TW202542179A - 經由異肽鍵形成之新穎多肽的製作方法 - Google Patents

Abstract

提供包含異肽鍵之新穎多肽。在一態樣中，提供一種多肽，其係在第一及第二多肽鏈間包含異肽鍵之多肽，並包含a）離胺酸、b）麩醯胺酸、麩胺酸、天冬醯胺酸或天冬胺酸以及c）麩胺酸或天冬胺酸，於此，在前述多肽的立體結構中之前述第一及第二多肽鏈互相鄰近之邊界區中，前述第一及第二多肽鏈各別包含a）及b）。

Description

經由異肽鍵形成之新穎多肽的製作方法

本公開提供包含異肽鍵之多肽及製作其之方法。

蛋白質亦有具有多肽鏈中的醯胺鍵作為共價鍵並具有半胱胺酸側鏈間的雙硫鍵之情形。多肽鏈間相互作用對於蛋白質形成高次結構（higher order structure）是重要的，但尤其是由共價鍵所致之相互作用會將多肽鏈彼此強力連結。因此，進一步導入共價鍵能有用於蛋白質的操作。

作為蛋白質中的共價鍵，亦已知被稱為異肽鍵之鍵結，但僅在釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的Spy0128蛋白質等有限之蛋白質中發現（非專利文獻1）。[先行技術文獻][非專利文獻]

非專利文獻1：J Am Chem Soc. 2011 Jan 26；133（3）：478－85.

本發明人等探討在多肽鏈間形成異肽鍵之多肽設計，製作包含異肽鍵之新穎多肽。基於此，本公開提供包含異肽鍵之多肽及製作其之方法。

因此，本發明提供以下。（項目1）一種方法，其係製作修飾多肽之方法，所述修飾多肽在第一及第二多肽鏈間包含以下的式所表示之肽間連結：[化1]（式中，虛線各別表示第一或第二多肽鏈），所述方法包含：建構包含前述第一及第二多肽鏈之中間體A的立體結構之步驟；特定在前述立體結構中之前述第一及第二多肽鏈互相鄰近之邊界區存在之胺基酸序列之步驟；使前述中間體A變異之步驟，其藉由將a）離胺酸、b）麩醯胺酸、麩胺酸、天冬醯胺酸或天冬胺酸以及c）麩胺酸或天冬胺酸之中的至少1個殘基導入前述中間體A而製備中間體B，於此，前述中間體B包含a）、b）及c），前述中間體B中之前述第一及第二多肽鏈各別在前述邊界區中包含a）及b）；以及藉由在前述中間體B中形成前述肽間連結而獲得前述修飾多肽之步驟。（項目2）如前述項目中任一方法，其中，基於前述邊界區內存在之前述第一多肽鏈的第一胺基酸殘基與前述第二多肽鏈的第二胺基酸殘基之間的距離以及前述第一及第二胺基酸殘基的種類而導入a）及／或b）。（項目3）如前述項目中任一方法，其中，b）為天冬醯胺酸或天冬胺酸，在前述中間體A的立體結構中，將α碳間的距離為約7～9Å之2個胺基酸位置特定作為a）及b）的胺基酸位置。（項目4）如前述項目中任一方法，其中，b）為麩醯胺酸或麩胺酸，在前述中間體A的立體結構中，將α碳間的距離為約8.5～10Å之2個胺基酸位置特定作為a）及b）的胺基酸位置。（項目5）如前述項目中任一方法，其中，在前述中間體A的立體結構中，將側鏈被配置於前述立體結構的內部之2個胺基酸的位置特定作為a）及b）的胺基酸位置。（項目6）如前述項目中任一方法，其中，更包含：建構前述中間體B的立體結構之步驟。（項目7）如前述項目中任一方法，其中，在前述中間體B的立體結構中，a）的殘基的ζ位的氮原子與c）的殘基的側鏈中的羧基的氧原子之間的距離為約2～5Å。（項目8）如前述項目中任一方法，其中，在前述中間體B的立體結構中，b）的殘基的側鏈中的羧基或醯胺基的氧原子與c）的殘基的側鏈中的羧基的氧原子之間的距離為約2～5Å。（項目9）如前述項目中任一方法，其中，在前述中間體B的立體結構中，a）的殘基的ζ位的氮原子與b）的殘基的側鏈中的羧基或醯胺基的氧原子之間的距離為約2～5Å。（項目10）如前述項目中任一方法，其中，前述第一多肽鏈包含c）。（項目11）如前述項目中任一方法，其中，更包含：判定前述邊界區的疏水性之步驟。（項目12）如前述項目中任一方法，其中，更包含：將在前述邊界區存在之胺基酸序列中之親水性胺基酸殘基進行刪除之變異、將胺基酸殘基取代成疏水性胺基酸殘基之變異或將疏水性胺基酸殘基進行插入之步驟。（項目13）如前述項目中任一方法，其中，在前述中間體B的立體結構中，在a）的殘基的ζ位的氮原子起12Å以內之處導入具有α碳之疏水性胺基酸。（項目14）如前述項目中任一方法，其中，以填埋前述邊界區的空間之方式導入具有不同體積的側鏈之疏水性胺基酸。（項目15）如前述項目中任一方法，其中，前述第一及第二多肽鏈各別被包含在不同分子中。（項目16）如前述項目中任一方法，其中，更包含：在前述中間體A中導入變異之步驟，所述變異係使在前述第一多肽鏈與前述第二多肽鏈之間形成雙硫鍵之2個半胱胺酸殘基之中的至少一者缺失或取代成其他胺基酸。（項目17）如項目15所記載之方法，其中，進一步製作二級修飾多肽，所述二級修飾多肽在前述修飾多肽與第三多肽鏈之間包含以下的式所表示之肽間連結，所述第三多肽鏈被包含在與前述修飾多肽不同的分子中：[化2]（式中，虛線表示往多肽骨架的鍵結），所述方法包含：建構包含前述修飾多肽及前述第三多肽鏈之二級中間體A的立體結構之步驟；特定在前述立體結構中之前述修飾多肽及前述第三多肽鏈互相鄰近之邊界區存在之胺基酸序列之步驟；使前述二級中間體A變異之步驟，其藉由將a）離胺酸、b）麩醯胺酸、麩胺酸、天冬醯胺酸或天冬胺酸以及c）麩胺酸或天冬胺酸之中的至少1個殘基導入前述二級中間體A而製備二級中間體B，於此，前述二級中間體B包含a）、b）及c），前述二級中間體B中之前述修飾多肽及前述第三多肽鏈各別在前述邊界區中包含a）及b）；以及藉由在前述二級中間體B中形成前述肽間連結而獲得前述二級修飾多肽之步驟。（項目18）一種多肽，其係在第一及第二多肽鏈間包含以下的式所表示之肽間連結之多肽：[化3]（式中，虛線表示往多肽骨架的鍵結），所述多肽包含：a）離胺酸、b）麩醯胺酸、麩胺酸、天冬醯胺酸或天冬胺酸以及c）麩胺酸或天冬胺酸，於此，在前述多肽的立體結構中之前述第一及第二多肽鏈互相鄰近之邊界區中，前述第一及第二多肽鏈各別包含a）及b）。（項目19）如前述項目中任一多肽，其為抗體或T細胞受體（TCR）。（項目20）如前述項目中任一多肽，其中，前述肽間連結存在於恆定區。（項目21）如前述項目中任一多肽，其包含抗體的重鏈恆定區與輕鏈恆定區之間的肽間連結。（項目22）如前述項目中任一多肽，其中，前述第一及第二多肽鏈存在於互相不同的分子上。

（項目23）一種在EU編號（EU numbering）中，重鏈183位的胺基酸被取代成天冬醯胺酸之CH1區或者編碼該區之核酸、包含前述CH1區之重鏈恆定區或者編碼該區之核酸、或包含前述CH1區之重鏈或者編碼該重鏈之核酸。（項目24）一種在EU編號中，輕鏈133位的胺基酸被取代成麩胺酸且輕鏈176位的胺基酸被取代成離胺酸之CL區或者編碼該區之核酸、包含前述CL區之輕鏈恆定區或者編碼該區之核酸、或包含前述CL區之輕鏈或者編碼該輕鏈之核酸。（項目25）一種抗體，其包含如項目23所記載之重鏈與如項目24所記載之輕鏈。（項目26）一種Fab片段、Fab’片段或F（ab’）₂片段，其包含如項目23所記載之CH1區與如項目24所記載之CL區。（項目27）一種嵌合抗原受體，其具有：包含如項目23所記載之CH1區與如項目24所記載之CL區之Fab片段、鉸鏈區（hinge region）、跨膜區域（transmembrane domain）及細胞內區域（intracellular domain）。（項目28）一種細胞，其表現如項目27所記載之嵌合抗原受體。

在本發明中，又提供使異肽鍵在抗體的CH1區與CL區間形成之技術。令人驚訝的是，此異肽鍵可藉由CH1區與CL區的胺基酸取代變異而在抗體產生細胞中自發地形成。抗體即使藉由異肽鍵亦不會實質地抑制往其抗原的結合特性，能維持其功能性。因此，可利用本發明的具有異肽鍵之抗體取代現有抗體的所有應用。異肽鍵因使Fab片段或Fab’片段穩定化，故亦可利用已以異肽鍵穩定化之Fab片段或Fab’片段取代僅scFv可做到的各種應用。

在本發明中，上述的1個或複數特徵除了已明確揭示的組合，還能被進一步組合提供。本發明的更進一步的實施形態及優點，只要因應需要閱讀以下的詳細說明並理解，即可被本發明所屬技術領域中具有通常知識者認識。

本公開提供包含異肽鍵之新穎多肽。本公開的包含異肽鍵之多肽具有已提升之穩定性、高純度地生成目標物質等之中的1個以上的有用性。本發明能適用於抗體例如多特異性抗體（尤其雙特異性或三特異性抗體）等具有複雜結構之重組抗體的產生等廣泛的多肽的製作。

[用以實施發明的形態]以下，一邊揭示本公開的最佳形態一邊說明本公開。本說明書的整體中，單數形的表現，只要未特別提及，則應理解亦包含其複數形的概念。因此，單數形的冠詞（例如，英語之情形為「a」、「an」、「the」等），只要未特別提及，則應理解亦包含其複數形的概念。又，在本說明書中所使用之用語，只要未特別提及，則應理解使用在該領域中通常使用之意義。因此，只要未另外定義，則本說明書中所使用之所有專門用語及科學技術用語具有與本公開所屬技術領域中具有通常知識者一般理解者相同的意義。矛盾之情形，以本說明書（包含定義在內）為優先。

以下適當說明在本說明書中特別使用之用語的定義及／或基本的技術內容。

在本說明書中，「包含（comprise）」之用語包括「由…所構成（consisting of）」。「包含」意指只要不破壞發明的主旨，則可包含未記載的第三成分，但「由…所構成」意指實質上不包含未記載的第三成分。所謂「實質上不包含」，係以亦可具有在製造過程中無法避免的第三成分的混入或檢測極限以下的第三成分（例如不純物等）的混入之意義使用。

在本說明書中，所謂「胺基酸」，係以該技術領域中之通常意義使用，係指在一分子內具有羧基及胺基之化合物。具代表性的是，胺基酸為α胺基酸，但亦可存在β胺基酸及γ胺基酸等羧基與胺基的距離更遠的胺基酸。在本說明書中，若未特別揭示，則胺酸表示L體的光學異構物，在為D體之情形中，最前方加上D（或者d）（例如，D－Ala（或者d－Ala））或以小寫的字母（例如，a）表示。以下雖揭示胺基酸的具代表性的例子，但在本說明書中亦考慮其他胺基酸。[表1]

胺基酸H₂N－C（R）－COOH中之胺基所鍵結之碳被特定為α位，但將本公開的異肽鍵的形成相關之具代表性的胺基酸中之位置標記揭示於以下。[化4]

在本說明書中，所謂「多肽」，係指結合複數個胺基酸之分子。為了多肽的胺基酸序列中的胺基酸的修飾，能適當採取定點誘變法（Kunkel等人（Proc. Natl. Acad. Sci. USA （1985） 82， 488－492））、重疊延伸PCR（重疊延伸PCR）等習知方法。又，亦能採用取代成天然的胺基酸以外的胺基酸之胺基酸的修飾方法（Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. （2006） 35， 225－249、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. （2003） 100 （11）， 6353－6357）。例如，能適合地使用無細胞轉譯系統（cell－free translation system）等，所述無細胞轉譯系統包含在為終止密碼子之一的UAG密碼子（琥珀密碼子（amber codon））的互補性琥珀壓制型tRNA（Complementary Amber Suppressor tRNA）結合非天然胺基酸而成之tRNA（Clover Direct（Protein Express））。

在本說明書中，所謂「對應之區域」或「對應之位置」的胺基酸或核苷酸，係指在一多肽分子或多核苷酸分子中具有或預測具有與成為比較基準之多肽或多核苷酸中之指定的位置的胺基酸或核苷酸同樣的作用之胺基酸或核苷酸。例如，本發明所屬技術領域中具有通常知識者可在原本的分子與其變異體之間進行比對，設定適當的閾值，特定對應之位置。例如，1個胺基酸的插入能使插入處後方的胺基酸殘基對應之位置各別僅增加1。例如，比對的結果，在將至少2個連續之胺基酸殘基為一致之2個區域及其間的區域進行對齊之序列中，50%以上的胺基酸殘基為一致之情形，可將此對齊序列的部分特定作為對應之區域。例如，比對的結果，在2個胺基酸序列之中各別將以下的序列1及序列2：序列1：XXXGGXX序列2：XXXA－XX特定作為對應之區域之情形，此對應之區域內，可將序列2的「A」作為4位，將序列2的「－」作為5位，特定對應之位置。

在本說明書中，所謂胺基酸的「變異」或「修飾」，係指胺基酸的插入、取代或缺失。胺基酸的1個變異或修飾，係指1個胺基酸的插入、1個胺基酸的取代或1個胺基酸的缺失。胺基酸插入亦包含對於胺基酸序列的末端之胺基酸加成。

在本說明書中，作為表示胺基酸的插入之表現，能適當使用將插入後的序列中之已插入之胺基酸的位置及1字元碼進行併記之表現。例如，從胺基酸序列XXXXXXXX往XXXXXGGXXX的變異，能表示為6G及7G的插入。在本說明書中，作為表示胺基酸的取代之表現，能適當使用在表示特定位置之數字的前後併記取代前與取代後的胺基酸的1字元碼之表現。例如，參照XXXXXGXXX之胺基酸序列所使用之G6A的取代，表示6位的甘胺酸往丙胺酸的取代。在本說明書中，作為表示胺基酸的缺失之表現，能適當使用表示缺失前的序列中之已缺失之胺基酸的位置（因應需要併記1字元碼）之表現。例如，從胺基酸序列XXXXXGXXX往XXXXXXXX的變異，能表示為6位的缺失或6G的缺失。因此，6位的胺基酸的變異包含上述例中之6G的插入、G6A的取代及6G的缺失。

變異的位置不一定需要將變異前的序列作為基準而表現，例如，從胺基酸序列XXXXXXXX往XXXXXGXXX的變異，亦可表示為往變異前的胺基酸序列XXXXXXXX插入6G，亦可表現為在變異後的胺基酸序列XXXXXGXXX包含6位的插入之序列。變異的位置不一定需要參照全長的多肽而表現，亦可基於上述的「對應之區域」及「對應之位置」而特定。

在本說明書中，所謂「保守性胺基酸取代（conservative amino acid substitution）」，係指將肽中之胺基酸取代成別的性質類似的胺基酸，能預測肽的性質在保守性取代的前後為類似。具體的保守性胺基酸取代的例子，被提供在本說明書的別處。

在本說明書中，只要未特別說明，則針對一分子（例如，蛋白質、核酸）的說明，被理解為亦為針對發揮與該分子的生物學功能同樣的功能（亦可非相同程度）之該分子的變異體（例如，在胺基酸序列具有修飾之變異體）的說明。例如，包含抗體的Fc區之重鏈蛋白質，不僅包含具有特定的胺基酸序列之蛋白質，亦能包含此蛋白質與標識分子（螢光標識等）的複合物（conjugate）、同位素取代體、可與抗體的輕鏈締合及／或可與抗體的另一Fc區締合之變異體等。此種變異體中，在原本的分子的片段、跨越同一尺寸的原本的分子的胺基酸序列或核酸序列、或藉由在該領域中習知的電腦同源性程式進行比對並與被比對之原本的分子的序列進行比較之際，能包含至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%相同之分子。變異體能包含具有經修飾之胺基酸（例如，由雙硫鍵形成、醣基化、脂質化、乙醯化或磷酸化所致之修飾）之分子。

在本說明書中，「抗體」係以最廣泛的意義使用，包括包含單株抗體、多株抗體、單域抗體（single domain antibody）及多重特異性抗體（例如，雙特異性抗體或者三特異性抗體）之各種的抗體結構。

在本說明書中，所謂「人源化（humanized）抗體」，係指具有以下結構的抗體：將在人以外的生物物種中所製作之抗體的CDR區併入人的抗體之結構。又，所謂「嵌合抗體」，係指具有以下結構的抗體：將在人以外的生物物種中所製作之抗體的可變區併入人的抗體之結構。

在本說明書中，「抗原結合片段」，係指具有與目標抗原結合之能力之抗體的部分結構，典型而言，至少包含抗體的重鏈可變區及輕鏈可變區。作為抗原結合片段，可列舉例如Fv、Fab、Fab’、Fab’－SH、F（ab’）2、雙鏈抗體（diabody）及單鏈可變區片段（scFv）。在較佳態樣中，抗原結合片段包含相當於抗體的VH區及CH1區之區以及相當於VL區及CL區之區。

在本說明書中，「可變區」或「可變區域」係指抗體的重鏈或輕鏈的區域。抗體的重鏈及輕鏈的可變區域（各別為VH及VL），通常各別包含4個經保存之框架區（framework region，FR）及3個互補決定區（complementarity determining region，CDR）（例如，參照Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 （2007））。

在本說明書中，「互補決定區」或「CDR」係指抗體的可變區域中的特別有助於抗原結合性之區。通常，抗體包含6個CDR：在VH有3個（H1、H2、H3）以及在VL有3個（L1、L2、L3）。CDR序列的決定法存在複數種類，有Kabat編號系統、IMGT編號系統、Paratome編號系統及Chothia編號系統等（例如，參照Kabat人等，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.（Kabat編號系統），Kunik，Ashkenazi and Ofran，2012，「Paratome：an  online tool for systematic identification of antigen－binding regions in antibodies based on sequence or structure‘ Nucl.Acids Res.，40：W521－W524（Paratome編號系統），Lefranc人等，2003，Dev Comparat Immunol 27：55－77（IMGT編號系統），Al－Lazikani人等，1997，J.Mol.Biol 273：927－948（Chothia編號系統））。

「框架」或「FR」係指可變區域中的互補決定區（CDR）以外的區。可變區域的FR，通常由4個FR區域：FR1、FR2、FR3及FR4所構成。CDR及FR的序列，通常依以下順序在VH（或VL）出現：FR1－H1（L1）－FR2－H2（L2）－FR3－H3（L3）－FR4。

