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TW202532430A - 細胞療法 - Google Patents

細胞療法

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Publication number
TW202532430A
TW202532430A TW114104313A TW114104313A TW202532430A TW 202532430 A TW202532430 A TW 202532430A TW 114104313 A TW114104313 A TW 114104313A TW 114104313 A TW114104313 A TW 114104313A TW 202532430 A TW202532430 A TW 202532430A
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TW
Taiwan
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cell
modified
hla
cells
gene
Prior art date
Application number
TW114104313A
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English (en)
Inventor
杜麗娟
蘇珊 威爾遜
郭增利
池田康弘
Original Assignee
瑞典商阿斯特捷利康公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

本文提供低免疫原性細胞及製造此類細胞的方法。

Description

細胞療法
序列表之參照本申請案與參照之序列表文字檔合併提交，該序列表名稱係USC-101_seq listing，建立於2024年2月6日，且大小係42.2千位元組。
本發明係關於一種低免疫原性細胞及製造此類細胞的方法。
產生同種異體細胞療法存在相當大的挑戰。向具有免疫能力的宿主投予後，同種異體細胞療法被受體免疫系統識別，觸發免疫反應，該免疫反應限制其存活並危及產品功效。已採用不同的策略來產生能夠向多個患者投予而不會被宿主免疫系統排斥的細胞療法產品。這些策略包括直接剔除高HLA I類及II類分子、及/或HLA基因之轉錄因子控制表現，以及引入免疫調節耐受性因子。然而，廣泛的基因體修飾之引入給最終的細胞療法產品帶來額外的風險，例如與基因修飾相關聯之脫靶整合及結構變異體[1]。此外，對細胞進行的基因修飾可能不穩定且不會保留在後代分化細胞中。
本揭露解決上述問題中之一或多者。
本揭露係關於一種經修飾之HLA-E重鏈多肽、包含該經修飾之HLA-E重鏈多肽的經修飾之人類白血球抗原(human leukocyte antigen, HLA)-E蛋白、以及經工程改造以表現經修飾之HLA-E蛋白的細胞。本揭露得到本文首次提供的資料之支持，該等資料令人驚訝地證明，與經修飾以過表現野生型HLA-E蛋白的細胞相比，經工程改造以表現該經修飾之HLA-E蛋白的細胞具有更大的能力避免NK細胞所介導之同種異體免疫。
本揭露係關於一種經修飾之人類白血球抗原(HLA)-E重鏈多肽，其相對於野生型HLA-E重鏈多肽包含截短的細胞質域。該野生型HLA-E重鏈分子可係人類的。該野生型HLA-E重鏈分子可具有與SEQ ID NO: 10同一的胺基酸序列。該野生型HLA-E重鏈分子可具有三個區：細胞質區、跨膜區、及結合CD8的高度保守的Ig樣域。經修飾之HLA-E重鏈多肽可包含細胞質區、跨膜區、及高度保守的Ig樣域。該截短的細胞質域與HLA-E重鏈野生型細胞質域相比，可被截短至少21個胺基酸殘基，可選地其中該截短的細胞質域與HLA-E野生型細胞質域相比被截短21個胺基酸殘基。該HLA-E重鏈野生型細胞質域可由與SEQ ID NO: 15同一的胺基酸序列組成，或與該序列相比包含1、2、或3個胺基酸取代。該截短的細胞質域可包含由小於8個胺基酸殘基組成的胺基酸序列。該截短的細胞質域可包含由小於7個胺基酸殘基組成的胺基酸序列。該截短的細胞質域可包含約6個胺基酸殘基或由約6個胺基酸殘基組成。該截短的細胞質域之該胺基酸序列可由與SEQ ID NO: 17或其功能片段至少70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的胺基酸序列組成，可選地其中該截短的細胞質域之該胺基酸序列由與SEQ ID NO: 17 100%同一的胺基酸序列組成，或與該序列相比包含1、2、或3個胺基酸取代。該截短的細胞質域之該胺基酸序列可由胺基酸序列RAASSD組成，或與該序列相比包含1、2、或3個胺基酸取代。該HLA-E多肽可包含與SEQ ID NO: 14或其功能片段至少70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一、可選地與SEQ ID NO: 14 100%同一的胺基酸序列，或與該序列相比包含1、2、或3個胺基酸取代。該經修飾之HLA-E重鏈多肽可單離自身體。該經修飾之HLA-E重鏈多肽可係人類的。該野生型HLA-E重鏈多肽可係人類的。
本揭露亦係關於包含本揭露的經修飾之HLA-E重鏈多肽的經修飾之HLA-E蛋白。HLA-E蛋白可包括HLA-E重鏈及輕鏈，例如β2M，並與信號肽（亦稱為單鏈結合肽）一起在細胞表面上表現。該經修飾之HLA-E蛋白可包含包含β‐2微球蛋白(β2M)多肽。換言之，該經修飾之HLA-E蛋白可包含經修飾之重鏈及β2M多肽。該β2M多肽可具有與SEQ ID NO: 18至少70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的胺基酸序列，可選地其中該β2M多肽具有與SEQ ID NO: 18 100%同一的胺基酸序列，或與該序列相比包含1、2、或3個胺基酸取代。該經修飾之HLA-E蛋白亦可包含信號肽（單鏈結合肽）。該信號肽可藉由HLA-E蛋白之胞外域的肽結合槽結合。該經修飾之HLA-E蛋白可與結合的信號肽一起在細胞表面上表現。該信號肽可具有與SEQ ID NO: 28至少70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一、可選地其中與SEQ ID NO: 28 100%同一的胺基酸序列，或與該序列相比包含1、2、或3個胺基酸取代。
本揭露亦係關於編碼本揭露的經修飾之HLA-E重鏈多肽的載體。本揭露亦係關於編碼本揭露的經修飾之HLA-E蛋白的載體。該載體可係慢病毒載體或其他用於基因療法中的適合載體。該載體可包含與SEQ ID NO: 23至少70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一、可選地與SEQ ID NO: 23 100%同一的多核苷酸序列，或與該序列相比包含1、2、或3個核苷酸取代。
本揭露亦係關於經修飾之細胞，其中該經修飾之細胞表現本揭露的HLA-E蛋白。該HLA-E蛋白可在細胞表面上表現，可選地如藉由流式細胞術所測量。
本揭露亦係關於包含本揭露的載體的經修飾之細胞。
該細胞可經修飾以避免HLA I類所介導之同種異體免疫。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含缺失或減少的內源性β2M基因之表現。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含缺失或降低的內源性β2M基因的兩個等位基因之表現。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含引入或增加的HLA-G基因之表現。該經修飾之細胞可包含編碼本揭露的HLA-E蛋白的外源性多核苷酸。該經修飾之細胞可包含編碼HLA-G基因的外源性多核苷酸。該HLA-G多肽可包含與SEQ ID NO: 11或其功能片段至少70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的胺基酸序列，可選地其中該HLA-G多肽包含與SEQ ID NO: 11 100%同一的胺基酸序列，或與該序列相比包含1、2、或3個胺基酸取代。
所屬技術領域中存在用於避免HLA I類所介導之同種異體免疫之方法，例如缺失或降低的NLRC5及/或CD38之表現。
該細胞可經修飾以避免HLA II類所介導之同種異體CTL殺傷。例如，相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含缺失或減少的II類主要組織相容性複合體反式活化子(CIITA)基因之表現，例如降低至少70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%，可選地降低100%，例如，如藉由流式細胞術所測量。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含缺失或降低的調節因子X相關聯之含錨蛋白蛋白(RFXANK)基因之表現，例如降低至少70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%，可選地降低100%，例如，如藉由流式細胞術所測量。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含缺失或減少的調節因子X相關聯之蛋白(RFXAP)基因之表現，例如降低至少70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%，可選地降低100%，例如，如藉由流式細胞術所測量。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含缺失或降低的CIITA基因、以及RFXANK基因或RFXAP基因之表現，例如降低至少70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%，可選地降低100%，例如，如藉由流式細胞術所測量。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含缺失或降低的CIITA基因、以及RFXANK基因或RFXAP基因之表現，例如降低至少70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%，可選地降低100%，例如，如藉由流式細胞術所測量。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含缺失或降低的CIITA基因、RFXANK基因、及RFXAP基因之表現，例如降低至少70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%，可選地降低100%，例如，如藉由流式細胞術所測量。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含引入或增加的CD47基因之表現，例如降低至少70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%，可選地降低100%，例如，如藉由流式細胞術所測量。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含引入或增加的CD47多肽之表現，例如降低至少70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%，可選地降低100%，例如，如藉由流式細胞術所測量。
該CD47多肽可包含與SEQ ID NO: 12或其功能片段至少70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的胺基酸序列，或與該序列相比包含1、2、或3個胺基酸取代。
相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可不包含引入或增加的CD47基因之表現。該CD47基因可係人類的。
相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可不包含降低或缺失的CD24基因、CD74基因、CIITA基因、HLA-A基因、HLA-B基因、HLA-C基因、MIC-1基因、MIC-2基因、NLRC5基因、RFX5基因、RFXAP基因、TAP1基因、TAP2基因、Tapasin基因、TXNIP基因、及/或RFXANK基因之表現，例如，不降低至少70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%，可選地不降低100%，例如，如藉由流式細胞術所測量。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可不包含增加或引入的C1-抑制劑基因、CD24基因、CD46基因、CD55基因、CD59基因、CR1基因、CTLA-4-Ig基因、MANF基因、TNFAIP3基因、PD-L1基因、GGTA1基因、CMAG基因、SLA-1 α鏈基因、及/或Β4galNT2基因之表現。
