TW503109B

TW503109B - Method for the preparation of methylidene malonate nanoparticles, nanoparticles which optionally contain one or more biologically active molecules, and pharmaceutical compositions containing them

Info

Publication number: TW503109B
Application number: TW086115768A
Authority: TW
Inventors: Bru-Magniez Nicole; Cuillon Xavier; Breton Pascal; Couvreur Patrick; Lescure Francois
Original assignee: Virsol
Priority date: 1996-10-25
Filing date: 1997-10-24
Publication date: 2002-09-21
Also published as: US6211273B1; CA2269783C; US20010006989A1; KR20000052813A; AU736097B2; CA2269783A1; FR2755136A1; ATE245171T1; WO1998018455A1; NZ335094A; HUP9904359A3; PL332957A1; HUP9904359A2; CN1237903A; ZA979550B; SK55599A3; DE69723571T2; CZ144099A3; EP0934059A1; EP0934059B1

Description

503109 A7

五、發明説明（i ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製本發明係有關-種自一由經聚合化之亞甲基丙二酸醋化合物來形成之奈米粒子的製備方法，該奈米粒子可任擇地含有-或多種具生物活性的分子，以及含有該等粒子的樂學組合物。 “奈米粒子”可了解其係意指具有低於約5〇〇毫微米之直徑的次微米粒子。由氰丙酸烷酯之乳化聚合反應所形成之奈米粒子係揭示於EP 〇〇〇7 895專利案中。在該等氮基丙酸烷酯粒子之製備中所使用的方法，乃是仰賴於會自發性地發生且是在水溶性介質中發生之單體（陰離子性）的聚合反應。一依循與甲基丙二酸酯聚合物所構成之奈米粒子之相同原則（陰離子性乳化聚合反應）的製備方法乃揭示於Lescure ei a/, Pharm· Res.5 1994. U5 1270.1276 中。其製備方式被揭示於EP 0 283 364專利案中之單體，具有一十分接近氰基丙酸酯的結構，但是後者之胯官能美係為酯或者一酯酯所取代。相似於氰基丙酸酯，其在冰〆條件且水性介質中進行聚合反應，且係為可生物降解的。但是，所得甲基丙二酸酯奈米粒子具有一些缺點。事實上，呈奈米粒子形式之甲基丙二酸酯的乳化聚合反應，在水相中且在微微地酸性pH下，會造成寡聚物的形成’該募聚物主要是三元體或四元體型式且是^产地可生物降解性。該分子物種係部分地為水可溶性，而使p 該等奈米粒子在於水性界質中分散時，會造成其的溶解，並很快地失去該粒子的結構（Ρ. Breton ei a/.，Eui\ J Pharm Biopharm·，1996，41，95-103)。當一具生物活性的分子係 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} -訂·

參紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇><297公釐） .I .......... II I............ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 503109 A7 —---B7 五、發明説明（2 ) ^~' --- 與該甲基丙二酸醋奈求粒子相結合時，分子是可能在投藥後可十分快速地被釋出，而後在循環液中達成稀釋作用，而該循環液會造成形成該粒子基質之寡聚物，在最終到達該活性成分作用之位置之前，就被快速溶解。一些實驗已顯示，在鹼性pH下之聚合物會使得該聚合物形成較高分子量的聚合物同時又維#其在奈米粒子的尺寸。但是，如此的合成具有下列特徵： -在不形成有凝集物，且不會顯著地有寡聚物物種存在下，不可能得到具有Mw<1〇〇〇〇 (更不要說是 8〇〇〇)之聚合物，來構成各別化的奈米粒子，。在不形成有凝集物（該等凝集物會使得該等製劑之靜脈變成不可能）下，是不可能在高PH (pH>7)下構成有Mw> 20000 (更不要話更高]^^)之聚合物。

Mw”可了解到係指定義如下之質量平均分子量（或者平均分子量）：Mw=Eni.Mi2/Zni。Mi與Μρ係為量上主要物夤之平均分子量。在本揭示内容的其它部分中，分子量係以聚苯乙烯當量（ΕΡ)來表示。 , 由此若是想要製備出由下列所構成之亞甲基丙二酸醋 8守’該方法是不適合的：一平均分子量係位在約5000與10000之間的聚合物’，特別是約8000之聚合物， ' 平均分子量高於20000之聚合物，而不會形成凝集物。 I 紙張尺度適用 ( -~ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

•P 發五、發明説明（3 ) 因此，本發明係包含亞甲基丙二酸酿之奈米粒子的製備方法’該奈米粒子具有低於500nm之直徑（特別是在100 m之間）》亥粒子係由-廣範圍質量（Mw係在約2〇〇〇至_〇〇之間）均相分子物質所形成。該成分係由被溶解於與水可相混之非質性有機相中單體所構成，但在奈米粒子的製傷時，其會與該水性聚合介質形成一由所形成之聚合物所構成之非溶劑混合物。非夤子性有機相或者"非質子性有機溶劑"，可了解到，乃是指一不具有能夠誘發出一陰離子之不安定質子的有機相或者溶劑，依據本發明之製備方法的優點是許多的： _其能夠在聚合反應介質中形成單體之更為均相的分散液，其可使用非經氣化的溶劑，該等溶劑是易於蒸蓋因其為揮發性的， * 其可防止聚合物之凝集物的形成， - 其可造成高的聚合反應產率，其使得具有均相廣範圍分子量約2〇〇〇至 00000特別疋約2000至80000)之聚合物形成直徑低於 500nm的奈米粒子。再者’該方法可使用諸如非離子性表面活性劑或者凝膠保護聚合物之分散劑，該等分散劑可使得該等粒子具有可撓性的表面特性。 I----S-I ------------、訂------^1 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製最後’該專依據本發明而形成奈米粒子之寡聚物/聚