在本說明書中，「恆定區」或「恆定區域」係指抗體的可變區以外的部分。例如，IgG抗體為由雙硫鍵結之2個相同輕鏈與2個相同重鏈所構成之約150,000道耳頓的異質四聚體（heterotetramer）糖蛋白質，從N端朝向C端，各重鏈具有可變區（VH）以及包含CH1區域、鉸鏈區、CH2區域、CH3區域之重鏈恆定區（CH）。同樣地，從N端朝向C端，各輕鏈具有可變區（VL）及恆定輕鏈（CL）區域。天然型抗體的輕鏈中，已知被稱為kappa（κ）及lambda（λ）之2個類型的恆定區域。

在本說明書中，「Fc區」係指包含抗體的恆定區域的CH3、CH2及鉸鏈區的至少一部分之區。依據情形，Fc區能包含在一些抗體類別（class）中存在之CH4區域。Fc區可包含抗體的恆定區域的鉸鏈區整體。Fc區可被T細胞等辨識，並與效應子功能等相關。人IgG1之情形，重鏈Fc區係從Cys226或從Pro230延伸至重鏈的羧基末端為止。但是，Fc區的C端的離胺酸（Lys447）或甘胺酸－離胺酸（Gly446－Lys447）可存在亦可不存在（Fc區中的胺基酸殘基的編號係依循Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991所記載之EU編號系統（EU索引））。

抗體的「類別」係依據抗體的重鏈所含之恆定區域的類別而被分類。抗體具有5個主要類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。而且，其中一些能被進一步分成子類（同型（isotype））。例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。

在本說明書中，所謂「抗原」，係指抗體所結合之目標分子或其部分。將在抗原中存在之抗原決定位稱為表位，抗體係與抗原的表位的部分結合。表位包含線性表位及立體表位。蛋白質抗原中之線性表位為胺基酸一級序列被抗體辨識之表位。蛋白質抗原中之線性表位，典型而言，係由至少3個、至少5個例如8～10個、6～20個胺基酸所構成。蛋白質抗原中之立體表位係與線性表位為對照性，為僅靠胺基酸的一級序列無法規定的表位。關於立體表位的辨識，抗體辨識蛋白質的三維結構。決定表位的立體結構之方法，包含例如X射線結晶學、二維核磁共振光譜學、定點自旋標記（Site－directed spin labeling）及電磁順磁共振光譜學（electromagnetic paramagnetic resonance spectroscopy），但不受限於此等。例如，參照Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology （1996），第66卷，Morris（編）。

在本說明書中，「嵌合抗原受體」（CAR）為具有抗體的抗原結合性片段（尤其，scFv）與免疫細胞的活化區域之嵌合分子。CAR一般而言為scFv、細胞外鉸鏈區域、跨膜區域（例如，CD8α或CD28）及活化訊息傳遞區域（例如，CD3ζ）連結而成之分子。CAR可導入細胞並在細胞表面表現。已表現CAR之細胞能對於特定的抗原進行標靶化。CAR例如被導入T細胞或NK細胞等免疫細胞，將T細胞或NK細胞等免疫細胞對癌進行標靶化。在第一代CAR中，scFv、細胞外鉸鏈區域、跨膜區域（例如，CD8α或CD28）及活化訊息傳遞區域（例如，CD3ζ）已連結，但為了已導入CAR之免疫細胞活化，第二代CAR進一步包含共刺激分子訊息傳遞區域。作為共刺激分子訊息傳遞區域，能使用CD28、4－1BB、OX40、CD27及ICOS等共刺激因子。在第三代CAR中，併入複數的共刺激因子。第四代CAR係以具有產生細胞激素（例如，IL12等發炎性細胞激素）之功能之方式修飾細胞。藉由釋放細胞激素而可改善主要微環境並促進免疫系統的活化。第五代CAR的特徵在於除了共刺激分子訊息傳遞區域以外還具有利用細胞激素受體相關的訊息傳遞路徑（例：JAK－STAT路徑）之結構。此種結構可列舉例如IL－2受體β鏈的細胞內區域、IL－7受體的細胞內區域、IL－15受體的細胞內區域及IL－21受體的細胞內區域。如此，在CAR中，已加上用於使已導入CAR之免疫細胞在活體內持續地增殖的改良。較佳為scFv的CDR區以外被人源化，但較佳為scFv部分以外的任一區域亦源自人蛋白質。亦有scFv本身源自人抗體之情形。另外，已開發各種的CAR的修飾版本，在本公開中，可將此等全部的CAR所具有之scFv區以具有重鏈VH－CH1區域及輕鏈VL－CL區域之抗體的抗原結合性片段進行取代。例如，在本發明中，可使用Fab片段、Fab’片段等抗體的抗原結合性片段以取代scFv，在CAR產生細胞中，在CH1與CL之間形成異肽鍵，可使具有已穩定化之Fab片段、Fab’片段等抗體的抗原結合性片段之CAR在細胞表面表現。

在本說明書中，胺基酸序列或鹼基序列的相同性（identity）的比較係使用序列分析用工具亦即BLAST並使用預設參數而計算。相同性的檢索，例如可使用NCBI的BLAST2.7.1（2017.10.19發行）進行。本說明書中之「相同性」的值，通常係指使用上述BLAST並以預設的條件進行比對之際的值。「相同性」係將在2個或者複數間的胺基酸或鹼基序列中相同的胺基酸或鹼基數的比例依循如上述般的習知方法而計算。若具體地說明，則在計算比例之前，使進行比較之胺基酸或鹼基序列群組的胺基酸或鹼基序列對齊，需要將相同胺基酸或鹼基的比例最大化之情形，將在胺基酸或鹼基序列的一部分導入間隙。用於對齊的方法、比例的計算方法、比較方法及與其等相關之電腦程式，在該領域中已為人熟知（例如，上述之BLAST等）。以BLAST將胺基酸或鹼基序列進行比較時的演算法，可預設使用Blastp。

在本說明書中，所謂「醫藥成分」，意指能構成醫藥之任意成分，可示例例如有效成分（其本身表現藥效者）、添加成分（其本身雖未被期待具藥效，但被包含作為醫藥之情形被期待發揮一定的作用（例如，賦形劑、潤滑劑、界面活性劑等）之成分）等。醫藥成分可為單獨的物質，亦可為複數的物質或劑的組合。亦能包含有效成分與添加成分的組合、佐劑與有效成分的組合等任意組合。

在本說明書中，「有效成分」係指發揮所欲藥效之成分，能適用單獨或複數的成分。

在本說明書中，所謂「添加成分」，係指雖不被期待具藥效但被包含作為醫藥之情形發揮一定的作用之任意成分，可列舉例如藥學上可容許的載體、穩定化劑、（輔）助劑、溶解度改善劑、助溶劑、稀釋劑、賦形劑、緩衝劑、結合劑、稀釋劑、香味劑、潤滑劑。

在本說明書中，「藥劑」、「劑」或「因子」（皆在英語中相當於agent），廣義而言，能被交換使用，只要可達成所欲目的則可為任何物質或其他要素（例如，光、放射能、熱、電等能量）。作為此種物質，可列舉例如抗體、蛋白質、多肽、寡肽、肽、多核苷酸、寡核苷酸、核苷酸、核酸（例如，包含cDNA、如基因體DNA般的DNA、如mRNA般的RNA）、多醣、寡醣、脂質、有機低分子（例如，荷爾蒙、配體、訊息傳遞物質、有機低分子、由組合化學所合成之分子、能利用作為醫藥品之低分子（例如，低分子配體等）等）、此等的複合分子及此等的混合物，但不受限於此等。

在本說明書中，所謂「標識」，係指用於將成為目標之分子或物質與其他分子或物質進行辨識的存在（例如，物質、能量、電磁波等）。作為此種標識方法，可列舉RI（放射性同位素）法、螢光法、生物素法、化學發光法等。目標蛋白質或捕捉其之因子或手段為複數且藉由螢光法進行標識之情形中，藉由螢光發光極大波長互相不同的螢光物質而進行標識。螢光發光極大波長的差，較佳為10nm以上。可使用不對功能造成影響的任意標識，但作為螢光物質，可列舉AlexaTMFluor。AlexaTMFluor為將香豆素、玫瑰紅、螢光素、花青等進行修飾所得到之水溶性的螢光色素，為與廣泛範圍的螢光波長對應之系列，相較於其他的適用波長的螢光色素，非常地穩定且明亮，又pH靈敏度低。作為螢光極大波長有10nm以上的螢光色素的組合，可列舉AlexaTM555與AlexaTM633的組合、AlexaTM488與AlexaTM555的組合等。作為其他螢光標識，可列舉花青色素（例如，CyDyeTM系列的Cy3、Cy5等）、玫瑰紅6G試劑、N－乙醯氧基－N2－乙醯基胺基茀（AAF）、AAIF（AAF的碘衍生物）等。在本公開中，可利用此種標識，以能被所使用之檢測手段檢測之方式修飾目標對象。此種修飾在該領域中為習知，本發明所屬技術領域中具有通常知識者可因應標識及目標對象而適當地實施此種方法。

在本說明書中，所謂「套組」，係指將應被提供之部分（例如，抗體、說明書等）分成通常2個以上的子部分而提供之單元。為了穩定性等，以不應混合提供而是較佳為在即將使用前進行混合使用的組合物為目的時，較佳為此套組的形態。此種套組，較佳為，具備記載應如何使用所提供之部分或應如何處理試劑之指示書或說明書為有利。在本說明書中，將套組使用作為試劑套組之情形，套組通常包含記載抗體等的使用方式等之指示書等。

在本說明書中，「指示書」為記載對於醫師或其他使用者說明使用本公開之方法者。此指示書記載指示投予本公開的醫藥等之字句。又，指示書亦可記載指示投予形態之字句。此指示書係依循實施本公開之國家的監管機構（例如，日本為厚生勞動省、美國為食品藥物管理局（FDA）等）所規定之樣式而作成，並明確記載已被該監管機構承認之主旨。指示書為所謂的仿單（package insert），通常提供紙本，但不受限於此，例如，亦能提供如電子檔（例如，網際網路所提供之主頁、電子郵件）般的形態。

用語「約」，係指所示之值的正或負10%的範圍。「約」被使用於溫度之情形，係指所示之溫度的正或負5℃的範圍，「約」被使用於pH之情形，係指所示之pH的正或負0.5的範圍。

在本說明書中，所謂「第一及第二多肽鏈互相鄰近之邊界區」，係在第一多肽與第二多肽中，2個多肽的骨架鏈之間的區。在本說明書中，所謂「第一及第二多肽鏈互相鄰近」，係指第一多肽鏈中之第一胺基酸與第二多肽鏈中之第二胺基酸之間的α碳原子間的距離成為10Å以下，所謂「第一及第二多肽鏈互相鄰近之邊界區」，係指從連結此種第一胺基酸的α碳原子與第二胺基酸的α碳原子之線段的中點起15Å以下的區（半徑15Å的球狀區）。

（較佳的實施形態）以下說明本公開的較佳的實施形態。以下所提供之實施形態係為了更易理解所提供者，應理解本公開的範圍不應受限於以下的記載。因此，可知本發明所屬技術領域中具有通常知識者可參酌本說明書中的記載而在本公開的範圍內進行適當修飾。又，應理解以下的實施形態可單獨使用或者將其等組合使用。

在一態樣中，本公開提供多肽中之異肽鍵。用於達成此的任意手段被認為在本公開的範圍內。例如，即使無明確記載，製作形成異肽鍵之多肽之方法的記載，亦同時為經製作之多肽、包含其之組合物及其用途等反映其他手段之實施形態。

（製作形成異肽鍵之多肽之方法）本發明提供製作形成異肽鍵之多肽之方法。在本說明書中，所謂異肽鍵，係指具有以下結構之肽間連結：[化5]，式中，虛線分別表示第一或第二多肽鏈，表示與兩多肽的α碳連結。該肽間連結係第一或第二多肽鏈的離胺酸的側鏈與天冬醯胺酸、天冬胺酸、麩醯胺酸或麩胺酸的側鏈進行鍵結而產生。在具代表性的實施形態中，本公開提供一種方法，其係製作在第一及第二多肽鏈間包含異肽鍵的肽間連結之修飾多肽之方法，並包含：建構包含第一及第二多肽鏈之中間體A的立體結構之步驟；特定在立體結構中之前述第一及第二多肽鏈互相鄰近之邊界區存在之胺基酸序列之步驟；使中間體A變異之步驟，其藉由將a）離胺酸、b）麩醯胺酸、麩胺酸、天冬醯胺酸或天冬胺酸以及c）麩胺酸或天冬胺酸之中的至少1個殘基導入中間體A而製備中間體B，於此，中間體B包含a）、b）及c），中間體B中之第一及第二多肽鏈各別在邊界區中包含a）及b）；以及藉由在中間體B中形成肽間連結而獲得修飾多肽之步驟。於此，中間體A相當於起始結構，中間體B相當於變異導入後且異肽鍵形成前的結構，修飾多肽相當於變異導入後且異肽鍵形成後的結構。

異肽鍵的形成反應被認為若適當地設計多肽則會在不存在酵素等追加要素下進行。但是，具有異肽鍵之蛋白質因僅知釀膿鏈球菌的Spy0128蛋白質等有限之例子（J Am Chem Soc. 2011 Jan 26;133（3）:478－85.），故促進異肽鍵的形成反應之多肽的設計為重要。雖在a）的離胺酸與b）的麩醯胺酸、麩胺酸、天冬醯胺酸或天冬胺酸之間形成異肽鍵，但c）的麩胺酸或天冬胺酸在促進此反應中具有特別重要的作用。c）可存在於與第一或第二多肽鏈相同的分子中，亦可存在於別的多肽鏈。在一實施形態中，c）存在於與第一多肽鏈相同的分子中。在一實施形態中，c）存在於第一多肽鏈上且比a）的離胺酸殘基更靠N端側。在一實施形態中，c）存在於第一多肽鏈上且距離a）的離胺酸殘基5殘基以上之位置。

包含或導入a）之多肽鏈在本說明書中被稱為第一多肽鏈，包含或導入b）之多肽鏈在本說明書中被稱為第二多肽鏈。第一多肽鏈及第二多肽鏈可存在於相同分子中，亦可存在於不同分子中。在一實施形態中，第一多肽鏈及第二多肽鏈係存在於不同分子中。尤其，藉由本公開而變得能在不同分子間形成異肽鍵，藉此獲得如本說明書所記載般的異質締合體的形成中之優點等。

在本說明書中，所謂「第一及第二多肽鏈互相鄰近之邊界區」，係在第一多肽與第二多肽中，2個多肽的骨架鏈之間的區。在本說明書中，所謂「第一及第二多肽鏈互相鄰近」，係指存在第一多肽鏈中之第一胺基酸與第二多肽鏈中之第二胺基酸之間的α碳原子間的距離成為10Å以下之第一胺基酸及第二胺基酸的至少1個組合（亦稱為「鄰近胺基酸對」），所謂「第一及第二多肽鏈互相鄰近之邊界區」，係指從連結此種第一胺基酸的α碳原子與第二胺基酸的α碳原子之線段的中點起15Å以下的區。第一多肽鏈與第二多肽鏈之間存在複數的鄰近胺基酸對之情形，所謂「第一及第二多肽鏈互相鄰近之邊界區」，係指從連結各個鄰近胺基酸對的胺基酸的α碳原彼此之線段的中點起15Å以下的區域與全部的鄰近胺基酸對重疊之區。在本公開中，異肽鍵不一定需要形成於鄰近胺基酸對的胺基酸之間，但其側鏈變得形成於邊界區內所含之胺基酸間。在具代表性的實施形態中，能將以下區定義為邊界區：從連結a）的胺基酸的α碳原子與b）的胺基酸的α碳原子之線段的中點起約25Å以內、約20Å以內、約15Å以內、約10Å以內、約7Å以內或約5Å以內的區。從多肽鏈伸出之胺基酸側鏈的方向通常並非固定，因此，尤其是形成異肽鍵之a）及b）的胺基酸側鏈，較佳為設計成朝向另一多肽並在邊界區內延伸。在一實施形態中，側鏈被配置於立體結構的內部之2個胺基酸的位置被特定作為a）及b）的胺基酸位置。

立體結構的建構亦可基於習知的立體結構。例如，習知的立體結構可取自Protein Database等。起始多肽（中間體A）的立體結構，例如，可下載登錄於Protein Data Bank（https://www.rcsb.org/）之起始多肽的晶體結構的座標資料，使用PyMOL（https://pymol.org/2/）進行建構。已建構之立體結構，因應需要，可將修飾後的多肽的立體結構藉由例如SWISS－MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）而建構同源建模（homology model），並使用Coot（https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/），藉此進行建構。若有需要，則參數使用預設值。本說明書所記載之立體結構能為如此所建構者。可在導入任意的變異後建構多肽中間體的立體結構。在一實施形態中，建構中間體B的立體結構。

在一實施形態中，基於在邊界區內存在之第一多肽鏈的第一胺基酸殘基（側鏈）與第二多肽鏈的第二胺基酸殘基（側鏈）之間的距離以及第一及第二胺基酸殘基的種類而導入a）及／或b）。在一實施形態中，b）為天冬醯胺酸或天冬胺酸，在中間體A的立體結構中，α碳間的距離為約6～10Å例如約6Å、約6.5Å、約7Å、約7.5Å、約8Å、約8.5Å、約9Å、約9.5Å、約10Å或其任意2個值之間的範圍內之2個胺基酸位置被特定作為a）及b）的胺基酸位置。在一實施形態中，b）為麩醯胺酸或麩胺酸，在中間體A的立體結構中，α碳間的距離為約7.5～11Å例如約7.5Å、約8Å、約8.5Å、約9Å、約9.5Å、約10Å、約10.5Å、約11Å或其任意2個值之間的範圍內之2個胺基酸位置被特定作為a）及b）的胺基酸位置。

形成多肽鏈間的相互作用界面之胺基酸殘基的原子，存在於互相靠近的距離，但在別的多肽鏈中存在之原子間為以下：C－C：4.1Å、C－N：3.8Å、C－O：3.7Å、O－O：3.3Å、O－N：3.4Å、N－N：3.4Å的距離以下之情形，在本說明書中將其等原子稱為「相互作用原子對」（參照S. Sheriff, W.A. Hendrickson, and J.L. Smith, J. Mol. Biol. 197, 273-296 （1987）.）。另一方面，若在一多肽鏈中存在之原子以及在位於與其最靠近的距離之別的多肽鏈中存在之原子的對為相互作用原子對，則2個多肽鏈能相互作用。在一實施形態中，在中間體B（變異導入後，異肽鍵形成前）的立體結構中，第一及第二多肽鏈的a）及b）的周邊的胺基酸（例如，從a）或b）起7個、6個、5個、4個、3個、2個或1個以內的胺基酸，包含a）及b））的側鏈，具有相互作用原子對。在一實施形態中，a）及b）的周邊的胺基酸的胺基酸對之中的1個、2個、3個、4個、5個或更多的胺基酸對，具有相互作用原子對。在一實施形態中，a）及b）的周邊的胺基酸的胺基酸對之中的具有相互作用原子對之胺基酸對的側鏈，具有1個、2個、3個、4個、5個或更多的相互作用原子對。於此，1個要素（胺基酸或原子）可在複數的不同要素之間形成複數的對。在一實施形態中，第一多肽鏈上的a）的N端側的7個、6個、5個、4個、3個、2個或1個以內的胺基酸與第二多肽鏈的b）的周邊的胺基酸之間的胺基酸對，具有相互作用原子對。