相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可不包含降低或缺失的CD24基因之表現。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可不包含降低或缺失的CD74基因之表現。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可不包含降低或缺失的CIITA基因之表現。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可不包含降低或缺失的HLA-A基因之表現。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可不包含降低或缺失的內源性HLA-B基因之表現。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可不包含降低或缺失的HLA-C基因之表現。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可不包含降低或缺失的MIC-1基因之表現。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可不包含降低或缺失的MIC-2基因之表現。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可不包含降低或缺失的NLRC5基因之表現。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可不包含降低或缺失的RFX5基因之表現。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可不包含降低或缺失的RFXAP基因之表現。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可不包含降低或缺失的TAP1基因之表現。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可不包含降低或缺失的TAP2基因之表現。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可不包含降低或缺失的Tapasin基因之表現。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可不包含降低或缺失的TXNIP基因之表現。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可不包含降低或缺失的RFXANK基因之表現。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可不包含增加或引入的C1-抑制劑基因之表現。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可不包含降低或缺失的CD24基因之表現。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可不包含降低或缺失的CD46基因之表現。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可不包含降低或缺失的CD55基因之表現。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可不包含降低或缺失的CD59基因之表現。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可不包含降低或缺失的CR1基因之表現。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可不包含降低或缺失的CTLA-4-Ig基因之表現。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可不包含降低或缺失的MANF基因之表現。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可不包含降低或缺失的TNFAIP3基因之表現。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可不包含降低或缺失的PD-L1基因之表現。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可不包含降低或缺失的GGTA1基因之表現。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可不包含降低或缺失的CMAG基因之表現。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可不包含降低或缺失的SLA-1 α鏈基因之表現。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可不包含降低或缺失的Β4galNT2基因之表現。
相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含野生型HLA-B基因。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含野生型HLA-A基因。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含野生型HLA-C基因。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含野生型TAP基因。
相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含野生型CD24基因。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含野生型CD74基因。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含野生型CIITA基因。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含野生型HLA-A基因。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含野生型HLA-B基因。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含野生型HLA-C基因。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含野生型MIC-1基因。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含野生型MIC-2基因。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含野生型NLRC5基因。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含野生型RFX5基因。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含野生型RFXAP基因。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含野生型TAP1基因。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含野生型TAP2基因。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含野生型Tapasin基因。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含野生型TXNIP基因。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含野生型RFXANK基因。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含野生型C1-抑制劑基因。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含野生型CD24基因。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含野生型CD46基因。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含野生型CD55基因。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含野生型CD59基因。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含野生型CR1基因。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含野生型CTLA-4-Ig基因。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含野生型MANF基因。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含野生型TNFAIP3基因。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含野生型PD-L1基因。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含野生型GGTA1基因。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含野生型CMAG基因。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含野生型SLA-1 α鏈基因。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含野生型Β4galNT2基因。
該經修飾之細胞可係哺乳類細胞。該經修飾之細胞可係人類細胞。該經修飾之細胞可並非豬細胞(pig cell)。該經修飾之細胞可並非豬細胞(porcine cell)。該經修飾之細胞可係未分化細胞。該經修飾之細胞可能能夠自我更新。該經修飾之細胞可係幹細胞。該經修飾之細胞可係多能(pluripotent)幹細胞。該經修飾之細胞可係胚胎幹細胞(ESC)。在分化為不同的細胞類型後，該經修飾之細胞可保留一或多種修飾。在分化為不同的細胞類型後，該經修飾之細胞仍可在細胞表面上表現該經修飾之HLA-E蛋白。在終末分化後，該經修飾仍可在細胞表面上表現該經修飾之HLA-E蛋白。該經修飾之細胞可係誘導性多能幹細胞(iPSC)。該經修飾之細胞可係多潛能(multipotent)幹細胞。該經修飾之細胞可係造血幹細胞(HSC)。該經修飾之細胞可係分化細胞。該經修飾之細胞可係經單離細胞。該經修飾之細胞可係經工程改造之細胞。
該經修飾之細胞可已經體外修飾或工程改造。該經修飾之細胞可已經離體修飾或工程改造。該經修飾之細胞可不存在於自然界中。
相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞在用IFN-γ刺激後可包含降低的HLA II類蛋白表現，可選地其中HLA II類蛋白表現係藉由如實例中所述之流式細胞術所判定。HLA II類蛋白表現可經降低至少70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%，可選地降低100%，例如，如藉由流式細胞術所測量。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞在用IFN-γ刺激後可包含降低的HLA-DR、HLA-DQ、及/或HLA-DR表現，可選地如藉由如實例中所述之流式細胞術所判定。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含降低的HLA I類表現，可選地如藉由流式細胞術所判定。該經修飾之細胞可不表現內源性HLA I類蛋白，可選地如藉由流式細胞術所判定。該經修飾之細胞可不表現內源性HLA-A、HLA-B、及HLA-C蛋白，可選地如藉由流式細胞術所判定。該經修飾之細胞可不表現內源性經典HLA I類蛋白。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含增加的HLA-G蛋白之表現，可選地如藉由流式細胞術所判定。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可包含降低的HLA-A、HLA-B、及HLA-C蛋白表現，可選地如藉由FACS或流式細胞術所判定。HLA-A、HLA-B、及HLA-C蛋白表現可經降低至少70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%，可選地降低100%，例如，如藉由流式細胞術所測量。
該經修飾之細胞可不表現HLA-A、HLA-B、或HLA-C蛋白，可選地如藉由FACS所判定。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可對同種異體細胞毒性淋巴球所介導之殺傷具有抗性，可選地如藉由基於即時之殺傷檢定所判定。
相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該細胞可以對同種異體NK細胞細胞裂解具有抗性，可選地如藉由基於即時之殺傷檢定所判定。該經修飾之細胞可係低免疫原性的。該經修飾之細胞可能適合向非HLA匹配的供體投予，而無需免疫抑制療法。該經修飾之細胞可能不活化NK細胞所介導之免疫，可選地如藉由基於即時之殺傷檢定所判定。該經修飾之細胞可能不在體外活化NK細胞所介導之免疫。該經修飾之細胞在向非HLA匹配的供體投予後可能不活化NK細胞所介導之免疫。該經修飾之細胞可能不活化NK細胞、T細胞、及/或巨噬細胞所介導之免疫。該經修飾之細胞在向非HLA匹配的供體投予後可能不活化NK細胞、T細胞、及/或巨噬細胞所介導之免疫。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可能尚未經修飾以對複製性老化(replicative senescence, RRS)具有抗性。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可能尚未經修飾以缺失或降低週期蛋白依賴性激酶抑制劑2A (CDKN2A)、週期蛋白依賴性激酶抑制劑2B (CDKN2B)、及/或S-甲基-5'-硫基腺苷磷酸化酶(MTAP)之表現。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可尚未經修飾以缺失或降低T細胞受體α恆定區(T-cell receptor α constant, TRAC)之表現。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可能尚未經修飾以增加B細胞淋巴瘤特大(Bcl-xL)或B細胞淋巴瘤2 (Bcl-2)之表現。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可能尚未經修飾以缺失或降低分化簇38 (CD38)之表現。相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞可能尚未經修飾以具有缺失或降低的分化簇38 (CD38)、及/或磷酸酶及張力蛋白同源物(PTEN)之表現。
引入或增加的基因表現可藉由流式細胞術、西方墨點法、qPCR、或免疫螢光來判定。缺失或降低的基因表現可藉由流式細胞術、西方墨點法、qPCR、或免疫螢光來判定。β2M內源性基因表現可藉由包含對細胞進行基因編輯的方法來缺失或減少。基因編輯可包含CRISPR-Cas9或TALEN。本揭露亦係關於一種細胞群體，其包含本揭露的經修飾之細胞。
本揭露亦係關於包含本發明的經修飾之細胞的醫藥組成物。本揭露亦係關於包含本揭露的細胞群體的醫藥組成物。該醫藥組成物可包含醫藥賦形劑。本揭露亦係關於一種製造醫藥組成物的方法，其包含將本揭露的經修飾之細胞與醫藥賦形劑組合。本揭露亦係關於經修飾之細胞在製造用於治療或預防對象之疾病之藥劑的用途。本揭露亦係關於一種用於製造經修飾之細胞的方法，其包含將本揭露的之經修飾之HLA-E重鏈多肽、或本揭露的經修飾之HLA-E蛋白之表現引入細胞中。該方法可包含消除或減少內源性β2M基因的一個或兩個等位基因在細胞中之表現。該方法可包含可選地藉由基因編輯、可選地藉由CRISPR-cas9基因編輯或TALEN消除CIITA、RFXANK、及/或RFXAP基因的兩個等位基因在該細胞中之表現。該細胞可係經修飾之幹細胞，可選地胚胎幹細胞或誘導性多能幹細胞。該方法可包含將該細胞分化為祖細胞、終末分化細胞、或體細胞。該細胞可係祖細胞、終末分化細胞、或體細胞。
本揭露亦係關於一種經修飾之細胞，其中該經修飾之細胞係根據本發明的方法來製造。
本揭露亦係關於一種載體，其使用於本揭露的任何方法中，可選地其中該載體係慢病毒載體。該慢病毒載體可係腺病毒載體。