DUJIUy 五、發明説明（4 ) 合物之分子量利用調整下列製備條件而完美地控制： - 在有機相中的單體濃度 - 聚合反應介質之pH以及莫耳濃度， - 該分散劑之特性與濃度， -該水相（聚合反應介質）/有機相之體積比例 - 將該有機混合物引入水相中的模式。因此’在第一方面’本發明係有關於—種自一含有. 少-種具有下列通式⑴之化合物的隨機聚合物中形成米粒子之製備方法， (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 中其

cII

one A β ,ιτ A代表 OR^ 基團或者經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1 一0, ο ο , , 基團 R以及R ，可相同或者不同 $个U代表一直線或分支之Cl 至C6的烧基基團，而n=l，2,3,4或5· 其特徵在於該（等）單體在命人、；早股在鬈合反應之前係被溶解於一與水可相混之非質子性有機溶劑中 π /合刎甲，該溶劑可與該聚合反應介質形成一為所形成聚合物之非溶劑混合物。本紙張尺度適财目醇標準（CNS ) Α4規格（2K)'X29^jy

在較佳的一方面，本發明係有關一種自一由具通式（1) 的化合物所構成之聚合物形成奈米粒子的製備方法：

1----!--------- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 基團經濟部中央標準局員工消費合作社印製一『〇-(〇^—叭 Ο Ο X及R可相同或者不同，代表一直線或分支之Cl 至〇6的烧基基圈，而11=：1，2,3,4或5; 其特徵在於該（等）單體在聚合反應之前，係被溶解於 -與水可混之非質子性有機溶劑中，該溶劑可與該聚合反應介質形成一為所形成聚合物之非溶劑混合物。依據特別的-方面，本發明的方法係能夠製備一種且有低於50〇nm (較佳是在⑽至卿⑽之間）直徑且且㈣在刪至1〇〇_之間之平均分子量較佳係在刚至 80000之間，特別佳是在8_至8()_之間）的奈米粒子。特別是，本發明之方法係包含下列步驟：

•製備一被配置於一與水可相混之非質子性有機溶劑中且含有至少-種具有通式⑴之化合物的

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公潑） 503109 經濟部智惡財產局3工消費合作社印製修正、本年月a 補充 90. Id 2 3 五、發明説明c 第861 1 5768號發明專利再審查案發明說明書修正頁修正日期：9〇年1〇月 -在攪拌下，將該有機相加入至一 1>11在45與1〇之間的水性聚合反應介質中，、 -在將該混合物均質化且抽真空蒸發該有機溶劑後，回收該奈米粒子。該水性聚合反應彳質亦可加入該已含有被溶解於其中的單體之有機相中’且在另一方面，本發明之方法包含下列步驟： -製備一被配置於一與水可相混之非質子性有機溶劑中之含有至少一種具通式（I)之化合物的溶液， -在授拌下，將一 pH在4.5與10之間的水性聚合反應介質加入該有機相中， -在將該混合物均質化且抽真空蒸發該有機溶劑後，回收該奈米粒子。如其後實施例所示，該聚合反應介質的pHS選自於一為其所欲聚合物分子量的函數中。較佳的是，該有機相以及該水性介質的混合物係利用連續地攪拌約30分鐘，而後，該製備可任擇地利用蒸餾水來完成。聚合物係會在該聚合反應介質中形成沈澱，且可利用例如過濾來予以回收。而後，所得到之該等奈米粒子懸浮液係可受到條件限制並被冷凍乾燥。該用以分散該單體之非質子性有機溶劑必須是該等單體的溶劑，該溶劑應可與水相混。該溶劑較佳是選自於下列·乙綱、乙勝、一 β惡烧以及四風吹°南，而以乙酮為最佳。 10. 本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) A4規格（210X 297公釐〉

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 503109 A7 __ B7 五、發明説明（7 ) 該方法的較佳方面如下： - 配置於該有機溶劑内的具有通式⑴的單體濃度係為 30 mg/ml至 1 50 mg/ml之級； - 該聚合反應介質的莫耳濃度係為1/30 Μ至1/3 Μ 之級； - 該水相對有機相之體積比例係在3/1至2〇/1之間，而以在3/1至15/1之間較佳。更佳的疋，該聚合反應介質含有一種或多種表面活性劑或者凝膠保護劑。該表面活性劑，例如，可為離子性或者非離子性的。較佳疋使用選自於下列的非離子性的表面活性劑：聚氧乙烯以及聚丙烯之共聚物，薄利克沙門（p〇1〇xamers)以及聚山梨酸6旨。而對膠體保護劑而言，較佳是使用多醣衍生物，例如，糊精，水溶性纖維素衍生物，聚乙二醇以及聚（乙烯醇）。較佳的是’用以依據本發明方法來形成奈米粒子之經聚合化的化合物係為具有通式⑴的化合物，其中：A係為一 ο δ 基團， η = 1且尺1=1^2 ==乙基。在較佳❺® ’用以依據本發明方法來开i成奈米粒子之經聚合化的化合物係為具有通式⑴的化合物，其中： A係為 ^紙張尺度適财酬家縣（CNS ) ______ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

期1〇9 經部中央準局員工消費合作社印製基團 A7 B7 五、發明説明（8 ) —C一 ° 基圈，且丙基。較佳的是，具有通式⑴之化合物所構成之混合物可隨機聚合化反應，其中A為如上所界定的下述基團： r°^ 或者 0 0 基團在第二方面，本發明係有關於一種奈米粒子，其係由一具有至少一種亞甲基丙二酸酯之隨機聚合物所形成，該奈米粒子具有低於500nm的直徑（較佳是在100與5〇〇11111之間），且具有在約1000至100000之間的的平均分子量（Mw) (較佳是在1000至80000之間，而以2000至80000之間最佳），其可利用本案方法來獲得。特別是，可得自於本案方法的奈米粒子係自一具有一種具通式（I)之化合物的聚合物所形成的，且具有低於 500nm的直徑（較佳是在10〇與5〇〇11111之間），且具有在約 1000至80000之間的的平均分子量（Mw)(較佳是在2〇⑽至 80000之間，而以8000至80000之間最佳）。在較佳的方面，本發明係有關於一種奈米粒子，其係自一含有至少一種具通式⑴之化合物的隨機聚合物所形成的，忒奈米粒子具有低於5〇〇nm的直徑（較佳是在1〇〇 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

