TW202532639A - 用於治療脫髮和／或白髮的工程化外泌體 - Google Patents

Abstract

本發明公開了一種工程化外泌體，該工程化外泌體包含(a)KGF多肽，該KGF多肽與第一錨定多肽融合，(b)VEGF-A多肽，該VEGF-A多肽與第二錨定多肽融合，和(c)參與Wnt/β-連環蛋白信號通路的Wnt家族成員多肽，該Wnt家族成員多肽與第三錨定多肽融合，其中(a)、(b)和(c)分別透過該第一、第二和第三錨定多肽錨定在該外泌體的膜上，並且其中該KGF多肽、該VEGF-A多肽和該Wnt家族成員多肽暴露在該外泌體的膜的外表面上。還公開了組合物、核酸構建體以及該外泌體在治療脫髮和/或白髮中的用途。

Description

用於治療脫髮和/或白髮的工程化外泌體

本公開涉及工程化外泌體，具體地涉及以下外泌體，該外泌體攜帶錨定在外泌體的膜外部的不同融合蛋白。本公開還涉及包含工程化外泌體的組合物、包含編碼融合蛋白的多核苷酸的核酸構建體以及工程化外泌體在預防或治療脫髮和/或白髮中的用途。

掉髮也稱為脫髮或禿髮，是指頭部或身體部位的毛髮掉落。掉髮的嚴重程度從一小塊區域到全身都有可能。脫髮可能是由心理壓力引起的，或者可能是由藥物或其他原因引起的。脫髮的常見類型包括雄激素性脫髮(包括男性型掉髮和女性型掉髮)、斑禿和稱為休止期脫髮的毛髮稀疏。男性型掉髮的原因包括遺傳和雄性激素的綜合作用，女性型掉髮的原因尚不清楚，斑禿的原因是自身免疫，休止期脫髮的原因通常是身體上或心理上的壓力事件。

毛囊是再生器官，其中幹細胞能夠大規模更新。毛囊由外根鞘、內根鞘和毛幹組成。增殖的未分化基質細胞形成內根鞘和毛幹，並且被由特化間充質細胞組成的真皮乳頭包圍。真皮乳頭指示毛囊的形成，但是毛囊的特徵是透過上皮資訊獲得的。毛囊的下部部分經歷一個生長週期，該週期包括生長期(活躍生長)、退行期(破壞)和休止期(靜止)的階段。這些不同的階段持續不同時間段，這取決於毛囊的位置和功能。基 質細胞在生長期期間快速增殖，向上遷移，然後分化成內根鞘和毛幹的細胞類型。在退行期期間，下部毛囊經歷凋亡性死亡，並且真皮乳頭向上移動，直到該真皮乳頭到達凸起下方的區域。在休止期期間，該真皮乳頭停留在該區域。一旦真皮乳頭從凸起處募集到幹細胞，生長期就重新開始，並且毛囊可透過增殖和分化實現再生。

控制脫髮通常包括使用藥物或外科手術。目前用於治療脫髮的藥物是米諾地爾(minoxidil)、非那雄胺(finasteride)和度他雄胺(dutasteride)。透過包括毛髮移植的外科手術控制脫髮。毛髮移植通常在局部麻醉下進行。外科醫生會將頭部後面和兩側的健康毛髮移植到毛髮稀疏的區域。該過程可能花費四小時至八小時，並且可能進行額外的療程以使毛髮更濃密。當非禿頂區域中沒有足夠的毛髮時，常規毛髮移植方法就會受到影響。幹細胞療法代表了治療和控制脫髮的新興策略。然而，在常規毛髮移植的情況下，將毛囊幹細胞施用到禿頂頭皮區域的效率非常低，因為這種區域的皮膚中沒有新毛囊生長所需的生長因子。

白髮(自然的毛髮變白)與毛髮黑色素細胞的特異性和逐漸耗竭有關，這種耗竭既影響毛球的黑色素細胞，也影響黑色素細胞的前體細胞。毛囊中存在的其他細胞類型不受影響。此外，在表皮中沒有觀察到黑色素細胞的這種耗竭。毛囊中的黑色素細胞和黑色素細胞前體逐漸和特異性耗竭的原因至今尚未查明。

因此，需要另外的且改善的用於治療脫髮(包括雄激素性脫髮和斑禿)的方法和組合物。為了防止白髮，還需要防止人體毛囊中黑色素細胞的消失，這一過程既影響毛球中的活躍黑色素細胞，也影響毛囊上 部區域中的靜止黑色素細胞。

在本發明的一個方面，提供了一種工程化外泌體，該工程化外泌體包含(a)KGF多肽，該KGF多肽與第一錨定多肽融合，(b)VEGF-A多肽，該VEGF-A多肽與第二錨定多肽融合，和(c)參與Wnt/β-連環蛋白信號通路的Wnt家族成員多肽，該Wnt家族成員多肽與第三錨定多肽融合，其中(a)、(b)和(c)分別透過該第一、第二和第三錨定多肽錨定在該外泌體的膜上，並且其中該KGF多肽、該VEGF-A多肽和該Wnt家族成員多肽暴露在該外泌體的膜的外表面上。

在一些實施方案中，該KGF多肽是KGF-1多肽，較佳地，該KGF-1多肽包含與如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列。

在一些實施方案中，該VEGF-A多肽是人VEGF₂₀₆異構體或其直系同源物或旁系同源物，較佳地，該VEGF-A多肽包含與如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列。

在一些實施方案中，該Wnt家族成員多肽是Wnt10a、Wnt10b、Wnt3a、Wnt1a、Wnt4、Wnt5a、Wnt7a或Wnt7b多肽；較佳地，該Wnt家族成員多肽是Wnt10b多肽；更佳地，該Wnt10b多肽包含與如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列。

在一些實施方案中，這些錨定多肽是外泌體的膜蛋白、膜靶 向序列或其錨定功能片段。示例性的外泌體的膜蛋白包括但不限於lamp2b、四跨膜蛋白諸如CD63、CD9和CD81、血小板來源的生長因子受體(PDGFR)、乳黏素(C1C2結構域)、水泡性口炎病毒糖蛋白(VSVG)、前列腺素F2受體負調節劑(PTGFRN)以及它們的任何組合。示例性的膜靶向序列包括但不限於糖基磷脂醯肌醇(GPI)錨和脂質錨定蛋白。

在較佳的實施方案中，該第一、第二和第三錨定多肽包含全長CD63或保留TM3結構域的截短CD63。在較佳的實施方案中，該第一、第二和第三錨定多肽中的每一者都包含CD63的TM3結構域。在較佳的實施方案中，該第一、第二和第三錨定多肽中的每一者都是CD63的TM3結構域。在一些實施方案中，該第一、第二和第三錨定多肽中的每一者都是CD63的TM3結構域；較佳地，該CD63的TM3結構域包含與如SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列。

在一些實施方案中，該KGF多肽、該VEGF-A多肽和該Wnt家族成員多肽分別任選地透過肽接頭與該第一、第二和第三錨定多肽的C末端融合，較佳地，該肽接頭由甘胺酸和絲胺酸組成，例如(G4S)n，其中n是1至3的整數。

在一些實施方案中，該外泌體不是源自間充質幹細胞；較佳地，該外泌體不是源自幹細胞。

在一些實施方案中，該外泌體促進毛髮再生，以及/或者改善脫髮，例如雄激素性脫髮、斑禿或休止期脫髮。在一些實施方案中，該外泌體預防和/或限制和/或阻止白髮的形成，並且維持和/或促進頭髮和/或體毛的自然復色。在一些實施方案中，該外泌體：(i)促進毛髮再生，以及 /或者改善脫髮，例如雄激素性脫髮、斑禿或休止期脫髮；以及(ii)預防和/或限制和/或阻止白髮的形成，並且維持和/或促進頭髮和/或體毛的自然復色。

本公開的另一方面涉及一種組合物，該組合物包含根據請求項1至8中任一項所述的外泌體，和載劑；較佳地，該組合物是液體製劑；更佳地，該組合物經配製用於局部或皮下施用。

在一些實施方案中，該組合物不含未附著於該外泌體的膜的KGF多肽(例如KGF-1多肽)、VEGF-A多肽或參與Wnt/β-連環蛋白信號通路的Wnt家族成員多肽(例如Wnt10b多肽)。

本公開的另一方面涉及一種核酸構建體，該核酸構建體包含編碼以下物質的多核苷酸：(a)KGF多肽，該KGF多肽與第一錨定多肽融合，(b)VEGF-A多肽，該VEGF-A多肽與第二錨定多肽融合，和(c)參與Wnt/β-連環蛋白信號通路的Wnt家族成員多肽，該Wnt家族成員多肽與第三錨定多肽融合。

在一些實施方案中，該KGF多肽是KGF-1多肽，較佳地，該KGF-1多肽包含與如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列。

在一些實施方案中，該VEGF-A多肽是人VEGF₂₀₆異構體或其直系同源物或旁系同源物，較佳地，該VEGF-A多肽包含與如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列。