該慢病毒載體可包含具有對應於SEQ ID NO: 1至8中任一項之核苷酸序列的gRNA。本揭露亦係關於一種治療或預防有需要之對象之疾病的方法，該方法包含向該對象投予本揭露的經修飾之細胞、或衍生自本揭露的經修飾之細胞的分化細胞、後代、子細胞、或細胞群體。該經修飾之細胞可衍生自非單離自該對象的細胞。
本揭露亦係關於一種治療或預防對象的疾病之方法，該方法包含：根據本揭露的方法體外生產經修飾之細胞，以及向該對象投予經修飾之細胞。
該HLA-E蛋白在該經修飾之細胞中的表現可由延長因子1 α (EF1 α)啟動子所驅動。該HLA-E蛋白在該經修飾之細胞中的表現可由相同的延長因子1 α (EF1 α)啟動子所驅動。該經修飾之細胞可不包含巨細胞病毒(cytomegalovirus, CMV)啟動子。該細胞中引入或增加的免疫耐受基因之表現可能不並非由CMV啟動子驅動。
該細胞可係間葉幹細胞。該細胞可係免疫細胞。該細胞係終末分化細胞。該細胞可係T細胞。該細胞可係NK細胞。該細胞係NKT細胞。該細胞可係B細胞。該細胞可並非間葉幹細胞。該細胞可並非免疫細胞。該細胞可並非終末分化細胞。該細胞可並非T細胞。該細胞可並非NK細胞。該細胞可並非NKT細胞。該細胞可並非B細胞。
該細胞可表現嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體。該細胞可不表現嵌合抗原受體或T細胞受體(TCR)。
與相同類型的未經修飾之細胞相比，該經修飾之細胞可能尚未經修飾以對複製性老化(RRS)具有抗性。與相同類型的未經修飾之細胞相比，該經修飾之細胞可能尚未經修飾以缺失或降低週期蛋白依賴性激酶抑制劑2A (CDKN2A)、週期蛋白依賴性激酶抑制劑2B (CDKN2B)、及/或S-甲基-5'-硫基腺苷磷酸化酶(MTAP)之表現。與相同類型的未經修飾之細胞相比，該經修飾之細胞可尚未經修飾以缺失或降低T細胞受體α恆定區(TRAC)之表現。與相同類型的未經修飾之細胞相比，該經修飾之細胞可能尚未經修飾以增加B細胞淋巴瘤特大(Bcl-xL)或B細胞淋巴瘤2 (Bcl-2)之表現。與相同類型的未經修飾之細胞相比，該經修飾之細胞可能尚未經修飾以缺失或降低分化簇38 (CD38)、及/或磷酸酶及張力蛋白同源物(PTEN)之表現。
引入或增加的基因表現可藉由所屬技術領域中已知的技術諸如流式細胞術、西方墨點法、qPCR、或免疫螢光來判定。缺失或減少的基因表現可藉由流式細胞術、西方墨點法、qPCR、或免疫螢光判定。引入或增加的HLA-E基因及HLA-G基因之表現可藉由流式細胞術來判定。可藉由包含對細胞進行基因編輯的方法以缺失或降低β2M基因表現。基因編輯技術係所屬技術領域中已知的，例如CRISPR-Cas9。
本揭露亦係關於一種細胞群體，其包含本揭露的經修飾之細胞中之一或多種。本揭露亦係關於包含在本揭露的細胞群體的經修飾之細胞中的醫藥組成物。該醫藥組成物可以適合於向對象投予。該醫藥組成物可包含醫藥上可接受之載劑。該醫藥組成物可包含醫藥賦形劑及經修飾之細胞或細胞群體。本揭露亦係關於經修飾之細胞在製造用於治療或預防對象之疾病之藥劑的用途。
本揭露亦係關於一種治療或預防有需要之對象之疾病的方法，該方法包含向該對象投予經修飾之細胞、或衍生自該經修飾之細胞的分化細胞、後代、子細胞、或細胞群體。該經修飾之細胞關於該對象可係自體的，亦即細胞或衍生自細胞的細胞係單離自該對象。該經修飾之細胞關於該對象可係同種異體的，亦即細胞或衍生自細胞的細胞係單離自不同的對象。
治療方法可包括從第一對象中單離細胞，修飾該細胞，然後向第二對象投予經修飾之細胞。本揭露亦係關於一種治療或預防對象的疾病之方法，該方法包含：a)根據本揭露的方法體外生產經修飾之細胞，以及b)向該對象投予該經修飾之細胞。本揭露亦係關於使用於治療方法中的醫藥組成物。
本揭露亦係關於包含本揭露的經工程改造之細胞的經工程改造或經修飾之細胞之群體。該經工程改造或經修飾之細胞之群體可包含介於10 4個與10 10個之間的本文提供的經工程改造之免疫細胞。在各種實施例中，該經工程改造之免疫細胞之群體包含10 4個、10 5個、10 6個、10 7個、10 8個、10 9個、或10 10個本揭露的經工程改造之免疫細胞。如本文所揭露的經工程改造之細胞之群體、或包含經工程改造之細胞的細胞群體包含至少10%經工程改造之細胞、至少20%經工程改造之細胞、至少30%經工程改造之細胞、至少40%經工程改造之細胞、至少50%經工程改造之細胞、至少75%經工程改造之細胞、至少90%經工程改造之細胞、或100%經工程改造之細胞。如本文所揭露的經修飾之細胞之群體、或包含經修飾之細胞的細胞群體包含至少10%經修飾之細胞、至少20%經修飾之細胞、至少30%經修飾之細胞、至少40%經修飾之細胞、至少50%經修飾之細胞、至少75%經修飾之細胞、至少90%經修飾之細胞、或100%經修飾之細胞。
本揭露係關於一種細胞，其中，相對於不包含修飾且已經歷在其他方面相同條件的相同細胞類型的細胞，經修飾之細胞包含以下修飾：引入或增加經修飾之HLA-E蛋白之表現，以及剔除或降低β2M基因之表現。該細胞亦可包含修飾，其中相對於不包含該等修飾且已經歷在其他方面相同條件的相同細胞類型的細胞，該細胞包含剔除或降低CIITA基因之表現的修飾。該細胞亦可包含修飾，其中相對於不包含該等修飾且已經歷在其他方面相同條件的相同細胞類型的細胞，該細胞包含剔除或降低RFXANK基因之表現的修飾。該細胞亦可包含修飾，其中相對於不包含該等修飾且已經歷在其他方面相同條件的相同細胞類型的細胞，該細胞包含剔除或降低CIITA基因之表現的修飾。該細胞亦可包含修飾，其相對於不包含該等修飾且已經歷在其他方面相同條件的相同細胞類型的細胞，引入或增加分化簇47 (CD47)之表現。該CD47基因可係人類的。
該經修飾之細胞可衍生自細胞或包含幹細胞的細胞。該經修飾之細胞可衍生自胚胎幹細胞。該經修飾之細胞可衍生自誘導性多能幹細胞。該經修飾之細胞可衍生自中胚層細胞。該經修飾之細胞可衍生自中間中胚層細胞。
細胞群體可衍生自已離體擴增的一或多種細胞。該細胞群體可衍生自單離自對象的一或多種細胞。該細胞群體可係人造的。該細胞群體可能不存在於自然界中。該細胞群體可包含已被經基因修飾或基因編輯的一或多種細胞。該細胞群體可單離自身體並可包含在醫藥組成物中。
該細胞群體可衍生自包含幹細胞的細胞。該細胞群體可衍生自包含胚胎幹細胞（ES細胞）的細胞。該等ES細胞可來自哺乳動物來源，包括囓齒類動物諸如小鼠(mES)、以及靈長類動物諸如人類(hES)。該ES細胞可係選自以下文獻中報導的SEES-1、SEES-2、SEES-3、SEES-4、SEES-5、SEES-6、及SEES-7的ES細胞系：H. Akutsu, Regen Ther.1:18-29 (2015)。亦可使用其他已知的ES細胞。可以對此類已知的ES細胞系進行進一步的基因修飾。該細胞群體可衍生自包含誘導性多能幹細胞(iPSC)的細胞。iPSC之生產係由Yamanaka在例如WO 2007/069666中報導。其他研究小組，包括麻省理工學院的Rudolf Jaenisch、威斯康辛大學的James Thomson、哈佛大學的Konrad Hochedlinger亦已報導了iPSC之生產。有關綜述，參見Nature Reviews Drug Discovery, vol. 16, pp. 115-130 (2017)。iPSC可由任何體細胞誘導。iPSC可來自哺乳動物來源，包括囓齒類動物諸如小鼠、以及靈長類動物諸如人類。體細胞可包括纖維母細胞、上皮細胞、內皮細胞、神經細胞、胰臟細胞、血球、骨髓細胞、肌肉細胞、肝細胞、脂肪細胞、牙周細胞、成骨細胞及類似者。iPSC可藉由首先將一或多種重編程基因引入體細胞中來生產。重編程基因之組合包括(i) Oct基因、Klf基因、Sox基因、及Myc基因；(ii) Oct基因、Sox基因、NANOG基因、及LIN28基因；(iii) Oct基因、Klf基因、Sox基因、Myc基因、hTERT基因、及SV40大T基因；及(iv) Oct基因、Klf基因、及Sox基因。該細胞群體可衍生自包含中胚層細胞的細胞。該細胞群體可衍生自包含中間中胚層細胞的細胞。中胚層細胞及中間中胚層細胞可衍生自ES細胞或iPSC。對於非人類來源，中胚層細胞及中間中胚層細胞可在胚胎發育期間從天然來源獲得。分化為中胚層細胞或中間中胚層細胞可藉由檢查中胚層特異性標記物來確認。用於中胚層細胞的基因標記物包括FKL-1、COL2A1、FLT1、HBZ、MYF5、MYOD1、RUNX2、PECAM1及類似者。用於中胚層細胞的基因標記物亦包括GATA4、GATA6、及T(Brachyury)。該等細胞可衍生自包含中間中胚層細胞的細胞。 5.1 細胞效力
多能細胞係能夠自我更新並增殖、同時保持未分化狀態，且在適當的條件下可被誘導以分化為特化細胞類型的細胞。如本文所使用，用語「多能細胞(pluripotent cell)」涵蓋胚胎幹細胞及其他類型的幹細胞，包括胎兒幹細胞、羊膜幹細胞、或體細胞幹細胞。例示性人類幹細胞系包括H9人類胚胎幹細胞系。其他例示性幹細胞系包括透過美國國立衛生研究院人類胚胎幹細胞登記處及霍華休斯醫學研究所HUES收集系統獲得的幹細胞系[2]。
多能幹細胞具有分化為三個胚層中之任一者的潛能：內胚層（例如，胃連接部、胃腸道、肺等）、中胚層（例如，肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖組織等）或外胚層（例如，表皮組織及神經系統組織）。如本文所使用，用語「多能幹細胞(pluripotent stem cell)」亦涵蓋「誘導性多能幹細胞(induced pluripotent stem cell)」或「iPSC」（一種衍生自非多能細胞的多能幹細胞）。親代細胞的實例包括已透過各種手段重編程以誘導多能、未分化表型的體細胞。此類「iPS」或「iPSC」細胞可藉由誘導某些調節基因之表現或藉由外源性應用某些蛋白質來產生。用於誘導iPS細胞之方法係所屬技術領域中已知的[3-6]。
產生能夠在適當條件下分化為細胞類型的後代的能力係多能幹細胞特徵，該等細胞類型共同表現出與來自所有三個胚層（內胚層、中胚層、及外胚層）的細胞譜系相關聯之特徵。分子標記物的某些組合之表現或不表現亦係多能幹細胞特徵。例如，人類多能幹細胞表現來自以下非限制性列表的至少若干標記物，且在一些實施例中表現所有該等標記物：SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E、ALP、Sox2、E-鈣黏蛋白、UTF-1、Oct4、Rexl、及Nanog。
多潛能細胞可產生有限數量的其他特定的細胞類型。例如，誘導性多潛能細胞能夠形成內胚層細胞。此外，多潛能造血幹細胞自身可分化為若干類型的血細胞，包括淋巴球、單核球、嗜中性球等。寡潛能細胞係只能分化為幾種不同細胞類型的成體幹細胞。例如，淋巴樣或骨髓性幹細胞能夠分別形成淋巴或骨髓譜系的細胞。單潛能細胞形成單一細胞類型。例如，精原細胞幹細胞只能形成精子細胞。全潛能細胞具有形成整個生物體的能力。例如，在哺乳動物中，僅受精卵及第一卵裂期卵裂球係全潛能的。分化細胞包括但不限於多潛能細胞、寡潛能細胞、單潛能細胞、祖細胞、及終末分化細胞。分化細胞包括但不限於多潛能細胞、寡潛能細胞、單潛能細胞、祖細胞、及終末分化細胞。特定而言
非多能細胞並非多能細胞。此類細胞的實例包括分化細胞以及祖細胞。分化細胞的實例包括但不限於來自選自骨髓、皮膚、骨骼肌、脂肪組織、及周邊血液的組織的細胞。例示性細胞類型包括但不限於纖維母細胞、肝細胞、成肌細胞、神經元、成骨細胞、蝕骨細胞、及T細胞。用於產生該等誘導性多潛能細胞、內胚層祖細胞、及肝細胞的起始細胞可係非多能細胞。 5.2 基因編輯
可使用所屬技術領域中已知的成簇規則間隔的短回文重複/Cas (「CRISPR」)技術來修飾、工程改造或操作本揭露的細胞。有大量基於CRISPR的技術[7]。CRISPR技術及套組係市售的，例如購自IDT的Alt-R ™S.p.Cas9核酸酶V3。
可使用所屬技術領域中已知的TALEN技術來修飾、工程改造或操作本揭露的細胞。TALEN係與核酸酶合併的限制酶，其可經工程改造以結合至並切割幾乎任何所需之DNA序列。鋅指核酸酶係藉由將鋅指DNA結合域與DNA切割域融合所產生的人工限制酶。鋅指域可經工程改造以靶向特定的所需之DNA序列，且這使得鋅指核酸酶能夠靶向複雜基因體內的獨特序列。藉由利用內源性DNA修復機制，這些試劑可用於精確改變高等生物的基因體，類似於CRISPR及TALEN。 5.3 表1 ：基因彙總
名稱 縮寫 基因ID
β-2微球蛋白 β2M或B2M 567
CD47 CD47 961
II類主要組織相容性複合體反式活化子 CIITA 4261
調節因子X相關聯之含錨蛋白蛋白 RFXANK 8625
人類白血球抗原-E HLA-E 3133
人類白血球抗原-G HLA-G 3135
分化簇24分子 CD24 100133941
HLA II類組織相容性抗原γ鏈 CD74 972
人類白血球抗原-B HLA-B 3106
人類白血球抗原-C HLA-C 3107
巨噬細胞抑制性細胞激素-1 MIC-1 9518
巨噬細胞抑制性細胞激素-2 MIC-2 4267
調節因子X5 RFX5 5993
調節因子X相關聯之蛋白 RFXAP 5994
載體蛋白1，ATP結合卡匣子族B成員 TAP1 6890
載體蛋白2，ATP結合卡匣子族B成員 TAP2 6891
TAP結合蛋白(tapasin)，串聯重複2 Tapasin 100034470
硫氧還蛋白交互作用蛋白 TXNIP 10628
CD46分子 CD46 4179
分化簇55分子（Cromer血型） CD55 1604
分化簇59分子（CD59血型） CD59 966
補體C3b/C4b受體1 CR1 1378
中腦星狀細胞衍生之神經營養因子 MANF 7873
TNF α誘導蛋白3 TNFAIP3 7128
分化簇274分子 PD-L1 29126
鈣黏蛋白5 CD144 1003
NK2同源匣5 NKX2.5 1482
肌鈣蛋白T2，心臟型 TNNT2 7139
去唾液酸糖蛋白受體1 ASGPR1 432
5.4 人類白血球抗原 (HLA)
MHC基因家族分為三組：I類、II類、及III類。在人類中，MHC被稱為人類白血球抗原(HLA)。來自同種異體來源的HLA I類及/或II類蛋白在移植的背景下構成外來抗原。非自身HLA I類及/或II類蛋白的識別係使用多能細胞進行移植或補充療法的主要障礙。HLA II類缺陷細胞、HLA I類缺陷細胞、或HLA I/II類缺陷細胞可用為通用供體細胞。 5.4.1HLA I 類
HLA I類分子由兩條非共價連接之多肽鏈、一條HLA編碼的α鏈或重鏈（44至47 kD）、以及一個非HLA編碼的次單元（稱為β2微球蛋白(β2M)）(12 kD)組成。該重鏈具有三個胞外域(α1-3)、跨膜區、及C端細胞質尾部。α鏈的α1及α2域係識別區，在它們之間形成肽抗原結合槽。高度保守的α3免疫球蛋白樣域係CD8結合的區。β2M鏈主要與α3域締合，且對於HLA穩定性係必需的。
HLA I類蛋白係在所有有核細胞上表現。經典HLA I類蛋白將細胞表面上的肽呈現給CD8+細胞毒性T細胞。迄今為止，已鑑別出六種HLA I類重鏈(α)，包括三種經典（HLA-A、HLA-B、及HLA-C）及三種非經典（HLA-E、HLA-F、及HLA-G）重鏈。HLA I類分子肽結合裂隙上肽結合之特異性係由重鏈判定。CD8+ T細胞對HLA I類分子呈現的肽之識別介導細胞免疫。
