TWI353847B - Sulfur-containing proanthocyanidin oligomer compos - Google Patents

Description

1353847 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種含硫原花色素低聚物及其組成物 以及彼等之製造方法及用途，更明確地說，係關於將植物 中之原花色素類低分子量化至容易被生體之腸管吸收之 程度之一種含硫原花色素低聚物之製造方法；及以該含硫 原花色素低聚物作為有效成分供治療及預防由活性氧種 (active oxygen species)之生成等為因之各種生活習慣病 及腦部疾病等之健康食品及醫藥組成物。 【先前技術】 由於飲食生活之改變攝取過多量之脂肪，環境的變 化，因臭氧層之破壞增加紫外線之曝露量，環境污染物質 之增加等為原因之高脂血症、高膽固醇血症、高血壓、糖 尿病、癌症等所謂之生活習慣病逐年增加，同時過敏症及 癡呆症等腦疾病患者亦有逐年增加趨勢。隨著高齡化社會 之形成，癡呆症及阿耳滋海默症候群等病患有增加之慮。 這些疾病之主要原因有人認為是與生體内生成之活性氧 種有關（例如 Bioorgnic & Medicinal Chemistry，10 (2002)， 2495-2509所載）。但，有關活性氧種之完全抑制或控制技 術未被開發，因此目前對生活習慣病或腦部疾病等有效預 防及治療技術尚未完全確立。 存在於植物中而具有生理活性之天然物質，尤其酚類 化合物，近年已特別受人關注。酚類通常含於茶、蔬菜、 水果及草本植物中，長年來當作食品或嗜好品為人攝取， 6 1353847 是為不具副作用且被視為具有治療、預防效果之物質。 酚類化合物為植物之二次代謝產物，係普遍且大量 在於植物界，其具多種之生理活性已為人所知，古時在藥 學、植物化學等領域而近年則在健康食品領域廣受人注 目。例如茶之聚酚，尤其兒茶素（catechin),在抗菌、抗 病毒、抗突變、抗氧化'抑制血壓上昇、降低血中膽固醇二 抗齲蝕、抗過敏、改善腸内微生物及消臭等具有廣泛之生 理活性是為人所知。 ^聚酚中最廣泛含於植物之聚酚為原花色素類。為使原 化色素類顯不上述之多種生理活性，原花色素化合物必須 經由腸管被吸收於生體内。但由於原花色素類之分子量通 吊尚達數千乃至數萬之譜。如此大分子量之物質極難經由 腸管被吸收，即便攝取亦不被生體吸收利用。 本發明人曾發現由喬麥萃取之聚酚具有改善脂質代 謝及腦功能等之作用而提出專利之申請（日本特開平）〇 -218786號公報）’其有效成分為原花色素之聚合物，但 其被生體吸收之吸收性尚難稱理想，猶待研發改進。 【發明内容】 本發明係以將難經由腸管被吸收於生體之原花色素 化合物改變成易被吸收之形態’使原花色素化合物所具有 之多種生理活性效果充份發揮，提高生體之抗氧化活性為 目的提供泠療及預防原因於活性氧種之生活習慣病或腸 疾病所用之醫藥品及健康食品等。 本發明人經研究發現含有原花色素類之植物或其萃 7 1353847 取物與SH基含有化合物反應所得之低分子量含硫原花色 素低聚物經由腸管易被生體吸收，經口攝取即能顯示各種 生理活性之一事實，逐而完成了本發明。 即，本發明涉及作為醫藥品及健康食品組成物有用之 下述含硫原花色素低聚物及其組成物，以及彼等之製造方 法。 1·以含有原花色素類之植物或其萃取物與SH基含有 化合物反應所得之反應液，經過濃縮及乾燥所得之含硫原 7匕色素低聚物作為主成分構成之組成物。 2. 上面1所述之含硫原花色素低聚物組成物，其中該 低聚物為原花色素之2〜5低聚物。 3. 上面1所述之含硫原花色素低聚物組成物，其中該 含有原花色素類之植物係選自果菜類、茶類、草本植物 類、木材·樹皮類之至少一種。 4. 上面1所述之含硫原花色素低聚物組成物，其中該 SH基含有化合物為選自半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽、别 基含有縮氨酸及彼等之鹽類之至少一種。 5. 上面1〜4之任一項所述之組成物，其係生活習慣病 之治療及/或預防用之醫藥組成物。 6. 上面卜4之任一項所述之組成物，其係老化預防用 之醫藥組成物。 7. 上面1-4之任一項所述之組成物，其係生活習慣病 之改善及/或預防用之健康食品組成物。 8. 上面1~4之任一項所述之組成物，其係老化預防用 1353847 之健康食品組成物》 9- 一種含硫原花色素低聚物’其係將含有原花色素類 之植物或其萃取物與SH基含有化合物反應所得之含有含 硫原花色素低聚物之成分分離所得者。 10. 上面9所述之含硫原花色素低聚物，該低聚物為 原花色素之2~5低聚物。 11. 一種含硫原花色素低聚物組成物之製法，包括： 令含原花色素類之植物或其萃取物於酸性條件下與含SH 基化合物反應’繼之將該反應液濃縮及乾燥處理。 12. —種含硫原花色素低聚物之製法，包括：令含原 花色素類之植物或其萃取物於酸性條件下與含SH基化合 物反應，繼之將該反應液濃縮及分離處理。 13. 上面11或12所述之製法，其中該含原花色素類 之植物係選自果菜類、茶類、草木植物，木材.樹皮類之 至少一種。 14. 上面11或12所述之製法，其中該含別基化合物 係選自半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘狀、含別基肽酸及彼 等之鹽類之至少一種。 15. 上面11或12所述之製法’其中該酸性條件係使 用無機酸、有機酸或此兩者形造者。 16. 上面15所述之製法，其中該酸性條件係使用選自 鹽酸、硫酸、硝酸、醋酸、檸檬酸、抗壞血酸、蘋果酸之 至少一種形造者。 9 1353847 17.—種如下式（4)所示之原花色素化合物：

0H

(4) 18·—種如下式（5)所示之原花色素化合物··

19. 一種如下式（6)所示之原花色素化合物： 10 1353847

OH

20. —種如下式（7)所示之原花色素化合物：

21.—種如下式（8)所示之原花色素化合物：

OH

11 1353847 發明之詳細說明 本發明之含硫低聚物通常為原花色素 (proanthocyanidin)之2~5聚物，分子量通常1500以下0 此低聚物，即含硫原花色素低聚物最好是由含有原花色素 類之植物或其萃取物與含SH基化合物在酸性條件下反應 而製取。所用之酸宜選自鹽酸、硫酸、硝酸等無機酸類， 或醋酸、檸檬酸、抗壞血酸、蘋果酸之至少一種，濃度為 0. 1N〜1. 0左右，最好為0. 5N。 在本說明書中所稱之原花色素係指兒茶素（catechin) 聚合物，具體而言，包括兒茶素、表兒茶素（epicatechin)、 表沒食子兒茶素（epigallocatechin)、表沒食子兒茶素沒食 子酸鹽（epigallocatechin gallate)、沒食子兒茶素（gallo catechin)、沒食子兒茶素沒食子酸鹽（gallo catechin gallate) 或以這些為構成單元者。 含有原花色素類之植物可例舉柿子、梨子、葡萄、草 苺、香蕉、酪梨、毛桃、蓮藕、喬麥等果菜類、綠茶、紅 茶、烏龍茶等茶類以及例如草本植物類、木材·松樹皮等 多種植物。此等含有原花色素類之植物或其萃取物（包括 梓汁）均適用。 本發明所用之含SH基化合物可舉半胱氨酸、胱氨 酸、谷胱甘肽、含SH基肽酸及彼等之鹽類，其他尚有含 有硫之蔥及蒜等天然物。硫醇類雖亦可用，但由於本發明 之含硫原花色素低聚物係供作食品及醫藥組成物利用，故 宜選用在食品及醫療品上所許可之含SH基化合物。 12 1353847 含有原花色素類之植物或其萃取物與含SH基化合物 之反應係於室溫至8(TC，較佳為40〜60t之溫度下實行數 小時乃至一星期，最好24〜48小時。 反應溶媒可用水'甲醇、乙醇等一種或二種以上之混 合物’但考慮其用途為食品及醫藥品，宜選用水或乙醇。 反應後濾除殘渣，將濾液濃縮後依通常方法精製。即 濃縮液之精製可利用膜處理法（限外過濾或逆浸透等）或 用吸收劑處理。吸收劑可舉苯乙烯_二乙烯笨系吸收劑、 曱基丙烯酸系吸附劑、親水性乙烯系聚合物、改質聚合葡 萄糖膠、聚丙烯醯胺凝膠、逆相系矽凝膠及離子交換樹脂 等。使用此等吸附劑時，於其吸附區會含有與含SH基化 合物反應而低分子量化之聚酚化合物（含硫原花色素低聚 物）。使用含水乙醇、乙醇或丙酮等從該吸附區溶出即可 得各種分子量之成分。

