TW422700B

TW422700B - Pharmaceutical compositions for inducing cartilaginous tissue formation and maintenance

Info

Publication number: TW422700B
Application number: TW085106281A
Authority: TW
Inventors: Gary Hattersley; Neil M Wolfman; Elisabeth A Morris; Vicki A Rosen
Original assignee: Genetics Inst
Priority date: 1995-06-06
Filing date: 1996-05-27
Publication date: 2001-02-21
Also published as: AU6024696A; US5902785A; WO1996039170A1

Description

422700 at __B7_ 五、發明説明（i ) 發明領域本發明是有關新穎的純蛋白質後，及含彼之組成物| 此組成物可用於誘生軟骨組織之形成，傷口癒合及軟骨及其他組織之修復。這些蛋白質也可用於組成物中以增強骨成形蛋白質之活性。特言之，本申請案也是有關使用上述蛋白質以誘生軟骨組織，如關節軟骨。發明背景經濟部中央標準局員工消費含作社印装 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 在負實骨、軟骨、肌鍵及存在於骨骼及其他組織萃取物中其他組織形成之分子尋求研究中，發現了一組新穎的分子稱爲骨成形蛋白質（BMPs ，Bone Μ o r p h o g e n e ΐ i c P r o t e i n s ) 先前已評估出許多蛋白質結構，命名爲BMP— 1至BMP — 13。這些蛋白質之獨特誘生活性，加上其在骨骼中之存在可推測其爲骨胳修復過程中重要的調控者，且涉及於骨骼組織中之正常維持 *在此需鑑定出在形成其他重要組織中扮演角色之額外蛋白質。近來已示出·BMP-12相關之蛋白質亞族，包括BMP- 1 3具有類似肌腱/韌帶組織誘生活性，且可用於肌腱/韌帶一類似組織形成及修復之誘生作用中β令人驚訝地，本發明者也發現此亞族成員可有效誘生軟骨組織，因此可用於治療軟骨組織之疾病或缺陷》特言之，本發明者已發現，ΒΜΡ-13或VL — 1特別有效於軟骨組織之誘生。此外，本發明者發現ΒΜΡ - 9可用於增加蛋白多醣基質之合成，因此可用於軟骨組織之維持。本紙乐^度適用中國國家榡準（CNS ) Α4規格（210'〆297公釐） -4 - 經濟部中央標準局員工消作社印裝 4227 , ΚΊ _Β7五、發明説明（2 ) 發明要點本發明是有關BMP — 1 2相關之蛋白質亞族，其中蛋白質於誘生軟骨組織上之用法，如關節軟骨，半月板，及發育中骨骼之關節表面’或可用於軟骨組織疾病或缺陷之治療。於本發明一個較佳具體實例中，所使用的蛋白質是BMP — 13或VL— 1。此'蛋白質之鼠類版本也有所述，稱爲GPF — 6。 BMP — 12相關蛋白質爲BMP/TGF-^/ Vg—1蛋白質族中一子族，包括有BMP-12及 BMP — 1 3，先前已示出具有類肌鍵/韌帶組織誘生能力，且已利用如P CR選殖及鑑定出所編碼之DNA序列。此亞族也包括MP52，其述於WO93/16099 。BMP — 1 2有關之蛋白質族，編碼彼之DNA序列，載體*宿主細胞，製備彼等之方法及組成物已詳述於W0 95/16035，以及系列號 08/362，670，公告於 1994 年 12 月 22 日；08/333 ，576 ，公告於1 9 94年1 1月2曰，及08/21 7， 780 | 公告於 1994 年 12 月 22 日：08/333 ，576，公告於1994年11月2日，及08/ 217，780 ，公告於1994年3月25日；以上各安均爲08/164 · 103之部份編篇，其公告於 1 9 9 3年1 2月7日，目前已放棄"這些申請案之揭示已列爲本案之參考》在本發明中，含有BMP- 1 2相關蛋白質，較好是本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本S) -5 - 422 A 7 B7 經濟部中央標準局員工消|!>作社印装五、發明説明（3 ) BMP - 1 3或VL·— 1之組成物投予需軟骨修復之患者，或具有涉及軟骨組織疾病或缺陷之患者，如骨關節炎。 DNA分子較好具有編碼BMP—13蛋白質之 DNA序列•此序列示於WO95/16035中。編碼 BMP - 1 3蛋白質之DNA分子，宿主細胞及載體及製備BMP — 1 3之方法，述於W09 5/1 60 3 5中。文獻之揭示已列爲此中參考》 BMP — 12及相關亞族中的其他蛋白質，如BMP _ 1 3先前已由誘生肌腱/韌帶類似組織形成之能力予以鑑定。本發明者已示出，BMP — 1 2相關蛋白質後之成員，較好是BMP — 1 3，可由誘生軟骨組織形成之能力進一步鑑定。於較佳之具體實例中，經純化之多肽可呈由二個亞單位組成之二聚體型式，各自具有BMP — 1 3之胺基酸序列。 ~ 於另一具體實例中，本發明包括含有有效劑量之上述 BMP — 1 2相關蛋白質，較好是BMP — 1 3之組成物。在組成物中，蛋白質摻合以藥學上可接受之賦形劑。於特殊具體實例中，組成物可額外包括一種以上額外的轉形生長因子_5蛋白質或已證明具成骨性質之BMPs ，較好是 BMP — 2，一 4，一 5，一 6 及/或 BMP-7 ; 更好是BMP — 2，— 4或BMP — 7。含有BMP -1 2相關蛋白質及其他TGF —沒或BMP之組成物，可用於多重組織型式之新生，如在組織間界面或接頭處。含有可用於誘生軟骨細胞及軟骨組織之蛋白質•如BMP - 請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁- 本紙浪尺度逋用中國國家梂準（CNS ) A4規格（210X297公釐} -6 - 經濟部中央樣隼局員工消*^作杜印衷 422700 Μ Β7 ~ _____.____ _ ___ ___________ .. ___五、發明説明（4 ) 1 2，BMP - 13或ΜΡ — 52，及可用於誘生骨骼細胞及骨組織之蛋白質，如BMP — 2 ，-4，— 5 ，_6 或BMP — 7二種蛋白質之組成物，尤其可用於治療關節軟骨·其中關節表面，軟骨，軟骨下骨胳及/或軟骨及骨骼間之漲潮線界面需加以修復。