TW202540425A - 雙鏈siRNA及其綴合物的應用 - Google Patents

Abstract

本發明公開了一類雙鏈siRNA及其應用，具體公開了一類含非天然核苷酸的雙鏈siRNA及其綴合物的應用。

Description

雙鏈siRNA及其綴合物的應用

本發明涉及雙鏈siRNA及其應用，具體涉及一類含非天然核苷酸的雙鏈siRNA及其綴合物的應用。

本申請要求申請日為2024/1/26的中國專利申請2024101154015、申請日為2024/4/16的中國專利申請2024104636471、申請日為2024/4/26的中國專利申請202410518440X、申請日為2024/9/13的中國專利申請2024112876053以及申請日為2025/1/17的中國專利申請2025100845612的優先權。本申請引用上述中國專利申請的全文。

腹部肥胖，又稱腹型肥胖，是一種脂肪組織在腹腔內臟器官、腸繫膜及主動脈周圍積聚的一種肥胖狀態。主要表現為腰圍的增加。根據中國工業健康標準，男性腰圍超過90cm或女性腰圍超過85cm即可確診為腹部肥胖。

腹部肥胖在中國患病人群數量大。2012-2015年間的一項調查顯示中國人腹部肥胖的患病率為29.1%，其中男性為28.6%，女性為29.6%。根據這個比例，全國範圍內腹部肥胖成年人數量約為2.778億人。

腹部肥胖是代謝綜合症的表現之一，與II型糖尿病和冠心病密切相關。通過對31萬餘韓國人的健康調查顯示，僅有一般性全身肥胖不會導致主要不良心血管事件風險上升。但僅有腹部肥胖和同時具有全身肥胖和腹部肥胖的人群，主要不良心血管事件風險明顯上升。

但尚無針對腹部肥胖的藥物獲批，表明該領域存在未被滿足的臨床需求。

Inhibin E (INHBE) 基因編碼抑制素βE亞基，這是一種激活素/抑制素成分，屬於 TGF-β 超家族。根據對該基因突變導致功能缺失的人群研究發現，INHBE基因的表達與腹部脂肪和脂肪分佈有著密切關係。由於INHBE基因突變導致功能缺失的人具有更低的Waist-to-hip ratio adjusted for BMI (WHRadjBMI), 這個指標通常用來衡量腹部肥胖程度。同時，由於INHBE基因突變導致功能缺失的人冠心病和II型糖尿病的發病率也有降低趨勢。更重要的是，INHBE基因突變導致INHBE基因表達下降約50%的人具有更低的甘油三酯和更高的高密度脂蛋白水平，總體代謝表型更健康。

RNA干擾（RNAi或siRNA）機制在1998年被發現以來一直被密切關注；該機制通過下調靶標mRNA水平來實現對相應靶點功能的控制從而達到預期的藥理效果。近年來，有多個RNAi藥物獲批上市，完成了應用於人體藥物的可行性驗證。通過該機制實現藥理效果的藥物被稱為RNAi藥物。

本發明提供一種雙鏈siRNA或其藥學上可接受的鹽，其中，所述雙鏈siRNA包含能夠形成雙鏈區的正義鏈和反義鏈，所述正義鏈包含SEQ ID NO: 1-80、SEQ ID NO: 161-188中任意一個所示序列中的至少16個連續的核苷酸；所述反義鏈包含SEQ ID NO: 81-160、SEQ ID NO: 189-230中任意一個所示序列中的至少16個連續的核苷酸；所述正義鏈包含的核苷酸和所述反義鏈包含的核苷酸，為修飾或未修飾的核苷酸。

在本發明的一些方案中，上述雙鏈siRNA或其藥學上可接受的鹽，其中，所述正義鏈包含SEQ ID NO: 1-80、SEQ ID NO: 161-188中任意一個所示序列5’端起的1-17、1-18、1-19、1-20、1-21、2-17、2-18、2-19、2-20、2-21、3-18、3-19、3-20、3-21、4-19、4-20、4-21或5-21位的核苷酸；優選地，所述正義鏈包含SEQ ID NO: 1-80、SEQ ID NO: 161-188中任意一個所示序列5’端起的1-17、1-18、1-19、2-17、2-18、2-19、2-20、3-18、3-19、3-20、4-19、4-20、4-21或5-21位的核苷酸。

在本發明的一些方案中，上述雙鏈siRNA或其藥學上可接受的鹽，其中，所述反義鏈包含SEQ ID NO: 81-160、SEQ ID NO: 189-230中任意一個所示序列5’端起的1-17、1-18、1-19、1-20、1-21、1-22、1-23、2-18、2-19、2-20、2-21、2-22、2-23、3-19、3-20、3-21、3-22、3-23、4-20、4-21、4-22、4-23、5-21、5-22、5-23、6-22、6-23或7-23位的核苷酸；優選地，所述反義鏈包含SEQ ID NO: 81-160、SEQ ID NO: 189-230中任意一個所示序列5’端起的1-19、1-20、1-21、1-22、1-23、2-18、2-19、2-20、2-21、3-20或3-21位的核苷酸。

在本發明的一些方案中，上述雙鏈siRNA或其藥學上可接受的鹽，其中，所述正義鏈、所述反義鏈、或者所述正義鏈及反義鏈上至少有一個核苷酸殘基分別獨立地任選被dR、R或Z替換，所述dR為，所述R為，所述Z為。

在本發明的一些方案中，上述雙鏈siRNA或其藥學上可接受的鹽，其中，所述反義鏈5’端的第2位、第5-7位、第12位和第14-18位中有1-4個核苷酸殘基分別獨立地任選被dR、R或Z替換。

在本發明的一些方案中，上述雙鏈siRNA或其藥學上可接受的鹽，其中，所述反義鏈5’端的第2位、第5-7位、第12位和第14-18位中有1-4個核苷酸分別獨立地任選為2’脫氧核苷酸。

在本發明的一些方案中，上述雙鏈siRNA或其藥學上可接受的鹽，其中，所述反義鏈5’端的第1個核苷可被乙烯基磷酸酯的核苷類似物替換。

在本發明的一些方案中，上述雙鏈siRNA或其藥學上可接受的鹽，其中，所述乙烯基磷酸酯的核苷類似物選自如下結構片段：、、、、、、、、、、、、、、和。

本發明提供一種雙鏈siRNA或其藥學上可接受的鹽，其包含能夠形成雙鏈區的正義鏈和反義鏈，所述正義鏈包含SEQ ID NO：1-80中任意一個所示序列5’端起的1-17、1-18、1-19、1-20、1-21、2-17、2-18、2-19、2-20、2-21、3-18、3-19、3-20、3-21、4-19、4-20、4-21或5-21位的核苷酸，所述正義鏈上的1-4個核苷酸殘基分別獨立地任選被dR、R或Z替換，所述dR為，所述R為，所述Z為，所述正義鏈上的核苷酸任選被修飾。

本發明提供一種雙鏈siRNA或其藥學上可接受的鹽，其包含能夠形成雙鏈區的正義鏈和反義鏈，所述反義鏈包含SEQ ID NO：81-160中任意一個所示序列5’端起的1-17、1-18、1-19、1-20、1-21、1-22、1-23、2-18、2-19、2-20、2-21、2-22、2-23、3-19、3-20、3-21、3-22、3-23、4-20、4-21、4-22、4-23、5-21、5-22、5-23、6-22、6-23或7-23位的核苷酸，所述反義鏈上的1-4個核苷酸殘基分別獨立地任選被dR、R或Z替換，所述dR為，所述R為，所述Z為，所述反義鏈上的核苷酸任選被修飾。

本發明提供一種雙鏈siRNA或其藥學上可接受的鹽，其包含能夠形成雙鏈區的正義鏈和反義鏈，所述正義鏈包含SEQ ID NO：161-188中任意一個所示序列5’端起的1-17、1-18、1-19、1-20、1-21、2-17、2-18、2-19、2-20、2-21、3-18、3-19、3-20、3-21、4-19、4-20、4-21或5-21位的核苷酸，所述正義鏈上的1-4個核苷酸殘基分別獨立地任選被dR、R或Z替換，所述dR為，所述R為，所述Z為，所述正義鏈上的核苷酸任選被修飾。

本發明提供一種雙鏈siRNA或其藥學上可接受的鹽，其包含能夠形成雙鏈區的正義鏈和反義鏈，所述反義鏈包含SEQ ID NO：189-230中任意一個所示序列5’端起的1-17、1-18、1-19、1-20、1-21、1-22、1-23、2-18、2-19、2-20、2-21、2-22、2-23、3-19、3-20、3-21、3-22、3-23、4-20、4-21、4-22、4-23、5-21、5-22、5-23、6-22、6-23或7-23位的核苷酸，所述反義鏈上的1-4個核苷酸殘基分別獨立地任選被dR、R或Z替換，所述dR為，所述R為，所述Z為，所述反義鏈上的核苷酸任選被修飾。

本發明提供一種雙鏈siRNA或其藥學上可接受的鹽，其包含能夠形成雙鏈區的正義鏈和反義鏈，所述正義鏈包含SEQ ID NO：161-188中任意一個所示序列5’端起的1-17、1-18、1-19、1-20、1-21、2-17、2-18、2-19、2-20、2-21、3-18、3-19、3-20、3-21、4-19、4-20、4-21或5-21位的核苷酸，所述正義鏈上的1-4個核苷酸殘基分別獨立地任選被dR、R或Z替換，所述dR為，所述R為，所述Z為。

本發明提供一種雙鏈siRNA或其藥學上可接受的鹽，其包含能夠形成雙鏈區的正義鏈和反義鏈，所述反義鏈包含SEQ ID NO：189-230中任意一個所示序列5’端起的1-17、1-18、1-19、1-20、1-21、1-22、1-23、2-18、2-19、2-20、2-21、2-22、2-23、3-19、3-20、3-21、3-22、3-23、4-20、4-21、4-22、4-23、5-21、5-22、5-23、6-22、6-23或7-23位的核苷酸，所述反義鏈上的1-4個核苷酸殘基分別獨立地任選被dR、R或Z替換，所述dR為，所述R為，所述Z為。

在本發明的一些方案中，上述正義鏈包含SEQ ID NO：1-80中任意一個所示序列5’端起的1-17、1-18、1-19、2-17、2-18、2-19、2-20、3-18、3-19、3-20、4-19、4-20、4-21或5-21位的核苷酸，所述正義鏈上的1-4個核苷酸殘基分別獨立地任選被dR、R或Z替換，所述dR為，所述R為，所述Z為，所述正義鏈上的核苷酸包含至少一個修飾的核苷酸。

在本發明的一些方案中，上述反義鏈包含SEQ ID NO：81-160中任意一個所示序列5’端起的1-19、1-20、1-21、1-22、1-23、2-18、2-19、2-20、2-21、3-20或3-21位的核苷酸，所述反義鏈上的1-4個核苷酸殘基分別獨立地任選被dR、R或Z替換，所述dR為，所述R為，所述Z為，所述反義鏈上的核苷酸包含至少一個修飾的核苷酸。

在本發明的一些方案中，上述正義鏈包含SEQ ID NO：161-188中任意一個所示序列5’端起的1-17、1-18、1-19、2-17、2-18、2-19、2-20、3-18、3-19、3-20、4-19、4-20、4-21或5-21位的核苷酸，所述正義鏈上的1-4個核苷酸殘基分別獨立地任選被dR、R或Z替換。

在本發明的一些方案中，上述反義鏈包含SEQ ID NO：189-230中任意一個所示序列5’端起的1-19、1-20、1-21、1-22、1-23、2-18、2-19、2-20、2-21、3-20或3-21位的核苷酸，所述反義鏈上的1-4個核苷酸殘基分別獨立地任選被dR、R或Z替換。

在本發明的一些方案中，上述正義鏈包含SEQ ID NO：1-80中任意一個所示序列5’端起的1-17、1-18、1-19、2-17、2-18、2-19、2-20、3-18、3-19、3-20、4-19、4-20、4-21或5-21位的核苷酸。

在本發明的一些方案中，上述正義鏈包含SEQ ID NO：161-188中任意一個所示序列5’端起的1-17、1-18、1-19、2-17、2-18、2-19、2-20、3-18、3-19、3-20、4-19、4-20、4-21或5-21位的核苷酸。

在本發明的一些方案中，上述反義鏈包含SEQ ID NO：81-160中任意一個所示序列5’端起的1-19、1-20、1-21、1-22、1-23、2-18、2-19、2-20、2-21、3-20或3-21位的核苷酸。

在本發明的一些方案中，上述反義鏈包含SEQ ID NO：189-230中任意一個所示序列5’端起的1-19、1-20、1-21、1-22、1-23、2-18、2-19、2-20、2-21、3-20或3-21位的核苷酸。

在本發明的一些方案中，上述所述反義鏈5’端的第2位、第5-7位、第12位和第14-18位中有1-4個核苷酸殘基分別獨立地被dR、R或Z替換。

在本發明的一些方案中，上述反義鏈5’端的第2位、第5-7位和第12位中有1-4個核苷酸殘基分別獨立地任選被dR、R或Z替換。

在本發明的一些方案中，上述反義鏈5’端的第2位、第5-7位、第12位和第14-18位中有1-4個核苷酸分別獨立地任選為2’脫氧核苷酸。

在本發明的一些方案中，上述反義鏈5’端的第2位、第5-7位、第12位和第14-18位中有1-4個核苷酸分別獨立地任選為腺嘌呤脫氧核糖核苷酸、鳥嘌呤脫氧核糖核苷酸、胞嘧啶脫氧核糖核苷酸或胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸。

在本發明的一些方案中，上述反義鏈5’端的第2位、第5-7位和第12位中有1-4個核苷酸分別獨立地任選為腺嘌呤脫氧核糖核苷酸、鳥嘌呤脫氧核糖核苷酸、胞嘧啶脫氧核糖核苷酸或胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸。

在本發明的一些方案中，上述正義鏈或反義鏈的5’端或3’端分別獨立地任選包含突出端。

在本發明的一些方案中，上述突出端包含1-5個核苷酸。

在本發明的一些方案中，上述突出端包含2個核苷酸。

在本發明的一些方案中，上述反義鏈的3’端任選包含突出端，所述突出端包含1-5個核苷酸。

在本發明的一些方案中，上述反義鏈的3’端任選包含突出端，所述突出端包含2個核苷酸。

在本發明的一些方案中，上述反義鏈5’端的第1個核苷可被乙烯基磷酸酯的核苷類似物替換。

在本發明的一些方案中，上述乙烯基磷酸酯的核苷類似物選自如下結構片段：、、、、、、、、、、、、、、和。

在本發明的一些方案中，上述乙烯基磷酸酯的核苷類似物選自B19和B33，所述B19為，所述B33為。

在本發明的一些方案中，上述乙烯基磷酸酯的核苷類似物選自B33，所述B33為。

在本發明的一些方案中，上述正義鏈選自SEQ ID NO：161-188所示任意一個序列，上述反義鏈選自SEQ ID NO：189-230所示任意一個序列。

在本發明的一些方案中，上述雙鏈siRNA選自S1-S81。

本發明提供一種雙鏈siRNA或其藥學上可接受的鹽，其包含能夠形成雙鏈區的正義鏈和反義鏈，所述正義鏈的核苷酸序列和所述反義鏈的核苷酸序列組合選自S83-S129所示的任意一組核苷酸序列組合。