如此獲得之含硫原花色素低聚物，由順相HPLC及NMR 測定值確認係如下—般式⑼所示之原花色素之2聚物至 5聚物。 13 1353847 R2

式中：n為0或1〜3之整數，R1為氫或下式所示

OH

OH 之掊醯（galloyl)基，R2及R3各獨立的代表氫或氫氧 基，R4為半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽、含SH基肽殘基。 含硫原花色素低聚物因係分子量1500以下之低分子 物質，故通過腸管容易被吸收於生體内。由下述試驗例所 示它具有：良好之DPPH游離基消除作用、SOD狀活性增 進作用、P450系酯質過氧化抑制作用、對FNT氧化緊張 之保護作用 '由膠化纖維素（amyloid)誘導之對氧化的 14 1353847 細胞死具有神經細胞保護作用以及對由鏈脲菌素 (Streptoz〇t〇cin，STS)誘發之糖尿病具有預防作用，且比其 他聚酚素材具有較高之抗氧化能。另外，在對人之抗氧化 指標之監測試驗亦得到了被判斷為基於抗氧化效果之資 料（data)。 因此，以本發明之含硫原花色素低聚物為有效成分之 組成物不但對生體具有過氧化脂質生成抑制作用且對起 因於活性氧之氧化障害為因之疾病具有功效，因此對起因 於過氧化脂質或活性氧生成之各種臟器之障害及老化具 有預防效果，對於由其發生之各種疾病之治療及預防具^ 效果。此外，對被認為腦之老化為因之礙呆症等腦功能障 害之抑制、防止、治療亦可能有效。同時由於腦功能之改 進，對學習能力之提高、焦慮感之減消、不眠症之解消等 效果亦可期待。故以本發明之含硫原花色素低聚物為有效 成分之組成物可當作醫藥組成物及健康食品組成物利用。 本發明之組成物由於全無毒性，可安心使用。使用方 式可經π或非經σ ’經口使用之場合其投與劑量雖依年 齡、體重、症狀、治療目的及投與方法等不同，但通常對 成人一日一次使用i 〇〇〜2〇〇〇mg範圍。經口投盥時， 將本發明組成物製成錠劑、膠囊劑、粒劑、粉劑、 t口=與時，製成注射劑、塗布劑等。製成粒劑、 需要適當使用補助.添加劑，例如殿粉類， 糊甘味劑類'色素、香料等一般 【實施方式】 15 1353847 以下依實施例及試驗例具體的說明本發明之含硫原 花色素低聚物組成物，但本發明不受所舉例子之範圍之限 制。 實施例1 :葡萄種軒由來含硫原花色素低聚物之製造 (1)葡萄種籽聚酚之萃取 使用80%曱醇（30公升）在室溫下萃取8公斤之 乾燥葡萄種籽3天，濾除殘渣後對濾液實施減壓濃縮，然 後依下述條件精製該濃縮液。 [精製條件] 將濃縮液全量放置於填充有DIAION HP-20 (三菱化 學製’載體）之直徑200麵，高30cm (約25公升）之枉 中（column)，以1〇〇公升（L)之水洗淨。隨後用曱醇50公 升溶出’並將此溶出物減壓濃縮及冷凍乾燥，獲得456克 之粉末狀組成物。 (2)與半胱氨酸進行低分子化反應 將上述（1)所得之葡萄種籽聚酚400克、L-半胱氨酸 (和光純藥工業公司製）400克、抗壞血酸（純正化學公 司製）4克、檸檬酸（和光純藥工業公司製）〇8公斤及 水4公升混合，置於4〇°c下反應48小時。將反應液引入 填充有載體DIAION HHP-20 (三菱化學製）之直徑200 随’高800咖1之柱（容積約25公升）中，以ι〇〇公升之 水洗淨非吸附部分後，利用4〇%乙醇5〇公升回收溶出部 分，然後減壓濃縮及冷凍乾燥，獲取易溶於水、曱醇、乙 醇之紅褐色粉末408克。將此粉末導入填充有載體 16 1353847

Sephadex LH-20 (Parmacia公司製）之柱（直徑5〇麵、高 500圃，容積約1公升）中’以乙醇/水混合液分劃，並依 野中等人之方法（載於〇1^111、卩11已1*111、刊物，34(2)、633〜642 頁（1986))分析該分劃之低聚物，結果組成如下： 19% 21% 11% 16% 半胱氨酸結合環氧兒茶素單聚物 半胱氨酸結合環氧兒茶素2聚物 半胱氨酸結合環氧兒茶素3聚物 半胱氨酸結合環氧兒茶素4〜6聚物 (3)半胱氨酸結合表兒茶素單體之精製分離 利用填充有SephadexLH-20載體（膠體物）的柱式 色譜分離法（使用水-曱醇-丙酮作為移動相），藉茚滿二 酮-醋酸試液之喷霧加熱呈現桃褐色之色點為心精: 述半胱氨酸結合表兒茶素單體部分，分 , 雕獲仵如下（1)〜（3Ί 式所示之化合物。