修復軟骨下骨 > 漲潮線界面及軟骨組織之骨細胞及軟骨細胞良好來源可利用因子組合獲得。此種具體實例之最佳者爲混合BMP - 2及 BMP-13之組成物》於本發明另一較佳具體實例中，組成物含有可用於誘生骨細胞或軟骨組織之蛋白質，如BMP — 1 2， MP 5 2或BMP — 1 3，加上可用於維持軟骨細胞或軟骨組織之蛋白質，如BMP- 9及較少程度的BMP — 2 ，BMP-4 及 BMP-7。含有 BMP— 13 及 BMP 一 9之組成物尤其可在需軟骨修復之位置上誘生及維持軟骨組織，如關節軟骨之缺陷•已示出BMP — 9可用於維持成熟的軟骨細胞》因此，在本發明較佳之具體實例中，可先應用誘生軟骨細胞或軟骨組織之蛋白質，如BMP -1 3，BMP— 1 2或MP52，以誘導軟骨細胞之形成，且在較後時間時投予BMP - 9或其他適合的因子，如 BMP-2 ’ BMP — 4或BMP — 7，以維持軟骨細胞及軟骨組織之形成* BMP — 1 3及BMP — 9也可在單一組成物中投予》此組成投予之型式較好是BMP - 1 3 在BMP — 9前先釋出，如此BMP - 1 3之軟骨—誘生作用可繼以BMP — 9之軟骨維持作用》本紙伕尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) '1Τ -7、嫂濟部中夹梂參局—工消作杜印衆 422700a7 B7五、發明説明（5 ) 又另一較佳具體實例中，組成物包括可用於誘生軟骨組織的至少一種蛋白質，如BMP-1 3 ，BMP — 1 2 或Μ P - 5 2 ;可用於誘導軟骨下骨組織形成之蛋白質，如ΒΜΡ — 2，一4或一 7 ;及可用於維持軟骨組織之蛋白質，如BMP — 9 »此種組成物最佳的是包括BMP -13，BMP-2 及 BMP — 9 ;或 BMP — 13， BMP-7 及 BMP-9。 .本發明也包括軟骨組織瘫合及組織修復之方法，以治療骨關節炎，或其他軟骨缺陷，及誘導需彼病患中軟骨組織之形成，此方法包括對該病患投予有效劑量的上述組成物。本發明也包括雜二髖蛋白質分子，包括具有可誘生軟骨細胞或軟骨組織之蛋白質胺基酸序列的一個單體，較好是BMP — 1 3，及具有TGF — /3亞族另外蛋白質胺基酸序列的一個單體。最後，本發明包括在需彼之患者中誘生軟骨組織形成之方法，方法包括對患者投予有效劑量之組成物，其中含有可呈現出誘生軟骨組織形成能力之蛋白質，如BMP — 1 3，BMP — 12 及MP-52，最好是 BMP—1 3 »於較佳具體實例中，此方法包括對病人同時或相繼投予有效劑量之組成物，其中的蛋白質選自下列包括：BMP —9，BMP-2 ’ BMP — 4 或 BMP — 7，最好是 Β Μ P ~ 9 4 詳細說.明_ >紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) '~' -8 - I---------K------^訂卜-----1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) · . 經濟部中央橾準局員工消費合作社印製

^ 42270aQ Β7 _ 五、發明説明（6 ) 下文進一步說明誘生軟骨組織形成之方法。DNA序列進一步可用於分離及選殖可編碼相似活性之Β Μ P -1 2相關蛋白質之進一步DNA序列。這些BMP — 1 2 相關蛋白質可同源自其他種類，或是相同種類同之相關蛋白質。如先前所述，BMP-1 2相關蛋白質爲BMP/ TGF — yS/Vg — 1蛋白質族之亞族，包括BMP — 1 2及BMP— 1 3，其已利用已經選殖及鑑定之DNA 序列所編碼之類肌腱/韌帶組織誘生蛋白質的鑑知，如此中利用P CR及BMP- 1 2特異引子並在較不迫切條件下。在本發明中，也示出BMP — 1 2相關蛋白質亞族之成員，特別是BMP— 1 3或GDF — 6可誘生軟骨組織之形成。 BMP— 12相關蛋白質，包括BMP — 13，所碼之DNA及胺基酸序列掲示於W0 9 5/1 6 0 3 5中，其揭示已列入此中。人類MP 5 2 D NA述於W0 9 3/ 16099 ，其揭示已列入此中爲參考。MP52蛋白質和BMP-12及BMP-13有關·然而，W093/ 1 6 0 9 9中並未揭示蛋白質形成軟骨或類肌腱/韌帶組織之能力，或其在組成物中誘生軟骨或類肌腱/韌帶組織之用法。人類MP 5 2最初是利用來自人類胚盤組熾之 RNA所分離。在此強調，MP 5 2可用於本發明之組成物及方法中。 BMP - 9之編碼D NA及胺基酸序列揭示於本紙張尺度適用t國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

,1T 422T00 ，； A7 _B7_ 五、發明説明（7 ) WO93/00432 *其揭示已列爲此中參考》本發明方法應用可誘導軟骨組織或其他組織在此組織並不正常形成之狀況下形成之蛋白質，且已應用於軟骨之癒合中，如關節軟骨撕裂，變形及其他人類及其他動物之軟骨缺陷•此應用軟骨組織誘生蛋白質之製劑具有預防用途，可避免對軟骨組織之傷害，以及可用於改善軟骨對骨骼或其他組織之固定，及可修復對軟骨組織之缺陷。由本發明組成物誘生之軟骨組織重新形成，可修復先天的，由外傷誘生的，或其他原因之軟骨缺陷，且也可用於軟骨粘附或修復之手術》本發明組成物也可用於治療關節炎及其他軟骨缺陷。本發明組成物也可用於其他適應症，其中軟骨組織之癒合或再生係欲求的》此種適應症包括關節軟骨受傷之再生或修復，但並不限於此*本發明組成物可提供吸引軟骨形成細胞之環境，刺激軟骨形成細胞之生長或誘導軟骨形成細胞前軀體之分化* 經濟部中央標準局員工消費含作杜印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本1'} 所謂軟骨組織意指軟骨細胞及由其形成之組織，其明示出軟骨之組織學及組成特性。例如1可呈現軟骨及/或軟骨細胞標幟蛋白質特性之組織（此中將進一步描述），如Π型膠原蛋白及凝集多酸（aggre can )，也已知爲蛋白多醣核心蛋0質。用於本發明方法之蛋白質可誘導軟骨組織之形成。這些蛋白質可由以下分析法中證明軟骨組織形成活性之能力以進一步鑑定3希望這些蛋白質也有誘生其他組織型式形成之能力，如肌腱及韌帶。