503109 A7 五、發明説明（9 ) 與50〇nm之間）..，且*有在約8〇〇〇至1〇〇〇〇〇之間的的平均分子量（Mw)(較佳是在8000至80000之間）。更特別的是’本發明係有關於一種奈米粒子，其係自一由具通式（I)之化合物所構成之聚合物所形成的，該奈米粒子具有低於500nm的直徑（較佳是在1〇〇與5〇〇11111之間），且具有在約800.0至名〇〇〇〇之間的的平均分子量（Mw)。較佳的是’該奈米粒子係自一具有通‘式⑴之化合物所形成，其中A為：——叫 0 〇基團， η - 1 R1=R 2 =乙基^ 〇在較佳的一方面，該奈米粒子之係自經一具有通式⑴ 的化合物所成，其中Α係為基團 (請先閱讀背面之注意事項再本頁)

# 經濟部中央標準局員工消費合作社印製且R产R2=丙基。 .較佳的是，該奈米粒子係可為一隨機聚合物所構成，而該隨機聚合物係由具有通式⑴之化合物的混合物所構成的，其中A係為如上所界定之下列基團：或者 Ο 基團

503109 A7 五、發明説明（10 ) -C-O-WrC^OR, 0 0 基團經濟部中央標準局負工消費合作社印製依據本發明之另一方面，該奈米粒子在其聚合網中包含有一或多種諸如上所述之具生物活性的分子。事貫上，在本發明方法的較佳一方面中，該有機相（當其係一種水不溶性的生物活性分子時）或者聚合物介質含有一或多種具有生物活性的分子。可了解的是“具有生物活性的分子，，係指，但非限制於，該等在活體外或者活體内具有預防性或者治療性之生物活性的任一分子或者巨分子，較佳係為一抗傳染性劑，特別是一種殺菌劑、抗生素、抗病毒劑、抗寄生蟲劑或者抗分絲分裂劑，尤其是一抗癌劑。可使用之抗生素或者殺菌劑係為，例如，利福平 (rifampicin)以及黏菌素。在抗病毒劑方面，地德松辛（di(ianosin)、三氮唾核苷、曰多福定（zidovudin)、愛西克林福（aCyCi〇vir)、格西克林福（ganciclovir)、福斯卡尼特（f0scarnet)、維達拉並 (vidarabin)以及日西他並（zaicitabin)亦可以非限制的方式來加以應用。順式-(怕斯定）、5 -氟尿哺咬或者紅豆杉醇，例如，可使用作為抗癌劑。其它較佳的抗腫瘤劑係為磷酸肌酸，該磷酸肌酸洁性係揭示於EP 0 614 366中。本發明亦有一種藥學組成物，其包含有一含有一或多種之具有生物活性分子的奈米粒子，其係與一藥學上可接 14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁)

-、>τ_ 503109 A7

五、發明説明（U ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製受的載劑相結合。本發明的組成物係可為，例如，口服投藥。舌下#藥。皮下投藥，肌内内投藥、靜脈投藥、穿皮投藥、局部投藥、直腸投藥、經肺投藥或者鼻内投藥的組成物。該等投藥之適合形式，較佳係為口服形式，例如錠劑、凝膠、膠囊、粉末、顆粒以及口服溶液或者懸浮液，舌下投藥或者頰内投藥之形式，以及皮下投藥、肌内内投藥、靜脈投藥、鼻内投藥、眼内投藥以及直腸投藥形式。本發明係以下列實施例來加以例示說明，其中該粒子的製備係在室溫（約21 °C )下進行的。該奈米粒子的尺寸或直徑係以一雷射散射計數器（Coulter Electr()nic Ine。USA) 來加以測定。該聚合物之分子量係利用凝膠層析法來加以測定的。實施例1 已在25m亳巴下進行釋出所吸收之S〇2 3小時的5〇〇 mg 1-乙氧基羰基-1-乙氧基羰基甲撐基氧基羰基乙烯 (Laboratoires UPSA/(AUIBEM，法國）係被解於 5.55nil 的乙酮中。而後該溶劑在磁性攪拌下逐漸地與50ml的在pH 8 下具有緩衝效用且含有500mg糊精70(FLUKA CHEMIE， Switzerland)的水性介質（Na2P04/KH2P04.l/15 Μ)相混合。幾乎馬上的聚合反應生成一雲霧狀的混合物，該混合物具有一膠體溶液之丁鐸爾（Tyndall)效應。在將該有機相完全加入後，維持攪拌30分鐘。而後，含有2.5g的葡萄糖或漏蘆糠（膠體保護劑以及冷凍保護劑）之50 ml的蒸餾 -15 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再^一:本頁)

-1— n η 503109 A7 B7 發明説明（12 ) 水係被加入該奈米粒子懸浮液中，且該混合物係經過抽真空蒸發，以去除乙酮，並將該水性懸浮液之體積降至 50ml。在濾紙（孔徑5至15//111)上過濾後，該製劑係被冷凍乾燥，如雷射散射所測定的，含於該濾液中的粒子具有288nm的直徑。構成該粒子之聚合物基質的亞甲基丙二酸酯之平均分子量，利用凝膠通透層析法而被估量為 67000 〇實施例2 : pH變化的研究此實驗係依實施例1所述的技術來進行變化該磷酸緩衝液的pH。結果如下述表i所示，其中Mp係為主要物種的分子量，而Mw係為聚合物之平均分子量。 (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製表1 聚合反應介質的pH 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 尺寸（nm) 280 344 424 423 361 382 313 288 標準偏離 +/-nm 9 9 7 6 9 7 2 3 __ 聚合物的特徵（Ep) MP 662 655 655 19700 31500 36900 40300 59300 mw 2080 4740 11140 17600 28900 39000 53200 67200 者t合反應介質的pH值而有規則地增加。第1圖所示的凝膠通通層析法之圖形代表在pH 5 ί (濃度；90 mg/ml)下所製得之聚合物的分子量分佈情況。在 1上可觀察到一寬帶，其係對應於高平均分子量（Mw)的物種，而在2上可觀察到一窄峰，其係對應於微量的寡聚張 -紙本、度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇χ297公釐

1T -. )〇31〇9 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（13 ) 物（主要是三元體與四元體）。該虛線限制出該層析圖可分析之部分。峰F係為使用作為内標準物之甲苯，而負峰表示少量的水。 3,:單體濃度變化的研究此實驗係依實施例i所述的技術，但僅變化配置於乙酮中之單體濃度pH。結果如下述表2所示：表2 ——__在有機相中單體的濃度（mg/ml) 30 60 90 尺寸（nm) 213 239 299 標準偏離 +/_nm 2 4 3 聚合物的牿徼ίΕρ、 MP 31500 39600 59300 Mw 44700 63000 67200 此結果顯示，該主要物種之分子量（Mp)以及用以構成該奈米粒子之聚合物的平均分子量（Mw)是隨著在有機相中單體濃度而規律地增加。實施例4 : 此實驗係依實施例1與3所述的技術，但以一非離子性表面活性劑 Pluronic F68 (BASF Corporation，USA)·來取糊精70膠體保護劑。結果如下述表3所示： -17- 本紙張尺度適财關家縣（CNS ) A4規格（21GX297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再本頁)

503109 A7 B7五、發明説明（14 )表3 含有0.5% Pluronic F68之聚合反應介質的 ρ] Η 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 尺寸（nm) 87 80 95 117 122 121 146 153 標準偏離+/-nm 1 2 2 5 9 1 3 1 聚合物的特徵（Ep)# MP 656 13300 14800 25600 38600 43700 45300 77800 Mw 5520 9740 12300 23600 33000 51600 70900 88900 *在乙酮中單體濃度=90mg/ml 此結果顯示，對於相同的pH : -在有關膠體保護劑方面，在表面活性劑存在下，可 (請先閱讀背面之注意事項再本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製增力tr主要物種之分子量（Μρ)以及構成該奈米粒子之聚合物之平均分子量（Mw)。 -在有關膠體保護劑方面，在表面活性劑存在下會降低相同的奈米粒子的尺寸。實施例5 :聚合反應介質之莫耳濃度的研究依據實施例1的方法，溶解於16.6 ml乙酮中之500 mg的單體係被送入有增加莫耳濃度且另含有0.5 % Pluronic F68 之磷酸緩衝液（Na2HP04/KH2PO4)中。結果如下表4所示的訂

-18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 503109 A7 B7 五、發明説明（15 ) 表4 莫耳濃度奈米粒子尺寸（nm) 標準偏差 (nm) MP (Ep) Mw (Ep) 0.033 Μ 127 2 15200 12500 0.066Μ 123 1 14600 12400 0.133Μ 124 1 653 9790 0.267Μ 179 3 660 8690 此結果顯示該構成奈米粒子之聚合物的平均分子量上的降低係與該介質的莫耳濃度之增加成比例關係。實施例6 依據實施例1至3來製備該奈米粒子，且將之與依據 Lescure et al. Pharm. Res. 1994. 1270-1276所揭示之方法製得的奈米粒子相比較。對此，將l〇〇mg的單體引入至. 10ml且pH為5-9之10ml磷酸緩衝液介質（Na2HP04/KH2P04. 1/15 Μ)中。其結果係如下述表5所示，其中該募聚物係被定義成任何具有低於或者等於920之分子量的分子物種。 (請先閱讀背面之注意事項再^^本頁) ----1Τ

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 _— __B7 五、發明説明（16 ) 表5 含亨1 %辉精之聚合反應介質的pH 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 Lescure 尺寸 260 296 337 335 271 322 et al·所 (nm) 揭示之標準偏 5 5 10 4 6 6 方法離 +/-nm MP 666 660 675 685 15572 13000 Mw 1719 2421 5335 6041* 6759* 7594* 募聚物％ 43 53 27 28 18 13 所得奈米粒子的產率 87 79.5 71.5 59.5 21 23 %土5 本發明尺寸 424 423 361 382 313 288 揭示之 (nm) 方法μ 標準偏 7 6 9 7 2 3 離 +/-nm MP 655 19395 31508 36290 40278 59300 Mw 11138 17569 28918 38799 53181 67201 寡聚物％ 19 14 8 4 3 2 所得奈米粒子的產率 82.5 73 84.5 91 85 86.5 % ±5 有凝集的存在 *在乙酮中單體濃度=90mg/ml (請先閲讀背面之注意事項再_舄本頁)

L--1T

_____-20- 本紙張尺度適用中國國家標準（ CNS ) A4規格（210X297公襲Γ 503109

糸年厂月，

S 煩請委員明示 Λ-iiv ♦ ;質内容經濟部智慧財產局員工消費合作钍印製第861 15768號發明真采丨丨as η» ^ ^行 H a寻刊再奋查茶發明說明書修正頁修正曰期：9〇年5月此結果顯示，對相同pH之實驗條件而言·· -依據Lescure以α/所製得之構成奈米粒子的聚合物平均分子量係低依據本發明方法所製得之聚合物為低。 -依據本發明方法，該構成該聚合物之暮聚物（三元體或者四元體），對奈米粒子而言，係顯著地降低。 -本案方法相較於Lescure w的方法，聚合反應中呈奈米粒子形式之產率是較高的（依W的方法在鹼性pH下有凝集物形成，而造成低產率）。第2圖之凝膠通透層析圖形，一方面代表依據本發明之方法在pH 7.5下所製得之聚合物的分子量分佈情況（蹤跡A )，而另一方面則代表依據Lescure “所製得者（蹤跡B )。除了對應於甲苯之峰3外，對峰a而言，所觀察到的單一 1係對應為主要物種（Μρ = 40278)，而對蹤跡B 而言，可觀察到一顯著峰2的存在，其係對於應募聚物（三元體及四元體）。實施例7 50ml在pH 6·5具缓衝效用且含有〇·5 %的Pluronic F68 (BASF Corporation，USA)之水性介質（Na2HP04/KH2P04 1/15M)被逐漸地加入5.55 ml配置於5.5ml乙酮中之500mg 的1-乙氧基羰基-1-乙氧基羰基乙撐氧基羰基乙烯單體 (LABORATOIRES UPSA/CARPIBEM，France)的溶液中，並作磁性攪拌，該單體已先在25;m毫巴下進行釋出所吸收 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