在一些實施方案中，該Wnt家族成員多肽是Wnt10a、 Wnt10b、Wnt3a、Wnt1a、Wnt4、Wnt5a、Wnt7a或Wnt7b多肽；較佳地，該Wnt家族成員多肽是Wnt10b多肽；更佳地，該Wnt10b多肽包含與如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列。

在一些實施方案中，編碼該KGF多肽的多核苷酸具有如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列或其簡併序列。

在一些實施方案中，編碼該VEGF-A多肽的多核苷酸具有如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列或其簡併序列。

在一些實施方案中，編碼該Wnt家族成員多肽的多核苷酸具有如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列或其簡併序列。

在一些實施方案中，這些錨定多肽是外泌體的膜蛋白、膜靶向序列或其錨定功能片段。示例性的外泌體的膜蛋白包括但不限於lamp2b、四跨膜蛋白諸如CD63、CD9和CD81、血小板來源的生長因子受體(PDGFR)、乳黏素(C1C2結構域)、水泡性口炎病毒糖蛋白(VSVG)、前列腺素F2受體負調節劑(PTGFRN)以及它們的任何組合。示例性的膜靶向序列包括但不限於糖基磷脂醯肌醇(GPI)錨和脂質錨定蛋白。

在較佳的實施方案中，該第一、第二和第三錨定多肽包含全長CD63或保留TM3結構域的截短CD63。在較佳的實施方案中，該第一、第二和第三錨定多肽中的每一者都包含CD63的TM3結構域。在較佳的實施方案中，該第一、第二和第三錨定多肽中的每一者都是CD63的TM3結構域。在一些實施方案中，編碼該CD63的TM3結構域的多核苷酸具有如SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列或其簡併序列。

在一些實施方案中，該多核苷酸是包含編碼(a)、(b)和(c)的核苷酸片段的單個多核苷酸；較佳地，該多核苷酸從5’到3’包含編碼以下物質的核苷酸片段：

(i)[第一錨定多肽]-[KGF]-[自切割肽]-[第二錨定多肽]-[VEGF-A]-[自切割肽]-[第三錨定多肽]-[Wnt]，

(ii)[第一錨定多肽]-[KGF]-[自切割肽]-[第二錨定多肽]-[Wnt]-[自切割肽]-[第三錨定多肽]-[VEGF-A]，

(iii)[第一錨定多肽]-[VEGF-A]-[自切割肽]-[第二錨定多肽]-[KGF]-[自切割肽]-[第三錨定多肽]-[Wnt]，

(iv)[第一錨定多肽]-[VEGF-A]-[自切割肽]-[第二錨定多肽]-[Wnt]-[自切割肽]-[第三錨定多肽]-[KGF]，

(v)[第一錨定多肽]-[Wnt]-[自切割肽]-[第二錨定多肽]-[KGF]-[自切割肽]-[第三錨定多肽]-[VEGF-A]，或

(vi)[第一錨定多肽]-[Wnt]-[自切割肽]-[第二錨定多肽]-[VEGF-A]-[自切割肽]-[第三錨定多肽]-[KGF]，

其中，[]代表單獨的多肽，並且]-[代表接頭或鍵結；

其中，Wnt代表參與Wnt/β-連環蛋白信號通路的Wnt家族成員多肽。

在一些實施方案中，該自切割肽是2A肽，例如T2A、E2A、P2A或它們的任何組合。

在其他實施方案中，該第一、第二和第三錨定多肽中的每一者位於Wnt、KGF和/或VEGF的C末端，以確保Wnt、KGF和/或VEGF 暴露在外泌體的表面上。例如，當lamp2b用作這些錨定多肽中的一者時，待呈遞至該外泌體表面上的多肽(例如Wnt、KGF和VEGF)可位於lamp2b的N末端。在一些實施方案中，當使用不同的錨定多肽時，待呈遞至該外泌體表面上的多肽可位於這些錨定多肽的N末端或C末端，這取決於所使用的錨定多肽的種類。例如，在一個實施方案中，單個多核苷酸包含編碼(a)、(b)和(c)的核苷酸片段，該單個多核苷酸從5’至3’包含編碼以下物質的核苷酸片段：[第一錨定多肽]-[Wnt]-[自切割肽]-[VEGF-A]-[第二錨定多肽]-[自切割肽]-[第三錨定多肽]-[KGF]，其中該第二錨定多肽位於VEGF-A多肽的C末端。

本公開的另一方面涉及一種載體，該載體包含本文所述的核酸構建體中的任一者所述的核酸構建體。

本公開的另一方面涉及一種用本文所述的載體轉導的細胞，其中該多核苷酸整合到該細胞的基因組中。

在一些實施方案中，該細胞不是間充質幹細胞；較佳地，該細胞不是幹細胞；較佳地，該細胞是哺乳動物細胞；或更佳地，該細胞是HEK293或CHO細胞。

本公開的另一方面涉及一種產生如本文所公開的工程化外泌體的方法，該方法包括(a)用如上所述的載體轉導如上所述的細胞；(b)在允許外泌體從該細胞分泌的條件下，培養該細胞；以及(c)收集並純化該外泌體。

在一些實施方案中，該方法還包括在步驟(b)期間使該細胞適應無血清條件。

本公開的再一方面涉及如本文所公開的工程化外泌體或組合物在製備用於治療脫髮和/或白髮的藥物中的用途；較佳地，該脫髮是雄激素性脫髮、斑禿或休止期脫髮；較佳地，該白髮是年齡相關的毛髮變灰白、早發性白髮或突發性白髮。

本公開的再一方面涉及一種治療脫髮和/或白髮的方法；較佳地，該脫髮是雄激素性脫髮、斑禿或休止期脫髮；較佳地，該白髮是年齡相關的毛髮變灰白、早發性白髮或突發性白髮；該方法包括向受試者施用有效量的如本文所公開的工程化外泌體或組合物。

本公開的再一方面涉及用於治療脫髮和/或白髮的如本文所公開的工程化外泌體或組合物；較佳地，該脫髮是雄激素性脫髮、斑禿或休止期脫髮；較佳地，該白髮是年齡相關的毛髮變灰白、早發性白髮或突發性白髮。

根據下文提供的具體實施方式，本公開的這些及其他方面和優點將是顯而易見的。

圖1顯示穩定細胞株的構建，其可以分泌負載有功能蛋白的工程化外泌體。培養哺乳動物細胞(例如HEK293細胞)，並用慢病毒感染，該慢病毒包裝有功能基因KGF、VEGFA和Wnt10b。然後使用殺稻瘟菌素(blasticidin)選擇穩定細胞株。經過三次傳代選擇後，在細胞沉澱物和外泌體中都發現了功能基因的表達。在確認表達後，進行了穩定細胞株在無血清條件下的適應性培養。最後，收集無血清穩定細胞株的培養上清液，並鑒定透過超高速離心純化的外泌體。

圖2顯示用於雄激素性脫髮的工程化外泌體的鑒定。圖2A顯示透過NanoFCM分析了源自穩定細胞株的外泌體的粒徑和顆粒濃度。圖2B顯示透過穿透式電子顯微鏡(TEM)檢查外泌體。圖2C顯示使用抗CD63-TM3的抗體對外泌體進行免疫墨點分析，該CD63-TM3是與外泌體融合的支架蛋白。

圖3顯示對用於掉髮治療的工程化外泌體35#的體內評估。圖3A顯示雄激素性脫髮小鼠模型和方案的示意圖。小鼠背部毛髮脫毛後，每3天用35#外泌體、對照外泌體(Ctrl Exo.)、PBS(陰性對照)或5%米諾地爾(陽性對照)處理小鼠皮膚一次。在18天的治療期間持續觀察，然後在第18天處死動物，進行組織學分析。圖3B顯示觀察毛髮覆蓋情況。將小鼠分成四組(n=4)，並顯示出了小鼠在第15天的代表性圖像。圖3C顯示小鼠背部皮膚關於毛囊數量、長度和生長階段比例的組織學分析。資料點代表平均值±SD(n=4)。誤差槓表示標準差(SD.)；ns表示無顯著差異；*P<0.05、**P<0.01以及***P<0.001。

圖4顯示對工程化外泌體35#在抗毛髮變灰白方面的體內評估。圖4A顯示氫醌誘導的毛髮變灰白模型和方案的示意圖。小鼠背部毛髮脫毛後，將雌性C57BL/6小鼠隨機分組(n=4)，並用氫醌乳膏局部施塗，一天2次。陰性模型對照組使用PBS透過塗抹局部施用處理。用不同的施用途徑(例如，微針接種後塗抹、奈米結晶輸注後塗抹、皮下注射)處理35#外泌體組。在28天的治療期間持續觀察。圖4B顯示觀察背部毛髮。顯示出了小鼠在第14天的代表性圖像。

