESGGGL VQPGGSLRLS CAASGFTFSS YAMSffVRQAP 70 80 90 100 110 120 GKGLEWVSDI SGSGGYmA DSVKGRFTIS RDNSKKTLYL QMNSLRAEDT AVYYCAKTGD 130 140 150 GSGSYSPDYW GQGTLVTVSS AS........ <125R5AAAA輕鏈核酸序列 >(序列號52) 10 20 30 40 50 60

ATGGACATGA GGGTCCTCGC TCAGCTCCTG GGGCTCCTGC TGCTCTGTTT CCCAGGTGCC 70 80 90 100 110 120 AGATGTGACA TCCAGATGAC CCAGTCTCCA TCCTCACTGT CTGCATCTGT AGGAGACAGA 130 140 150 160 170 180 GTCACCATCA CTTGTCGGGC GAGTCAGGGT ATTAGCAGCT GGTTAGCCTG GTATCAGCAG 190 200 210 220 230 240 AAACCAGAGA AAGCCCCTAA GTCCCTGATC TATGCTGCAT CCAGTTTGCA AAGTGGGGTC 250 260 270 280 290 300 CCATCAAGGT TCAGCGGCAG TGGATCTGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGCAGCCTG 310 320 330 340 350 360 CAGCCTGAAG ATTTTGCAAC TTATTACTGC CAACAGTATA ATAGTTACCC GTACACTTTT 370 380 390

GGCCAGGGGA CCAAGCTGGA GATCAAACGA <125R5AAAA輕鏈胺基酸序列 >(序列號53)

10 20 30 40 50 60 MDMRVLAQLL GLLLLCFPGA RCDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQG ISSWLAWYQQ 70 80 90 100 110 120 KPEKAPKSLI YAASSLQSGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC QQYNSYPYTF 130

GQGTKLEIKR 重鏈核酸序列（序列號50)中之抗體可變區域與抗體不變區域之邊界，位於420號之腺嘌呤（A)及第421號之鳥嘌呤 (G)之間；重鏈胺基酸序列（序列號51)中之抗體可變區域與抗體不變區域之邊界，位於第140號之絲胺酸（S)與第141 號之丙胺酸（A)之間。又，重鏈核酸序列（序列號50)中之信 104697-1000825.doc -85- 1359154 號序列與抗體可變區域之邊界，位於第57號之胸腺嘧啶 (T)與第58號之鳥嘌呤（G)之間；重鏈胺基酸序列（序列號 51)中之信號序列與抗體可變區域之邊界，位於第19號之半胱胺酸（C)與第20號之榖胺酸（E)之間。根據以上，125R5AAAA抗體重鏈之可變區域之核酸序列（序列號50)，係自第58號之鳥嘌呤（G)至第420號之腺嘌呤（A)為止。又，重鏈之可變區域之胺基酸序列（序列號 51)，係自第20號之穀胺酸（E)至第140號之絲胺酸（S)為止。輕鏈核酸序列（序列號52)中之抗體可變區域與抗體不變區域之邊界，位於第387號之腺嘌呤（A)與第388號之胞嘧啶（C)之間；輕鏈胺基酸序列（序列號53)中之抗體可變區域與抗體不變區域之邊界，位於第129號之離胺酸（K)與第 130號之精胺酸（R)之間。又，輕鏈核酸序列（序列號52)中之信號序列與抗體可變區域之邊界，位於第66號之胸腺嘧啶（T)與第67號之鳥嘌呤（G)之間；輕鏈胺基酸序列（序列號 53)中之信號序列與抗體可變區域之邊界，位於第22號之半胱胺酸（C)與第23號之天冬胺酸（D)之間。根據以上，125R5AAAA抗體輕鏈之可變區域之核酸序列（序列號52)，係自第67號之烏嘌呤（G)至第387號之腺嘌呤（A)為止。又，於輕鏈之可變區域之胺基酸序列（序列號 53)，係自第23號之天冬胺酸（D)至第129號之離胺酸（K)為止。實施例14包含於融合瘤125N26F6AA及125M10AA中所表 104697-1000825.doc -86 - 1359154 現之人類抗體重鏈基因、輕鏈基因之不變區域的全長序列之確定於實施例13中，確定各抗體之抗體可變區域之DNA鹼基序列及胺基酸序列，就來自KM小鼠之融合瘤125N26F6AA 及125M10AA，實施含有不變區域之全長序列之解析。根據實施例13，使用藉由融合瘤125N26F6AA及25M10AA而製備之Total RNA作為材料，使用SMART RACE cDNA擴增套組（Becton Dickinson Bioscience Clontech公司製造），實行cDNA之合成。第一股cDNA之合成 Total RNA 5 pg/3 μΐ 3'CDS 引子 1 μΐ Η2〇 1 μΐ 將上述組成之反應液於70°C培養2分鐘後，添加 5x緩衝液2 μΐ DTT 1 μΐ dNTP mix 1 μΐ PowerScript 逆轉錄酶 ΐμΐ 於42°C培養1.5小時。進而’添加50 μΐ之Tricine緩衝液後，於72°C培養7分鐘，取得第一股cDNA » 為取得包含不變區域之編碼區域全體之DNA，將上述合成之cDNA作為模板’又，使用具有結合於各抗體基因之端之ATG起始密碼子附近的序列之合成〇ΝΑ(5,引子）與特 104697-1000825.doc -87· 1359154 異性結合於人類抗體基因3'非翻譯區域之合成DNA(3 ·引子）作為引子組，實行藉由PCR之擴增反應。藉由該擴增反應，可自抗體基因（cDNA)之ATG起始密碼子中，獲得包含直至終止密碼子之3’非翻譯區域為止之全長序列。 125N26F6AA之重鏈之DNA擴增，以Η鏈5·引子： N26H5Sall(序列號 58)與 Η 鏈 3'弓| 子：H_3UTR1 848(5·-CGGGGTACGTGCCAAGCATCCTCGTG-3' > 序列號 74)之引子組，或Η鏈5·引子：N26H5Sall(序列號58)與Η鏈3·引子：H_3UTRI875(5'-ATGCTGGGCGCCCGGGAAGTATGTAC-3'，序列號75)之引子之組合，重複35次之94°C 15秒、68°C 2分鐘之培養循環。另一方面，使用L鏈5·用引子： N26KA10Minor L Bgl(序列號64)與L鏈3’用引子： L_3UTR_823(5'-GAAAGATGAGCTGGAGGACCGCAATA-3。序列號76)之引子組，進行125N26F6AA之輕鏈（κ)之擴增。引子以外之反應液組成，與實施例13之（2)-1相同之組成而實施。至於125M10AA之重鏈之DNA擴增用，係Η鍵5,用引子： M10H5Sal(序列號70)與Η鏈3’用引子：H_3UTR1848(序列號74)之引子組、或η鏈5，引子：M10H5Sal(序列號70)與Η 鏈3’引子：H_3UTR1875(序列號75);至於125Μ10ΑΑ之輕鏈（κ)之DNA擴增用，係L鏈5,用引子：Ml〇KBgl(序列號 66)與L鏈3·用引子：l_3UTR_823(序列號76)之引子組。將擴增之各PCR片段以乙醇沉澱回從後，以瓊脂糖凝膠電泳回收’且以QIA快速萃取套組（Qiagen公司製造）進行 104697-1000825.doc -88 - 純化。分別於Zero Blunt TOPO PCR選殖套組（Invitrogen公司製造）之PCR 4 Blunt-TOPO載體中，進行純化之擴增片段之次選殖。就所獲得之純系，使用定序模板用DNA製備試藥即 TempliPhi DNA擴增套組（Amersham Bioscience股份有限公司製造），根據附加之協議，製備定序模板用 DNA，而決定插入DNA之驗基序列。至於人類抗體重鍵之 DNA鹼基序列解析之引子，使用M13FW(序列號3)、 M13RV(序列號 4)、hh4(序列號 21)、hhl(5'-CCAAGGGCC CATCGGTCTTCCCCCTGGCAC-3，)（序列號 77)、CMVH903F (5'-GACACCCTCATGATCTCCCGGACC-3')(序列號 78)、 CMVHR1303(5'-TGTTCTCCGGCTGCCCATTGCT CT-3')(序列號 79)、hh-6(5'-GGTCCGGGAGATCATGAGGGTGTCC TT-3')(序列號 80)、hh-2(序列號 20)、H_3UTR1848(序列號 74)、及 H_3UTRI875(序列號75)，又，至於人類抗體輕鍵（κ)之 DNA鹼基序列解析用之引子，使用M13FW(序列號3)、 M13RV(序列號 4)、hk-5(序列號 19)、及 hk-l(5'-TGGCT GCACCATCTGTCTTCATCTTC-3')(序列號 81)。以下分別表示可對125N26F6AA抗體之重鏈及輕鏈全區域編碼之DNA、以及重鏈及輕鏈全區域之胺基酸序列。 <125N26F6AA重鏈核酸序列 >(序列號82) 10 20 30 40 50 60

ATGGAGTTTG GGCTGAGCTG GGTTTTCCTC GTTGCTCTTT TAAGAGGTGT CCAGTGTCAG 70 80 90 100 11〇 120

GTGCAGTTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCGTG GTCCAGCCTG GGAGGTCCCT GAGACTCTCC 130 140 150 160 170 180 104697-1000825.doc -89-

TGTGCAGCGT CIGGAHCAC CHCAGTCAC TATGGCATGC ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA 190 200 210

GGCAAGGGGC TGGAGTGGGT GGCACTTATA 250 260 270

GACTCCGTGA AGGGCCGATT CACCATCTCC 310 320 330

CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACACG 370 380 390

GCAGCTGGTA CGTCCTACTT TGACTACTGG 430 440 450

GCCTCCACCA AGGGCCCATC GGTCTTCCCC 490 500 510

GGCACAGCGG CCCTGGGCTG CCTGGTCAAG 550 560 570

TGGAACTCAG GCGCCCTGAC CAGCGGCGTG 610 620 630

GGACTCTACT CCCTCAGCAG CGTGGTGACC 670 680 690

TACATCTGCA ACGTGAATCA CAAGCCCAGC 730 740 750

AAATCTTGTG ACAAAACTCA CACATGCCCA 790 800 810

CCGTCAGTCT TCCTCTTCCC CCCAAAACCC 850 860 870

GAGGTCACAT GCGTGGTGGT GGACGTGAGC 910 920 930

TACGTGGACG GCGTGGAGGT GCATAATGCC 970 980 990

AGCACGTACC GTGTGGTCAG CGTCCTCACC 220 230 240

TGGTATGATG GAAGTAATAA ATACTATGCA 280 290 300

AGAGACAATT CCAAGAACAC GCTGTATCTG 340 350 360

GCTGTGTATT ACTGTGCGAG AGATCCCTTA 400 410 420

GGCCAGGGAA CCCTGGTCAC CGTCTCCTCA 460 470 480

CTGGCACCCT CCTCCAAGAG CACCTCTGGG 520 530 540

GACTACTTCC CCGAACCGGT GACGGTGTCG 580 590 600

CACACCTTCC CGGCTGTCCT ACAGTCCTCA 640 650 660

GTGCCCTCCA GCAGCTTGGG CACCCAGACC 700 710 720

AACACCAAGG TGGACAAGAA AGTTGAGCCC 760 770 780

CCGTGCCCAG CACCTGAACT CCTGGGGGGA 820 830 840

AAGGACACCC TCATGATCTC CCGGACCCCT 880 890 900

CACGAAGACC CTGAGGTCAA GTTCAACTGG 940 950 960

AAGACAAAGC CGCGGGAGGA GCAGTACAAC

1000 1010 1020 GTCCTGCACC AGGACTGGCT GAATGGCAAG 104697-1000825.doc 90- 1359154 1030 1040 1050 1060 1070 1080

GAGTACAAGT GCAAGGTCTC CAACAAAGCC CTCCCAGCCC CCATCGAGAA AACCATCTCC 1090 1100 1110 1120 1130 1140

AAAGCCAAAG CiGCAGCCCCG AGAACCACAG GTGTACACCC TGCCCCCATC CCGGGATGAG 1150 1160 1170 1180 1190 1200

CTGACCAAGA ACCAGGTCAG CCTGACCTGC CTGGTCAAAG GCTTCTATCC CAGCGACATC 1210 1220 1230 1240 1250 1260

GCCGTGGAGT GGGAGAGCAA TGGGCAGCCG GAGAACAACT ACAAGACCAC GCCTCCCGTG 1270 1280 1290 1300 1310 1320

CTGGACTCCG ACGGCTCCTT CTTCCTCTAC AGCAAGCTCA CCGTGGACAA GAGCAGGTGG 1330 1340 1350 1360 1370 1380

CAGCAGGGGA ACGTCTTCTC ATGCTCCGTG ATGCATGAGG CTCTGCACAA CCACTACACG 1390 1400 1410

CAGAAGAGCC TCTCCCTGTC TCCGGGTAAA TGA <125N26F6AA重鏈胺基酸序列 >(序列號83)

10 20 30

MEFGLSWVFL VALLRGVQCQ VQLVESGGGV 70 80 90

GKGLEWVALI WYDGSNKYYA DSVKGRFTIS 130 140 150

AAGTSYFDYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP 190 200 210

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT 250 260 270

KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP 310 320 330

YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT 370 380 390

KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC 40 50 60

VQPGRSLRLS CAASGFTFSH YGMHWVRQAP

100 110 120 RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AVYYCARDPL 160 170 180

LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS 220 230 240

VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP 280 290 300

KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW 340 350 360

VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS 400 410 420

LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV I04697-1000825.doc -91 - 480 430 440 450 460 470 LDSDGSFFLY SKLTVDKSRff QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK <125N26F6AA輕鏈核酸序列 >(序列號84) 10 20 30 40 50

ATGTCGCCAT CACAACTCAT TGGGTTTCTG CTGCTCTGGG TTCCAGCCTC 70 80 90 100 110

ATTGTGCTGA CTCAGTCTCC AGACTTTCAG TCTGTGACTC CAAAGGAGAA 130 140 150 160 170

ACCTGCCGGG CCAGTCAGAG CATTGGTAGT AGCTTACACT GGTACCAGCA 190 200 210 220 230

CAGTCTCCAA AGCTCCTCAT CAAGTATGCT TCCCAGTCCT TCTCAGGGGT 250 260 270 280 290

TTCAGTGGCA GTGGATCTGG GACAGATTTC ACCCTCACCA TCAATAGCCT 310 320 330 340 350

GATGCTGCAG CGTATTACTG TCATCAGAGT AGTAGTTTAC CATTCACTTT 370 380 390 400 410

ACCAAAGTGG ATATCAAACG AACTGTGGCT GCACCATCTG TCTTCATCTT 430 440 450 460 470

GATGAGCAGT TGAAATCTGG AACTGCCTCT GTTGTGTGCC TGCTGAATAA 490 500 510 520 530

AGAGAGGCCA AAGTACAGTG GAAGGTGGAT AACGCCCTCC AATCGGGTAA 550 560 570 580 590

AGTGTCACAG AGCAGGACAG CAAGGACAGC ACCTACAGCC TCAGCAGCAC 610 620 630 640 650

AGCAAAGCAG ACTACGAGAA ACACAAAGTC TACGCCTGCG AAGTCACCCA 670 680 690 700

AGCTCGCCCG TCACAAAGAG CTTCAACAGG GGAGAGTGTT AG <125N26F6AA輕鏈胺基酸序列 >(序列號85)

60 CAGGGGTGAA 120 AGTCACCATC 180 GAAACCAGAT 240 CCCCTCGAGG 300 GGAAGCTGAA 360 CGGCCCTGGG 420 CCCGCCATCT 480 CTTCTATCCC 540 CTCCCAGGAG 600 CCTGACGCTG 660 TCAGGGCCTG 104697-1000825.doc -92- 1359154 10 20 30 40 50 60

MSPSQLIGFL LLWVPASRGE IVLTQSPDFQ SVTPKEKVTI TCRASQSIGS SLHWYQQKPD 70 80 90 100 110 120

QSPKLLIKYA SQSFSGVPSR FSGSGSGTDF TLTINSLEAE DAAAYYCHQS SSLPFTFGPG 130 140 150 160 170 180

TKVDIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS WCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE

190 200 210 220 230

SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL SSPVTKSFNR GEC 以下分別表示對125M10AA抗體之重鏈及輕鏈全區域編碼之DNA、以及重鏈及輕鍵全區域之胺基酸序列。 <125M10AA重鏈核酸序列 >(序列號86) 10 20 30 40 50 60

ATGGATCTCA TGTGCAAGAA AATGAAGCAC CTGTGGTTCT TCCTCCTGCT GGTGGCGGCT 70 80 90 100 110 120

CCCAGATGGG TCCTGTCCCA GCTGCAGGTG CAGGAGTCGG GCCCAGGACT GGTGAAGCCT 130 140 150 160 170 180

TCGGAGACCC TGTCCCTCAT CTGCACTGTC TCTGGTGGCT CCATCAGGAC CAGTGGTTAC 190 200 210 220 230 240

TACTGGGGCT GGTTCCGCCA GCCCCCAGGG AAGGGACTGG AGTGGATTGG GACTAGTCAT 250 260 270 280 290 300

AATAGTGGGA GCACCTACTA CAACCCGTCC CTCAAGAGTC GAGTCACCAT ATCCGTAGAC 310 320 330 340 350 360 104697-1000825.doc -93 1359154

ACGTCCAAGA ACCAGHCTC CCTGAAGCTG 370 380 390

TATTACTGTG CGAGACAAGG TTACGATTTT 430 440 450

ACCACGGTCA CCGTCTCCTC AGCCTCCACC 490 500 510

TCCTCCAAGA GCACCTCTGG GGGCACAGCG 550 560 570

CCCGAACCGG TGACGGTGTC GTGGAACTCA 610 620 630

CCGGCTGTCC TACAGTCCTC AGGACTCTAC 670 680 690

AGCAGCTTGG GCACCCAGAC CTACATCTGC 730 740 750

GTGGACAAGA AAGTTGAGCC CAAATCTTGT 790 800 810

GCACCTGAAC TCCTGGGGGG ACCGTCAGTC 850 860 870

CTCATGATCT CCCGGACCCC TGAGGTCACA 910 920 930

CCTGAGGTCA AGTTCAACTG GTACGTGGAC 970 980 990

CCGCGGGAGG AGCAGTACAA CAGCACGTAC 1030 1040 1050

CAGGACTGGC TGAATGGCAA GGAGTACAAG 1090 1100 1110

CCCATCGAGA AAACCATCTC CAAAGCCAAA 1150 1160 1170

CTGCCCCCAT CCCGGGATGA GCTGACCAAG

AACTCTGTGA CCGCCGCAGA CACGGCTGTG 400 410 420

AAAGTCAATA TAGACGTCTG GGGACAAGGG 460 470 480

AAGGGCCCAT CGGTCTTCCC CCTGGCACCC 520 530 540

GCCCTGGGCT GCCTGGTCAA GGACTACnC 580 590 600

GGCGCCCTGA CCAGCGGCGT GCACACCTTC 640 650 660

TCCCTCAGCA GCGTGGTGAC CGTGCCCTCC 700 .710 720

AACGTGAATC ACAAGCCCAG CAACACCAAG 760 770 780

GACAAAACTC ACACATGCCC ACCGTGCCCA 820 830 840

TTCCTCTTCC CCCCAAAACC CAAGGACACC 880 890 900

TGCGTGGTGG TGGACGTGAG CCACGAAGAC 940 950 960

GGCGTGGAGG TGCATAATGC CAAGACAAAG

1000 1010 1020 CGTGTGGTCA GCGTCCTCAC CGTCCTGCAC 1060 1070 1080

TGCAAGGTCT CCAACAAAGC CCTCCCAGCC 1120 1130 1140

GGGCAGCCCC GAGAACCACA GGTGTACACC 1180 1190 1200

AACCAGGTCA GCCTGACCTG CCTGGTCAAA

104697-1000825.doc -94- 1359154 1210 1220 1230 1240 1250 1260

GGCTTCTATC CCAGCGACAT CGCCGTGGAG TGGGAGAGCA ATGGGCAGCC GGAGAACAAC 1270 1280 1290 1300 1310 1320

TACAAGACCA CGCCTCCCGT GCTGGACTCC GACGGCTCCT TCTTCCTCTA CAGCAAGCTC 1330 1340 1350 1360 1370 1380

ACCGTGGACA AGAGCAGGTG GCAGCAGGGG AACGTCTTCT CATGCTCCGT GATGCATGAG 1390 1400 1410 1420 1430

GCTCTGCACA ACCACTACAC GCAGAAGAGC CTCTCCCTGT CTCCGGGTAA ATGA <125M10AA重鏈胺基酸序列 >(序列號87)

10 20 30

MDLMCKKMKH LWFFLLLVAA PRWVLSQLQV 70 80 90

YWGWFRQPPG KGLEWIGTSH NSGSTYYNPS 130 140 150

YYCARQGYDF KVNIDVffGQG TTVTVSSAST 190 200 210

PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY 250 260 270

VDKKVEPKSC DKTHTCPPCP APELLGGPSV 310 320 330

PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY 370 380 390

PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSRDELTK 430 440 450

YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG 40 50 60

QESGPGLVKP SETLSLICTV SGGSIRTSGY

100 110 120 LKSRVTISVD TSKNQFSLKL NSVTAADTAV 160 170 180

KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF 220 230 240

SLSSVVTVPS SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK 280 290 300

FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED 340 350 360

RVVSVLTVLH QDffLNGKEYK CKVSNKALPA 400 410 420

NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN 460 470 480

NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK <125M10AA輕鏈核酸序列 >(序列號88) 10 20 30 40 50 60

ATGGAAGCCC CAGCTCAGCT TCTCTTCCTC CTGCTACTCT GGCTCCCAGA TACCACCGGA 70 80 90 100 110 120 104697-1000825.doc -95- 1359154

GAAAnGTGT TGACACAGTC TCCAGCCACC CTGTCTTTGT CTCCAGGGGA AAGAGCCACC 130 140 150 160 170 180

CTCTCCTGCA GGGCCAGTCA GAGTGTTAGC AGCTACnAG CCTGGTACCA ACAGAAACCT 190 200 210 220 230 240

AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC TGGGACAGAC TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTAGAGCCT 310 320 330

GAAGATTTTG CAGTTTATTA CTGTCAGCAG 370 380 390

GGGACCAAGG TGGAGATCAA ACGAACTGTG 430 440 450

TCTGATGAGC AGTTGAAATC TGGAACTGCC 490 500 510

CCCAGAGAGG CCAAAGTACA GTGGAAGGTG 550 560 570

GAGAGTGTCA CAGAGCAGGA CAGCAAGGAC 610 620 630

CTGAGCAAAG CAGACTACGA GAAACACAAA 340 350 360

CGTAGCAACT GGCCGCTCAC TTTCGGCGGA 400 410 420

GCTGCACCAT CTGTCTTCAT CTTCCCGCCA 460 470 480

TCTGTTGTGT GCCTGCTGAA TAACTTCTAT 520 530 540

GATAACGCCC TCCAATCGGG TAACTCCCAG 580 590 600

AGCACCTACA GCCTCAGCAG CACCCTGACG 640 650 660

GTCTACGCCT GCGAAGTCAC CCATCAGGGC

670 680 690 700

CTGAGCTCGC CCGTCACAAA GAGCTTCAAC AGGGGAGAGT GTTAG <125MI0AA輕鏈胺基酸序列 >(序列號89) 20 30 40 50 60

MEAPAQLLFL LLLWLPDTTG EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP 80 90 100 110 120

GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPLTFGG 104697-1000825.doc -96- 1359154 130 140 150 160 170 180

GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SWCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ 190 200 210 220 230 ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC 實施例15重組抗艎表現载體之構築

就 263A17、125M10AA、125M165DAAA、125N26F6AA 及125Q54AAAA抗體方面，構築重組抗體表現載體。就 263A17、125M165DAAA 及 125N26F6AA抗體，將含有所取得之抗體之HV鏈的質體DNA作為模板，使用以附加用於與末端連結之限制酶部位（5^末側Sail、3'末側Nhel) 之方式所設計之引子。具體之引子如下所述。 263A17 ；

HV鏈 5'用引子：A33 2-6A2 H VH3-23 Sal 1(序列號 54) 5'-GCG ACT AAG TCG ACC ATG GAG TTT GGG CTG AGC TG -3' HV鏈 3,用引子：A33 2-6A2 H VH3-23 Nhe I(序列號 55) 5'-TGG GCC CTT GGT GCT AGC TGA GGA GAC GGT GAC CG -3' 125M165DAAA; HV鏈5·用引子：M165H5Sal(序列號56) 5'-AGA GAG AGA GGT CGA CCA CCA TGG AGT TTG GGC TGA GCT GGG TTT-3' 104697-1000825.doc -97- 1359154 HV鏈3'用引子：M165H3Nhe(序列號57) 5'-AGA GAG AGA GGC TAG CTG AGG AGA CGG TGA CCA GGG TGC -3' 125N26F6AA; HV鏈51用引子：N26H5Sall(序列號58) 5'-AGA GAG AGA GGT CGA CCA CCA TGG AGT TTG GGC TGA GCT GGG TTT -3， HV鏈3'用引子：N26H3Nhel(序列號59) 5'-AGA GAG AGA GGC TAG CTG AGG AGA CGG TGA CCA GGG TTC CC-3' 以PCR將各A33抗體之HV擴增（94°C 3分鐘—94°C 10秒、 68°C 45秒（35次循環）—72°C 7分鐘）。將擴增之DNA片段以 Sail、Nhel消化，且導入以同一酶所解裂之N5KG1-Val Lark 載體（IDEC Pharmaceuticals，N5KG1(US 專利 6001358) 之改變載體）。將載體作為模板而決定序列，藉此確認所插入之序列與根據次選殖之HV之DNA鹼基序列解析而決定者相同。繼而，將LV插入已插入有所獲得之HV之質體載體中。將含有所取得之抗體之LV鏈的質體DNA作為模板，使用以附加用於與末端相連結之限制酶部位（5’末側Bglll，3'末側BsiWI)之方式所設計之引子。具體之引子如下所述。 263A17 ； LV鏈 5'用引子：A332-6A2 K L19 BglII(序列號 60)

5'-ATC ACA GAT CTC TCA CCA TGG ACA TGA GGG 104697-1000825.doc •98- 1359154 TCC CC -3' LV鏈 3·用引子：A33 2-6A2 K L19 BsiWI(序列號 61) 5'-ACA GAT GGT GCA GCC ACC GTA CGT TTA ATC TCC AG-3' 125M165DAAA; LV鏈5·用引子：M165K5L6Bgl2(序列號62) 5'-AGA GAG AGA GAG ATC TCA CCA TGG AAG CCC CAG CTC AGC TTC TCT-3'