OH

17 1353847

OH

OH

式（1)之化合物（化合物1)在hr-fab-ms (高分解 高速原子衝擊法質量光譜法）的測定顯示分子離子峰

[M+H]+(m/z)在 410.0925，其與相當於分子式 C18H2〇〇8NS 之δ十算值410.0910僅以3.6ppm(10ppm以内）之誤差相— 致，因此推定化合物1之分子式為Cl8Hl908NS，且具有 L-半胱氨酸之硫原子結合於兒茶素（catechin)或表兒茶素 (epicatechin)之化學構造。另外，經由化合物！之ih_nmR (氫核磁共振譜’參照表1)測定確認到除兒茶素或表兒 务素共通所有之芳香環上之5個質子訊號（pr〇t〇n signal) 之外’在（5 5.〇9(br.s)、（5 4.〇7(m)及 5 3.86(d，J=2Hz)確認 到質子一個分之根部具有氧原子或硫原子之訊號群。前二 者表示該化合物1具有表兒茶素之立體配位。而5 3.86(d， 18 1353847 J=2Hz)之質子訊號屬於4α配位，硫原子配位於、係 相當於硫解（thiolysis)生成物之訊號。另外在54.13(1H， dd，J=9，4Hz)，<5 2.95(1H，dd，J=15 ’ 9Hz)及 <5 3.43(1H， dd，J=15，4Hz)確認到有ABX型之信號群，此表示在半 胱氨酸之次甲基有亞曱基鄰接之部分構造。根據此等資 料，推定化合物1之化學構造為式（1)所示之4yS -(S-L半 胱氨酸基）-(-)-表兒茶素。在此化合物1之13C-NMR (碳 -13核磁共振譜，參照表2) (DEPT法）測定所確認到之包 含各碳級數以及18個碳訊號亦支持此化學構造。 經由式（2)之化合物（化合物2)之1H-NMR (參照表 1 )測定在 5 4.86(1H，d，J=9,6Hz)，<5 4.22(1H，dd，J=9.6， 4.31^)及（5 4.23(1^1，0，1=4，31^)確認到質子一個分之根 部具有氧原子或硫原子之訊號群。前二者分別屬於兒茶素 之 2召、3 /5 配位，而，d 4·23(1Η，d，J=4，3Hz)屬於 4 Cl!配位，硫原子係相當於硫解生成物之訊號。因此化合物 1及化合物2只是其3位之立體配位不同，推定係具有式 (2)所示構造之化合物4/3 -(S-L-半胱氨酸基）-( + )-兒茶 素。 式（3)之化合物（化合物3)於HR-FAB-MS之測定顯 示分子離子峰在[M+H]+(m/z)在426.0844，其與相當於比 化合物1多一個氧原子之分子式C18H2G09NS之計算值 · 426.0859以誤差3.5ppm相一致。另由W-NMR (參照表 1)之測定獲知，除在芳香環領域之5 6_57(2H，s)顯示有 2’及6’位之氫之等價訊號之外，與化合物1對應、類似。 19 1353847 因此併合表2所示13C-NMR之訊號歸屬，推定化合物3 為/、有式（3)所式構造之4谷_(S_L_半胱氨酸基）-(-)-表 沒食子兒茶紊。 表1 · •化合物1、2及3之1H-NMR信號歸屬（占為ppm) ----- H No. 化合物1 化合物2 化合物3 2-H 5. 09 (br. s) 4. 86 (d, 2Hz) 5.13 (s) 3-H 4. 07 (m) 4. 22 (dd, 8. 3, 2Hz) 4. 07 (s) 4-H 3.86(d，2Hz) 4. 27 (d, 2Hz) 3. 92(s) 6-H 5. 99 (d, 2Hz) 6. 04 (d, 2Hz) 6. 03 (br. s) 8-H 5. 87 (d, 2Hz) 5. 81(d，2Hz) 5. 96(br. s) 2，-H 6. 99 (d, 2Hz) 6. 94 (br. s) 6. 57 (s) 5，-H 6. 76 (d, 8. 3Hz) 6. 86 (br. s) 6〜H 6. 8l(dd, 8. 3, 2Hz) 6. 86 (br. s) 6. 57 (s) cys 2-H 4. 13 (dd, 9, 4Hz) 4. 07 (dd, 9, 4Hz) 4. 10 (m) cys 3-¾ 2. 95(dd, 15, 9Hz) 3.02(dd，15,9Hz) 3. 00(dd, 15, 9Hz) 3. 43 (dd, 15, 4Hz) 3. 55 (dd, 15,4Hz) 3. 45 (dd, 15,4Hz) 表中化合物1係在丙酿1 -dg-DzO中，而化合物2及3 係在CD3OD中之測值。 20 1353847 表2:化合物1及3之丨3C-NMR信號歸屬（占為PPm) C No. 化合物1 化合物3 02 74.7 75.7 -3 70.6 71.9 -*4 41.7 42.9 - 5 156. 1 157.2 -6 94.5 96.2 -7 167. 1 158.2 -8 96.4 99.0 -9 157.7 159.1 -10 99.0 99.6 -1' 130.8 131.1 _2， 115.8 a) 107.1 -3， 144. 6 b) 146.7 -4f 144.7 b) 133.6 -5’ 115.9 a) 146.7 _6’ 119. 1 107. 1 Cys-1 172. 1 172.9 -2 53.7 54.7 -3 32.9 34.0 表中化合物1係在丙酮-心-〇2〇中，而化合物3係在 CDsOD中之測值。又，表中標有a)、b)之值係可交換。 (4)半胱氦酸結合表兒茶素二聚物之精製分離 由半胱氮酸結合表兒茶素二聚物區分粉末’依上述（3) 所述同樣方法精製，分離獲得式（4)所示之化合物（化合 物4 ) 〇 21 1353847

OH

化合物4在FAB-MS之測定顯示分子離子峰[M+H] + (m/z)在698,由此可認為比化合物i具有多一個兒茶素單

位（unit)之構造。另外，雖然在TLc及HPLC之測定兩者 (化合物1及4)顯示同一舉動（behavior)，但此化合物4 之H-NMR信號顯示寬訊號群中混挾有尖銳訊號（sharp signal)之頻譜。由此特徵的ih nmr信號推想縮合之結合 位置為4->6或4->8中較強力產生回轉障害之後者（4-> 8)。在直結於4—8鍵結合之各個苯駢哌喃由來訊號群確 "忍到有變寬之變形。即<5 4· 22、5 4.54、5 4.96 (各為 1H，br. m，c-3，_4，_2)屬於上端單元（unit)而較尖銳之占 3.83、（5 3.90(各為 1H，s，c_4，，-3，）、5.20(1H，br，m，c-2')屬 於，硫原子結合之單位（下端）。由分子模型觀察亦證明下 端單位比上端單位較無受到回轉障害。在5 5.92之芳香環 領域確認到有屬於e_6、_8、_6，之f子三個分之信號呈封 包（envelope)。而在占66與5 7 〇9間確認到兩單位B環上 之質子群’其中之結合常數8·3Ηζ之线的雙訊號(dl〇ublet 22 1353847 signal)可視為屬於無受回轉障害之下端單位之$配位。其 餘之訊號5 2.95、6 3_44(各為出，1>]*.111，。)^-〇-3)、<5 4·14(1Η’ dd，J=9, 4Hz，Cys-C-2)可推定為源自半脘氨酸殘 基》在化合物4之13C-NMR測定（參照表3)時確認到有 相當於化合物1之信號群，由此支持其為具有式（4)構造 之化合物4,即4沒（S_L_半胱氨酸基）_(_)_表兒茶素_(4万 —8)-(-)-表兒茶素。 表3:化合物4之13C-NMR信號歸屬（5為ppm) __Cfc. C No. C-2 76.0 C-2f 74.6 '3 72.0 -3' 69.9 -4 36. 1 ~4f 42.0 -5 156. 6 s> •5' 156. 5 a) —6 95.3 -6' 95.3 -7 156.5 一 V 156.6 - 8 95.3 一 8' 99.0 *9 156.5 -9' 156. 6 a) -10 99.0 -10， 99.0 〇 ring-i 130.7 B ring-1， 130.7 -2 114. 7 b) -2， 115.7 r3 144. 6 e) -3' 144.6 -4 144. 2 c) 144.2 . -5 115.0 w 115.7 -6 119.2 -6' 119.2 Cys-1 172.2 -2 53.7 32.8 表中各試料係在丙酮-d6-D2〇中測定》 ‘有a)、b)及c)之化學移位值係可交換。 23 (5)半脱氨酸結合環氧兒茶素三聚物之精製 依上述⑴同樣方法精製半耽氨酸結合 ^ 聚物粉末，分離獲得式（5)所示之化合物（化合物y =

化合物5在HR-ESI-MS之測定顯示分子離子峰 [M-H]+(m/z)在984.1956,其與相當於分子式C48H為〇ns 之計算值984.2011僅以5.5ppm之誤差相一致。因此推定 化合物5之分子式為C48H43〇2〇NS ’且具有L-半胱氨酸结 合於兒茶素或表兒茶素構成之3分子縮合物之化學構 造。又此化合物5之1H-NMR訊號全體呈寬頻訊號，其3 個兒茶素單元皆直鏈狀的縮合於4—8鍵，此提示有l-半 胱氨酸結合於下端單位且由於芳香環上之訊號在5 5 98 顯示者為單訊號（singlet signal)，因此分別歸屬於a環 -6-H、-8-H ’ A’環-6-H ’ A"環-6-H。在較低磁場確認到之 24 1353847 ^f^#(5 6.04,s； 5 6.91，7.01 · s； 57.ll > s) « * - ^ 比為m 3 ’係屬於B環、Bi環、b”環上之2 h由 來信號，占6.91及57.〇1(2: υ之信號推想係因位置於中 間之Β，_2·Η最受到轉障害而分裂顯現者。根據此等資 訊，暫推定化合物5之平面構造為式（5)所示。 實施例2:葡萄種轩由來含硫原花色素低聚物之製造 實施例1同-原料及條件萃取葡萄種軒聚盼，並依實 施例1之同-條件精製。使用此精製物在下述條件下與谷 胱甘肽反應’進行低分子化。 、 即，將製得之葡萄種軒聚盼1〇克、谷脱甘狀（和光 純藥製）3.0克、抗壞血酸（純正化學製）〇·5克、ιν鹽 酸50.0毫升混合，在贼下反應48小時，然後使用載^ DOAPM ΗΡ-20 (三菱化學製）、MCIgel CHp 2〇 (三菱化 學製）、SephadexLH-20(Pharmacia公司製）等精製、減壓 濃縮及冷;東乾無獲得紅褐色粉末12〇毫克。 1)谷胱甘肽結合單體 以聚苯乙烯膠、Sephadex LH-20膠及ODS系矽膠作 為載體及以水及甲醇之混合液作為移動相，利用柱式色笋 分離法反覆精製’獲得下式（6)所示之化合物6 : 25 1353847