本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS > Λ4規格（210Χ297公釐Ί -10 - 五、發明説明（8 此中提出生成之Β Μ Ρ 所編碼之因子中胺基酸變化作》類似地，然生成之Β Μ 中可自然修飾之對偶基因變全或部份加倍之連續序列· Β Μ Ρ - 9 之 4227〇a〇7 B7 之軟骨組織一 1 2相關，但此中可之核苷酸序此中提供的 Ρ — 9蛋白 (如在造成化）或故意 Β Μ Ρ - 1 這些序列經軟骨組織生誘生蛋蛋白質自然提列之對軟骨組質類似多肽胺地操作 3及/ 由與自長或維白質，，如Β 供修飾偶基因織維持序列所基酸變。例如或Β Μ 然生成持因子也包括 Μ Ρ -作用（變化）蛋白質編碼之化之核，合成 Ρ - 9 之Β Μ 多狀共由類似自然 1 3，序列如造成多肽或故意地操也包括由自因子，但其苷酸序列中的多狀可完胺基酸殘基 Ρ - 1 3 或有一級、二 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本賢) 級或三級結構及構型特色，因此也具有與之共有之軟骨或其他組織生長或維持因子生物特性。因此，其可充作治療組成物及方法中之自然生成的軟骨組織誘生多肽及軟骨組織維持多肽中之生物活性組份。此中所述之軟骨組織誘生蛋白質序列的其他特異突變包括糖基化作用位置之修飾。這些修飾作用包括0 -鍵結的或Ν -鏈結的糖基化作用位置*例如，糖基化作用或僅部份糖基化作用之缺乏，始自與天冬醯胺連接之糖基化作用確認位置之胺基酸置換或刪除。天冬醯胺連接之糖基化作用確認位置包括三肽序列，其可爲適合的細胞糖基化作用酵素特異地確認。這些三肽序列可爲天冬醯胺- X -胺酸，天冬醯胺- X -弱胺酸或天冬醯胺一 X -半胱胺酸，其中X通常爲脯胺酸外的任何胺基酸。在糖基化作用確本紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) Λ4規格（210Χ297公釐） -11 Μ 濟部中標隼局 Μ 作社印製 _ 11 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 422700 A7 ____B7五、發明説明（9 ) 認位置第一或第三胺基酸位置之一或二者上之各樣的胺基.删酸置換或徵除C及/或在第二位置上之胺基酸删除），可造成在經修飾的三肽序列上之非糖基化作用。另外，蛋白質之細菌表現也造成非糖基化蛋白質之產生，即使糖基化作用位置並未經修飾β 本發明誘生軟骨組織形成之組成物，包括有效劑量的軟骨組織誘生蛋白質，其中該蛋白質包括BMP — 1 3之胺基酸序列，以及BMP — 1 3之突變型及/或變型，其呈現可形成軟骨組織之能力。本發明的組成物可進一步包括額外的蛋白質，如TGF —卢蛋白質超族中額外的成員，如activins *本發明另一卞面是提出藥學組成物，其中舎有治療有效劑量之軟骨組織誘生蛋白質，如BMP -13或VL-1，於藥學上可接受之溶媒或載劑中。這些組成物可用於誘導軟骨組織或其他組織之形成。希望此種組成物可用於關節軟骨之修復，傷口癒合及其他組锇之修復，如皮麻之修復。進一步希望本發明之蛋白質可增加神經元之存活，且因此可用於移植及治療神經元存活降低之狀況。本發明組成物可進一步包括至少一種其他的治療有用作用物，如BMP蛋白質BMP — 1 ，BMP — 2， BMP-3，BMP-4，BMP-5，BMP-6 及 BMP — 7如揭示於美國專利案No. 5，108， 922:5*012，649: 5，116，738: 5 ，106，748; 5，187*076 及 5，141 -905:BMP—8揭示於PCT案W091/ 尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） _ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -12 - 經濟部中央標準局員工消費合作.社印製 422700 at B7五、發明説明（10 ) 18098;BMP-9揭示於PCT案W093/ 00432 : BMP — 10，揭示於 PCT 案W094/ 26893 ;及 BMP— 11，揭示於 PCT 案W094 /2 6 8 9 2 »上述文獻之揭示已列爲此中參考。在本發明一個特殊具體實例中·組成物包括治療有效劑量之軟骨組織誘生蛋白質*如BMP—13或VL—1 |加上治療有效劑量之軟骨組織維持蛋白質，如BMP -9，在此一組成物中，BMP_9蛋白質較好經包膠，或是投予方式使得BMP - 9之軟骨組織維持活性，可與軟骨組織-誘生活性同時開始及繼績接續。如，BMP — 9 組份可包膠在可再吸收之聚合物遞送系統中，如多乳酸，多甘醇酸或其共聚物，多原酸酯，多原碳酸酯•及其他聚合物。適合的聚合物揭示於如EP 0145240中，其掲示已列爲本案參考。另外，BMP — 9可包膠在脂質體中以與BMP — 1 3同時遞送。如，TGF — 蛋白質之脂質體遞送述於美國專利案5 · 206 ，023， 5，270，300 及 5 · 368 · 858，其各別之掲示已列爲此中參考。這些遞送系統均可經修飾以在較後的時間釋出BMP — 9 ，或歷較長時間，使得BMP-9在軟骨細胞及軟骨維持上之有益作用可作用以互補BMP -9在誘生軟骨細胞及軟骨組織上之有益作用》本發明之蛋白質或組成物也可用於處理細胞族群，如胚胎細胞或幹細胞族群*以加強或加豐細胞之生長，分化及/或維持》經處理之細胞族群可用於基因治療應用。 t張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注$項再填寫本頁) -13 - 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 ,4227g?〇 ___B7五、發明説明（11 ) 本發明組成物除了軟骨組織誘生蛋白質，如BMP — 1 3或VL — 1之外，可含有其他的治療有用作用物，包括MP52，甲狀旁腺激素一相關肽（PTHrP);上皮生長因子（EGF)，戡維母細胞生長因子（FGF) ，血小板衍生之生長因子（拭DfGF)，轉形生長因子（ TGF-α及TGF — jS)，及纖維母細胞生長因子一4 (FGF — 4)，甲狀旁腺激素（PTH)，白血病抑制性因子（LIF/HILDA/DIA)，類胰島素生長因子（IGF — 1及IGF — II)。這些作用物部份也可用於本發明之組成物中。例如，包括BMP — 2及BMP - 1 3 —起植入之組成物可造成骨及軟骨組織*此種組成物可用於治療軟骨間接頭之缺陷，及同時在緊鄰解剖位置之骨型式，且可在與骨粘附之軟骨部位用於組織之再生。