定義

當在本說明書中與詞語“包括”一起使用時，包括申請專利範圍在內，詞語“一”和“一個”表示“一個或多個”。

如本文所用，術語“或”和“和/或”用於描述多種組分的組合或相互排斥。例如，“x、y和/或z”可以指單獨的“x”、單獨的“y”、單獨的“z”、“x、y和z”、“(x和y)或z”、“x或(y和z)”或“x或y或z”。具體來說，可將x、y或z明確地排除在實施方案之外。

在本申請中，術語“約”根據其在細胞和分子生物學領域中普通和一般的含義使用，表示一個值包括用於確定該值的裝置或方法的誤差標準差。

“同源性”或“同一性”或“相似性”是指兩個肽之間或兩個核酸分子之間的序列相似性。同源性可透過比較可出於比較的目的而被比對的每條序列中的位置來確定。當所比較的序列中的位置被相同的鹼基或胺基酸佔據時，則分子在該位置是同源的。序列之間的同源性程度隨序列具有的匹配或同源位置數量而變化。“不相關”或“非同源”序列與本公開的序列中的一條序列具有小於40%的同一性，但較佳地小於25%的同一性。

多核苷酸或多核苷酸區域(或多肽或多肽區域)與另一條序列具有特定百分比(例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%)的“序列同一性”意指當比對時，在比較兩條序列時鹼基(或胺基酸)的百分比相同。這種比對和同源性或序列同一性百分比可使用本領域已知的軟體程式來確定。

如本文所用的術語“接頭”是指胺基酸(AA)的短片段或含 有兩個或更多個相同或不同胺基酸或核苷酸的核苷酸序列。

如本文所用，“細胞株”是指透過原代細胞培養物的一次或多次傳代培養形成的細胞群。每輪傳代培養稱為一次傳代。當細胞經傳代培養後，這些細胞便被稱為“經傳代”的細胞。特定的細胞群或細胞株有時以其傳代次數來表示或表徵。例如，已經傳代十次的培養細胞群可稱為P10培養物。原代培養物，即，從組織分離細胞後的第一次培養物，命名為P0。在第一次傳代培養後，將該細胞描述為二代培養物(P1或第1代)。在第二次傳代培養後，該細胞變成三代培養物(P2或第2代)等等。本領域技術人員將理解，在傳代期間可能存在許多群體倍增；因此，培養物的群體倍增數大於傳代數。細胞在傳代期間的擴增(例如群體倍增數)取決於許多因素，包括但不限於接種密度、底物、培養基、生長條件和傳代間隔時間。

當涉及未治療的受試者與受治療的受試者相比，表達任何症狀時，術語“減少”、“抑制”、“減輕”、“降低”、“下降”、“防止”以及它們的語法等效詞(包括“較低”、“較小”等)是指受治療的受試者的症狀數量和/或程度低於未治療的受試者的症狀數量和/或程度，並且這一差異在任何醫學專業人員看來是臨床上具有相關性的。在一個實施方案中，受治療的受試者的症狀數量和/或程度比未治療的受試者的症狀數量和/或程度低至少10%、低至少25%、低至少50%、低至少75%和/或低至少90%。

如本文所用，術語“治療有效量”與“有效量”、“治療有效劑量”和/或“有效劑量”同義，是指在有需要的個體中引起從業者所尋求的生物學、美容學或臨床反應的化合物量。作為一個示例，有效量是足以減少掉髮的量。對於所公開方法的特定應用，施用的適當有效量可由本領域技術 人員使用本文提供的指導來確定。例如，可從如本說明書所述的體外和體內測定來推斷有效量。本領域技術人員將認識到，可以在整個治療過程中監測個體的狀況，並且可以相應地調整所施用的本文所公開的外泌體或組合物的有效量。

如本文所用，術語“治療”是指試圖改變受治療的個體或細胞的自然過程的干預，並且可用於預防或在疾病或病症的病理過程中進行。治療可達到各種期望結局中的一種或多種，例如，包括預防疾病發生或復發、減輕症狀、減弱疾病的任何直接或間接病理結果、降低疾病進展速度、改善或減輕疾病狀態、緩解或改善預後。

如本文所用，術語“受試者”可與術語“個體”或“患者”互換使用，並且通常是指需要治療的個體。受試者可以是哺乳動物，諸如人、狗、貓、馬、豬或齧齒動物。受試者可以是例如患有或疑似患有與掉髮有關的疾病或醫學病症或處於患有這種疾病或醫學病症的風險的患者。對於患有或疑似患有與掉髮直接或間接相關的醫學病症的受試者，該醫學病症可以是一種或多種類型。

如本文所用，“載劑”是指與治療劑一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒介物。此類藥物載劑可以是無菌液體，諸如鹽水溶液和油，包括石油、動物、植物或合成來源的油，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油和類似的。當靜脈內施用組合物時，鹽水溶液是較佳的載劑。鹽水溶液以及葡萄糖和甘油水溶液也可用作液體載劑，特別是用於可注射溶液。合適的賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化鈉、脫脂 奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇和類似的。如果需要，組合物還可以含有少量的潤濕劑或乳化劑或pH緩衝劑。這些組合物可以採取溶液、懸浮液、乳液、片劑、丸劑、膠囊、粉末、持續釋放製劑和類似的形式。此類組合物將含有治療有效量的化合物，較佳純化形式的化合物，以及合適量的載劑，以便向患者提供適當的施用形式。製劑應適合施用模式。

術語“N末端胺基酸殘基”或“N末端”是指多肽或肽的第一個胺基酸殘基(1號胺基酸)。術語“C末端胺基酸殘基”或“C末端”是指多肽或肽的最後一個胺基酸殘基(n號胺基酸，其中n=肽或多肽中殘基的總數)。

術語“KGF”是指角質形成細胞生長因子，它是上皮促分裂原和成纖維細胞生長因子(FGF)家族的成員。在脊椎動物中，FGF家族包含22個成員，這些成員對於調節許多發育過程是必需的。KGF包括兩種功能上相似的變體，即KGF-1(也稱為FGF-7)和KGF-2(也稱為FGF-10)。重組人成纖維細胞生長因子FGF-10的特徵揭示了其與角質形成細胞生長因子(FGF-7)的功能相似性。這兩種生長因子與相同的高親和力受體(FGFR2的同種型KGFR)相互作用，該KGFR與FGFR2在第三免疫球蛋白環的後半部分有所不同，並且該KGFR由替代型外顯子編碼。KGF-1和KGF-2以高親和力結合KGFR的能力將它們與FGF-10家族的其他成員區別開來。KGF-2與KGF-1高度相關，該KGF-2與KGF-1結合相同的受體，並且它們具有57%的序列同源性。人KGF-2與大鼠KGF-2有96%的同一性，並特異性刺激正常人表皮角質形成細胞的生長。

術語“VEGFA”或血管內皮生長因子A是血管內皮生長因子(VEGF)家族細胞因子的主要成員，與胎盤生長因子(PlGF)、哺乳動物 中的VEGF-B/C/D、其他生物體中的VEGF-E/F一起，在血管發生、血管生成和淋巴管生成中起關鍵作用。1989年初，N.Ferrara等人首次將其命名為“VEGF”，VEGF-A是VEGF家族中研究最為廣泛的成員。Vegfa基因在外顯子8的選擇性剪接產生了不同的VEGF-A同種型，形成了VEGFxxxa或VEGFxxxb同種型。除了最近發現的轉譯後通讀事件之外，外顯子5-7的選擇性剪接事件還產生了VEGF-A同種型，這些同種型的生物利用度以及與共受體神經纖毛蛋白-1的相互作用各不相同。迄今為止，已經從最常見的六種轉錄本中鑒定出16種不同的VEGFA同種型：VEGF₁₁₁、VEGF₁₂₁、VEGF₁₄₅、VEGF₁₆₅、VEGF₁₈₉和VEGF₂₀₆。在大鼠中，已經描述了類似的VEGF-A剪接變體圖譜，每個變體編碼的胺基酸比人類少一個。較短的同種型VEGF₁₁₁和VEGF₁₂₁都缺少外顯子6和外顯子7，因此不與細胞外基質(ECM)相連，並且可自由擴散。相反，含有外顯子6a和外顯子7兩者的較長同種型VEGF₁₄₅、VEGF₁₈₉和VEGF₂₀₆可與硫酸肝素糖蛋白以高親和力結合。

術語“Wnt/β-連環蛋白信號通路”是指典型的Wnt通路，其涉及β-連環蛋白的核轉位以及透過TCF/LEF轉錄因子啟動標靶基因。典型的Wnt通路主要控制細胞增殖。非典型的Wnt通路不依賴於β-連環蛋白-T-細胞因子/淋巴增強子-結合因子(TCF/LEF)，諸如Wnt/Ca²⁺通路和非典型的Wnt平面細胞極性。Wnt/β-連環蛋白信號通路是胚胎發育和成人組織穩態再生所必需的。該通路的異常調節與不同疾病密切相關，表明Wnt/β-連環蛋白信號通路是疾病治療的有吸引力的標靶。術語“參與Wnt/β-連環蛋白信號通路的Wnt家族成員多肽”是指參與Wnt/β-連環蛋白信號通路的任何Wnt 家族成員或其功能性片段，包括但不限於Wnt10a、Wnt10b、Wnt3a、Wnt1a、Wnt4、Wnt5a、Wnt7a或Wnt7b多肽。