此化合物6在HR-ESI-MS (高分解能電子噴麗離子 化質量光譜儀）之測定顯示分子離子峰[M+H]+(m/z) 596.1550，與相當於分子式CuHwOuNJ之計算值 596.1551僅以0.17ppm之誤差相一致。因此判斷化合物6 具有谷胱甘狀之L-半脱氨酸由來硫原子結合於兒茶素 或表兒茶素之化學構造。此化合物6在1H-NMR測定中除 確認到兒茶素或表兒茶素共通之芳香環上之5個質子訊

號群（5 5.84’ 5.96,6.91(各為 1H，8-，6-，2，-H); 3 6 73-6 78 (2H，m，5'- ’ 6'-H)外，在 <5 3.90，3_91，5.15(各為 1H， 3-，4-，5-H)確認到根部有氧原子或硫原子之訊號群，從 而與化合物1同樣被推定為在環氧兒茶素之4位有硫原子 配置於4/S之構造。此外還確認到相當於半胱氨酸部分（5 3·63(1Η，br.t，J=9, 4Hz，cys-2-H)，3.72，3.80(各為 1H d J=17.6 Hz, cys-3-H2)、谷氨酸酸部分（占 i m glu-4-H2)、1.78 (2H，m，glu-3-H2)、3.05 (1H, br.d，J=5.4 Hz glu-2-H))及甘胺酸部分（5 3_20 (2H，s，gly_2_H2))之訊號 群。此種構造由化合物6之13C-NMR(參照表4)測定所° 26 1353847 觀’測到之25個碳信號亦得以支持。 因此，推定化合物6之構造為谷胱甘肽分子之半脱氨 酸部分由來琉原子結合於表兒茶素之4 A之式（6)所示4 ^ -(甘胺氧硫基）-(-)-表兒茶素。 _ C No. C No. C-2 74.9 glu-1 173.3 -3 70.9 -2 55.0 -4 43.3 -3 27.0 -5 156.5 -4 32.4 -6 96.9 _5 174.3 -7 115.9 cys-1 174.3 - 8 95.8 -2 174.3 '9 157.9 -3 34.0 -10 99.7 gly-1 175. 4 131.5 -2 42.7 115.4 -3' 144. 9 * 145.0* -5' 116.7 一6’ 119.9 表4 :化合物6之13C-NMR信號歸屬（占為ppm) 表中各試料係溶解於cd3od中測定。 附有*之化學移位值為可交換。 實施例3松樹由來含硫原花色素低聚物之製造 (1)松樹皮聚酚之萃取 使用8〇%曱醇h5公升在室溫下萃取松樹皮400克,3 天，濾除殘渣後對濾液實施減壓濃縮，然後依下述條件精 製該濃縮液。

[精製條件I 27 丄叫847 將濃縮液全量放置於填充有DIAION Hp_20 (三菱化 千製載體）之直徑50 mm、高30 cm (約600毫升）之柱中， 以2500毫升之水洗淨非吸附部分。隨後用甲醇丨2〇〇毫升 /♦出，及將此溶出物減壓濃縮及冷凍乾燥，獲得18 4克 之粉末狀組成物。 (2)與半胱氨酸進行低分子化反應 將上述（1)所得之松樹皮聚酚1〇克、^半胱氨酸（和 光純藥公司製）1.7克、抗壞血酸（純正化學製）〇 25克、 鹽酸20.0毫升混合後置於4〇»c下反應48小時。將反 應液引入填充有載體DIAI〇NHP-20 (三菱化學製）之柱 (容積約100毫升）中’以400毫升之水洗淨非吸附部分 後’利用甲醇400毫升回收溶出部分，然後減壓濃縮及冷 來乾燥’獲取紅褐色粉末0.95克。 原花色素在試管内顯示強抗氧化活性，但經口攝取 時’在生體内不一定發揮充份之效果。其理由推想係因高 分子之原花色素在腸管難被吸收。對此，本發明之藉由 SH基含有物質低分子化之含硫原花色素低聚物，在試管 内顯示比高分子之原花色素為優之抗氧化活性。 實施例4山桃由來含硫原花色素低聚物之製造 (1)山桃聚酚之萃取 使用80%曱醇1.5公升在室溫下萃取山桃樹皮（揚梅 皮）400克3天，濾除殘渣後對濾液實施減壓濃縮，然後 依下述條件精製該濃縮液。 [精製條件1 28 1353847 將濃縮液全量放置於填充有DIAION HP-20 (三菱化 學製載體）之直徑50丽、高30 cm (約600毫升）之柱中， 以2500毫升之水洗淨非吸附部分。隨後用甲醇1200毫升 溶出，及將此溶出物減壓濃縮及冷凍乾燥，獲得18.4克 之粉末狀組成物。 (2) 與半胱氨酸進行低分子化反應 將上述（1)所得之山桃聚酚1.0克、L-半胱氨酸（和光 純藥公司製）1.7克、抗壞血酸（純正化學製）0.25克、 IN鹽酸20.0毫升混合後置於40°C下反應48小時。將反 應液引入填充有載體DIAION HP-20 (三菱化學製）之直 徑25 mm、高150mm(容積約100毫升）之柱中，以400 毫升之水洗淨非吸附部分後，利用甲醇400毫升回收溶出 部分，然後減壓濃縮及冷凍乾燥，獲得紅褐色粉末0.95 克。 (3) 楊梅皮聚酚與L-半胱氨酸之結合體 1)L-半胱氨酸結合表沒食子茶兒素沒食子酸鹽單體 以聚苯乙烯凝膠、Sephadex LH-20凝膠及ODS系矽 凝膠作為載體及以水-曱醇-丙酮之任意混合液作為移動 相，利用柱式色譜分離法反覆的精製上述（2)之紅褐色粉 末，分離獲得表沒食子兒茶素沒食子酸鹽、表兒茶素沒食 子酸鹽、（4点-8)表沒食子兒茶素沒食子酸鹽及上述化合物 3(式（3)化合物）外，分離下式（7)及（8)之化合物（化合物 7及化合物8 )。 29 (7)1353847

OH

OH

化合物7在ESI-MS之測定顯示分子離子峰[m_h]+ (m/z)575。另外，WNMR之測定結果（參照表5)，與化 合物1及化合物3相類似，但觀測到3_々（1h，5 29, s)有 約1.3ppm之低磁場移位，及在芳香環領域之a環上之6 鹽 及8位，以及6.68及6.96位分別確認到有質子2個分之 銳利的等價單訊號（1 ’ 3 ’ 4，5取代苯上之2及6位紅 由來）。此等訊號暗示該化合物7為表茶兒素之沒食子^ 併合此等資訊與表 vr r/f ^ v 推定化合物7為具有下式（7)之構造 基）-(-)-表茶兒素沒食子酸鹽。