在一實施形態中，在中間體B（變異導入後，異肽鍵形成前）的立體結構中，a）的殘基的ζ位的氮原子與c）的殘基的側鏈中的羧基的氧原子之間的距離為約1～6Å，例如約1Å、約1.5Å、約2Å、約2.5Å、約3Å、約3.5Å、約5Å、約5.5Å、約6Å或其任意2個值之間的範圍內。在一實施形態中，在中間體B的立體結構中，b）的殘基的側鏈中的羧基或醯胺基的氧原子與c）的殘基的側鏈中的羧基的氧原子之間的距離為約1～6Å，例如，約1Å、約1.5Å、約2Å、約2.5Å、約3Å、約3.5Å、約5Å、約5.5Å、約6Å或其任意2個值之間的範圍內。在一實施形態中，在中間體B的立體結構中，a）的殘基的ζ位的氮原子與b）的殘基的側鏈中的羧基或醯胺基的氧原子之間的距離為約1～6Å，例如約1Å、約1.5Å、約2Å、約2.5Å、約3Å、約3.5Å、約5Å、約5.5Å、約6Å或其任意2個值之間的範圍內。

在一實施形態中，在中間體A的立體結構中，a）與c）的α碳間的距離為約5～10Å例如約5Å、約5.5Å、約6Å、約6.5Å、約7Å、約7.5Å、約8Å、約8.5Å、約9Å、約9.5Å、約10Å或其任意2個值之間的範圍內之2個胺基酸位置被特定作為a）及c）的胺基酸位置。在一實施形態中，在中間體A的立體結構中，b）與c）的α碳間的距離為約5～10Å例如約5Å、約5.5Å、約6Å、約6.5Å、約7Å、約7.5Å、約8Å、約8.5Å、約9Å、約9.5Å、約10Å或其任意2個值之間的範圍內之2個胺基酸位置被特定作為a）及c）的胺基酸位置。在一實施形態中，在中間體A的立體結構中，滿足上述的a）與c）的α碳間的距離及上述的b）與c）的α碳間的距離之3個胺基酸位置被特定作為a）、b）及c）的胺基酸位置。

在一實施形態中，在中間體B的立體結構中，從a）的殘基的α碳朝向β碳的向量與從b）的殘基的α碳朝向β碳的向量之間的角度未被特別限定，但例如為約180°、約170°、約160°、約150°、約140°、約130°、約120°、約110°、約100°、約90°、約80°、約70°、約60°或其任意2個值之間的範圍內。在一實施形態中，在中間體B的立體結構中，從a）的殘基的α碳朝向b）的殘基的α碳的向量與從c）的殘基的α碳朝向β碳的向量之間的角度未被特別限定，但例如為約130°、約120°、約110°、約100°、約90°、約80°、約70°、約60°、約50°、約40°、約30°、約20°或其任意2個值之間的範圍內。

在一實施形態中，在中間體B（變異導入後，異肽鍵形成前）的立體結構中，a）、b）及c）之中的1個、2個或3個不存在於區域中。在Spy蛋白質中，在區域中存在之殘基之間進行反應而形成異肽鍵，但在本公開中，異肽鍵能獨立於區域形成而形成。例如，一殘基是否存在於區域中，能基於其溶劑接觸面積而判定。殘基的溶劑接觸面積可藉由AREAIMOL的程式而計算。AREAIMOL被記載於J. Mol. Biol. 55, 379－400（1971），能被利用作為CCP4之蛋白質結構分析用程式包所含之程式（https://www.ccp4.ac.uk/）。可讀取構成分子之各原子的座標資料，使用預設的參數進行計算。例如，本案實施例的isoCH1（序列識別號1）中之異肽鍵形成性的Asn的計算結果為0.24，isoCL（序列識別號2）中之異肽鍵形成性的Lys的計算結果為0.24，觸媒性的Glu的計算結果為0.25。在一實施形態中，在殘基的溶劑接觸面積為0.1以上、0.11以上、0.12以上、0.13以上、0.14以上、0.15以上、0.16以上、0.17以上、0.18以上、0.19以上、0.2以上、0.21以上、0.22以上、0.23以上、0.24以上或0.25以上之情形中，能判定該殘基存在於區域中。

被c）催化之a）與b）之間的異肽鍵形成反應，因能在疏水性環境中被促進，故邊界區能較佳為疏水性環境。在一實施形態中，包含判定邊界區的疏水性之步驟。在一實施形態中，導入以下變異：將在邊界區存在之胺基酸序列中之親水性胺基酸殘基進行刪除之變異、將胺基酸殘基取代成疏水性胺基酸殘基之變異、或將疏水性胺基酸殘基進行插入之變異。

在一實施形態中，親水性胺基酸能包含麩胺酸、天冬胺酸、離胺酸、精胺酸、絲胺酸及蘇胺酸。在一實施形態中，親水性胺基酸能包含麩胺酸、天冬胺酸、離胺酸、精胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸及組胺酸。在一實施形態中，疏水性胺基酸能包含苯丙胺酸、色胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸。在一實施形態中，疏水性胺基酸能包含苯丙胺酸、色胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸及脯胺酸。

在一實施形態中，在中間體B的立體結構中，在a）的殘基的ζ位的氮原子起約20Å以內、約18Å以內、約16Å以內、約14Å以內、約12Å以內、約10Å以內、約8Å以內、約6Å以內或約4Å以內之處，導入具有α碳之疏水性胺基酸。因應需要，在中間體B的立體結構中，所導入之疏水性胺基酸的α碳距離a）的殘基的ζ位的氮原子約3Å以上、約3.5Å以上、約4Å以上、約4.5Å以上或約5Å以上。

在一實施形態中，以填埋邊界區的空間之方式導入（插入或取代）具有不同體積的側鏈之疏水性胺基酸。能導入如下述般的變異：導入後的多肽的（已再計算的）立體結構中之邊界區中的側鏈所佔之體積的比例大於導入前的多肽的立體結構中之邊界區中的側鏈所佔之體積的比例。即使導入色胺酸等具有大體積之側鏈的胺基酸，邊界區中的側鏈所佔之體積的比例亦不一定會上升，亦有藉由增加多肽骨架鏈間距離而比例反而降低之情形。胺基酸的側鏈的體積能從小到大依序排列成甘胺酸、脯胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸＝異白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、色胺酸。在一實施形態中，在中間體B的立體結構中，第一及第二多肽鏈互相鄰近之邊界區之中的至少60%、至少62%、至少64%、至少66%、至少68%、至少70%、至少72%、至少74%、至少76%、至少78%、至少80%、至少82%或至少84%的體積被第一及第二多肽鏈的殘基佔據。於此，為了計算側鏈的體積，各原子具有以下的原子半徑：氫：0.53Å、碳：0.67Å、氮：0.56Å、氧：0.48Å、硫：0.88Å。原子的球體積重複之情形中，減去重複部分。在一實施形態中，在中間體B的立體結構中，a）的離胺酸的ε氮原子起的半徑15Å的球體的體積之中的至少60%、至少62%、至少64%、至少66%、至少68%、至少70%、至少72%、至少74%、至少76%、至少78%、至少80%、至少82%或至少84%的體積被第一及第二多肽鏈的殘基佔據。

在本說明書所記載之藉由在中間體B（變異導入後的異肽鍵形成前的多肽）中形成肽間連結而獲得修飾多肽之步驟中，能不需要酵素等追加要素。此步驟在活體外及活體內（細胞內）皆可實施。例如，可在不同細胞中產生第一及第二多肽鏈，之後，將此等多肽鏈在活體外形成異肽鍵。在同時表現第一及第二多肽鏈之細胞中，可在活體內形成異肽鍵。藉由操作第一及第二多肽鏈的細胞內局部存在（例如，使局部存在化訊息分子進行融合），可抑制或促進異肽鍵的形成。

相較於起始多肽（中間體A），最終多肽（修飾多肽）藉由在該領域中習知的電腦同源性程式而進行比對並與被比對之原本的分子的序列進行比較之際，能具有至少約70%、約80%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%相同的胺基酸序列。最終多肽（修飾多肽）亦可包含任意的變異，但在一實施形態中，變異之中的至少約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%或約95%為保守性胺基酸取代。在一實施形態中，保守性胺基酸取代係將以下的胺基酸的群組中之胺基酸取代成相同群組內的別的胺基酸。．群組1：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸．群組2：絲胺酸及蘇胺酸．群組3：苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸．群組4：離胺酸、羥離胺酸、精胺酸及組胺酸．群組5：半胱胺酸、甲硫胺酸、甲硫胺酸亞碸及升半胱胺酸．群組6：脯胺酸及羥脯胺酸．群組7：麩胺酸及天冬胺酸．群組8：麩醯胺酸及天冬醯胺酸．群組9：絲胺酸及半胱胺酸

（包含異肽鍵之多肽）在一態樣中，本公開提供多肽，其係在第一及第二多肽鏈間包含以下的式所表示之肽間連結之多肽：[化6]（式中，虛線表示往多肽骨架的鍵結），所述多肽包含：a）離胺酸、b）麩醯胺酸、麩胺酸、天冬醯胺酸或天冬胺酸以及c）麩胺酸或天冬胺酸，於此，在多肽的立體結構中之第一及第二多肽鏈互相鄰近之邊界區中，第一及第二多肽鏈各別包含a）及b）。

本公開的包含異肽鍵之多肽能為藉由本公開的製作形成異肽鍵之多肽之方法所製作者。在一實施形態中，本公開的包含異肽鍵之多肽，相較於習知的多肽或天然的多肽，具有以下結構差異：已導入本公開的製作形成異肽鍵之多肽之方法中之變異。在一實施形態中，本公開的包含異肽鍵之多肽能具有上述所記載之a）、b）、c）及／或疏水性殘基的配置。此等殘基的配置，在異肽鍵形成前後被大致維持。在一實施形態中，本公開的包含異肽鍵之多肽，相較於習知的多肽或天然的多肽，在藉由該領域中的習知的電腦同源性程式而進行比對並與被比對之原本的分子的序列進行比較之際，能具有至少約70%、約80%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%相同的胺基酸序列。

在一實施形態中，本公開的包含異肽鍵之多肽為不同多肽分子被異肽鍵連結之多肽分子，此能藉由被異肽鍵連結之2個多肽鏈未被肽鍵連結而判定。

在一實施形態中，本公開的包含異肽鍵之多肽為抗體或T細胞受體（TCR）。在一實施形態中，異肽鍵（肽間連結）存在於恆定區。例如，若在抗體的恆定區（重鏈與輕鏈的結合相關之恆定區等）導入異肽鍵，則藉由與各種的可變區進行組合，而能提供維持著異肽鍵形成能力且具有各種的目標特異性之抗體。在一實施形態中，本公開的包含異肽鍵之多肽為酵素補充療法（enzyme replacement therapy）所使用之治療蛋白質、細胞激素或趨化介素。在一實施形態中，作為本公開的包含異肽鍵之多肽，可列舉FcRn等Fc受體、TNFα受體等細胞激素受體，但不受限於此等。

再者，為了說明包含異肽鍵之抗體的實施形態，圖11～12揭示具代表性的抗體序列的比對結果。即使為源自其他生物物種之抗體之情形，亦可取得序列資訊並同樣地決定iSoMAb變異的導入處。此等為使用CLUSTALW（J.D. Thompson, D.G. Higgins, and T.J. Gibson, Nucleic Acids Res. 22, 4673－4680（1994））而作成並編號者。重鏈恆定區及κ鏈恆定區的殘基號碼為依循EU編號者，λ鏈恆定區的殘基號碼為依循Kabat編號者，在本說明書中，能同時提及抗體的殘基與圖11～12所示之號碼。基於在本案說明書的實施例中所示之包含異肽鍵之抗體的成功例，包含與實施例同樣的修飾之抗體亦能形成異肽鍵。在一實施形態中，本公開的包含異肽鍵之抗體，包含重鏈183位中之天冬醯胺酸或天冬胺酸、輕鏈133位中之麩胺酸及輕鏈176位中之離胺酸，因應需要，包含以下之中的1個或複數：重鏈173位中之異白胺酸、重鏈181位中之白胺酸、輕鏈131位中之纈胺酸、輕鏈162位中之甲硫胺酸、輕鏈178位中之白胺酸及輕鏈180位中之麩醯胺酸。在一實施形態中，本公開的包含異肽鍵之抗體，包含重鏈183位中之離胺酸、重鏈170位中之麩胺酸及輕鏈176位中之天冬醯胺酸或天冬胺酸，因應需要，包含以下之中的1個或複數：重鏈173位中之異白胺酸、重鏈181位中之白胺酸、輕鏈162位中之甲硫胺酸、輕鏈178位中之白胺酸及輕鏈180位中之麩醯胺酸。可理解為藉由將上述變異導入抗體，而在各種的動物物種的不同子類的抗體中，在重鏈及輕鏈間形成異肽鍵（參照圖11及12）。在一較佳態樣中，例如，抗體能為人IgG1、人IgG2或人IgG4。在一較佳態樣中，輕鏈能為人κ鏈或人λ鏈。

又，在本發明中提供抗體，其包含重鏈183位的胺基酸被取代成天冬醯胺酸之CH1區與輕鏈133位的胺基酸被取代成麩胺酸且輕鏈176位的胺基酸被取代成離胺酸之CL區，前述天冬醯胺酸與麩胺酸間已形成異肽鍵。在此態樣中，重鏈183位的往天冬醯胺酸的取代，亦可為往麩醯胺酸、麩胺酸或天冬胺酸的取代。

又，在本發明中提供重鏈183位的胺基酸被取代成天冬醯胺酸之CH1區及編碼該區之核酸。又，在本發明中提供具有重鏈183位的胺基酸被取代成天冬醯胺酸之CH1區之重鏈恆定區及編碼該區之核酸。又，在本發明中提供具有重鏈183位的胺基酸被取代成天冬醯胺酸之CH1區之重鏈及編碼該重鏈之核酸。在此態樣中，重鏈183位的往天冬醯胺酸的取代，亦可為往麩醯胺酸、麩胺酸或天冬胺酸的取代。

又，在本發明中提供輕鏈133位的胺基酸被取代成麩胺酸且輕鏈176位的胺基酸被取代成離胺酸之CL區及編碼該區之核酸。又，在本發明中提供包含輕鏈133位的胺基酸被取代成麩胺酸且輕鏈176位的胺基酸被取代成離胺酸之CL區之輕鏈及編碼該輕鏈之核酸。

又，在本發明中提供重鏈183位的胺基酸被取代成天冬醯胺酸之CH1區或編碼該區之核酸與輕鏈133位的胺基酸被取代成之麩胺酸且輕鏈176位的胺基酸被取代成離胺酸之CL區或編碼該區之核酸的組合物。又，在本發明中提供重鏈183位的胺基酸被取代成天冬醯胺酸之重鏈恆定區區或編碼該區之核酸與輕鏈133位的胺基酸被取代成之麩胺酸且輕鏈176位的胺基酸被取代成離胺酸之CL區或編碼該區之核酸的組合物。又，在本發明中提供包含重鏈183位的胺基酸被取代成天冬醯胺酸之CH1區之重鏈或編碼該重鏈之核酸與包含輕鏈133位的胺基酸被取代成之麩胺酸且輕鏈176位的胺基酸被取代成離胺酸之CL區之輕鏈或編碼該輕鏈之核酸的組合物。在此態樣中，重鏈183位的往天冬醯胺酸的取代，亦可為往麩醯胺酸、麩胺酸或天冬胺酸的取代。

CH1區亦可進一步具有173位的胺基酸的往疏水性胺基酸殘基（例如，異白胺酸）的取代。CH1區亦可進一步具有在EU編號中181位的胺基酸的往疏水性胺基酸殘基（例如，白胺酸）的取代。在一較佳態樣中，CH1區亦可進一步具有173位的胺基酸的往異白胺酸的取代、181位的胺基酸的往例如白胺酸的取代。

CL區亦可進一步具有131位的胺基酸的往疏水性胺基酸殘基（例如，纈胺酸）的取代。CL區亦可進一步包含162位的胺基酸的往甲硫胺酸的取代。CL區亦可進一步具有178位的胺基酸的往疏水性胺基酸殘基（例如，白胺酸）的取代。CL區亦可進一步具有在Kabat編號中180位的胺基酸的往麩醯胺酸的取代。CL區，在一較佳態樣中，亦可具有131位的往纈胺酸的取代、162位的胺基酸的往甲硫胺酸的取代、178位的胺基酸的往白胺酸的取代及180位的胺基酸的往麩醯胺酸的取代。在一較佳態樣中，例如，抗體能為人IgG1、人IgG2或人IgG4。在一較佳態樣中，輕鏈為人κ鏈或人λ鏈。

在一態樣中，具有異肽鍵之本公開的抗體，能具有與具有下述重鏈與輕鏈之抗體同等以上或更大的穩定性：具有序列識別號61所記載之胺基酸序列之重鏈；具有序列識別號77的胺基酸序列之輕鏈。在一態樣中，具有異肽鍵之本公開的抗體的抗原結合性片段（例如，Fab、Fab’及F（ab’）₂片段等型式（format）），能具有與具有下述重鏈與輕鏈之抗體所對應之型式的抗原結合性片段同等以上或更大的穩定性：具有序列識別號61所記載之胺基酸序列之重鏈；具有序列識別號77的胺基酸序列之輕鏈。在一態樣中，具有異肽鍵之本公開的抗體及其抗原結合性片段，能具有重鏈183位的胺基酸被取代成天冬醯胺酸之CH1區及輕鏈133位的胺基酸被取代成之麩胺酸且輕鏈176位的胺基酸被取代成離胺酸之CL區。在一態樣中，具有異肽鍵之本公開的抗體及其抗原結合性片段，能具有至少重鏈183位的胺基酸被取代成天冬醯胺酸之CH1區及至少輕鏈133位的胺基酸被取代成之麩胺酸且輕鏈176位的胺基酸被取代成離胺酸之CL區。在此態樣中，重鏈183位的往天冬醯胺酸的取代，亦可為往麩醯胺酸、麩胺酸或天冬胺酸的取代。