四跨膜蛋白家族成員(諸如CD63、CD81和CD9)，在外泌體上普遍表達，並廣泛用作外泌體生物標記物，參與生理過程，例如細胞黏附、細胞運動和信號轉導。CD63(第一特徵為四跨膜蛋白)具有兩個大小不等的細胞外環和兩個短的胞質結構域，參與各種類型免疫細胞的信號轉導過程。連續結構域缺失已經表明跨膜螺旋3(TM3)對於膜錨定和外泌體靶向是必要且充分的。

術語“錨定多肽”是當外泌體由細胞產生時錨定在外泌體膜上的多肽。跨膜蛋白是本公開文本中典型的錨定多肽。“錨定”或其語法變體是指多肽的至少一個片段嵌入外泌體膜中。錨定多肽可以完全或部分地嵌入外泌體膜中。在本公開中，錨定多肽和與同一細胞天然產生的外泌體異源的多肽融合，諸如KGF-1多肽。示例性錨定多肽是外泌體的膜蛋白、膜靶向序列或其錨定功能片段。示例性的外泌體的膜蛋白包括但不限於lamp2b、四跨膜蛋白諸如CD63、CD9和CD81、血小板來源的生長因子受體(PDGFR)、乳黏素(C1C2結構域)、水泡性口炎病毒糖蛋白(VSVG)、前列腺素F2受體負調節劑(PTGFRN)以及它們的任何組合。示例性的膜靶向序列包括但不限於糖基磷脂醯肌醇(GPI)錨和脂質錨定蛋白。有關外泌體中GPI錨的詳細綜述可從以下文獻中獲得，例如，Michel Vidal，“外泌體和GPI錨定蛋白：用於研究體液中生物標記物的明智配對(Exosomes and GPI-anchored proteins：Judicious pairs for investigating biomarkers from body fluids)”，Advanced Drug Delivery Reviews，第161-162卷，2020年(其全 文以引用方式併入本文)。在本公開的較佳實施方案中，該錨定多肽包含CD63蛋白的跨膜螺旋3(TM3)或由其組成。

工程化外泌體

本公開的一個方面涉及一種工程化外泌體，該工程化外泌體包含(a)KGF多肽，該KGF多肽與第一錨定多肽融合，(b)VEGF-A多肽，該VEGF-A多肽與第二錨定多肽融合，和(c)參與Wnt/β-連環蛋白信號通路的Wnt家族成員多肽，該Wnt家族成員多肽與第三錨定多肽融合，其中(a)、(b)和(c)分別透過該第一、第二和第三錨定多肽錨定在該外泌體的膜上，並且其中該KGF多肽、該VEGF-A多肽和該Wnt家族成員多肽暴露在該外泌體的膜的外表面上。

在本公開中，該KGF多肽是KGF-1多肽或KGF-2多肽。在較佳的實施方案中，該KGF多肽是KGF-1多肽。在一些實施方案中，該KGF-1多肽包含與如SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列。

在較佳的實施方案中，該KGF-1多肽包含與如SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列。在一些實施方案中，該KGF-1多肽包含如SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列，該多肽是人KGF-1多肽。在一些實施方案中，該KGF-1多肽的胺基酸序列示於SEQ ID NO：4。

在本公開中，該VEGF-A多肽可以是本領域發現的任何 VEGF-A異構體。在較佳的實施方案中，該VEGF-A多肽是人VEGF₂₀₆異構體或其直系同源物或旁系同源物。在一些實施方案中，該VEGF-A多肽包含與如SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列。

在較佳的實施方案中，該VEGF-A多肽包含與如SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列。在一些實施方案中，該VEGF-A多肽包含如SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，該多肽是人VEGF₂₀₆異構體。在一些實施方案中，人VEGF₂₀₆異構體的胺基酸序列示於SEQ ID NO：5。

在本公開中，參與Wnt/β-連環蛋白信號通路的Wnt家族成員多肽可以是參與Wnt/β-連環蛋白信號通路的任何Wnt家族成員。在較佳的實施方案中，參與Wnt/β-連環蛋白信號通路的Wnt家族成員多肽是Wnt10a、Wnt10b、Wnt3a、Wnt1a、Wnt4、Wnt5a、Wnt7a或Wnt7b多肽。

在較佳的實施方案中，該Wnt家族成員多肽是Wnt10b。在較佳的實施方案中，該Wnt10b多肽包含與如SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列。在較佳的實施方案中，該Wnt10b多肽包含與如SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列。在一些實施方案中，該Wnt10b多肽包含如SEQ ID NO：6所 示的胺基酸序列，該多肽是人Wnt10b多肽。在一些實施方案中，該Wnt10b多肽的胺基酸序列示於SEQ ID NO：6。

在一些實施方案中，這些錨定多肽是外泌體的膜蛋白、膜靶向序列或其錨定功能片段。示例性的外泌體的膜蛋白包括但不限於lamp2b、四跨膜蛋白諸如CD63、CD9和CD81、血小板來源的生長因子受體(PDGFR)、乳黏素(C1C2結構域)、水泡性口炎病毒糖蛋白(VSVG)、前列腺素F2受體負調節劑(PTGFRN)以及它們的任何組合。示例性的膜靶向序列包括但不限於糖基磷脂醯肌醇(GPI)錨和脂質錨定蛋白。在較佳的實施方案中，該第一、第二和第三錨定多肽包含CD63的TM3結構域。在較佳的實施方案中，該第一、第二和第三錨定多肽中的每一者都包含CD63的TM3結構域。在一些實施方案中，這些錨定多肽是全長CD63蛋白，例如全長人CD63(參見例如UniProtKB/Swiss-Prot：F8VZE2、P08962、Q5TZP3、Q8N6Z9或Q9UCG6)。在一些實施方案中，這些錨定多肽是包含TM3結構域以及TM1、TM2和TM4結構域中的至少一者的截短的CD63蛋白。例如，這些錨定多肽可以由CD63的TM2和TM3；CD63的TM3和TM4；或CD63的TM1、TM2和TM3組成。在一些實施方案中，這些錨定多肽由CD63的TM3結構域組成。在本公開中，該第一、第二和第三錨定多肽可以是不同的或相同的。在較佳的實施方案中，該第一、第二和第三錨定多肽是相同的，並且由CD63的TM3結構域組成。

在較佳的實施方案中，該CD63的TM3結構域包含與如SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列。在較佳 的實施方案中，該CD63的TM3結構域包含如SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列。在較佳的實施方案中，該CD63的TM3結構域的胺基酸序列示於SEQ ID NO：13。

因此，在較佳的實施方案中，提供了一種工程化外泌體，該工程化外泌體包含(a)KGF-1多肽，該KGF-1多肽與第一錨定多肽融合，(b)VEGF-A多肽，該VEGF-A多肽與第二錨定多肽融合，和(c)Wnt10b多肽，該Wnt10b多肽與第三錨定多肽融合，其中該第一、第二和第三錨定多肽中的每一者都包含CD63的TM3結構域，其中(a)、(b)和(c)分別透過該第一、第二和第三錨定多肽錨定在該外泌體的膜上，並且其中該KGF-1多肽、該VEGF-A多肽和該Wnt10b多肽暴露在該外泌體的膜的外表面上。

在較佳的實施方案中，提供了一種工程化外泌體，該工程化外泌體包含(a)人KGF-1多肽，該人KGF-1多肽與第一錨定多肽融合的，(b)人VEGF-A多肽，該人VEGF-A多肽與第二錨定多肽融合，和(c)人Wnt10b多肽，該人Wnt10b多肽與第三錨定多肽融合，其中該第一、第二和第三錨定多肽中的每一者都包含CD63的TM3結構域，其中(a)、(b)和(c)分別透過該第一、第二和第三錨定多肽錨定在該外泌體的膜上，並且其中該人KGF-1多肽、該人VEGF-A多肽和該人Wnt10b多肽暴露在該外泌體的膜的外表面上。

在較佳的實施方案中，提供了一種工程化外泌體，該工程化外泌體包含(a)KGF-1多肽，該KGF-1多肽包含與如SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列，該KGF-1多肽與第一錨 定多肽融合，(b)VEGF-A多肽，該VEGF-A多肽包含與如SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列，該VEGF-A多肽與第二錨定多肽融合，和(c)Wnt10b多肽，該Wnt10b多肽包含與如SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列，該Wnt10b多肽與第三錨定多肽融合，其中該第一、第二和第三錨定多肽中的每一者都包含CD63的TM3結構域，其中(a)、(b)和(c)分別透過該第一、第二和第三錨定多肽錨定在該外泌體的膜上，並且其中該KGF-1多肽、該VEGF-A多肽和該Wnt10b多肽暴露在該外泌體的膜的外表面上。