含有Ρ ΤΗ r Ρ之組成物也可能特別重要，因爲頃發現此因子可用於維持軟骨組織之表型。見共有之專利案N 〇 , _，公告於1996年3月26日，其揭示已列入此中參考。因此，本發明組成物包括P TH r Ρ與本發明軟骨誘生及/或軟骨維持蛋白質之組合》希望本發明組成物也可用於傷口癒合，如皮虜癒合及相關之組織修復。傷口型式包括灼傷、切傷及潰瘍，但並不限於此。（則PCT案WO84/01106，關於傷口癒合及相關組織修復之討論）。預期本發明之蛋白質可與其他相關蛋白質及生長因子配合及/或協同作用·因此本發明進一步的治療方法及組 {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家棉準（CMS ) A4規格（210 X 297公釐）經濟部中央標準局員工消作社印裝 422 ?7〇〇 __Β7 五、發明説明（12 ) 成物包括治療劑量的至少一種本發明之蛋白質，加上治療劑量的至少一種上述的BMP蛋白質。此種組成物可包括分別的BMP分子，或含有不同BMP部份之雜分子。例如，本發明之方法及組成物包括一個BMP- 1 2相關蛋白質亞單位及來自上述蛋白質之一亞單位之由雙硫鍵結之二聚體。因此，本發明包括含有經純化之 BMP — 1 2相關多肽之組成物，其爲一種雜二體其中一個亞單位包括BMP - 1 3之胺基酸序列，一個亞單位包括骨成形蛋白質之胺基酸序列，選自下列包括：BMP -1，BMP-2，BMP-3，BMP-4，BMP-5 * BMP-6，BMP-7，BMP-8，BMP-9， BMP — 1 0及BMP — 1 1 »進一步具體實例可包括二個雙硫鍵結之軟骨組織誘生部份之雜二體，如BMP -12 ，VL — 1 (BMP - 13)或ΜΡ52β 例如，雜二體可包括一個含有BMP—13胺基酸序列之亞單位，及另一個含有BMP-12胺基酸之亞單位》再者，本發明之組成物可混合以其他有益於討論中之缺陷、傷口或組織之其他作用物。此種生理上可接受蛋白質組成物之製備及調和物，在關於pH、等滲度，穩定性等《均在技藝之技術內。治療組成物在獸醫學應用上目前也十分珍貴，因爲TGF -石蛋白質並無種類專一性。除了人類外•特殊的家畜及純種馬，爲本發明組成物可處理之欲求病患。治療方法包括局部，全身性或區域性*由可注射的及 1張尺度適趸中國國家標準（€〜5~)八4規格（210,297公釐)" -15 ' (請先W讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部令央標準局員工消身合作杜印製 1 4?2T00 Α7 B7五、發明説明（w) /或植入物或裝置投予組成物。當投予時，本發明中所使. 用之治療組成物當然呈無熱原之生理可接受之型式《再者，組成物可呈粘稠型式包膠或注射，以遞送至組織受傷部位。局部投藥適合傷口癒合及組織修復用。也可視所需包括在組成物中之蛋白質，除此以外的其他治療有用作用物，可另外或額外地與本發明方法中之組成物同時或相繼投予。此外，本發明組成物可配合使用於目前關於軟骨受傷之療法中，如縫合（如Vicryl縫合或手術內臟之縫合， Et hi con Inc·, Somerville, NJ )，或軟骨同種移植或自身移植，以加強或加速縫合或移植物之癍合潛力《如，縫合，同種移植或自身移植可浸泡於本發明之組成物中· 再行移植。也可將本發明之蛋白質或組成物納入縫合材料中，如經由冷凍乾燥方式8 組成物中可包括適合的基質及/或螫合劑爲載劑。例如，基質可支持組成物或提供表面以供軟骨組織之形成及 /或其他組織之形成。基質可提供蛋白質之緩慢釋出及/ 或供其呈現之適合環境。螫合劑爲有助於易於經由注射或其他方式投藥之物質|或可使蛋白質由施加部位移動減緩載劑之選用基礎有：生物相容性，生物可降解性*機械特性，美容外觀及界面特性。組成物之特性應用可界定適合的調和物。組成物可能的基質可以是可降解且化學界定的<進一步的基質由純蛋白質及細胞外基質組份組成《其他可能的基質爲非可生物降解及化學界定的•較佳的基 ---------在-----r訂 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) Λ4現格（210X29?公釐） 16

422T0U A7 ____B7^_ 五、發明説明（14) 質包括以膠原蛋白爲基礎之物質，包括海線，如 Helistat® ( Integra Life Science, Plainsboro, N. J.)，或呈可注射型式之膠原蛋白，以及螫合劑，其係可生物降解的，如衍自透明質酸者。可生物降解之材料，如嫌維素薄膜，或手術孔篩也可充作基質。此種物質可縫合至受損部.位，或圍著軟骨包紮。另一類較佳的載劑爲聚合基質，包括多（乳酸），多 (乙醇酸）之聚合物，及乳酸及乙醇酸之共聚物。這些基質可呈海線型式，或多孔粒子型式，且可包括有螫合劑。適合的聚合物基質如W09 3/00050中所述，此案已列爲本案之參考。經濟部中央標率局員工消着合作社印袋 (請先聞讀背面之注意事項再填寫冬頁} 較佳的螫合劑族包括：血疾，纖維蛋白及/或纖維質物質如烷基纖維素（包括羥烷基纖維素）包括甲基纖維素，乙基纖維素，羥乙基織維素，羥丙基織維素，羥丙基-甲基纖維素及羧甲基纖維素，最佳者爲羧甲基纖維素之陽 .離子鹽類（CMC )。其他較佳的螫合劑包括玻璃質酸，藻酸鈉，聚（乙二醇），聚氧化乙烯氧，羧乙烯聚合物及聚（乙烯醇）。此中所用的螫合劑用量爲按總調和物重量計之0· 5 — 2〇wt%，較好是l-l〇wt%，其代表避免蛋白質爲聚合物基質解吸附之必要置，且可提供組成物適合之操作，又因不放太多故先軀細胞不致浸潤基質 ’因而提供蛋白質幫助先軀細胞活性之機會》用於實行主題案之額外的視所需組份包括如低溫保護劑’如甘露醇，蔗糖，乳糖，葡萄糖或甘胺酸（保護蛋白表紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） 17 - 422700 經濟部中央榇準局員工消费合作社印袈 A 7 B7 五、發明説明（15) 質在冷凍乾燥中免於降解），抗菌保藏劑如對羥胺基苯甲酸甲及丙酯，及笮醇：抗氧化劑如EDTA，檸檬酸鹽及 BHT (丁基化之羥基甲苯）：及界面活性劑如聚（山梨醇）及聚（氧乙烯類）；等。