在本發明的一些方案中，上述雙鏈siRNA選自表1和表2：表1 未修飾的雙鏈siRNA

雙鏈siRNA化合物	SEQ ID NO	正義鏈 （5’—3’）	SEQ ID NO	反義鏈 （5’—3’）
S1	1	AGCUAGCCAAGCAGCAAAUCA	81	UGAUUUGCUGCUUGGCUAGCUCC
S2	2	CCAGUCGUCCCAGAAUAACUA	82	UAGUUAUUCUGGGACGACUGGUC
S3	3	CGAGACCAUUACGUAGACUUA	83	UAAGUCUACGUAAUGGUCUCGCC
S4	4	AAUGUGGUCAAGACGGAUGUA	84	UACAUCCGUCUUGACCACAUUGC
S5	5	GCUAGCCAAGCAGCAAAUCCA	85	UGGAUUUGCUGCUUGGCUAGCUC
S6	6	CUCCUCAAAGCCAACAAUCCA	86	UGGAUUGUUGGCUUUGAGGAGGC
S7	7	GUCUUCAGCCUCCUCAAAGCA	87	UGCUUUGAGGAGGCUGAAGACGG
S8	8	UGGAUCAUAAUGGCAAUGUGA	88	UCUCAUUGCCAUUAUGAUCCAGG
S9	9	UCUACCUGGAUCAUAAUGGCA	89	UGCCAUUAUGAUCCAGGUAGAGG
S10	10	GACGGAUGUGCCAGAUAUGGA	90	UCCAUAUCUGGCACAUCCGUCUU
S11	11	UCAAGACGGAUGUGCCAGAUA	91	UAUCUGGCACAUCCGUCUUGACC
S12	12	AUCAUAAUGGCAAUGUGGUCA	92	UGACCACAUUGCCAUUAUGAUCC
S13	13	UUAUGUUGCAGGCGAGACCAU	93	AUGGUCUCGCCUGCAACAUAAGG
S14	14	CCCCUCUCUCUCCUCUACCUA	94	UAGGUAGAGGAGAGAGAGGGGCC
S15	15	UCUUCAGCCUCCUCAAAGCCA	95	UGGCUUUGAGGAGGCUGAAGACG
S16	16	CUCUACCUGGAUCAUAAUGGA	96	UCCAUUAUGAUCCAGGUAGAGGA
S17	17	GACCCCCUUAUGUUGCAGGCA	97	UGCCUGCAACAUAAGGGGGUCGC
S18	18	CCUUAUGUUGCAGGCGAGACA	98	UGUCUCGCCUGCAACAUAAGGGG
S19	19	CUCUGGUGCUGGAGCUAGCCA	99	UGGCUAGCUCCAGCACCAGAGCU
S20	20	GGCUCUUGGACACAGCAGGAA	100	UUCCUGCUGUGUCCAAGAGCCGC
S21	21	GGGUACCAGCUGAAUUACUGA	101	UCAGUAAUUCAGCUGGUACCCCU
S22	22	GCUUAAGAUCCGAGCCAAUGA	102	UCAUUGGCUCGGAUCUUAAGCUC
S23	23	GUGCUGGAGCUAGCCAAGCAA	103	UUGCUUGGCUAGCUCCAGCACCA
S24	24	CUGGAUCAUAAUGGCAAUGUA	104	UACAUUGCCAUUAUGAUCCAGGU
S25	25	CAGUCGUCCCAGAAUAACUCA	105	UGAGUUAUUCUGGGACGACUGGU
S26	26	AAUGGCAAUGUGGUCAAGACA	106	UGUCUUGACCACAUUGCCAUUAU
S27	27	CACCCCAAGCAGAACGAGCUA	107	UAGCUCGUUCUGCUUGGGGUGCC
S28	28	UGACCAGUCGUCCCAGAAUAA	108	UUAUUCUGGGACGACUGGUCAGG
S29	29	UCCUCAAAGCCAACAAUCCUU	109	AAGGAUUGUUGGCUUUGAGGAGG
S30	30	GCCCUCCGGAGACUACAGCCA	110	UGGCUGUAGUCUCCGGAGGGCUC
S31	31	UCCCACCACCUGUACCAUGCA	111	UGCAUGGUACAGGUGGUGGGACC
S32	32	AGGGGUACCAGCUGAAUUACU	112	AGUAAUUCAGCUGGUACCCCUCG
S33	33	GAGCCCUCCGGAGACUACAGA	113	UCUGUAGUCUCCGGAGGGCUCUG
S34	34	CGGUCCCACCACCUGUACCAU	114	AUGGUACAGGUGGUGGGACCGAG
S35	35	GUGGUCAAGACGGAUGUGCCA	115	UGGCACAUCCGUCUUGACCACAU
S36	36	UCAAAGCCAACAAUCCUUGGA	116	UCCAAGGAUUGUUGGCUUUGAGG
S37	37	CCUCUACCUGGAUCAUAAUGA	117	UCAUUAUGAUCCAGGUAGAGGAG
S38	38	CCAGAGCCCUCCGGAGACUAA	118	UUAGUCUCCGGAGGGCUCUGGUC
S39	39	AGCUGAAUUACUGCAGUGGGA	119	UCCCACUGCAGUAAUUCAGCUGG
S40	40	GGCAUUGCUGCCUCUUUCCAU	120	AUGGAAAGAGGCAGCAAUGCCUG
S41	41	GGGGUACCAGCUGAAUUACUA	121	UAGUAAUUCAGCUGGUACCCCUC
S42	42	AGCCUCCUCAAAGCCAACAAU	122	AUUGUUGGCUUUGAGGAGGCUGA
S43	43	AUGUGGUCAAGACGGAUGUGA	123	UCACAUCCGUCUUGACCACAUUG
S44	44	UGCUGGAGCUAGCCAAGCAGA	124	UCUGCUUGGCUAGCUCCAGCACC
S45	45	GACCAGUCGUCCCAGAAUAAA	125	UUUAUUCUGGGACGACUGGUCAG
S46	46	AGGACCCCCACCUGUGAGCCU	126	AGGCUCACAGGUGGGGGUCCUCC
S47	47	UGCGACCCCCUUAUGUUGCAA	127	UUGCAACAUAAGGGGGUCGCAGG
S48	48	AUUGCUGCCUCUUUCCAUUCU	128	AGAAUGGAAAGAGGCAGCAAUGC
S49	49	CACCUGUGAGCCUGCGACCCA	129	UGGGUCGCAGGCUCACAGGUGGG
S50	50	CUCCUCUACCUGGAUCAUAAU	130	AUUAUGAUCCAGGUAGAGGAGAG
S51	51	CGAGCUCUGGUGCUGGAGCUA	131	UAGCUCCAGCACCAGAGCUCGUU
S52	52	GAGGGGUACCAGCUGAAUUAA	132	UUAAUUCAGCUGGUACCCCUCGG
S53	53	AAGCAGCAAAUCCUGGAUGGA	133	UCCAUCCAGGAUUUGCUGCUUGG
S54	54	CUGGCAGCCCAGGCAUUGCUA	134	UAGCAAUGCCUGGGCUGCCAGCC
S55	55	GACCAUUACGUAGACUUCCAA	135	UUGGAAGUCUACGUAAUGGUCUC
S56	56	CAAAGCCAACAAUCCUUGGCA	136	UGCCAAGGAUUGUUGGCUUUGAG
S57	57	CGAGGGGUACCAGCUGAAUUA	137	UAAUUCAGCUGGUACCCCUCGGG
S58	58	CUUAUGUUGCAGGCGAGACCA	138	UGGUCUCGCCUGCAACAUAAGGG
S59	59	UCGGUCCCACCACCUGUACCA	139	UGGUACAGGUGGUGGGACCGAGG
S60	60	GUACCAGCUGAAUUACUGCAA	140	UUGCAGUAAUUCAGCUGGUACCC
S61	61	AGGCAGCGCUGACCAGAGCCA	141	UGGCUCUGGUCAGCGCUGCCUGG
S62	62	GAGACCAUUACGUAGACUUCA	142	UGAAGUCUACGUAAUGGUCUCGC
S63	63	UCCGAGCCAAUGAGCCUGGAA	143	UUCCAGGCUCAUUGGCUCGGAUC
S64	64	GGUGCUGGAGCUAGCCAAGCA	144	UGCUUGGCUAGCUCCAGCACCAG
S65	65	UAAUGGCAAUGUGGUCAAGAA	145	UUCUUGACCACAUUGCCAUUAUG
S66	66	GCUCUGGUGCUGGAGCUAGCA	146	UGCUAGCUCCAGCACCAGAGCUC
S67	67	GCUGAAUUACUGCAGUGGGCA	147	UGCCCACUGCAGUAAUUCAGCUG
S68	68	CUAGCCAAGCAGCAAAUCCUA	148	UAGGAUUUGCUGCUUGGCUAGCU
S69	69	CGUCUUCAGCCUCCUCAAAGA	149	UCUUUGAGGAGGCUGAAGACGGC
S70	70	ACCAGUCGUCCCAGAAUAACU	150	AGUUAUUCUGGGACGACUGGUCA
S71	71	ACCAUUACGUAGACUUCCAGA	151	UCUGGAAGUCUACGUAAUGGUCU
S72	72	AGACGGAUGUGCCAGAUAUGA	152	UCAUAUCUGGCACAUCCGUCUUG
S74	73	GAGGGGUACCAGCUGAAUUAC	153	GUAAUUCAGCUGGUACCCCUCGG
S75	74	CAGAGCCCUCCGGAGACUACA	154	UGUAGUCUCCGGAGGGCUCUGGU
S76	75	AGACCAUUACGUAGACUUCCA	155	UGGAAGUCUACGUAAUGGUCUCG
S77	76	ACCAUUACGUAGACUUCCAGG	156	CCUGGAAGUCUACGUAAUGGUCU
S78	77	CCCGAGGGGUACCAGCUGAAU	157	AUUCAGCUGGUACCCCUCGGGCU
S79	78	GCACCCCAAGCAGAACGAGCU	158	AGCUCGUUCUGCUUGGGGUGCCA
S80	79	ACUGGCACCCCAAGCAGAACG	159	CGUUCUGCUUGGGGUGCCAGUUU
S81	80	ACCCCAAGCAGAACGAGCUCU	160	AGAGCUCGUUCUGCUUGGGGUGC