在上述的全部態樣中，重鏈183位的胺基酸亦可為麩醯胺酸或麩胺酸，輕鏈133位的胺基酸亦可為天冬醯胺酸，輕鏈176位的胺基酸亦可為離胺酸。又，在上述的全部態樣中，重鏈170位的胺基酸亦可為麩醯胺酸或麩胺酸，重鏈183位的胺基酸亦可為離胺酸，輕鏈176位的胺基酸亦可為天冬醯胺酸。在此態樣中，輕鏈176位的往天冬醯胺酸的取代，亦可為往麩醯胺酸、麩胺酸或天冬胺酸的取代。

在一態樣中，具有異肽鍵之本公開的抗體能具有與具有下述重鏈與輕鏈之抗體同等以上或更大的穩定性或產率：具有序列識別號92所記載之胺基酸序列之重鏈；具有序列識別號94的胺基酸序列之輕鏈。在一態樣中，具有異肽鍵之本公開的抗體的抗原結合性片段（例如，Fab、Fab’及F（ab’）₂片段等型式）能具有與具有下述重鏈與輕鏈之抗體所對應之型式的抗原結合性片段同等以上或更大的穩定性或產率：具有序列識別號92所記載之胺基酸序列之重鏈；具有序列識別號94的胺基酸序列之輕鏈。在一態樣中，具有異肽鍵之本公開的抗體及其抗原結合性片段，能具有重鏈170位被取代成麩胺酸且重鏈183位被取代成離胺酸之CH1區及輕鏈176位被取代成天冬醯胺酸之CL區。在一態樣中，具有異肽鍵之本公開的抗體及其抗原結合性片段，能具有至少重鏈170位被取代成麩胺酸且重鏈183位被取代成離胺酸之CH1區及至少輕鏈176位被取代成天冬醯胺酸之CL區。

在一態樣中，提供具有選自由序列識別號45、47、49、53、55、57、59、60、61、62、81、83、85、88、90、91及92所組成之群組的序列的CH1區（尤其，相當於EU編號中之170位～183位之區）的胺基酸序列之重鏈CH1區、重鏈可變區及重鏈、以及包含此等之中任一者之抗體、或編碼此等之中任一者之核酸。

在一態樣中，提供具有選自由序列識別號46、48、50、54、56、58、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、82、84、86、87、90、93及94所組成之群組的序列的CL區（尤其，相當於176～180位之區（尤其相當於mut3的176位之區），例如相當於162位～180位之區，例如相當於131位～180位之區）的胺基酸序列之CL區、輕鏈可變區及輕鏈、以及包含此等之中任一者之抗體、或編碼此等之中任一者之核酸。

在一態樣中，能提供以下兩者的組合物：具有選自由序列識別號45、47、49、53、55、57、59、60、61、62、81、83、85、88、90、91及92所組成之群組的序列的CH1區（尤其，相當於EU編號中之170位～183位之區）的胺基酸序列之重鏈CH1區、重鏈可變區及重鏈、以及包含此等之中任一者之抗體、或編碼此等之中任一者之核酸；以及具有選自由序列識別號46、48、50、54、56、58、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、82、84、86、87、90、93及94所組成之群組的序列的CL區（尤其，相當於176～180位之區域）的胺基酸序列之CL區、輕鏈可變區及輕鏈、以及包含此等之中任一者之抗體、或編碼此等之中任一者之核酸。

在一態樣中，具有選自由上述所組成之群組的序列的CH1區（尤其，相當於EU編號中之170位～183位之區）的胺基酸序列之重鏈CH1區，能與各種的抗體的VH區連結。

在一態樣中，具有選自由上述所組成之群組的序列的CL區（尤其，相當於176～180位之區）的胺基酸序列之CL區，能與各種的VL區連結。

在一態樣中，具有選自由上述所組成之群組的序列的CH1區（尤其，相當於EU編號中之170位～183位之區）的胺基酸序列之重鏈CH1區，能與鉸鏈或CH2－CH3連結。在一態樣中，並非CH1區而是具有選自由上述所組成之群組的序列的CL區（尤其，相當於176～180位之區）的胺基酸序列之CL區，能與鉸鏈或CH2－CH3連結。

在本發明中，抗體的重鏈能源自選自由人IgG1、人IgG2、人IgG3及人IgG4所組成之群組的任一者或其異型（allotype）。人IgG1、人IgG2、人IgG3及人IgG4能各別具有例如序列識別號11～14。在本發明中，抗體的輕鏈能源自選自由人κ鏈及人λ鏈所組成之群組的任一者或其異型。人κ鏈及人λ鏈能各別具有例如序列識別號31及37。因此，本發明的抗體或抗體的抗原結合性片段能源自上述源自人的重鏈及源自人的輕鏈。

重鏈及輕鏈恆定區各別亦可進一步具有更有用的變異，例如，緘默（silent）Fc變異、CH／CL界面控制以及用於改善C端的異質性的446位及／或447位（EU編號）的缺失等變異（例如，選自由插入、加成、取代及缺失所組成之群組）。往重鏈恆定區的變異，只要不明顯地抑制抗體功能（尤其，被期待之抗體功能）則會被容許，但將序列識別號11～14中任一者所含之重鏈恆定區的胺基酸序列作為基準，能為序列所含之胺基酸的個數的15%以下、10%以下或5%以下。往輕鏈恆定區的變異，只要不明顯地抑制抗體功能（尤其，被期待之抗體功能）則會被容許，但將序列識別號31及37中任一者所含之輕鏈恆定區的胺基酸序列作為基準，能為序列所含之胺基酸的個數的15%以下、10%以下或5%以下。

根據本發明，能提供具有上述核酸之細胞（尤其抗體產生細胞，較佳為中國倉鼠卵巢細胞）及具有上述核酸的組合之細胞（尤其抗體產生細胞，較佳為中國倉鼠卵巢細胞）。根據本發明，提供包含上述CH1區與CL區之抗體的抗原結合性片段。抗原結合性片段，可列舉例如Fab片段、Fab’片段、或者F（ab’）₂片段、或包含此等之片段。抗體或其抗原結合性片段亦可與其他蛋白質等進行融合。抗體或其抗原結合性片段亦可為多特異性（例如，雙特異性）。

根據本發明，提供包含Fab片段之嵌合抗原受體（CAR），所述Fab片段包含上述CH1區與CL區。CAR通常具有scFv作為抗原結合區域，但在本發明中，CAR能包含包含上述CH1區與CL區之Fab片段以取代scFv。在此等片段及CAR中，較佳為在CH1區與CL區間形成有異肽鍵。異肽鍵係在CAR產生時在細胞內形成，因此，可使具有Fab片段或Fab’片段之已穩定的CAR在細胞表面表現。在本發明中，可列舉表現上述CAR之細胞（例如，免疫細胞，例如，NK細胞、T細胞、巨噬細胞、嗜中性球等）。藉由使用Fab片段或Fab’片段，可較容易地獲得對於抗原的結合親和性強的CAR。

根據本發明，提供上述包含包含CH1區之重鏈與包含CL區之輕鏈之抗體、或其抗原結合性片段（例如，Fab片段及Fab’片段等）與細胞毒性劑的複合物（ADC）。此ADC較佳為在上述包含CH1區之重鏈與包含CL區之輕鏈之間形成異肽鍵，藉由，即使為暫時將分子間SS鍵結使用於與藥物的連結之情形，重鏈與輕鏈間的結合亦穩定。ADC的藥物抗體比能為1～8，例如4～8，較佳能為6～8，更佳能為8。在較佳態樣中，具有異肽鍵之ADC，能具有比不具有異肽鍵之ADC更高的穩定性及／或更高的細胞毒性。

根據本發明，提供上述包含包含CH1區之重鏈與包含CL區之輕鏈之抗體的抗原結合性片段（例如，Fab片段、Fab’片段、F（ab’）₂片段等）與細胞毒性劑的複合物（ADC）。在抗原結合性片段（例如，Fab片段、Fab’片段、F（ab’）₂片段等）與細胞毒性劑的複合物（ADC）中亦為同樣，CH1－CL間被由異肽鍵所致之共價鍵連結，藉此即使為暫時將分子間SS鍵結用於與藥物的連結之情形，重鏈與輕鏈間的結合亦穩定。因此，異肽鍵的導入能在ADC中特別有益。

根據本發明，提供肽（第一肽），其包含包含CH1區的181位的胺基酸之胺基酸序列，較佳為包含包含173位的胺基酸與181位的胺基酸之胺基酸序列。又，根據本發明，提供肽（第二肽），其包含包含CL區的133位的胺基酸與176位的胺基酸之胺基酸序列。此等肽，藉由在生理環境下共存而可自發性地在肽間形成異肽鍵。因此，在上述第一肽與第二肽間可形成穩定的結合。藉由將上述第一肽與第二肽作為標籤並各別與目標蛋白質融合，可使複數的目標蛋白質相互作用、藉由異肽鍵而連結。第一肽及第二肽各別能為5胺基酸長以上、10胺基酸長以上、15胺基酸長以上、20胺基酸長以上、30胺基酸長以上、40胺基酸長以上、50胺基酸長以上、60胺基酸長以上、70胺基酸長以上、80胺基酸長以上、90胺基酸長以上或者100胺基酸長以上、或CH1區或者CL1區的全長。根據本發明，肽能進一步包含重鏈可變區（VH）或輕鏈可變區（VL）。在較佳態樣中，該肽包含VH、CH1、VL及CL區，並具有對於抗原的結合性的全部或一部分。

各種的抗體的修飾為習知，但亦可將任意的抗體的修飾導入包含異肽鍵之抗體。例如，依循參照圖11之重鏈的EU編號，作為促進Fc異質二聚體（heterodimer）化之變異，可列舉第一鏈：354C及366W且第二鏈：349C、366S、368A及407V的變異組合；第一鏈：356K、357K及399K且第二鏈：370E、409D及439E的變異組合；第一鏈：364H及405A且第二鏈：349T及394F的變異組合；第一鏈：405L且第二鏈：409R的變異組合；第一鏈：350V、351Y、400E、405A及407V且第二鏈：350V、366L、390R、392M及394W的變異組合；以及第一鏈：351D及368E且第二鏈：351K及366K的變異組合等。作為增強效應子功能之變異，可列舉298A、333A及334A的變異組合；239D、330L及332E的變異組合；236A、239D及332E的變異組合；236A、330L及332E的變異組合；236A、239D、330L及332E的變異組合；243L、292P、300L、305I及396L的變異組合；235V、243L、292P、300L及396L的變異組合；以及第一鏈：234Y、235Q、236W、239M、268D、270E及298A且第二鏈：270E、326D、330M及334E的變異組合，作為增強CDC活性之變異，可列舉326W及333S的變異組合；345R、430G及440Y的變異組合；以及236A、267E、268F、324T及332E的變異組合，作為增強對於FcγRIIB之結合活性之變異，可列舉267E及328F的變異組合；以及233D、237D、238D、268D、271G及330R的變異組合，作為抑制效應子功能之變異，可列舉297A的單變異；297Q的單變異；297G的單變異；265A的單變異；234A、235A的變異組合（LALA變異）；235A、237A及318A的變異組合；234A及235A的變異組合；228P及235E的變異組合；236R及328R的變異組合；298G及299A的變異組合；234F、235E及331S的變異組合；268Q、309L、330S及331S的變異組合；233P、234V、235A、236缺失及267K的變異組合；234A、235A及329G的變異組合；234A、237A、238S、268A、309L、330S及331S的變異組合；以及234F、235E及265A的變異組合；以及此等的單變異及／或變異組合的組合，作為延長血中半衰期之變異，可列舉252Y、254T及256E的變異組合；250Q及428L的變異組合；433K及434F的變異組合；307A、380A及434A的變異組合；428L及434S的變異組合；308P的單變異；252Y、308P及434Y的變異組合；285D、307Q及378V的變異組合；以及309D、311H及434S的變異組合，但不受限於此等。

（包含異肽鍵之多肽的性能及進一步開發）異肽鍵因相較於雙硫鍵等其他形式的肽鏈間鍵結能更穩定且強力，故能對多肽賦予高溫、pH、高濃度及／或高滲透壓中之穩定性（例如，減少凝聚體形成）、對於由酵素等所導致之分解之抗性（例如，增大血漿半衰期）等有益的效果。多肽的穩定性，不僅在多肽的使用中，在多肽的生產中亦能為有利（例如，為了精製，可使用更嚴苛的條件）。多肽的高濃度穩定性，能以更小容量投予相同量的治療用多肽，因此能減輕患者的負擔。

異肽鍵因至少在a）及b）的不同胺基酸之間形成，故已形成異肽鍵之多肽具有非對稱的雜鏈。因此，在使不同分子締合而形成異質二聚體之情形中，可減少經常成為問題之目標締合體以外的締合體的形成。尤其，為了形成異肽鍵，能變得需要使成為配對之多肽鏈具有互相為特異性之結構，因此即使為包含a）或b）之複數種類的多肽鏈共存之情形，亦能有效率地生產目標締合體。利用此種優點，亦能有效率地生產由3個以上的多肽鏈所構成之締合體（三特異性抗體等）。為了抑制重鏈－輕鏈間的錯誤配對，已知在與本來的CH1－CL間雙硫鍵不同的部位導入新的雙硫鍵之DuetMAb技術，但有報導指出會產生副產物，所述副產物起因於與新導入之Cys殘基的雙硫鍵形成（Journal of Pharmaceutical Sciences 110 （2021） 2904－2915）。又，作為形成特定的配對的締合體之技術，有杵臼（knob hole），但本公開的使用異肽鍵之締合體，其配對間的結合力為強力，能在更緊密的區域形成締合體。例如，亦可在雙特異性抗體的2個重鏈的恆定區之間形成異肽鍵。

在一實施形態中，本公開的包含異肽鍵之多肽為包含至少2個（例如，2個、3個、4個、5個）異肽鍵之多肽分子。在一實施形態中，本公開的包含異肽鍵之多肽為至少3個（例如，3個、4個、5個、6個）不同的多肽分子被異肽鍵連結之多肽分子。在一實施形態中，本公開的包含異肽鍵之多肽為不同的多肽分子被異肽鍵連結之多肽分子，不同的多肽分子之中的1個係藉由至少2個（例如，2個、3個、4個、5個）異肽鍵而與別的不同的多肽分子結合。

在一實施形態中，使在天然中以單一分子的形式表現之蛋白質，藉由去除連接子區等而表現作為互相不同的多肽分子，藉由異肽鍵而可維持天然的蛋白質的立體結構。

習知的多肽中之雙硫鍵，有使多肽的結構穩定化之作用，在已去除雙硫鍵之情形中，被認為能使雙硫鍵形成部位中之多肽鏈彼此不會靠近，但發明人等意外地發現可導入異肽鍵以取代雙硫鍵。在一實施形態中，本公開的包含異肽鍵之多肽係以取代雙硫鍵之方式導入異肽鍵。例如，特定在習知的多肽的立體結構中形成雙硫鍵之2個半胱胺酸殘基，使此2個半胱胺酸殘基之中的至少一者缺失。於此，藉由去除雙硫鍵性的半胱胺酸殘基，而可防止藉由雙硫鍵（對稱性的反應為可能的）而形成目標以外的締合體。在習知的多肽中形成雙硫鍵之部分，被認為有或無伴護蛋白等輔助摺疊之蛋白質，且在雙硫鍵形成前靠近，因此藉由在雙硫鍵形成部位的附近導入a）及／或b），而能藉由與修飾前的多肽同樣的機制而促進a）及b）的鄰近。又，作為雙硫鍵的代替而導入異肽鍵，藉此能維持蛋白質的高次結構，並能維持功能。在一實施形態中，a）及／或b）被導入藉由雙硫鍵而互相接觸之2個區域間的界面區。在一實施形態中，a）及／或b）被導入雙硫鍵形成部位的附近（例如，雙硫鍵形成相關之半胱胺酸起5殘基以內、4殘基以內、3殘基以內、2殘基以內或1殘基以內存在之殘基）。

在一實施形態中，本公開的包含異肽鍵之多肽係在細胞內表現，藉由異肽鍵而互相連結之不同的多肽分子之中的至少1個係由導入基因表現。例如，提供表現嵌合抗原受體之CAR－T細胞，所述嵌合抗原受體包含Fab型抗體作為本公開的包含異肽鍵之多肽。

在一實施形態中，本公開的製作包含異肽鍵之多肽之方法，進一步製作二級修飾多肽，所述二級修飾多肽在修飾多肽與第三多肽鏈之間包含以下的式所表示之肽間連結，所述第三多肽鏈被包含在與修飾多肽不同的分子中：[化7]（式中，虛線表示往多肽骨架的鍵結），所述方法包含：建構包含修飾多肽及第三多肽鏈之二級中間體A的立體結構之步驟；特定在立體結構中之修飾多肽及第三多肽鏈互相鄰近之邊界區存在之胺基酸序列之步驟；使二級中間體A變異之步驟，其藉由將a）離胺酸、b）麩醯胺酸、麩胺酸、天冬醯胺酸或天冬胺酸以及c）麩胺酸或天冬胺酸之中的至少1個殘基導入二級中間體A而製備二級中間體B，於此，二級中間體B包含a）、b）及c），二級中間體B中之修飾多肽及第三多肽鏈各別在邊界區中包含a）及b）；以及藉由在二級中間體B中形成肽間連結而獲得二級修飾多肽之步驟。同樣地，藉由在第四多肽鏈、第五多肽鏈等之間設計肽間連結，而可製作更多的多肽鏈被異肽鍵連結之多肽。

若為本發明所屬技術領域中具有通常知識者，則可使用任意的系統而生產多肽鏈，所述多肽鏈形成本說明書所記載之包含異肽鍵之多肽。

已生產之多肽可藉由任意的精製方法而精製或單離。可列舉例如尺寸分餾（size fractionation）法、由使用硫酸銨或硫酸鈉之鹽析所進行之分餾法、PEG分餾法、乙醇分餾法、DEAE離子交換層析法、凝膠過濾法、蛋白質A／G親和力層析法等免疫球蛋白精製法。尤其，單株抗體為小鼠IgG之情形，能藉由使用蛋白質A結合載體或抗小鼠免疫球蛋白結合載體之親和力層析法而效率佳地進行精製。

（用途／使用）本公開的包含異肽鍵之多肽可使用於多肽的習知用途，例如，多肽為抗體之情形，可使用於抗原的檢測及／或抗原相關疾病的處置或預防。在一態樣中，本公開提供本公開的包含異肽鍵之多肽的用途。在一態樣中，本公開提供組合物，所述組合物包含本公開的包含異肽鍵之多肽。組合物可使用於多肽的習知用途。

（劑型等）本說明書所記載之組合物能以各種的形態提供。作為組合物的形態，例如亦可為注射劑、膠囊劑、錠劑、顆粒劑等。注射用的水溶液亦可保存於例如小瓶或不鏽鋼容器。又，注射用的水溶液亦可摻合例如生理食鹽水、糖（例如海藻糖）、NaCl或NaOH等。