HLA-G藉由結合抑制性受體發揮免疫調節作用，HLA-G透過與白血球受體諸如LILRB1 (LIR1/ILT2)、LILRB2 (ILT4)、及KIR2DL4 (CD158d)直接交互作用來抑制T CD8+及NK細胞的細胞毒性活性。HLA-G一級轉錄本透過替代性剪接來編碼七種不同的重異構體。4種係膜相關的，且3種係分泌的。HLA-G1及HLA-G5係HLA-G中僅有的可結合β2M的異構體[8]。
HLA-E分子結合衍生自各種HLA I類分子之前導序列的九聚自體肽。作為針對NK細胞上的CD94/NKG2受體、以及針對NKT細胞上的TCR的配體，HLA-E分子參與先天免疫及適應性免疫兩者。HLA-E CD94/NKG2 A/C系統調節NK細胞所介導之細胞毒性及細胞激素產生的抑制或活化。HLA-E分子可結合衍生自各種HLA I類分子之前導序列的九聚自體肽。HLA-E的例示性肽配體係所屬技術領域中已知的，參見例如Nadine & Purcell, Encyclopedia of Immunology, Vol. 2, 2016, pages 215-219 [9]。
大部分與HLA-E結合的肽係衍生自其他MHC I類分子的信號肽，包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、及HLA-G。這些通常係信號序列的胺基酸殘基3至11。這些肽在轉位到ER期間從I類分子上被切割，並以TAP及Tapasin依賴性方式加載到HLA-E的裂隙中。用信號序列肽裝載HLA-E可指導HLA-E分子的運輸，且該等肽係HLA-E與NK受體CD94-NKG2A（抑制性）、CD94-NKG2B、及CD94-NKG2C（活化）結合所需之輔因子。經典HLA I類之下調干擾信號序列肽供應以及隨後HLA-E在細胞表面上的表現。這消除針對CD94/NKG2A受體的抑制信號，促進細胞溶解效應物諸如NK細胞清除受影響的宿主細胞。儘管HLA-E可選地呈現來自HLA I類分子之前導序列的肽，但HLA-E亦結合其他非典型肽。當HLA-E表現喪失時，CD94/NKG2A受體不再發送抑制信號。因此，CD94/NKG2A受體為NK細胞提供一種監測MHC I類在組織上之總體表現並透過MHC I類分子之下調來防止腫瘤或病毒感染細胞逃避之手段。 5.4.2HLA II 類
HLA II類分子(HLA-II)係僅在專業抗原呈現細胞(APC)（包括巨噬細胞、樹突狀細胞、及B細胞）上發現的跨膜蛋白。此外，實體器官有時可以表現參與免疫排斥的HLA II類基因。
II類HLA分子係由兩條非共價締合之多肽鏈（一條32 kD至34 kD的α鏈、及一條29 kD至32 kD的β鏈）構成。編碼II類分子之兩條鏈的基因係多型性的，且存在於HLA基因座中。兩條鏈皆具有三個區，其中包括：含有TCR識別（α1及β1）及CD4結合（α2及β2）域的胞外區；含有疏水性胺基酸的跨膜區，藉由該區，分子被錨定到細胞膜上；以及短的細胞質區。肽結合槽形成於α1與β1域之間。
HLA II類(HLA-II)分子或蛋白質在細胞表面呈現來自細胞外蛋白質（包括細胞外病原體的蛋白質）的肽抗原，而HLA I類蛋白質則呈現來自細胞內蛋白質或病原體的肽。細胞表面上負載的HLA II類蛋白與CD4+輔助T細胞交互作用。該交互作用導致吞噬細胞的募集、局部發炎、及/或透過活化B細胞產生的體液反應。迄今為止，已鑑別出若干HLA II類基因座，包括HLA-DM（分別編碼HLA-DM a鏈及HLA-DM β鏈的HLA-DMA及HLA-DMB）、HLA-DO（分別編碼HLA-DO α鏈及HLA-DO β鏈的HLA-DOA及HLA-DOB）、HLA-DP（分別編碼HLA-DP α鏈及HLA-DP β鏈的HLA-DPA及HLA-DPB）、HLA-DQ（分別編碼HLA-DQ α鏈及HLA-DQ β鏈的HLA-DQA及HLA-DQB）、及HLA-DR（分別編碼HLA-DR α鏈及HLA-DR β鏈的HLA-DRA及HLA-DRB）。 5.5 序列
本揭露的多肽或蛋白質亦係關於呈現於 表 2中的序列，以及與該等序列相比包含1、2、或3個胺基酸取代的序列。本揭露的多肽或蛋白質可包含SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 28、及/或SEQ ID NO: 29中之任一者。 表 2 ：胺基酸序列
名稱 分子類型 序列 SEQ ID NO:
HLA-E重鏈(WT) 胺基酸 HSLKYFHTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDNDAASPRMVPRAPWMEQEGSEYWDRETRSARDTAQIFRVNLRTLRGYYNQSEAGSHTLQWMHGCELGPDGRFLRGYEQFAYDGKDYLTLNEDLRSWTAVDTAAQISEQKSNDASEAEHQRAYLEDTCVEWLHKYLEKGKETLLHLEPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQQDGEGHTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPVTLRWKPASQPTIPIVGIIAGLVLLGSVVSGAVVAAVIWRKKSSGGKGGSYSKAEWSDSAQGSESHSL 10
HLA-G重鏈異構體1 (HLA-G1) 胺基酸 GSHSMRYFSAAVSRPGRGEPRFIAMGYVDDTQFVRFDSDSACPRMEPRAPWVEQEGPEYWEEETRNTKAHAQTDRMNLQTLRGYYNQSEASSHTLQWMIGCDLGSDGRLLRGYEQYAYDGKDYLALNEDLRSWTAADTAAQISKRKCEAANVAEQRRAYLEGTCVEWLHRYLENGKEMLQRADPPKTHVTHHPVFDYEATLRCWALGFYPAEIILTWQRDGEDQTQDVELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLMLRWKQSSLPTIPIMGIVAGLVVLAAVVTGAAVAAVLWRKKSSD 11
CD47 胺基酸 MWPLVAALLLGSACCGSAQLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVSWFSPNENILIVIFPIFAILLFWGQFGIKTLKYRSGGMDEKTIALLVAGLVITVIVIVGAILFVPGEYSLKNATGLGLIVTSTGILILLHYYVFSTAIGLTSFVIAILVIQVIAYILAVVGLSLCIAACIPMHGPLLISGLSILALAQLLGLVYMKFVASNQKTIQPPRKAVEEPLNAFKESKGMMNDE 12
HLA-E-C1重鏈（截短） 胺基酸 HSLKYFHTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDNDAASPRMVPRAPWMEQEGSEYWDRETRSARDTAQIFRVNLRTLRGYYNQSEAGSHTLQWMHGCELGPDGRFLRGYEQFAYDGKDYLTLNEDLRSWTAVDTAAQISEQKSNDASEAEHQRAYLEDTCVEWLHKYLEKGKETLLHLEPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQQDGEGHTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPVTLRWKPASQPTIPIVGIIAGLVLLGSVVSGAVVAAVIW RAASSD 13
HLA-E-C2重鏈（截短） 胺基酸 HSLKYFHTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDNDAASPRMVPRAPWMEQEGSEYWDRETRSARDTAQIFRVNLRTLRGYYNQSEAGSHTLQWMHGCELGPDGRFLRGYEQFAYDGKDYLTLNEDLRSWTAVDTAAQISEQKSNDASEAEHQRAYLEDTCVEWLHKYLEKGKETLLHLEPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQQDGEGHTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPVTLRWKPASQPTIPIVGIIAGLVLLGSVVSGAVVAAVIW RKKSSGGK 14
HLA-E重鏈(WT)細胞質域 胺基酸 RKKSSGGKGGSYSKAEWSDSAQGSESHSL 15
HLA-E-C1重鏈截短的細胞質域 胺基酸 RAASSD 16
HLA-E-C2重鏈截短的細胞質域 胺基酸 RKKSSGGK 17
β2M 胺基酸 IQRTPKIQVYSRHPADIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM 18
HLA-E單鏈結合肽 胺基酸 VMAPRTLFL 28
HLA-G單鏈結合肽 胺基酸 RIIPRHLQL 29
WT：野生型
本揭露的多肽或蛋白質可包含呈現於 表 3中的序列中之任一者，以及與該等序列相比包含1、2、或3個核苷酸取代的序列。 表 3 ：多核苷酸序列
名稱 分子類型 序列 SEQ ID NO:
HLA-E重鏈(WT) DNA CACAGCCTGAAGTACTTTCACACCTCCGTGTCCAGACCTGGCAGAGGCGAGCCTAGATTCATCAGCGTGGGCTACGTGGACGACACCCAGTTCGTCAGATTCGACAACGACGCCGCCTCTCCTCGGATGGTTCCTAGAGCACCCTGGATGGAACAAGAGGGCAGCGAGTACTGGGATCGCGAGACAAGAAGCGCCAGAGACACTGCCCAGATCTTCCGCGTGAACCTGAGAACCCTGCGGGGCTACTACAATCAGTCTGAGGCCGGCTCTCACACCCTGCAGTGGATGCATGGATGTGAACTGGGCCCCGACGGCAGATTCCTGAGAGGCTATGAGCAGTTCGCCTACGACGGCAAGGACTACCTGACACTGAACGAGGACCTGAGAAGCTGGACCGCCGTGGATACAGCCGCTCAGATCAGCGAGCAGAAGTCTAACGACGCCAGCGAGGCCGAACACCAGAGAGCCTATCTGGAAGATACCTGCGTGGAATGGCTGCACAAGTACCTGGAAAAGGGCAAAGAAACCCTGCTGCACCTGGAACCTCCAAAGACACATGTGACCCACCATCCTATCAGCGACCACGAGGCCACACTGAGATGTTGGGCCCTGGGCTTTTACCCCGCCGAGATCACACTGACATGGCAGCAGGATGGCGAGGGCCACACACAGGATACAGAGCTGGTGGAAACAAGACCTGCCGGCGACGGCACCTTCCAGAAATGGGCTGCTGTGGTGGTTCCCAGCGGCGAGGAACAGAGATACACCTGTCACGTGCAGCACGAGGGACTGCCTGAACCTGTGACTCTGAGATGGAAGCCTGCCAGCCAGCCAACAATCCCCATCGTGGGAATCATTGCCGGCCTGGTGCTGCTGGGATCTGTGGTTTCTGGTGCAGTGGTGGCCGCCGTGATTTGGAGAAAGAAGTCCTCTGGCGGCAAAGGCGGCAGCTACTCTAAAGCCGAGTGGAGCGATTCTGCCCAGGGCTCTGAAAGCCACTCTCTC 19
HLA-G異構體1重鏈(HLA-G1) DNA ggatctcacagcatgcggtacttctctgccgccgtgtccagacctggaagaggcgagcctagattcattgccatgggctacgtggacgacacccagttcgtcagattcgacagcgacagcgcctgtcctcggatggaacctagagcaccttgggtcgagcaagagggccctgagtactgggaagaagagacacggaacaccaaggctcacgcccagaccgacagaatgaacctgcagaccctgcggggctactacaatcagtctgaggccagcagccatactctgcagtggatgatcggctgcgatctgggctctgatggcagactgctgagaggctacgagcagtacgcctacgacggcaaggattatctggccctgaacgaggacctgcggtcttggacagctgccgatacagccgctcagatcagcaagagaaagtgcgaggccgccaatgtggccgaacagagaagggcttacctggaaggcacctgtgtggaatggctgcacagatacctggaaaacggcaaagagatgctgcagcgggccgatcctcctaagacacatgtgacccaccatcctgtgttcgactacgaggccacactgagatgttgggccctgggcttttaccctgccgagatcatcctgacctggcagagagatggcgaggatcagacccaggacgtggaactggtggaaacaagacctgccggcgacggcaccttccagaaatgggctgctgtggtggttcccagcggcgaggaacagagatacacctgtcacgtgcagcacgagggactgcctgaacctctgatgctgagatggaagcagagcagcctgcctacaatccccatcatgggaatcgtggccggactggtggttctggccgctgttgttacaggtgctgcagtggctgccgtgctgtggcggaagaaaagctccgat 20
CD47 DNA atgtggcctctcgtagcggcacttcttttggggtctgcatgttgcggcagtgctcaactcctgtttaataagactaaatcagtggaatttaccttttgcaatgataccgtagtcattccttgcttcgtcacaaatatggaagcccaaaacactacagaagtctacgtgaagtggaaattcaagggaagagatatttatacctttgatggcgccctcaataaaagcactgttccaacagatttttcttccgcgaagattgaagtgtcacaacttttgaaaggcgacgcgtccctcaaaatggacaagtccgatgcggtgtcacacacgggaaattatacgtgtgaagttaccgagttgacgcgagagggcgagacaattattgaactcaagtacagggtagtctcttggttctccccgaacgaaaacatcctgatcgtgatattcccaatttttgccatacttcttttctggggccagtttgggatcaagacgctgaagtatcggagcggtggaatggacgagaaaactatagcgcttctggttgcaggtcttgtcatcactgtaattgtcatagtgggtgctatacttttcgtccccggtgaatacagtttgaagaacgcgacaggcctcggacttatcgtcaccagtaccggcattctgatattgcttcattactacgtattctcaacggccattggtcttactagctttgtcatagctatcctggtaatccaagtaatagcatacatacttgctgttgtgggcctttctctgtgcatagccgcgtgtatccctatgcatggaccacttctcataagcggactttctatacttgccctcgctcagcttctgggcttggtatatatgaaatttgtcgcgagcaaccaaaaaacgatacaaccgcctcgaaaggctgtagaggagcctttgaacgcattcaaggagagcaaagggatgatgaacgacgaa 21