表2 修飾的雙鏈siRNA

雙鏈siRNA 化合物	SEQ ID NO	正義鏈 （5’—3’）	SEQ ID NO	反義鏈 （5’—3’）
S83	161	cs,cs,a,g,u,c,g,u,Cf,Cf,Cf,a,g,a,a,u,a,a,c,u,a	189	us,dAs,g,u,dT,a,dT,u,c,u,g,dG,g,Af,c,g,a,c,u,g,gs,us,c
S84	162	as,as,u,g,u,g,g,u,Cf,Af,Af,g,a,c,g,g,a,u,g,u,a	190	us,dAs,c,a,dT,c,dC,g,u,c,u,dT,g,Af,c,c,a,c,a,u,us,gs,c
S85	163	as,gs,g,g,g,u,a,c,Cf,Af,Gf,c,u,g,a,a,u,u,a,c,u	191	as,dGs,u,a,dA,u,dT,c,a,g,c,dT,g,Gf,u,a,c,c,c,c,us,cs,g
S86	164	gs,us,g,g,u,c,a,a,Gf,Af,Cf,g,g,a,u,g,u,g,c,c,a	192	us,dGs,g,c,dA,c,dA,u,c,c,g,dT,c,Uf,u,g,a,c,c,a,cs,as,u
S87	165	cs,cs,u,c,u,a,c,c,Uf,Gf,Gf,a,u,c,a,u,a,a,u,g,a	193	us,dCs,a,u,dT,a,dT,g,a,u,c,dC,a,Gf,g,u,a,g,a,g,gs,as,g
S88	166	gs,gs,g,g,u,a,c,c,Af,Gf,Cf,u,g,a,a,u,u,a,c,u,a	194	us,dAs.g,u,dA,a,dT,u,c,a,g,dC,u,Gf,g,u,a,c,c,c,cs,us,c
S89	167	as,gs,c,c,u,c,c,u,Cf,Af,Af,a,g,c,c,a,a,c,a,a,u	195	as,dTs,u,g,dT,u,dG,g,c,u,u,dT,g,Af,g,g,a,g,g,c,us,gs,a
S90	168	gs,as,c,c,a,g,u,c,Gf,Uf,Cf,c,c,a,g,a,a,u,a,a,a	196	us,dTs,u,a,dT,u,dC,u,g,g,g,dA,c,Gf,a,c,u,g,g,u,cs,as,g
S91	169	gs,as,c,c,a,u,u,a,Cf,Gf,Uf,a,g,a,c,u,u,c,c,a,a	197	us,dTs,g,g,dA,a,dG,u,c,u,a,dC,g,Uf,a,a,u,g,g,u,cs,us,c
S92	170	cs,gs,a,g,g,g,g,u,Af,Cf,Cf,a,g,c,u,g,a,a,u,u,a	198	us,dAs,a,u,dT,c,dA,g,c,u,g,dG,u,Af,c,c,c,c,u,c,gs,gs,g
S93	171	as,cs,c,a,g,u,c,g,Uf,Cf,Cf,c,a,g,a,a,u,a,a,c,u	199	as,dGs,u,u,dA,u,dT,c,u,g,g,dG,a,Cf,g,a,c,u,g,g,us,cs,a
S94	172	cs,us,c,c,u,c,u,a,Cf,Cf,Uf,g,g,a,u,c,a,u,a,a,u	200	as,dTs,u,a,dT,g,dA,u,c,c,a,dG,g,Uf,a,g,a,g,g,a,gs,as,g
S95	161	cs,cs,a,g,u,c,g,u,Cf,Cf,Cf,a,g,a,a,u,a,a,c,u,a	201	us,dAs,g,u,dT,a,Z,u,c,u,g,dG,g,Af,c,g,a,c,u,g,gs,us,c
S96	161	cs,cs,a,g,u,c,g,u,Cf,Cf,Cf,a,g,a,a,u,a,a,c,u,a	202	us,dAs,g,u,Z,a,dT,u,c,u,g,dG,g,Af,c,g,a,c,u,g,gs,us,c
S97	161	cs,cs,a,g,u,c,g,u,Cf,Cf,Cf,a,g,a,a,u,a,a,c,u,a	203	us,as,g,u,dT,a,Z,u,c,u,g,dG,g,Af,c,g,a,c,u,g,gs,us,c
S98	161	cs,cs,a,g,u,c,g,u,Cf,Cf,Cf,a,g,a,a,u,a,a,c,u,a	204	us,dAs,g,u,dT,a,Z,u,c,u,g,Gf,g,Af,c,g,a,c,u,g,gs,us,c
S99	161	cs,cs,a,g,u,c,g,u,Cf,Cf,Cf,a,g,a,a,u,a,a,c,u,a	205	B19s,dAs,g,u,Z,a,dT,u,c,u,g,dG,g,Af,c,g,R,c,u,g,gs,us,c
S100	161	cs,cs,a,g,u,c,g,u,Cf,Cf,Cf,a,g,a,a,u,a,a,c,u,a	206	B19s,dAs,g,u,Z,a,dT,u,c,u,g,dG,g,Af,c,g,R,c,u,g,gs,cs,c
S101	173	cs,cs,a,g,u,c,g,u,Cf,Cf,Cf,a,g,a,a,u,a,R,c,u,a	205	B19s,dAs,g,u,Z,a,dT,u,c,u,g,dG,g,Af,c,g,R,c,u,g,gs,us,c
S102	174	cs,cs,R,g,u,c,g,u,Cf,Cf,Cf,a,g,a,a,u,a,R,c,u,a	205	B19s,dAs,g,u,Z,a,dT,u,c,u,g,dG,g,Af,c,g,R,c,u,g,gs,us,c
S103	161	cs,cs,a,g,u,c,g,u,Cf,Cf,Cf,a,g,a,a,u,a,a,c,u,a	230	us,dAs,g,u,Z,a,dT,u,c,u,g,dG,g,Af,c,g,a,c,R,g,gs,us,c
S104	161	cs,cs,a,g,u,c,g,u,Cf,Cf,Cf,a,g,a,a,u,a,a,c,u,a	207	us,dAs,g,u,Z,a,dT,u,c,u,g,dG,g,Af,c,g,a,c,R,g,gs,cs,c
S105	161	cs,cs,a,g,u,c,g,u,Cf,Cf,Cf,a,g,a,a,u,a,a,c,u,a	208	us,dAs,g,u,dR,a,dT,u,c,u,g,dG,g,Af,c,g,a,c,R,g,gs,us,c
S106	161	cs,cs,a,g,u,c,g,u,Cf,Cf,Cf,a,g,a,a,u,a,a,c,u,a	209	us,dAs,g,u,dR,a,dR,u,c,u,g,dG,g,Af,c,g,a,c,R,g,gs,us,c
S107	161	cs,cs,a,g,u,c,g,u,Cf,Cf,Cf,a,g,a,a,u,a,a,c,u,a	210	us,dAs,g,u,dT,a,dR,u,c,u,g,dG,g,Af,c,g,a,c,R,g,gs,us,c
S109	175	gs,as,g,g,g,g,u,a,Cf,Cf,Af,g,c,u,g,a,a,u,u,a,a	211	us,dTs,a,a,dT,u,dC,a,g,c,u,dG,g,Uf,a,c,c,c,c,u,cs,gs,g
S110	176	as,gs,g,g,g,u,a,Cf,Cf,Af,g,c,u,g,a,a,u,u,a,c,a	212	us,dGs,u,a,dA,u,dT,c,a,g,c,dT,g,Gf,u,a,c,c,c,c,us,cs,g
S111	177	cs,as,g,a,g,c,c,c,Uf,Cf,Cf,g,g,a,g,a,c,u,a,c,a	213	us,dGs,u,a,dG,u,dC,u,c,c,g,dG,a,Gf,g,g,c,u,c,u,gs,gs,u
S112	178	as,gs,a,c,c,a,u,u,Af,Cf,Gf,u,a,g,a,c,u,u,c,c,a	214	us,dGs,g,a,dA,g,dT,c,u,a,c,dG,u,Af,a,u,g,g,u,c,us,cs,g
S113	179	as,cs,c,a,u,u,a,c,Gf,Uf,Af,g,a,c,u,u,c,c,a,g,a	215	us,dCs,u,g,dG,a,dA,g,u,c,u,dA,c,Gf,u,a,a,u,g,g,us,cs,u
S114	180	cs,cs,c,g,a,g,g,g,Gf,Uf,Af,c,c,a,g,c,u,g,a,a,a	216	us,dTs,u,c,dA,g,dC,u,g,g,u,dA,c,Cf,c,c,u,c,g,g,gs,cs,u
S115	181	gs,cs,a,c,c,c,c,a,Af,Gf,Cf,a,g,a,a,c,g,a,g,c,a	217	us,dGs,c,u,dC,g,dT,u,c,u,g,dC,u,Uf,g,g,g,g,u,g,cs,cs,u
S116	182	as,cs,u,g,g,c,a,c,Cf,Cf,Cf,a,a,g,c,a,g,a,a,c,a	218	us,dGs,u,u,dC,u,dG,c,u,u,g,dG,g,Gf,u,g,c,c,a,g,us,us,u
S117	183	as,cs,c,c,c,a,a,g,Cf,Af,Gf,a,a,c,g,a,g,c,u,c,a	219	us,dGs,a,g,dC,u,dC,g,u,u,c,dT,g,Cf,u,u,g,g,g,g,us,gs,u
S118	184	as,gs,a,c,c,a,u,u,Af,Cf,Gf,u,a,g,a,c,Uf,u,c,c,a	220	U,us,dGs,gs,a,dA,g,dT,c,u,a,c,dG,u,Af,a,u,g,g,u,cs,us,cs,g
S119	184	as,gs,a,c,c,a,u,u,Af,Cf,Gf,u,a,g,a,c,Uf,u,c,c,a	221	B33s,Gfs,gs,a,dA,g,dT,c,u,a,c,Gf,u,Af,a,Uf,g,Gf,u,Cfs,us,Cfs,g
S120	184	as,gs,a,c,c,a,u,u,Af,Cf,Gf,u,a,g,a,c,Uf,u,c,c,a	222	us,dGs,gs,a,dA,g,dR,c,u,a,c,dG,u,Af,a,u,g,g,u,cs,us,cs,g
S121	184	as,gs,a,c,c,a,u,u,Af,Cf,Gf,u,a,g,a,c,Uf,u,c,c,a	223	B33s,dGs,gs,a,dA,g,dR,c,u,a,c,dG,u,Af,a,u,g,g,u,cs,us,cs,g
S122	184	as,gs,a,c,c,a,u,u,Af,Cf,Gf,u,a,g,a,c,Uf,u,c,c,a	224	B33s,Gfs,gs,a,dA,g,Z,c,u,a,c,Gf,u,Af,a,Uf,g,Gf,u,Cfs,us,Cfs,g
S123	184	as,gs,a,c,c,a,u,u,Af,Cf,Gf,u,a,g,a,c,Uf,u,c,c,a	225	B33s,Gfs,g,a,Af,g,Uf,c,u,a,c,g,u,Af,a,Uf,g,Gf,u,c,us,cs,g
S124	185	as,gs,a,c,c,Af,Uf,u,Af,Cf,Gf,u,a,g,a,c,Uf,u,c,c,a	220	U,us,dGs,gs,a,dA,g,dT,c,u,a,c,dG,u,Af,a,u,g,g,u,cs,us,cs,g
S125	186	cs,cs,Af,Uf,u,Af,Cf,Gf,u,a,g,a,c,Uf,u,c,c,a	226	us,dGs,gs,a,dA,g,dT,c,u,a,c,dG,u,Af,a,u,g,g,u,cs,us,cs,g
S126	187	cs,cs,Af,Uf,u,Af,Cf,Gf,u,a,g,a,c,u,u,c,c,a	227	B33s,dGs,gs,a,dA,g,dT,c,u,a,c,dG,u,Af,a,u,g,g,u,cs,us,cs,g
S127	188	as,gs,a,c,c,Af,Uf,u,Af,Cf,Gf,u,a,g,a,c,u,u,c,c,a	228	B33s,dGs,gs,a,dA,g,dT,c,u,a,c,g,u,Af,a,u,g,g,u,cs,us,cs,g
S128	188	as,gs,a,c,c,Af,Uf,u,Af,Cf,Gf,u,a,g,a,c,u,u,c,c,a	229	B33s,dGs,gs,a,dA,g,dR,c,u,a,c,g,u,Af,a,u,g,g,u,cs,us,cs,g
S129	188	as,gs,a,c,c,Af,Uf,u,Af,Cf,Gf,u,a,g,a,c,u,u,c,c,a	225	B33s,Gfs,g,a,Af,g,Uf,c,u,a,c,g,u,Af,a,Uf,g,Gf,u,c,us,cs,g

。

本發明提供一種綴合物或其藥學上可接受的鹽，其包含上述任一雙鏈siRNA和藥學上可接受的綴合基團。

在本發明的一些方案中，上述綴合物或其藥學上可接受的鹽可以包含1、2、3、4或5個藥學上可接受的綴合基團。

在本發明的一些方案中，上述綴合物或其藥學上可接受的鹽包含1個藥學上可接受的綴合基團。

在本發明的一些方案中，上述藥學上可接受的綴合基團選自抗體、多肽和配體。

在本發明的一些方案中，上述藥學上可接受的綴合基團分別獨立地可連接至雙鏈siRNA的正義鏈和/或反義鏈的任一核苷酸上。

在本發明的一些方案中，上述藥學上可接受的綴合基團可連接至雙鏈siRNA的正義鏈和/或反義鏈的3’末端和/或5’末端。

在本發明的一些方案中，上述藥學上可接受的綴合基團分別獨立地含有1、2、3、4或5個GalNAc基團，所述GalNAc基團可與ASGPR結合。

在本發明的一些方案中，上述綴合基團選自如下結構：、、、、、和。

本發明中，所述綴合物中雙鏈siRNA和綴合基團的連接方式如下所示：，，，，，和。

其中，SS表示正義鏈，AS表示反義鏈；X選自O和S。

在本發明的一些方案中，上述綴合物選自C1-C47。

在本發明的一些方案中，上述綴合物選自表3：表3 綴合物

綴合物	正義鏈序列 SEQ ID NO	綴合基團（通過磷酸酯鍵或磷硫酯鍵綴合在正義鏈的3’端）	反義鏈序列 SEQ ID NO
C1	161	D01	189
C2	162	D01	190
C3	163	D01	191
C4	164	D01	192
C5	165	D01	193
C6	166	D01	194
C7	167	D01	195
C8	168	D01	196
C9	169	D01	197
C10	170	D01	198
C11	171	D01	199
C12	172	D01	200
C13	161	D01	201
C14	161	D01	202
C15	161	D01	203
C16	161	D01	204
C17	161	D01	205
C18	161	D01	206
C19	173	D01	205
C20	174	D01	205
C21	161	D01	230
C22	161	D01	207
C23	161	D01	208
C24	161	D01	209
C25	161	D01	210
C27	175	D01	211
C28	176	D01	212
C29	177	D01	213
C30	178	D01	214
C31	179	D01	215
C32	180	D01	216
C33	181	D01	217
C34	182	D01	218
C35	183	D01	219
C36	184	D01	220
C37	184	D01	221
C38	184	D01	222
C39	184	D01	223
C40	184	D01	224
C41	184	D01	225
C42	185	D01	220
C43	186	D01	226
C44	187	D01	227
C45	188	D01	228
C46	188	D01	229
C47	188	D01	225

本發明的一些方案中，上述綴合物如式(I)所示：其中，X為O或S；SS為所述正義鏈，AS為所述反義鏈；所述正義鏈和所述反義鏈選自如（1）~（9）任意一項所示的組合：（1） 所述正義鏈如SEQ ID NO: 161所示，所述反義鏈如SEQ ID NO: 189所示；（2） 所述正義鏈如SEQ ID NO: 161所示，所述反義鏈如SEQ ID NO: 210所示；（3） 所述正義鏈如SEQ ID NO: 186所示，所述反義鏈如SEQ ID NO: 226所示；（4） 所述正義鏈如SEQ ID NO: 188所示，所述反義鏈如SEQ ID NO: 225所示；（5） 所述正義鏈如SEQ ID NO: 164所示，所述反義鏈如SEQ ID NO: 192所示；（6） 所述正義鏈如SEQ ID NO: 171所示，所述反義鏈如SEQ ID NO: 199所示；（7） 所述正義鏈如SEQ ID NO: 161所示，所述反義鏈如SEQ ID NO: 202所示；（8） 所述正義鏈如SEQ ID NO: 185所示，所述反義鏈如SEQ ID NO: 220所示；（9） 所述正義鏈如SEQ ID NO: 188所示，所述反義鏈如SEQ ID NO: 228所示。

本發明的一些方案中，上述綴合物如式(I)所示：其中，X為O；SS為所述正義鏈，AS為所述反義鏈；所述正義鏈和所述反義鏈選自如（1）~（4）任意一項所示的組合：（1） 所述正義鏈如SEQ ID NO: 161所示，所述反義鏈如SEQ ID NO: 189所示；（2） 所述正義鏈如SEQ ID NO: 161所示，所述反義鏈如SEQ ID NO: 210所示；（3） 所述正義鏈如SEQ ID NO: 186所示，所述反義鏈如SEQ ID NO: 226所示；（4） 所述正義鏈如SEQ ID NO: 188所示，所述反義鏈如SEQ ID NO: 225所示。本發明還提供上述雙鏈siRNA、其綴合物、其鹽或其綴合物的鹽在製備治療與INHBE基因表達相關疾病的藥物中的應用。

本發明的一些方案中，上述的應用，其特徵在於，所述與INHBE基因表達相關疾病是體脂分佈異常導致的代謝類疾病。

本發明的一些方案中，上述的應用，其中所述體脂分佈異常導致的代謝類疾病包括但不限於2型糖尿病、肥胖症、腹部肥胖、冠心病、非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝炎、高脂血症、血脂異常、動脈粥樣硬化症等。

本發明還提供如下測試方法測試方法1：PHH細胞自由攝取實驗1.實驗原理：將待測樣品與人原代肝細胞進行孵育，評估待測樣品對INHBE mRNA的下調程度。2.實驗材料：人原代肝細胞 (PHH)，RNeasy® 96 Kit，FastKing RT Kit (With gDNase)，TaqMan Gene Expression Assay。3.實驗方法：用PBS溶液將本發明綴合物稀釋至待測濃度的10倍。轉移10μL siRNA到96孔板中。將PHH細胞解凍並移植到96孔板中，最終的細胞密度為5.4×10⁵細胞/孔。本發明綴合物測試10個濃度點，最高濃度為500nM，4倍稀釋。細胞在37℃，5% CO₂中孵育48h，用顯微鏡檢查細胞狀態。孵育完成後，將細胞裂解，使用獲得裂解液，RNeasy® 96 Kit提取所有的RNA，並用FastKing RT Kit (With gDNase)反轉錄獲得cDNA。用qPCR檢測INHBE cDNA。4. 實驗結論：本發明綴合物可以顯著下調PHH細胞中的INHBE mRNA水平。

測試方法2：非人類靈長類動物食蟹猴體內PD實驗1.實驗原理：通過與人類INHBE基因高度同源的非人類靈長類動物食蟹猴模型，觀察待測樣品對食蟹猴血漿INHBE蛋白的下調程度。2.實驗材料：食蟹猴，1x PBS（磷酸緩衝液），本發明綴合物。3.實驗方法：訂購體重在2-3公斤的食蟹猴10隻，到達動物房後適應檢疫一週。給藥前第6天，按照體重數據將食蟹猴隨機分組，每組2隻，分組後檢測所有食蟹猴的血漿INHBE蛋白濃度，作為每組的實驗數據基線。第1天給藥，給藥後在第1, 2, 4, 8, 15, 22, 29, 32, 35, 43, 57, 71天採血，檢測每隻食蟹猴血漿INHBE蛋白濃度。比較給藥後的血漿INHBE蛋白濃度和給藥前第6天的INHBE蛋白濃度，得到每組動物INHBE蛋白相對下調比例。4.實驗結論：本發明綴合物可以顯著下調食蟹猴血漿中INHBE蛋白濃度。