在一實施形態中，本公開的組合物包含藥學上可容許的載體或者賦形劑。此種載體亦能為無菌液體例如水及油，包含石油、動物、植物或合成起源者，雖不受限但包含花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。經口投予醫藥之情形，水為較佳載體。靜脈內投予醫藥組合物之情形，生理食鹽水及水性葡萄糖為較佳載體。較佳為，將生理食鹽水溶液以及水性葡萄糖及甘油溶液使用作為能注射溶液的液體載體。適當的賦形劑包含輕質無水矽酸（light anhydrous silicic acid）、結晶纖維素、甘露醇、澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、小麥粉、白堊、矽膠、硬酯酸鈉、單硬脂酸甘油酯（glycerol monostearate）、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇、纖維素鈣（carmellose calcium）、纖維素鈉、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯縮醛二乙基胺基乙酸酯（polyvinyl acetal diethyl aminoacetate）、聚乙烯吡咯啶酮、明膠、中鏈脂肪酸三酸甘油酯、聚氧乙烯氫化蓖麻油60、白糖、羧甲基纖維素、玉米澱粉、無機鹽等。組合物在期望之情形亦能更含有少量的濕潤劑或乳化劑、或pH緩衝劑。此等組合物亦能為溶液、懸浮物、乳劑、錠劑、丸劑、膠囊、粉末、緩釋摻合物等的形式。傳統的結合劑及載體，亦能使用例如三酸甘油酯，摻合組合物作為栓劑。經口摻合物亦能包含醫藥等級的甘露醇、乳糖、澱粉、硬酯酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等標準載體。適當的載體的例子被記載於E.W.Martin, Remington’s Pharmaceutical Sciences（Mark Publishing Company, Easton, U.S.A）。此等以外，亦可包含例如界面活性劑、賦形劑、著色劑、香料、防腐劑、穩定劑、緩衝劑、懸浮液、等張化劑、結合劑、崩解劑、潤滑劑、流動性促進劑、矯味劑等。在一實施形態中，本公開的任意的液體組合物的pH能為約3、約3.5、約4、約4.5、約5、約5.5、約6、約6.5、約7、約7.5、約8、約8.5、約9、約9.5、約10、約10.5、約11或此等任意2個值之間的範圍。

本公開的組合物的任意的成分，可作為藥學上可容許的鹽而提供，例如能為：與源自鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等之遊離型的羧基一起形成之鹽；與源自異丙胺、三乙胺、2－乙基胺基乙醇、組胺酸、普羅卡因等者等的遊離型的胺基一起形成之鹽；以及與鈉、鉀、銨、鈣及氫氧化鐵一起形成之鹽。

在較佳的實施形態中，依循習知的方法，作為適應對於人的投予之醫藥組合物，可摻合組合物。此種組合物可藉由注射而投予。具代表性的是，用於注射投予的組合物為無菌等張水性緩衝劑中的溶液。需要之情形，組合物亦能亦包含助溶劑及緩和注射部位的疼痛之利多卡因等局部麻醉劑。一般而言，可將成分獨立地供給或在單位劑型中一起混合供給，例如可在顯示活化劑的量之安瓿或小袋（Sachet）等密封容器中，作為冷凍乾燥粉末或不含水的濃縮物而供給。欲藉由注入而投予組合物之情形，亦能使用含有無菌藥劑等級的水或生理食鹽水之注入瓶進行分配。欲藉由注射而投予組合物之情形，亦能在投予前，以能混合成分之方式，提供注射用的無菌水或生理食鹽水的安瓿。

將本公開的組合物適用於受驗體之情形，受驗體未被特別限定，能為哺乳動物（例如，小鼠、大鼠、倉鼠、兔、貓、狗、牛、綿羊、豬、猴、人等）、鳥類、爬蟲類、兩棲類、節肢動物、魚類等。

本公開的組合物及／或有效成分的量，能依據進行處置或預防之障礙或狀態的性質而變動，但本發明所屬技術領域中具有通常知識者能基於本說明書的記載並藉由標準的臨床技術而決定。依據情形，亦能使用活體外分析，輔助辨識最適當的投藥量範圍。又，欲使用於摻合物之正確用量，亦會依據投予路徑及疾病或障礙的嚴重性而變動，因此應依據主治醫生的判斷及各患者的狀況而決定。本公開的組合物及／或有效成分的投予量未被特別限定，但例如可為每1次0.00001、0.0001、0.001、1、5、10、15、100或1000mg／kg體重，亦可為其等任2個值的範圍內。投予間隔未被特別限定，但例如可每1、7、14、21或28日投予1或2次，亦可每任2個值的範圍投予1或2次。投予量、投予間隔、投予方法亦可依據患者的年齡、體重、症狀、對象內臟等而適當選擇。

本說明書所記載之組合物的投予路徑，例如可為靜脈內、皮內、皮下、肌肉內、腹腔內、鼻內、硬膜外或經口投予等。在一實施形態中，可同時使用本公開的組合物、各種的輸送（傳遞）系統。此種系統例如有：脂質體、微粒及微膠囊中的封裝（encapsulation）：受體媒介之胞吞作用的使用；作為反轉錄病毒載體或其他載體的一部分的療法核酸的建構等。亦能藉由合適的路徑的任一者，例如藉由注入、藉由推注（bolus）注射、藉由通過上皮或皮膚黏膜內襯（lining）（例如口腔、直腸及腸黏膜等）之吸收而投予醫藥，亦能因應需要使用霧化劑（aerosolizing agent）並使用吸入器或噴霧器，然後與其他藥劑一起投予。投予亦能為全身性或局部。

本公開的組合物可作為套組而提供。在一實施形態中，本公開提供藥包或套組，其包含1以上的容器，所述容器已填充能添加至本公開的組合物之1以上的成分。依據情形，亦能在此種容器附上資訊，所述資訊係以規制醫藥或生物學產品的製造、使用或販售之政府機關所規定之形式表示由政府機關所訂定之用於人投予的製造、使用或販售的認可。

作為本公開的組合物的醫藥等的製劑化流程，在該領域中為習知，例如，記載於日本藥典（The Japanese Pharmacopoeia）、美國藥典、其他國的藥典等。因此，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，若有本說明書的記載，則可不進行過度實驗地決定應使用的量等實施形態。

本公開的抗體具有用於導入異肽鍵的鏈內的變異（例如，如同上述所說明之胺基酸的取代變異），但只要不明顯地抑制或喪失抗體功能（例如，期待之抗體功能），則亦可進一步具有該變異以外的各種的變異。變異能因應目的而選擇並導入適當者，但因變異會產生提高抗體的抗原性的可能性，故期望為最小限度。例如，作為能進一步導入抗體之變異，可列舉例如用於降低對於Fcγ受體的結合能力（對於FcγI、FcγIIA、FcγIIB、FcγIIIA及FcγIIIB中任一Fcγ受體之結合腦）的變異（亦即，緘默Fc變異）、用於抑制或缺失醣基化的對於297或299位的胺基酸的變異、用於改善C端的異質性的變異（例如，G446及／或K447的缺失）等。

抗體為雙特異性抗體之情形中，雖未被特別限定，但亦可導入例如用於異質Fc締合的變異（例如，杵－臼（knobs－into－holes）變異等）、用於CH／CL界面控制的變異、用於降低對於蛋白質A的結合性的變異。

在具有2個Fab型臂之雙特異性抗體中，可在其中一者的Fab型臂所具有之CH1－CL間形成異肽鍵。藉此，能促進正確的重鏈與輕鏈之間的複合體形成。

在本說明書中，「或」被使用於可採用文章中所列舉之事項的「至少1個以上」時。「或者」亦同樣。在本說明書中，明確記載為「2個值」的「範圍內」之情形，在其範圍中亦包含2個值本身。

在本說明書中所引用之科學文獻、專利、專利申請等參考文獻，其整體係與各具體記載者相同程度地作為參考而援用至本說明書中。

以上，為了容易理解本公開而揭示並說明較佳的實施形態。以下，基於實施例而說明本公開，但上述的說明及以下的實施例僅被提供作為示例的目的，並非提供作為限定本公開的目的。因此，本公開的範圍不受限於本說明書具體記載之實施形態及實施例，僅受限於申請專利範圍。

[實施例]試劑類，具體而言，使用實施例中所記載之產品，但亦能代替使用其他製造商（Sigma－Aldrich、和光純藥、Nacalai、R&D Systems、USCN Life Science INC等）的同等品。

（實施例1：異肽鍵形成淬斯妥擬單抗IgG的設計）嘗試在抗體的重鏈－輕鏈間形成異肽鍵。作為起始蛋白質，使用抗HER2抗體h4D5（淬斯妥擬單抗）。

下載登錄於Protein Data Bank（https://www.rcsb.org/）之淬斯妥擬單抗Fab－HER2複合體晶體結構（PDB ID：1N8Z）的座標資料，使用PyMOL（https://pymol.org/2/）建構立體結構。

基於由上述所建構之立體結構，特定重鏈的恆定區與輕鏈的恆定區鄰近之區，在此區導入天冬醯胺酸及離胺酸。在isoCH1導入天冬醯胺酸，在isoCL導入離胺酸。接著，以已導入之天冬醯胺酸及離胺酸的側鏈的周邊成為疏水性環境之方式導入疏水性胺基酸。又，將雙硫鍵的形成相關之半胱胺酸取代成絲胺酸。於此，將適當序列資料作為基礎，藉由SWISS－MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）而建構同源建模，使用Coot（https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/）製作已導入異肽鍵之結構模型。

其結果，設計以下所示之序列。此外，在本實施例中，有時將已為了異肽鍵形成而修飾之多肽稱為「iso－」或「iSo－」（isoCH1、iSoMAb等）。此外，所謂MAb，意指單株抗體。[化8]

將已導入上述變異後的抗體的結構藉由再計算而進行建構，結果異肽鍵形成相關之天冬醯胺酸、離胺酸及麩胺酸的側鏈係如圖1所示般被配置。又，將再計算異肽鍵形成後的立體結構之結果揭示於圖2。

（實施例2：異肽鍵形成淬斯妥擬單抗IgG的製作與結合活性的評價）製作如上述般設計之多肽並進行評價。

（isoCH1及isoCL的iSoMAb的製作）．h4D5 iSoMAb IgG表現載體的製作委託Eurofins Genomics公司合成變異型CH1（isoCH1）及CL（isoCL）基因。藉由重疊延伸PCR而連結isoCH1基因與鉸鏈－Fc基因，藉由限制酵素Nhe I及Not I而消化。插入已預先藉由相同酵素而消化之包含h4D5VH基因之pCAGEN，製作表現載體pCA h4D5 isoHC。又，藉由重疊延伸PCR而連結h4D5VL基因與isoCL基因，藉由限制酵素Eco RI及Not I而消化。插入已預先藉由相同酵素而消化之pCAGEN，製作表現載體pCA h4D5 isoLC。

．h4D5 iSoMAb IgG的表現將Expi293F細胞（Gibco，Thermo Fisher Scientific）使用作為宿主細胞。在37℃、5% CO2、125rpm條件下，使用包含2mM的L－丙胺醯基－L－麩醯胺酸之HE200培養基（Gmep），培養Expi293F細胞。將7.5×107個細胞藉由1,500rpm、5分鐘的離心操作而回收，藉由27mL的包含5mM的L－丙胺醯基－L－麩醯胺酸之HE400培養基（Gmep）而懸浮。在1.5mL的Opti－MEM培養基（Gibco）中添加30μg的質體（15μg的pCA h4D5 isoHC及15μg的pCA h4D5 isoLC）並進行混合。又，在1.5mL的Opti－MEM培養基中添加120μL的PEI MAX（1mg／mL；Polysciences）並進行混合，在室溫靜置5分鐘。將質體稀釋液與PEI稀釋液進行混合後，在室溫靜置20分鐘，將此作為轉染溶液。對藉由HE400培養基而懸浮之Expi293F細胞添加轉染溶液並進行培養。20小時後，添加75μL的0.5M偉伯益酸鈉（sodium valproate）、120μL的1M丙酸鈉及750μL的20%（w／v）胰化蛋白，再培養6日。

．h4D5 iSoMAb IgG的精製藉由4℃、6,000rpm、10分鐘的離心操作而從培養上清液去除細胞。使用孔尺寸0.45μm的過濾器（Membrane Solutions）過濾培養上清液，添加至已預先以磷酸緩衝液（PBS）進行平衡化之蛋白質A管柱（管柱體積250μL；Bipo Resin Protein A； Protein Express）。以10mL的PBS進行清洗後，藉由100mM甘胺酸－HCl（pH2.5）而溶出目標抗體。每次200μL地進行回收，藉由已預先添加至試管之10μL的100mM Tris－HCl（pH9.0）而進行中和。將各組分（fraction）藉由SDS－PAGE而進行分析，將包含目標抗體之組分透析至PBS。藉由分光光度計（NanoPhotometer NP80；Implen）而測量280nm的吸光度，作為背景值，減去320nm的吸光度，將目標抗體進行定量。作為吸光係數195400M－1．cm－1／四量體而計算。再將精製抗體藉由西方印漬術而進行分析。作為檢測抗體，使用HRP標識抗人Fc抗體（Sigma）及HRP標識抗人κ鏈抗體（Sigma）。

將結果揭示於圖3。雙硫鍵因被還原剪切，故在野生型h4D5 IgG中未形成重鏈與輕鏈的締合體。另一方面，在h4D5 iSoMAb中，在重鏈與輕鏈的締合體的目標分子量的部分確認到帶，認為在重鏈與輕鏈之間形成有異肽鍵。

．對於HER2陽性細胞之結合活性的評價藉由流動式細胞測量術而評價對於為HER2陽性之人乳癌細胞株SKBR－3之結合活性。將在37℃、5% CO2條件下藉由10% FBS／D－MEM培養基（Wako）而培養之SKBR－3，使用胰蛋白酶／EDTA（0.25%（w／v）胰蛋白酶－1mM EDTA．4Na；Gibco）從培養皿剝離。藉由室溫、1,000rpm、5分鐘的離心操作而回收細胞，在試管中分注5×105個細胞。以0.1% NaN3／PBS進行清洗，作為一級抗體，使最終濃度500nM的h4D5 iSoMAb IgG在冰中進行反應30分鐘。同樣地清洗後，作為二級抗體，添加1μL的抗人IgG（Fc特異性）－FITC抗體（2mg／mL；Sigma）及499μL的0.1% NaN3／PBS，在冰中進行反應30分鐘。再次清洗，以500μL的0.1% NaN3／PBS將細胞懸浮。以尼龍過濾器進行過濾後，分注至塑膠管，使用流式細胞儀（Accuri C6；BD Biosciences）進行分析。

將結果揭示於圖4。發現iSoMAb係與原本的抗體同樣地具有HER2結合能力。

（實施例3：Fab型式的異肽鍵形成抗體的製作）基於由上述所製作之iSoMAb，製作Fab型式的抗體片段並進行評價。

．h4D5 iSoMAb Fab重鏈表現載體的製作將已合成之isoCH1基因作為模板，藉由PCR而在CH1區的C端側附加組胺酸標籤序列。將PCR產物藉由限制酵素Nhe I及Not I而進行消化。插入已預先藉由相同酵素而消化之包含h4D5VH基因之pCAGEN，製作表現載體pCA h4D5VH－isoCH1。

．h4D5 iSoMAb Fab的表現使用與上述同樣的方法，使h4D5 iSoMAb Fab表現。作為進行基因轉移之質體，使用pCA h4D5VH－isoCH1及pCA h4D5 isoLC。

．h4D5 iSoMAb Fab的精製藉由4℃、6,000rpm、10分鐘的離心操作而從培養上清液去除細胞。使用孔尺寸0.45μm的過濾器（Membrane Solutions）過濾培養上清液，添加至已預先以20mM磷酸鈉／500mM NaCl（pH7.4）進行平衡化之Ni Sepharose excel（管柱體積500μL；Cytiva）。藉由10mL的包含30mM咪唑之20mM磷酸鈉／500mM NaCl（pH7.4）而進行清洗後，藉由包含500mM咪唑之20mM磷酸鈉／500mM NaCl（pH7.4）而溶出目標抗體。每次200μL地進行回收後，將各組分藉由SDS－PAGE而進行分析，將包含目標抗體之組分透析至PBS。藉由分光光度計（NanoPhotometer NP80）而測量280nm的吸光度，作為背景值，減去320nm的吸光度，將目標抗體進行定量。作為吸光係數64900M－1．cm－1／二聚體而計算。

將結果揭示於圖5。雙硫鍵因被還原剪切，故在野生型h4D5 Fab中未形成重鏈與輕鏈的締合體。另一方面，在h4D5 iSoMAb Fab中，在重鏈與輕鏈的締合體的目標分子量的部分確認到帶，認為在重鏈與輕鏈之間形成有異肽鍵。

．由示差掃瞄螢光法所進行之熱穩定性的評價對於0.1mg／mL的抗體溶液70μL，添加17.5μL的已50倍稀釋之螢光色素（SYPRO（註冊商標）dye，protein gel stain；Merck）並進行混合。將其抗體－色素混合溶液各25μL地分注至PCR用48孔盤的3孔。使用即時PCR（Real－Time PCR）裝置，以約40分鐘從25℃升溫至99℃為止，測量螢光強度。又，為了研究在還原條件下之熱穩定性，對抗體溶液添加最終濃度1mM的TCEP（參（2－羧乙基）膦），在冰上靜置3小時後，同樣地進行測量。

將結果揭示於圖6及以下的表。相較於h4D5 Fab，h4D5 iSoMAb Fab被觀察到些微的熱穩定性的降低，但並非會妨礙精製或在活體內的使用的程度的熱穩定性的降低。又，h4D5 iSoMAb Fab係與h4D5 Fab不同，在還原條件下（TCEP存在下）未見到穩定性的降低，確認到異肽鍵對於在還原條件下的剪切具有抗性。[表2]

（實施例4：異肽鍵形成抗CD63抗體的設計）與上述的基於抗HER2抗體h4D5的例子同樣地，基於抗CD63抗體（Monoclon. Antib. Immunodiagn. Immunother. 39,74－76（2020）所記載之No.2的殖株），嘗試製作重鏈－輕鏈間藉由異肽鍵而結合之修飾抗體。

與實施例1同樣地建構立體模型，基於其而設計以下的序列。在isoCH1v1中導入天冬醯胺酸，在isoCLv1中導入離胺酸。相反地，在isoCH1v2中導入離胺酸，在isoCLv2中導入天冬醯胺酸。接著，將麩胺酸以其側鏈與已導入之天冬醯胺酸及離胺酸的側鏈鄰近之方式進行導入。[化9]

立體結構中之a）、b）、c）及疏水性變異殘基的原子間的位置關係如下。[表3]

．hCD63 iSoMAb IgG表現載體的製作委託Eurofins Genomics公司合成包含變異型CH1（isoCH1）之IgG及CL（isoCL）基因。將已合成之基因藉由無縫選殖（seamless cloning）而各插入至pCEC4.3W，製作pCEC4.3W－isoCH1vC（Afl II）或pCEC4.3W－isoCLvC（BsrG I）。將此載體藉由限制酵素Afl II或BsrG I而進行消化，將已人源化之hCD63抗體基因的重鏈、輕鏈各別藉由無縫選殖（seamless cloning）而插入，製作表現載體pCEC4.3W－isoCH1vC hCD63 H1及pCEC4.3W－isoCLvC hCD63 K1。