如上述，本發明的組成物可應用於治療各樣軟骨缺陷之方法中，如在軟骨受傷區域再生軟骨組織，有助於軟骨組織撕裂的修復，及其他各種型式之組锇缺陷或傷口 *這些方法依據本發明包括對需要此種軟骨組锇或其他組織修復之病人投予組成物，其中含有有效劑量之軟骨組織誘生蛋白質，如WO 9 5 / 1 6 0 3 5中所述•其揭示已列爲此中參考》這些方法也包括投予軟骨組織誘生蛋白質，並配合至少一種上述的BMP蛋白質》在另一具體實例中，方法包括投予雜二體蛋白質*其中一種單體爲軟骨組織誘生多肽，如BMP — 1 2，VL 一 1 (BMP — 13)或MP52，且第二種單體是 TGF_jS生長因子超族中一成員*此外，這些方法也包括投予軟骨組織誘生蛋白質，加上其他因子，包括 PTHrP - EGF，FGF，TGF-a，TGF —召及 I G F - 因此，本發明進一步方面是可修復軟骨組織，修復軟骨以及治療關節炎及其他和關節炎缺陷有關狀況之治療方法及組成物a此種組成物包括治療有效劑量的一種以上的軟骨組織誘生蛋白質，如BMP — 1 3，並摻合藥學上可接受之溶媒*載劑或基質* ΐϋ適七中國國家標準（CNS > Λ4規格Γ2Η)Χ 297公釐)~" -18 * H. -I » I «n I— In n « —I—I 1 n n-------I X (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)' 經濟部中央標隼局員工消作杜印裝 4227 QO Λ7 ___B7五、發明説明（丨6) 劑量療程由醫師考慮各種會影麥組成物作用之因子而. 決定，如欲形成之軟骨組織量，受傷之軟骨組織部位，受傷的軟骨組織狀況，傷口大小，受傷組織之型式，病人的年齡，性別及飲食，任何感染之嚴重程度，投藥時間及其他臨床因素。劑量隨重組中所用基質之型式，及組成物中額外蛋白質之型式而變化。添加其他的已知生長因子，如 IGF - I (類胰島素生長因子I)，至最終組成物中也會影響劑量。一般而言，用於誘生軟骨組織形成之重組體 BMP蛋白質用量在約1至約1 〇〇微克，應用於約3毫米X 3毫米大小之缺陷上•一般而言，用於誘使軟骨組锇維持之重組體Β Μ P蛋白質用量爲每毫升溶液約1至約 1 0 0 0毫微克β 由定期評估軟骨組織形成，或軟骨組織生長及/或修復，可追踪過程。過程之追踪可利用技藝中已知之方法，如此一射線，關節內視鏡，組織形態比較決定及四環素標記。以下實例說明本發明之實務，計有收穫及鑑定人類軟骨組織誘生蛋白質，及應用彼等回收其他的軟骨組織誘生蛋白質，獲得人類蛋白質，經由重組體手支術表現蛋白質，及證明本發明組成物在活體內模式中形成軟骨組織之能力。雖然實例中以ΒΜΡ — 1 3爲軟骨一誘生蛋白質來證明本發明，在技藝技術內以些微的變化’利用有誘生軟骨組織形成作用之其他蛋白質仍可得到相同結果，特別是 BMP.— 12或ΜΡ52。雖然實例中以BMP — 2爲成 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央標隼局員工消作杜印製 A 7 ____B7 _ 五、發明説明（) 骨蛋白質來證明本發明，在技藝技術內以些微的變化，利用有誘生骨細胞及骨組織形成作用之其他蛋白質仍可得到相同結果，特別是BMP-4或BMP — 7 β 實例1 :在胚胎發生中定位BMP — 13mRNA 使用BMP - 1 3特異的核糖核苷酸探針來定位老鼠胚胎發生中BMP—13mRNA轉錄子之表現。與成骨蛋白質BMP — 2比較，BMP — 1 3mRNA呈現更限制之表現型式。在四肢的發展中，BMP - 13轉錄子僅見於發展中關節軟骨表面間區域，且並不在BMP - 2受體明顯存在之軟骨凝集處，或是BMP- 2及BMP — 4 mRNA轉錄子很置富之指間間葉。實例2 :利用Β Μ P — 1 3誘生軟骨測試ΒΜΡ—13在由Ε13老鼠肢芽衍生之細胞株上之作用。細胞在含有DME且添加1%胚牛血清之培養基中生長至呈融合狀。細胞以由少至1毫微克/毫升多至約5. ΟΧΙΟ3毫微克/毫升之變化量的BMP—13 處理*以至少約0.1毫微克/毫升之劑量即可見到作用。在以BMP — 1 3處理1 0天後，類軟骨胚細胞表型加上富含蛋白多醣之基質聚稹在細胞四週β *BMP — 1 3 處理之肢芽細胞，其mR ΝΑ以北方分析法顯示出Π型膠原蛋白及蛋白多醣核心蛋白質二者之表現，但非骨鈣素β 已知Π型膠原蛋白及蛋白多醣核心蛋白質爲軟骨胚細胞或 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（2!0Χ297公釐） -20 - 422/00 經濟部t央標準局員工消作社印製 .4 2 ? n iA7 " B7五、發明説明（18 ) 軟骨組織之標幟》至於對照組·以已知之成骨蛋白質BMP - 2類似地處理，可造成骨骼表型之表現，其特徵爲骨鈣素，鹸性碟酸酶及I型膠原蛋白之產製。骨鈣素，鹼性磷酸酶及I型膠原蛋白爲骨胚細胞或骨組織已知之標幟。這些觀察組合四肢發展中BMP—13之定位可支持以下結論，即BMP - 1 3涉及於軟骨組織之誘生，且特別是在發展中之骨骼關節表面處發生之軟骨形成上之誘生〇實例3 ··北方吸漬分析利用北方吸漬分析，BMP_ 1 3及其他蛋白質測試其在各種細胞株上之作用。適合的細胞株包括衍生自 E 1 3老鼠肢芽之細胞株。在以BMP — 1 3或其他蛋白質處理1 0天後，檢査細胞表型（組織學方式）以顯示組織之分化。此外’可針對各種標幟進行BMP— 1 3或其他蛋白質處理細胞mRN A之北方吸漬分析’包括一種以上針對骨胳，軟骨及/或肌腱/韌帶之下列標幟’如表1 所示：本紙乐尺度適用t國國家標準（CNS ) Α4規格（21UX 297公釐） f碕先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 士衣訂 ί 4227Λ〇 Α7 Β7 五、發明説明（19 ) 檁幟骨鈣素鹼性磷酸酶蛋白多醣核心蛋白質膠原蛋白I型膠原蛋白Π型 Decor i η 彈性蛋白表 I 骨骼 + 十十/ -十 + / -+ + / - 軟骨肌腱/韌帶 + + + + + + + + ----------A-----.丨if (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貝工消Ϊ0作社印製 1 一早期見到的標幟，在成熟的骨組織型式中並未見 2 —依肌腱位置而定之標幟；最強處在骨之界面 3 -在低水平見到之標幟實例4:實物厚度之關節軟骨修復模式使用成兔大腿骨-膝蓋骨關節中之實物厚度之關節軟骨缺陷模式，以評估BMP s影響軟骨及骨修復之能力。