測試方法3：體外RNA測序研究1.實驗介紹：轉錄組是指特定組織或細胞在某個時間或某個狀態下轉錄出來的所有RNA的總和，主要包括mRNA和非編碼RNA。轉錄組測序是基於Illumina測序平臺，研究特定組織或細胞在某個時期轉錄出來的所有mRNA，是基因功能與結構研究的基礎，對理解生物體的發育和疾病的發生具有重要作用。隨著基因測序技術的發展以及測序成本的降低，RNA-seq憑藉高通量、高靈敏度、應用範圍廣等優勢，已成為轉錄組研究的主要方法。RNA-seq技術流程主要包含兩個部分：建庫測序和生物訊息分析。2.RNA提取與檢測：採用標準提取方法從組織或細胞中提取RNA，隨後對RNA樣品進行嚴格質控，質控方式主要是通過Agilent 2100 bioanalyzer：精確檢測RNA完整性。3.文庫構建與質檢：mRNA的獲取主要有兩種方式：一是利用真核生物大部分mRNA都帶有polyA尾的結構特徵，通過Oligo(dT)磁珠富集帶有polyA尾的mRNA。二是從總RNA中去除核糖體RNA，從而得到mRNA。隨後在NEB Fragmentation Buffer中用二價陽離子將得到的mRNA隨機打斷，按照NEB普通建庫方式或鏈特異性建庫方式進行建庫。NEB普通建庫：以片段化的mRNA為模版，隨機寡核苷酸為引子，在M-MuLV反轉錄酶體系中合成cDNA第一條鏈，隨後用RNaseH降解RNA鏈，並在DNA polymerase I體系下，以dNTPs為原料合成cDNA第二條鏈。純化後的雙鏈cDNA經過末端修復、加A尾並連接測序接頭，用AMPure XP beads篩選250-300bp左右的cDNA，進行PCR擴增並再次使用AMPure XP beads純化PCR產物，最終獲得文庫。建庫用試劑盒為NEBNext® Ultra™ RNA Library Prep Kit for Illumina®。鏈特異性建庫：反轉錄合成cDNA第一條鏈方法與NEB普通建庫方法相同，不同之處在於合成第二條鏈時，dNTPs中的dTTP由dUTP取代，之後同樣進行cDNA末端修復、加A尾、連接測序接頭和長度篩選，然後先使用USER酶降解含U的cDNA第二鏈再進行PCR擴增並獲得文庫。鏈特異性文庫具有諸多優勢，如相同數據量下可獲取更多有效訊息；能獲得更精準的基因定量、定位與註釋訊息；能提供反義轉錄本及每一isoform中單一exon的表達水平。建庫所用試劑盒為NEBNext® Ultra™ Directional RNA Library Prep Kit for Illumina®。註：測序接頭：包括P5/P7，index和Rd1/Rd2 SP三個部分。其中P5/P7是PCR擴增引子及flow cell上引子結合的部分，index提供區分不同文庫的訊息，Rd1/Rd2 SP即read1/read2 sequence primer，是測序引子結合區域，測序過程理論上由Rd1/Rd2 SP向後開始進行。文庫構建完成後，先使用Qubit2.0 Fluorometer進行初步定量，稀釋文庫至1.5ng/μL，隨後使用Agilent 2100 bioanalyzer對文庫的insert size進行檢測，insert size符合預期後，qRT-PCR對文庫有效濃度進行準確定量（文庫有效濃度高於2nM），以保證文庫質量。4.上機測序：庫檢合格後，把不同文庫按照有效濃度及目標下機數據量的需求pooling後進行Illumina測序。測序的基本原理是邊合成邊測序（Sequencing by Synthesis）。在測序的flow cell中加入四種螢光標記的dNTP、DNA聚合酶以及接頭引子進行擴增，在每一個測序簇延伸互補鏈時，每加入一個被螢光標記的dNTP就能釋放出相對應的螢光，測序儀通過捕獲螢光訊號，並通過計算機軟體將光訊號轉化為測序峰，從而獲得待測片段的序列訊息。5.實驗結論：本發明綴合物在RNA測序研究中顯著下調INHBE基因。

測試方法4：Huh7細胞轉染實驗1.實驗目的：本研究的目的是應用Huh7細胞評價該專利所述綴合物抑制靶基因的效果，以化合物的IC₅₀值為指標，來評價化合物對靶基因INHBE的抑制活性。2.實驗材料:2.1細胞系：Huh7細胞，本發明綴合物Huh7細胞在含10 % 胎牛血清、1%青黴素-鏈黴素的 DMEM 培養基中培養。2.2試劑：本實驗使用的主要試劑包括Lipofectamine™iRNAiMAX 轉染試劑，FastStart Universal Probe Mast，RNA提取試劑盒，GAPDH基因表達試劑盒，INHBE基因表達試劑盒，FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒，96 孔板。2.3耗材與儀器：本實驗使用的主要儀器包括螢光qPCR儀（Applied Biosystems，型號QuantStudio 6 Flex）、細胞計數儀（Vi-cellTM XR）。3.實驗步驟和方法：3.1轉染1）第一天，按需配置RNAiMAX轉染試劑和Opti-MEM混合液，室溫孵育15分鐘；2）對於每孔細胞，取一定量的稀釋好的化合物加入到等量的 RNAiMAX Optim-MEM培養液中，混勻，孵育15分鐘；3）取Huh7細胞，先用DPBS洗滌後，加入胰蛋白酶進行消化，調整細胞到合適的密度；4）種細胞同時取20μL Opti-MEM RNAiMax和化合物的混合物加入到細胞培養板中，以每孔20,000個細胞的密度接種到96孔板中，每孔最終的培養液為120 μL。5）細胞置於5% CO₂、37℃孵箱中培養24h。3.2 RNA提取及反轉錄收集細胞，參照提取試劑盒說明書提取RNA，參照FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒說明書將RNA反轉錄為cDNA。3.3 QPCR檢測利用qPCR檢測目的基因cDNA，GAPDH作為內參基因，qPCR在384孔板中進行。qPCR反應程序為：95℃加熱10分鐘，然後進入循環模式，95℃加熱15秒，隨後60℃ 1分鐘，共40個循環。3.4 數據分析：ΔΔCt 法（Ct差值比較法）此方法裡面需要引進內參基因GAPDH，因為內參基因在所有細胞中均表達，其產物是維持細胞生存所必須，且在細胞中的表達量或基因組的拷貝數恆定，受環境影響小。qRT- PCR後，內參的CT值同時會被記錄，被稱為Ct(GAPDH)，樣品的CT值，被稱為Ct(樣品)。ΔCt (樣品) =Ct (樣品)-Ct (GAPDH)ΔCt (對照) =Ct (對照)-Ct (GAPDH)ΔΔCt=ΔCt (樣品) -ΔCt (對照)基因的相對表達量=2^-ΔΔCt4. 實驗結論：本發明綴合物在Huh7細胞中對INHBE mRNA有良好的剔除效果。

技術效果本發明雙鏈siRNA和綴合物可在體外及體內顯著抑制INHBE mRNA的表達，脫靶風險低，穩定性良好，可以用於治療與INHBE基因和蛋白相關的疾病。

定義和說明除非另有說明，本文所用的下列術語和短語旨在具有下列含義。一個特定的術語或短語在沒有特別定義的情況下不應該被認為是不確定的或不清楚的，而應該按照本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解的含義去理解。當本文中出現商品名時，意在指代其對應的商品或其活性成分。

除非另有說明，否則術語「包含、包括和含有」或等同物為開放式表述，意味著除所列出的要素、組分或步驟外，還可涵蓋其他未指明的要素、組分或步驟。

除非另有說明，本發明所述「序列」或「核苷酸序列」表示使用標準核苷酸命名的一序列字母描述的核鹼基或核苷酸的次序或順序物。

雙鏈siRNA是指核糖核酸分子的複合體，其具有雙鏈結構，包含兩條反向平行的且基本上互補的核酸鏈，其相對於靶RNA具有「正義」和「反義」定向。在本發明中，「互補」具有本發明所屬技術領域中具有通常知識者周知的含義，即，在雙鏈核酸分子中，一條鏈的鹼基與另一條鏈上的鹼基以互補的方式相配對。嘌呤鹼基腺嘌呤（A）始終與嘧啶鹼基尿嘧啶（U）或胸腺嘧啶（T）相配對；嘌呤鹼基鳥嘌呤（G）始終與嘧啶鹼基胞嘧啶（C）相配對。每個鹼基對都包括一個嘌呤和一個嘧啶。當一條鏈上的腺嘌呤始終與另一條鏈上的尿嘧啶配對，以及鳥嘌呤始終與胞嘧啶配對時，兩條鏈被認為是彼此相互補的，以及從其互補鏈的序列中可以推斷出該鏈的序列。

本發明所述術語「單鏈寡核苷酸」指具有與靶mRNA至少部分互補的序列的單鏈寡聚核苷酸，其能夠通過氫鍵在哺乳動物生理條件(或相當的體外環境)下與靶mRNA雜交。在本發明的一些實施方式中，單鏈寡核苷酸是單鏈反義寡核苷酸。

本發明所述術語「雙鏈寡核苷酸」指包含兩個反向平行且基本互補的核苷酸鏈的雙鏈體結構，其中一條鏈為正義鏈，另一條鏈為反義鏈，其中所述反義鏈是指與靶序列(例如，INHBE mRNA)的相應區域基本上互補的鏈，其能夠通過氫鍵在哺乳動物生理條件(或相當的體外環境)下與靶mRNA雜交。所述「基本上互補」是指兩條序列的相應位置可以完全互補，也可以存在一個或多個錯配，當存在錯配通常為存在不超過3、2或1個錯配的鹼基對。在雙鏈核酸分子中，一條鏈的鹼基與另一條鏈上的鹼基以互補的方式相配對。嘌呤鹼基腺嘌呤（A）始終與嘧啶鹼基尿嘧啶（U）相配對；嘌呤鹼基鳥嘌呤（G）始終與嘧啶鹼基胞嘧啶（C）相配對。在本發明的一些實施方式中，雙鏈寡核苷酸是雙鏈siRNA。

本發明所述「短干擾RNA(siRNA)」是一類RNA分子，雙鏈區長度為17～25個鹼基對，類似於miRNA，並且在RNA干擾(RNAi)途徑內操作，它干擾了與核苷酸序列互補的特定基因的mRNA的翻譯，導致mRNA降解。本發明所述短干擾RNA(siRNA)包括雙鏈siRNA(包括正義鏈和反義鏈)和單鏈siRNA(僅反義鏈)。

在本發明中，如無特別說明，大寫字母T、C、G、U、A表示核苷酸的鹼基組成。

本發明中所述核苷酸的「修飾」包括但不限於甲氧基修飾、氟代修飾、(E)-乙烯基磷酸酯修飾、硫代磷酸酯基連接或將核苷酸替換為GNA（甘油核酸）核苷酸的單體，所述GNA包括GNA-A、GNA-T、GNA-C、GNA-G和GNA-U。本發明所述的序列可以包括如表2中「進一步修飾的序列」所列。

本發明所述氟代修飾的核苷酸指核苷酸的核糖基2’位的羥基被氟取代形成的核苷酸，所述甲氧基修飾的核苷酸指核糖基的2’-羥基被甲氧基取代而形成的核苷酸。

本發明所述GNA（甘油核酸）核苷酸的單體（GNA-A、GNA-T、GNA-C、GNA-G和GNA-U）：GNA-A結構為；GNA-T結構為；GNA-C結構為；GNA-G結構為；GNA-U結構為。

除非另有規定，本發明所述的「核苷酸任選被修飾」是指核苷酸可以是未經修飾的核苷酸，也可以是經修飾的核苷酸，所述「未經修飾的核苷酸」是指由天然的核鹼基、糖環及磷酸酯組成的核苷酸。所述「經修飾的核苷酸」是指由修飾的核鹼基，和/或修飾的糖環，和/或修飾的磷酸酯組成的核苷酸。在本發明的一些實施例中，「經修飾的核苷酸」由修飾的核鹼基、修飾的糖環和天然的磷酸酯組成；在本發明的一些實施例中，「經修飾的核苷酸」由修飾的核鹼基、修飾的磷酸酯和天然的糖環組成；在本發明的一些實施例中，「經修飾的核苷酸」由天然的核鹼基、修飾的糖環和修飾的磷酸酯組成；在本發明的一些實施例中，「經修飾的核苷酸」由修飾的核鹼基、天然的糖環和天然的磷酸酯組成；在本發明的一些實施例中，「經修飾的核苷酸」由天然的核鹼基、修飾的糖環和天然的磷酸酯組成；在本發明的一些實施例中，「經修飾的核苷酸」由天然的核鹼基、天然的糖環和修飾的磷酸酯組成；在本發明的一些實施例中，「經修飾的核苷酸」由修飾的核鹼基、修飾的糖環和修飾的磷酸酯組成。

除非另有規定，本發明所述「天然的糖環」選自2’-OH的五元糖環。

除非另有規定，本發明所述「天然的鹼基」選自嘌呤鹼基腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)，以及嘧啶鹼基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。

除非另有規定，本發明所述「修飾的核鹼基」是指除天然鹼基之外的5-12元的飽和、部分不飽和或芳香的雜環，包括單環或稠環，其具體例包括但不限於噻吩、噻蒽、呋喃、吡喃、異苯並呋喃、苯並噻𠯤、吡咯、咪唑、取代或未取代的三氮唑、吡唑、異噻唑、異㗁唑、嗒𠯤、吲哚𠯤、吲哚、異吲哚、異喹啉、喹啉、萘並吡啶、喹唑啉、哢唑、菲啶、哌啶、吩𠯤、菲那𠯤、吩噻𠯤、呋喃烷、吩㗁𠯤、吡咯烷、吡咯啉、咪唑烷、咪唑啉、吡唑烷、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-胺基腺嘌呤、2-胺基腺嘌呤、2-胺基鳥嘌呤、2-丙基的腺嘌呤和鳥嘌呤以及其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、2-硫代胞嘧啶、5-鹵代尿嘧啶以及胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶以及胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-鹵基，8-胺基，8-氫硫基，8-硫烷基，8-羥基以及其他8-取代腺嘌呤和鳥嘌呤、5-鹵基尤其是5-溴，5-三氟甲基以及其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮鳥嘌呤和8-氮腺嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤和7-脫氮腺嘌呤、以及3-脫氮鳥嘌呤和3-脫氮腺嘌呤、、、、和。