HLA-E - C1重鏈（截短） DNA CACAGCCTGAAGTACTTTCACACCTCCGTGTCCAGACCTGGCAGAGGCGAGCCTAGATTCATCAGCGTGGGCTACGTGGACGACACCCAGTTCGTCAGATTCGACAACGACGCCGCCTCTCCTCGGATGGTTCCTAGAGCACCCTGGATGGAACAAGAGGGCAGCGAGTACTGGGATCGCGAGACAAGAAGCGCCAGAGACACTGCCCAGATCTTCCGCGTGAACCTGAGAACCCTGCGGGGCTACTACAATCAGTCTGAGGCCGGCTCTCACACCCTGCAGTGGATGCATGGATGTGAACTGGGCCCCGACGGCAGATTCCTGAGAGGCTATGAGCAGTTCGCCTACGACGGCAAGGACTACCTGACACTGAACGAGGACCTGAGAAGCTGGACCGCCGTGGATACAGCCGCTCAGATCAGCGAGCAGAAGTCTAACGACGCCAGCGAGGCCGAACACCAGAGAGCCTATCTGGAAGATACCTGCGTGGAATGGCTGCACAAGTACCTGGAAAAGGGCAAAGAAACCCTGCTGCACCTGGAACCTCCAAAGACACATGTGACCCACCATCCTATCAGCGACCACGAGGCCACACTGAGATGTTGGGCCCTGGGCTTTTACCCCGCCGAGATCACACTGACATGGCAGCAGGATGGCGAGGGCCACACACAGGATACAGAGCTGGTGGAAACAAGACCTGCCGGCGACGGCACCTTCCAGAAATGGGCTGCTGTGGTGGTTCCCAGCGGCGAGGAACAGAGATACACCTGTCACGTGCAGCACGAGGGACTGCCTGAACCTGTGACTCTGAGATGGAAGCCTGCCAGCCAGCCAACAATCCCCATCGTGGGAATCATTGCCGGCCTGGTGCTGCTGGGATCTGTGGTTTCTGGTGCAGTGGTGGCCGCCGTGATTTGGAGAGCCGCCTCCTCTGAC 22
HLA-E-C2重鏈（截短） DNA cacagcctgaagtactttcacacctccgtgtccagacctggcagaggcgagcctagattcatcagcgtgggctacgtggacgacacccagttcgtcagattcgacaacgacgccgcctctcctcggatggttcctagagcaccctggatggaacaagagggcagcgagtactgggatcgcgagacaagaagcgccagagacactgcccagatcttccgcgtgaacctgagaaccctgcggggctactacaatcagtctgaggccggctctcacaccctgcagtggatgcatggatgtgaactgggccccgacggcagattcctgagaggctatgagcagttcgcctacgacggcaaggactacctgacactgaacgaggacctgagaagctggaccgccgtggatacagccgctcagatcagcgagcagaagtctaacgacgccagcgaggccgaacaccagagagcctatctggaagatacctgcgtggaatggctgcacaagtacctggaaaagggcaaagaaaccctgctgcacctggaacctccaaagacacatgtgacccaccatcctatcagcgaccacgaggccacactgagatgttgggccctgggcttttaccccgccgagatcacactgacatggcagcaggatggcgagggccacacacaggatacagagctggtggaaacaagacctgccggcgacggcaccttccagaaatgggctgctgtggtggttcccagcggcgaggaacagagatacacctgtcacgtgcagcacgagggactgcctgaacctgtgactctgagatggaagcctgccagccagccaacaatccccatcgtgggaatcattgccggcctggtgctgctgggatctgtggtttctggtgcagtggtggccgccgtgatttggagaaagaagtcctctggcggcaaa 23
HLA-E (WT)細胞質域 DNA AGAAAGAAGTCCTCTGGCGGCAAAGGCGGCAGCTACTCTAAAGCCGAGTGGAGCGATTCTGCCCAGGGCTCTGAAAGCCACTCTCTC 24
HLA-E-C1截短的細胞質域 DNA AGAGCCGCCTCCTCTGAC 25
HLA-E-C2截短的細胞質域 DNA agaaagaagtcctctggcggcaaa 26
β2M DNA attcagcggacccctaagatccaggtgtacagcagacaccctgccgagaacggcaagagcaacttcctgaactgctacgtgtccggctttcaccccagcgacattgaggtggacctgctgaagaacggcgagcggatcgagaaggtggaacacagcgatctgagcttcagcaaggactggtccttctacctgctgtactacaccgagttcacccctaccgagaaggacgagtacgcctgcagagtgaaccacgtgacactgagccagcctaagatcgtgaagtgggacagagacatg 27
HLA-E單鏈肽 DNA gtgatggcccctagaacactgtttctc 30
HLA-G單鏈肽 DNA agaatcatccctagacatctgcagctc 31
HLA-E-C2重鏈（截短）完整表現載體 DNA aaggatctgcgatcgctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaacgggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacagctgaagcttcgaggggctcgcatctctccttcacgcgcccgccgccctacctgaggccgccatccacgccggttgagtcgcgttctgccgcctcccgcctgtggtgcctcctgaactgcgtccgccgtctaggtaagtttaaagctcaggtcgagaccgggcctttgtccggcgctcccttggagcctacctagactcagccggctctccacgctttgcctgaccctgcttgctcaactctacgtctttgtttcgttttctgttctgcgccgttacagatccaagctgtgaccggcgcctactctagagctagcgccaccatgcctttgttgctgctgctgcctcttctgtgggctggtgctctggctgtgatggcccctagaacactgtttctcggcggaggcggatctggtggcggaggaagtggcggcggaggatctattcagcggacccctaagatccaggtgtacagcagacaccctgccgagaacggcaagagcaacttcctgaactgctacgtgtccggctttcaccccagcgacattgaggtggacctgctgaagaacggcgagcggatcgagaaggtggaacacagcgatctgagcttcagcaaggactggtccttctacctgctgtactacaccgagttcacccctaccgagaaggacgagtacgcctgcagagtgaaccacgtgacactgagccagcctaagatcgtgaagtgggacagagacatgggaggcggtggaagcggaggtggtggatctggcggtggcggcagcggaggcggaggttctggatctcacagcctgaagtactttcacacctccgtgtccagacctggcagaggcgagcctagattcatcagcgtgggctacgtggacgacacccagttcgtcagattcgacaacgacgccgcctctcctcggatggttcctagagcaccctggatggaacaagagggcagcgagtactgggatcgcgagacaagaagcgccagagacactgcccagatcttccgcgtgaacctgagaaccctgcggggctactacaatcagtctgaggccggctctcacaccctgcagtggatgcatggatgtgaactgggccccgacggcagattcctgagaggctatgagcagttcgcctacgacggcaaggactacctgacactgaacgaggacctgagaagctggaccgccgtggatacagccgctcagatcagcgagcagaagtctaacgacgccagcgaggccgaacaccagagagcctatctggaagatacctgcgtggaatggctgcacaagtacctggaaaagggcaaagaaaccctgctgcacctggaacctccaaagacacatgtgacccaccatcctatcagcgaccacgaggccacactgagatgttgggccctgggcttttaccccgccgagatcacactgacatggcagcaggatggcgagggccacacacaggatacagagctggtggaaacaagacctgccggcgacggcaccttccagaaatgggctgctgtggtggttcccagcggcgaggaacagagatacacctgtcacgtgcagcacgagggactgcctgaacctgtgactctgagatggaagcctgccagccagccaacaatccccatcgtgggaatcattgccggcctggtgctgctgggatctgtggtttctggtgcagtggtggccgccgtgatttggagaaagaagtcctctggcggcaaaggatccgcggccgctgagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggcccttccgggatgaccgagtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtccccagggccgtacgcaccctcgccgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgatccggaccgccacatcgagcgggtcaccgagctgcaagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggacgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctgaatctaggtcgacaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacgaaaataagatctgctttttgcttgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtagtagttcatgtcatcttattattcagtatttataacttgcaaagaaatgaatatcagagagtgagaggaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggctctagctatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctagacttttgcagagacggcccaaattcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgccaagctgacgcgtgtagtcttatgcaatactcttgtagtcttgcaacatggtaacgatgagttagcaacatgccttacaaggagagaaaaagcaccgtgcatgccgattggtggaagtaaggtggtacgatcgtgccttattaggaaggcaacagacgggtctgacatggattggacgaaccactgaattgccgcattgcagagatattgtatttaagtgcctagctcgatacaataaacgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacctgaaagcgaaagggaaaccagagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccactgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcctcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagattggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttatcgatactagt 32
5.6 修飾方法
基因修飾及編輯的方法係所屬技術領域中熟知的，參見例如[10]。缺失或降低細胞中免疫活化基因之表現可透過多種方式（例如，藉由基因剔除）達成。基因剔除係使特定基因在其所在細胞中失去活性的程序，其導致不產生所關注蛋白質或產生失活形式。基因剔除可透過多種不同的方式（包括從基因中移除核酸序列，或將該序列用其他序列中斷，改變閱讀框，或改變核酸的調節組分）達成。例如，可去除所關注基因之編碼區的全部或一部分，或用「無義」序列置換，可去除或替換調節序列諸如啟動子的全部或一部分，可去除或置換轉譯起始序列等。用於降低標靶基因之基因表現的基因編輯技術包括TALEN、鋅指、Cas-CLOVER、及CRISPR/Cas系統，及/或使用任何已知的基因敲低方法，例如採用各種基於RNA的技術（例如，shRNA、反義RNA、miRNA、siRNA [11,12]）中之任一者的那些方法。可透過多種方式（例如，藉由「基因敲入」達成免疫耐受基因的引入或增加表現。基因敲入意指向宿主細胞中添加遺傳功能的程序。這導致所編碼的蛋白質之含量增加，例如藉由將基因的一個或多個額外拷貝添加至宿主細胞或改變內源性基因的調節組分來增加蛋白質之表現。這可以藉由修飾啟動子、添加不同的啟動子、添加增強子、或修飾其他基因表現序列來達成。