1V1XV 之 爪现听又歸屬4召-(S-L-半胺酸 30 1353847 2)L -半胱氨酸結合表兒茶素沒食子酸鹽二聚物 化合物8在HR-ESI-MS之測定顯示分子離子峰 [M-J]+(m/z)1032.1517,與相當於分子式 C25H3〇012N3Si 計算值1032.1503僅以0.4ppm之誤差相一致，因而推定 比化合物7具有多一個表茶兒素沒食子酸鹽單位之構 造。又，化合物8之1H-NMR顯示與化合物4同樣在寬訊 號群中混夾有銳利（sharp)之訊號譜，因而推定其為4-> 8 縮合型且1Η及13C-NMR之訊號群與化合物4為同一歸屬 (參照表5及表6)，推定為具有式（8)所示構造之4yS(S-L-半胱氨酸基）-(-)-表茶兒素沒食子酸鹽-(4/3 — 8)-(-)-表茶兒素沒食子酸鹽。 31 1353847 表5 :化合物7及8之1H-NMR信號歸屬（<5為ppm) H No. 化合物7 化合物8 C-2-H 5. 37(s) 5. 50 (s) 3-H 5. 29 (s) 4. 75(s) 4-H 4. 16 (s) 4. 15 (br. s) A-6-H 6. 08 (s) 5. 87 (br. s) 8-H 6. 01 (d, 2. 2Hz) 5. 90 (br. s) B-2'-H 6. 45(s) 6. 45 (br. s) 6'-H 6. 45 (s) 6. 45 (br. s) gal-2-H 6. 96(s) 6. 96 (br. s) gal_6_H 6. 96(s) 7. 00 (br. s) C-2-H 5. 39 (br. s) 3-H 5. 12(br) 4-H 4. 15 (br. s) A〜6-H 6. 09 (br· s) 8-H — 6. 57 (br. s) 6'-H 6. 57 (br. s) gal-2-H 7. 00 (br. s) gal-6-H 7. 00 (br. s) cys 2-H 4. 19 (br. m) 4. 07 (dd, 9, 4Hz) cys 3~H2 3. 17 (dd, 15,8Hz) 3. 02 (dd, 15,9Hz) 3. 71 (br. d, 15Hz) 3. 55 (dd, 15, 4Hz) 表中化合物7及化合物8係分別在25°C及40°C之丙 _ -d6D20中測定。 32 1353847 表6 :化合物7及化合物8之13C-NMR信號歸屬（δ為 ppm) C No. 化合物7 化合物8 C-2 74.0 C-C-2 75.0 C，-c-2 73. 5 -3 74.0 -3 75.0 -3 73.5 -4 39. 3 -4 32.4 -4 38.9 -5 156. 2 A-C-5 154.8 A' -05 154.8 _6 95. 4 _6 94.7 -6 94. 7 -7 157. 3 -7 156. la) -7 155. 9 a) -8 97. 0 -8 95.3 -8 95.3 -9 158.9 -9 156.5 -9 156.5 -10 97.9 -10 96.6 -10 96.9 -lr 129.3 B~C~1 131· 9 B'-C -1 131.9 -2' 106.4 -2 106.0 -2 106.0 -3' 145.6 -3 131.9 -3 131.9 -4' 132.9 一 4 119.6 -4 119.6 -5' 145.6 - 5 144.8 _5 144.8 -6， 106.4 一 6 106.0 -6 106.0 gal-C-1 120. 2 gal-C-1 119.6 gal-C-1 119· 6 -2 109. 8 -2 109. 4 b> -2 109.4 -3 146.0 -3 145.0 -3 145.3 -4 139. 2 -4 138.8 -4 138.8 -5 146.0 -5 145.0 -5 145.3 - 6 109. 8 -*6 109. 5 b) - 6 109. 4 -c(=o)o- 167. 0 一 166. 7 -c(=o)o- 166.7 Cys-1 171.8 〇(=〇)〇- Cys-1 171.0 -2 53. 9 -2 53· 3 -3 33.3 -3 32.6 表中化合物7在丙酮-d6D20中’化合物8在CDaOD 中測定。 又表中標有a)、b)之化學移位值係可交換。 試驗例1 : DPPH基消除作用 對於實施例1之分離前之粉末（物質1 )。由該物質1 33 1353847 分離所得之單體部份（物質2)，由該物質1分離所得之 二聚物及三聚物部份（物質3)，由該物質1分離所得之 四〜六聚物部份（物質4) '實施例1之原料（葡萄種籽聚 酚萃取物）（比較物質1)，及市售之兒茶素（和光純藥 公司製）（比較物質2)分別依下述方法測定1，1-二苯基 -2-苄咪酸肼基（DPPH)之消除作用。 試驗方法 於具96個孔之微細板（microplate)裝填100微公升（// L)之DPPH溶液（60# L甲醇溶液），繼之添加試料之乙醇 溶液100//L及控制液之乙醇10〇eL，從在室溫下混合靜 置30分鐘，然後測定520nm之吸光度，依下式計算試料 之DPPH基消除能，並從階段的稀釋之試料之DPPH基消 除能及濃度計算其50%有效濃度（EC50)。 DPPH基消除能（％)=[( 1-試料之吸光度）/控制液之吸 光度]X 100 由各試料之階段的濃度之DPPH基消除能算出50%有 效濃度（EC5G)。結果示於表7。 表7_ DPPH 基消除之 EC5〇( /z g/mL) 物質1 1.62 物質2 2.78 物質3 1.45 物質4 0.77 比較物質1 1.55 比蛟物皙2 1.71 34 1353847 由上表可知DPPH基消除能，在低濃度時物質4顯示 較高。其他試料顯示同樣活性，在高濃度各試料皆顯示高 活性。 試驗例2 :活性氧去除酵素（SOD)狀活性 使用血中SOD活性測定器（商品名SOD Testwako， 和光純藥公司製）測定與上述試驗例1同物質1〜4，及比 較物質1〜2之SOD狀活性。依下式計算SOD狀活性，進 而從其與試料之濃度關係算出50%有效濃度（EC50)。 SOD狀活性（％)=[( 1 -試料之吸光度）/控制之吸光度] X 100 從各試料之階段的濃度之SOD狀活性算出EC5〇而將 結果示於表8。 表8_ SOD 狀活性之 EC5Q(# g/mL) 物質1 69.7 物質2 84.8 物質3 74.6 物質4 75.5 比較物質1 70.9 比較物質2 62.0 由上表顯示，物質2〜4比比較物質卜2具有較高，之 SOD狀活性。 試驗例3 :對亞急性FeNTA誘導多臟器障害模態之 效果 35 1353847 使用一種為人習知之投與生體時會發出大量之活性 氧且會誘發多臟器障害之生體内氧化模態之FeNTA (硝 酸鐵，Fe(N〇3)3)與硝基三醋酸鈉，（NTA3Na)之混合物） 試驗。 即’在冰冷下混合溶解於400mL冷水之頌酸鐵九水 和物（關東化學製）240mg及溶解於40mL冷水之三硕基 醋酸鈉一水和物390mg，用IN鹽酸調整PH為7.5而將全 體調製成lOOmL作為FeNTA溶液。在調製後1〇分鐘内 對體重1公斤以22_5mg之Fe用量比率將該FeNTA溶液 隔曰投與七週齡雄性ddy系老鼠（平均體重3〇g )的腹腔 内。物質1及比較物質【則每天各對體重1公斤以25rng (低用量投與群）或50mg (高用量投與群）之用量比率 強制經口投與。另外，給對照群攝取自來水並分成不投與 FeNTA之陰性對照群及投與FeNTA之陽性對照群。在試 驗期間飲料7以食_是允許自由攝取。自投與開始第7、 21及28天採血測定血清中之過氧化脂質（Lp〇)濃度。 投與開始第28天解剖老鼠取出肝臟、腎臟及腦測定該等 臟器中之均勻化LPO濃度。 試驗結果 ⑴血清令之Lp〇濃度示於圖i(a)及⑻。在低用量投 ^ 1 >3 1在第21天’ A清中之LP〇濃度即對比較物 f生對照群顯示有意（統計上）的降低（如圖1(A) 二量投與群，物f丨亦從投與開始第Η天起 ’、的降低（如圖1(B)所示）。比較物質丄雖亦在第 36 1353847 21天顯示低值’但本發明物質顯示較高之效果。 (2)各臟器中之LP〇濃度 肝臟、腎臟及腦中之LPO濃度示於圖2(A)〜(C)。在 肝臟無確認到因投與FeNTA而有Lp〇濃度之有意的上 昇，各投與群亦無確認到LPO濃度之變化。腎贜及腦中 有因投與FeNTA顯示均勻化LP〇濃度之上昇。但，投與 物質1及比輓物質1，LP〇濃度即降低。腎臟及腦均在物 質1咼用量投與群顯示最低Lp〇濃度值，尤其腦在投與 比較物質1時顯示低值，但物質i高用量投與群比起其他 群顯示有意的低值。 結論 由上述試驗結果顯示FeNTA之投與能使血清中之 LPO濃度上昇.。同時物質i比比較物j能以低用量及在短 期間内發揮玫果。由此推想其乃由於因低分子化結果物質 1變成可經口攝取而容易由腸管吸收之形態，故能以低用 量，在短期間發揮效果。尤其確認到物質i在腎臟及腦顯 示強抗氧化活性。 試驗例4:對人之偵測試驗 將健康的男女34人（平均年齡41.2歲，男性21人， 女性13人）分為二群，如表9所示，每天分別投與物質 1及比較物質1各500mg連續28天。投與開始前及找與 後採血並測定血清中之LP〇濃度及s〇D狀活性。結果以 表9表示。 37 1353847 表9 投與群 平均年齡 男女比率 LPO初期値·高 SOD初期値.低 物質1 41.9 10 ： 7 7人 7人 比較物質1 40.5 11 ： 6 11人 8人 結果 投與前後之LPO濃度及SOD狀活性示於圖3及圖4。 圖3(A)為初期值正常者之LPO濃度，圖3(B)為初期值異 常者之LPO值；圖4(A)為初期值正常者之SOD狀活性， 圖4(B)為初期值異常者之SOD狀活性。 28天連續投與比較物質1及物質1時，有lp〇濃度 降低而SOD狀活性上昇之傾向，就被驗者令初期異常者 之LPO濃度之初期值較高者（lp〇濃度8.0以上）及s〇D 狀活性較低者（SOD狀活性12‘0以下）而言，投與物質 1之群不單LPO濃度有統計之有意降低（參照圖3(B))。 同樣，SOD狀活性亦有統計之有意上昇（參照圖4(B) ) ^ 由此確認物質1比同量之比較物質丨具有生體氧化狀態的 改進效果。 試驗例5:對々-類澱粉質（amyi〇id)誘導之氧化的細 胞死之神經細胞保護效果 原因於神經之再生異常之疾病之阿耳滋海默病具有 因^類澱粉質之積蓄形老人斑為特徵L殿粉質係一 種會生成活性種使神經細⑽因細胞毒性引發及加速阿耳 滋海默病之主要物質。本試驗例係調查廣泛被用於神經細 胞毒性的實驗之低分子化㈣（以下簡稱GSM)之神經 38 1353847 細胞保護效果，用以確認低分子化聚酚對PC-12細胞之由 細胞死（apoptosis)誘導的細胞傷害活性。 試驗方法 PC-12細胞係使用含有10%熱不活性馬血清及5%半 胎兒血清之DMEM培基在10%二氧化碳氣氛下培養，將 細胞密度調整為4x 104細胞/300//L後實行24小時之預 備培養，然後置於不含血清之N-2培基中，添加濃度1、 1.5、5、10/zg/mL之GSM或葡萄種籽聚酚（以下簡稱 GSP)，在48孔之盤中進行培養。 (1) 細胞存活度試驗 處理後，以濃度lmg/mL之MTT溶液處理，將深藍 色之甲艘·（formazan)產物溶解於缓衝液中，並測定 540〜595nm之吸光度。結果以與無處理之對照細胞之吸光 度之比率（％)表示。 結果 經由MTT試驗確認到GSM具有濃度依存的抑制/3-類澱粉質引起之細胞死的效果。其效果尤其在1及1.5 Vg/mL之濃度範圍顯示較GSP為高（參照圖5)。 (2) 粒線體（mitochondria)膜電位測定試驗 粒線體膜電位之測定係使用脂溶性陽離子探測子 TMRE。在GSM或GSP的存在下或不存在下，以25#M 之冷-類澱粉質處理PC-12細胞（lx 104個細胞/mL)後，以 磷酸緩衝生理食鹽水洗淨及在37°C下用TMRE(150nM)處 理30分鐘。然後利用激發波長488nm，發光波長590nm 39 1353847 之螢光檢測依存粒線體之膜電位積蓄於粒線體内之 TMRE。 結果 粒線體在有細胞死之徵候前發生膜之完整性的變 化。此種變化發生於粒線體之内膜及外膜之雙方，最後會 導致如放出細胞色素C等可溶性膜間蛋白之膜貫通電位 之放散及膜透過性之變化。PC-12細胞曝露於召_類澱粉 質時會急速降低粒線體膜貫通電位，此可使用電位依存型 色素之TMRE之紅色螢光顯現（參照圖6(A))。起因於沒 -類澱粉質之膜貫通電位之降低可藉GSM之預處理有意 (統統上）的抑制，其效果比GSP為高（參照圖6(A)及 (B))。 (3)細胞内活性氧種之累積之測定 為觀察活性氧種在細胞内之累積量，使用螢光探測元 件DCF-DA(2’，7·-二氣二氫螢光素_二醋酸醋）。在gsm或 GSP的存在下或不存在下，以類澱粉質處理 PC-12細胞（ix 106細胞/3mL)後，用克雷布斯_林格氏 液（一種生理鹽液）洗淨並添加之DCF-DA。於 3 7 C下培養15分鐘後，使用利用氬雷射之共焦點雷射顯 微鏡’在勵起波長488nm，發光波長53Onm下觀察。 結果 為了解明起因於類澱粉質之PC-12細胞之細胞死 時之氧化應力，使用可透過細胞膜之DCF-DA測定細胞内 之活性氧種之累積情形。在細胞内，DCF-DA會因細胞之 40 1353847 酯酶（esterase)活性被水解成DCF而與過氧化物反應生成 螢光物質。經過召-類澱粉質處理之PC-12細胞受DCF色 素之染色而顯現出來（參照圖（7))。起因於召-類澱粉質之 細胞内活性氧種累積量因GSM而減少，其效果比GSP為 高（參照圖7(A)及（B))。 (4) 細胞内谷胱甘狀（glutathion)濃度 使用市售之裝置（商品名BIOXYTECH GSH-400 ;美 國OXIS研究公司製）測定細胞内之谷胱甘肽濃度，將 GSM或GSP之存在下或不存在下培養且經冷-類澱粉質處 理之PC-12細胞回收，置於偏磷酸溶液中均和後，於其離 心分離所得之上澄液中添加色素原鹽酸溶液，攪拌後再添 加30%氫氧化鈉溶液而在25°C下培養10分鐘後離心分離 獲得透明之上.澄液，並測定其400nm之吸光度。另外利 用BCA蛋白質測定器測定蛋白質含量，將此測得之蛋白 質之每一單位重量之谷胱甘肽濃度與無處理之對照品比 較。 結果 起因於冷-類澱粉質之細胞死有氧化毁損（damage)伴 隨。經-類澱粉質處理之細胞之細胞内谷胱甘肽濃度降 低。經GSP處理之細胞，雖然其細胞内谷胱甘肽濃度回 復到正常水準，但經GSM處理者則顯示超越正常水準，之 細胞内谷胱甘肽濃度，證明其在細胞内顯示高抗氧化活性 (參照圖8 )。 (5) 過氧化脂質濃度 41 1353847 使用市售之裝置（BIOXYTECH LPO-586，美國OXIS 研究公司製）測定過氧化脂質濃度。將GSM或GSP之存 在下或不存在下培養且經類澱粉質處理之PC-12細胞 回收，置於含有0.5mM之丁基化羥基甲苯之20mM三鹽 酸緩衝液中均和後，於其離心分離所得之上澄液中混合 10.3mM之N-曱基-2-苯基吲哚之乙腈溶液，然後添加37% 鹽酸在45°C下培養60分鐘。冷卻後離心分離並測定透明 之上澄液590nm之吸光度。另利用BCA蛋白質測定器測 定蛋白質含量，將此測得之蛋白質之每一單位重量之過氧 化脂質濃度與無處理之對照品比較。 結果 由/5 -類澱粉質處理產生之細胞膜的過氧化的過氧化 脂質產生之丙二醛（MDA)表示。藉由GSM或GSP之前處 理抑制因石-類澱粉質產生之脂質的過氧化，其效果GSM 較高，將過氧化脂質抑制於無處理對照水準以下（參照圖 9)。 總結 GSM在神經細胞之代表細胞之PC-12細胞中能減少 活性氧種累積於神經細胞内，因此抑制起因於石-類澱粉 質毒性之神經細胞死，其效果比GSP高。起因於/5 -類澱 粉質毒性之神經細胞死對細胞之氧化傷害有關連，GSM 可抑制對細胞之氧化傷害，而其效果較GSP高。 GSM藉其抗氧化作用抑制與起因於/3 -類澱粉質之神 經細胞死有極大關連之阿耳滋海默症之發病及進展，故證 42 1^^3847 明可藉GSM抑制阿耳滋海默症之發病及進展。 試驗例6 :對鏈脲菌素（STZ)誘發之糖尿病之預防效果 為探討物質1對STZ誘發糖尿病老鼠之預防效果， 使用相當於由STZ之低劑量多次（multiple low dose，MLD) 投與誘發的糖尿病的初期病態模態。 方法 測定Jla : ddy老鼠（雄性、7週齡）之體重、血糖值 及血中LPO值，而將各群均等區分如下（其中n為老鼠 數）： ⑴陰性對照群：STZ ( — ) (η=：5，1籠） (2) 陽性對照群：STZ(+) (η=5,3籠） (3) 物質 1 群：STZ ( + ) +物質 1 ( η=ι〇，2 籠） ⑷比較物質1群：STZ (+) +比較物質i (η=10， 2籠） 將STZ以20mg/kg劑量連續4天投與腹腔内兩次後， 再以40mg/kg劑量連續4天投與腹腔内。其間讓試驗鼠自 由攝取混合有物質1或比較物質1之各〇 〇6%粉末餌（由 1天之食餌攝取量計算，1天之物質1或比較物質1的攝 取量為約100mg/kg)。投與期間為STZ投與開始日之5 天前至第65天。 在投與期間採血液及尿液’測定金糖、尿糖、尿蛋今、 血中脈氣（BUN)及血中 LPO/TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity)。結果示於圖 i〇〜14。 結果 43 1353847 U)空腹時血糖值 糖尿病時，如圖ίο所示，在空腹時血糖值顯示高值， 但STZ投與後第35天、49天及66天陽性對照群比陰性 對照群血糖值高，經低劑量多次投與STZ確認到形成一 輕度糖尿病模態。物質1群及比較物質1群之血糖值顯示 比陽性對照群有意的低值，而血糖值降減效果則物質1比 比較物質1高》 (2)尿糖值 糖尿病時，尿中之糖排泄量增加，經STZ處理確認 到尿中之糖排泄量大幅增高’老鼠有誘發糖尿病，如圖 11所示。在物質1群及比較物質i群觀察到對因STZ增 加之尿糖值有改善效果，第49天確認到與陽性對照群之 間分別有統計上之有意差，同時物質i比比較物質i顯示 稍低之值。 (3) 尿蛋白值 糖尿病時，尿中之蛋白質排泄量增加。如圖12所示， 物質1及比較物質1能抑制因STZ而漏出尿中之蛋白質， 而在S'Z投與後第49天兩物質皆比陽性對照群有意的減 %蛋白量另外#質1比比較物質1預測能於本病態模 態之早期顯現效果。 (4) 抗氧化指標 (4-1)血令之LPO (過氧化脂質）值 如圖13所不，物質1群比陽性對照群及比較物質i 群顯示有較低值傾向。 較物質1 44 1353847 (4-2)血中之TEAC值 TEAC值已廣被作為抗氧化指標使用。TEAC法係一 種將某化合物具有之抗氧化活性換算成生育酚衍生物 之Trolox的抗氧化能而相對評估抗氧化強度之方法。如 圖14所示’血中之抗氧化活性於第49天及第66天，比 較物質1群及陽性對照群顯示大約相同之抗氧化能，但物 質1投與群顯示高TEAC值，表示抗氧化能最強。 結論 STZ之低劑量多次投與模式能引發老鼠輕度糖尿 病，與高劑量投與模式相較血糖值之個體間之差少，因此 認為極適用於檢討糖尿病之預防效果，在糖尿病上可抑制 伴隨病態之進行而增高之血糖值及尿糖值，顯示具有預防 糖展病之效果。 對STZ誘發之糖尿病會在脬臟万細胞產生獨特之基 (radical)、点細胞受此基之傷害導致死亡而引發糖尿病: 於STZ投與之5天前投與物質i及比較物質時，由於能 預先提高體内之抗氧化活性，故得以減輕STZ對点細胞 之傷害。 ' 由血中之LPO及TEAC的結果可知，物質1可將血 中之抗氧化能有意的提升。一氧化氮及活性氧等之基對胰 島素依存性糖尿病之胰藍蓋罕氏小島（胰島）之^壞有 關，為周知之事實。將此等自由基之細胞傷害抑制可改善 糖尿病一節已經由人體試驗暫趨明晰。因此，物質丨可^ 作為健康人預防糖尿病以及初期糖尿病患之病態進展抑 45 制劑使用β 試驗例7. /臭酸鉀誘發鼠急性腎功能障害之比較試驗 一為求物質1與其他抗氧化聚酚素材之抗氧化性能， 實行下述之溴酸鉀誘發鼠急性腎障害之比較試驗。 方法 依下述將Wistar鼠（雄性，12週齡）分群： 陰性對照群：溴酸鉀（-)(n=5) 陽性對照群：溴酸鉀（ + )(n=5) 物質1群（葡萄種籽由來）：溴酸鉀（ + )+物質l(n=5) 物質5群（松樹皮由來）：溴酸鉀) +物質5(n=5) 比較物質2群（兒茶素）：溴酸鉀（ + ) +比較物質2(n=5) 比較物質3群（銀杏葉萃取物）：漠酸斜（ + ) +比較物 質 3(n=5) 比較物質4群（松樹皮萃取物）：溴酸鉀（ + ) +比較物 質 4(n=5) 比較物質5群（可可萃取物）：溴酸鉀（ + ) +比較物質 5(n=5) 〇 溴酸卸以6〇mg/kg (體重）劑量投與腹腔内一次。物 質1、物質5及各比較物質係以！〇 mg/kg劑量於溴酸鉀投 與開始曰（第0天）之一週前（一第7天）至翌曰每天投 與一次。溴酸奸投與日時，於漠酸舒投與之前後30分鐘 實施投與。於一第7天、第〇天及第2天從頸靜脈採血’ 測定血中之聚酚濃度、過氧化脂質濃度、TEAC、脲氮及 46 1353847 肌氨酸野（creatinine)濃度。 結果 因物質1及各比較物質之對溴酸鉀誘發急性腎障宝 7果係基於抗氧化作用，為此檢查血中聚1農度、血; =乳化能（TEAC)及血中過氧化脂質濃度作為抗氧化指 仏，及檢查血中脲氮濃度及血中肌氨酸酐濃度作為腎障害 之病態指標，測定結果示如圖15〜19 ^ (Ό抗氧化指標 (1-1)血中聚酚濃度 值各；圖Λ所示，漠酸鉀投與前之血中聚紛濃度之初期 ^各群白―疋，但投與物質1及各比較物質7天後投與漠 酉夂卸之第G天（投與開始天）物質丨群顯示最高值，其次 為比較物質2群。另確認到，物質1之投與可使血中：聚 酚濃度上昇’其上昇率比各比較物質有意的高。 (1-2)企中抗氧化能（TEAC) 如圖16所不，物質1及各比較物質之一週之前投斑 使血中之抗氧化能顯示上升傾向，因物質ι之投與而引起 之抗氧化叙上昇對各比較物質投與群係有意的。 (1-3)血中過氧化脂質濃度 \及各比較物質之—週之前投與抑制溴酸卸投 ，、引起之血中過氧化脂質濃度之上昇。如圖17所示，其 效果以物質1群為最高，對各比較物f顯示有意的低值、。 (2)病態指標 (2-1)血中脲氮濃度 47 U53847 如圖18所示’由溴酸鉀之投與，血中之脲氮濃度較 無處理有意的上昇。物質1及各比較物之投與抑制由溴酸 鉀投與引起之血中脲氮濃度的上昇，由物質1之投與引起 之血中脲氮濃度之上昇抑制對各比較物質投與群為有意 的。 (2-1)血中肌氨酸酐濃度 如圖19所示，由溴酸鉀之投與，血中之肌氨酸酐濃 度比無處理有意的上昇。物質1及各比較物質之投與抑制 由t酸鉀投與引起之血中肌氨酸酐濃度之上昇，由物質1 之投與引起之血中肌氨酸酐濃度之上昇抑制對各比較物 質投與群為有意的。 總結 匕較物質3、4、5係含疏原花色素之聚合物堇富之素 材’於试官内顯示高抗氧化活性，但被攝取於體内時低分 子化之物質丨顯示較高之抗氧化活性。 比較質2為單體（兒茶素），但是物質i的活性較高， 之料量看，因物Η為低分子化，故易被吸收於 二 S生物内顯示高抗氧化活性。物f1之前投與提