LV鏈 3·用引子：M165K3L6BsiWI(序列號 63) 5'-AGA GAG AGA GCG TAC GTT TGA TTT CCA CCT TGG TCC CTT GGC -3' 125N26F6AA ； LV鏈 5'用引子：N26KA10Minor L Bgl(序列號 64) 5'-AGA GAG AGA GAT CTC TCA CCA TGT CGC CAT CAC AAC TCA TTG GG-3'

LV鏈 3'用引子：N26KA10Minor L Bsi(序列號 65) 5'-AGA GAG AGA GCG TAC GTT TGA TAT CCA CTT TGG TCC CAG GG-3·。以PCR將各A33抗體之LV擴增（94°C 3分鐘—94°C l〇秒、 68°C 45 秒（35 次循環）—72°C 7 分鐘）。以 BglII、BsiWI 消化擴增之DNA片段，導入以同一酶所解裂之N5KG1-HV載體中。將載體作為模板而決定序列，藉此確認插入之序列與根據次選殖之LV之DNA鹼基序列解析而確定者相同。就125M10AA及125Q54AAAA抗體，將含有所取得之抗 104697-1000825.doc -99· 1359154 體之LV鏈的質體DNA作為模板，使用以附加用於與末端相連結之限制酶部位（5·末側Bglll、3'末側BsiWI)之方式所設計之引子。具體之引子如下所述。 125M10AA ； LV鏈5'用引子：M10KBgl(序列號66)

5，-AGAGAGAGAGAGATCTCACCATGGAAGCCCCACCT GCTTCTCT-3' LV鏈3'用引子：M10KBsi(序列號67)

5'-AGAGAGAGAGCGTACGTTTGATCTCCACCTTGGTCC TCCG-3' 125Q54AAAA; LV鏈5’用引子：Q54K5Bgl(序列號68)

5，-AGAGAGAGAGAGATCTCACCATGGACATGAGGGTCC CGCTCAGC-3' LV鏈3'用引子：Q54K3Bsi(序列號69)

5'-AGAGAGAGAGCGTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCC CTGG-3' 以PCR擴增各A33抗體之LV(94°C 3分鐘—94°C 10秒、 68°C 45秒（35次循環）— 72°C 7分鐘）。將擴增之DNA片段以 Bglll、BsiWI消化，導入以同一酶所解裂之N5KG1-Val Lark載體中。將載體作為模板而決定序列，藉此確認插入之序列與根據次選殖之LV之DNA鹼基序列解析而決定者相同。繼而，將HV插入已插入有所獲得之LV插入之質體載體 104697-1000825.doc -100- 1359154 中。將含有取得之抗體之HV鏈的質體DNA作為模板，使用以附加用於與末端相連結之限制酶部位（5'末側Sail、3· 末側Nhel)之方式所設計之引子。具體之引子如下所述。 125 M10AA ； HV鍵5'用引子：M10H5Sal(序列號70) 5'-AGA GAG AGA GGT CGA CCA CCA TGG ATC TCA TGT GCA AGA AAA TGA AGC-3'

HV鏈3·用引子：M10H3Nhe(序列號71) 5' AGA GAG AGA GGC TAG CTG AGG AGA CGG TGA CCG TGG TCC CT -3' 125 Q54AAAA; HV鏈5'用引子：Q54H5Sal(序列號72). 5'-AGA GAG AGA GGT CGA CCA CCA TGG AGT TTG GGC TGA GCT GGC TTT-3' HV鏈Y用引子：Q54H3Nhe(序列號73)

5'-AGA GAG AGA GGC TAG CTG AGG AGA CGG TGA CCA GGG TTC CC-3' 以PCR擴增各A33抗體之HV(94°C 3分鐘->94°C 10秒、 68°C 45秒（35次循環）—72°C 7分鐘）。將擴增之DNA片段以 Sail、Nhel消化，導入以同一酶所解裂之N5KG1-LV載體中。將載體作為模板而決定序列，藉此確認插入之序列與根據次選殖之HV之DNA鹼基序列解析而決定者相同。表5表示合成DNA之鹼基序列，表6表示重組載體及產生之抗體名稱。 104697-1000825.doc • 101· 1359154 表5 ua ΛΜ1111ϋ;η 厗列（i~to 3' ) If別ST· ! m jFAHvK： Nbe bee ctt g6T (»Ct agC ΤόΑ agA i;ac κπτ gac cag agt cCC ttg i GPALvR38s i CTt CAC CCLr Get GGT CiRi «GLl ftr.C TC~ ~ - 1 12 團 (I13FW GrA AAA CGA CGG CCA CTG —-- ~ΓΪ— 3 413ftV CagCaa aCA GcT AtC AC "Tt" 4 k·! LiP ΑΗνΐί^ 1 AbA ϋΑϋ AG(i ttii ACC tMi l：AT GAA CTt Trtfe (；cT ϋΑ(ί tTi aGT T 43 b 圖 im m GPALv2FB*l AGA GAG AGA GAT ClC TCA CCA TcTI C,tk fcA ΑΓ.Α TGU AOT TTfi AG 44 6 A33-F2 GCA GAC GAA TTC AAG ACC ATG fttG fi£g AlC AT 32 13 A33-Rl ΙιϊΓϋΑα CW； COTCTC TGCTCC TfiT, PiT RYC ACT WiT CCA Γ,ΠΤ fi- 43 ^~ wm 〇«] Ell m GPA-EXCRR2 etc gAg CG^retiTccA Gil CaT ΓΛΑ GCG A(5A ΤΪΤ GAC G - 37 IgGlfi-：- TCT TGT CCA CCT TWi f6T tGC T0G Γ·ΓΤ TGT G 31 τ— GTT GAA GCt CTnCT CATfcW： ΓΛΑ CC~ - 26 1~ 1rG2d/G134 TGC ACG CCC ct6 gtc a«T(£G Crf ?.aG TfC T--- ii— B IBl hk-b AGG CAC ACA ACA GAG GCA Crf CCA CAT TTC 30 9 in ΠΆ hh-2 CCT GGA GGG CAC GGTTaC Γ.ΑΓ (U*J ft 2S 20 hh*4 23 21 A33 2-6A2 H VH3-Z3 ball GCG AQJ AAC TQG ACC /TTG (JAG m GfiG m AGC TG- 忿5 54 Ui ⑽ A33 2-6AZ H Vh3^ Nhel TGt GCC CTT ggY gcT ACT TrA ftcA CAC GcT CaC'Tg- 35 55 MlBbHbSa1 Aga gAg AgA got cca ula cca iog agt ttg ugc igA CcT r,ftG TTT 4b b6 iVl KM Ml65H3Nbe AGA GAC AGA GGC TAG Cft AGG ΑΓ.Α CGG YCA CCA (iGG T〇C 39 57 N26H5Sa11 AGA GAG AGA GGT CGA CCA CCA Y0G AfiT fTG GGC ΤδΧ (icT YfT " 一 ~5δ N26^Nhel AGA GAG AGA GGC TAG tTG A(lG AGA Cfiti TCA CCA GWTft i!t _ 41 59 A33 2-6A2 K L19 BrUI ATC ACA GAr CTI： TCA UUA TGG ACA TGA GGG TCC C(T — 95 bo A33 2—6A2 K Ll9 BsiWI ACA CAT GCT GCA CCL ACC GTA CGt TTA ATC TCC At - - 3S 61 MI65K5L6BS1Z AGA GAG AGA GAG ATC TCA CCA T0C AAG cfcc CA0 CTC AGC YtC tcT —4S ~ 62 M16bK3LoBsiwl AGA GAG AGA GCG TAC GTT TGA ttY cdA C(iT Τ(5ϋ itc CfT CftC 42 1 63 财 N26KA10Minor L Bffl AGA GAG AGA GAT CTt ICA CCA TGT CGC CAT CAC A^C 'ttk YTG GG ^ 44 64 Mrl N26KA10Minor L fisi AGA GAG AGA GdG TAC UTT TGA TAT CCA CTt TtG fit CaG Γ.Λ 41 65 AGA (iAG ΑώΑ GAG AtC TCA CCA TGG AAG CCC 0AG CTC A〇C TtC YCT 4B"~ 86 MIDKBSl Aga UAti AGA GCU ¥ac GtrTGA TCT CCA CCT TGC TtC C.rc.T.h ^ 41 67 Q54K5BRI AGA GAG agA GAG ATC ItA CCA TGG ACA TGA COG'TCC 'ttG ΕΤΓ ACC- 4S 68 054K3BSI '~1 AGA CAG AGA GCG TAC GTT TGA TCT CCA tid t6g T(i(l ftrY (Ul 41 69 M10H5Sal AGA GA〇 AgA f；GT cdA CdA tCA tGG ATC tCa TGT iiCA ΑΓ.Α AaA tnA Af.C 48 Y〇 gifeKe_ AGA CW XGA «!c TAG Ct(T AGG ABX Pftfi tCX iCG T68 fECT.T0- ^ ^ 41 71 啦 its 0b4HbSal ACA GAG AGA GGT CGA CCA CCA TGG ΑΓ.Τ TTG GGC TiiA ί：ί!Τ fiCC TTT 45 7Z 054H3Nhe ACA GAG AGA GGC TAG CTG AGG AGA CGG TGA CCA CGG TTC ΓΓ —n— 73 ft-gfeglMg_ CGG CGI AC(i TGC CAA UCA fee TCfi TG 26 74 li 3UTR1876 Atii Ct6 GGC GCC ccSTGaA Gta Ygt AC 26 7b 咖 L SOtR 823 〇AA ΑϋΑ ΤΌΑ t；Cf GGA TSU ΜΓ· (^A ΪΛ_ 26 76 砂j hfi-ϊ CCA agG gCC CAt cgg TC¥ TCC fee TCC CAC ~ 30 77 EU1 GAc Acc CTd ATG atc TCC CfiG ACC-- 24 78 W 09 卿 ICMVHK1303 I TGT TCT CCC GCT GCC CAt YfiC Tet _ 24 79 ihh—6 i ϋΰι ecu gga gat CAT CATS ACT CTC CTT 一· - 80 lhk-i i TGt ctu cac caT CTiJ 111 TCA TCT TC-'—-- 表6 抗體載體名稱亞型重組抗體之名稱 263A17 N5KG1-Val Lark IgGl rec263 125M10AA N5KG1-Val Lark IgGl recMIO 125M165DAAA N5KG1-Val Lark IgGl recM165 125N26F6AA N5KG1-Val Lark IgGl recN26 125Q54AAAA N5KG1-Val Lark IgGl recQ54 實施例16重组型抗體之製作將於實施例15中所構築之重組型抗體表現載體導入宿主細胞，製作重組型抗體表現細胞。用於表現之宿主細胞，例如可使用CHO細胞之dhfr缺失株（ATCC CRL-9096)、 CHO-Ras(Katakura Y.等，Cytotechnology. 31 : 103-109， 1999)、HEK293T(ATCC CRL-1 1268)等。藉由電穿孔法或脂轉染法等，將載體導入宿主細胞。電 -102·

104697-1000825.doc 1359154 穿孔法’將約2 pg之抗體表現載體以限制酶線狀化，使用

Bio-Rad electrophoreter，於 350V、500 pF之條件下，將基因導入4χ106個CHO細胞内’播種於96孔培養皿中。使用

LipofectAMINE Plus(Gibco · BRL公司製造），根據指南，實施脂轉染法。載體之導入處理後，添加對應於表現載體之選擇標記物之藥劑’繼續培養。確認菌落後，根據實施例6中所表示之方法’篩選抗體表現株。自篩選之細胞中純化抗體：吸著後以PBS洗淨，使用Mab選擇蛋白質 (Select Protein) A 3.2x10 cm管柱（Amersham pharmacia