訂本紙張尺度通用中國國家標隼（CNS ) Μ規格（210X297公釐） 503109 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製實施例 A7 B7 五、發明説明（） v 18 1 之S〇2 3小時。在該有機相完全加入後該攪拌持續1 6小夺而後’ 50 ml含有葡萄糖或漏屢糖（膠體保護劑或者冷，東保護劑）的蒸餾水係加入該奈米粒子懸浮液，並將該混合物送至真抽真空蒸發，以去除乙酮並降低該懸浮液之體積至50 °在濾紙（孔徑5至15〆m)上過濾後，該製劑係被冷凍乾燥，例如，被包含於該濾液中的粒子的直徑係以雷射散射來測定。構成該粒子之聚合物基質的亞甲基丙二酸S旨之平均分子量是利用凝膠通透層析法來估量的。其結杲顯示於下表6，其中Μρ係為主要物種的分子量’而Mw係為聚合物之平均分子量β 產率係由被引入反應介質内的單體量與構成奈米粒子之聚合物量的比例來加以測得的。表6 聚合反應介質的pH 6.5 尺寸（nm) 394 標準偏差+/-nm 32 聚合物的特徵（Ed MP 24300 Mw 20100 — 產率 % 57 標準偏離 4.6 ~ 此實驗.係依實施例1的方法，但使用乙酮、乙睛或四氫呋喃（THF)來值為單體的溶劑。 (請先閲請背面之注意事項再填寫本頁)

503109 五、發明説明（19 ) 其結果顯示於下表7中表7

貫方β例9 ·水/溶劑體積比例的研究實驗係依實施例1來進行，但變化水/溶劑體積比例結果係如下表8所示表8 -^^ 4.5/1 —>—-—- 溶劑體精比名 9/1 -— 18/1 尺寸（nm) 產率（％) 241 74 288 74 334 8s —- % 12100 1 ^竺物的特徵（Εΐ 59300 〇 _Mw 42000 [57200 ^ 11/1» _ 24600^—-

2f先閑讀背面之注意事項再本百C ill衣本 π ----訂. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製此測試係在pH 10的水性介質中，且於一表面活性隨或者一膠體保護存在下進行的，其係依實施例^的方法。、者依實施例7的方法。 e 1) 測試1 100mg的1-乙氧基羰基小乙氧基羰基甲撐氧羰基乙烯單體係被溶解於1 ml的乙酮中。而後該溶液係被逐漸地加至i 〇ml之pH在丨〇且含有 -23 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 Ox297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（20 ) 100mg糊精70的水性介質中。該聚合反應馬上發生。在將該有機相完全加入後，該攪拌持續30分鐘。而後，將1 〇ml的蒸餾水加入該奈米粒子懸浮液，且該混合物係被送去抽真空蒸發，以去除乙酮。而後將該介質離心（v = 1 〇〇〇〇 rpm，4°C 10分鐘）。 2) 測試2 實驗步驟是完相同於測試1者，而僅以Plur〇nic F68 來取代糊精70。 3) 測試3 10ml之pH在10且含有l〇〇mg糊精70的水性介質在攪拌下加入至由100mg單體與lml乙酮所構成的有機相。該聚合反應是馬上發生。在將該有機相完全加入後，該擾拌持續30分鐘。而後，將10ml的蒸餾水加入該奈米粒子懸浮液，且該混合物係被送去抽真空蒸發，以去除乙酮。而後將該介質離心（v = 10 000 rpm，4°C 10分鐘）。 4) 測試3 實驗步驟是完相同於測試3者，而僅以Pluronic F68 來取代糊精70。在離心後，含於該柱塞内的奈米粒子係以立體排除層析法（steric exclusion chromatography)來測定出其分子量（Mw)。其結果顯示於下表9 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 訂 503109 A7 B7五、發明説明（21 ) 表9·

Mw 粒子尺寸（mn) 測試1 88〇〇 240 測試2 6900 245 測試3 1400 316 測試4 1850 333 實施例11 此實驗係依實施例1所揭示之聚合反應進行，但1,1-丙氧基羰基乙烯（Laboratoires UPSA/CARPIBEM，法國） (其後稱為MM 3.3)單獨使用，或者是使用其與1-乙氧基羰基小乙氧基羰基甲撐氧-基羰基乙烯單體（Laboratoires UPSA / CARPIBEM，法國）所構成之混合物（其後稱為MM 2.1.2)。其結果係如下表10所示，其中Mp係為主物種的分子量，而Mw係為該聚合物之平均分子量。表10 MM3.3/MM2.1.2的比例 100/0 75/25 50/50 25/75 尺寸 123 223 298 155 產率（％) 77 73 80 78 聚合物的特性 Mp 44764 92090 37467 21727 Mw 44122 89793 37467 21727 實施例12 ··含有利福平的奈米粒子 (請先閲讀背面之注意事項再本頁)

1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 5mg利福平基底（Sigma)係為被溶於1 ml的已先添加有9Omg之乙氧基羰基-1-乙氧基藏基甲撐氧-基黢基乙烯单體（LABORATOIRES UPSA /CARPIBEM，法國）的乙酮内，該單體已在25m毫巴下進行釋出所吸收之S02 3小時。利用玻璃滴管的辅助，將該溶液在攪拌（750 rPm)下漸漸地 -25- 足度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 503109 Α7 Β7 五、發明説明（22 ) 加入至9 ml之一種添加有礙酸緩衝液（Na2HP04/KH2PO4 (1.066M)且含有90 mg糊精70 (1% w/v)而在pH 6·0下具有緩衝效用的水性介質。在2 0 °C下聚合反應1 8小時後，在對該奈米粒子懸浮液攪拌下將9 ml含有5%D-葡萄糖之蒸餾水加入其中，而後將該混合物在旋轉蒸發器 (Rotavapor )(20°C，25 m毫巴）的辅助下抽真空蒸發，以去除乙酮並降低該水性懸浮液體積至9ml。再將該製劑加以冷凍乾燥；在-30°C下冷凍，再於20°C且壓力為〇.〇5m亳巴下昇華36小時。奈米粒子的尺寸以及福利平的濃度係在冷凍乾燥前與後測Ί：之。該尺寸係以雷射散射來測定。而福利平的濃度係利用一偶合至分光光度計之高效能液相層析儀來進行的。該移動相係相甲醇/0·05Μ(65··35)乙酸銨所組成之混合物，該pH係被調整至7.3，而流速固定於iml/min且該吸光值係在254 nm下測定出的。未結合至奈米粒子之福利平的含篁係在以對該奈米粒子超高速離心（8〇〇⑽g，4 °C 1小時）後測量所得之上清液。該結合至奈米粒子之福利平的置是對應於存在於柱塞内的部分，在進行直接決定福利平之前，將該部分溶解於THF。可得到下列結果。 -在’含有福利平之奈米粒子尺寸係為266±63 ，而冷凍乾燥後係為282±54nm。 -福利平的結合百分比··冷凍乾燥之前與之後 8·5±0·5% 〇 ―丨咖丨丨......................丨丨丨........................ …… - 26 - 本紙張尺度適财ϋ國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公襲) 一一—— 一 (請先閲讀背面之注意事項再本頁)