．hCD63 iSoMAb IgG的表現將ExpiCHO－S細胞（Gibco，Thermo Fisher Scientific）使用作為宿主細胞。在37℃、5%CO2、125rpm條件下，使用ExpiCHO Expression Medium（Gibco，Thermo Fisher Scientific）培養ExpiCHO－S細胞。培養方法、轉染方法係依循ExpiCHO Expression System（Gibco，Thermo Fisher Scientific）的實驗室指南（protocol）。將18.0×107個細胞藉由300xg、5分鐘的離心操作而進行回收，藉由30mL的ExpiCHO Expression Medium而懸浮。在1.2mL的OptiPRO SFM Complexation Medium（Gibco，Thermo Fisher Scientific）中添加24μg的質體（12μg的pCEC4.3W－isoCH1vC hCD63 H1及12μg的pCEC4.3W－isoCLvC hCD63 K1）並進行混合。又，在1.104mL的OptiPRO SFM Complexation Medium中添加96μL的ExpiFectamine CHO Reagent（Gibco，Thermo Fisher Scientific）並進行混合，將質體稀釋液與ExpiFectamine（註冊商標）CHO Reagent稀釋液進行混合後，在室溫靜置5分鐘，將此作為轉染溶液。對已藉由ExpiCHO Expression Medium而懸浮之CHO－S細胞添加轉染溶液並進行培養。18小時後，添加180μL的ExpiFectamine（註冊商標）CHO Enhancer及7.2mL的ExpiCHO（註冊商標）Feed，再培養12日。

．hCD63 iSoMAb IgG的精製藉由4℃、12,000xg、10分鐘的離心操作而從培養上清液去除細胞。使用孔尺寸0.45μm的過濾器（GVS）過濾培養上清液，添加至已以蛋白質A瓊脂糖（Protein A Sepharose）1.0mL進行過濾之上清液，所述蛋白質A瓊脂糖已預先以PBS緩衝液（PBS）進行平衡化。一邊在4℃攪拌一晩一邊使其反應後，將所有凝膠添加至管柱。30mL的PBS清洗後，藉由0.1M檸檬酸溶出液（pH3.0）而溶出目標抗體。每次1.0mL地進行回收，將各組分藉由SDS－PAGE而進行分析，將包含目標抗體之組分使用Pierce（註冊商標）Protein Concentrators PES、10K MWCO、2～6ml，將溶劑取代成PBS。藉由分光光度計（Eppendorf BioPhotometer plus）而測量280nm的吸光度，作為背景值，減去340nm的吸光度，將目標抗體進行定量。之後使用Pierce（註冊商標）BCA Protein Assay Kits求取更正確的濃度。

．對於hCD63陽性細胞之結合活性的評價藉由流動式細胞測量術而評價對於為hCD63陽性之源自人胎兒腎臟的細胞株293株之結合活性。將在37℃、5% CO2、125rpm條件下藉由Expi293 Expression Medium（Gibco，Thermo Fisher Scientific）而培養之Expi293F細胞，藉由室溫300xg、5分鐘的離心操作而回收細胞，在試管中分注5×105個細胞。以0.2% BSA／PBS進行清洗，作為一級抗體，使最終濃度2μg／mL的hCD63 iSoMAb IgG在4℃反應60分鐘。同樣地清洗後，作為二級抗體，使最終濃度0.5μg／mL的山羊F（ab’）2抗人IgG－Fc（PE）、pre－adsorbed（ab98596， Abcam）在4℃反應30分鐘。再次清洗，以200μL的0.2% BSA／PBS將細胞懸浮。分注至塑膠管，使用流式細胞儀（FACS Verse；BD Biosciences）進行分析。

凝膠電泳的結果（圖7），在還原條件下，在iSoMAb的重鏈與輕鏈的締合體的目標分子量的部分確認到帶，認為在重鏈與輕鏈之間形成有異肽鍵（道3、4）。又，iSoMAb亦被確認到在Expi293F細胞中之表現（道5、6）。再者，由流動式細胞測量術的結果（圖8）亦確認到兩種類的iSoMAb的雙方維持對於CD63表現細胞（293株）的結合性。亦即，在重鏈186位的胺基酸與輕鏈176位的胺基酸的任一者為離胺酸且另一者為天冬醯胺酸之情形中，在此等胺基酸間已形成異肽鍵。

（實施例5：包含異肽鍵之雙特異性抗體的製作）嘗試製作包含1個異肽鍵之雙特異性抗體。將已建構之雙特異性抗體的結構的概要揭示於圖9。此為包含h4D5（抗HER2）及U1－59（抗HER3）的可變區之雙特異性抗體，h4D5為以依循實施例1～2形成異肽鍵之方式進行修飾者。

．h4D5xU1－59 iSoMAb雙特異性IgG表現載體的製作藉由重疊延伸PCR而連結isoCH1基因與鉸鏈－Fc（knob）基因，藉由限制酵素Nhe I及Not I而進行消化。插入已預先藉由相同酵素而消化之包含h4D5VH基因之pCAGEN，製作表現載體pCA h4D5 isoHC（knob）。接著，委託Eurofins Genomics公司合成U1－59VH及VL基因。將包含U1－59VH基因之質體藉由限制酵素Afl II及Nhe I而進行消化後，插入已預先藉由相同酵素而消化之包含CH1－Fc（hole）基因之pCAGEN，製作表現載體pCA U1－59 HC（hole）。又，藉由重疊延伸PCR而連結U1－59VL基因與CL基因，藉由限制酵素Eco RI及Not I而進行消化。插入已預先藉由相同酵素而消化之pCAGEN，製作表現載體pCA U1－59 LC。

．h4D5xU1－59 iSoMAb雙特異性IgG表現載體的表現將Expi293F細胞（Gibco，Thermo Fisher Scientific）使用作為宿主細胞。在37℃、5% CO2、125rpm條件下，使用包含2mM的L－丙胺醯基－L－麩醯胺酸之HE200培養基（Gmep），培養Expi293F細胞。將7.5×10⁷個細胞藉由1,500rpm、5分鐘的離心操作而進行回收，藉由27mL的包含5mM的L－丙胺醯基－L－麩醯胺酸之HE400培養基（Gmep）而進行懸浮。在1.5mL的Opti－MEM培養基（Gibco）中添加30μg的質體（7.5μg的pCA h4D5 isoHC（knob）、7.5μg的pCA U1－59 HC（hole）、7.5μg的pCA h4D5 isoLC及7.5μg的pCA U1－59 LC並進行混合。又，在1.5mL的Opti－MEM培養基中添加120μL的PEI MAX（1mg／mL；Polysciences）並進行混合，在室溫靜置5分鐘。將質體稀釋液與PEI稀釋液進行混合後，在室溫靜置20分鐘，將此作為轉染溶液。對已藉由HE400培養基而懸浮之Expi293F細胞添加轉染溶液並進行培養。20小時後，添加75μL的0.5M偉伯益酸鈉、120μL的1M丙酸鈉及750μL的20%（w／v）胰化蛋白，再培養6日。

．h4D5xU1－59 iSoMAb雙特異性IgG的精製藉由4℃、6,000rpm、10分鐘的離心操作而從培養上清液去除細胞。使用孔尺寸0.45μm的過濾器（Membrane Solutions）過濾培養上清液，添加至已預先以磷酸緩衝液（PBS）進行平衡化之蛋白質A管柱（管柱體積250μL；Bipo Resin Protein A； Protein Express）。以10mL的PBS進行清洗後，藉由100mM甘胺酸－HCl（pH2.5）而溶出目標抗體。每次200μL地進行回收，藉由已預先添加至試管之10μL的100mM Tris－HCl（pH9.0）而進行中和。將各組分藉由SDS－PAGE而進行分析，將包含目標抗體之組分透析至PBS。藉由分光光度計（NanoPhotometer NP80； Implen）而測量280nm的吸光度，作為背景值，減去320nm的吸光度，將目標抗體進行定量。作為吸光係數220500 M－1cm－1／四量體而計算。

．由三明治ELISA法所進行之雙特異性的評價在96孔EIA／RIA盤（Corning）中，各50μL地添加10μg／mL的HER2－ECD－人Fc，在37℃靜置30分鐘。去除溶液後，各200μL地添加包含0.05%（v／v）Tween（註冊商標）20之PBS（PBST），清洗3次。作為阻斷緩衝液，各100μL地添加包含1%（w／v）BSA之PBST。在37℃靜置1小時後，去除阻斷緩衝液，各200μL地添加PBST，清洗3次。各50μL地添加已藉由包含1%（w／v）BSA之PBST進行稀釋之各濃度的雙特異性抗體溶液，在37℃靜置30分鐘。去除抗體溶液後，各200μL地添加PBST，清洗3次。各50μL地添加10μg／mL的HER3－ECD－小鼠Fc。在37℃靜置30分鐘後，去除溶液，各200μL地添加PBST，清洗3次。作為檢測抗體，各50μL地添加0.25μg／mL的抗IgG（H＋L）， Mouse， Goat－Poly， HRP（SeraCare Life Sciences， Inc.），在37℃靜置30分鐘。去除抗體溶液後，各200μL地添加PBST，清洗3次。各50μL地添加發色基質溶液[10mg／mL TMB 50μL、3% H2O2 4μL、基質溶液A（50mM Na₂HPO₄．12H₂O、25mM 檸檬酸、pH5.5）5mL]，靜置15分鐘後，各50μL地添加反應停止液（1N H₂SO₄）。使用盤式儀（plate reader）Infinite 200 PRO（TECAN），測量450nm中之吸光度。

將結果揭示於圖10。在單結合性的h4D5 IgG及U1－59 IgG未觀察到發色，相對於此，在h4D5xU1－59 iSoMAb雙特異性IgG中觀察到明顯的發色。由此可知，包含異肽鍵之抗體能適用於雙特異性抗體的型式。認為在雙特異性抗體的雙方的抗原結合部位亦可各別同樣地建構包含異肽鍵之雙特異性抗體等。此外，於此，以有效率地獲得目標的雙特異性抗體之方式，採用用於在特異性的抗體的重鏈間促進配對形成的杵臼結構，但此杵臼結構亦可被本公開的異肽鍵取代。

（實施例6：無疏水性變異的修飾體的製作）製作僅導入上述的isoCH1v1、isoCLv2、isoCLv1及isoCH1v2中之K、N及E的變異之多肽。其結果，預測會確認異肽鍵的形成。

（實施例7：包含異肽鍵之各種的型式的抗體的製作）以上述的已導入異肽鍵形成變異之序列為基礎，製作Fab、Fab’或F（ab’）₂型式的抗體。在此等不同型式中，亦依然預測會形成異肽鍵。

（實施例8：異肽鍵形成抗CD63抗體的細胞毒性活性的測量）．抗體藥物複合體（複合物）的製作依循實施例4所記載之方法，製備抗hCD63 iSoMAbv1（重鏈具有序列識別號45，輕鏈具有序列識別號46）與不具有變異的抗hCD63 WT（野生型）MAb（重鏈具有序列識別號43，輕鏈具有序列識別號44）。對各IgG（1mg／mL）添加最終濃度100μM的TCEP（參（2－羧乙基）膦）並進行混合後，在37℃靜置2小時。將此反應液在室溫靜置30分鐘後，添加最終濃度100μM的VcMMAE（MedChemExpress），在室溫靜置30分鐘。接著，添加最終濃度1mM的NAC（N－乙醯半胱胺酸），在冰中靜置30分鐘，停止反應後，透析至PBS（－）而製作抗體藥物複合體。利用UV吸收法測量所得到之抗體藥物複合體的藥物抗體比，結果抗hCD63 WT MAb－VcMMAE及抗hCD63 iSoMAbv1－MMAE的藥物抗體比皆為約4。

．細胞毒性活性的測量將人胰臟癌細胞株SUIT－2以每1孔4x10³細胞播種至96孔盤，隔天，添加最終濃度0.1～3μg／mL的抗體藥物複合體，在CO2培養箱內以37℃培養96小時。在陰性對照中，添加同量的培養基，同樣地培養96小時。培養後，作為陽性對照，添加最終濃度0.1%Tween20，在CO₂培養箱內靜置30分鐘。接著，將Cell Counting Kit－8（Dojindo）添加至各孔，在CO₂培養箱內靜置1小時後，使用盤式儀測量450nm中之吸光度。依循以下的式而計算細胞毒性活性（%）。細胞毒性活性（%）＝（（陰性對照的吸光度－抗體藥物複合體的吸光度）／（陰性對照的吸光度－陽性對照的吸光度））×100將結果揭示於圖13。在抗體藥物複合體濃度1及3μg／mL中，抗hCD63 iSoMAbv1－MMAE顯示有意義地比抗hCD63 WT MAb－VcMMAE高的細胞毒性活性。

（實施例9：異肽鍵形成抗CD63抗體Fab型式的細胞毒性活性的測量）．抗體藥物複合體的製作基於由實施例8所製作之抗hCD63 iSoMAbv1，製作Fab型式抗體片段（重鏈片段具有序列識別號49，輕鏈片段具有序列識別號50）的抗體藥物複合體。對照係設為抗hCD63 WT Fab（重鏈具有序列識別號47，輕鏈具有序列識別號48）的抗體藥物複合體。利用UV吸收法測量所得到之抗體藥物複合體的藥物抗體比，結果抗hCD63 WT Fab－VcMMAE及抗hCD63 iSoMAbv1 Fab－MMAE的藥物抗體比皆為約1。

．細胞毒性活性的測量依循實施例8所記載之方法，測量Fab型式抗體片段的抗體藥物複合體的細胞毒性活性。

將結果揭示於圖14。在抗體藥物複合體濃度1及3μg／mL中，抗hCD63 iSoMAbv1 Fab－MMAE顯示有意義地比抗hCD63 WT Fab－VcMMAE高的細胞毒性活性。

（實施例10：異肽鍵形成淬斯妥擬單抗IgG的小鼠血中濃度的測量）將由實施例2所製作隻異肽鍵形成淬斯妥擬單抗IgG（h4D5 iSoMAb）（重鏈具有序列識別號53，輕鏈具有序列識別號54）與未形成異肽鍵的WT（野生型）淬斯妥擬單抗IgG（h4D5 WT MAb）（重鏈具有序列識別號51，輕鏈具有序列識別號52）投予至小鼠，經時地採取血液，測量最高血中濃度與血中半衰期。

．投予與血漿的製備對5週齡雄ICR小鼠5隻以10mg／kg腹腔內投予IgG的PBS溶液（1mg／mL）。投予1小時後，在1日後、2日後、3日後、7日後、10日後、15日後，各別從尾靜脈採取血液。採取到之血液係以3,500rpm、4℃、15分鐘進行離心分離，製備血漿，立刻保存於－30℃。

．小鼠血漿中的人IgG濃度的測量小鼠血漿中的人IgG濃度係使用Human IgG ELISA Kit（Assaypro）進行測量。

將結果揭示於圖15。最高血中濃度，h4D5 WT MAb為107.8±10.6μg／mL（1日後），h4D5 iSoMAb為102.0±10.8μg／mL（2日後），為幾乎同程度。另一方面，血中半衰期，h4D5 WT MAb為6.3±4.1日，h4D5 iSoMAb為8.2±3.7日，h4D5 iSoMAb的血中半衰期比h4D5 WT MAb長。

（實施例11：異肽鍵形成抗CD63抗體Fab型式對於抗原陽性細胞之結合的測量）．hCD63 iSoMAb Fab的表現使用與實施例4同樣的方法，使hCD63 iSoMAb Fab（重鏈片段具有序列識別號57，輕鏈具有序列識別號58）表現。作為進行基因轉移之質體，使用pCEC4.3W－iSoMAb Fab hCD63 H1及pCEC4.3W－isoCLvC hCD63 K1。

．hCD63 iSoMAb Fab的精製藉由4℃、12,000xg、10分鐘的離心操作而從培養上清液去除細胞。使用孔尺寸0.45μm的過濾器（GVS）過濾培養上清液，添加至已預先以PBS進行平衡化之KanCapG（管柱體積1.0mL；KANEKA）。藉由PBS而進行清洗後，藉由0.1M Glycine－HCl（pH2.5）而溶出目標抗體，以1M Tris－HCl（pH8）進行中和。將清洗組分（5mL）與溶出組分（各1mL）在SDS－PAGE後進行CBB染色並分析，將包含目標抗體之組分，使用Pierce^TMProtein Concentrators PES，10K MWCO，2－6ml，將溶劑取代成PBS。藉由分光光度計（Eppendorf BioPhotometer plus）而測量280nm的吸光度，作為背景值，減去340nm的吸光度，將目標抗體進行定量。之後，使用Pierce^TMBCA Protein Assay Kit，求取更正確的濃度。針對hCD63 WT（野生型）Fab（重鏈片段具有序列識別號55，輕鏈具有序列識別號56）亦同樣地製備精製抗體。

．對於hCD63陽性細胞之結合活性的評價藉由流動式細胞測量術而評價對於為hCD63陽性之源自人胎兒的腎臟的細胞株293株之結合活性。將在37℃、5%CO₂、125rpm條件下藉由Expi293 Expression Medium（Gibco，Thermo Fisher Scientific）進行培養之Expi293F細胞，藉由室溫300xg、5分鐘的離心操作而回收細胞，以0.2%BSA／PBS進行清洗，在試管中分注5×10⁵個細胞。作為一級抗體，使最終濃度2μg／mL的hCD63 iSoMAb Fab在4℃反應60分鐘。同樣地清洗後，作為二級抗體，使最終濃度12.5μg／mL的小鼠二抗人IgKappa（PE）、（TB28－2，BD Biosciences）在4℃反應30分鐘。再次清洗，以200μL的0.2% BSA／PBS將細胞懸浮。分注至塑膠管，使用流式細胞儀（FACS Verse；BD Biosciences）進行分析。

將結果揭示於圖16。hCD63 iSoMAb Fab與hCD63 WT（野生型）Fab對於抗原陽性細胞之結合為同等。

（實施例12：h4D5 iSoMAbv1變異體的異肽鍵形成的分析）．h4D5 iSoMAb變異體表現質體的製作為了研究由重鏈的173位、181位、183位及輕鏈的131位、133位、162位、176位、178位、180位的胺基酸變異（尤其，表4～6所示之胺基酸變異）所致之對於異肽鍵形成的影響，委託Eurofins Genomics公司，基於h4D5 iSoMAb重鏈（序列識別號53）及輕鏈（序列識別號54）的表現質體，依循表4～6，製作已取代重鏈的173位、181位、183位及輕鏈的131位、133位、162位、176位、178位、180位的任一胺基酸之變異體表現質體。h4D5 iSoMAb重鏈mut1～mut4各別具有序列識別號59～62，h4D5 iSoMAb輕鏈mut1～mut15各別具有序列識別號63～77。

[表4][表5][表6]