Biotech公司製造），吸著後以PBS洗淨，以2〇 mM(甘胺酸）檸檬酸鈉、50mMNaCl(pH值2.7)緩衝液進行溶出。將溶出液以50 mM填酸鈉缓衝液（pH值7.0)中和。其次，以陰離子交換柱即 Hitrap Q HP Sepharose 管柱（Amersham Pharmacia Biotech公司製造）’進而以相同之陽離子管柱即 Hitrap SP HP Sepharose 管柱（Amersham Pharmacia Biotech 公司製造）加以純化。將製備之抗體溶液’使用透析膜 (10000 截止（cut)、Spectrum Laboratories公司製造）置換為 PBS，以孔徑為0.22 μιη之薄膜過瀘、器MILLEX-GV (Millipore公司製造）進行過濾滅菌，取得純度至少為95% 以上、内毒素為0.1 EU/mg以下之純化抗體。測定280 nm 之吸光度，將1 mg/mL作為1.4 OD ’計算重組型純化抗 A33抗體之濃度。實施例17使用重組型抗體之反應試驗以FCM，研究針對表現A33抗原之人類大腸癌細胞株 104697-1000825.doc •103- 1359154 COLO205 細胞、LS174T 細胞（ATCC No. CL-188)及 NCI-H508細胞（ATCC No. CCL-253)之於實施例16中所獲得之重組型抗體的反應性。又，亦研究有作為陰性對照細胞之並未表現A33抗原之人類大腸癌細胞株HT-29細胞（ATCC No. HTB-3 8)。以與實施例9相同之試驗方法進行試驗。其結果示於表7 »於COLO205細胞中，將平均螢光強度半值設為45 ;於LSI 74T細胞中，將平均螢光強度半值設為 100 ;於NCI-H508細胞中，將平均螢光強度半值設為175; 達到其之抗體濃度於10<=x<100 ng/ml時表示為+++，於 100<=χ<1000 ng/m時表示為++，於 1000<=x<10000 ng/ml 時表示為+，於並未確認結合之情形時，表示為-。對於表現A33抗原之任一細胞，重組型抗體皆表現出結合。表7 抗體名 COLO205 LS174T NCI-H508 _ -1 抗 DNP-IgGl 一 . _ — cA33 -H-f +++ -HH- - rec263 ++ ++ - recMIO -H-4- H-H- H-H- - recM165 -H- -H- -H- - recN26 -H- -H-+ - recQ54 +-H- -H-h - 平均螢先強度半值45 平均螢先強度半值100 平均螢光強度半值175 10<=x<100ng/ml ； +++ 10<=x<10〇ng/ml ； +++ 10<=x<100 ng/ml ； +++ 100<=x<1000ng/ml ： ++ 100<=x<l 000 ng/ml ： ++ 100<=x<1000 ng/ml ； ++ 100(X=x<10000 ng/ml ； + 1000<=x<10000 ng/ml ； + 1000<=x<10000 ng/ml ； + 未结合：- 结合：- 未結合：· 實施例18重组型抗體與小鼠抗A33抗體之競爭試驗以使用FCM之競爭實驗研究實施例16中所獲得之重組犁抗體是否識別與小鼠抗A33抗體同樣之抗原決定基。以與 104697-1000825.doc -104- 1359154 實施例ίο相同之試驗方法進行試驗。與實施例10之各單株純化抗體之結果相同，將rec263及 recMIO分類為"非阻斷"，將recM165及recN26分類為"阻斷"，將recQ54分類為"部分阻斷"。其結果表示於表8。表8 抗體名抑制率(％) 分類 cA33 94.6 阻斷 rec263 15.3 非阻斷 recMIO 0.2 非阻斷 recM165 93.4 阻斷 recN26 95.3 阻斷 recQ54 44.6 部分阻斷實施例19重組型抗體中之細胞傷害性試驗測定於實施例16中所取得之重組型抗體中之ADCC及 CDC。ADCC分析，相對於5000個51Cr標記之目標細胞 (COLO205或NCI-H5 08)，將50萬個以實施例11所揭示之方法所獲得之健康人類末梢血液單細胞，置於V底96孔培養皿（Costar公司製造）中，全體容量為200 μί，根據各抗體濃度於37°C、5%C02存在下培養4小時。 CDC分析，相對於5000個51Cr標記之目標細胞（COLO205 或NCI-H5 08)，將最終濃度為5%之來自人類血清之補體 (Sigma公司製造）置於V底96孔培養皿中，全體容量為 200pL，根據各抗體濃度於37°C於5%C02存在下培養4小 104697-1000825.doc -105- 1359154 時。以與實施例12相同之試驗方法進行試驗。其結果表示於圖2A至圖2D及表9中。ADCC，於將 COLO205細胞作為目標時，將特異性溶解率半值設為 12.5%，於將NCI-H5 08細胞作為目標時，設為30%。達到其之抗體濃度於l<=x<10 ng/ml時表示為+++，於 10<=x< 100 ng/ml 時表示為++，於 100<=χ<1000 ng/ml 時表示為+，於並未確認特異性溶解率之情形時，表示為-。於 CDC中，於將COLO205細胞作為目標時，將特異性溶解率半值設為7%，於將NCI-H5 08細胞設為目標時，設為20%。達到其抗體濃度，於10<=x<100 ng/ml時表示為+++，於 1 00<=χ<1000 ng/ml 時表示為++，於 x>= 1 000 ng/ml 時表示為+，於並未確認特異性溶解率時表示為-。於ADCC中， cA33、recMIO及recQ54表現出較高之傷害活性。另一方面，於CDC中，recMIO表現出較高之傷害活性。 104697-1000825.doc 106- 1359154 表9 細胞名 COLO205 NCI-H508 抗體名 ADCC CDC ADCC CDC 抗 DNP-IgGl • • _ _ cA33 -H-l· 土 -H- -H- rec263 -H- -H- ++ -H- recMIO 4-H- +-H- -H- -H-f- recM165 十 -H- recN26 -H- + 4-f -H- recQ54 -H-l· -H- ++ -H- 特異性溶解半值12.5% l<=x<10ng/ml ； -H-+ 10<=x<100 ng/ml ； ++ 100<=^<1000 ng/ml ； ++ 無特異性溶解：特異性溶解半值30% <=x<10 ng/ml ； +++ 10<=x<100 ng/ml ； ++ 100<=χ<1000 ng/ml ； + 無特異性溶解；

特異性溶解半值7% 0<=x<100 ng/ml ； +++ 100<=x<1000 ng/ml ； Ή-1000<=x< 10000 ng/ml ； + x>=l〇〇〇〇 ng/ml ; 士無特異性溶解；· 特異性溶解半值20% 10<=x<100 ng/ml ； +++ 100<=χ<1000 ng/ml ； ++ 1000<=x< 10000 ng/ml ； + x>=10000 ng/ml; 士無特異性溶解；-

104697-1000825.doc 107- 1359154 實施例20使用純化抗體及重組型抗體之西方墨點法解析現報告有小鼠抗A33抗體及人類化A33抗體確認構象之抗原決定基。即’現報告有以西方轉潰法解析，於還原條件（5% β-毓基乙醇）下，並未確認有反應性。因此，以調查人類抗Α33純化抗體及重組型抗體之反應性為目的，實施西方墨點法解析。將於實施例3中所製備之shA33EX-hFc蛋白質，於還原 (5% β-Μ基乙醇）及非還原條件下，藉由使用1〇至20%聚丙烯醯胺梯度凝膠（第一化學藥品公司製造）之SDS-PAGE進行分離。此時，以每1區帶shA33EX-hFc蛋白質為2.5 ng之方式進行稀釋。另一方面，作為標記物，生物素化SDS-PAGE Standard Broad Range(Bio-Rad公司製造）亦適用於1 區帶。使用 Panzar Semidorai Electoroblotter(第一化學藥品）將shA33EX-hFc蛋白質於PVDF膜以150 mA/牧予以點1 小時。以TBS緩衝液及加入0.05%Tween之TBS(TTBS)，將轉潰有蛋白質之膜洗淨，以阻斷液（大日本製藥公司製造）進行阻斷。以TTBS洗淨2次。125M10AA 、 125Q54AAAA 、 125M96ABA 、 125Q47BA 、及 125R5AAAA，使融合瘤純化抗體以1 pg/ml，於室溫下反應60分鐘。另一方面，嵌合體抗A33抗體' 25M165DAAA(即 recM165)及 125N26F6AA(即 recN26)，使重組型抗體以1 pg/ml、於室溫下反應60分鐘。以TTBS洗淨後，使用稀釋1000倍之以辣根過氧化物酶所標識之山羊抗人類/c鏈F(ab')2抗體（Biosource公司製造），作為檢測用 104697-1000825.doc • 108- 1359154 抗體。此時，為檢測標記物，亦添加稀釋3000倍之以辣根過氧化物酶標識之抗生蛋白鏈菌素使其反應。以TTBS洗淨2次，以PBS洗淨1次後，使用西方轉潰法檢測系統ECL-plus(Amersham Bioscience公司製造），進行區帶之檢測。使用影像分析儀LAS-100(FUJIFILM公司製造），接受化學發光而進行圖像處理。

結果表示於圖3A及圖3B。其結果是，僅125Q54AAAA於還原條件下亦與約67 kD蛋白質之區帶反應。其他抗體，與嵌合體抗A33抗體同樣僅於非還原條件下確認反應。實施例21純化抗體及重組型抗體中之免疫組織化學為評價人類抗A33抗體之特異性、選擇性是否與嵌合體抗A33抗體相同，而根據免疫組織化學，解析與腫瘤組織切片及正常組織切片之反應性。

(1)純化抗體及重組型抗體之螢光標識以 Alexa FlourTM488(Molecular Probe公司製造）直接標識根據實施例8所製備之各單株純化抗體或於實施例16中所製備之重組型抗體 rec263、125M10AA、recM165、recN26 及125Q54AAA。亦同樣地直接標識嵌合體抗A33抗體作為陽性對照、直接標識抗DNP-IgGl抗體作為陰性對照。如下進行純化抗體及重組型抗體之螢光標識化。根據附屬之說明書，使Alexa Fluor TM488結合於實施例8或實施例16中所製備之抗A33抗體。於0·5 ml之2 mg/ml之純化抗體及重組型抗體中添加50 μΐ之1M碳酸緩衝液後，與Alexa FluorTM488混合，一面攪拌一面於室溫下使之反應1小時。 104697-1000825.doc -109- 1359154 添加羥胺終止反應，將混合液供給至凝膠過濾管柱 (NAP5，Amersham Pharmacia Biotech公司製造），除去未結合於抗體之Alexa FluorTM488。於該條件下，4至6個螢光物質結合於1分子抗體。螢光標識之抗體結合於 COLO205細胞，且其結合活性與並未標識之抗體相同。 (2)免疫組織化學所使用之組織切片係成人結腸癌凍結組織切片（Biochain 公司製造）、成人正常結腸凍結組織切片（Biochain公司製造）、成人小腸凍結組織切片（Biochain公司製造）及成人胃凍結組織切片（Biochain公司製造）。以含有10%山羊血清 (Gibco · BRL公司製造）之PBS，於室溫下阻斷1至2小時。以PBS洗淨2次，使於實施例21(1)中以Alexa FluorTM488所標識之各單株純化抗體或重組型抗體以1 pg/ml於室溫下反應30至60分鐘。其後，加以密封，以螢光顯微鏡（BX51， Olympus公司製造）進行觀察，以Olympus公司製造之DP70 解析其圖像。其結果表示於圖4至6。確認有與Garin-Chesa P.等人報告之大腸癌組織之免疫組織染色（Int · J . Oncology 1996 9 : 465-471)同樣，於結腸癌組織之腺上皮細胞或形成異常腺構造中，亦與嵌合體抗A33抗體、rec263、125M10AA、 recM165、recN26及125Q54AAA廣泛均勻地強染色（圖4)。又，於正常小腸組織（圖5)、正常結腸組織（圖6)中，亦發現與嵌合體抗A33抗體相同之染色。另一方面，於正常胃組織中，亦與論文中並未確認染色同樣，本抗體中亦並未 104697-1000825.doc -110· 1359154 確認染色。又，於陰性對照之抗DNP-IgGl抗體中，於全部組織中皆未確認有染色。實施例22融合瘤純化抗體及重組型抗體針對小鼠荷癌模型之效果根據以下所揭示方法，使用小鼠荷癌模型，研究自實施例16中所獲得之人類抗A33重組型抗體之效果。所使用之大腸癌細胞株為COLO205細胞及NCI-H508細胞。

使用COLO205細胞株之小鼠荷癌模型之製作方法如下所述。將大腸癌細胞株COLO205，以5χ106/小鼠個體之方式，移植入6週齡之Balb/c裸鼠（自日本CLEA公司購入）之背部皮下。於移植後1、2、7及10日後，將10隻作為1群，於荷癌小鼠之腹腔内，投與嵌合體抗A33及rec263抗體 10、lOOpg/小鼠個體（溶解於200 μΐ之含有1%裸鼠血清之 PBS者），測定移植7、9、1 1、14、17、21日後之腫瘤大小。使用同量之人類抗DNP-IgGl抗體，作為抗體之陰性對照（Control)。"載體"係表示，於抗體投與時用作溶解的媒體之含有1%裸鼠血清之PBS(200 μΐ)。使用NCI-H5 08細胞株之小鼠荷癌模型之製作方法如下所述。將大腸癌細胞株NCI-H5 08以與含有提高腫瘤細胞生著性之小鼠惡性肉瘤之Matrigel(Becton Dickinson Bioscience Clontech公司製造）為1: 1容量之方式，以lxlO7/小鼠個體移植入於6週齡Balb/c裸鼠（自日本CLEA公司購入）之背部皮下。於移植後1、4及7日後，將10隻作為1群，於荷癌小鼠之腹腔内，投與嵌合體抗A33及rec263抗體10、100 gg/ 104697-1000825.doc 111 1359154 小鼠個體（溶解於200μ1之含有1%裸鼠血清之PBS者），且測定於移植 7、11、14、18、21 ' 27、33、40、48、55、62 日後腫瘤之大小。使用同量之人類抗DNP-IgGl抗體，作為抗體之陰性對照（Control)。"載體•，表示於抗體投與時，用作溶解的媒體之含有裸鼠jk清之PBS(200 μΐ)。以上之實驗結果表示於圖7。於移植COLO205細胞株之系中，於以1 〇 pg/小鼠個體投與rec263抗體之群中，與載體投與群相比，於移植後7、 9、11日後，確認有意義地抑制腫瘤（p<〇.〇5)。與抗DNP-IgG 1抗體投與群相比，於移植7、9、1 1、14日後，確認於腫瘤尺寸上之有意義之差異（p<0.05)。又，以1〇〇 pg/小鼠個體投與之群中，與抗DNP-IgGl抗體投與群相比，於移植14、17日後確認有意義地抑制腫瘤（p<0 05)。另一方面’於以10 pg/小鼠個體投與嵌合體抗A33重組型抗體之群中，與載體投與群相比，於移植7、11日後，確認有意義地抑制腫瘤（p<〇.05)。與抗DNP-IgGl抗體投與群相比，於移植7、9、11、14、17、21日後，確認有意義地抑制腫瘤（p<0.05)。又，於以100 gg/小鼠個體投與群中，與載體投與群相比’於移植7、9、14日後，確認有意義地抑制腫瘤（p<0.05)。與抗DNP-IgGl抗體投與群相比，於移植7、 9、11、14、17、21日後，確認有意義地抑制腫瘤（p<〇 . 05)(圖 7A)。另一方面，於移植NCI-H508細胞株之系中，於以1〇 gg/ 小鼠個體投與rec263抗體群中，全部未表現出抗腫瘤效 104697-I000825.doc •112- 1359154