If • i in 503109 A7 B7 五、發明説明（23 ) A. %.例.13 :含有黏菌素的奈米粒子之製傷此實驗係以相同於實施例12的方法來進行，但該活性成份係為水可溶的，將該活性成分在加入有機相之前，以濃度為0.5mg/ml加入該聚合反應介質中。含有黏菌素的奈米粒子尺寸，利用雷射散射測量，在蒸發後為282±65nm，而在+4t下保存4天後為283±26nm。依據凍瓊臘糖擴散技術（S.P. Gotoff a/.,AntimierQb. Agents Chemother，1962, 107-113)來測定，該黏菌素被發現在奈米粒子懸浮液超離心（80000g，1小時）之上清液中所得到的濃度係為15ug/ml :未結合至奈米粒子之部分被估計為所加入之黏菌素總量的3%。實施例14:含有疊氮胸腺嘧啶（AZT) (Sigma八丨&丨仏 Chimic，法國）·之製備已在25m亳巴下進行釋出所吸收之s〇2 3小時的240 mgl-乙氧基羰基_1_乙氧基羰基甲撐基氧基羰基乙烯 (Laboratoires UPSA/CAUIBEM，法國）係被解於2.5ml 的乙酮中。利用谪定管，該溶液在磁性攪拌下逐漸地加入22 5ml 之一種添加有磷酸緩衝液（Na2HP04/KH2P〇4 (〇·〇66Μ)且含有22.5 mg糊精70 (1% w/v)以及濃度為〇.53mg/ml的水溶性活性成分的水性介質，該水性介質在ρΗ8·〇下具有緩衝效用。在20°C下聚合反應18小時後，在攪拌下，將含有5% D-葡萄糖的去礦物質水加入該奈米粒子懸浮液中，而後將該混合物在旋轉蒸發器（R〇tavap〇r )(2〇°C，25 m亳巴）的辅助下抽真空蒸發，以去除乙酮並降低該水性懸浮液體積 ____ - 27. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再_舄本頁)

1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 503109 A7 ____ B7 五、發明説明（24 ) 至39.0ml。再將該製劑加以冷凍乾燥；在_3{rc下冷康，再於20°C且壓力為〇.〇5m毫巴下昇華36小時。利用雷射散射所測定之含有AZT的奈米粒子尺寸，在冷康乾燥之前為255±63nm。再將該奈米粒子懸浮液離心 (12000 rpm，4°C下1小時）後之上清液中AZT的含量係乃是利用在266nm下的UV吸光值來加以測定的。此可得到 98ug/ml的濃度：未結合至該奈米粒子上的部分因此被估計為加所入之AZT總量的3 1.9%。而結合至該奈米粒子上之AZT部分係為68·1 % 〇見多包例15 ·—含有鱗酸肌酸（Boehringer Mannheim)之奈米粒子的製備填酸肌酸的囊封作為係依實施例14的技術來進行。含有磷酸肌酸的奈米粒子的尺寸，係以雷射散射來測定，在）冷乾燥之前為275± 260nm。利用偶合至分光光度計上之高效能液相層析儀來進行磷酸肌酸的測定。該移動相係由被調整為pH 3.3之磷酸緩衝液（κη2Ρ04，0.05M)。該流動速係固定於2 ml/min，且該吸光值係在2〇〇11111下測定。未結合於該奈米粒子上的磷酸肌酸含量，係在該奈米粒子離心（12000 rpm，4 t： 1小時）後所得之上清液中測得的。在上清液中，該磷酸肌酸的濃度係為463ug/ml :未結合至該奈米粒子上的部分，估計為所加入之磷酸肌酸總量的81 %。因此’結合至該奈米粒子上的磷酸肌酸部分係為 19%。實施例16 :含有5-氟尿嘧啶的奈米粒子之製備 —....... .. _ - 28 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210^291^)----- I- - II· (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 503109 Α7 ---—---- Β7___ _ 五、發明説明（25 ) — ~~-- 5-氟尿嘧啶（Sigma Aldrich Chirnie，法國）的囊封作為係依實施例14的技術來進行。含有5_氟尿嘧啶的奈米粒子的尺寸’係以雷射散射來測定，在冷乾燥之前為5丨 88nm。利用在266nm下之UV分光光度測定，可知在該奈米粒子離心（12000 rpm，4 t： 1小時）後所得之上清液中，該5 -氧尿唯、唆的濃度係為7〇ug/mi :未結合至該奈米粒子上的部分’估計為所加入之5_氟尿嘧啶總量的23·3%。因此’結合至該奈米粒子上的磷酸肌酸部分係為76.7〇/〇。 (請先閱讀背面之注意事項再_舄本頁) -訂經濟部中央榡準局員工消費合作社印製 4—-：~一~>~~_____—... -29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) M規格（2丨〇><297公襲）