在基因之背景下，「剔除(knock-out)」意指攜帶該剔除的宿主細胞不產生該基因的功能性蛋白質產物。如本文所概述，剔除可透過多種方式達成：去除編碼序列的全部或一部分；引入框移突變，使得功能性蛋白質無法產生（截短的序列或無義序列）；移除或改變調節組分（例如，啟動子），使得基因無法轉錄；透過與mRNA結合阻止轉譯等。一般而言，剔除在基因體DNA位準上受影響，使得細胞的後代亦永久攜帶該剔除。
在基因之背景下，「敲入(knock in)」意指攜帶該敲入的宿主細胞在細胞中具有更多活性功能性蛋白質。如本文所概述，敲入可透過多種方式達成，通常藉由將至少一個編碼蛋白質的轉基因(tg)拷貝引入細胞中，儘管這亦可藉由置換調節組分來完成，例如藉由向內源性基因中添加持續性啟動子。一般而言，敲入技術導致轉基因的額外拷貝整合到宿主細胞中。 5.7 經修飾之細胞
細胞可藉由包括以下的方法來修飾：基因修飾(GM)、基因編輯（例如，CRISPR-Cas、TALEN、鋅指、Cas-CLOVER）、引入基因表現卡匣、慢病毒轉導、基因沉默技術及RNA干擾、基於RNA的技術（例如，shRNA、反義RNA、miRNA、siRNA）。經修飾之細胞係人工細胞，且不存在於自然界中。細胞可藉由非本質上的生物方法進行修飾。 5.8NK 細胞活化及非經典 HLA 分子
人類NK細胞構成先天免疫系統的第一線，且亦參與適應性免疫。NK細胞使用多種與標靶細胞上的配體交互作用的細胞表面受體來區分自身及非自身。抑制信號與活化信號的平衡判定NK細胞活化或抑制。
避免T細胞同種異體免疫的策略係缺失HLA I類表現。然而，HLA I類缺失可能使經修飾之細胞對NK所介導之免疫敏感。缺失β2M（例如）阻止非多型性非經典HLA Ib類分子HLA-E及HLA-G的表面表現，該等分子係維持NK細胞耐受性所需。 5.9 啟動子
Kim等人[13]描述了人類延伸因子1 α (EF1α)啟動子。Barrow等人[14]描述了CMV啟動子。CMV啟動子係一種強大的啟動子，且對組織類型無選擇性[10]。 5.10 幹細胞
為避免疑問，本揭露中所使用之人類胚胎細胞可衍生自孤雌生殖活化的人類卵母細胞。幹細胞可係多能的。該等幹細胞可並非全潛能的。 5.11 未經修飾之細胞
未經修飾之細胞可係野生型細胞。野生型(WT)細胞係在自然界中發現的細胞，特定而言是尚未經工程改造或修飾之細胞。 6 實例1 ：方法 6.1 細胞系
人類ESC系121 (SA121)獲自Takara Bio Europe AB。iPSC系係內部得到的iPSC殖株B的殖株及衍生自殖株B的B2M-KO殖株。 6.2HLA-E 及 HLA-G 過表現
將B2M融合的HLA-E-T2A-Puro（或HLA-E-C1/C2-T2A-Puro）及B2M融合的HLA-G-T2A-Blast選殖到慢病毒構築體中。HLA-E及HLA-G蛋白係以單鏈肽表現。50X濃縮慢病毒係藉由標準超速離心方案產生。然後透過慢病毒轉導產生表現HLA-E及HLA-G的B2M-KO iPSC系。第0天，將0.2x106個B2M-KO iPSC接種到基質膠包被之6孔盤中的補充有10 µM Y-27632 (StemCell Technologies 72302)的StemFlex培養基(Gibco)中。第1天，將20 µL 50X濃縮慢病毒與2 µL聚凝胺(8 mg/ml)混合，然後向添加至iPSC之各孔中的2 ml StemFlex培養基中（聚凝胺之最終濃度係8 µg/ml）。第2天，將培養基更換為新鮮StemFlex培養基。自第5天開始，用StemFlex培養基中的0.5 µg/ml嘌呤黴素及/或5 µg/ml殺稻瘟菌素進行抗生素選擇。在檢查表現及螢光活化細胞分選(FACS)之前，在7天選擇期內根據需要分割細胞。 6.3 螢光活化細胞分選 (FACS) 6.3.1HLA-A 、 B 、 C 表現 (HeLa)
將野生型或基因剔除的HeLa細胞用或不用25 ng/mL干擾素γ (IFNγ)預處理48小時，然後使用TrypLE ™Express酶(Gibco)從培養板上分離，以350 g旋轉沉降5分鐘，並使用FACS緩衝液（含1% FBS的DPBS）沖洗。將細胞以＜1x10 6個細胞/100 µL的密度重懸於FACS緩衝液中。對於每100 µL細胞懸浮液，添加5 µL Alexa Flour 647結合的小鼠抗人類HLA-A、B、C抗體(BioLegend 311414)、及PE結合的小鼠抗人HLA-DR抗體(BioLegend 307606)，並與細胞充分混合。然後將該細胞於4℃孵育15分鐘，以350 g旋轉沉降5分鐘，並使用1 mL FACS緩衝液沖洗。最後將經染色之細胞以＜1x10 6個細胞/100 µL的密度重懸於FACS緩衝液中，在BD LSRFortessa ™細胞分析儀上進行流式細胞術分析，以測量HLA I類及HLA II類表現。使用Flowjo軟體(v10.7)分析資料。 6.3.2HLA-E 及 HLA-G 過表現（ iPSC 及 SA121 ）
使用無酶細胞解離緩衝液(Gibco)將經修飾之幹細胞從培養板上分離，以300 g旋轉沉降5分鐘，並使用補充有10 µM Y-27632 (StemCell Technologies 72302)的FACS緩衝液（含1% FBS的DPBS）沖洗。將細胞以＜1x10 6個細胞/100 µL的密度重懸於補充有10 µM Y-27632的FACS緩衝液中。對於各100 µL細胞懸液，添加5 µL各對應抗體（如以下 表 4所列）並與細胞充分混合。將該細胞於4℃孵育30分鐘，以300 g旋轉沉降5分鐘，並使用1 mL FACS緩衝液沖洗。最後將經染色之細胞以＜1x10 6個細胞/100 µL的密度重懸於補充有10 µM Y-27632的FACS緩衝液中，在BD FACSAria ™融合細胞分選儀上進行螢光細胞分選。將收集的細胞接種到基質膠包被之組織培養處理的平盤上，用於擴增及進一步實驗。使用Flowjo軟體(v10.7)分析流式細胞術資料。 表 4 ：抗體
所關注蛋白質 螢光團 來源
HLA-A、B、C Alexa Flour 647 BioLegend 311414
β2M APC BioLegend 316312
PE BioLegend 316306
HLA-E APC BioLegend 342605
PE BioLegend 342604、342610
CD47 APC BioLegend 323124
FITC BioLegend 323106
HLA-DR PE BioLegend 307606
HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ APC BioLegend 361714
FITC BioLegend 361706
HLA-G APC BioLegend 335910
SOX17 APC Miltenyi Biotec 130-111-033
FOXA2 PE Miltenyi Biotec 130-107-773
CD56 (NCAM) APC BioLegend 362503
Brachyury Alexa Fluor 488 R&D Systems IC2085G
PAX6 Alexa Fluor 488 NOVUS Biologicals NBP2-34705AF488
NKX2-5 Alexa Fluor 647 Thermo Fisher Scientific A25974、A25970（二級抗體）
TNNT2 Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A25969、A25972、或A32787（二級抗體）
ASGPR1 PE BD Pharmingen 563655
6.4 三系、心肌細胞、內皮細胞、及肝細胞分化的流式細胞術分析
對於三系分化，將分化的細胞用DPBS洗滌一次並用Accutase於37℃解離3 min。將解離的細胞轉移至U型底96孔盤，在DPBS中洗滌兩次，並按照96孔U形平盤製造商之說明使用True-Nuclear轉錄緩衝液組(424401, BioLegend)進行染色。透化後，將細胞與抗譜系特異性標記物的抗體一起孵育隔夜。使用抗SOX17、FOXA2（針對內胚層）、CD56、Brachyury（針對中胚層）、及PAX6（針對外胚層）的螢光團結合抗體。將細胞洗滌3次並重懸於DPBS中，進行流式細胞術分析。按照製造商之說明，使用STEMdiff心肌細胞解離套組(05025, STEMCELL Technologies)解離心肌細胞。使用人類心肌細胞免疫細胞化學套組(A25973, Thermo Fisher Scientific)對重懸的心肌細胞進行染色。簡言之，將心肌細胞於室溫在固定液中固定15 min，離心，吸乾，然後重懸於透化液中。將細胞於室溫透化15 min，離心，吸乾，重懸並於室溫在封閉液中孵育30 min。將初級抗體直接添加至封閉溶液中，輕輕混合，並於4℃孵育隔夜。將細胞用洗滌緩衝液洗滌3次，重懸於含有二級抗體（Alexa Fluor 488驢抗小鼠抗體，A25972、或Alexa Fluor 647驢抗小鼠抗體、A32787、及Alexa Fluor 594驢抗兔抗體、A25970）的封閉緩衝液中。將細胞於室溫避光孵育30 min。在使用流式細胞術分析前，將細胞洗滌3次。將解離的心肌細胞亦用FITC抗人類CD47抗體(323106, BioLegend)及APC抗人類HLA-E抗體(342605, BioLegend)在細胞染色緩衝液(420201, BioLegend)中於室溫染色10 min，用細胞染色緩衝液洗滌一次，並重懸於DPBS中以進行流式細胞術分析。肝細胞分化22天後，將細胞於37℃用TrypLE Express酶(Gibco)解離5 min至10 min。於室溫使用FACS緩衝液（含1%FBS的DPBS）將解離的細胞用PE抗人類ASGPR1抗體(563655, BD Pharmingen)染色15分鐘。用FACS緩衝液洗滌後，在BD LSRFortessa細胞分析儀上分析染色的細胞。 6.5xCelligence 基於即時之殺傷檢定（ NK 細胞及 CTL ）
NK供體細胞係藉由GB blood core單離自內部RSCP供體材料，並在補充有200U/mL IL2的Advanced RPMI+10% FBS+1x GlutaMax中生長至少1天。將幹細胞以35K/孔的幹細胞培養基(StemFlex)鋪在96孔基質膠包被之平盤上，並在鋪板後使其恢復並黏附隔夜。次日，以1:1或1:2的E:T比率添加NK細胞，並運行XCELLigence測定達24小時至48小時。藉由RTCA軟體Pro對結果進行分析。 6.6 三系、心肌細胞、及內皮細胞分化方案
將人類多能幹細胞（hPSC、ESC、或iPSC）維持在StemFlex培養基(A3349401, Gibco)中。將細胞在補充有RevitaCell補充劑(100X) (A2644501, Gibco)或10 µM Y-27632的培養基中傳代，並傳代到包被有hESC合格基質膠(354277, Corning)或截短的重組人類玻連蛋白(rhVTN-N, A14701SA, Gibco)的培養容器上。對於三系分化，分別使用STEMdiff定形內胚層套組(05110, STEMCELL Technologies)、STEMdiff三系外胚層培養基(05231, STEMCELL Technologies)、中胚層誘導培養基(05221, STEMCELL Technologies)、及STEMdiff三系分化套組進行內胚層、中胚層、及外胚層分化。使用STEMdiff心肌細胞分化套組（現為STEMdiff心室心肌細胞分化套組，05010，STEMCELL Technologies）使hPSC分化為心肌細胞，並藉由STEMdiff心肌細胞維持套組(05020, STEMCELL Technologies)進行維持。簡而言之，將解離的細胞接種到包被有hESC合格基質膠的培養容器上。按照製造商之說明置換培養基，並在第15天後分析所得到的細胞。按照製造商之關於修飾之說明，使用STEMdiff內皮分化套組(08005, STEMCELL Technologies)及STEMdiff中胚層誘導培養基(05220, STEMCELL Technologies)進行內皮分化及擴增。簡而言之，將hPSC接種到包被有rhVTN-N的培養容器上。中胚層及內皮誘導、傳代、及擴增係按照製造商之說明進行。在使用48 h 50 nM IFN-γ處理進行分化第14天後，分析MHC II類受體之表現。 6.7 肝細胞分化方案
將人類PSC以100萬個活細胞/孔之密度接種到包被有CellAdhere ™Laminin-521 (200-0117, STEMCELL Technologies)的12孔盤上。次日（第0天），將補充有3 µM CHIR99021、30 ng/ml活化素A、及0.2% B27 (12587010, Thermo Fisher Scientific)的RPMI培養基添加至細胞中以誘導內胚層。在分化的第1天，從該培養基中去除CHIR99021。第5天，用補充有10 ng/ml FGF4、10 ng/ml HGF、及0.2% B27補充劑的RPMI培養基啟動肝祖細胞形成，持續4天。第9天，藉由補充有10 ng/ml HGF、10 ng/ml抑瘤素M、10 -7M地塞米松、15 mM Hepes、1X ITS (41400045, Thermo Fisher Scientific)的Williams' E培養基誘導肝細胞成熟，直至第22天。 6.8 同種異體反應性細胞毒性 T 淋巴球 ( 同種異體 CTL) 所介導之殺傷測定
為評估HLA I類絲裂黴素C處理的野生型HeLa細胞的消融導致的T細胞抗性，使用野生型幹細胞衍生之內皮細胞作為飼養細胞來開發同種異體CTL。為進一步評估對HLA-II限制性T細胞的額外抗性，使用B2M剔除的B細胞系(Raji-A5)作為飼養細胞來開發HLA-II限制性同種異體CTL。對於同種異體CTL的開發，將飼養細胞製備為濃度為4x10 5個細胞/mL的細胞懸液，並用絲裂黴素C (50 µg/mL)於37℃處理10分鐘。然後，將細胞用RPMI-1640基礎培養基沖洗，並旋轉沉降5次以完全去除絲裂黴素C。然後將原代人類初始CD8+ T細胞與絲裂黴素C處理的飼料細胞以2.5:1之比率共培養8天至10天。每三天藉由移除一半體積的培養基並添加相同體積的含有20單位/mL IL-2的新鮮培養基（補充有10% FBS、1%青黴素/鏈黴素、1x GlutaMax的RPMI-1640培養基）進行培養基交換。10天後，收集T細胞並與新鮮製備的飼養細胞以2.5:1之比率共培養8天至10天，以進一步富集同種異體CTL。經過2輪開發後，將同種異體CTL用於同種異體CTL殺傷測定或於-80℃凍存。