果。另一方面，於以1 〇〇 μβ/小鼠個體投與群中，與載體投與群相比’於移植18日後，確認有意義地抑制腫瘤 (Ρ<0.05)»又，與抗DNP-lgGl抗體投與群相比，於測定曰’幾乎於全部之測定曰皆確認有意義地抑制腫瘤 (ρ<0·05)。另一方面，於以1 〇 μβ/小鼠個體投與嵌合體抗 A33重組型抗體之群中，與載體投與群相比，於移植21、 55、62曰後，確認有意義地抑制腫瘤（p<〇〇5)。又，與抗 DNP-IgGl抗體投與群相比，於移植後7、21、33日後，確認有意義地抑制腫瘤（ρ<〇·〇5)。又，於以1〇〇 pg/小鼠個體投與群中，與載體投與群相比，幾乎於所有之測定日，確認有意義地腫瘤抑制（p<〇. 05)。又，與抗DNP-IgGl抗體投與群相比，直至移植33日後，確認有意義地抑制腫瘤 (p<0.05) ° 根據以上顯示：本發明之抗體，於使用兩種大腸癌細胞株之小鼠荷癌模型中，具有較高之抗腫瘤效果（圖7B)。

使用小鼠荷癌模型，研究人類抗A33產生融合瘤純化抗體及人類抗A33重組型抗體之效果。所使用之大腸癌細胞株，為COLO205細胞及NCI-H508細胞。 (使用自 125M10AA、125M165DAAA及 125M96ABA 融合瘤所純化之坑體之COLO205細胞株時之抗腫瘤效果）以5xlO6/小鼠個體將大腸癌細胞株COLO205移植入6週齡Balb/c裸鼠（自日本CLEA公司購入）之背部皮下。於移植 1、3、7、10、14、17曰後，將10隻作為1群（載體投與群，為15隻1群），於荷癌小鼠之腹腔内，投與 104697-1000825.doc • 113- 1359154 125M10AA、125M165DAAA及 125M96ABA抗體以 20 Pg/小鼠個體（溶解於200 μΐ之含有1%裸鼠血清之PBS中者）投與，測定移植7、10、12、14、17日後之腫瘤大小。"載體" 表示抗體投與時用作溶解之媒體之含有1%裸鼠血清之 PBS(200 μΐ)。以上之實驗結果表示於圖7C。圖7C中’ Μ10表示 125Μ10ΑΑ抗體，Μ96 表示 125Μ96ΑΒΑ抗體，Μ165 表示

125M165DAAA抗體。於投與125Μ10ΑΑ抗體之群中’與載體投與群相比，於移植後之所有測定日中’皆確認有意義地抑制腫瘤（ρ<〇.〇5)。又’於投與125M165DAAA抗體之群中，與載體投與群相比，於移植後12、14、17曰後’確認有意義地抑制腫瘤（Ρ<0.05)。另一方面’於投與 125Μ96ΑΒΑ抗體之群中，與載體投與群相比’於移植後 12、 14日後，確認有意義地抑制腫瘤（Ρ<0.〇5)。 (使用Ν26及Μ165重組型抗體之COLO205及NCI-H508細

胞株時之抗腫瘤效果）以5x106/小鼠個體將大腸癌細胞株匸01^。205移植入6週齡之Balb/c裸鼠（自曰本CLEA公司購入）之背部皮下。於移植1、3、6曰後，將1〇隻作為1群，於荷癌小鼠之腹腔内’ 以抗體10及1〇〇 μ@/小鼠個體投與recN26及recM165(溶解於 200 μΐ之含有1%裸鼠血清之PBS者）’測定於移植8、10、 13、 15、17、20、23日後之腫瘤大小。以上之實驗結果表示於圖7D。圖7D中，Ml 65-10表示 recM165 抗體（投與 1〇 Pg/隻）’ M165-100 表示 recM165 抗體 104697-1000825.doc • 114· 1359154 (投與100 pg/隻），N26-10表示recN26抗體（投與10 eg/隻）， N26-100表示recN26抗體（投與100 pg/隻）。於以10 pg/隻投與recN26抗體之群中，與載體投與群相比，於移植10、13 曰後，確認有意義地抑制腫瘤（p<0.05)。於以100 gg/隻投

與recN26抗體之群中，與載體投與群相比，於移植8、 10、13、15、17、20日後，確認有意義地抑制腫瘤 (p<0.05)。又，於以1 OOpg/隻將recM165抗體投與之群中，與載體投與群相比，於移植8、10、13、15、17、20 曰後，確認有意義地抑制腫瘤（p<〇.05)。

將大腸癌細胞株NCI-H508，以與含有提高腫瘤細胞之生著性之小鼠惡性肉瘤之Matrigel(Becton Dickinson Bioscience公司製造）為_1: 1之容量比之方式，以1χ107/小鼠個體移植入6週齡之Balb/c裸鼠（自日本CLEA公司購入）之背部皮下。於移植1、4及7日後，將10隻作為1群（載體投與群，將12隻作為1群），於荷癌小鼠腹腔内，以10及 lOOpg/小鼠個體投與recN26及recM165抗體（溶解於200 μΐ 之含有1%裸鼠血清之PBS中者），於移植11、18、28、 36、43、50、57、64日後，測定腫瘤之大小。以上之實驗結果表示於圖7E。圖7E中，N26-10表示 recN26抗體（投與10pg/隻），N26-100表示recN26抗體（投與 100 pg/隻），M165-10表示 recM165 抗體（投與 10 pg/隻）， M165-100表示recM165抗體（投與100 pg/隻）。於移植NCI-H508細胞株之系中，於以10 pg/小鼠個體投與recN26抗體之群中，與載體投與群相比，於移植後11、1 8、36、43曰 104697-1000825.doc -115- 1359154 後，確認有意義地抑制腫瘤（p<0.05)。又，於以100μβ/小鼠個體投與之群中，與載體投與群相比，於移植後η、 18、28、36、50日後確認有意義地抑制腫瘤（ρ<〇〇5)。另一方面，於以10pg/小鼠個體投與recM165抗體之群中，與載體投與群相比’於移植11、18日後確認有意義地抑制腫瘤（p<0.05)。又，於以lOOpg/小鼠個體投與之群中，與載體投與群相比，於移植後全部之測定日中，確認有意義地抑制腫瘤（p<0.05)。 (使用M10及Q54重組型抗體之NCI-H508細胞株時之抗腫瘤效果）將大腸癌細胞株NCI-H508，以與含有提高腫瘤細胞之生者性之小鼠惡性肉瘤之Matrigel(Becton Dickinson Bioscience公司製造）為1: 1之容量比之方式，以1 χ ι〇7/小鼠個體移植入6週齡之Balb/c裸鼠（自日本CLEA公司購入）之背部皮下。於移植1、4及7日後，將10隻作為1群，於荷癌小鼠之腹腔内，以10及100 pg厂】、鼠個體投與recMIO及 recQ54抗體（溶解於200 μΐ之含有1%裸鼠血清之PBS中者），測定移植 14、21、28、35、42、49、56、63 日後之腫瘤大小。以上之實驗結果表示於圖7F。圖7F中，Ml 0-10表示 recMIO抗體（投與1〇 μβ/隻），}^10-100表示[6〇1^10抗體（投與 100 pg/隻），Q54-10 表示 recQ54 抗體（投與 10 pg/隻）， Q54-100表示recQ54抗體（投與100pg/隻）》於移植NCI-H508細胞株之系中，於以1〇 μβ/小鼠個體投與recM10抗體 104697-1000825.doc -116· 1359154 之群中’與载體投與群相比，於移植14、21、28、42、 49 56曰後’確或有意義地抑制腫瘤（ρ<〇· 〇5)。又，於以 1〇〇 Pg/小鼠個體投與群中，與載體投與群相比，於移植 14 ' 21、28、35、42、49、56日後，確認有意義地抑制腫瘤（p<0.05)。另一方面，於以1〇 μβ/小鼠個體投與recQ54抗體之群中，與載體投與群相比，於移植後28、42日後，確認有意義地抑制腫瘤（p<0 〇5)。又，於以1〇〇 pg/小鼠個體投與之群中，與載體投與群相比，於移植後14、21、28、 35、42、56日後’確認有意義地抑制腫瘤（p<〇.〇5)。本說明書令所引用之全部刊物，係將其全體内容作為引入本說明書令者。X，業者容易理解的是，在並未脫離所附加之專利令請範圍内所揭示之技術思想及發明之範圍内，可對本發明進行各種變形及變更。本發明亦欲包含如此之變形及變更。 [產業上之可利用性] 根據本發明，提供一種針對起因於表現A33之細胞之疾病的預防或治療劑，尤其是提供一種對具有A33多型之患者亦有用之分子，作為.惡性腫瘤治療藥。現在於A33之mRNA中已知有9個多型，但其中7個係非翻譯領域中之多型。又，剩餘之兩個中之一個係第3個密碼子中之多型，故而係並未進行胺基酸取代之沉默突變。又’剩餘之兩個中之-個，係伴隨胺基酸取代之多型，但位於信號序列内。根據以上，本抗體，不管是否為AM之多型，對治療、預防均有效。 104697-1000825.doc 1359154 發明者將本說明書中所引用之全部刊物、專利及專利申請直接作為參考，而收載入本說明書中。【圖式簡單說明】圖1A係表示使用各單株純化抗體，將COLO205細胞作為標的時之ADCC活性之圖。圖1B係表示使用各單株純化抗體，將COLO205細胞作為標的時之CDC活性之圖。圖1C係表示使用各單株純化抗體，將NCI-H508細胞作為標的時之ADCC活性之圖。圖1D係表示使用各單株純化抗體，將NCI-H508細胞作為標的時之CDC活性之圖。圖2A係表示使用重組型抗體，將COLO205細胞作為標的時之ADCC活性之圖。圖2B係表示使用重組型抗體，將COLO205細胞作為標的時之CDC活性之圖。圖2C係表示使用重組型抗體，將NCI-H508細胞作為標的時之ADCC活性之圖。圖2D係表示使用重組型抗體，將NCI-H508細胞作為標的時之CDC活性之圖。圖3 A係表示使用純化抗體及重組型抗體之西方墨點法解析結果之照片。圖3B係表示使用純化抗體及重組型抗體之西方墨點法解析結果之照片。圖4係表示使用純化抗體及重組型抗體之人類結腸癌組 104697-1000825.doc -118- 1359154 織的免疫組織染色結果之照片。圖5係表示使用純化抗體及重組型抗體之人類正常小腸組織的免疫組織染色結果之照片。圖6係表示使用純化抗體及重組型抗體之人類正常結腸組織的免疫組織染色結果之照片。圖7A係表示針對移植COLO205細胞時之小鼠荷癌模型的重組型抗體cA33及rec263之抗腫瘤效果之圖。

圖7B係表示針對移植NCI-H508細胞時之小鼠荷癌模型的重組型抗體cA33及rec263之抗腫瘤效果之圖。圖7C係表示針對移植COLO205細胞時之小鼠荷癌模型的融合瘤純化抗體125M10AA 、 125M165DAAA及 125M96ABA之抗腫瘤效果之圖。圖7D係表示針對移植NCI-H508細胞時之小鼠荷癌模型的重組型抗體recN26及recM165之抗腫瘤效果之圖。

圖7E係表示針對將NCI-H508細胞與Matrigel—併移植時之小鼠荷癌模型之重組型抗體recN26及recM165之抗腫瘤效果之圖。圖7F係表示針對將NCI-H508細胞與Matrigel—併移植時之小鼠荷癌模型的重組型抗體recMl 0及recQ54之抗腫瘤效果之圖。 104697-1000825.doc -119- 1359.154 序列表

<110〉麒麟啤酒股份有限公司 <120〉抗A33抗體 <130> PH-2569-PCT

<140〉 094130541 <141〉 2005-09-06 <150〉 JP 2004/259090 <151〉 2004-09-06 <160> 89 <170> Patentln Ver. 2. 1 <210> 1 <211〉42 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列描述：引子 <400> 1 gcccttggtg ctagctgaag agacggtgac cagagtccct tg 104697-1.doc 1359154 <210〉 2 <211〉 26 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列描述：引子 <400> 2

gtgcacgccg ctggtcaggg cgcctg <210〉 3 <211> 18 〈212> DNA 〈213>人工序列 <220〉 <223〉人工序列描述：引子