將成年的紐西蘭白兔麻醉及做無菌手術之準備· 3 X 3毫米之缺陷穿越關節軟骨並達底層之軟骨下骨，纘入膝蓋關節之膝蓋骨溝中》此缺陷可以是空的（空的對照組），充滿膠原蛋白海綿（海綿對照組），或有膠原蛋白海綿並浸入r hBMP-1 3蛋白質，另一BMP蛋白質，或 BMP — 1 3與其他BMPs之組合（實驗組）。此切口表紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4规格（2丨0X297公釐） -22 - 經濟部中央梯準局員工消"合作社印製 422 Ζϋ ___ Β7___五、發明説明（20) 閉合，令動物在其櫊內自由移動4週* 4週後，動物像人般安樂死，並針對組織結構，修復組織之量及質評估關節軟骨/軟骨下骨缺陷。在一個寊驗中，缺陷中充滿（1) 10微克的 rhBMP-13 · (2) 5 微克的 rhBMP — 2 ;或 (3)2. 5微克的rhBMP_2加5微克rhBMP —13混合於膠原蛋白海綿〔rhBMP — 2/13〕* 手術 4 週後 * ointSurg·, 7 6 _A : 4 ( 1 9 9 4 )修飾之等級系統組織學上評估修復之組織。由總組織學記分可證明所有經 BMP處理組和空白組或膠原蛋白對照組間之顯著差異* 就形態學上而言，由r hBMP— 1 3或rhBMP — 2 /1 3處理所得之修復的軟骨，和以r hBMP — 2單獨處理的不同·在含有rhBMP_13缺陷中，30%修復軟骨中之軟骨細胞組織結構和正常的玻璃質關節軟骨幅射環構造相似，此表型並不見於以r h BMP - 2處理4 週後。以r hBMP — 2單獨處理之缺陷可修復纖維軟骨而非類玻璃質軟骨a然而，此軟骨係一致地缺乏在空的或膠原蛋白對照組中常見之中空及裂縫。此經改良之修復可反映出曝於r h BMP — 2之缺陷中快速且再生的軟骨下骨骼癒合。和空白的或膠原蛋白對照組，或以r h BMP 一 1 3單獨處理之缺陷比較下*以r h BMP — 2及 r hBMP — 2/1 3處理之缺陷（分別爲8 8%及9 0 %之置換）軟骨下骨骼之修復顯著地改善（p < 〇 . 〇 5 &張尺度適用卞國國家標準（^奶）44現格（2(0'乂297公釐）_ ' -23 - A7 {請先閲讀背面之注意事項再填寫本寅) Α7 Β7 經濟部中央標隼局員工消费合作.社印製五、發明説明（u) )(前者分別爲5 3%，5 5%及5 1%置換）。這些結果證明r hBMP — 2及r hBMP - 1 3對於實物厚度關節軟骨缺陷早期修復上之差別作用* r hBMP — 2對軟骨修復上之有益作用似乎源自其可快速且實質地再生軟骨下骨接骨板之能力，造成軟骨再生之穩定位置，而 r hBMP — 1 3之有益作用更直接與以小的成骨作用修復關節軟骨直接有關’且造成軟骨在細胞組織上更類似正常的玻璃質關節軟骨。此二蛋白質之組合益處造成有大比例修復組織之一致的軟骨下骨修復，證明類玻瑰質軟骨之表型。實例5:以BMPs調控基質之合成自牛腕關節中刮下關節軟骨，並以0. 2%膠原蛋白酶水解以釋出軟骨細胞。軟骨細胞維持在DME中•其中加有5 0微克/毫升抗壞血酸，6mM穀胺酸，抗生素，並添加10%FCS，共歷21天。最初的細胞密度爲 0. 12 5x1 0β細胞/毫升》在培養物中加入細胞動素，其濃度先前已示出可誘生幾乎最大的反映。在1、2 、6、8、10、12、14及21天培養物中以分光光度分析法偵測總DNA及蛋白多醣含量。在14天樣品中進行細胞層之組織學分析，且波片利用Sofranin- 〇染色以測出蛋白多醣含量。結果：在培養14天後，rhBMP - 2，rhBMP — (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4現格（210X297公釐）一 24 - 經濟部中央標準扃舅工消作社印製 __4g^7〇〇 Β7_五、發明説明（22 ) 9及TGF - θ 1刺激蛋白多醣合成顯著高於對照組水平 (ρ < 0 . 05) ^進一步，在21天的培養物中， rhBMP — 9的處理較對照組，rhBMP — 2或 TGF - /9 1處理在增加蛋白多醣水平上更爲顯著。由 DNA含量偵測知，rhBMP — 9及TGF -召1與空白對照培養物比較下前二者可更顯著地增加細胞數之增加速率（P < 0 . 0 5 ) β就組織學而言，由Safranin- 0 染色知空白培養物顯示出最少的細胞外基質合成。經 TG F -沒1處理之培養物含有較多的細胞，但其與軟骨細胞在形態上並不相似。由Sufranin-Ο染色證明經 r h BMP — 9處理之培養物其蛋白多醣之產製有顯著的增加，rhBMP - 2處理增加細胞亞族群之蛋白多醣合成。 r hBMP — 2及r hBMP — 9可刺激培養物蛋白多醣合成之觀察顯示，這些因素在成年關節軟骨代謝上扮演重要角色*這些細胞動素刺激關節軟骨之基質合成及維持軟骨細胞表型之能力可推測出重要的應用，包括軟骨缺陷之修復及骨關節炎之預防/舒緩，軟骨細胞表型。這些研究中建議，這些BMP s特別可用於在r hBMP — 1 3之配合下之軟骨分化•生長，維持及修復，後者已示出有造成軟骨細胞分化之能力。實例6 :由rhBMP_9及rhBMP — 2刺激關節軟骨代謝 1張尺度適用中國國家橾準（（：阳〉八4規格（210'/297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -25 - 經濟部中央標準局員工消^作社印製；422700 A7 ____ Β7五、發明説明（23) 在7 - 1 0天大經安樂死後之牛中立即自掌骨及指骨關節中切出5 X 1毫米直徑之軟骨盤。經三天平衡後，活組織移植物培育在無血清且TGF —，rhBMP-2或r h BMP - 9漸增劑量之培養基中。每天更換培養基及細胞動素》經培養三天後，加入1 0微居里之 33 S04 /毫升達8小時•回收活組織移植物，在組織水解物管柱層析後定量出經放射標記之蛋白多醣*新合成之蛋白多醣常規至移植物之DNA含量。也評估累積在軟骨基質中之總蛋白多醣《移植物在有或無細胞動素下培育 1 4天，再評估總蛋白多醣及DNA含量。蛋白多醣含量利用分光光度分析法評估，而D NA含量利用Hoechst 染料結合分析法評估。所有結果爲六次測試之平均值。結果：以10、100及1000毫微克rhBMP - 9 /毫升處理之活組織移植物顯示在培養3天後蛋白多醣合成有顯著的增加。100或1000毫微克的rhBMP 一 2/毫升也會增加蛋白多醣合成*相反的，以TGF — 占1處理之活組織移植物，其蛋白多醣合成並未高出未處理水平》事實上，100毫微克/毫升TGF — /31可顯著地抑制蛋白多醣合成在未處理組下。