將xCELLigence即時細胞分析(RTCA)系統(Agilent)及Celltiter-glo ®2.0測定(Promega, G9241)用於評估殺傷測定的細胞裂解，使用貼壁細胞（例如經編輯之HeLa、iPS、或ES細胞）作為標靶細胞。簡而言之，將細胞以15,000個細胞/孔（HeLa細胞）或35,000個細胞/孔（iPS或ES細胞）之密度接種到RTCA E-Plate 96（基於RTCA的測定）或正常96孔盤(Celltiter-glo)上。一天後，將同種異體CTL效應細胞以不同的效應與標靶(E-to-T)比率添加至各孔中。對於基於RTCA的測定，即時系統監測細胞指數並自動計算%細胞裂解；對於Celltiter-glo測定，%細胞裂解係藉由以下公式計算： %細胞裂解= （（無生物發光效應物–生物發光效應物）/無生物發光效應物） X 100
將Celltiter-glo ®2.0測定(Promega, G9241)用於評估殺傷測定的細胞裂解作用，使用經編輯之Raji細胞作為標靶細胞。簡而言之，將HLA-II限制性同種異體CTL（藉由HLA I類消融的Raji-A5細胞刺激）與HLA I及II類消融的細胞（其中CIITA、RFXAP、或RFXANK基因基於Raji-A5系被進一步敲除）共培養24小時。然後按照製造商之說明進行Celltiter-glo ®2.0測定。%細胞裂解係藉由上述公式進行計算。 6.9 基因剔除
CRISPR基因編輯係根據標準方案進行。將購自IDT的Alt-R ™S.p.Cas9核酸酶V3用於所有CRISPR實驗。用於基因剔除的標靶序列係如 表 5中所示。 表 5 ：用於基因剔除的標靶序列
描述 SEQ ID NO: 參考 序列
HeLa及Raji細胞中B2M剔除的標靶序列 1 B2MKOtg1 AAGATTCAGGTTTACTCACG
HeLa細胞中TAP1剔除的標靶序列 2 TAP1KOtg1 CGGAGCTTCTCTCGCATGGC
HeLa細胞中TAP2剔除的標靶序列 3 TAP2KOtg1 TGGTGGACGCGGCTTTACTG
Raji細胞或Raji衍生之細胞中CIITA剔除的標靶序列 4 CIITAKOtg1 AGATTGAGCTCTACTCAGGT
Raji細胞或Raji衍生之細胞中RFXAP剔除的標靶序列 5 RFXAPKOtg2 GTTAGACACTTCGGACCCTC
Raji細胞或Raji衍生之細胞中RFXANK剔除的標靶序列 6 RFXANKKOtg1 CTCTCACCAACCGGCAGCGA
SA121及SA121衍生之殖株中β2M靶向敲入的標靶序列 7 B2M_5UTR_tg AGTGGAGGCGTCGCGCTGGC
SA121及SA121衍生之殖株中RFXAP靶向敲入的標靶序列 8 RFXAP_5UTR_tg CCGGCCAGGTCTTAGCAGCA
使用TrypLE ™Express酶(Gibco)將HeLa細胞從培養板上分離，以350 g旋轉沉降5分鐘，並使用DPBS進行沖洗。將細胞以400,000個細胞/mL之密度重懸於含有10% FBS的DMEM培養基(Gibco)中。靶向TAP1、TAP2、或B2M（標靶序列見表2）的Alt-R ™CRISPR sgRNA、以及Alt-R ™S.p.Cas9核酸酶V3係購自Integrated DNA Technologies (IDT)。為了在24孔盤的孔中進行實驗，將含有相關sgRNA的核糖核蛋白(RNP)複合體於室溫在25 µL opti-MEM培養基中孵育5分鐘，然後與含有3 uL Lipofectamine ™RNAiMAX轉染試劑(Invitrogen 13778075)的25 µL opti-MEM培養基混合。將混合溶液於室溫孵育10分鐘至15分鐘，然後添加至500 uL HeLa細胞懸液中。將含有最終濃度係10 nM Cas9及10 nM sgRNA的充分混合的細胞懸液接種到24孔盤的孔中，並培養24小時至48小時，然後進行培養基交換。經過5天常規培養及傳代後，可評定經工程改造之細胞的HLA I類表現。
將iPSC或ES細胞(SA121)以50,000個細胞/孔之密度接種於玻連蛋白(VTN-N, Gibco)包被之24孔盤上。48小時後，當細胞達到約70%匯合時，進行CRISPR組分之轉染。為了進行實驗，將含有相關sgRNA的核糖核蛋白(RNP)複合體於室溫在25 µL opti-MEM培養基中孵育5分鐘，然後與含有3 uL Lipofectamine ™RNAiMAX轉染試劑(Invitrogen 13778075)或Lipofectamine ™幹細胞轉染試劑(Invitrogen STEM00001)的25 µL opti-MEM培養基混合。將混合溶液於室溫孵育10分鐘至15分鐘，然後添加至含有500 uL新鮮StemFlex培養基(Gibco A3349401)的幹細胞之孔中，該培養基含有10 ug/mL Rock抑制劑(Y-27632, StemCell technologies Y-27632)。將細胞在含有最終濃度為10 nM Cas9及10 nM sgRNA的充分混合的培養基中培養24小時，然後用500 uL新鮮StemFlex培養基進行培養基交換。
從正常培養物中收集Raji細胞，並以500,000至1,000,000個細胞/80 uL的密度重懸於Lonza SG 4D-Nucleofector ™X溶液(Lonza V4XC-3024)中。為轉染CRISPR組分，將含有大約25 µM相關sgRNA及20 µM Cas9的核糖核蛋白(RNP)複合體於室溫孵育10分鐘，然後與細胞懸液充分混合。然後將細胞溶液轉移至Lonza Single Nucleocutte ™，並使用Lonza 4D-Nucleofector按照預先定義的方案進行電穿孔。電穿孔後，將細胞轉移至含有1 mL/孔的含10% FBS的RPMI-1640培養基的24孔盤中，以進一步回收及常規培養。 7 實例2 ： 降低細胞毒性T 細胞所介導之免疫 7.1HLA I 類所介導之同種異體免疫
為確定產生低免疫原性細胞所需之最小修飾，將HeLa細胞藉由CRISPR基因編輯進行修飾，以降低TAP1、TAP2、或β2M之表現（gRNA標靶序列係提供於 表 5中）。在編輯後測量HeLa細胞中的HLA-A、HLA-B、及HLA-C表現。與野生型HeLa細胞相比，基因的單獨缺失/剔除降低了經修飾之HeLa細胞中的HLA-A/B/C表現，如藉由流式細胞術所測量（ 圖 1）。與野生型/未經修飾之HeLa細胞相比，內源性β2M基因的缺失/剔除最大程度地降低了經修飾之HeLa細胞中的HLA-A/B/C表現（ 圖 1）。令人驚訝的是，單獨剔除β2M有效消除了HLA-A/B/C表現。這些資料證明，β2M基因表現之缺失足以消除HLA-A/B/C表現，而無需對細胞進行進一步修飾。
β2M剔除導致細胞表面HLA A/B/C表現的消除，轉化為經修飾之HeLa細胞對同種異體反應性CD8 T細胞(CTL)所介導之細胞殺傷的降低之敏感性。剔除β2M保護經修飾之HeLa細胞免受CTL所介導之細胞裂解（ 圖 2）。因此，單獨剔除β2M即足以使經修飾之細胞耐受CTL所介導之免疫。令人驚訝的是，TAP2或TAP1剔除不能保護細胞免受HLA I類特異性CTL所介導之免疫。 7.2HLA II 類所介導之同種異體免疫
HeLa細胞經修飾以降低RFXAP-、RFXANK、及CIITA之表現。在IFN-γ刺激之存在下評定HLA-II表現。RFXAP-及RFXANK-KO而非CIITA-KO導致降低的經典HLA I類分子(HLA A/B/C)之表現。CIITA-、RFXAP-、或RFXANK-KO在IFN-γ刺激之存在下皆導致降低的HLA II類(HLA-DR)表現（ 圖 3）。CIITA、RFXAP、或RFXANK-KO亦導致天然HLA II類陽性細胞類型Raji-A5細胞中的HLA-DR表現的類似的降低（ 圖 4A）。CIITA-、RFXAP-、或RFXANK-KO以相似之位準降低HLA-II限制性同種異體CTL所介導之細胞殺傷（ 圖 4B）。因此，單獨剔除CIITA、RFXAP、或RFXANK中之任一者保護細胞免受HLA II類特異性殺傷。 8 實例3 ：降低NK 細胞所介導之免疫
對iPSC進行修飾以剔除β2M之表現（使用CRISPR-Cas9基因編輯），並經由慢病毒轉導過表現HLA-E、HLA-G、或CD47。證明了在β2M剔除之背景下的HLA-E及HLA-G過表現（ 圖 5）。
CD47通常用於誘導針對NK細胞所介導之同種異體免疫的免疫耐受性。令人驚訝的是，外源性HLA-E蛋白及外源性HLA-G蛋白之組合的過表現比CD47基因及HLA-E基因之組合的過表現以更大程度保護免受NK細胞所介導之細胞裂解的影響（ 圖 6）。此外，令人驚訝的是，HLA-E及HLA-G過表現的免疫耐受效應係非冗餘的及協同的，使得僅HLA-E及HLA-G之組合的過表現消除NK細胞所介導之同種異體免疫，而無需在該測定中額外過表現CD47基因。然而，該免疫耐受策略需要使用兩個單獨的過表現載體，分別編碼外源性HLA-E蛋白及HLA-G蛋白。 9 實例4 ：截短的HLA-E 改善NK 抑制效力
為進一步改善經修飾之細胞的NK逃避能力，本發明人類對HLA-E的新組態進行了工程改造，亦即「截短的HLA-E」：HLA-E-C1及HLA-E-C2。HLA-E及截短的HLA-E之序列係顯示於 表 2及 表 3中。HLA-E-C1比HLA-E-C2截短更多，且包含3個胺基酸殘基取代。截短的HLA-E之結構係顯示於 圖 7中。截短的HLA-E在iPSC中成功表現（ 圖 8）。
令人驚訝的是，截短的HLA-E-C2在逃避NK所介導之免疫方面比全長HLA-E更有效（ 圖 9）。將截短的HLA-E-C2抑制NK免疫的能力與HLA-G/HLA-E組合進行比較。HLA-E-C2在抑制NK誘導之細胞裂解方面與HLA-E/HLA-G組合一樣有效。使用HLA-E-C2而不過表現HLA-G具有降低所需之細胞修飾量的優勢。與HLA-G/HLA-E組合相比，在HLA-E/HLA-G組合中添加CD47並未給NK免疫逃避提供任何額外的益處（ 圖 9）。
亦測試替代性經修飾之HLA分子改善NK抗性的能力，亦即「HLA-E-C1」，其中截短的HLA-E細胞質鏈的剩餘序列亦經過修飾。然而，雖然與未經修飾之HLA-E相比，HLA-E-C2顯示出改善NK抗性的益處，但令人驚訝的是，HLA-E-C1無該益處（ 圖 10）。這些資料證明截短的細胞質域的序列與HLA-E功能相關。 10 實例5 ：多能低免疫原性幹細胞
HLA II類通常僅在抗原呈現細胞(APC)中表現，而不在其他體細胞或幹細胞中表現。HLA II類可在發炎後（例如用IFN-γ刺激後）被誘導。在IFN-γ處理後，在胚胎幹細胞中觀察到最低程度的HLA II類表現。作為陽性對照，使經修飾及未經修飾之ESC分化為內皮細胞，並用IFN-γ處理，以評定修飾對誘導HLA II類表現的影響。將胚胎幹細胞系(SA121)藉由剔除β2M及RFXAP進行修飾，且用於過表現HLA-E及CD47（殖株1E11）（gRNA標靶序列係提供於 表 5中）。如先前在HeLa細胞中所證明的，β2M剔除消除了HLA I類(HLA-A/B/C)在經修飾之細胞中的表現（ 圖 11）。
與對照細胞相比，RFXAP KO細胞分化為內皮(CD144 +)細胞在IFN-γ刺激後未顯示HLA II類表現。特定而言，RFXAP剔除降低了HLA II類（HLA-DP、DQ、及DR）回應於IFN-γ刺激的表現（ 圖 12）。此外，使用EF1α啟動子成功地過表現HLA-E及CD47，且在分化後保留過表現（ 圖 12）。
已藉由β2M剔除、RFXAP剔除、以及HLA-E及CD47過表現修飾的幹細胞(ESC)對引發之同種異體反應性T細胞殺傷（ 圖 13）及NK細胞殺傷（ 圖 14）具有抗性。
經修飾之細胞亦保留其多能性，且能夠如對照野生型或未經修飾之細胞一樣分化為內胚層、中胚層、及外胚層（ 圖 15）。
經修飾之細胞能夠進一步分化為心肌細胞，如藉由NKX2.5及TNNT2表現所測量（ 圖 16）。分化為肝細胞後，細胞保留免疫耐受基因CD47及HLA-E之過表現（ 圖 17）。
經修飾之細胞亦能夠分化為肝細胞，如藉由ASGPR1表現（一種成熟的肝細胞標記物）所測量（ 圖 18）。分化為肝細胞後，細胞保留免疫耐受基因CD47及HLA-E之過表現（ 圖 19）。 11 實例5 ：實施例
以下條項定義本揭露之實施例。 條項1)      一種經修飾之人類白血球抗原(HLA)-E重鏈多肽，其相對於野生型HLA-E重鏈多肽包含截短的細胞質域。 條項2)      如條項1之經修飾之HLA-E重鏈多肽，其中該野生型HLA-E重鏈分子具有與SEQ ID NO: 10同一的胺基酸序列，或與該序列相比包含1、2、或3個胺基酸取代。 條項3)      如條項1或2之經修飾之HLA-E重鏈多肽，其中該截短的細胞質域與HLA-E重鏈野生型細胞質域相比被截短至少21個胺基酸殘基，可選地其中該截短的細胞質域與HLA-E野生型細胞質域相比被截短21個胺基酸殘基。 條項4)      如前述條項中任一項之經修飾之HLA-E重鏈多肽，其中該HLA-E重鏈野生型細胞質域由與SEQ ID NO: 15同一的胺基酸序列所組成，或與該序列相比包含1、2、或3個胺基酸取代。 條項5)      如前述條項中任一項之經修飾之HLA-E重鏈多肽，其中該截短的細胞質域包含由小於8個胺基酸殘基所組成之胺基酸序列。 條項6)      如前述條項中任一項之經修飾之HLA-E重鏈多肽，其中該截短的細胞質域包含約6個胺基酸殘基或由約6個胺基酸殘基所組成。 條項7)      如前述條項中任一項之經修飾之HLA-E重鏈多肽，其中該截短的細胞質域之該胺基酸序列由與SEQ ID NO: 17或其功能片段至少70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的胺基酸序列所組成，可選地其中該截短的細胞質域之該胺基酸序列由與SEQ ID NO: 17 100%同一的胺基酸序列所組成，或與該序列相比包含1、2、或3個胺基酸取代。 條項8)      如前述條項中任一項之經修飾之HLA-E重鏈多肽，其中該截短的細胞質域之該胺基酸序列由胺基酸序列RAASSD所組成，或與該序列相比包含1、2、或3個胺基酸取代。 條項9)      如前述條項中任一項之經修飾之HLA-E重鏈多肽，其中該HLA-E多肽包含與SEQ ID NO: 14或其功能片段至少70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一、可選地與SEQ ID NO: 14 100%同一的胺基酸序列，或與該序列相比包含1、2、或3個胺基酸取代。 條項10)    如前述條項中任一項之經修飾之HLA-E重鏈多肽，其單離自身體。 條項11)    如前述條項中任一項之經修飾之HLA-E重鏈多肽，其中該經修飾之HLA-E重鏈多肽係人類多肽，且該野生型HLA-E重鏈多肽係人類多肽。 條項12)    一種經修飾之HLA-E蛋白，其包含如條項1至11中任一項之經修飾之HLA-E重鏈多肽。 條項13)    如條項12之經修飾之HLA-E蛋白，其包含β‐2微球蛋白(β2M)多肽。 條項14)    如條項13之經修飾之HLA-E蛋白，其中該β2M多肽具有與SEQ ID NO: 18至少70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的胺基酸序列，可選地其中該β2M多肽具有與SEQ ID NO: 18 100%同一的胺基酸序列，或與該序列相比包含1、2、或3個胺基酸取代。 