Sit:抗氧化能’發揮抗氧化活性。結果，能抑制起因 之投與之血中過氧化脂質濃度之上昇，抑制腎障 =服氣及肌氨酸肝漏出於血中。其效果比各比較Ξ 質f意的向，且被生㈣取時比迄今所知之任何高分 =為主體之聚时材及單體（兒茶素）顯示優異之抗氧化 48 1353847 本發明物質之安全性 依據單次抗與毒性試驗評估安全性。對體重每1公斤 (kg)使用2.5、5.0、7.5及10.0劑量，分別經口強制的投 與8、7、3及18隻之ddy系鼠（9週齡、雄性）。投與後 觀察行動變化及死亡例算出LC50。結果物質1之50%致 死濃度（1^50)為5.(^/1^(體重）（95%可靠界限3.5〜6.4 g/kg)，並無投與後之行動異常及試驗終了時之解剖結果 之異常。因此確認物質1作為食品係安全性極高之物質。 於前述之試驗例4 (對人之檢測試驗），用問卷方式 收集被驗者之意見，其中有關腫眠者列於表10,有關疲 勞感、頭之清醒度及胃之舒適感則用五段評估法，結果列 於表11。 表10 群 年齡 性別 使用意見 物質1 49 男 睡、醒有改進 物質1 43 男 睡眠之品質有改進（睡得好） 物質1 57 男 早上起床鬆爽 比較物質1 27 女 早上起床有疲勞感 比較物質1 34 男 早上起不來，仍想睡 比較物質1 43 男 睡不好，起床困難 49 1353847 表11 依5段評估之問卷得分數 疲勞感 頭之清醒度 胃之舒適度 比較物質1 2.8 (3.2) 3.7 (3.3) 3.9 (3.5) 物質1 3.2 (2.9) 3.7(3.3) 3.8 (3.5) 數值愈大表示情況愈好，括弧内為投與前之數值 50 1353847 【圖式簡單說明】 圖1為投與本發明實施例1之含硫原花色素低聚物组 成物（分離前之粉末；物質D及其原料（葡萄種籽酚萃 取物；比較物f 1)之老鼠之血ί青巾LPO濃度之線圖；其 中圖1(A)表示低用量投與群，圖1(B)表示高用量投與群 之結果。 圖2為投與本發明實施例i之含硫原花色素低聚物組 成物（物質1)及其原料（比較物質〇之老鼠之肝臟（A)、 腎臟（B)及腦（C)中之LP0濃度之線圖。 圖3為投與本發明實施例1之組成物（物質1)及實 施例1之原料（比較物質〇之人之血清中Lp〇濃度之圖 表’其中圖3(A)表示LPO濃度初期值正常者，圖3(b)表 示LPO濃度初期值異常者之結果。 圖4為投與本發明實施例1之組成物（物質1 )及實 施例1之原料（比較物質1)之人之血清中S〇D濃度之 圖表；其中圖4(A)表示SOD濃度初期值正常者，圖4(B) 表示SOD濃度初期值異常者之結果。 圖5為表示本發明物質1及比較物質1對因点-類澱 粉質引起之PC-12細胞死之抑制效果之圖表。 圖6(A)及（B)分別表示本發明物質1及比較物質i之 對因/3 -類澱粉質引起之粒線體膜電位降低之抑制效果之 照片及圖表》 ’ 圖7(A)及（B)分別表示本發明物質1及比較物質1之 對因召-類澱粉質引起之PC_12細胞内活性氧種累積之抑 51 1353847 制效果之照片及圖表。 圖8表示本發明物質丨及比較物質丨之細胞内抗氧化 活性效果之圖表。 圖9表示本發明實施例！之物質丨及比較物質丨之起 因於石-類澱粉質之細胞膜過氧化抑制效果之圖表。 圖ίο表示本發明物質i及比較物質！之對STZ誘發 糖尿病鼠空腹時血糖值之降低效果之圖表。 圖11表示本發明物質i及比較物質i之對STZ誘發 糖尿病鼠之尿糖值之降低效果之圖表。 圖12表示本發明物質丨及比較物質丨之對STZ誘發 糖尿病鼠之尿蛋白值之降低效果之圖表。 圖13表示本發明物質丨及比較物質丨之對stz誘發 糖尿病鼠之血中LPO值之降低效果之圖表。 圖14表示本發明物質1及比較物質1之對誘發 糖尿病鼠之血中TEAC值（抗氧化能）之上昇效果之圖表。 圖15表示本發明物質！之對溴酸卸誘發鼠急性腎障 害之血中聚酚濃度之上昇效果之圖表。 圖16表示本發明物質i之對漠酸卸誘發鼠急性腎障 。之血中抗氧化能（TEAC)之上昇效果之圖表。 金圖Π表示本發明物質1之對漠酸卸誘發鼠急性腎障 。之血中過氧化脂質濃度之上昇抑制效果之圖表。 宝圖18表示本發明物質1之對漠酸卸誘發鼠急性腎障 。之血中脲氮濃度之上昇抑制效果之圖表。 圖19表不本發明物質i之對澳駿卸誘發氣急性腎障 52 1353847 害之血中肌氦酸酑濃度之上昇抑制效果。 【主要元件符號說明】 53