Claims

503109 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍第86115768號專利申請案申請專利範圍修正本μ年5月24曰 1· 一種用以製備由一含有至少一種具有下列通式⑴之化合物的隨機聚合物所形成的奈米粒子之亨法： h2c=c: 0 II (D 其中 A代表一個 ro〜 (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 基團或者一個 0 0 基團， R1以及R2可為相同或者不同，域表—直線或分支之CrC6的烷基基團； ? = 1，2,3,4 或 5 ; 、其特徵在於該（精體在聚合反應之前被溶解於一與水可相混之非質子財機溶财，該溶劑可與聚合反應介質形成一為所形成之聚合物的非溶劑混合物。 2.如申請專利範圍第]_項方法，其係供用於製備由一、 .，机I用田一通式(I)的化合物所構成之聚合物所形成奈米粒子，具 -、-1丨本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公楚） -15* 申請專利範圍 h2c: 、h (I) 其中 A代表一個基團或者一個基團 Rl以及R2為可相同或者不同，肛代表-直線或分支之CrC6的烷基基團； n= l，2,3,4 或其特徵在於該（等）單體在聚合反應之前被溶解於一與尺了相混之非質子性有機溶劑中，該溶劑可與聚合反應介質形成一為所形成聚合物之非溶劑混合物。間 3·如申請專利範圍第項之方法，其係供用於製傷具有低於500nm直徑且具有約在1〇〇〇至1〇〇〇〇〇之的平均分子量（Mw)的奈米粒子。 4.如申請專利範圍第項之方法，其特徵在於包含下列步驟： -製備一配於一與水可相混之非質子性有機溶劑中且含有至少一種具有通式⑴之化合物的溶液，本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X 297公釐） -16** 503109 A8 B8 C8 D8 申請專利範圍在授拌下’將該有機相加至一 pH值在4.5與10 之間下之水性聚合反應介質中， -在將垓混合物均質化且抽真空蒸發該有機溶劑後’回收該等奈米粒子。 5. 申請專利範圍第⑷項之方法，其特徵在於包含有下列步驟： •製備一配於一與水可相混之非質子性有機溶劑中且含有至少一種具通式⑴之化合物的溶液， -在攪拌下，將一 PH值在4.5與1〇之間的水性聚合反應介質加至該有機相中， -在將該混合物均質化且抽真空蒸發該有機溶劑後，回收該等奈米粒子。 6. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其特徵在於該非質子有機溶劑係選自於乙酮、乙腈、二〇惡炫以及四 σ夫喃之中。 7. 如申請專利範圍第1或2項之方法’其特徵在於被.配於該有機溶劑内之該（等）具有通式⑴之化合物（等）的濃度範圍係為30 mg/mi至i5〇mg/ml。 8·如申請專利範圍第13戈2項之方法，其特徵在於該聚合反應介質的莫耳濃度範圍係為1/30 Μ至1/3 Μβ 9.如申請專利範圍第工或2項之方法，其特徵在於該聚 ‘心”質S有或多種表面活性劑或膠體保護劑。 1〇.如申請專利範圍第9項之方法，其特徵在於該表面活性劑係選自於下列的非離子性表面活性劑··聚氧乙締氫 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張切適用中_家標準—M規格（膽297公

•訂*丨 -17- A8 B8 C8 D8 、申請專利範圍以及聚丙烯之共聚物，薄利克沙門（p〇1〇xamers)以及聚山梨酸酯。 11 ·如申請專利範圍第9項之方法，其特徵在於該膠體保護劑係選自於下列：糊精，水溶性纖維素^生物，聚乙二醇以及聚（乙烯醇）。 12·如申請專利範圍第i或2項之方法，其特徵在於該有機相或該聚合反應介質含有一種或多種具有生物活性的分子。 13·如申請專利範圍第丄或2項之方法，其特徵在於該經聚合化的化合物係為一個具有通式⑴的化合物，其中 A代表一個 .............#·: (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .訂卜基團且η =卜R1==R2 =乙基。 14·如申請專利範圍第或2項之方法，其特徵在於該經聚合化的化合物係為一具有通式⑴的化合物，其中A 為一 S一 ° 基團，且Ri=R2=丙基。 15·如申請專利範圍第1或2項之方法，其特徵在於該由具有通式（I)之化合物所構成的混合物被隨機地聚合化’其中A係為一個如申請專利範圍第1項中所界之衣紙張尺度適用中國國家標準（cnS) A4規格（21〇χ297公董） -18- 503109 A8 B8 C8 D8 申請專利範圍或者基團 1_"CH2)rjf—0¾ 〇 0 基團。 16· —種由一含有至少一種具有下列通式⑴之亞曱基丙酸酯化合物的隨機聚合物所形成之奈米粒子. 0 II /C一 OR h2c=c、 A 其中 A代表一個一 S一叫〇或者一個基團 (I) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .、¥ 4 〇 0 基團， R1以及R2可為相同或者不同，且代表—個直線或分支之CrC6的烷基基團； η = 1，2,3,4 或 5 ; 該粒子具有低於500nm直徑且具有約在_至 100000之間之平均分子量叫其係可利用如申請本紙張尺度適用t國國家標準（CNS) A4規格（210X297公爱） -19- 503109 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍專利範圍第1至15項中任一項之方法來加以獲得 17· —種由一含有至少一種具有下列通式⑴之亞甲基丙酸酯化合物的聚合物所形成之奈米粒子：> HjC ——C · 0 II kA (I) 其中 A代表一個 OR^ 基團 (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 或者一個訂-丨 0 基團 R1以及R2可為相同或者不同，且代表—直線或分支之C「C6的烷基基團； η = 1，2,3,4 或 5 ; 請该粒子具有低於5〇〇nm之直徑且具有約在麵至 1〇〇咖之間时均分子量（Mw),其係可利用如申專利犯圍第1至15項中任—項之方法來而獲得之的隨 18. —種由一含有至φ ^ ^ 各虿至V—種具有下列通式⑴之化合物機聚合物所形成之奈米粒子： **20- A8 B8 C8 D8 申請專利範園 h2c=c. ο II -C—〇Rt 、k (I) 其中 A代表一個 OR^ O 基團或者一個 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 一 S一 O-WrjJ-OR^ 0 0 基團， R1以及R2可為相同或者不同’且代表一直線或分支之C「c6的烷基基團； η = 1，2,3,4 或 5 ; 該粒子具有低於500nm之直徑且具有約在8〇〇〇至 100000之間的平均分子量（Mw)。 19. 一、種自一由具有下列通式⑴之化合物所構成之聚合物所形成之奈米粒子： 0 II (I) ,C-〇Rt h2c=c_ 其中 A代表一個本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X297公釐） -21-