．h4D5 iSoMAb變異體的表現將HEK293T細胞使用作為宿主細胞。培養全部在37℃、5%CO₂的條件下進行。首先，使用96孔盤，在包含10%FBS之DMEM中培養HEK293T細胞。成為80～90%滿度（confluence）後，進行轉染。轉染之際，事先在不包含FBS的DMEM 1100μL中混合10 mg／ml聚乙亞胺溶液2μL，各13μL地分注至96孔，混合質體0.12 μg（重鏈：0.065μg，輕鏈：0.065μg，組合係依循表7）。

[表7]

靜置20分鐘後，添加至包含2%FBS之DMEM 200μL，將此作為轉染溶液。從已播種細胞之96孔盤去除培養基後，在各孔中各注入200μL的轉染溶液，培養8日。回收培養上清液，藉由SDS－聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS－PAGE）與使用抗人Fc抗體（A0170，SIGMA－ALDRICH）之西方印漬術而研究表現。又，使用ImageJ計算帶強度，估算異肽鍵的形成比例。依循以下的式，計算形成比例（%）。

形成比例（%）＝（（重鏈與輕鏈已交聯之帶的強度）／（重鏈與輕鏈已交聯之多肽的帶強度＋重鏈的帶強度））×100

將結果揭示於表8。在已將重鏈183位、輕鏈133位、輕鏈176位各別取代成天冬醯胺酸、麩胺酸、離胺酸之變異體（變異體3－15）中，檢測到重鏈與輕鏈已藉由異肽鍵而交聯之多肽。

[表8]

（實施例13：h4D5 iSoMAbv1變異體的製備）．h4D5 iSoMAb變異體的表現與精製使用由實施例12所製作之變異體表現質體，藉由與實施例2同樣的方法而使其表現，從培養上清液藉由蛋白質A管柱而進行精製。針對精製抗體，藉由在還原條件下之SDS－PAGE而進行分析。又，使用ImageJ計算帶強度，估算異肽鍵的形成比例。依循以下的式，計算形成比例（%）。

形成比例（%）＝（（重鏈與輕鏈已交聯之帶的強度）／（重鏈與輕鏈已交聯之多肽的帶強度＋重鏈的帶強度＋輕鏈的帶強度））×100

將結果揭示於圖17及18。已將重鏈183位、輕鏈133位、輕鏈176位各別取代成天冬醯胺酸、麩胺酸、離胺酸之變異體（變異體3－15，圖17道1）在生理條件下充分地形成CH1－CL間的異肽鍵。又，雖顯示比h4D5 iSoMAbv1（圖17道4）高的產量，但異肽鍵的形成比例些許減少。在此等抗體中，認為在重鏈183位的天冬醯胺酸與輕鏈176位的離胺酸間已形成異肽鍵。

[表9]

另一方面，在除了對於重鏈183位、輕鏈133位、輕鏈176位之往天冬醯胺酸、麩胺酸、離胺酸的各取代以外更已將重鏈181位取代成白胺酸之變異體（變異體1－15，圖18道2）中，顯示與h4D5 iSoMAbv1同等的異肽鍵的形成比例。在此等抗體中，認為在重鏈183位的天冬醯胺酸與輕鏈176位的離胺酸間已形成異肽鍵。

[表10]

（實施例14：h4D5 iSoMAbv1 H－S183D變異體的異肽鍵形成的分析）．h4D5 iSoMAbv1 H－S183D變異體表現質體的製作委託Eurofins Genomics公司製作已將重鏈173位、181位、183位各別取代成異白胺酸、白胺酸、天冬胺酸之重鏈變異體表現質體。

．h4D5 iSoMAbv1 H－S183D變異體的表現將由上述所製作之重鏈變異體質體與由實施例12所製作之輕鏈變異體表現質體（已將輕鏈133位及176位各別取代成麩胺酸及離胺酸之變異體）（重鏈具有序列識別號45，輕鏈具有序列識別號78）進行組合，藉由與實施例12同樣的方法而使其表現，藉由SDS－PAGE及西方印漬術而進行分析。與實施例12同樣地估算異肽鍵的形成比例。

將結果揭示於圖19。在已將重鏈183位取代成天冬胺酸之情形中，檢測到重鏈與輕鏈已藉由異肽鍵而交聯之多肽。異肽鍵的形成比例為約10%。在此等抗體中，認為在重鏈183位的天冬醯胺酸或天冬胺酸與輕鏈176位的離胺酸間已形成異肽鍵。

[表11]

（實施例15：h4D5 iSoMAb Fab對於HER2細胞外區域之結合的分析）．由表面電漿共振法所進行之h4D5 Fab－HER2細胞外區域間的相互作用分析針對由實施例3所製作之h4D5 iSoMAb Fab（重鏈具有序列識別號80，輕鏈具有序列識別號46），藉由表面電漿共振法而分析對於HER2細胞外區域之結合。作為比較，使用h4D5 WT（野生型）Fab（重鏈具有序列識別號79，輕鏈具有序列識別號46）。藉由分子間相互作用分析裝置BIACORE3000（Cytiva）而進行測量。使用Mouse Antibody Capture Kit（Cytiva），將已融合源自小鼠的Fc區之HER2細胞外區域捕捉至感測晶片（CM5，Cytiva）後，添加已製備成各種濃度之Fab溶液，研究結合行為。針對所得到之感測圖（sensorgram），藉由BIAevaluation Software（Cytiva）並以1：1朗格繆爾結合模型（Langmuir binding model）進行擬合（fitting），計算關於相互作用之動力學參數。

將結果揭示於圖20。h4D5 iSoMAb Fab對於HER2細胞外區域之結合活性係與h4D5 WT（野生型）Fab為同等以上。

[表12]

（實施例16：hCD63 iSoMAb Fab的晶體結構分析）．hCD63 iSoMAb Fab的結晶化使用由實施例11所製備之16.0mg／mL的hCD63 iSoMAb Fab樣品進行結晶化。結晶化緩衝液係使用0.1M二甲胂酸鈉pH6.5、0.2M乙酸鈣、43%PEG300，以懸滴蒸氣擴散法在20℃進行結晶化。

．hCD63 WT Fab的結晶化使用由實施例11所製備之15.8 mg／mL的hCD63 WT Fab樣品進行結晶化。結晶化緩衝液係使用0.1M二甲胂酸鈉pH6.5、0.2M乙酸鈣、42%PEG300，以懸滴蒸氣擴散法在20℃進行結晶化。

．hCD63 iSoMAb Fab及hCD63 WT Fab的結構分析將所得到之結晶利用筑波KEK Photon Factory BL5A光束線進行繞射資料的收集。使用類似的分子結構進行分子取代，藉由Phenix Refine而進行精密化。分子模型建構係使用Coot。

將結果揭示於圖21。在重鏈183位的天冬醯胺酸殘基與輕鏈176位的離胺酸殘基的側鏈間，觀測到表示異肽鍵的形成之電子密度。又，在其附近存在輕鏈133位的麩胺酸殘基。將iSoMAb Fab與野生型Fab的結構進行重疊，結果RMSD（均方根離差）為0.34A，整體結構未見到大變化。

（實施例17：人IgG4κ中之異肽鍵的形成）．表現質體的製作基於逆伏單抗（Human IgG4κ）的胺基酸序列資訊，在參與異肽鍵的形成之部位導入變異（將重鏈183位、輕鏈133位、輕鏈176位各別取代成天冬醯胺酸、麩胺酸、離胺酸），製作逆伏單抗iSoMAb的胺基酸序列。委託Eurofins Genomics公司，基於胺基酸序列而製作重鏈（序列識別號81）及輕鏈（序列識別號82）的人工基因，插入表現質體。

．逆伏單抗iSoMAb的表現使用由上述所製作之表現質體，與實施例12同樣地在HEK293T細胞中使重組抗體表現。回收培養上清液，藉由SDS－PAGE與西方印漬術而研究表現。作為檢測抗體，使用抗人Fc抗體（SIGMA：A0170）及抗人κ鏈抗體（SIGMA：A7164）。將結果揭示於圖22。即使在將抗人Fc抗體及抗人κ鏈抗體的任一者使用作為檢測抗體之情形中，亦檢測到重鏈與輕鏈已藉由異肽鍵而交聯之多肽。

（實施例18：人IgG2κ中之異肽鍵的形成）．表現質體的製作基於泛益妥單抗（Human IgG2κ）的胺基酸序列資訊，在參與異肽鍵的形成之部位導入變異（將重鏈183位、輕鏈133位、輕鏈176位各別取代成天冬醯胺酸、麩胺酸、離胺酸），製作泛益妥單抗iSoMAb的胺基酸序列。委託Eurofins Genomics公司，基於胺基酸序列而製作重鏈（序列識別號83）及輕鏈（序列識別號84）的人工基因，插入表現質體。

．泛益妥單抗iSoMAb的表現使用由上述所製作之表現質體，與實施例12同樣地在HEK293T細胞中使重組抗體表現。回收培養上清液，藉由SDS－PAGE與西方印漬術而研究表現。作為檢測抗體，使用抗人Fc抗體（SIGMA：A9544）及抗人κ鏈抗體（SIGMA：A7164）。將結果揭示於圖23。即使在將抗人Fc抗體及抗人κ鏈抗體的任一者使用作為檢測抗體之情形中，亦檢測到重鏈與輕鏈已藉由異肽鍵而交聯之多肽。

（實施例19：人IgG1λ中之異肽鍵的形成）．表現質體的製作委託Eurofins Genomics公司，將抗BCMA抗體（殖株名372，Human IgG1λ）的重鏈（序列識別號85）及輕鏈可變區（序列識別號86）合成作為人工基因。將由實施例12所製作之h4D5 iSoMAbv1的重鏈表現質體藉由限制酵素Eco RI及Nhe I而進行消化，插入已藉由相同酵素而進行消化之372重鏈可變區，藉此製作372重鏈表現質體。又，同樣地將合成作為人工基因之輕鏈恆定區（將131位、133位、162位、176位、178位、180位各別取代成纈胺酸、麩胺酸、甲硫胺酸、離胺酸、白胺酸、麩醯胺酸）與372輕鏈可變區藉由重疊延伸PCR而進行連結後，藉由限制酵素Eco RI及Not I而進行消化，插入已預先藉由相同酵素而進行消化之表現質體，藉此製作372輕鏈表現質體。

．372 iSoMAb的表現及精製使用上述的表現質體，藉由與實施例2同樣的方法而使重組抗體表現，從培養上清液藉由蛋白質A親和力層析法而進行精製。針對蛋白質A精製後的重組抗體，藉由在還原條件下之SDS－PAGE而進行分析。

將結果揭示於圖24。在已精製之372 iSoMAb中，檢測到重鏈與輕鏈已藉由異肽鍵而交聯之多肽。

（實施例20：使用短芽孢桿菌之h4D5 iSoMAb Fab的生產）／表現質體的製作委託Eurofins Genomics公司製作包含h4D5 iSoMAb輕鏈的序列（表6的133位及176位的胺基酸取代序列）（序列識別號87）及重鏈的序列（表4的183位的胺基酸取代序列）（序列識別號88）之質體。接著，將該質體作為模板，使用引子（5‘－AGTTCCGCATTCGCTGACATC－3’及5‘－CATCCTGTTAAGCTTAGTGGGTCTTGTCGCTGC－3’），進行PCR，將具有His標籤序列之目標序列進行增幅，插入pBIC3 DNA載體（將載體序列揭示於圖25）。

．h4D5 iSoMAb Fab的精製將由上述所得到之表現載體導入短芽孢桿菌，製作轉形體，將轉形體在MT培養基中以30℃培養3日。在進行離心分離所得到之培養上清液中，添加Ni－NTA樹脂（Ni Sepharose excel，Cytiva），精製h4D5 iSoMAb Fab。針對培養上清液，藉由SDS－PAGE、CBB染色及西方印漬術而進行分析。作為檢測抗體，使用抗His標籤抗體（MBL：Code No.D291－3）及抗人κ鏈抗體（SIGMA：A7164）。針對精製抗體，進行CBB染色。同樣地進行，針對h4D5 WT（野生型）Fab亦製備精製抗體並進行CBB染色。

將結果揭示於圖26及27。即使在使用抗His標籤抗體及抗人κ鏈抗體的任一者作為檢測抗體之情形中，亦檢測到重鏈與輕鏈已藉由異肽鍵而交聯之多肽。又，即使在精製後的h4D5 iSoMAb Fab中，亦檢測到重鏈與輕鏈已交聯之多肽。

（實施例20）：異肽鍵形成淬斯妥擬單抗Fab的嵌合抗原受體的製作以及與抗原的結合活性的測量）一般而言，嵌合抗原受體（CAR）為使辨識癌細胞的細胞表面抗原之單股抗體與誘導T細胞活化之訊息傳遞區進行融合而成之人工嵌合蛋白質。然而，已知不易製作辨識細胞表面抗原之單股抗體。於是，製作由形成異肽鍵之抗體所構成之CAR以及測量與抗原的結合活性。

．異肽鍵形成淬斯妥擬單抗Fab的CAR表現載體的製作與表現確認在由實施例3所製作之h4D5 iSoMAb Fab輕鏈的下游，製作由人CD28、CD3zeta及高敏感度綠色螢光蛋白質（EGFP）所構成之CAR表現載體（i）。又，製作由h4D5 iSoMAb Fab重鏈所構成之CAR表現載體（ii）（圖28所示）。所得到之CAR具有序列識別號89。

將HEK293細胞以每1孔2x10⁵細胞播種至24孔盤，隔天，若每1孔的CAR表現載體（i）及／或CAR表現載體（ii）計為500ng，則將聚乙亞胺（1mg／mL）1.5μL在室溫下混合20分鐘後添加至HEK293細胞。在基因轉移3日後，添加包含界面活性劑之RIPA緩衝液，進行移液，製備溶胞產物，添加具還原劑的樣品緩衝液，煮沸後進行SDS－PAGE，轉移至PVDF膜，以抗GFP抗體進行印漬。

將結果揭示於圖29。在僅基因轉移CAR表現載體（i）之細胞中檢測到約80kDa的帶，相對於此，在已基因轉移CAR表現載體（i）及CAR表現載體（ii）之細胞中，約80kDa的帶的強度減弱，另一方面，在高分子側檢測到包含異肽鍵形成淬斯妥擬單抗Fab之帶（以箭號表示）。又，將已導入兩載體之HEK293細胞進行螢光顯微鏡觀察，結果如圖30所示般，顯示異肽鍵形成淬斯妥擬單抗Fab的嵌合抗原受體存在於細胞膜表面。

．與抗原的結合活性的測量將HER2（附分泌訊息的細胞外區域）－小鼠Fc的表現載體基因轉移至HEK293細胞，製備2日後的培養上清液。將利用以小鼠IgG作為標準之墨點法（dot blot）所定量之該培養上清液（包含1μg／mL的HER2－小鼠Fc）添加至基因轉移CAR表現載體（i）及／或CAR表現載體（ii）3日後的HEK293細胞，在4℃靜置1小時。以包含1%BSA之PBS（－）清洗3次後，添加抗小鼠IgG－PE及將核進行染色之Hoechst 33342，同樣地在4℃靜置1小時。接著，以包含1%BSA之PBS（－）清洗3次後，以4%甲醛進行固定，進行螢光顯微鏡觀察。

將結果揭示於圖31。確認到藉由導入CAR表現載體（i）及（ii），以箭號所示之HER2－小鼠Fc係與HEK293細胞的細胞膜結合。

（實施例21）與上述同樣地作成以下表的變異體，確認到CH1－CL間的異肽鍵的形成。iSoMAbv2的重鏈具有序列識別號91，iSoMAbv2 HC mut15具有序列識別號92。

[表13][表14][表15]

[表16]

結果，如圖32所示般，在任一變異體中皆在改質條件下在H＋L的分子量的區產生帶，暗示CH1－CL間的異肽鍵的存在。在此等抗體中，認為在重鏈183位的離胺酸與輕鏈176位的天冬醯胺酸間已形成異肽鍵。

（實施例22）與上述同樣地作成以下表的變異體，確認到CH1－CL間的異肽鍵的形成。iSoMAbv2的重鏈具有序列識別號91，iSoMAbv2 HC mut15具有序列識別號92。iSoMAbv2 LC mut3具有序列識別號94。

[表17]

[表18]

[表19]

[表20]

結果，如圖33所示般，在任一變異體（道1、2及3）中皆在改質條件下在H＋L的分子量的區產生帶，暗示CH1－CL間的異肽鍵的存在。若有重鏈F170E及S183K的變異以及輕鏈S176N變異，則CH1－CL間的異肽鍵在生理條件下充分地形成，藉由進一步的變異導入而可改善異肽形成的效率。在此等抗體中，認為在重鏈183位的離胺酸與輕鏈176位的天冬醯胺酸間已形成異肽鍵。

如由以上的實施例可理解般，由CH1－CL間的異肽鍵所致之共價鍵的形成，不會對抗體對於抗原的結合親和性造成負面影響，相反地，可使重鏈與輕鏈所形成之複合體穩定化。複合體結構的穩定化的結果，可知對於抗體導入CH1－CL間的異肽鍵甚至會使抗體的抗體對於抗原的結合親和性提升。又，CH1－CL間的異肽鍵的形成反應為具有生物正交性（bioorthogonality）之反應，且為能在活體內進行之反應，在抗體的基因工程或抗體的製造過程中能為有益。再者，天冬醯胺酸與麩醯胺酸以及天冬胺酸與麩胺酸為具有非常類似的生化學特性之胺基酸。能理解異肽鍵不僅在天冬醯胺酸與離胺酸間以及天冬胺酸與離胺酸間，在麩醯胺酸與離胺酸間以及麩胺酸與離胺酸間亦同樣地能形成異肽鍵。

（備註）如以上般，雖使用本公開的較佳實施形態示例本公開，但應理解本公開的範圍應僅被申請專利範圍解釋。應理解在本說明書中所引用之專利、專利申請及文獻的內容本身應與具體地記載於本說明書者同樣地將其內容作為對於本說明書的參考而加以援用。

[產業利用性]本公開的包含異肽鍵之多肽提供已提升之穩定性、高純度地生成目標物質等之中的1個以上的有用性。本發明能適用於三特異性抗體等具有複雜結構之重組抗體的產生等廣泛的多肽產生。[序列表自由本文(free text)]