在較佳的實施方案中，提供了一種工程化外泌體，該工程化外泌體包含(a)KGF-1多肽，該KGF-1多肽包含與如SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列，該KGF-1多肽與第一錨定多肽融合，(b)VEGF-A多肽，該VEGF-A多肽包含與如SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列，該VEGF-A多肽與第二錨定多肽融合，和(c)Wnt10b多肽，該Wnt10b多肽包含與如SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列，該Wnt10b多肽與第三錨定多肽融合，其中該第一、第二和第三錨定多肽中的每一者都包含CD63的TM3結構域，該結構域包含與如SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列，其中(a)、(b)和(c)分別透過該第一、第二和第三錨定多肽錨定在該外泌體的膜上，並且其中該KGF-1多肽、該VEGF-A多肽和該Wnt10b多肽暴露在該外泌體的膜的外表面上。

在較佳的實施方案中，提供了一種工程化外泌體，該工程化外泌體包含(a)KGF-1多肽，該KGF-1多肽具有如SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列，該KGF-1多肽與第一錨定多肽融合，(b)VEGF-A多肽，該VEGF-A多肽具有如SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，該VEGF-A多肽與第二錨定多肽融合，和(c)Wnt10b多肽，該Wnt10b多肽具有如SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列，該Wnt10b多肽與第三錨定多肽融合，其中該第一、第二和第三錨定多肽中的每一者都由CD63的TM3結構域組成，該結構域具有如SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列，其中(a)、(b)和(c)分別透過該第一、第二和第三錨定多肽錨定在該外泌體的膜上，並且其中該KGF-1多肽、該VEGF-A多肽和該Wnt10b多肽暴露在該外泌體的膜的外表面上。

在上述任何實施方案中，該KGF多肽、該VEGF-A多肽和該Wnt家族成員多肽分別直接或透過肽接頭與該第一、第二和第三錨定多肽的C末端融合。該肽接頭可以是本領域可獲得的用於連接融合蛋白中的不同結構域或功能區的任何肽接頭。在較佳的實施方案中，該肽接頭由甘胺酸和絲胺酸組成，例如(G4S)n，其中n是1至3的整數。

在本公開中，較佳地，該外泌體不是源自間充質幹細胞。更佳地，該外泌體不是源自幹細胞。在較佳的實施方案中，本發明所提供的 外泌體源自非幹細胞，諸如CHO或HEK293細胞。在本公開中，較佳地，該外泌體從其所源自的細胞純化和/或分離。

在一些實施方案中，本公開所提供的外泌體促進毛髮再生，以及/或者改善脫髮，例如雄激素性脫髮、斑禿或休止期脫髮。例如，本公開所提供的外泌體增加毛囊數量、毛囊長度和/或生長期/休止期比例。

在一些實施方案中，本公開所提供的外泌體預防和/或限制和/或阻止白髮的形成，並且維持和/或促進頭髮和/或體毛的自然復色。

在一些實施方案中，本公開所提供的外泌體促進毛髮再生，以及/或者改善脫髮，例如雄激素性脫髮、斑禿或休止期脫髮；以及預防和/或限制和/或阻止白髮的形成，並且維持和/或促進頭髮和/或體毛的自然復色。

用於治療或預防脫髮的方法和組合物

本公開的各個方面涉及用於治療或預防脫髮、白髮或兩者的方法和組合物。脫髮(也稱為“掉髮”)描述的是受試者頭部或身體任何部位的毛髮掉落。各種類型的脫髮是本領域已知的並且是本文考慮的，包括但不限於雄激素性脫髮(例如，男性型掉髮、女性型掉髮)、斑禿和休止期脫髮。在一些實施方案中，公開了用於治療斑禿的方法。白髮(自然的毛髮變白)與毛髮黑色素細胞的特異性和逐漸耗竭有關，這種耗竭既影響毛球的黑色素細胞，也影響黑色素細胞的前體細胞。各種類型的白髮是本領域已知的並且是本文考慮的，包括但不限於，白髮是年齡相關的毛髮變灰白、早發性白髮或突發性白髮。在一些實施方案中，公開了用於治療年齡相關的毛髮變灰白的方法。

如本文所公開的，本公開所提供的工程化外泌體可用於治療和預防脫髮、白髮或兩者。因此，本公開的實施方案涉及用於治療或預防脫髮、白髮或兩者的方法，該方法包括向受試者提供有效量的工程化外泌體。在一些實施方案中，本公開的方法包括向受試者施用工程化外泌體以用於治療或預防脫髮、白髮或兩者。此類組合物的施用包括例如局部施用、透皮施用和皮內施用。

可以將工程化外泌體與一種或多種治療劑或療法組合提供給受試者。當該工程化外泌體旨在用於治療脫髮時，在一個示例中，本公開的工程化外泌體與二苯基環丙烯酮組合(例如，同時、之前或之後)施用於受試者。在一個示例中，本公開的工程化外泌體與巴瑞替尼組合(例如，同時、之前或之後)施用於受試者。在一個示例中，本公開的工程化外泌體與米諾地爾組合(例如，同時、之前或之後)施用於受試者。在一個示例中，本公開的工程化外泌體與非那雄胺組合(例如，同時、之前或之後)施用於受試者。在一個示例中，本公開的工程化外泌體與螺內酯或度他雄胺組合(例如，同時、之前或之後)施用於受試者。在一個示例中，本公開的工程化外泌體與毛髮移植外科手術組合(例如，同時、之前或之後)施用於受試者。

當該工程化外泌體旨在用於治療白髮時，在一個示例中，將本公開的工程化外泌體與染髮組合(例如，同時、之前或之後)施用於受試者。

在本公開中，所提供的組合物包含該工程化外泌體和載劑。在較佳的實施方案中，該組合物是液體製劑。在較佳的實施方案中，該組 合物經配製用於局部或皮下施用。可考慮使用包含該工程化外泌體的組合物，包括例如肥皂、洗髮劑、軟膏和其他此類製劑。

在較佳的實施方案中，該組合物不含未附著於該外泌體的膜的KGF多肽(例如KGF-1多肽)、VEGF-A多肽或參與Wnt/β-連環蛋白信號通路的Wnt家族成員多肽(例如Wnt10b多肽)。例如，除了錨定在該工程化外泌體的膜上的多肽之外，不向該組合物中添加另外的KGF多肽(例如KGF-1多肽)、VEGF-A多肽或參與Wnt/β-連環蛋白信號通路的Wnt家族成員多肽(例如Wnt10b多肽)。

在一些實施方案中，該組合物是化妝品組合物。在一些實施方案中，該組合物是非化妝品組合物。在一些實施方案中，該組合物是藥物組合物。在一些實施方案中，該組合物包含用於治療脫髮的其他活性劑。較佳地，用於治療脫髮的其他活性劑選自二苯基環丙烯酮、巴瑞替尼、米諾地爾、非那雄胺、螺內酯、度他雄胺或它們的任何組合。在較佳的實施方案中，用於治療脫髮的其他活性劑是二苯基環丙烯酮、巴瑞替尼或米諾地爾。在一些實施方案中，該組合物包含用於治療白髮的其他活性劑。

核酸構建體、載體、細胞和產生方法

本公開的各個方面還涉及編碼錨定在外泌體上的多肽的核酸構建體。

在一些實施方案中，提供了一種核酸構建體，該核酸構建體包含編碼以下物質的多核苷酸：(a)KGF多肽，該KGF多肽與第一錨定多肽融合，(b)VEGF-A多肽，該VEGF-A多肽與第二錨定多肽融合，和(c)參與Wnt/β-連環蛋白信號通路的Wnt家族成員多肽，該Wnt家族成員多肽 與第三錨定多肽融合。

在一些實施方案中，提供了一組三個核酸構建體，其中第一核酸構建體包含編碼(a)的多核苷酸，第二核酸構建體包含編碼(b)的多核苷酸，並且第三核酸構建體包含編碼(c)的多核苷酸，其中(a)、(b)和(c)如上文所定義。

在一些實施方案中，提供了一組兩個核酸構建體，其中一個核酸構建體包含編碼(a)和(b)的多核苷酸，並且另一個核酸構建體包含編碼(c)的多核苷酸，其中(a)、(b)和(c)如上文所定義。

在一些實施方案中，提供了一組兩個核酸構建體，其中一個核酸構建體包含編碼(a)和(c)的多核苷酸，並且另一個核酸構建體包含編碼(b)的多核苷酸，其中(a)、(b)和(c)如上文所定義。

在一些實施方案中，提供了一組兩個核酸構建體，其中一個核酸構建體包含編碼(b)和(c)的多核苷酸，並且另一個核酸構建體包含編碼(a)的多核苷酸，其中(a)、(b)和(c)如上文所定義。