經r hBMP — 9 處理之活組織移植物之總蛋白多醣含量，在1 4天培養後較未處理之活組織移植物增加1. 45_2. 1倍，最高增加量之劑量在1 0毫微克/毫升。在所有劑量下•含量均顯著高於未處理之活組織移植物（ρ<0· 05)。 t張尺度適用t國國家標羋（CNS ) Α4規格（210X297公釐) 一 -26 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本寅) A7 422703 _ B7 五 '發明説明（24) rhBMP- 2增加之總蛋白多醣含量爲未處理組之 1. 4 6-1. 91倍，最高增加量之劑量在1 000毫 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 微克/毫升。在1 0至1 0 〇 0毫微克/毫升下，含量均顯著高於未處理組（P<〇. 05) »在培養期間， TGF — θ 1處理組之蛋白多醣含量並未變化。 r hBMP — 9及r hBMP — 2處理組之DNA含量增加方式和蛋白多醣含量平行，但略不顯著》經濟部令央標隼局員工消IMP作社印製上述結果證明，r hBMP-9及r hBMP - 2可增加牛關節軟骨活組織移植物之蛋白多醣合成速率及總基質蛋白多醣聚稹•此與抑制蛋白多醣合成之TGF-召1 作用相反。r hBMP-9及rhBMP — 2處理組之 D N A含量也有所增加*這些發現推測細胞數目及每細胞之合成速率二者之增加可歸因於蛋白多醣含量之增加。在所有實驗中，在較低劑量下rhBMP-9作用顯著於 rhBMP — 2 »這些結果證明，rhBMP — 9及 rhBMP — 2、特別是rhBMP — 9 ，具有在已分化之軟骨細胞中增加DNA合成之能力，且因此可能是軟骨細胞或軟骨組織維持之有效的誘生劑。實例9 : rhBMP — 9對關節軟骨活組織移植物中凝集多醣基因表現及合成之誘導自剛殺死之牛掌骨及指骨間關節採取關節軟骨，並維持在DMEM添加有1 一穀胺醯胺，抗壞血酸，及〇. 1 %B SA之活組織移植物培養基中。令軟骨平衡4 8小時 t張尺度適用中國國家標準（CNS ) Ad現格（2[0x297公釐) 一 -27 - A7 ____B7_ 五 '發明説明（25 ) ’再決定劑量-依賴的反應，再培養活組織移植物，重覆三次，並有重組體人類BMP — 9 (rhBMP — 9)( 〇 ^ 1 ’ 10，100及1000毫微克/毫升）或IL _1 (10毫微克/毫升）存在或不存在下歷5天。爲決經濟部中央橾準局員工消身合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 定時間依賴之反應，軟骨移植物在1 〇〇〇毫微克/毫升存在下培養3、5及7天•關於mRNA之決定，對軟骨移植物稱重’再置於〇. 5奄升之Prone ga總R N A分離系統變性緩衝溶液中〔Chont czynski et al.，Ana+1. Biochem·， 162 : 156 (1987)〕，分離 RNA ，再純化（RNeasy RNA分離套組），並利用oligo-dT 弓i子進行反轉錄作用〔Re et al., Anal. Biochem. 225 :357 (1995〕〕。使用非競爭性定量 PCR來決定凝集多醣之mRNA水平〔Id.〕。所使用之引子經設計可擴大插入子-古塔之區域。以瓊脂糖凝膠電泳及溴化乙錠染色下分析P CR產物，再由影像分析決定帶之強度。利用標準品定量，其中包括已知套數之含特異P C R產物爲嵌入子之質體。以每微克總RNA之套數來表示結果。至於35S —硫酸鹽納入硏究，將5天之活組織移植物追加10微居里3SS_硫酸鹽歷12小時。軟骨再以木瓜蛋白酶水解，並決定納入葡糖胺基多醣鏈內之35S —硫酸鹽》以AN0VA及Dunnens統計分析。結果:軟骨活組織移植物對BMP-9之反應是和劑量有關的。對照組移植物每微克RNA有2. 8土0. 4x (張尺度適用中國國家樣準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -28 ** 422700 ^ ° A7 B7 經濟部中央標準局員工消#合作社印製五、發明説明（26) 1 08套數之凝集多醣mRNA水平。BMP — 9濃度增加時，在凝集多醣mRN A水平上有和劑量有關之增加。在1及1 0毫微克/毫升下測知凝集多醣mRNA水平並無變化，但在1 0 0毫微克/毫升及1 〇〇〇毫微克/毫升BMP -9下，凝集多醣mRNA水平有顯著的刺激（ p < 0 . 05)。在100毫微克/毫升下，凝集多醣 mRNA水平有1. 9倍的增加，在1000毫微克/毫升下和對照組水平比較下則有6. 5倍之增加。時間曲線硏究顯示以1 0 0 0毫微克/毫升可在三天培育內達到最大的刺激，並維持7天。在BMP — 9存在下3SS —硫酸鹽納入也增加，且在1 0 0毫微克/毫升下35S —硫酸鹽之納入增加2. 7倍》相反的，在10毫微克/毫升 1 L - 1存在下培養活組锇移植物，頃發現會劇烈地抑制凝集多醣mRNA水平，至對照組1 〇%以下（p> 0. 0 5) °35S -硫酸鹽納入也減少，到對照組納入之 2 7 % * 凝集多醣（aggre can )爲關節軟骨細胞外基質之主要組份，且由軟骨細胞所合成。這些結果證明，BMP -9可刺激軟骨中凝集多醣之基因表現及合成。因此在軟骨-特異之基質組份合成剌激十分重要之軟骨中，bmp —9對軟骨之修復及維持是有效的* (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)· 本紙張尺度適珂中國國家標準（CNS > A4規格（210'x297公釐）

Claims