除非另有規定，本發明所述「修飾的糖環」可以在2'位置包含但不限於以下之一的修飾：H；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C₁至C₁₀烷基或C₂至C₁₀烯基和炔基。示例性的適合的修飾包括O[(CH₂)_nO]_mCH₃、O(CH₂)_nOCH₃、O(CH₂)_nNH₂、O(CH₂)_nCH₃、O(CH₂)_nONH₂、和O(CH₂)_nON[(CH₂)_nCH₃)]₂，其中n和m是從1至10。在其他實施例中，在2'位置包含但不限於以下之一的修飾：取代或未取代的C₁至C₁₀低級烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH₃、OCN、Cl、Br、CN、CF₃、OCF₃、SOCH₃、SO₂CH₃、ONO₂、NO₂、N₃、NH₂、雜環烷基、雜環烷芳基、胺烷基胺基、聚烷胺基、取代的甲矽烷基、RNA切割基團、報導基團、嵌入劑、用於改善iRNA的藥物代謝動力學特性的基團、或用於改善iRNA的藥效特徵的基團、和具有相似特性的其他取代基。在一些實施例中，該修飾包括但不限於2'-甲氧基乙氧基(2'-O-CH₂CH₂OCH₃，也稱作2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE)。

除非另有規定，本發明所述「修飾的磷酸酯」包括但不限於：硫代磷酸酯修飾，所述的「硫代磷酸酯」包括(R)-和(S)-異構體和/或其混合物。

除非另有說明，術語「磷酸酯」以本發明所屬技術領域中具有通常知識者理解的一般含義使用，並且包括其質子化形式(例如，和)。

除非另有說明，術語「硫代磷酸酯」和「硫代磷酸酯(phosphorothioate)」是指式，其質子化形式(例如，)及其互變異構體(例如)的化合物。

在本發明的一些實施例序列中，修飾的核苷酸包含一個或多個dX（脫氧核苷酸）核苷酸的單體。dX包括dA、dT、dC和dG。dA結構為；dT結構為；dC結構為；dG結構為。

除非另有規定，本發明所述「突出端」是指從雙鏈化合物的雙鏈區結構突出的至少一個未配對的核苷酸。例如一條鏈的3’-端延伸超出另一條鏈5’-端，或一條鏈的5’-端延伸超出另一條鏈3’-端。所述的突出端可包含至少一個核苷酸；或者該突出端可包含至少兩個核苷酸、至少三個核苷酸、至少四個核苷酸、至少五個或更多個核苷酸。核苷酸突出端的核苷酸為任選經修飾的核苷酸。突出端可位於正義鏈、反義鏈或其任何組合上。此外，突出端可存在於雙鏈化合物的反義或正義鏈的5’-端、3’-端或同時存在於兩端。在本發明的一些實施例中，反義鏈在3’-端和/或5’-端具有1至10個核苷酸 (例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸)的突出端。在本發明的一些實施例中，正義鏈在3’-端和/或5’-端具有1至10個核苷酸 (例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸)的突出端。在本發明的一些實施例中，反義鏈在3’-端，正義鏈在3’-端具有1至10個核苷酸 (例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸)的突出端。在本發明的一些實施例中，反義鏈在5’-端，正義鏈在5’-端具有1至10個核苷酸 (例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸)的突出端。

本發明中，雙鏈siRNA的綴合物（也稱「綴合物」）是雙鏈siRNA和藥學上可接受的綴合基團連接形成的化合物，並且雙鏈siRNA和藥學上可接受的綴合基團共價連接。

本發明中，藥學上可接受的綴合基團包括但不限於抗體、多肽、配體等。

本發明中，藥學上可接受的綴合基團的數量為1、2、3、4或5個，且所述藥學上可接受的綴合基團分別獨立地可連接至雙鏈siRNA的正義鏈和/或反義鏈的任一核苷酸上。

本發明中，藥學上可接受的綴合基團可連接至雙鏈siRNA的正義鏈和/或反義鏈的3’末端和/或5’末端。

本發明中，藥學上可接受的綴合基團的數量為1、2、3、4或5個，且所述藥學上可接受的綴合基團分別獨立地可連接至雙鏈siRNA的正義鏈和/或反義鏈的3’末端和/或5’末端。

在本發明的上下文中，除非另有說明，「綴合」是指兩個或多個各自具有特定功能的化學部分之間以共價連接的方式彼此連接；相應地，「綴合物」是指該各個化學部分之間通過共價連接而形成的化合物。

在本發明中，除非另有說明，「鍵聯體」是指連接化合物的兩個部分的有機部分基團，例如：共價附接化合物的兩個部分。該鍵聯體通常包含一個直接鍵聯或原子(如：氧或硫)、原子團(如：NRR、C(O)、C(O)NH、SO、SO₂、SO₂NH)、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、取代或未取代的環烷基、取代或未取代的雜環烷基，其中所述取代或未取代的烷基、取代或為取代的烯基、取代或未取代的炔基中的任選的一個或多個C原子能被取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、取代或未取代的環烷基、取代或未取代的雜環烷基替換。

可裂解的鍵聯體在細胞外具有充分穩定性，但當進入標靶細胞內時即會裂解而釋出該鍵聯體所共同固定的兩個部分的基團。

本發明的化合物可以存在特定的幾何或立體異構體形式。本發明設想所有的這類化合物，包括 (R)- 和 (S)-對映體、非對映異構體，及其外消旋混合物和其他混合物，例如對映異構體或非對映體富集的混合物，所有這些混合物都屬於本發明的範圍之內。烷基等取代基中可存在另外的不對稱碳原子。所有這些異構體以及它們的混合物，均包括在本發明的範圍之內。

除非另有說明，術語「對映異構體」或者「旋光異構體」是指互為鏡像關係的立體異構體。

除非另有說明，術語「非對映異構體」是指分子具有兩個或多個手性中心，並且分子間為非鏡像的關係的立體異構體。

除非另有說明，用楔形實線鍵（）和楔形虛線鍵（）表示一個立體中心的絕對構型，用直形實線鍵（）和直形虛線鍵（）表示立體中心的相對構型，用波浪線（）表示楔形實線鍵（）或楔形虛線鍵（），或用波浪線（）表示直形實線鍵（）或直形虛線鍵（）。

除非另有說明，術語「富含一種異構體」、「異構體富集」、「富含一種對映體」或者「對映體富集」指其中一種異構體或對映體的含量小於100%，並且，該異構體或對映體的含量大於等於60%，或者大於等於70%，或者大於等於80%，或者大於等於90%，或者大於等於95%，或者大於等於96%，或者大於等於97%，或者大於等於98%，或者大於等於99%，或者大於等於99.5%，或者大於等於99.6%，或者大於等於99.7%，或者大於等於99.8%，或者大於等於99.9%。

除非另有說明，術語「異構體過量」或「對映體過量」指兩種異構體或兩種對映體相對百分數之間的差值。例如，其中一種異構體或對映體的含量為90%，另一種異構體或對映體的含量為10%，則異構體或對映體過量（ee值）為80%。

可以通過的手性合成或手性試劑或者其他常規技術製備光學活性的(R)-和(S)-異構體以及D和L異構體。如果想得到本發明某化合物的一種對映體，可以通過不對稱合成或者具有手性助劑的衍生作用來製備，其中將所得非對映體混合物分離，並且輔助基團裂開以提供純的所需對映異構體。 或者，當分子中含有鹼性官能團（如胺基）或酸性官能團（如羧基）時，與適當的光學活性的酸或鹼形成非對映異構體的鹽，然後通過本領域所公知的常規方法進行非對映異構體拆分，然後回收得到純的對映體。此外，對映異構體和非對映異構體的分離通常是通過使用色譜法完成的，所述色譜法採用手性固定相，並任選地與化學衍生法相結合（例如由胺生成胺基甲酸鹽）。

除非另有規定，當某一基團具有一個或多個可連接位點時，該基團的任意一個或多個位點可以通過化學鍵與其他基團相連。所述位點與其他基團連接的化學鍵可以用波浪線（）表示。例如中的波浪線表示通過dR中的3和5位氧原子與雙鏈siRNA其他核苷酸相連。

本發明的化合物可以在一個或多個構成該化合物的原子上包含非天然比例的原子同位素。例如，可用放射性同位素標記化合物，比如氚（³H），碘-125（¹²⁵I）或C-14（¹⁴C）。又例如，可用重氫取代氫形成氘代藥物，氘與碳構成的鍵比普通氫與碳構成的鍵更堅固，相比於未氘化藥物，氘代藥物有降低毒副作用、增加藥物穩定性、增強療效、延長藥物生物半衰期等優勢。本發明的化合物的所有同位素組成的變換，無論放射性與否，都包括在本發明的範圍之內。

本文所用的術語「藥學上可接受的鹽」表示本發明化合物的那些羧酸鹽、胺基酸加成鹽，它們在可靠的醫學判斷範圍內適用於與患者組織接觸，不會產生不恰當的毒性、刺激作用、變態反應等，與合理的益處/風險比相稱，就它們的預期應用而言是有效的，包括(可能的話)本發明化合物的兩性離子形式。

術語「鹽」是指本發明化合物的鹽，由本發明發現的具有特定取代基的化合物與相對無毒的酸或鹼製備。當本發明的化合物中含有相對酸性的功能團時，可以通過在純的溶液或合適的惰性溶劑中用足夠量的鹼與這類化合物接觸的方式獲得鹼加成鹽。藥學上可接受的鹼加成鹽包括鈉、鉀、鈣、銨、有機胺或鎂鹽或類似的鹽。當本發明的化合物中含有相對鹼性的官能團時，可以通過在純的溶液或合適的惰性溶劑中用足夠量的酸與這類化合物接觸的方式獲得酸加成鹽。藥學上可接受的酸加成鹽的實例包括無機酸鹽，所述無機酸包括例如鹽酸、氫溴酸、硝酸、碳酸、碳酸氫根、磷酸、磷酸一氫根、磷酸二氫根、硫酸、硫酸氫根、氫碘酸、亞磷酸等；以及有機酸鹽，所述有機酸包括如乙酸、丙酸、異丁酸、馬來酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、扁桃酸、鄰苯二甲酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、檸檬酸、酒石酸和甲磺酸等類似的酸；還包括胺基酸（如精胺酸等）的鹽，以及如葡糖醛酸等有機酸的鹽。本發明的某些特定的化合物含有鹼性和酸性的官能團，從而可以被轉換成任一鹼或酸加成鹽。

本發明的鹽可由含有酸根或鹼基的母體化合物通過常規化學方法合成。一般情況下，這樣的鹽的製備方法是：在水或有機溶劑或兩者的混合物中，經由游離酸或鹼形式的這些化合物與化學計量的適當的鹼或酸反應來製備。

本發明的化合物可以通過本發明所屬技術領域中具有通常知識者所熟知的多種合成方法來製備，包括下面列舉的具體實施方式、其與其他化學合成方法的結合所形成的實施方式以及本發明所屬技術領域中具有通常知識者所熟知的等同替換方式，優選的實施方式包括但不限於本發明的實施例。

本發明的化合物可以在一個或多個構成該化合物的原子上包含非天然比例的原子同位素。例如，可用放射性同位素標記化合物，比如氚（³H），碘-125（¹²⁵I）或C-14（¹⁴C）。又例如，可用重氫取代氫形成氘代藥物，氘與碳構成的鍵比普通氫與碳構成的鍵更堅固，相比於未氘化藥物，氘代藥物有降低毒副作用、增加藥物穩定性、增強療效、延長藥物生物半衰期等優勢。本發明的化合物的所有同位素組成的變換，無論放射性與否，都包括在本發明的範圍之內。

當所列舉的連接基團沒有指明其連接方向，其連接方向是任意的，例如，中連接基團L為-M-W-，此時-M-W-既可以按與從左往右的讀取順序相同的方向連接環A和環B構成，也可以按照與從左往右的讀取順序相反的方向連接環A和環B構成。所述連接基團、取代基和/或其變體的組合只有在這樣的組合會產生穩定的化合物的情況下才是被允許的。

術語「任選」或「任選地」指的是隨後描述的事件或狀況可能但不是必需出現的，並且該描述包括其中所述事件或狀況發生的情況以及所述事件或狀況不發生的情況。

術語「被取代的」是指特定原子上的任意一個或多個氫原子被取代基取代，取代基可以包括重氫和氫的變體，只要特定原子的價態是正常的並且取代後的化合物是穩定的。當取代基為氧（即=O）時，意味著兩個氫原子被取代。氧取代不會發生在芳香基上。術語「任選被取代的」是指可以被取代，也可以不被取代，除非另有規定，取代基的種類和數目在化學上可以實現的基礎上可以是任意的。

當任何變量（例如R）在化合物的組成或結構中出現一次以上時，其在每一種情況下的定義都是獨立的。因此，例如，如果一個基團被0-2個R所取代，則所述基團可以任選地至多被兩個R所取代，並且每種情況下的R都有獨立的選項。此外，取代基和/或其變體的組合只有在這樣的組合會產生穩定的化合物的情況下才是被允許的。

當一個連接基團的數量為0時，比如-(CRR)₀-，表示該連接基團為單鍵。

當一個取代基為空缺時，表示該取代基是不存在的，比如A-X中X為空缺時表示該結構實際上是A。當所列舉的取代基中沒有指明其通過哪一個原子連接到被取代的基團上時，這種取代基可以通過其任何原子相鍵合，例如，吡啶基作為取代基可以通過吡啶環上任意一個碳原子連接到被取代的基團上。

本發明的化合物可以通過本發明所屬技術領域中具有通常知識者所熟知的多種合成方法來製備，包括下面列舉的具體實施方式、其與其他化學合成方法的結合所形成的實施方式以及本發明所屬技術領域中具有通常知識者所熟知的等同替換方式，優選的實施方式包括但不限於本發明的實施例。

本發明的化合物可以通過本發明所屬技術領域中具有通常知識者所熟知的常規方法來確認結構，如果本發明涉及化合物的絕對構型，則該絕對構型可以通過本領域常規技術手段予以確證。例如單晶X射線繞射法（SXRD），把培養出的單晶用Bruker D8 venture繞射儀收集繞射強度數據，光源為CuKα輻射，掃描方式：φ/ω掃描，收集相關數據後，進一步採用直接法(Shelxs97)解析晶體結構，便可以確證絕對構型。

如無特殊說明，本發明柱層析、製備薄層矽膠色譜所用溶劑配比均為體積比。

本發明所使用的溶劑可經市售獲得。

本發明採用下述縮略詞：aq代表水；HATU代表O-(7-氮雜苯並三唑-1-基）-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸鹽；EDC代表N-（3-二甲基胺基丙基）-N'-乙基碳二亞胺鹽酸鹽；m-CPBA代表3-氯過氧苯甲酸；eq代表當量、等量；CDI代表羰基二咪唑；DCM代表二氯甲烷；PE代表石油醚；DIAD代表偶氮二羧酸二異丙酯；DMF 代表N，N-二甲基甲醯胺；DMSO代表二甲亞碸；EtOAc代表乙酸乙酯；EtOH代表乙醇；MeOH代表甲醇；CBz代表苄氧羰基，是一種胺保護基團；Boc代表三級丁氧羰基是一種胺基保護基團；HOAc代表乙酸；NaCNBH₃代表氰基硼氫化鈉；r.t.代表室溫；O/ N代表過夜；THF代表四氫呋喃；Boc₂O代表二-三級丁基二碳酸酯；TFA代表三氟乙酸；DIPEA代表二異丙基乙基胺；SOCl₂代表氯化亞碸；CS₂代表二硫化碳；TsOH代表對甲苯磺酸；NFSI代表N-氟-N-（苯磺醯基）苯磺醯胺；NCS代表1-氯吡咯烷-2,5-二酮；n-Bu₄NF代表氟化四丁基銨；iPrOH代表2-丙醇；mp代表熔點；LDA代表二異丙基胺基鋰；GalNAc基團代表；PBS代表磷酸鹽緩衝液；ASGPR代表抗去唾液酸糖蛋白受體，是一種肝特異性跨膜糖蛋白。