在較佳的實施方案中，提供了包含編碼(a)、(b)和(c)的多核苷酸的單個核酸構建體，其中(a)、(b)和(c)如上文所定義。

在一些實施方案中，這些錨定多肽是外泌體的膜蛋白、膜靶向序列或其錨定功能片段。示例性的外泌體的膜蛋白包括但不限於lamp2b、四跨膜蛋白諸如CD63、CD9和CD81、血小板來源的生長因子受體(PDGFR)、乳黏素(C1C2結構域)、水泡性口炎病毒糖蛋白(VSVG)、前列腺素F2受體負調節劑(PTGFRN)以及它們的任何組合。示例性的膜靶向序列包括但不限於糖基磷脂醯肌醇(GPI)錨和脂質錨定蛋白。

在一些實施方案中，該第一、第二和第三錨定多肽中的每一者位於Wnt、KGF和/或VEGF的N末端，以確保Wnt、KGF和/或VEGF暴露在外泌體的表面上。在一些實施方案中，該第一、第二和第三錨定多肽中的每一者位於Wnt、KGF和/或VEGF的C末端，以確保Wnt、KGF和/或VEGF暴露在外泌體的表面上。例如，當lamp2b用作這些錨定多肽中的一者時，待呈遞至該外泌體表面上的多肽(例如Wnt、KGF和VEGF)可位於lamp2b的N末端。例如，當CD63的TM3結構域用作這些錨定多肽中的一者時，待呈遞至該外泌體表面上的多肽(例如Wnt、KGF和VEGF)可位於CD63的TM3結構域的C末端。在一些實施方案中，當使用不同的錨定多肽時，待呈遞至該外泌體表面上的多肽可位於這些錨定多肽的N末端或C末端，這取決於所使用的錨定多肽的種類。

在較佳的實施方案中，該第一、第二和第三錨定多肽包含全長CD63或保留TM3結構域的截短CD63。在較佳的實施方案中，該第一、第二和第三錨定多肽中的每一者都包含CD63的TM3結構域。在較佳的實施方案中，該第一、第二和第三錨定多肽中的每一者都是CD63的TM3結構域。

在較佳的實施方案中，該多核苷酸從5’到3’可包含編碼以下物質的核苷酸片段：

(i)[第一錨定多肽]-[KGF]-[自切割肽]-[第二錨定多肽]-[VEGF-A]-[自切割肽]-[第三錨定多肽]-[Wnt]，

(ii)[第一錨定多肽]-[KGF]-[自切割肽]-[第二錨定多肽]-[Wnt]-[自切割肽]-[第三錨定多肽]-[VEGF-A]，

(iii)[第一錨定多肽]-[VEGF-A]-[自切割肽]-[第二錨定多肽]-[KGF]-[自切割肽]-[第三錨定多肽]-[Wnt]，

(iv)[第一錨定多肽]-[VEGF-A]-[自切割肽]-[第二錨定多肽]-[Wnt]-[自切割肽]-[第三錨定多肽]-[KGF]，

(v)[第一錨定多肽]-[Wnt]-[自切割肽]-[第二錨定多肽]-[KGF]-[自切割肽]-[第三錨定多肽]-[VEGF-A]，或

(vi)[第一錨定多肽]-[Wnt]-[自切割肽]-[第二錨定多肽]-[VEGF-A]-[自切割肽]-[第三錨定多肽]-[KGF]，

其中，[]代表單獨的多肽，並且]-[代表接頭或鍵結；其中，該多肽中的每一者從N末端排列到C末端；並且其中，Wnt代表參與Wnt/β-連環蛋白信號通路的Wnt家族成員多肽。

在較佳的實施方案中，該自切割肽是2A肽，例如T2A、E2A、P2A或它們的任何組合。例如，該自切割肽是T2A肽。在轉譯多核苷酸之後切割自切割肽，產生三個獨立的融合蛋白，每個融合蛋白包含待呈遞至外泌體的表面上的單個多肽和單個錨定多肽。

在其他實施方案中，單個多核苷酸包含編碼(a)、(b)和(c)的核苷酸片段，該單個多核苷酸從5’至3’包含編碼以下物質的核苷酸片段：[第一錨定多肽]-[Wnt]-[自切割肽]-[VEGF-A]-[第二錨定多肽]-[自切割肽]-[第三錨定多肽]-[KGF]，其中該第二錨定多肽位於VEGF-A多肽的C末端。這種改變也適用於如上(i)至(vi)中列出的任何多核苷酸。在一些實施方案中，該第一、第二和第三錨定多肽中的每一者都是不同的，因此這些錨定多肽可位於多肽Wnt、KGF和VEGF-A的N末端或C末端。

在較佳的實施方案中，提供了包含編碼(a)、(b)和(c)的多核苷酸的單個核酸構建體，其中(a)、(b)和(c)如上文所定義，並且其中該第一、第二和第三錨定多肽中的每一者包含CD63的TM3結構域，該多核苷酸從5’到3’可包含編碼以下物質中的一者的核苷酸片段：

(i)

[TM3]-[KGF]-[T2A]-[TM3]-[VEGF-A]-[T2A]-[TM3]-[Wnt]，

(ii)

[TM3]-[KGF]-[T2A]-[TM3]-[Wnt]-[T2A]-[TM3]-[VEGF-A]，

(iii)

[TM3]-[VEGF-A]-[T2A]-[TM3]-[KGF]-[T2A]-[TM3]-[Wnt]，

(iv)

[TM3]-[VEGF-A]-[T2A]-[TM3]-[Wnt]-[T2A]-[TM3]-[KGF]，

(v)

[TM3]-[Wnt]-[T2A]-[TM3]-[KGF]-[T2A]-[TM3]-[VEGF-A]，和

(vi)

[TM3]-[Wnt]-[T2A]-[TM3]-[VEGF-A]-[T2A]-[TM3]-[KGF]，

其中，[]代表單獨的多肽，並且]-[代表接頭或鍵結；其中，該多肽中的每一者從N末端排列到C末端；並且其中，Wnt代表參與Wnt/β-連環蛋白信號通路的Wnt家族成員多肽；TM3代表CD63的TM3結構域；T2A代表自切割肽T2A。

在本章節中，該KGF、VEGF-A和參與Wnt/β-連環蛋白信號通路的Wnt家族成員多肽具有上文關於標題為“工程化外泌體”的章節給 出的含義和較佳實施方案。

在一些實施方案中，編碼該KGF多肽的多核苷酸具有如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列或其簡併序列。

在一些實施方案中，編碼該VEGF-A多肽的多核苷酸具有如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列或其簡併序列。

在一些實施方案中，編碼該Wnt家族成員多肽的多核苷酸具有如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列或其簡併序列。

在一些實施方案中，編碼該CD63的TM3結構域的多核苷酸具有如SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列或其簡併序列。

還提供了包含上述核酸構建體的載體。在一些實施方案中，該載體是病毒載體。在較佳的實施方案中，該載體是慢病毒載體或腺相關病毒載體。

本文提供的載體有助於將以下多核苷酸整合到產生外泌體的細胞基因組中，該多核苷酸編碼錨定在工程化外泌體的膜上的多肽。

還提供了用該載體轉導的細胞。在較佳的實施方案中，該細胞不是間充質幹細胞。在較佳的實施方案中，該細胞不是幹細胞。在較佳的實施方案中，該細胞是非幹細胞，諸如HEK293或CHO細胞。

本公開還提供了一種產生本文提供的工程化外泌體的方法，該方法包括用上述載體轉導上述細胞，諸如HEK293細胞；在允許該工程化外泌體從該細胞分泌的條件下，培養該細胞；以及收集並純化該工程化外泌體。

在一些實施方案中，該方法包括在培養期間使細胞從含血清 條件適應到無血清條件。該適應可包括逐步適應，即逐漸減少完全培養基的比例，同時增加無血清培養基的比例。

序列表

實施例

實施例1.源自穩定細胞株的工程化外泌體的構建。

材料和方法

材料：HEK293細胞株(人胚胎腎臟293細胞，CRL-1573^TM) 購自ATCC，其維持在含有10%(體積/體積)FBS、補充有100U/mL青黴素和100μg/mL鏈黴素的DMEM(高葡萄糖)中。CHO-K1細胞株(中國倉鼠卵巢細胞)購自BeNa菌種保藏中心(中國北京)。CHO-K1細胞維持在含有10%(體積/體積)FBS、補充有100U/mL青黴素和100μg/mL鏈黴素的F-12K(31765035，Thermo Fisher Scientific，美國)中。將細胞孵育在37℃、含5% CO₂的濕潤空氣中。本研究中使用的抗體是抗CD63抗體(目錄號MA5-32085，Invitrogen)。

pGOI質體構建：所有標靶基因(包括KGF-1、VEGF-A和Wnt10b)的胺基酸序列都源自Uniprot，並且相應的DNA序列(分別參見SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12)由General Biotechnology(中國滁州)用質體pCDH-CMV-MCS-EF1a-GFP+BSD(System Biosciences)合成。T2A肽(參見SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18)用於在轉譯後將所有標靶蛋白解離成單個蛋白質。將第3代系統的4個質體(即pGOI、pGag/pol、pRev和pVSV-G)用於產生慢病毒，其中pCDH-CMV-MCS-EF1a-GFP+BSD(殺稻瘟菌素抗性)作為慢病毒包裝質體。慢病毒由WZ Biotechnology(中國濟南)包裝。pGOI質體中構建的有效載荷基因：CD63-TM3-接頭-KGF-1-T2A-CD63-TM3-接頭-VEGF-A-T2A-CD63-TM3-接頭-Wnt10b，其中每個CD63-TM3是CD63的TM3結構域，由SEQ ID NO：14所示的DNA序列編碼，每個接頭由SEQ ID NO：16所示的DNA序列編碼，並且每個T2A由SEQ ID NO：18所示的DNA序列編碼。