Claims (1)

1. 1353847

   ，93122234號專利申請案 補充、修正後無劃線之說明書修正頁一式三份 十、申請專利範圍： 1.一種以含硫原花色素低聚物為主成分之組成物，係 由： 以含有原花色素類之植物或其萃取物與選自半胱氨 酸、胱氨酸、谷胱甘肽、SH基含有縮氨酸及彼等之鹽類之 至少一種SH基含有化合物反應所得之反應液，經過濃縮

   及乾燥所得之含硫原花色素之2〜5低聚物作為主成分組成 為其特徵者。 2. 如申請專利範圍第1項所述之組成物，其中該含有 原花色素類之植物係選自果菜類、茶類、草本植物類、木 材·樹皮類之至少一種。 3. —種健康食品組成物，含有申請專利範圍第丨及2 項之任一項所述之組成物。 4· 一種含硫原花色素低聚物，係由： 將含有原花色素類之植物或其萃取物與選自半胱氨 酸、胱氨酸、谷胱甘肽、SH基含有縮氨酸及彼等之鹽類之 至少一種SH基含有化合物反應所得之反應液分離所得之 含硫原花色素之2-5低聚物。 5.—種含硫原花色素低聚物之製法，包括： 令含原花色素類之植物或其萃取物於酸性條件下與 54 1353847 第93122234號專利申請案 補充、修正後無劃線之說明書修正頁一式三份 選自半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽、SH基含有縮氨酸及彼 等之鹽類之至少一種SH基含有化合物在室溫至80°C之溫 度下進行數小時乃至一星期之反應，繼之將該反應液濃縮 及乾燥處理。 6. —種含硫原花色素低聚物之製法，包括：令含原花 色素類之植物或其萃取物於酸性條件下與選自半胱氨 酸、胱氣酸、谷胱甘狀、SH基含有縮氨酸及彼等之鹽類之 鲁 至少一種SH基含有化合物在室溫至8〇。〇之溫度下進行數 小時乃至一星期之反應，繼之將該反應液濃縮及分離處 理。 7. 如申睛專利範圍第5或6項所述之製法，其中該含 原花色素類之植物係選自果菜類、茶類、草木植物，木材· 樹皮類之至少一種。 8·如申凊專利範圍第5或ό項所述之製法，其中該酸 ® 性條件係使用無機酸、有機酸或此兩者形造者。 9.如申請專利範圍第8項所述之製法，其中該酸性條 件係使用選自鹽酸、硫酸、硝酸、醋酸、檸檬酸、抗壞血 酸、蘋果酸之至少一種形造者。 10·—種如下式（4)所示之原花色素化合物： 55 1353847 第93122234號專利申請案 補充、修正後無劃線之說明書修正頁一式三份 OH

   11. 一種如下式（5)所示之原花色素化合物： 0H

   (5)

   12.—種如下式（6)所示之原花色素化合物： 56 1353847 第93122234號專利申請案 補充、修正後無劃線之說明書修正頁一式三份 0H

   13.—種如下式（8)所示之原花色素化合物： 0H

   57