在本發明的一些方案中，所述 「A」、「U」、「C」和「G」變成小寫字母「a」、「u」、「c」和「g」代表核苷酸被2’-O-甲基修飾（屬於甲氧基修飾）；所述 「A」、「U」、「C」和「G」後標有「f」代表核苷酸被2’-氟核苷酸修飾（屬於氟代修飾）；小寫字母「s」代表核苷酸之間通過硫代磷酸酯基連接；所述 「A」、「U」、「C」和「G」前標有「d」代表字母d右側相鄰的一個核苷酸為脫氧核糖核苷酸。示例性的，5’-us,Ufs,U,g,dA-3’化學結構如下：。

化合物依據本領域常規命名原則或者使用ChemDraw®軟體命名，市售化合物採用供應商目錄名稱。

下面通過實施例對本發明進行詳細描述，但並不意味著對本發明任何不利限制。本發明的化合物可以通過本發明所屬技術領域中具有通常知識者所熟知的多種合成方法來製備，包括下面列舉的具體實施方式、其與其他化學合成方法的結合所形成的實施方式以及本發明所屬技術領域中具有通常知識者所熟知的等同替換方式，優選的實施方式包括但不限於本發明的實施例。對本發明所屬技術領域中具有通常知識者而言，在不脫離本發明精神和範圍的情況下針對本發明具體實施方式進行各種變化和改進將是顯而易見的。

實施例1：Z1和Z2的合成

步驟A：將1-1（10g，19.82mmol）溶於乙腈（120mL）和1,2-二氯乙烷（80mL），於0℃下加入1-2（6.02g，42.62mmol）和三甲矽基三氟甲磺酸酯（11.01g，49.56mmol，8.95mL），該體系在35℃下攪拌12h。體系在0℃下緩慢加入飽和碳酸氫鈉水溶液（100mL）淬滅和二氯甲烷（100mL×2）萃取，有機相用飽和氯化鈉水溶液（200mL）洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾減壓濃縮得到粗品。粗品經矽膠柱層析純化（洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=20：1）得到1-3。

步驟B：將1-3（6.7g，13.05mmol）溶於氨甲醇溶液（7mol/L，50mL），體系於40℃下攪拌12h，反應液經減壓濃縮得到粗品。粗品經矽膠柱層析純化（洗脫劑：乙酸乙酯/甲醇=50/1至10/1）得到1-4。

步驟C：將1-4（2.3g，11.43mmol）溶於無水吡啶（25 mL），於0℃下加入1,3-二氯-1,1,3,3-四異丙基二矽氧烷（3.64g，11.55mmol，3.69mL），體系在20℃下攪拌12h。體系加入水（30 mL）淬滅和乙酸乙酯（30mL×2）萃取，有機相依次用鹽酸(1mol/L，30 mL×3）和飽和食鹽水（30 mL）洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾減壓濃縮得到粗品。粗品經矽膠柱層析純化（洗脫劑，石油醚/乙酸乙酯=7/1至5/1）得到1-5。

步驟D：將1-5（4g，9.02mmol）溶於乙腈（40mL），依次加入氧化銀（8.36g，36.06mmol），4Å分子篩（3g），無水吡啶（1.78g，22.54mmol，1.82mL）和碘甲烷（6.4g，45.08mmol，2.81mL），體系在25℃下攪拌12h。體系加入乙酸乙酯（50mL）在20℃攪拌1h，用布氏漏斗墊矽藻土過濾並收集濾液，濾液加入水（100mL）和乙酸乙酯（100mL×2）萃取，有機相用飽和食鹽水（200mL）洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾減壓濃縮得到粗品。粗品經矽膠柱層析純化（洗脫劑，石油醚/乙酸乙酯=15/1至10/1至8/1）得到1-6。

步驟E：將1-6（2g，4.37mmol）溶於無水四氫呋喃（20mL），加入三乙胺三氫氟酸鹽（1.55g，9.61mmol,1.57mL），體系在20℃下攪拌12h，反應液經減壓濃縮得到粗品。粗品經矽膠柱層析純化（洗脫劑：乙酸乙酯/甲醇=100/1至50/1）得到1-7。

步驟F：將1-7（1g，4.65mmol）溶於無水吡啶（10mL），加入4,4-雙甲氧基三苯甲基氯（1.57g，4.65mmol），體系在20℃攪拌12h。體系加入水（20mL）淬滅和乙酸乙酯（20mL×2）萃取，有機相用飽和食鹽水（40mL）洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾減壓濃縮得到粗品。粗品經矽膠柱層析純化（洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=3/1至1/1）得到Z1。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ = 8.78 (s, 1H), 8.14 - 8.03 (m, 1H), 7.41 - 7.31 (m, 2H), 7.29 - 7.16 (m, 7H), 6.92 - 6.76 (m, 4H), 6.08 (d,J= 3.2 Hz, 1H), 5.25 (d,J= 6.5 Hz, 1H), 4.48 - 4.34 (m, 1H), 4.13 - 4.01 (m, 2H), 3.73 (s, 6H), 3.38 (s, 3H), 3.18 - 3.03 (m, 2H)。

步驟G：室溫下，在10L乾燥的反應釜中，氮氣保護。分別加入二氯甲烷(5.5L )，原料Z1（1.1g ，2.13mmol），雙(二異丙基胺基)(2-氰基乙氧基)膦（0.7g ，2.34mmol）和4,5-二氰基咪唑（0.13g ，1.06mmol），控溫20-25℃反應3-4h。反應完成後，在20-25℃下，加入1mL飽和碳酸氫鈉淬滅反應，再加10 mL水稀釋，靜置，分液，再用10mL水洗滌，有機相用1g無水硫酸鈉乾燥，過濾，母液減壓濃縮得粗品。將濃縮物轉移至圓底燒瓶中，加入15mL甲苯和10mL正庚烷，攪拌溶解，用5mL*3 N,N-二甲基甲醯胺/水=7/3 洗滌三次，再用5mL*3水洗三次，再用5mL飽和食鹽水洗滌，有機相用11g無水硫酸鈉乾燥，過濾，母液濃縮，乙腈帶蒸得到Z2。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 8.82 (s, 1H), 8.11 (d, J = 6.6 Hz, 1H), 7.42 - 7.32 (m, 2H), 7.30 - 7.16 (m, 7H), 6.90 - 6.76 (m, 4H), 6.20 - 6.08 (m, 1H), 4.76 - 4.51 (m, 1H), 4.29 (q, J = 4.2 Hz, 1H), 4.23 - 4.09 (m, 1H), 3.83 - 3.75 (m, 1H), 3.72 (d, J = 2.4 Hz, 6H), 3.61 - 3.45 (m, 3H), 3.38 (d, J = 15.2 Hz, 3H), 3.30 - 3.16 (m, 1H), 3.07 (br dd, J = 5.6, 10.4 Hz, 1H), 2.77 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 2.63 - 2.55 (m, 1H), 1.16 - 1.07 (m, 9H), 0.96 (d, J = 6.6 Hz, 3H).

Z2是用於製備含Z的正義鏈、反義鏈或綴合物的中間體。

實施例2：B19-M

步驟一：氮氣保護，-78℃下，化合物2-2（78 g，236.43 mmol）的四氫呋喃（1000 mL）的溶液中加入正丁基鋰（2.5 mol/L，94.57 mL），用時10分鐘。加畢，在這個溫度下攪拌20分鐘，在-78℃下加入化合物2-1（98.94 g，236.43 mmol）的四氫呋喃（500 mL）溶液。在-78℃下攪拌反應1.5小時，0℃下，加入飽和氯化銨（500 mL）淬滅反應，乙酸乙酯（1000 mL）萃取，飽和食鹽水（500 mL×2）洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓濃縮得粗品。粗品再經矽膠柱層析純化（石油醚/乙酸乙酯=1/0至3/1）得化合物2-3。

步驟二：氮氣保護，在化合物2-3（110 g，176.71 mmol）的二氯甲烷（1100 mL）溶液中，在-78℃下，加入三氟化硼乙醚（250.80 g，1.77 mol/L，217.33 mL）和三乙基矽氫（205.47 g，1.77 mol/L），在-78℃下攪拌反應2小時，在0℃下，加入5%碳酸鈉（500 mL）淬滅反應，二氯甲烷（300 mL×2）萃取，合併有機相，飽和氯化鈉（200 mL×2）洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓濃縮得粗品。粗品經矽膠柱層析純化（石油醚/乙酸乙酯=1/0至5/1）得化合物2-4。

步驟三：氮氣保護，在乙腈（400 mL）中，分別加入化合物2-4（73 g，120.36 mmol），化合物2-5（21.08 g，132.40 mmol），碘化亞銅（2.29 g，12.04 mmol），N,N-二異丙基乙基胺（104.83 mL）和1,1-雙(二苯基磷)二茂鐵氯化鈀(8.81 g，12.04 mmol)，在25℃小攪拌反應2小時，反應液加水（300 mL）稀釋，乙酸乙酯（500 mL×2）萃取。合併有機相，用飽和氯化鈉（300 mL×2）洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濃縮得粗品。粗品經矽膠柱層析純化（石油醚/乙酸乙酯=1/0至3/1）得化合物2-6。

步驟四：氮氣保護，在乙腈（700 mL）中，加入化合物2-6（70 g，109.76 mmol）和碳酸銫（71.52 g，219.52 mmol），在80℃下攪拌反應16小時。反應液減壓濃縮除去乙腈，加水（100 mL）稀釋，乙酸乙酯（100 mL×2）萃取。合併有機相，飽和氯化鈉（50 mL×2）洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓濃縮得粗品。粗品經矽膠柱層析純化（石油醚/乙酸乙酯=1/0至3/1）得化合物2-7。

步驟五：氮氣保護，在-78℃，在化合物2-7（50 g，78.40 mmol）的二氯甲烷（500 mL）溶液中加入三氯化硼（1 mol/L，627.19 mL）。在-78℃下攪拌反應2小時。檢測反應完成。在-78℃下，緩慢滴加甲醇（100 mL）淬滅反應液，再減壓濃縮得粗品。粗品經矽膠柱層析純化（石油醚/乙酸乙酯=1/0到1/1，再乙酸乙酯/乙醇=10/1至5/1）得化合物2-8。

步驟六：氮氣保護，在二氯甲烷（280 mL）中，加入化合物2-8（28.8 g，78.39 mmol），1,3-二氯-1,1,3,3-四異丙基二甲矽醚（29.67 g，94.07 mmol）和咪唑（21.35 g，313.56 mmol），在25℃下攪拌反應16小時。反應液加水（200 mL）稀釋，二氯甲烷（200 mL×2）萃取。合併有機相，飽和氯化鈉（200 mL）洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓濃縮得粗品。粗品經矽膠柱層析純化（石油醚/乙酸乙酯=1/0至4/1）得化合物2-9。

步驟七：氮氣保護，在化合物2-9（28 g，45.91 mmol）的N,N-二甲基甲醯胺（140 mL）的溶液中，在0℃下，緩慢加入鈉氫（2.20 g，55.09 mmol，60%純度）。加畢，0℃下攪拌反應0.5小時，加入碘甲烷（8.57 mL），在25℃下攪拌反應1.5小時。反應液在10-25℃下，加飽和氯化銨（100 mL）淬滅，加水（200 mL）稀釋，乙酸乙酯（200 mL×2）萃取。合併有機相，用飽和氯化鈉（30 mL×2）洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓濃縮得粗品。粗品經矽膠柱層析純化（石油醚/乙酸乙酯=1/0至4/1）得化合物2-10。

步驟八：氮氣保護，在四氫呋喃（160 mL）的溶液中，加入化合物2-10（22.3 g，35.74 mmol）和三乙胺氟化氫（9.53 g，78.63 mmol）。在25℃下攪拌反應16小時。反應液減壓濃縮得粗品。粗品經矽膠柱層析純化（石油醚/乙酸乙酯=1/0至0/1）得化合物2-11。

步驟九：氮氣保護，在二氯甲烷（60 mL）中，將化合物2-11（10.6 g，27.79 mmol），4,4-二甲氧基三苯甲基氯（11.30 g，33.35 mmol）和三乙烯二胺（4.68 g，41.69 mmol）混合，在25℃下攪拌反應16小時。反應液用水（30 mL）稀釋，二氯甲烷（50 mL×2）萃取。合併有機相，飽和氯化鈉（20 mL）洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓濃縮得粗品。粗品經過矽膠柱層析純化（石油醚/乙酸乙酯=1/0至1/1，0.1%三乙胺）得化合物2-12。

步驟十：氮氣保護，在二氯甲烷（170 mL）中，加入化合物2-12（17 g，24.86 mmol），咪唑（3.39 g，49.72 mmol）和三級丁基二苯基氯矽烷（8.20 g，29.83 mmol），在25℃下攪拌反應16小時。反應液加水（20 mL）稀釋，二氯甲烷（30 mL×2）萃取。合併有機相，飽和氯化鈉（30 mL）洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濃縮得粗品。粗品經矽膠柱層析純化（石油醚/乙酸乙酯=1/0至2/1）得化合物2-13。

步驟十一：氮氣保護，在二氯甲烷（200 mL）和甲醇（60 mL）中，加入化合物2-13（21 g，22.77 mmol）和一水合對甲苯磺醯氯（2.17 g，11.39 mmol），在5℃下攪拌反應1小時。反應液加飽和碳酸氫鈉（20 mL）淬滅反應，二氯甲烷（50 mL×2）萃取。合併有機相，飽和氯化鈉（30 mL×2）洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓濃縮得粗品。粗品經矽膠柱層析純化（石油醚/乙酸乙酯=1/0至2/1）得化合物2-14。

步驟十二：氮氣保護，在二氯甲烷（100 mL）中，加入化合物2-14（13.7 g，22.10 mmol）和戴斯-馬丁過碘烷（11.25 g，26.52 mmol），在25℃下攪拌反應1小時。反應液加飽和碳酸氫鈉（20 mL）淬滅反應，二氯甲烷（50 mL×2）萃取。合併有機相，飽和氯化鈉（30 mL×2）洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓濃縮得粗品。粗品經矽膠柱層析（石油醚/乙酸乙酯=1/0至2/1）純化得化合物2-15。

步驟十三：氮氣保護，在二氯甲烷（20 mL）中，加入化合物2-15（2 g，3.24 mmol），四乙基亞甲基二磷酸酯（1.12 g，3.88 mmol），氯化鋰（274.48 mg，6.47 mmol）和1.8-二氮雜二環[5.4.0]十一烷-7-烯（1.48 g，9.71 mmol），在25℃下攪拌反應3小時，在25℃下，反應液加水（10 mL）淬滅，二氯甲烷（30 mL×2）萃取。合併有機相，用飽和氯化鈉（30 mL）洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓濃縮得粗品。粗品經矽膠柱層析純化（石油醚/乙酸乙酯=1/0至1/1）得化合物2-16。