<400〉 3 gtaaaacgac ggccagtg <210〉 4 <211〉 17 <212〉 DNA <213〉人工序列 104697-1. doc <220〉 1359154 <223〉人工序列描述：引子 <400〉 4

caggaaacag ctatgac <210> 5 <211> 43 <212> DNA • <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列描述：引子 <400> 5 agagagaggt cgacccacca tgaactttgg gctgagctta gtt

<210〉 6 <211> 44 <212> DNA 〈213〉人工序列 <220> 〈223>人工序列描述：引子 <400〉 6 agagagagag atctctcacc atgggcatca agatggagtt tcag -3 - 104697-1. doc 1359154 <210〉 7 <211> 414 <212〉 DNA <213> Homo sapiens <400〉 7 atgaactttg ggctgagctt gattttcctt gtcctaattt taaaaggtgt ccagtgtgaa 60 gtgaagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgaagcctg gagggtccct gaaactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcgc tttcagtacc tatgacatgt cttgggttcg ccagactccg 180

gagaagaggc tggagtgggt cgcaaccatt agtagtggtg gtagttacac ctactattta 240 gacagtgtga agggccgatt caccatctcc agagacagtg ccaggaacac cctatacctg 300 caaatgagca gtctgaggtc tgaggacacg gccttgtatt actgtgcacc gactacggta 360 gtcccgtttg cttactgggg ccaagggact ctggtcaccg tctcttcagc tagc 414 <210> 8 <211〉 138 <212> PRT <213> Homo sapiens <400〉 8

Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu lie Phe Leu Val Leu lie Leu Lys Gly 15 10 15

Val Gin Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe 35 40 45 104697-l.doc 1359154

Ser Thr Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Glu Lys Arg Leu 50 55 60

Glu Trp Val Ala Thr He Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Leu 65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Ser Ala Arg Asn 85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gin Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu 100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Pro Thr Thr Val Val Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 115 120 125

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 130 135

<210〉 9 <211〉 396 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 atgggcatca agatggagtt tcagacccag gtctttgtat tcgtgttgct ctggttgtct 60 ggtgttgatg gagacattgt gatgacccag tctcaaaaat tcatgtccac atcagtagga 120 gacagggtca gcatcacctg caaggccagt cagaatgttc gtactgttgt agcctggtat 180 104697-1, doc 1359154 caacagaaac cagggcagtc tcctaaaaca ctgatttact tggcctccaa ccggcacact 240 ggagtccctg atcgcttcac aggcagtgga tctgggacag atttcactct caccattagc 300 aatgtgcaat ctgaagacct ggcagattat ttctgtctgc aacattggag ttatcctctc 360 acgttcggct cggggacaaa gttggaagta aaacgt 396 <210〉 10 <211〉 132

<212〉 PRT <213> Homo sapiens <400> 10

Met Gly lie Lys Met Glu Phe Gin Thr Gin Val Phe Val Phe Val Leu 15 10 15

Leu Trp Leu Ser Gly Val Asp Gly Asp lie Val Met Thr Gin Ser Gin 20 25 30

Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser lie Thr Cys Lys 35 40 45

Ala Ser Gin Asn Val Arg Thr Val Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 50 55 60

Gly Gin Ser Pro Lys Thr Leu lie Tyr Leu Ala Ser Asn Arg His Thr 65 70 75 80

Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 104697-1. doc -6 - 1359154

Leu Thr lie Ser Asn Val Gin Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys 100 105 110

Leu Gin His Trp Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu 115 120 125

Glu Val Lys Arg 130

<210> 11 <211〉 2793 <212> DNA <213> Homo sapiens <400〉 11

aaggcagggg 60 ggacctttgg 120 gagctcacct 180 agggacctcc 240 tgtctggagg 300 gggaagatgt 360 tctgtggaaa 420 ctaccccttt aggtggctgg agtaggtgac gccaatccag agttgggcca ctgccagtga ggcctgtgtt gtgagcagtc tttaagggga acatgagccc ctgaggctgg ggccagaagc caggttaggt gtggacactc taggactttg acttgaggga agccccagct gcagaggtgg tgctgtagct ttagggcaga tgtgcagtca tacacctgtt agtagggaag cacctgccaa gtgagaagag ttaaccagac gaagaagcaa gggtgaccgt aagtagggag actcctcttg tccagctgag ggaaaattgc agctcagacc gaccatggtg cgatgccatc tgcacctacc 480 ctcactcata 540 gagctttata 600 accattgatc 660 ctccgcagga acacttccac cggaaagggt agaatcgcgt cgttcttcgg ctccagtcga ggtcatctgg cagcatatcc gcttcgcagg gagggactta ccgttttcaa aacaatgctg gaaagagtgt ttcaatggga acaaaaacta agcagtccga caccctgccc taagctcctc catccatggt tgcctccatc 104697-1. doc 1359154

agctgaccat ggctgacaac ggcacctacg agtgttctgt ctcgctgatg tcagacctgg 720 agggcaacac caagtcacgt gtccgcctgt tggtcctcgt gccaccctcc aaaccagaat 780 gcggcatcga gggagagacc ataattggga acaacatcca gctgacctgc caatcaaagg 840 agggctcacc aacccctcag tacagctgga agaggtacaa catcctgaat caggagcagc 900 ccctggccca gccagcctca ggtcagcctg tctccctgaa gaatatctcc acagacacat 960 cgggttacta catctgtacc tccagcaatg aggaggggac gcagttctgc aacatcacgg 1020 tggccgtcag atctccctcc atgaacgtgg ccctgtatgt gggcatcgcg gtgggcgtgg 1080 ttgcagccct cattatcatt ggcatcatca tctactgctg ctgctgccga gggaaggacg 1140 acaacactga agacaaggag gatgcaaggc cgaaccggga agcctatgag gagccaccag 1200 agcagctaag agaactttcc agagagaggg aggaggagga tgactacagg caagaagagc 1260 agaggagcac tgggcgtgaa tccccggacc acctcgacca gtgacaggcc agcagcagag 1320 ggcggcggag gaagggttag gggttcattc tcccgcttcc tggcctccct tctcctttct 1380 aagccctgtt ctcctgtccc tccatcccag acattgatgg ggacatttct tccccagtgt 1440 cagctgtggg gaacatggct ggcctggtaa gggggtccct gtgctgatcc tgctgacctc 1500 actgtcctgt gaagtaaccc ctcctggctg tgacacctgg tgcgggcctg gccctcactc 1560 aagaccaggc tgcagcctcc acttccctcg tagttggcag gagctcctgg aagcacagcg 1620 ctgagcatgg ggcgctccca ctcagaactc tccagggagg cgatgccagc cttggggggt 1680 gggggctgtc ctgctcacct gtgtgcccag cacctggagg ggcaccaggt ggagggtttg 1740 cactccacac atctttcttg aatgaatgaa agaataagtg agtatgcttg ggccctgcat 1800 tggcctggcc tccagctccc actccctttc caacctcact tcccgtagct gccagtatgt 1860 tccaaaccct cctgggaagg ccacctccca ctcctgctgc acaggccctg gggagctttt 1920 gcccacacac tttccatctc tgcctgtcaa tatcgtacct gtccctccag gcccatctca 1980 aatcacaagg atttctctaa ccctatccta attgtccaca tacgtggaaa caatcctgtt 2040 actctgtccc acgtccaatc atgggccaca aggcacagtc ttctgagcga gtgctctcac 2100 tgtattagag cgccagctcc ttggggcagg gcctgggcct catggctttt gctttccctg 2160 aagccctagt agctggcgcc catcctagtg ggcacttaag cttaattggg gaaactgctt 2220 tgattggttg tgccttccct tctctggtct ccttgagatg atcgtagaca cagggatgat 2280 tcccacccaa acccacgtat tcattcagtg agttaaacac gaattgattt aaagtgaaca 2340 cacacaaggg agcttgcttg cagatggtct gagttcttgt gtcctggtaa ttcctctcca 2400 ggccagaata attggcatgt ctcctcaacc cacatggggt tcctggttgt tcctgcatcc 2460 104697-1. doc 1359154 cgatacctca gccctggccc tgcccagccc atttgggctc tggttttctg gtggggctgt 2520 cctgctgccc tcccacagcc tccttctgtt tgtcgagcat ttcttctact cttgagagct 2580 caggcagcgt tagggctgct taggtctcat ggaccagtgg ctggtctcac ccaactgcag 2640 tttactattg ctatcttttc tggatgatca gaaaaataat tccataaatc tattgtctac 2700 ttgcgatttt ttaaaaaatg tatattttta tatatattgt taaatccttt gcttcattcc 2760 aaatgctttc agtaataata aaattgtggg tgg 2793 <210> 12

<211〉 319 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12

Met Val Gly Lys Met Trp Pro Val Leu Trp Thr Leu Cys Ala Val Arg 15 10 15

Val Thr Val Asp Ala He Ser Val Glu Thr Pro Gin Asp Val Leu Arg 20 25 30

Ala Ser Gin Gly Lys Ser Val Thr Leu Pro Cys Thr Tyr His Thr Ser 35 40 45

Thr Ser Ser Arg Glu Gly Leu lie Gin Trp Asp Lys Leu Leu Leu Thr 50 55 60

His Thr Glu Arg Val Val lie Trp Pro Phe Ser Asn Lys Asn Tyr lie 65 70 75 80 104697-1. doc 1359154

His Gly Glu Leu Tyr Lys Asn Arg Val Ser lie Ser Asn Asn Ala Glu 85 90 95

Gin Ser Asp Ala Ser lie Thr lie Asp Gin Leu Thr Met Ala Asp Asn 100 105 110

Gly Thr Tyr Glu Cys Ser Val Ser Leu Met Ser Asp Leu Glu Gly Asn 115 120 125

Thr Lys Ser Arg Val Arg Leu Leu Val Leu Val Pro Pro Ser Lys Pro 130 135 140

Glu Cys Gly lie Glu Gly Glu Thr lie He Gly Asn Asn lie Gin Leu 145 150 155 160

Thr Cys Gin Ser Lys Glu Gly Ser Pro Thr Pro Gin Tyr Ser Trp Lys 165 170 175

Arg Tyr Asn lie Leu Asn Gin Glu Gin Pro Leu Ala Gin Pro Ala Ser 180 185 190

Gly Gin Pro Val Ser Leu Lys Asn lie Ser Thr Asp Thr Ser Gly Tyr 195 200 205

Tyr lie Cys Thr Ser Ser Asn Glu Glu Gly Thr Gin Phe Cys Asn lie 210 215 220

Thr Val Ala Val Arg Ser Pro Ser Met Asn Val Ala Leu Tyr Val Gly 225 230 235 240 10 - 104697-1. doc 1359154 lie Ala Val Gly Val Val Ala Ala Leu lie lie lie Gly lie lie lie 245 250 255

Tyr Cys Cys Cys Cys Arg Gly Lys Asp Asp Asn Thr Glu Asp Lys Glu 260 265 270

Asp Ala Arg Pro Asn Arg Glu Ala Tyr Glu Glu Pro Pro Glu Gin Leu 275 280 285

Arg Glu Leu Ser Arg Glu Arg Glu Glu Glu Asp Asp Tyr Arg Gin Glu 290 295 300

Glu Gin Arg Ser Thr Gly Arg Glu Ser Pro Asp His Leu Asp Gin 305 310 315 〈210〉 13 〈211〉 32 <212> DNA <213〉人工序列

<220> <223〉人工序列描述：引子 <400> 13 gcagacgaat tcaagaccat ggtggggaag at 〈210〉 14 <211> 43 -11 104697-1.doc 1359154 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列描述：引子 <400> 14 ctcgagcggc cgctctgctg ctggcctgtc actggtcgag gtg 43

<210〉 15 <211〉 37 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列描述：引子

<400〉 15 ctcgagcggc cgccagttca tggagggaga tctgacg 37 〈210〉 16 <211〉 31 <212> DNA <213〉人工序列 <220> 12 104697-1.doc 1359154 〈223>人工序列描述：引子 <400〉 16 tcttgtccac cttggtgttg ctgggcttgt g <210〉 17 <211〉 26 <212> DNA <213〉人工序列

<220〉〈223>人工序列描述：引子 <400> 17 gttgaagctc tttgtgacgg gcgagc <210〉 18 <211〉 31 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉〈223>人工序列描述：引子 <400〉 18 tgcacgccgc tggtcagggc gcctgagttc c 104697-1. doc 1359154 <210〉 19 <211〉 30 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列描述：引子

<400〉 19 aggcacacaa cagaggcagt tccagatttc 30 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213〉人工序列

<220〉〈223>人工序列描述：引子 <400〉 20 25 gctggagggc acggtcacca cgctg <210〉 21 <211〉 23 14 104697-1. doc 1359154 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列描述：引子 <400〉 21 ggtgccaggg ggaagaccga tgg 23

<210〉 22 <211〉 435 <212> DNA <213> Homo sapiens <400〉 22 atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60 gtgcagttgt tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac ctttagcagc tatgccatga gctggatccg ccaggctcca 180 gggaaggggc tggagtgggt ctcagctatt agtgctagtg gtggtagcac atactacgca 240 gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgaa agatcggata 360 gtgggagcta cgaactacta ctacggtatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc 420 gtctcctcag ctagc 435

<210〉 23 <211> 145 <212〉 PRT 一 15 - 104697-l.doc 1359154 <213> Homo sapiens <400〉 23

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala lie Leu Lys Gly 1 5 10 15

Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin 20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45

Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60

Glu Trp Val Ser Ala lie Ser Ala Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala 65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Arg lie Val Gly Ala Thr Asn Tyr Tyr Tyr 115 120 125

Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala 130 135 140 -16 - 104697-1· doc 1359154

Ser 145 <210> 24 <211〉 390 <212> DNA <213> Homo sapiens

<400〉 24 atggacatga gggtccccgc agatgcgaca tccagatgac gtcaccatca cttgtcgggc aaaccaggga aagccccaaa ccatcaaggt tcagcggcag cagcctgaag attttgcaac ggccaaggga cacgactgga tcagctcctg gggctcctgc tgctctggtt cccaggttcc 60 ccagtctcca ccttccgtgt ctgcatctgt aggagacaga 120 gagtcagggt attagcagct ggttagcctg gtatcagcat 180 gctcctgatc tatggtgcat ccagtttgca aagtggggtc 240 tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagcctg 300 ttactattgt caacaggcta atagtttccc tatcaccttc 360 gattaaacgt 390

<210〉 25 <211> 130

<212〉 PRT <213〉 Homo sapiens <400〉 25

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 15 10 15 17 104697-1.doc 1359154

Phe Pro Gly Ser Arg Cys Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Pro Ser 20 25 30

Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45

Gin Gly lie Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gin His Lys Pro Gly Lys 50 55 60

Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val 65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 100 105 110

Ala Asn Ser Phe Pro He Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu lie 115 120 125

Lys Arg 130 <210〉 26 <211> 447 <212> DNA <213> Homo sapiens -18 - 104697~1.doc 1359154 <400> 26 atggatctca tgtgcaagaa aatgaagcac ctgtggttct tcctcctgct ggtggcggct 60 cccagatggg tcctgtccca gctgcaggtg caggagtcgg gcccaggact ggtgaagcct 120 tcggagaccc tgtccctcat ctgcactgtc tctggtggct ccatcaggac cagtggttac 180 tactggggct ggttccgcca gcccccaggg aagggactgg agtggattgg gactagtcat 240 aatagtggga gcacctacta caacccgtcc ctcaagagtc gagtcaccat atccgtagac 300 acgtccaaga accagttctc cctgaagctg aactctgtga ccgccgcaga cacggctgtg 360 tattactgtg cgagacaagg ttacgatttt aaagtcaata tagacgtctg gggacaaggg 420 accacggtca ccgtctcctc agctagc 447

<210〉 27 <211〉 149 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27

Met Asp Leu Met Cys Lys Lys Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu 15 10 15

Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp Val Leu Ser Gin Leu Gin Val Gin Glu 20 25 30

Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu lie Cys 35 40 45

Thr Val Ser Gly Gly Ser lie Arg Thr Ser Gly Tyr Tyr Trp Gly Trp 50 55 60

Phe Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie Gly Thr Ser His -19 - 104697-1.doc 1359154 65 70 75 80

Asn Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr 85 90 95 lie Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Lys Leu Asn Ser 100 105 110

Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gin Gly Tyr 115 120 125

Asp Phe Lys Val Asn lie Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr 130 135 140

Val Ser Ser Ala Ser 145

<210> 28 〈211〉 384 鲁 <212〉 DNA <213> Homo sapiens -- <400〉 28 atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 ' gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 180 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 240 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 300 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggccgctcac tttcggcgga 360 20 104697-1. doc 1359154 gggaccaagg tggagatcaa acga

<210〉 29 <211〉 128 〈212〉 PRT <213> Homo sapiens <400〉 29

Met Glu Ala Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 15 10 15

Asp Thr Thr Gly Glu He Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser 35 40 45

Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro

50 55 60

Arg Leu Leu He Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala 65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser 85 90 95

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser 100 105 110 21 - 104697-1. doc 1359154

Asn Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 115 120 125

<210〉 30 <211〉 426 <212〉 DNA <213> Homo sapiens <400〉 30 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcgt ctggattcac cttcagttat tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagtaataa atactatgca 240 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaaaac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agatgggcat 360 agcagtggct ggggggactt ccagcactgg ggccagggca ccctggtcac cgtctcctca 420 gctagc 426 <210〉 31 <211〉 142 <212〉 PRT <213〉 Homo sapiens <400〉 31

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 104697-1. doc 22 -τι - 1359154 10 15

Val Gin Cys Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin 20 25 30

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45

Ser Tyr Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60

Glu Trp Val Ala Val lie Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala 65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys 85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly His Ser Ser Gly Trp Gly Asp Phe Gin 115 120 125

His Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 130 135 140

<210> 32 <211〉 384 <212〉 DMA -23 - 104697-1. doc 1359154 <213> Homo sapiens <400〉 32 atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctccttag cctggtacca acagaaacct 180 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 240 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 300 gaagattttg caatttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctccgac gttcggccaa 360 gggaccaagg tggaaatcaa acga 384 〈210〉 33 〈211〉 128 〈212〉 PRT <213> Homo sapiens <400〉 33

Met Glu Ala Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 15 10 15

Asp Thr Thr Gly Glu He Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser 35 40 45

Val Ser Ser Ser Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro 50 55 60 24 104697-l.doc 1359154

Arg Leu Leu lie Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala 65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser 85 90 95

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala lie Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser 100 105 110

Asn Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 115 120 125 <210〉 34 <211〉 426 <212〉 DNA <213> Homo sapiens <400> 34 atgaagcacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcggctc ccagatgggt cctgtcccaa 60 ctgcagctgc aggagtcggg cccaggactg gtgaagcctt cggagaccct gtccctcacc 120 tgcactgtct ctggtggctc catcagcact agtagttact actggggctg gatccgccag 180 ccccccggga agggcctgga atggattggg actatctatt ataatgggag cacctactac 240 agcccgtccc tcaagagtcg agtcagtata tccgtagaca cgtccaagaa ccagttctcc 300 ctgaagctga gctctgtgac cgccgcagac acgtctgtgt attactgtgc gagacaaggt 360 tacgatatta aaatcaatat agacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 420 gctagc 426 -25 - 104697-1. doc 1359154 <210〉 35 <2Γ2> ^RT <213〉 Homo sapiens <400〉 35

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp y 15 10 15

Val Leu Ser Gin Leu Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 20 25 30

Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser lie 35 40 45

Ser Thr Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys 50 55 60

Gly Leu Glu Trp lie Gly Thr lie Tyr Tyr Asn Gly Ser Thr Tyr Tyr 65 70 75 80

Ser Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Ser lie Ser Val Asp Thr Ser Lys 85 90 95

Asn Gin Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ser 100 105 110

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gin Gly Tyr Asp lie Lys He Asn lie Asp 115 120 125 26 - 104697-l.doc 1359154

Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 130 135 140 <210〉 36 <211〉 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <400〉 36

atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 180 ggccaggctc ccaggctcct catctatgtt gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 240 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 300 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggccgctcac tttcggcgga 360 gggaccaagg tggagatcaa acga 384 <210> 37 參 <211〉 128

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37

Met Glu Ala Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 15 10 15

Asp Thr Thr Gly Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser 104697-l.doc 1359154 20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser 35 40 45

Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro 50 55 60

Arg Leu Leu lie Tyr Val Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala 65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser 85 90 95

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser 100 105 110

Asn Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 115 120 125

〈210〉 38 <211〉 426 <212〉 DNA <213> Homo sapiens <400〉 38 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagttgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcgt ctggattcac cttcagtcac tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180 28 104697-1.doc 1359154 ggcaaggggc tggagtgggt ggcacttata tggtatgatg gaagtaataa atactatgca 240 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agatccctta 360 gcagctggta cgtcctactt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 420 gctagc 426 <210〉 39 <211> 142

<212〉 PRT

<213> Homo sapiens <400〉 39

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 15 10 15

Val Gin Cys Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin 20 25 30

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

Ser His Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60

Glu Trp Val Ala Leu lie Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala 65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 29 104697-l.doc 1359154

Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Leu Ala Ala Gly Thr Ser Tyr Phe Asp 115 120 125

Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 130 135 140

<210> 40 <211> 378 <212〉 DNA <213> Homo sapiens <400〉 40 atgtcgccat cacaactcat tgggtttctg ctgctctggg ttccagcctc caggggtgaa 60 attgtgctga ctcagtctcc agactttcag tctgtgactc caaaggagaa agtcaccatc 120 acctgccggg ccagtcagag cattggtagt agcttacact ggtaccagca gaaaccagat 180

cagtctccaa agctcctcat caagtatgct tcccagtcct tctcaggggt cccctcgagg 240 ttcagtggca gtggatctgg gacagatttc accctcacca tcaatagcct ggaagctgaa 300 gatgctgcag cgtattactg tcatcagagt agtagtttac cattcacttt cggccctggg 360 accaaagtgg atatcaaa 378 <210> 41 <211〉 126 〈212〉 PRT <213> Homo sapiens 104697-l.doc -30 - 1359154 <400〉 41

Met Ser Pro Ser Gin Leu lie Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala 15 10 15

Ser Arg Gly Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Asp Phe Gin Ser Val 20 25 30

Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser He 35 40 45

Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gin Ser Pro Lys 50 55 60

Leu Leu lie Lys Tyr Ala Ser Gin Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg 65 70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Asn Ser 85 90 95

Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gin Ser Ser Ser 100 105 110

Leu Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp lie Lys 115 120 125

<210〉 42 <211〉 426 <212> DNA 104697-1. doc 31 31 - 1359154 <213〉 Homo sapiens <400> 42 atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60 gtgcagctgt tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac cttcagcagc tacgccatga cctgggtccg ccaggctcca 180 gggaaggggc tggagtgggt ctcagatatt agtggtagtg gtggttatac atactacgca 240 gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgaa aacaggcgct 360

ggttcgggga gttattcccc tgactcctgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 420 gctagc 426 <210〉 43 <211> 142

<212〉 PRT <213> Homo sapiens <400〉 43

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala He Leu Lys Gly 15 10 15

Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin 20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45

Ser Ser Tyr Ala Met Thr Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu -32 - 104697-L doc 1359154 50 55 60

Glu Trp Val Ser Asp lie Ser Gly Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala 65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Lys Thr Gly Ala Gly Ser Gly Ser Tyr Ser Pro Asp 115 120 125

Ser Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 130 135 140 <210> 44

<211> 390 <212> DNA <213〉 Homo sapiens <400〉 44 atggacatga gggtcctcgc tcagctcctg gggctcctgc tgctctgttt cccaggtgcc 60 agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctcactgt ctgcatctgt aggagacaga 120 gtcaccatca cttgtcgggc gagtcagggt attagcagct ggttagcctg gtatcagcag 180 aaaccagaga aagcccctaa gtccctgatc tatgctgcat ccagtttgca aagtggggtc 240 ccatcaaggt tcagcggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagcctg 300 cagcctgaag attttgcaac ttattactgc caacagtata atagttaccc gtacactttt 360 104697-1. doc 33 1359154 ggccagggga ccaagctgga gatcaaacga <210〉 45 <211〉 130

<212〉 PRT <213> Homo sapiens <400〉 45

Met Asp Met Arg Val Leu Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys

Phe Pro. Gly Ala Arg Cys Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser 20 25 30

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45

Gin Gly lie Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Lys 50 55 60

Ala Pro Lys Ser Leu lie Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val 65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 100 105 110 -34 104697-1. doc 1359154

Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie 115 120 125

Lys Arg 130

<210〉 46 <211〉 426 <212〉 DNA

<213> Homo sapiens <400〉 46 atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60 gtgcagctgt tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac ctttagcagc tatgccatga gctgggtccg ccaggctcca 180 gggaaggggc tggagtgggt ctcagatatt agtggtagtg gtggttacac atactacgca 240 gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgaa aacaggcgat 360 ggttcgggga gttattcccc tgactcctgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 420 gctagc 426

<210> 47 <211〉 142 <212〉 PRT <213> Homo sapiens <400> 47

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala lie Leu Lys Gly -35 — 104697-l.doc 1359154 15 10

Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin 20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45

Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60

Glu Trp Val Ser Asp He Ser Gly Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala 65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Lys Thr Gly Asp Gly Ser Gly Ser Tyr Ser Pro Asp 115 120 125

Ser Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 130 135 140 <210〉 48 <211〉 390 36 104697-1.doc 1359154

<212〉 DMA <213〉 Homo sapiens <400> 48 atggacatga gggtcctcgc tcagctcctg gggctcctgc tgctctgttt cccaggtgcc 60 agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctcactgt ctgcatctgt aggagacaga 120 gtcaccatca cttgtcgggc gagtcagggt attagcaggt ggttagcctg gtatcagcag 180 aaaccagaga aagcccctaa gtccctgatc tatgctgcat ccagtttgca aagtggggtc 240 ccatcaaggt tcagcggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagcctg 300 cagcctgaag attttgcaac ttattactgc caacagtata atagttaccc gtacactttt 360

ggccagggga ccaagctgga gatcaaacga 390 <210> 49 <211〉 130 <212> PRT <213> Homo sapiens <400〉 49

Met Asp Met Arg Val Leu Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys

Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser 20 25 30

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45

Gin Gly lie Ser Arg Trp Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Lys 50 55 60 104697-1. doc 1359154

Ala Pro Lys Ser Leu lie Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val 65 70 75 80

Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie 115 120 125

Lys Arg 130

<210〉 50 <211〉 426 <212> DNA 〈213〉 Homo sapiens <400〉 50 atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60 gtgcagctgt tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac ctttagcagc tatgccatga gctgggtccg ccaggctcca 180 gggaaggggc tggagtgggt ctcagatatt agtggtagtg gtggttacac atactacgca 240 gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaaaac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgaa aacaggcgat 360 ggttcgggga gttattcccc tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 420 -38 - 104697-l.doc 1359154 426 gctagc <210〉 51 <211〉 142 <212〉 PRT <213> Homo sapiens <400> 51

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala lie Leu Lys Gly

Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin 20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45

Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60

Glu Trp Val Ser Asp lie Ser Gly Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala 65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys 85 · 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 -39 - 104697-1. doc 1359154

Tyr Tyr Cys Ala Lys Thr Gly Asp Gly Ser Gly Ser Tyr Ser Pro Asp 115 120 125

Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 130 135 140 <210〉 52 <211〉 390

<212> DNA <213〉 Homo sapiens <400> 52 atggacatga gggtcctcgc tcagctcctg gggctcctgc tgctctgttt cccaggtgcc 60 agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctcactgt ctgcatctgt aggagacaga 120 gtcaccatca cttgtcgggc gagtcagggt attagcagct ggttagcctg gtatcagcag 180 aaaccagaga aagcccctaa gtccctgatc tatgctgcat ccagtttgca aagtggggtc 240 ccatcaaggt tcagcggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagcctg 300 cagcctgaag attttgcaac ttattactgc caacagtata atagttaccc gtacactttt 360 ggccagggga ccaagctgga gatcaaacga 390 <210〉 53 <211〉 130 <212〉 PRT <213> Homo sapiens <400> 53

Met Asp Met Arg Val Leu Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys 40 - 104697-l.doc 1359154 15 10

Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser 20 25 30

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45

Gin Gly lie Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Lys 50 55 60

Ala Pro Lys Ser Leu He Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val 65 70 75 80

Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie 115 120 125

Lys Arg 130

<210> 54 <211〉 35 <212> DNA 41 104697-l.doc 1359154 〈213>人工序列 <220〉 <223〉人工序列描述：引子 <400> 54 gcgactaagt cgaccatgga gtttgggctg agctg 35

<210〉 55 <211〉 35 <212> DNA <213〉人工序列 <220> 〈223>人工序列描述：引子 <400> 55 tgggcccttg gtgctagctg aggagacggt gaccg 35 <210〉 56 <211〉 45 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列描述：引子 42 104697-l.doc 1359154 <400> 56 agagagagag gtcgaccacc atggagtttg ggctgagctg ggttt 45 <210〉 57 <211〉 39 <212> DNA • <213〉人工序列

<223〉人工序列描述：引子 <400> 57 39 agagagagag gctagctgag gagacggtga ccagggtgc <210〉 58 <211〉 45

<212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列描述：引子 <400〉 58 agagagagag gtcgaccacc atggagtttg ggctgagctg ggttt 45 104697-1.doc 1359154 <210〉 59 <211〉 41 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列描述：引子 <400> 59 agagagagag gctagctgag gagacggtga ccagggttcc c 41

〈210〉 60 <211〉 35 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列描述：引子 <400〉 60 35 atcacagatc tctcaccatg gacatgaggg tcccc <210> 61 <211〉 35 〈212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 -44 - 104697-l.doc 1359154 <223〉人工序列描述：引子 <400> 61 acagatggtg cagccaccgt acgtttaatc tccag 35

<210〉 62 <211> 45 <212> DNA 〈213>人工序列 <220〉 <223〉人工序列描述：引子 <400〉 62 45 agagagagag agatctcacc atggaagccc cagctcagct tctct <210〉 63 <211〉 42 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列描述：引子 <400〉 63 agagagagag cgtacgtttg atttccacct tggtcccttg gc 42 45 104697-1. doc 1359154 <210> 64 <211> 44 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列描述：引子

<400〉 64 agagagagag atctctcacc atgtcgccat cacaactcat tggg 44 <210〉 65 <211> 41 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列描述：引子

<400〉 65 41 agagagagag cgtacgtttg atatccactt tggtcccagg g <210〉 66 <211> 45 <212> DNA 〈213〉人工序列 104697-1.doc 46 1359154 <220〉 <223〉人工序列描述··引子 <400> 66 agagagagag agatctcacc atggaagccc cagctcagct tctct 45

<210〉 67 <211〉 41 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列描述：引子 <400> 67 agagagagag cgtacgtttg atctccacct tggtccctcc g 41 〈210〉 68 <211〉 45 <212〉 DNA 〈213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列描述：引子 <400> 68 agagagagag agatctcacc atggacatga gggtcctcgc tcagc 45 -47 - 104697-1.doc 1359154 <210> 69 <211〉 41 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉〈223>人工序列描述：引子

<400〉 69 agagagagag cgtacgtttg atctccagct tggtcccctg g 41 〈210〉 70 <211〉 48 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列描述：引子

<400> 70 agagagagag gtcgaccacc atggatctca tgtgcaagaa aatgaagc 48 <210〉 71 <211> 41 <212> DNA <213〉人工序列 48 - 104697-1.doc 1359154 <220〉 <223〉人工序列描述：引子 <400> 71 agagagagag gctagctgag gagacggtga ccgtggtccc t 41

<210〉 72 <211〉 45 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列描述：引子 <400> 72 agagagagag gtcgaccacc atggagtttg ggctgagctg gcttt 45

<210〉 73 <211〉 41 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列描述：引子 <400〉 73 agagagagag gctagctgag gagacggtga ccagggttcc c 41 104697-1.doc -49 - 1359154 <210〉 74 <211〉 26 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列描述：引子

<400〉 74 cggggtacgt gccaagcatc ctcgtg 26 <210〉 75 <211〉 26 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列描述：引子

<400> 75 atgctgggcg cccgggaagt atgtac 26 <210〉 76 <211〉 26 <212> DNA <213〉人工序列 104697-1. doc 50 1359154 <220〉 <223〉人工序列描述：引子 <400> 76 gaaagatgag ctggaggacc gcaata

<210〉 77 <211〉 30 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列描述：引子 <400〉 77 ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac <210〉 78 <211> 24 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列描述：引子 <400> 78 gacaccctca tgatctcccg gacc 104697-1.doc 1359154 <210〉 79 <211> 24 <212> DNA 〈213>人工序列 <220> <223〉人工序列描述：引子

<400> 79 tgttctccgg ctgcccattg ctct 24 <210〉 80 <211> 27 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列描述：引子

<400〉 80 27 ggtccgggag atcatgaggg tgtcctt <210〉 81 <211〉 26 <212> DNA <213〉人工序列 52 104697-1. doc 1359154 <220〉 <223〉人工序列描述：引子 <400> 81 tggctgcacc atctgtcttc atcttc 26

<210> 82 <211〉 1413 <212〉 DNA <213> Homo sapiens <400〉 82 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagttgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcgt ctggattcac cttcagtcac tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcacttata tggtatgatg gaagtaataa atactatgca 240 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agatccctta 360 gcagctggta cgtcctactt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 420 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 480 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 540 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 600 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 660 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 720 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 780 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 900 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 960 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1020 104697-1.doc -53 1359154 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1140 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1200 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1260 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1380 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1413

<210〉 83 <211〉 470 <212〉 PRT <213> Homo sapiens <400〉 83

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 1 5 10 15

Val Gin Cys Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin 20 25 30

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45

Ser His Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60

Glu Trp Val Ala Leu He Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 -54 - 104697-1. doc 1359154

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Leu Ala Ala Gly Thr Ser Tyr Phe Asp 115 120 125

Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 130 135 140

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 145 150 155 160

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 165 170 175

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 180 185 190

Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 195 200 205

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn 210 215 220

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro 225 230 235 240 一 55 _ 104697-l.doc 1359154

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 245 250 255

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 260 265 270

Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 275 280 285

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 290 295 300

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn 305 310 315 320

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp 325 330 335

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 340 345 350

Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 355 360 365

Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 370 375 380

Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie 385 390 395 400 56 - 104697-1.doc 1359154

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 405 410 415

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 420 425 430

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys 435 440 445

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 450 455 460

Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 84 <211> 702 <212〉 DNA <213> Homo sapiens <400> 84 atgtcgccat cacaactcat tgggtttctg ctgctctggg ttccagcctc caggggtgaa 60 attgtgctga ctcagtctcc agactttcag tctgtgactc caaaggagaa agtcaccatc 120 acctgccggg ccagtcagag cattggtagt agcttacact ggtaccagca gaaaccagat 180 cagtctccaa agctcctcat caagtatgct tcccagtcct tctcaggggt cccctcgagg 240 ttcagtggca gtggatctgg gacagatttc accctcacca tcaatagcct ggaagctgaa 300 gatgctgcag cgtattactg tcatcagagt agtagtttac cattcacttt cggccctggg 360 accaaagtgg atatcaaacg aactgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 420 gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 480 -57 - 104697-l.doc 1359154 agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 540 agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 600 agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 660 agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ag 702 <210〉 85 <211〉 233 <212〉 PRT <213> Homo sapiens

<400〉 85

Met Ser Pro Ser Gin Leu lie Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala 15 10 15

Ser Arg Gly Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Asp Phe Gin Ser Val 20 25 30

Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie 35 40 45

Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gin Ser Pro Lys 50 55 60

Leu Leu He Lys Tyr Ala Ser Gin Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg 65 70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Asn Ser 85 90 95 104697-1. doc -58 - 1359154

Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gin Ser Ser Ser 100 105 110

Leu Pro Phe Thr Fhe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp lie Lys Arg Thr 115 120 125

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu 130 135 140

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 145 150 155 160

Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly 165 170 175

Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 180 185 190

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 195 200 205

Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val 210 215 220

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210〉 86 <211> 1434 59 - 104697-1. doc 1359154 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 86 atggatctca tgtgcaagaa aatgaagcac ctgtggttct tcctcctgct ggtggcggct 60 cccagatggg tcctgtccca gctgcaggtg caggagtcgg gcccaggact ggtgaagcct 120 tcggagaccc tgtccctcat ctgcactgtc tctggtggct ccatcaggac cagtggttac 180 tactggggct ggttccgcca gcccccaggg aagggactgg agtggattgg gactagtcat 240 aatagtggga gcacctacta caacccgtcc ctcaagagtc gagtcaccat atccgtagac 300 acgtccaaga accagttctc cctgaagctg aactctgtga ccgccgcaga cacggctgtg 360

tattactgtg cgagacaagg ttacgatttt aaagtcaata tagacgtctg gggacaaggg 420 accacggtca ccgtctcctc agcctccacc aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc 480 tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc 540 cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc 600 ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc 660 agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag 720 gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc accgtgccca 780 gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 840 ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 900 cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 960 ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 1020 caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 1080 cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 1140 ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 1200 ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1260 tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 1320 accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1380 gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa atga 1434 104697-1. doc 60 - 1359154 <210> 87 <211> 477 <212> PRT <213> Homo sapiens <400〉 87

Met Asp Leu Met Cys Lys Lys Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu 15 10 15

Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp Val Leu Ser Gin Leu Gin Val Gin Glu 20 25 30

Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu He Cys 35 40 45

Thr Val Ser Gly Gly Ser He Arg Thr Ser Gly Tyr Tyr Trp Gly Trp 50 55 60

Phe Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp He Gly Thr Ser His 65 70 75 80

Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gin Gly Tyr 115 120 125 -61 104697-1. doc 1359154

Asp Phe Lys Val Asn lie Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr 130 135 140

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 145 150 155 160

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 165 170 175

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 180 185 190

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly 195 200 205

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 210 215 220

Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 225 230 235 240

Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 245 250 255

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 260 265 270

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu 275 280 285 -62 - 104697-l.doc 1359154

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Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 340 345 350

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr He Ser Lys 355 360 365

Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 370 375 380

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 385 390 395 400

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin 405 410 415

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 420 425 430

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin 435 440 445 63 104697-1. doc 1359154

Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 450 455 460

His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 475

<210〉 88 <211〉 705 <212〉 DNA <213> Homo sapiens <400〉 88 atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 180 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 240 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 300 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggccgctcac tttcggcgga 360 gggaccaagg tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 705

<210〉 89 <211〉 234 <212〉 PRT -64 - 104697-1. doc 1359154 <213> Homo sapiens <400〉 89

Met Glu Ala Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser 35 40 45

Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro 50 55 60

Arg Leu Leu lie Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala 65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser 85 90 95

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser 100 105 110

Asn Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg 115 120 125

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 130 135 140 104697-1. doc _ 65 - 1359154

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160

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Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 66 - 104697-1.doc

Claims

13襲4 申請專利範圍：種人類抗體或其機能性片段，其結合於A33，且該人類抗體或其機能性片段具有包含以序列號39表示之重鏈胺基酸序列之可變區域、及以序列號41表示之輕鏈胺基酸序列之可變區域之重鏈可變區域及輕鏈可變區域。 2. -種醫藥組合物，其係以如請求項i之人類抗體或其功能性片段作為有效成分。 3. :種腫瘤之預防或治療劑，其係以如請求項r人類抗體或其功能性片段作為有效成分。 4. 如凊求項；3之腫瘤之預p大七、A 士 ^ 現幻3之^ / 療劑’其中_係、含有表兄A 3 3之癌細胞。 5. —種抗體之製造方法，其 Μ表示之重鏈核酸序列之可變區域·製作具有以序列號之輕鏈核㈣狀可變區域㈣^序列號40表示導入宿主，培養該宿主ή 見载體，將該表現載體以，自培養物中獲得該抗體。 104697-1000825.doc