．序列識別號1：h4D5的CH1ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC．序列識別號2：h4D5的修飾CH1ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAILQSSGLYLLNSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSS．序列識別號3：h4D5的CLRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC．序列識別號4：h4D5的修飾CLRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTAVVECLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQEMVTEQDSKDSTYSLKSLLQLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGES．序列識別號5：CD63抗體的CH1ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC．序列識別號6：CD63抗體的修飾CH1v1ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAILQSSGLYLLNSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC．序列識別號7：CD63抗體的修飾CH1v2ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTEPAILQSSGLYLLKSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC．序列識別號8：CD63抗體的CLRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC．序列識別號9：CD63抗體的修飾CLv1RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTAVVECLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQEMVTEQDSKDSTYSLKSLLQLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC．序列識別號10：CD63抗體的修飾CLv2RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQEMVTEQDSKDSTYSLNSLLQLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC．序列識別號11：人＿IgG1ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK．序列識別號12：人＿IgG2ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK．序列識別號13：人＿IgG3ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK．序列識別號14：人＿IgG4ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK．序列識別號15：小鼠＿IgG1AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLESDLYTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK．序列識別號16：小鼠＿IgG2AAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK．序列識別號17：小鼠＿IgG2BAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTSGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYTLPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSPGK．序列識別號18：小鼠＿IgG2CAKTTAPSVYPLAPVCGGTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPALLQSGLYTLSSSVTVTSNTWPSQTITCNVAHPASSTKVDKKIEPRVPITQNPCPPLKECPPCAAPDLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPMVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNRALPSPIEKTISKPRGPVRAPQVYVLPPPAEEMTKKEFSLTCMITGFLPAEIAVDWTSNGRTEQNYKNTATVLDSDGSYFMYSKLRVQKSTWERGSLFACSVVHEVLHNHLTTKTISRSLGK．序列識別號19：小鼠＿IgG3ATTTAPSVYPLVPGCSDTSGSSVTLGCLVKGYFPEPVTVKWNYGALSSGVRTVSSVLQSGFYSLSSLVTVPSSTWPSQTVICNVAHPASKTELIKRIEPRIPKPSTPPGSSCPPGNILGGPSVFIFPPKPKDALMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVHVSWFVDNKEVHTAWTQPREAQYNSTFRVVSALPIQHQDWMRGKEFKCKVNNKALPAPIERTISKPKGRAQTPQVYTIPPPREQMSKKKVSLTCLVTNFFSEAISVEWERNGELEQDYKNTPPILDSDGTYFLYSKLTVDTDSWLQGEIFTCSVVHEALHNHHTQKNLSRSPGK．序列識別號20：大鼠＿IgG1AETTAPSVYPLAPGTALKSNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGALSSGVHTFPAVLQSGLYTLTSSVTVPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRNCGGDCKPCICTGSEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISQDDPEVHFSWFVDDVEVHTAQTRPPEEQFNSTFRSVSELPILHQDWLNGRTFRCKVTSAAFPSPIEKTISKPEGRTQVPHVYTMSPTKEEMTQNEVSITCMVKGFYPPDIYVEWQMNGQPQENYKNTPPTMDTDGSYFLYSKLNVKKEKWQQGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK．序列識別號21：大鼠＿IgG2AAETTAPSVYPLAPGTALKSNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGALSSGVHTFPAVLQSGLYTLTSSVTVPSSTWSSQAVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRECNPCGCTGSEVSSVFIFPPKTKDVLTITLTPKVTCVVVDISQNDPEVRFSWFIDDVEVHTAQTHAPEKQSNSTLRSVSELPIVHRDWLNGKTFKCKVNSGAFPAPIEKSISKPEGTPRGPQVYTMAPPKEEMTQSQVSITCMVK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LCMAWSPLLLTLLAHCTGSWAQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKAVLECLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETMKPSKQSNNKYAAKSLLQLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS．序列識別號87：h4D5VL－isoCLMSISVRFKSLIALLMTVVFLLVPSSAFADIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVECLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLKSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGES．序列識別號88：His－h4D5VH－isoCH1MKKRRVVNSVLLLLLLASALALTVAPMAFAADHHHHHHDDDDKEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLNSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSSDKTH．序列識別號89：h4D5VL－isoCL－CD28－CD3Zeta－EGFPMETPAQLLFLLLLWLPESTGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVECLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLKSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECCFNGGSGGAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGGGGSMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK．序列識別號90：h4D5VH－isoCH1MEFGLSWLFLVAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYLLNSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC．序列識別號91：hCD63 iSoMAbv2 HCKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYYVQWIRQPPGKGLEWMGFIRSGGNTDYNSEFKSRLTISRDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCVRGGEYNWDYFEYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTEPAILQSSGLYLLKSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG．序列識別號92：hCD63 iSoMAbv2 HC mut15MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYYVQWIRQPPGKGLEWMGFIRSGGNTDYNSEFKSRLTISRDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCVRGGEYNWDYFEYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTEPAVLQSSGLYSLKSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG．序列識別號93：hCD63 iSoMAbv2 LCMVLQTQVFISLLLWISGAYGDIVLTQSPASLAVSPGERATISCRASQSVTIFSINLMQWFQQKPGQPPKLLIYRASNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISRVEAEDVAVYYCQQTRESPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQEMVTEQDSKDSTYSLNSLLQLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC．序列識別號94：hCD63 iSoMAbv2 LC mut3MVLQTQVFISLLLWISGAYGDIVLTQSPASLAVSPGERATISCRASQSVTIFSINLMQWFQQKPGQPPKLLIYRASNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISRVEAEDVAVYYCQQTRESPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLNSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

圖1揭示異肽鍵形成前的由isoCH1及isoCL所構成之締合體的立體結構中之天冬醯胺酸、離胺酸及麩胺酸的側鏈部分的結構。圖2揭示異肽鍵形成後的由isoCH1及isoCL所構成之締合體（左）或由isoCH1v2及isoCLv2所構成之締合體（右）的立體結構中之異肽鍵部分的結構。圖3為表示已形成目標締合體之西方印漬法的結果。左圖表示考馬斯藍（Coomassie blue）染色的結果，中央圖表示由Fc區結合抗體所致之染色的結果，右圖表示由輕鏈κ區結合抗體所致之染色的結果。左道（lane）為分子量標記，中央道（1）為h4D5 IgG，右道（2）為h4D5 iSoMAb。圖4為表示h4D5 iSoMAb保持原本的抗體的結合能力之流動式細胞測量術的結果。表示螢光標識h4D5 IgG及螢光標識h4D5 iSoMAb對於HER2表現SKBR－3細胞具有同等的結合能力。圖5為表示已形成目標締合體之SDS－聚丙烯醯胺凝膠電泳的結果。左圖表示分子量標記的結果，中央圖表示h4D5 Fab的結果，右圖表示h4D5 iSoMAb Fab的結果。1的道為培養上清液樣品，2的道為流通（flow through）樣品，3的道為清洗樣品，4的道為溶出樣品。圖6為有無添加還原劑（TCEP）的條件中之h4D5 iSoMAb Fab及h4D5 Fab的示差掃瞄螢光測量的結果。任一條件皆顯示在75～85℃附近的不穩定化。圖7為表示已形成基於抗CD63抗體的目標iSoMAb之SDS－聚丙烯醯胺凝膠電泳的結果。M的道表示分子量標記，1的道表示BSA（對照），道2～4表示在CHO細胞中表現之原本的抗體及iSoMAb（兩種類），道5～6表示在Expi293F細胞中表現之iSoMAb（兩種類）。圖8為表示基於抗CD63抗體的iSoMAb維持往CD63表現細胞的結合性之流動式細胞測量術的結果。上段為原本的抗體的結果，中段為iSoMAb（v1）的結果，下段為iSoMAb（v2）的結果。圖9為由實施例4所建構之雙特異性抗體HER2／HER3 iSoMAb的結構的概要。為包含h4D5（抗HER2）及U1－59（抗HER3）的可變區之雙特異性抗體，h4D5包含異肽鍵。圖10為由三明治ELISA（Sandwich ELISA）所進行之h4D5xU1－59 iSoMAb雙特異性IgG的結合性確認試驗的結果。左邊表示此試驗的概要。右邊表示結果，表示單結合性的h4D5 IgG及U1－59 IgG以及h4D5xU1－59 iSoMAb雙特異性IgG的結果。縱軸表示發色強度，橫軸表示抗體濃度。圖11－1揭示各種的抗體重鏈序列（118位～167位）的比對（alignment）結果。殘基號碼依循EU編號。圖11－2揭示各種的抗體重鏈序列（168位～217位）的比對結果。殘基號碼依循EU編號。圖11－3揭示各種的抗體重鏈序列（218位～220位）的比對結果。殘基號碼依循EU編號。圖11－4揭示各種的抗體重鏈序列（221位～270位）的比對結果。殘基號碼依循EU編號。圖11－5揭示各種的抗體重鏈序列（271位～320位）的比對結果。殘基號碼依循EU編號。圖11－6揭示各種的抗體重鏈序列（321位～369位）的比對結果。殘基號碼依循EU編號。圖11－7揭示各種的抗體重鏈序列（370位～417位）的比對結果。殘基號碼依循EU編號。圖11－8揭示各種的抗體重鏈序列（418位～447位）的比對結果。殘基號碼依循EU編號。圖12－1揭示各種的抗體輕鏈κ (kappa)鏈的序列（108位～156位）的比對結果。κ鏈的殘基號碼依循EU編號，λ (lambda)鏈的殘基號碼依循Kabat編號。圖12－2揭示各種的抗體輕鏈λ鏈序列（107A位～156位）的比對結果。κ鏈的殘基號碼依循EU編號，λ鏈的殘基號碼依循Kabat編號。圖13揭示基於抗CD63抗體的WT MAb與iSoMAbv1各別的抗體藥物複合體的癌細胞毒性活性。縱軸表示細胞毒性活性，橫軸表示抗體藥物複合體的濃度。圖14揭示基於抗CD63抗體Fab型式的WT Fab與iSoMAb Fab各別的抗體藥物複合體的癌細胞毒性活性。縱軸表示細胞毒性活性，橫軸標示抗體藥物複合體的濃度。圖15揭示將h4D5 WT MAb與h4D5 iSoMAb對小鼠進行腹腔內投予後的血中濃度變化。縱軸表示血中濃度，橫軸表示腹腔內投予後的時間。圖16揭示基於抗CD63抗體Fab型式的WT Fab與iSoMAb Fab各別往抗原陽性細胞的結合。縱軸表示細胞數，橫軸表示螢光強度。圖17揭示已精製之h4D5 iSoMAb變異體的由SDS－PAGE所致之分析結果。圖18揭示已精製之h4D5 iSoMAb變異體的由SDS－PAGE所致之分析結果。圖19揭示h4D5 iSoMAb變異體的由SDS－PAGE及西方印漬術所致之分析結果。圖20揭示藉由表面電漿共振法而h4D5 WT Fab與h4D5 iSoMAb Fab各別對於HER2細胞外區域（extracellular domain）之結合行為。縱軸表示結合量，橫軸表示從Fab添加時起的經過時間。圖21的左圖揭示hCD63 iSoMAb Fab中之異肽鍵導入部位的電子密度。右圖揭示iSoMAb Fab晶體結構與Fab晶體結構的疊合。又，以空間填充模型表示異肽鍵部位。圖22揭示逆伏單抗（Nivolumab） iSoMAb的由SDS－PAGE及西方印漬術所致之分析結果。圖23揭示泛益妥單抗（Panitumumab） iSoMAb的由SDS－PAGE及西方印漬術所致之分析結果。圖24揭示已精製之372 WT  MAb與372 iSoMAb的由SDS－PAGE所致之分析結果。圖25揭示已製作之h4D5 iSoMAb Fab短芽孢桿菌屬（Brevibacillus）表現質體。圖26揭示藉由短芽孢桿菌（Brevibacillus choshinensis）所生產之h4D5 iSoMAb Fab的由SDS－PAGE及西方印漬術所致之分析結果。圖27揭示使用短芽孢桿菌使其表現並藉由His標籤管柱所精製之h4D5 iSoMAb Fab的由SDS－PAGE所致之分析結果。圖28揭示已製作之CAR表現質體（i）及（ii）。圖29揭示將已基因轉移CAR表現載體（i）及／或CAR表現載體（ii）之HEK293細胞的溶胞產物以抗GFP抗體進行印漬之圖。在已基因轉移CAR表現載體（i）及CAR表現載體（ii）之細胞中，在高分子量側檢測到包含異肽鍵形成淬斯妥擬單抗（Trastuzumab） Fab之帶（band）（箭號表示）。圖30揭示將已基因轉移CAR表現載體（i）及CAR表現載體（ii）之HEK293細胞進行螢光顯微鏡觀察之圖。圖31揭示在基因轉移CAR表現載體（i）及／或CAR表現載體（ii）3日後的HEK293細胞中添加包含HER2－小鼠Fc之培養上清液並以抗小鼠IgG－PE及Hoechst 33342進行螢光染色之圖。橢圓形表示核。細胞膜表面的箭號表示HER2－小鼠Fc的存在。圖32揭示已製備之iSoMAb的由SDS－PAGE及西方印漬術所致之分析結果。圖33揭示已製備之iSoMAb的由SDS－PAGE及西方印漬術所致之分析結果。

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Claims (28)

1. 一種方法，其係製作修飾多肽之方法，該修飾多肽在第一及第二多肽鏈間包含以下的式所表示之肽間連結：[化10]（式中，虛線各別表示第一或第二多肽鏈），該方法包含：建構包含該第一及第二多肽鏈之中間體A的立體結構之步驟；特定在該立體結構中之該第一及第二多肽鏈互相鄰近之邊界區存在之胺基酸序列之步驟；使該中間體A變異之步驟，其藉由將a）離胺酸、b）麩醯胺酸、麩胺酸、天冬醯胺酸或天冬胺酸，以及c）麩胺酸或天冬胺酸之中的至少1個殘基導入該中間體A而製備中間體B，於此，該中間體B包含a）、b）及c），該中間體B中之該第一及第二多肽鏈各別在該邊界區中包含a）及b）；以及藉由在該中間體B中形成該肽間連結而獲得該修飾多肽之步驟。
2. 如請求項1之方法，其中，基於該邊界區內存在之該第一多肽鏈的第一胺基酸殘基與該第二多肽鏈的第二胺基酸殘基之間的距離以及該第一及第二胺基酸殘基的種類而導入a）及／或b）。
3. 如請求項1之方法，其中，b）為天冬醯胺酸或天冬胺酸，在該中間體A的立體結構中，將α碳間的距離為約7～9Å之2個胺基酸位置特定作為a）及b）的胺基酸位置。
4. 如請求項1之方法，其中，b）為麩醯胺酸或麩胺酸，在該中間體A的立體結構中，將α碳間的距離為約8.5～10Å之2個胺基酸位置特定作為a）及b）的胺基酸位置。
5. 如請求項1之方法，其中，在該中間體A的立體結構中，將側鏈被配置於該立體結構的內部之2個胺基酸的位置特定作為a）及b）的胺基酸位置。
6. 如請求項1之方法，其中，更包含：建構該中間體B的立體結構之步驟。
7. 如請求項6之方法，其中，在該中間體B的立體結構中，a）的殘基的ζ位的氮原子與c）的殘基的側鏈中的羧基的氧原子之間的距離為約2～5Å。
8. 如請求項6之方法，其中，在該中間體B的立體結構中，b）的殘基的側鏈中的羧基或醯胺基的氧原子與c）的殘基的側鏈中的羧基的氧原子之間的距離為約2～5Å。
9. 如請求項6之方法，其中，在該中間體B的立體結構中，a）的殘基的ζ位的氮原子與b）的殘基的側鏈中的羧基或醯胺基的氧原子之間的距離為約2～5Å。
10. 如請求項1之方法，其中，該第一多肽鏈包含c）。
11. 如請求項1之方法，其中，更包含：判定該邊界區的疏水性之步驟。
12. 如請求項1之方法，其中，更包含：將在該邊界區存在之胺基酸序列中之親水性胺基酸殘基進行刪除之變異、將胺基酸殘基取代成疏水性胺基酸殘基之變異或將疏水性胺基酸殘基進行插入之步驟。
13. 如請求項6之方法，其中，在該中間體B的立體結構中，在a）的殘基的ζ位的氮原子起12Å以內之處導入具有α碳之疏水性胺基酸。
14. 如請求項1之方法，其中，以填埋該邊界區的空間之方式導入具有不同體積的側鏈之疏水性胺基酸。
15. 如請求項1之方法，其中，該第一及第二多肽鏈各別被包含在不同分子中。
16. 如請求項15之方法，其中，更包含：在該中間體A中導入變異之步驟，該變異係使在該第一多肽鏈與該第二多肽鏈之間形成雙硫鍵之2個半胱胺酸殘基之中的至少一者缺失或取代成其他胺基酸。
17. 如請求項15之方法，其中，進一步製作二級修飾多肽，該二級修飾多肽在該修飾多肽與第三多肽鏈之間包含以下的式所表示之肽間連結，該第三多肽鏈被包含在與該修飾多肽不同之分子中：[化11]（式中，虛線表示往多肽骨架的鍵結），該方法包含：建構包含該修飾多肽及該第三多肽鏈之二級中間體A的立體結構之步驟；特定在該立體結構中之該修飾多肽及該第三多肽鏈互相鄰近之邊界區存在之胺基酸序列之步驟；使該二級中間體A變異之步驟，其藉由將a）離胺酸、b）麩醯胺酸、麩胺酸、天冬醯胺酸或天冬胺酸以及c）麩胺酸或天冬胺酸之中的至少1個殘基導入該二級中間體A而製備二級中間體B，於此，該二級中間體B包含a）、b）及c），該二級中間體B中之該修飾多肽及該第三多肽鏈各別在該邊界區中包含a）及b）；以及藉由在該二級中間體B中形成該肽間連結而獲得該二級修飾多肽之步驟。
18. 一種多肽，其係在第一及第二多肽鏈間包含以下的式所表示之肽間連結之多肽：[化12]（式中，虛線表示往多肽骨架的鍵結），該多肽包含：a）離胺酸、b）麩醯胺酸、麩胺酸、天冬醯胺酸或天冬胺酸以及c）麩胺酸或天冬胺酸，於此，在該多肽的立體結構中之該第一及第二多肽鏈互相鄰近之邊界區中，該第一及第二多肽鏈各別包含a）及b）。
19. 如請求項18之多肽，其為抗體或T細胞受體（TCR）。
20. 如請求項19之多肽，其中，該肽間連結存在於恆定區。
21. 如請求項18之多肽，其包含抗體的重鏈恆定區與輕鏈恆定區之間的肽間連結。
22. 如請求項18之多肽，其中，該第一及第二多肽鏈存在於互相不同的分子上。
23. 一種重鏈183位的胺基酸被取代成天冬醯胺酸之CH1區或者編碼該區之核酸、包含該CH1區之重鏈恆定區或者編碼該區之核酸、或包含該CH1區之重鏈或者編碼該重鏈之核酸。
24. 一種輕鏈133位的胺基酸被取代成麩胺酸且輕鏈176位的胺基酸被取代成離胺酸之CL區或者編碼該區之核酸、包含該CL區之輕鏈恆定區或者編碼該區之核酸、或包含該CL區之輕鏈或者編碼該輕鏈之核酸。
25. 一種抗體，其包含如請求項23之重鏈與如請求項24之輕鏈。
26. 一種Fab片段、Fab’片段或F（ab’）₂片段，其包含如請求項23之CH1區與如請求項24之CL區。
27. 一種嵌合抗原受體，其具有：包含如請求項23之CH1區與如請求項24之CL區之Fab片段、鉸鏈區（hinge region）、跨膜區域（transmembrane domain）及細胞內區域（intracellular domain）。
28. 一種細胞，其表現如請求項27之嵌合抗原受體。