步驟十四：氮氣保護，在四氫呋喃（10 mL）中，加入化合物2-16（2.1 g，2.79 mmol）和三乙胺三氟化氫（676.97 mg，5.59 mmol），在40℃下攪拌反應16小時，反應液減壓濃縮得粗品。粗品經矽膠柱層析純化（石油醚/乙酸乙酯=1/0到0/1，再乙酸乙酯/乙醇=1/0至5/1）得化合物2-17。

步驟十五：氮氣保護，在二氯甲烷（15 mL）中，加入化合物2-17（1.3 g，2.53 mmol），雙(二異丙基胺基)(2-氰基乙氧基)膦（1.07 g，3.54 mmol）和4,5-二氰基咪唑（149.48 mg，1.27 mmol），在25℃下反應1小時，反應液加水（10 mL）稀釋，二氯甲烷（50 mL×2）萃取。合併有機相，飽和氯化鈉（30 mL×2）洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓濃縮得粗品。粗品經反相柱層析（柱子：Waters Xbridge C18 150×50mm×10μm；流動相：[碳酸氫銨水溶液(10 mmol/L)-乙腈]；乙腈梯度：57%-87%）純化得到B19-M。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ = 8.00 - 7.82 (m, 2H), 7.58 - 7.44 (m, 3H), 7.43 - 7.23 (m, 4H), 7.04 (s, 1H), 6.90 - 6.65 (m, 1H), 6.10 (br dd,J= 18.0, 19.4 Hz, 1H), 4.89 (dd,J= 5.9, 15.8 Hz, 1H), 4.69 - 4.53 (m, 1H), 4.33 - 4.19 (m, 1H), 4.15 (s, 2H), 4.04 - 3.92 (m, 4H), 3.86 - 3.53 (m, 5H), 3.34 - 3.29 (m, 3H), 2.80 (td,J= 5.4, 11.0 Hz, 2H), 1.30 - 1.06 (m, 18H)。

B19-M是用於製備含B19的正義鏈、反義鏈或綴合物的中間體。

實施例3：B33-M

步驟一：將化合物3-1（1.9 g，6.68 mmol）溶於N,N-二甲基甲醯胺（30 mL），加入咪唑（2.73 g，40.10 mmol），4-二甲胺基吡啶（244.97 mg，2.01 mmol）和三級丁基二甲基氯矽烷（4.03 g，26.74 mmol）。混合液在65℃下攪拌反應16小時。反應液用乙酸乙酯（100 mL）稀釋，飽和食鹽水（100 mL×2）洗滌。有機相經無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓濃縮得粗品。粗品經矽膠柱層析純化（石油醚/乙酸乙酯=1/1至1/2）得化合物3-2。LCMS (ESI) m/z：513 [M+H]⁺。

步驟二：將化合物3-2（2.5 g，4.88 mmol）溶於四氫呋喃（24 mL），加入三氟乙酸水溶液（24 mL，V/V=1/1），混合液在25℃下攪拌反應2小時。反應液用乙酸乙酯（120 mL）稀釋，飽和碳酸氫鈉水溶液（120 mL）和水（120 mL）洗滌。有機相經無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓濃縮得粗品。粗品經矽膠柱層析純化（石油醚/乙酸乙酯=2/1至1/1）得化合物3-3。LCMS (ESI) m/z：399 [M+H]⁺。

步驟三：將化合物3-3（1.8 g，4.52 mmol）溶於乙腈（30 mL），加入2-碘醯基苯甲酸（2.53 g，9.03 mmol），混合液在50℃下攪拌反應16小時。反應液過濾，濾液濃縮得粗品化合物3-4。LCMS (ESI) m/z：397 [M+H]⁺。

步驟四：氮氣保護，在四氫呋喃（15 mL）中，在-78℃下加入鈉氫（411.55 mg，10.29 mmol，60%純度）和化合物3-4a（5.42 g，8.57 mmol），在-78℃下攪拌反應0.5小時，再加入化合物3-4（1.7 g，4.29 mmol）的四氫呋喃（15 mL）溶液，混合液在25℃下攪拌反應1小時。反應液加入到飽和氯化銨水溶液（30 mL）淬滅，乙酸乙酯（30 mL）萃取。有機相經無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓濃縮得粗品。粗品經矽膠柱層析純化（石油醚/乙酸乙酯=2/1至1/1）得化合物3-5。

步驟五：在甲酸（13 mL）和水（13 mL）中，加入化合物3-5（1.3 g，1.85 mmol），混合液在65℃下攪拌反應12小時。反應液用乙酸乙酯（120 mL）稀釋，飽和碳酸氫鈉水溶液（120 mL）和水（120 mL）洗滌。有機相經無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓濃縮得粗品。粗品經矽膠柱層析純化（石油醚/乙酸乙酯=2/1至1/1）得化合物3-6。

步驟六：氮氣保護，將化合物3-6（520 mg，883.54 μmol）溶於二氯甲烷（10 mL），加入4, 5-二氰基咪唑（520 mg，883.54 μmol）和化合物3-7（399.46 mg，1.33 mmol），混合液在25℃下攪拌反應16小時。反應液減壓濃縮得粗品。粗品經高效液相色譜純化（柱子：Waters Xbridge C18 150×50mm×10μm；流動相：[10 mmol/L碳酸氫銨水溶液-乙腈]；乙腈梯度：54%-84%）得化合物B33-M。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d⁶) δ = 11.45 (s, 1H), 7.62 - 7.58 (m, 1H), 6.99 - 6.75 (m, 1H), 6.22 - 6.10 (m, 1H), 6.04 (s, 1H), 5.66 - 5.59 (m, 5H), 4.58 - 4.51 (m, 1H), 4.17 - 4.01 (m, 1H), 3.84 - 3.68 (m, 3H), 3.65 - 3.51 (m, 3H), 2.84 – 2.78 (m, 2H), 2.39 - 2.16 (m, 1H), 1.94 – 1.80 (m, 2H), 1.77 - 1.64 (m, 1H), 1.17 (s, 30H)。

B33-M是用於製備含B33的正義鏈、反義鏈或綴合物的中間體。

實施例3：綴合物的製備方法

製備方法：按照亞磷醯胺固相合成技術合成寡核糖核苷酸。在可控多孔玻璃(CPG, 500Å)製成的固體支持物上進行合成。所有的2’-修飾的RNA亞磷醯胺和輔助試劑均為商品化可得試劑。所有的醯胺溶於無水乙腈中並且加入分子篩(3 Å)，使用苄基-1H-四唑（BTT）作為活化劑，偶合時間為5分鐘。使用（（二甲基胺基-亞甲基）胺基）-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(DDTT)，1g/100mL，於無水乙腈/吡啶（v/v=1/2）中的溶液產生磷酸酯鍵或硫代磷酸酯鍵，反應時間為3分鐘。所有序列在最後脫除DMT基團後即合成。

CPG上結合的低聚體的切割和去保護：在固相合成終止後，通過用含10%二乙胺的乙腈溶液處理30分鐘去除保護基，而沒有從CPG上切下核苷酸。隨後，乾燥的CPG在40℃下用濃氨水處理18h。在離心之後，上清液被轉移至新的管中並且用水洗滌CPG。濃縮合併的溶液得到固體混合物。

純化：通過使用NanoQ陰離子交換HPLC純化低聚體。緩衝液A是10mM 高氯酸鈉溶液，20mM Tris，1mM EDTA，pH 7.4和含有乙腈20%，以及緩衝液B，500mM高氯酸鈉，20mM Tris，1 mM EDTA，pH 7.4和含有乙腈20%。分離得到目標產物，並用反相C18柱脫鹽。

退火：把待退火的RNA寡聚體用無菌RNase free水（無RNA水解酶）配製成200μM。通過合併等莫耳的RNA溶液形成互補鏈。退火反應體系設置如下：將總體積為100 μL的混合液，10nmol放置95℃水浴鍋10分鐘，然後迅速放入60℃水浴，自然降溫。退火完成後的溶液不可放置在高溫中儲存。

例如，實施例4和5均可按照上述方法，按照序列所示核苷酸，dR，R和Z順序，調整原料順序即可製備得到。表3所示綴合物均使用該方法製得。

實施例4：綴合物C1的製備

正義鏈為5’- cs,cs,a,g,u,c,g,u,Cf,Cf,Cf,a,g,a,a,u,a,a,c,u,a,D01-3’ (SEQ ID NO: 161)，反義鏈為5’- us,dAs,g,u,dT,a,dT,u,c,u,g,dG,g,Af,c,g,a,c,u,g,gs,us,c -5’ (SEQ ID NO: 189)，其中，D01與a之間通過磷酸二酯鍵連接。

實施例5：綴合物C25的製備正義鏈為5’-cs,cs,a,g,u,c,g,u,Cf,Cf,Cf,a,g,a,a,u,a,a,c,u,a,D01-3’ (SEQ ID NO: 161)，反義鏈為5’-us,dAs,g,u,dT,a,dR,u,c,u,g,dG,g,Af,c,g,a,c,R,g,gs,us,c-3’ (SEQ ID NO: 210)，其中，D01與a之間通過磷酸二酯鍵連接。

生物測試測試例1：Huh7細胞INHBE mRNA抑制活性1.實驗目的：本研究的目的是應用Huh7細胞評價siRNA體外抑制靶基因INHBE mRNA的活性，以化合物的E_max值為指標，來評價化合物對INHBE mRNA的抑制活性。2.實驗材料:2.1細胞系：Huh7細胞Huh7細胞由上海藥明康德新藥開發有限公司提供。Huh7細胞在含10 % 胎牛血清（ExCellBio，貨號 FSP500）、1%青黴素-鏈黴素（HyClone貨號SV30010）的DMEM 培養基（Invitrogen-11965118）中培養。2.2試劑：本實驗使用的主要試劑包括Lipofectamine™iRNAiMAX 轉染試劑，FastStart Universal Probe Mast，RNA提取試劑盒，GAPDH基因表達試劑盒，INHBE基因表達試劑盒，FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒，96 孔板。2.3耗材與儀器：本實驗使用的主要儀器包括螢光qPCR儀（Applied Biosystems，型號QuantStudio 6 Flex）、細胞計數儀（Vi-cellTM XR）。3.實驗步驟和方法：3.1轉染1）第一天，根據（RNAiMAX轉染試劑：Opti-MEM = 1.5 : 48.5）按需配置兩者混合液，室溫孵育15 分鐘；2）對於每孔細胞，取一定量的稀釋好的化合物加入到等量的 RNAiMAX Optim-MEM培養液中，混勻，孵育15分鐘；3）取Huh7細胞，先用DPBS洗滌後，加入胰蛋白酶進行消化，調整細胞到合適的密度；4）種細胞同時取20μL Opti-MEM RNAiMax和化合物的混合物加入到細胞培養板中，以每孔20,000個細胞的密度接種到96孔板中，每孔最終的培養液為120 μL。5）細胞置於5% CO₂、37°C孵箱中培養24h。3.2 RNA提取及反轉錄收集細胞，參照Qiagen-74182 RNA提取試劑盒說明書提取RNA，參照FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒說明書將RNA反轉錄為cDNA。3.3 QPCR檢測利用qPCR檢測目的基因cDNA，qPCR反應體系配製見表4。GAPDH作為內參基因，qPCR在384孔板中進行。qPCR反應程序為：95℃加熱10分鐘，然後進入循環模式，95℃加熱15秒，隨後60℃ 1分鐘，共40個循環。表4. RT-PCR反應體系

組分	組分濃度	體積 (μL)/每孔
PCR Master Mix	2×	5
INHBE/GAPDH TaqMan® Assays and Arrays (60×)	60×	0.17
水	/	2.83
總計	/	8

3.4 數據分析：ΔΔCt 法（Ct差值比較法）此方法裡面需要引進看家基因GAPDH，因為看家基因在所有細胞中均表達，其產物是維持細胞生存所必須，且在細胞中的表達量或基因組的拷貝數恆定，受環境影響小。qRT- PCR後，內參的CT值同時會被記錄，被稱為Ct(GAPDH)，樣品的CT值，被稱為Ct(樣品)。ΔCt (樣品) =Ct (樣品)-Ct (GAPDH)ΔCt (對照) =Ct (對照)-Ct (GAPDH)ΔΔCt=ΔCt (樣品) -ΔCt (對照)基因的相對表達量=2^-ΔΔCt抑制率%=（1-樣品的相對表達量/對照組平均的相對表達量）×1004. 實驗結果見表5。表5. 本發明綴合物在Huh7細胞降低INHBE mRNA的抑制活性

綴合物	IC50（nM）	最大抑制率（%）
C1	0.07	84.1
C4	0.68	87.3
C5	0.06	76.8
C11	0.12	86.3
C12	0.08	82.7
C14	0.05	81.5
C23	0.05	86.4
C25	0.06	87.8
C27	0.66	63.9
C30	0.16	80.1
C42	0.13	85.8
C43	0.18	78.71
C44	0.28	78.6
C45	0.13	83.8
C47	0.12	81.91

5. 結論：本發明綴合物可顯著降低Huh7細胞中的INHBE mRNA的水平。

測試例2：PHH細胞自由攝取實驗1.實驗原理：將待測樣品與人原代肝細胞進行孵育，評估待測樣品對INHBE mRNA的下調程度。2.實驗材料：人原代肝細胞(PHH)，RNeasy® 96 Kit (12) (QIAGEN-74182)，FastKing RT Kit (With gDNase) (Tiangen- KR116-02)。3.實驗方法：用PBS溶液將本發明綴合物稀釋至待測濃度的10倍。轉移10μL siRNA到96孔板中。將PHH細胞解凍並移植到96孔板中，最終的細胞密度為5.4×10⁴細胞/孔。本發明綴合物測試10個濃度點，最高濃度為500nM，5倍稀釋。細胞在37℃，5% CO₂中孵育48小時，用顯微鏡檢查細胞狀態。孵育完成後，將細胞裂解，使用獲得裂解液，RNeasy® 96 Kit (QIAGEN-74182)提取總RNA，並用FastKing RT Kit (With gDNase) (Tiangen- KR116-02)反轉錄獲得cDNA。用qPCR檢測INHBE cDNA。4.實驗結果見表6。表6 本發明綴合物PHH細胞自由攝取實驗結果

綴合物	IC50 （nM）	最大抑制率（%）
C25	0.49	88.0
C42	0.18	74.1
C43	0.13	79.9
C44	0.48	72.2
C45	0.45	78.9
C47	0.25	87.0

5.實驗結論：本發明綴合物能夠顯著下調PHH細胞中INHBE mRNA的水平。

測試例3：小鼠hINHBE HDI模型1.實驗原理：通過高壓尾靜脈注射pcDNA-INHBE質體的小鼠模型來評價待測樣品體內靶向目的基因並對目的基因的抑制效果。2.實驗材料：pcDNA-INHBE質體，BALB/c雌性小鼠，DPBS（Dulbecco's磷酸鹽緩衝液），本發明綴合物。3.實驗方法：訂購6-8週齡的BALB/c雌性小鼠，小鼠到達動物房後適應檢疫一週。第0天，按照體重數據將小鼠隨機分組，每組4-6隻，分組後所有小鼠皮下注射給藥，單次給藥，給藥體積為10 mL/kg，第1組小鼠給DPBS；其他組小鼠給藥本發明綴合物。給藥後第7天，所有小鼠在5秒內經尾靜脈注射其體重8%體積的pcDNA-INHBE質體，（注射體積（mL）=小鼠體重（g）×8%），每隻小鼠注射質體的質量為10 µg。給藥後第8天，所有組小鼠經CO₂吸入安樂死，每隻小鼠分別收集2份肝臟樣品。肝臟樣品經RNAlater 4℃過夜處理，後移除RNAlater，保存於-80℃用於檢測INHBE基因表達水平。4.實驗結果如表7-9所示。表7. 本發明綴合物C1和C23對小鼠肝臟INHBE mRNA表達的抑制