•煩請委貝明示， .f 1 ^22 A8 B8 C8 D8 修正 87. 7.3t 表年* 0 補充1 lii是否變更原實質内容經濟部中央標準局員工消費合作社印製、申請專利範圍附件一 A :第85 106281號專利申請案中文申請專利範圍修正本民國8 7年7月修正 1 .—種可用於誘生軟骨組織形成及維持之藥學組成物，其包括： (a ) —種誘使軟骨組織形成之蛋白質，該蛋白質係選自 BMP~1 3 ' BMP-1 2 及 MP52 ;及 (b ) —種誘使軟骨組織維持之蛋白質，該蛋白質係選自3从？-9、3旭？ — 2、8]^?-4及8河？一7 2.如申請專利範圍第1項之組成物，其係用於誘使軟骨細胞或軟骨組織形成及/或維持。 3 .如申請專利範圍第1項之組成物，其係用於治療關節炎或其他軟骨組織缺陷。 4 .如申請專利範圍第1項之組成物，其係用於治療關節軟骨缺陷或傷害。 5.如申請專利範圍第1項之組成物，其進一步含有成骨蛋白質。 6 .如申請專利範圍第5項之組成物，其中該成骨蛋白質係選自BMP — 2 ，BMP — 4及BMP — 7。 7.如申請專利範圍第1項之組成物，其中誘使軟骨組織形成之蛋白質係選自BMP — 1 3，BMP — 1 2及 Μ P 5 2 。本紙浪尺度速用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X2打公釐） (請先閲讀背面之注意^項再填寫本頁) Iη -* ^'-' 1 A8 B8 C8 D8 經濟部中央標準局員工消費合作社印製六、申請專利範圍 8 ·如申請專利範圍第7項之組成物，其中誘使軟骨組織維持之蛋白質爲BMP — 9 ^ 9 .如申請專利範圍第8項之組成物，其進一步包括成骨蛋白質。 1 0 .如申請專利範圔第9項之組成物，其中該成骨蛋白質係選自BMP — 2，BMP-4及BMP — 7。 1 1 .如申請專利範圍第1 〇項之組成物，其中誘使軟骨組織形成之蛋白質是BMP - 13» 1 2 ·如申請專利範圍第1 〇項之組成物，其中誘使軟骨組織形成之蛋白質是BMP — 1 2。 1 3 .如申請專利範圍第1 〇項之組成物，其中誘使軟骨組織形成之蛋白質是MP 5 2 » 14·如申請專利範圍第項之組成物，其中該成骨蛋白質是BMP — 2 » 1 5 ·如申請專利範圍第1 〇項之組成物，其中該成骨蛋白質是BMP — 4。 1 6 .如申請專利範圍第i 〇項之組成物，其中該成骨蛋白質是BMP — 7。 17. —種可有效形成及維持軟骨細胞及軟骨組織之藥學組成物，其包括： (a) BMP—13蛋白質；及 (b) BMP-9蛋白質。 18. —種可有效形成及維持軟骨組織及相連之軟骨下骨之藥學組成物，其包括： ϋ3 (請先閱讀背面之注意事項再填窝本頁) T 本纸張尺度逋用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -2 - 切7〇〇 A8 Β8 C8 D8 申請專利範圍 BMP— 13蛋白質骨軟之 .1彐1— 違相及織組骨軟及持：及 ;。維質 .，。質質及：白質質白白成括蛋白白蛋蛋形包 3 蛋蛋 9 2 效其 1 9 7 - | 有， | | 一 p P 可物 p p P MM種成 MMM B B 一組 B B B VJ. Nly .«XIX Z-N b c 9 藥 a b c c c 1 之 c c c 骨下 u I "裝訂 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局J工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家摞準（CNS ) A4规格（21〇><297公釐） 3

85年 5月27日 85106281 ^ik ^S/(8 襴由本局填註） iii 二A:第51062 81號專利申請案中客說明書修正頁民國87年7月呈 A4 C4 丨修正補充^ .31 422700 是否變更原實質内容經濟部中央標準局員工消費合作杜印製發明新型名稱發明創作/ 三、申請人中英姓國壽I專利説明書文文名籍住、居所

國住、居所 (事務所）

誘生軟骨組織形成及維持的藥學組成物 Pharmaceutical compositions for inducing cartilaginous tissue formation and maintenance ⑴蓋利♦哈待斯萊Hattersley, Gary <2i 奈爾 * 武吳曼 Wolfman, Neil M* (3)伊利莎怡· M利斯 Morris, Elisabeth A, (1)英國 0美國 (1)美國麻州*康橋市•羅傑斯街十猇美國裝 10 Rogers Street, H303, Cambridge, Massachusetts 02l4〇j USA (2) 美國麻州*多佛·羅林巷三十號 30 Rolling Lane, Dover, Massachusetts 02030, USA (3) 美國麻州·南荷洛•蕭斯維爾路一六t號 167 Southville Road, Southhoro, Massachusetts 01772, USA 訂 (1)遣傳學學會股份有限公司 Genetics Institute, Inc, (1)美國 ⑴美國麻州*釗橋•劍橋公園大道八十七號 87 Carabridgepark Drive, Cambridge,ΜΑ 02140 USA ⑴湯瑪斯•戴思羅席爾DesRosier，Thomas J. 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4说格（2丨ΟΧ2ί>7公釐〉 •煩請委貝明示， .f 1 ^22 A8 B8 C8 D8 修正 87. 7.3t 表年* 0 補充1 lii是否變更原實質内容經濟部中央標準局員工消費合作社印製、申請專利範圍附件一 A :第85 106281號專利申請案中文申請專利範圍修正本民國8 7年7月修正 1 .—種可用於誘生軟骨組織形成及維持之藥學組成物，其包括： (a ) —種誘使軟骨組織形成之蛋白質，該蛋白質係選自 BMP~1 3 ' BMP-1 2 及 MP52 ;及 (b ) —種誘使軟骨組織維持之蛋白質，該蛋白質係選自3从？-9、3旭？ — 2、8]^?-4及8河？一7 2.如申請專利範圍第1項之組成物，其係用於誘使軟骨細胞或軟骨組織形成及/或維持。 3 .如申請專利範圍第1項之組成物，其係用於治療關節炎或其他軟骨組織缺陷。 4 .如申請專利範圍第1項之組成物，其係用於治療關節軟骨缺陷或傷害。 5.如申請專利範圍第1項之組成物，其進一步含有成骨蛋白質。 6 .如申請專利範圍第5項之組成物，其中該成骨蛋白質係選自BMP — 2 ，BMP — 4及BMP — 7。 7.如申請專利範圍第1項之組成物，其中誘使軟骨組織形成之蛋白質係選自BMP — 1 3，BMP — 1 2及 Μ P 5 2 。本紙浪尺度速用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X2打公釐） (請先閲讀背面之注意^項再填寫本頁) Iη -* ^'-' 1