申請專利範圍 OiL, Ο 或者一個基團一 C**0— II0 WrjJ-OR,0 基團 R1以及R2可為相同或者不同，且代表一直線或分支之C!至C6的烷基基團； n== 1，2,3,4 或 5 ; /粒子具有低於5〇〇nm直徑且具有約在8〇〇〇至8〇〇〇〇之間的平均分子量（Mw)。〇·如申睛專利範圍第丨8或19項之奈米粒子，其係自一由具有通式（I)的化合物所構成之聚合物所形成的，其中，A代表一個 -c-o-cch^-c-oi^ 0 0 基團 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、可丨 η 且R!=R2 =乙基 21 ·如申請專利範圍第18或19項之奈米粒子，其係自一由具有通式（I)的化合物所構成之聚合物所形成的，其中’ A代表 C II 〇基團本紙張尺度適用中國國家標準（哪）A4規格（21〇χ297公楚） -22- 22.如申請專利範圍第16或Π項之奈米粒子，其特徵在於該等粒子包含有一或多種具有生物活性的分子。 23·-種藥學組合物’包含_作為主要成份的如中請專利範圍第22項之奈米粒子，其可與一藥學上可接受的載劑相結合以用於輸送一或更多個生物活性分子，該分子係選自於抗傳染性劑、抗生素、抗病毒劑、抗寄生蟲劑或抗有絲分裂藥劑。 24. 如申請專利範圍第3項之方法，其特徵在於包含下列步驟： •製備一配於一與水可相混之非質子性有機溶劑中且含有至少一種具有通式⑴之化合物的溶液， -在攪拌下，將該有機相加至一 ph值在4·5與ι〇之間下之水性聚合反應介質中， -在將該混合物均質化且抽真空蒸發該有機溶劑後，回收該等奈米粒子。 25. 申請專利範圍第3項之方法，其特徵在於包含有下列步驟： -製備一配於一與水可相混之非質子性有機溶劑中且含有至少一種具通式⑴之化合物的溶液， -在攪拌下，將一 ΡΗ值在4·5與1〇之間的水性聚合反應介質加至該有機相中， -在將該混合物均質化且抽真空蒸發該有機溶劑後，回收該等奈米粒子。 26·如申請專利範圍第3項之方法，其特徵在於該非 A8 B8 C8 T—----^ _ 申請專利範圍有機溶劑係選自於乙酮、乙腈、二喔貌以及四氫咬啥之中。 27·如申請專利範圍第3項之方法，其特徵在於被配於該有機溶劑内之該（等）具有通式⑴之化合物(等）的濃度範圍係為30 mg/ml至150mg/mb 28·如申清專利範圍第3項之方法，其特徵在於該聚合反應介質的莫耳濃度範圍係為1/30 Μ至1/3 Μ。 29·如申請專利範圍第3項之方法，其特徵在於該聚合反應"質含有一或多種表面活性劑或膠體保護劑。 3〇·如申請專利範圍第3項之方法，其特徵在於該有機相或忒聚合反應介質含有一種或多種具有生物活性的分子。 31·如申請專利範圍，第4項之方法，其特徵在於該非質子有機溶劑係選自於乙綱、乙腈、二喔烧以及四氫吱喃之中。 · 32. 如申請專利範圍第4項之方法，其特徵在於被配於該有機/合劑内之該（等）具有通式⑴之化合物（等）的濃度範圍係為3〇 mg/ml至15〇mg/m卜 33. 如申請專利範圍第4項之方法，其特徵在於該聚合反應介質的莫耳濃度範圍係為1/30 Μ至1/3 Μ。 34·如申請專利範圍第4項之方法，其特徵在於該聚合反應介質含有一或多種表面活性劑或膠體保護劑。 35·如申請專利範圍第4項之方法，其特徵在於該有機相或讜聚合反應介質含有一種或多種具有生物活性的分本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) Α4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-24- 申請專利範圍子。 36·如申請專利範圍第5項之方法，其特徵在於該非質子有機溶劑係選自於乙酮、乙腈、二噁烷以及四氫呋喃之中。 37·如申請專利範圍第5項之方法，其特徵在於被配於該有機溶劑内之該（等）具有通式（I)之化合物（等）的濃度範圍係為30 mg/ml至I50mg/m卜 38·如申請專利範圍第5項之方法，其特徵在於該聚合反應介質的莫耳濃度範圍係為1/30 Μ至1/3 Μ。 39·如申請專利範圍第5項之方法，其特徵在於該聚合反應介質含有一或多種表面活性劑或膠體保護劑。 4〇.如申㈣利範圍第5項之方法，其特徵在於該有機相或該聚合反應介質含有一種或多種具有生物活性的分子。 41·如申請專利範圍第13項之方法，其係供用於製備具有低於50〇nm，直徑且具有約在1〇〇〇至1〇〇〇〇〇之間之平均分子量（Mw)的奈米粒子。 42. 如申請專利範圍第14項之方法，其係供用於製備具有低於50〇nm ,直徑且具有約在1〇〇〇至1〇〇〇〇〇之間之平均分子量（Mw)的奈米粒子。 43. 如申請專利範圍第15項之方法，其係供用於製備具有低於500nm，直徑且具有約在1〇〇〇至1〇〇〇〇〇之間之平均分子量（Mw)的奈米粒子。 44·如申請專利範圍第18或19項之奈米粒子，其特徵在 503109 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍於該等粒子包含有一或多種具有生物活性的分子。 45·如申請專利範圍第16項之方法，其係供用於製備具有在100至500nm之間的直徑且具有約在2000至80000 之間的平均分子量（Mw)的奈米粒子。/ 46.如申請專利範圍第17項之奈米粒子，其係供用於製備具有在100至500nm之間的直徑且具有約在2000至 80000之間的平均分子量（Mw)的奈米粒子。 47·如申請專利範圍第18或19項之奈米粒子，其具有在 100至500nm之間的直徑。 48.如申請專利範圍第18項之奈米粒子，其具有約在8000 至80000之間的平均分子量（Mw)。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

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