動物編號	組 1	組 2	組3
磷酸緩衝液(%)	綴合物C1，5 mg/kg (剩餘mRNA%)	綴合物C23，5 mg/kg (剩餘mRNA%)
1	97	13	27
2	83	11	22
3	90	16	16
4	135	15	25
5	95	/	/
平均	100	13.8	22.5

「/」代表無數據，p＜0.05代表有統計學的差異表8. 本發明綴合物C25對小鼠肝臟INHBE mRNA表達的抑制

動物編號	組 1	組 2
磷酸緩衝液 (%)	綴合物C25，5mg/kg (剩餘mRNA%)
1	100	8
2	91	14
3	101	7
4	101	6
5	107	11
6	/	16
平均	100	10

「/」代表無數據，p＜0.05代表有統計學的差異表9. 本發明綴合物C42-C45和C47對小鼠肝臟INHBE mRNA表達的抑制

動物編號	組 5mg/kg (剩餘mRNA%)
磷酸緩衝液 (%)	綴合物C42	綴合物C43	綴合物C44	綴合物C45	綴合物C47
1	107	13	10	15	21	19
2	137	14	14	19	33	20
3	90	14	10	19	30	16
4	67	16	11	16	19	17
平均	100	14	11	18	26	18

「/」代表無數據，p＜0.05代表有統計學的差異5.實驗結論：本發明綴合物能夠顯著下調小鼠肝臟中的INHBE mRNA水平。

測試例4：小鼠hINHBE HDI模型1.實驗原理：通過高壓尾靜脈注射pcDNA-INHBE質體的小鼠模型來評價待測樣品體內靶向目的基因並對目的基因的抑制效果。2.實驗材料：pcDNA-INHBE質體，BALB/c雌性小鼠，DPBS（Dulbecco's磷酸緩衝液），本發明綴合物。3.實驗方法：訂購6-8週齡的BALB/c雌性小鼠，小鼠到達動物房後適應檢疫一週。第0天，按照體重數據將小鼠隨機分組，每組6-7隻，分組後所有小鼠皮下注射給藥，單次給藥，給藥體積為10 mL/kg，第1組小鼠給DPBS；第2組小鼠給綴合物C43；第3組小鼠給綴合物C47。給藥後第14天，所有小鼠在5秒內經尾靜脈注射其體重8%體積的pcDNA-INHBE質體，（注射體積（mL）=小鼠體重（g）×8%），每隻小鼠注射質體的質量為10 µg。給藥後第15天，所有組小鼠經CO₂吸入安樂死，每隻小鼠分別收集2份肝臟樣品。肝臟樣品經RNAlater 4℃ 過夜處理，後移除RNAlater，保存於-80℃用於檢測INHBE基因表達水平。4.實驗結果如表10所示。表10. 給藥組小鼠相比於磷酸鹽緩衝液組小鼠肝臟INHBE mRNA的相對表達量

動物編號	組 1	組 2	組 3
磷酸緩衝液 (%)	綴合物C43，5mg/kg (剩餘mRNA%)	綴合物C47，5mg/kg (剩餘mRNA%)
1	89	4	13
2	143	3	15
3	105	6	18
4	83	4	8
5	83	6	14
6	99	5	13
7	99	/	/
平均	100	5	14

「/」代表無數據，p＜0.05代表有統計學的差異5.實驗結論：本發明綴合物能夠顯著下調小鼠肝臟中的INHBE mRNA水平，具有長效性。

測試方法5：非人類靈長類動物食蟹猴體內INHBE mRNA敲低實驗1. 實驗原理：通過與人類INHBE基因高度同源的非人類靈長類動物食蟹猴模型，觀察待測樣品對食蟹猴肝臟INHBE mRNA的下調程度。2. 實驗材料：食蟹猴，1x PBS（磷酸緩衝液），本發明綴合物。3. 實驗方法：訂購體重在2-4公斤的食蟹猴4隻，到達動物房後適應檢疫一週。給藥前第3天，按照體重數據將食蟹猴隨機分組，每組2隻。第1天皮下注射本發明綴合物，劑量為3mpk。給藥後在第15和29天採血和肝臟組織，用上述qPCR方法檢測食蟹猴肝臟INHBE mRNA水平。比較給藥後和給藥前的肝臟INHBE mRNA，可得到綴合物對每組動物INHBE mRNA的下調比例。4. 實驗結果如表11所示。表11 本發明綴合物對食蟹猴肝臟中INHBE mRNA表達的抑制

動物編號	組 1	組 2
綴合物C43 (剩餘mRNA%)	綴合物C47 (剩餘mRNA%)
給藥前3天	100	100
給藥後15天	84	48
給藥後29天	51	30

5. 實驗結論：本發明綴合物可顯著降低食蟹猴肝臟中INHBE mRNA表達，具有良好的體內抑制活性。

測試方法6：肝勻漿穩定性實驗1.實驗原理：將待測化合物與小鼠、大鼠、食蟹猴和人肝勻漿共孵育，觀察待測化合物在肝勻漿中的穩定性。2.實驗材料：小鼠、大鼠、食蟹猴和人肝勻漿，本發明綴合物。3.實驗方法：3.1 配製250μL待測化合物的工作溶液，濃度為20 μM。3.2 將凍存的肝勻漿在37℃水浴箱中解凍。3.3 在96孔板中每孔添加190μL肝勻漿。3.4 向190μL肝勻漿中添加10μL待測化合物的工作溶液。3.5 將載有肝勻漿和待測物的96孔板放置在37℃下孵育，最長孵育時間為48小時。3.6 在不同時間點終止孵育。提取待測物，並通過LC-MS/MS方法檢測待測化合物在的正義鏈和反義鏈濃度，計算其剩餘百分量。4.實驗結果如表12所示。表格中數據均為百分數。表12孵育後待測物的正反義鏈在不同種屬肝勻漿中的剩餘量

孵育時間	C47反義鏈	C47正義鏈
小鼠	大鼠	食蟹猴	人	小鼠	大鼠	食蟹猴	人
0	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0
2	99.4	96.6	92.2	116.3	78.0	54.5	12.7	95.2
4	101.0	99.6	94.2	102.9	51.6	30.4	2.8	81.0
6	103.9	103.2	97.4	109.3	33.6	17.4	0.8	77.6
24	103.3	109.3	94.1	94.4	1.2	1.5	0.0	24.9
48	94.9	101.6	93.5	96.9	0.0	0.0	0.0	10.2

5. 實驗結論：本發明綴合物反義鏈在小鼠、大鼠、食蟹猴和人肝勻漿均具有良好的穩定性，表明其可在體內長期存在，發揮藥效。

測試例7：體外RNA測序研究1.實驗原理：將本發明綴合物與人原代肝細胞共孵育48小時，裂解細胞得到細胞液，採用標準提取方法提取RNA，經過標準流程處理後進行上機測序，檢測本發明綴合物對人原代肝細胞內的基因調控，評估其脫靶性質。2. 實驗材料：本發明綴合物，人原代肝細胞3. 實驗方法3.1 受試綴合物通過自由攝取處理方式人原代肝細胞（48h）。1) 鋪板培養基配置：10%FBS InvitroGRO CP Medium包含：10%FBS, 1%雙抗。2) 從液氮罐取出凍存的人原代肝細胞，立即放入37℃水浴鍋融化，直到管內剩下一小塊冰。3) 將2mL融化的人原代肝細胞加入到18mL鋪板培養基，輕輕顛倒混勻。4) 取100μL化合物稀釋液加入到12孔膠原包被的細胞培養板中，每孔加入900μL細胞懸液到12孔板中。5) 鋪板完成後放37℃，5% CO₂培養48小時。3.2 裂解液收集1) 細胞培養48h後取出細胞板，顯微鏡觀察細胞狀態。2) 去除培養基，每孔加入500μL PBS 洗一遍，12孔板每孔加入400μL TRIzol（RNA抽提試劑）。3) 在鏡下觀察細胞完全裂解，將每塊的複孔合併收，轉移至1.5mL離心管中保存於-80℃冰箱。3.3.測序：提取TRIzol裂解液的總RNA並進行建庫，使用高通量測序儀進行測序。4.實驗結果如表13所示。表13. 本發明綴合物對人原代肝細胞中基因的調控

比較組名稱	差異基因總數	上調差異基因數	下調差異基因數	主要下調基因	閾值
C47 vs 磷酸鹽緩衝液	12	7	5	INHBE	padj≤0.05 |log2FoldChange|≥1.0
C43 vs 磷酸鹽緩衝液	1	0	1	INHBE	padj≤0.05 |log2FoldChange|≥1.0

5.實驗結論：本發明綴合物在體外RNA測序研究中顯示脫靶風險低，靶向性良好。

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Claims (16)

1. 一種雙鏈siRNA或其藥學上可接受的鹽，其中，所述雙鏈siRNA包含能夠形成雙鏈區的正義鏈和反義鏈，所述正義鏈包含SEQ ID NO: 1-80、SEQ ID NO: 161-188中任意一個所示序列中的至少16個連續的核苷酸；所述反義鏈包含SEQ ID NO: 81-160、SEQ ID NO: 189-230中任意一個所示序列中的至少16個連續的核苷酸；所述正義鏈包含的核苷酸和所述反義鏈包含的核苷酸，為修飾或未修飾的核苷酸。
2. 如請求項1所述雙鏈siRNA或其藥學上可接受的鹽，其中，所述正義鏈包含SEQ ID NO: 1-80、SEQ ID NO: 161-188中任意一個所示序列5’端起的1-17、1-18、1-19、1-20、1-21、2-17、2-18、2-19、2-20、2-21、3-18、3-19、3-20、3-21、4-19、4-20、4-21或5-21位的核苷酸；優選地，所述正義鏈包含SEQ ID NO: 1-80、SEQ ID NO: 161-188中任意一個所示序列5’端起的1-17、1-18、1-19、2-17、2-18、2-19、2-20、3-18、3-19、3-20、4-19、4-20、4-21或5-21位的核苷酸。
3. 如請求項1所述雙鏈siRNA或其藥學上可接受的鹽，其中，所述反義鏈包含SEQ ID NO: 81-160、SEQ ID NO: 189-230中任意一個所示序列5’端起的1-17、1-18、1-19、1-20、1-21、1-22、1-23、2-18、2-19、2-20、2-21、2-22、2-23、3-19、3-20、3-21、3-22、3-23、4-20、4-21、4-22、4-23、5-21、5-22、5-23、6-22、6-23或7-23位的核苷酸；優選地，所述反義鏈包含SEQ ID NO: 81-160、SEQ ID NO: 189-230中任意一個所示序列5’端起的1-19、1-20、1-21、1-22、1-23、2-18、2-19、2-20、2-21、3-20或3-21位的核苷酸。
4. 如請求項1~3任意一項所述雙鏈siRNA或其藥學上可接受的鹽，其中，所述正義鏈、所述反義鏈、或者所述正義鏈及反義鏈上至少有一個核苷酸殘基分別獨立地任選被dR、R或Z替換，所述dR為，所述R為，所述Z為。
5. 如請求項4所述雙鏈siRNA或其藥學上可接受的鹽，其中，所述反義鏈5’端的第2位、第5-7位、第12位和第14-18位中有1-4個核苷酸殘基分別獨立地任選被dR、R或Z替換。
6. 如請求項4所述雙鏈siRNA或其藥學上可接受的鹽，其中，所述反義鏈5’端的第2位、第5-7位、第12位和第14-18位中有1-4個核苷酸分別獨立地任選為2’脫氧核苷酸。
7. 如請求項1所述雙鏈siRNA或其藥學上可接受的鹽，其中，所述反義鏈5’端的第1個核苷可被乙烯基磷酸酯的核苷類似物替換。
8. 如請求項7所述雙鏈siRNA或其藥學上可接受的鹽，其中，所述乙烯基磷酸酯的核苷類似物選自如下結構片段：、、、、、、、、、、、、、、和。
9. 一種雙鏈siRNA或其藥學上可接受的鹽，其包含能夠形成雙鏈區的正義鏈和反義鏈，所述正義鏈的核苷酸序列和所述反義鏈的核苷酸序列組合選自S83-S129所示的任意一組核苷酸序列組合。
10. 一種綴合物或其藥學上可接受的鹽，其中，所述綴合物或其藥學上可接受的鹽包含如請求項1~9任意一項所述雙鏈siRNA和藥學上可接受的綴合基團。
11. 如請求項10所述綴合物或其藥學上可接受的鹽，其中，所述綴合基團選自如下結構中的一個：、、、、、和。
12. 如請求項11所述綴合物或其藥學上可接受的鹽，其中，所述綴合物選自C1-C47。
13. 如請求項10所述的綴合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述綴合物如式(I)所示：其中，X為O或S；SS為所述正義鏈，AS為所述反義鏈；所述正義鏈和所述反義鏈選自如（1）~（9）任意一項所示的組合：（1） 所述正義鏈如SEQ ID NO: 161所示，所述反義鏈如SEQ ID NO: 189所示；（2） 所述正義鏈如SEQ ID NO: 161所示，所述反義鏈如SEQ ID NO: 210所示；（3） 所述正義鏈如SEQ ID NO: 186所示，所述反義鏈如SEQ ID NO: 226所示；（4） 所述正義鏈如SEQ ID NO: 188所示，所述反義鏈如SEQ ID NO: 225所示；（5） 所述正義鏈如SEQ ID NO: 164所示，所述反義鏈如SEQ ID NO: 192所示；（6） 所述正義鏈如SEQ ID NO: 171所示，所述反義鏈如SEQ ID NO: 199所示；（7） 所述正義鏈如SEQ ID NO: 161所示，所述反義鏈如SEQ ID NO: 202所示；（8） 所述正義鏈如SEQ ID NO: 185所示，所述反義鏈如SEQ ID NO: 220所示；（9） 所述正義鏈如SEQ ID NO: 188所示，所述反義鏈如SEQ ID NO: 228所示。
14. 如請求項1-9任意一項所述雙鏈siRNA或其藥學上可接受的鹽，如請求項10-13任意一項所述綴合物或其藥學上可接受的鹽在製備治療與INHBE基因表達相關疾病的藥物中的應用。
15. 如請求項14所述的應用，其中，所述與INHBE基因表達相關疾病是體脂分佈異常導致的代謝類疾病。
16. 如請求項15所述的應用，其中，所述體脂分佈異常導致的代謝類疾病選自2型糖尿病、肥胖症、腹部肥胖、冠心病、非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝炎、高脂血症、血脂異常、動脈粥樣硬化症。