穩定細胞株的產生：透過用相應的慢病毒感染來產生表達標 靶蛋白(包括KGF-1、VEGF-A和Wnt10b)的穩定HEK293細胞株。感染後四十八小時，透過加入抗生素，例如殺稻瘟菌素(Solarbio Life Sciences)至最終濃度6μg/ml來選擇細胞。選擇具有綠色螢光蛋白(GFP)表達的單細胞群落，並培養在含有6μg/ml殺稻瘟菌素的完全培養基中。對穩定細胞株的GFP和相應標靶蛋白的表達進行監測。

使細胞培養物適應SFM(無血清培養基)：穩定細胞株在FM(完全培養基)中經過三次初始傳代後，從第4次傳代開始適應無血清培養。用表1中的培養基組合物傳代培養細胞。為了建立完全適應無血清的培養物，細胞應在SFM(HyClone^TM peak expression，SH31193.02，Cytiva Life Sciences)中傳代培養至少三次。

表1.適應性培養基

FM：完全培養基；SFM：無血清培養基

分離外泌體：將穩定細胞株接種在T150燒瓶中，培養24小時後，用PBS充分沖洗，並在SFM中再孵育48小時。透過以300×g離心10分鐘除去細胞，收穫含有外泌體的培養無細胞的細胞外培養基。然後 以10000×g離心30分鐘除去死細胞和細胞碎片。最後，將澄清的上清液以100000×g離心70分鐘，使外泌體沉澱兩次。並且重懸外泌體沉澱物。所有離心步驟都在4℃進行，獲得的外泌體在以下實施例中稱為35#外泌體。

圖1示意性地顯示出了根據本公開的一個示例性實施方案，源自HEK293細胞的外泌體產生過程的流程圖。

實施例2.外泌體的表徵

外泌體的顆粒濃度和大小分佈的分析

透過NanoFCM(NanoFCM公司，中國廈門)分析來自穩定細胞株的外泌體的顆粒濃度和大小分佈。NanoFCM分析使用兩個單光子計數雪崩光電二極體(APD)以同時檢測單個顆粒的側向散射(SSC)和螢光。首先，製備用於分析的外泌體沉澱物。然後，將200nm PE和AF488螢光團綴合聚苯乙烯珠用於顆粒濃度，並將二氧化矽奈米球混合物(NanoFCM公司，中國廈門)用於細微性分佈。檢測器記錄在每個測試中在1分鐘間隔期間通過的顆粒。將每個樣品稀釋至顆粒計數在3000至9000個顆粒/分鐘的最佳範圍內。使用NanoFCM軟體(NanoFCM專業V2.0)將流速和側向散射強度轉換為囊泡濃度和大小。

圖2A顯示出了透過NanoFCM分析源自穩定細胞株的外泌體的粒徑和顆粒濃度。該外泌體具有75.4nm的平均粒徑。

透過免疫墨點(WB)鑒定外泌體上的標靶蛋白

為了鑒定外泌體上的標靶蛋白表達，將純化的外泌體用補充有1mM蛋白酶抑制劑苯甲基磺醯氟(PMSF；Beyotime)和磷酸酶抑制劑(Beyotime)的RIPA裂解緩衝液(Beyotime)裂解，然後熱變性，透過 SDS-PAGE分離，並轉移到PVDF膜(Millipore，MA，USA)上。透過與抗CD63(外泌體的支架蛋白)的一級抗體孵育，隨後與HRP綴合的二級抗體(Invitrogen)孵育，來檢測蛋白質。然後使用增強的化學發光試劑(Millipore，MA，USA)使膜可視化。

外泌體的穿透式電子顯微鏡(TEM)分析

TEM用於證實外泌體的存在。將約20μL外泌體單獨添加到銅網。使用濾紙除去所有過量的液體，並將樣品用2%乙酸雙氧鈾負染30秒。將網格用去離子水沖洗，並使其乾燥過夜。然後使用白熾燈風乾樣品，並使用電子顯微鏡(Hitachi，S-3000N)觀察。

圖2B顯示出了外泌體的穿透式電子顯微鏡(TEM)圖像。圖2C顯示出了用抗CD63-TM3(與外泌體融合的支架蛋白)的抗體對外泌體進行的免疫墨點分析。如預期的，工程化外泌體相關標靶蛋白(Wnt10b、VEGF-A和KGF-1)存在於源自穩定細胞株的純化外泌體中。

實施例3.在小鼠模型中評估用於掉髮治療的工程化外泌體

動物和體內研究

所有實驗都使用6周齡雄性C57BL/6小鼠進行。動物購自Cavens(中國常州)。圖3A顯示出了雄激素性脫髮小鼠模型和方案的示意圖。小鼠背部毛髮脫毛後，每3天用35#外泌體、對照外泌體(Ctrl Exo.)、PBS(陰性對照)或5%米諾地爾(陽性對照)處理小鼠皮膚一次。在18天的治療期間持續觀察，然後在第18天處死動物，進行組織學分析。體內治療實驗中，首先對小鼠剃毛，然後用脫毛膏除去毛髮，觀察粉紅色皮膚。在脫毛的第二天，將30mg/EA DHT(二氫睾酮)懸浮液皮下注射到背部脫 毛區域的5個點上。將動物隨機分成4組(n=4)以研究毛髮再生。小鼠毛髮脫毛後，每3天用35#外泌體、對照外泌體和PBS(陰性對照)或5%米諾地爾(陽性對照)處理小鼠背部皮膚一次。外泌體治療劑量：將100μl PBS中的8.0×10⁹個外泌體皮下注射到背部皮膚上的5個點(每個位點20μl)。每天局部施塗200μl米諾地爾。在0天、9天、12天和15天時，對背部皮膚拍照。圖像J用於分析小鼠的脫毛區域和毛髮生長區域。毛髮覆蓋率%=(新毛髮面積/毛髮去除面積)×100%。在18天的治療期間持續觀察，然後處死動物以作進一步分析。

皮膚組織學

將小鼠安樂死，並除去整個背部皮膚。將皮膚組織固定在4%多聚甲醛中，然後用冷凍切片機(Cryostat)切成切片，接著進行蘇木精和伊紅(HE)染色。從每個切片中隨機選擇五個視野進行觀察。計數真皮中的毛囊數量，並計算生長期/休止期毛囊的值。測量真皮中毛囊到表皮的距離，以計算平均毛囊長度。

圖3B顯示出了毛髮覆蓋的觀察結果。將小鼠分成四組(n=4)，並顯示出了小鼠在第15天的代表性圖像。結果表明，用35#外泌體治療在第15天幾乎可以完全恢復毛髮覆蓋，具有與陽性對照米諾地爾類似的功效。圖3C顯示出了小鼠背部皮膚關於毛囊數量、長度和生長階段比例的組織學分析。資料點代表平均值±SD(n=4)。誤差槓表示SD.；ns表示無顯著差異；*P<0.05、**P<0.01以及***P<0.001。35#外泌體治療顯著增加了毛囊的數量和長度，以及延長的生長期/休止期的比例，這可以促進毛囊正常化並進一步增強休止期至生長期的轉變。

實施例4.在小鼠模型中評估用於白髮治療的工程化外泌體

所有實驗都使用6周齡雌性C57BL/6小鼠進行。圖4A是氫醌誘導的毛髮變灰白模型和方案的示意圖。體內治療實驗中，首先對小鼠剃毛，然後用脫毛膏除去毛髮。將動物隨機分成4組(n=4)以研究抗毛髮變灰白。在第二天脫毛時，將2.5%濃度氫醌乳膏局部施塗於背部脫毛區域。陰性模型對照組使用PBS透過塗抹局部施用處理。用不同的施用途徑(例如，微針接種後塗抹、奈米結晶輸注後塗抹、皮下注射)處理35#外泌體組。外泌體治療劑量：透過不同途徑施用200μl體積的1E11外泌體。在28天的治療期間持續觀察小鼠背部毛髮。表2顯示出了對治療方案的總結。

表2.對不同組的治療方案的總結。

圖4B顯示出了對背部毛髮的觀察結果。顯示出了小鼠在第14天的代表性圖像。結果表明，用35#外泌體透過不同施用途徑(例如，微針接種後塗抹、奈米結晶輸注後塗抹和皮下注射)處理的小鼠，與模擬(mock)處理相比，所有處理組都具有髮色加深的毛髮。

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Claims (18)

1. 一種工程化外泌體，該工程化外泌體包含

   (a)KGF多肽，該KGF多肽與第一錨定多肽融合，

   (b)VEGF-A多肽，該VEGF-A多肽與第二錨定多肽融合，和

   (c)參與Wnt/β-連環蛋白信號通路的Wnt家族成員多肽，該Wnt家族成員多肽與第三錨定多肽融合，

   其中(a)、(b)和(c)分別透過該第一、第二和第三錨定多肽錨定在該外泌體的膜上，並且

   其中該KGF多肽、該VEGF-A多肽和該Wnt家族成員多肽暴露在該外泌體的該膜的外表面上。
2. 根據請求項1所述的工程化外泌體，其中該KGF多肽是KGF-1多肽，較佳地，該KGF-1多肽包含與如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列。
3. 根據請求項1所述的工程化外泌體，其中該VEGF-A多肽是人VEGF₂₀₆異構體或其直系同源物或旁系同源物，較佳地，該VEGF-A多肽包含與如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列。
4. 根據請求項1所述的工程化外泌體，其中該Wnt家族成員多肽是Wnt10a、Wnt10b、Wnt3a、Wnt1a、Wnt4、Wnt5a、Wnt7a或Wnt7b多肽；較佳地，該Wnt家族成員多肽是Wnt10b多肽；更佳地，該Wnt10b多肽包含與如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列。
5. 根據請求項1所述的工程化外泌體，其中該錨定多肽是外泌體的膜蛋白、膜靶向序列或其錨定功能片段；較佳地，該外泌體的膜蛋白包括lamp2b、四跨膜蛋白諸如CD63、CD9和CD81、血小板來源的生長因子受體(PDGFR)、乳黏素(C1C2結構域)、水泡性口炎病毒糖蛋白(VSVG)、 前列腺素F2受體負調節劑(PTGFRN)以及它們的任何組合；較佳地，該膜靶向序列包括糖基磷脂醯肌醇(GPI)錨和脂質錨定蛋白；較佳地，該第一、第二和第三錨定多肽包含全長CD63或保留TM3結構域的截短CD63；更佳地，該第一、第二和第三錨定多肽中的每一者都包含CD63的TM3結構域；更佳地，該第一、第二和第三錨定多肽中的每一者都是CD63的TM3結構域；更佳地，該CD63的TM3結構域包含與如SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列。
6. 根據請求項1所述的工程化外泌體，其中該KGF多肽、該VEGF-A多肽和該Wnt家族成員多肽分別任選地透過肽接頭與該第一、第二和第三錨定多肽的C末端融合，較佳地，該肽接頭由甘胺酸和絲胺酸組成，例如(G4S)n，其中n是1至3的整數。
7. 根據請求項1所述的工程化外泌體，其中該外泌體不是源自間充質幹細胞；較佳地，該外泌體不是源自幹細胞。
8. 根據請求項1所述的工程化外泌體，其中該外泌體：

   (i)促進毛髮再生，以及/或者改善脫髮，例如雄激素性脫髮、斑禿或休止期脫髮；以及/或者

   (ii)預防和/或限制和/或阻止白髮的形成，並且維持和/或促進頭髮和/或體毛的自然復色。
9. 一種組合物，該組合物包含根據請求項1至8中任一項所述的外泌體，和載劑；較佳地，該組合物是液體製劑；更佳地，該組合物經配製用於局部或皮下施用；該組合物任選地是化妝品組合物或非化妝品組合物；並且其中該組合物任選地是藥物組合物。
10. 根據請求項9所述的組合物，其中該組合物不含未附著於該外泌體的該膜的KGF多肽(例如KGF-1多肽)、VEGF-A多肽或參與Wnt/β-連環蛋白信號通路的Wnt家族成員多肽(例如Wnt10b多肽)。
11. 一種核酸構建體，該核酸構建體包含編碼以下物質的多核苷酸：

    (a)KGF多肽，該KGF多肽與第一錨定多肽融合，

    (b)VEGF-A多肽，該VEGF-A多肽與第二錨定多肽融合，和

    (c)參與Wnt/β-連環蛋白信號通路的Wnt家族成員多肽，該Wnt家族成員多肽與第三錨定多肽融合。
12. 根據請求項11所述的核酸構建體，其中

    (i)該KGF多肽是KGF-1多肽，較佳地，該KGF-1多肽包含與如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列；

    (ii)該VEGF-A多肽是人VEGF₂₀₆異構體或其直系同源物或旁系同源物，較佳地，該VEGF-A多肽包含與如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列；

    (iii)該Wnt家族成員多肽是Wnt10a、Wnt10b、Wnt3a、Wnt1a、Wnt4、Wnt5a、Wnt7a或Wnt7b多肽；較佳地，該Wnt家族成員多肽是Wnt10b多肽；更佳地，該Wnt10b多肽包含與如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列；

    (iv)編碼該KGF多肽的多核苷酸具有如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列或其簡併序列；

    (v)編碼該VEGF-A多肽的多核苷酸具有如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列或其簡併序列；

    (vi)編碼該Wnt家族成員多肽的多核苷酸具有如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列或其簡併序列；

    (vii)該錨定多肽是外泌體的膜蛋白、膜靶向序列或其錨定功能片段；較佳地，該外泌體的膜蛋白包括lamp2b、四跨膜蛋白諸如CD63、CD9和CD81、血小板來源的生長因子受體(PDGFR)、乳黏素(C1C2結構域)、水泡性口炎病毒糖蛋白(VSVG)、前列腺素F2受體負調節劑(PTGFRN)以及它們的任何組合；較佳地，該膜靶向序列包括糖基磷脂醯肌醇(GPI)錨和脂質錨定蛋白；較佳地，該第一、第二和第三錨定多肽包含全長CD63 或保留TM3結構域的截短CD63；更佳地，該第一、第二和第三錨定多肽中的每一者都包含CD63的TM3結構域；更佳地，該第一、第二和第三錨定多肽中的每一者都是CD63的TM3結構域；並且/或者

    (viii)編碼該CD63的TM3結構域的多核苷酸具有如SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列或其簡併序列。
13. 根據請求項11或12所述的核酸構建體，其中該多核苷酸是包含編碼(a)、(b)和(c)的核苷酸片段的單個多核苷酸；較佳地，該多核苷酸從5’到3’包含編碼以下物質的核苷酸片段：

    (i)[第一錨定多肽]-[KGF]-[自切割肽]-[第二錨定多肽]-[VEGF-A]-[自切割肽]-[第三錨定多肽]-[Wnt]，

    (ii)[第一錨定多肽]-[KGF]-[自切割肽]-[第二錨定多肽]-[Wnt]-[自切割肽]-[第三錨定多肽]-[VEGF-A]，

    (iii)[第一錨定多肽]-[VEGF-A]-[自切割肽]-[第二錨定多肽]-[KGF]-[自切割肽]-[第三錨定多肽]-[Wnt]，

    (iv)[第一錨定多肽]-[VEGF-A]-[自切割肽]-[第二錨定多肽]-[Wnt]-[自切割肽]-[第三錨定多肽]-[KGF]，

    (v)[第一錨定多肽]-[Wnt]-[自切割肽]-[第二錨定多肽]-[KGF]-[自切割肽]-[第三錨定多肽]-[VEGF-A]，或

    (vi)[第一錨定多肽]-[Wnt]-[自切割肽]-[第二錨定多肽]-[VEGF-A]-[自切割肽]-[第三錨定多肽]-[KGF]，

    其中，[]代表單獨的多肽，並且]-[代表接頭或鍵結；

    其中，Wnt代表參與Wnt/β-連環蛋白信號通路的Wnt家族成員多肽；

    任選地，該自切割肽是2A肽，例如T2A、E2A、P2A或它們的任何組合。
14. 一種載體，該載體包含根據請求項11至13中任一項所述的核酸構建體；較佳地，該載體是病毒載體；更佳地，該載體是慢病毒載體或腺相關病毒載體。
15. 一種用根據請求項14所述的載體轉導的細胞，其中該多核苷 酸整合到該細胞的該基因組中；較佳地，該細胞不是間充質幹細胞；較佳地，該細胞不是幹細胞；較佳地，該細胞是哺乳動物細胞；或更佳地，該細胞是HEK293或CHO細胞。
16. 一種產生根據請求項1至8中任一項所述的工程化外泌體的方法，該方法包括

    (a)用根據請求項14所述的載體轉導根據請求項15所述的細胞；

    (b)在允許外泌體從該細胞分泌的條件下，培養該細胞；以及

    (c)收集並純化該外泌體。
17. 根據請求項16所述的方法，該方法還包括在步驟(b)期間使該細胞適應無血清條件。
18. 一種根據請求項1至8中任一項所述的工程化外泌體或根據請求項9或10所述的組合物在製備用於治療脫髮和/或白髮的藥物中的用途；較佳地，該脫髮是雄激素性脫髮、斑禿或休止期脫髮；較佳地，該白髮是年齡相關的毛髮變灰白、早發性白髮或突發性白髮。