條項15)    如條項12至14中任一項之經修飾之HLA-E蛋白，其包含結合肽，該結合肽具有與SEQ ID NO: 28至少70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的胺基酸序列，可選地其中該結合肽具有與SEQ ID NO: 28 100%同一的胺基酸序列，或與該序列相比包含1、2、或3個胺基酸取代。 條項16)    一種載體，其編碼如條項1至11中任一項之經修飾之HLA-E重鏈多肽、或如條項12至15中任一項之經修飾之HLA-E蛋白。 條項17)    一種載體，其包含與SEQ ID NO: 23至少70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一、可選地與SEQ ID NO: 23 100%同一的多核苷酸序列，或與該序列相比包含1、2、或3個胺基酸取代。 條項18)    一種經修飾之細胞，其中該經修飾之細胞表現如條項12至15中任一項之經修飾之HLA-E蛋白。 條項19)    如條項18之經修飾之細胞，其中該經修飾之HLA-E蛋白在該細胞之表面上表現，可選地如藉由流式細胞術所測量。 條項20)    一種經修飾之細胞，其包含如條項16或17之載體。 條項21)    如條項18至20中任一項之經修飾之細胞，其相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，包含缺失或減少的內源性β2M基因之表現，及/或包含在細胞表面上缺失或減少的內源性HLA I類蛋白之表現，可選地包含在該細胞表面上缺失或減少的HLA-A、HLA-B及HLA-C蛋白之表現，可選地如藉由流式細胞術所測量。 條項22)    如條項18至21中任一項之經修飾之細胞，其相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，包含引入或增加的外源性HLA-G蛋白之表現，可選地其中該外源性HLA-G蛋白係在該細胞表面上表現，可選地如藉由流式細胞術所測量，或其中該經修飾之細胞相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，不包含引入或增加的外源性HLA-G蛋白之表現。 條項23)    如條項18至22中任一項之經修飾之細胞，其包含編碼如條項12至15中任一項之HLA-E蛋白的外源性多核苷酸。 條項24)    如條項18至23中任一項之經修飾之細胞，其包含編碼HLA-G蛋白的外源性多核苷酸。 條項25)    如條項24之經修飾之細胞，其中該HLA-G蛋白包含與SEQ ID NO: 11或其功能片段至少70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的胺基酸序列，可選地其中該HLA-G多肽包含與SEQ ID NO: 11 100%同一的胺基酸序列，或與該序列相比包含1、2、或3個胺基酸取代，可選地該其中HLA-G蛋白包含單鏈結合肽，該單鏈結合肽具有與SEQ ID NO: 29至少70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、可選地與SEQ ID NO: 29 100%同一的胺基酸序列，或與該序列相比包含1、2、或3個胺基酸取代。 條項26)    如條項18至25中任一項之經修飾之細胞，其中相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞包含缺失或減少的II類主要組織相容性複合體反式活化子(CIITA)基因之表現。 條項27)    如條項18至26中任一項之經修飾之細胞，其中相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞包含缺失或減少的調節因子X相關聯之含錨蛋白蛋白(RFXANK)基因之表現。 條項28)    如條項18至27中任一項之經修飾之細胞，其中相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞包含缺失或減少的調節因子X相關聯之蛋白(RFXAP)基因之表現。 條項29)    如條項18至28中任一項之經修飾之細胞，其中相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞包含缺失或減少的CIITA基因、及RFXANK基因、或RFXAP基因之表現。 條項30)    如條項18至29中任一項之經修飾之細胞，其中相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞包含缺失或減少的CIITA基因、RFXANK基因、及RFXAP基因之表現。 條項31)    如條項26至30中任一項之經修飾之細胞，其中相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞包含引入或增加的CD47基因之表現。 條項32)    如條項26至31中任一項之經修飾之細胞，其中相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞包含引入或增加的CD47多肽之表現。 條項33)    如條項32之經修飾之細胞，其中該CD47多肽包含與SEQ ID NO: 12或其功能片段至少70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一、可選地與SEQ ID NO: 12 100%同一的胺基酸序列，或與該序列相比包含1、2、或3個胺基酸取代。 條項34)    如條項26至30中任一項之經修飾之細胞，其中相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞不包含引入或增加的CD47基因之表現。 條項35)    如條項31至34中任一項之經修飾之細胞，其中該CD47基因係人類基因。 條項36)    如條項26至35中任一項之經修飾之細胞，其中相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞不包含缺失或減少的CD24基因、CD74基因、CIITA基因、HLA-A基因、HLA-B基因、HLA-C基因、MIC-1基因、MIC-2基因、NLRC5基因、RFX5基因、RFXAP基因、TAP1基因、TAP2基因、Tapasin基因、TXNIP、及/或RFXANK基因之表現。 條項37)    如條項26至36中任一項之經修飾之細胞，其中相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞不包含增加或引入的C1-抑制劑基因、CD24基因、CD46基因、CD55基因、CD59基因、CR1基因、CTLA-4-Ig基因、MANF基因、TNFAIP3基因、PD-L1基因、GGTA1基因、CMAG基因、SLA-1α鏈基因、及/或B4galNT2基因之表現。 條項38)    如條項26至37中任一項之經修飾之細胞，其中相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞不包含增加或引入的GGTA1基因、CMAH基因、B4galNT2基因、及SLA-1α鏈基因之表現。 條項39)    如條項26至38中任一項之經修飾之細胞，其中該經修飾之細胞係哺乳類細胞。 條項40)    如條項26至39中任一項之經修飾之細胞，其中該經修飾之細胞係人類細胞。 條項41)    如條項26至39中任一項之經修飾之細胞，其中該經修飾之細胞非豬細胞。 條項42)    如條項26至41中任一項之經修飾之細胞，其中該經修飾之細胞係未分化細胞。 條項43)    如條項26至42中任一項之經修飾之細胞，其中該經修飾之細胞能夠自我更新。 條項44)    如條項26至43中任一項之經修飾之細胞，其中該經修飾之細胞係幹細胞。 條項45)    如條項26至44中任一項之經修飾之細胞，其中該經修飾之細胞係多能幹細胞。 條項46)    如條項26至45中任一項之經修飾之細胞，其中該經修飾之細胞係胚胎幹細胞(ESC)。 條項47)    如條項26至46中任一項之經修飾之細胞，其中在分化為不同細胞類型後，該經修飾之細胞保留一或多種修飾。 條項48)    如條項26至47中任一項之經修飾之細胞，其中該細胞係誘導性多能幹細胞(iPSC)。 條項49)    如條項48之經修飾之細胞，其中該細胞係多潛能幹細胞。 條項50)    如條項46之經修飾之細胞，其中該細胞係造血幹細胞(HSC)。 條項51)    如條項26至41中任一項之經修飾之細胞，其中該細胞係分化細胞。 條項52)    如條項26至51中任一項之經修飾之細胞，其中該經修飾之細胞係經單離細胞。 條項53)    如條項26至52中任一項之經修飾之細胞，其中該經修飾之細胞係經工程改造之細胞。 條項54)    如條項26至53中任一項之經修飾之細胞，其中該經修飾之細胞已經體外修飾或工程改造。 條項55)    如條項26至53中任一項之經修飾之細胞，其中該經修飾之細胞已經離體修飾或工程改造。 條項56)    如條項26至55中任一項之經修飾之細胞，其中該經修飾之細胞不存在於自然界中。 條項57)    如條項26至56中任一項之經修飾之細胞，其中相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞在用IFN-γ刺激後包含降低的HLA II類蛋白表現，可選地其中HLA II類蛋白表現係藉由流式細胞術所判定。 條項58)    如條項26至57中任一項之經修飾之細胞，其中相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞在用IFN-γ刺激後包含降低的HLA-DR、HLA-DQ、及/或HLA-DR表現，可選地如藉由流式細胞術所判定。 條項59)    如條項26至58中任一項之經修飾之細胞，其中相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞包含降低的HLA I類表現，可選地如藉由流式細胞術所判定。 條項60)    如條項26至59中任一項之經修飾之細胞，其中該經修飾之細胞不表現HLA I類蛋白，可選地如藉由流式細胞術所判定。 條項61)    如條項26至60中任一項之經修飾之細胞，其中相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞包含增加的HLA-G蛋白之表現，可選地如藉由流式細胞術所判定。 條項62)    如條項26至61中任一項之經修飾之細胞，其中相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞包含降低的HLA-A、B、及C蛋白表現，可選地如藉由FACS所判定。 條項63)    如條項26至62中任一項之經修飾之細胞，其中該經修飾之細胞不表現HLA-A、B、或C蛋白，可選地如藉由FACS所判定。 條項64)    如條項26至63中任一項之經修飾之細胞，其中相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞對同種異體細胞毒性淋巴球所介導之殺傷具有抗性，可選地如藉由基於即時之殺傷檢定所判定。 條項65)    如條項26至64中任一項之經修飾之細胞，其中相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該細胞對同種異體NK細胞細胞裂解具有抗性，可選地如藉由基於即時之殺傷檢定所判定。 條項66)    如條項26至65中任一項之經修飾之細胞，其中該經修飾之細胞係低免疫原性的。 條項67)    如條項26至66中任一項之經修飾之細胞，其中該經修飾之細胞不活化NK細胞所介導之免疫，可選地如藉由基於即時之殺傷檢定所判定。 條項68)    如條項26至67中任一項之經修飾之細胞，其中該經修飾之細胞不活化NK細胞、T細胞、及/或巨噬細胞所介導之免疫。 條項69)    如條項26至68中任一項之經修飾之細胞，其中相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞尚未經修飾以對複製性老化(RRS)具有抗性。 條項70)    如條項26至69中任一項之經修飾之細胞，其中相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該細胞已經修飾以相對於相同類型的野生型細胞缺失或降低週期蛋白依賴性激酶抑制劑2A (CDKN2A)、週期蛋白依賴性激酶抑制劑2B (CDKN2B)、及/或S-甲基-5'-硫基腺苷磷酸化酶(MTAP)之表現。 條項71)    如條項26至70中任一項之經修飾之細胞，其中相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞已經修飾以缺失或降低T細胞受體α恆定區(TRAC)之表現。 條項72)    如條項26至71中任一項之經修飾之細胞，其中相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞尚未經修飾以增加B細胞淋巴瘤特大(Bcl-xL)或B細胞淋巴瘤2 (Bcl-2)之表現。 條項73)    如條項26至72中任一項之經修飾之細胞，其中相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞尚未經修飾以缺失或降低分化簇38 (CD38)之表現。 條項74)    如條項26至73中任一項之經修飾之細胞，其中相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞尚未經修飾以缺失或降低分化簇38 (CD38)、及/或磷酸酶及張力蛋白同源物(PTEN)之表現。 條項75)    如條項26至74中任一項之經修飾之細胞，其中引入或增加的基因表現係藉由流式細胞術、西方墨點法、qPCR、或免疫螢光所判定。 條項76)    如條項26至75中任一項之經修飾之細胞，其中缺失或減少的基因表現係藉由流式細胞術、西方墨點法、qPCR、或免疫螢光所判定。 條項77)    如條項26至76中任一項之經修飾之細胞，其中引入或增加的該HLA-E基因及該HLA-G基因之表現係藉由流式細胞術所判定。 條項78)    如條項26至77中任一項之經修飾之細胞，其中β2M基因表現係藉由包含對細胞進行基因編輯的方法而缺失或減少。 條項79)    如條項26至78中任一項之經修飾之細胞，其中該基因編輯包含CRISPR-Cas9。 條項80)    如條項26至79中任一項之經修飾之細胞，其中該基因編輯包含TALEN。 條項81)    一種細胞群體，其包含如條項26至80中任一項之經修飾之細胞。 條項82)    一種醫藥組成物，其包含如條項26至80中任一項之經修飾之細胞、或如條項81之細胞群體。 條項83)    如條項82之醫藥組成物，其包含醫藥賦形劑。 條項84)    一種製造醫藥組成物的方法，其包含將如條項26至80中任一項之經修飾之細胞與醫藥賦形劑組合。 條項85)    一種如條項26至60中任一項之經修飾之細胞在製造用於治療或預防對象之疾病之藥劑中的用途。 條項86)    一種用於製造經修飾之細胞的方法，其包含將如條項1至11中任一項之經修飾之HLA-E重鏈多肽、或如條項11至15中任一項之經修飾之HLA-E蛋白之表現引入細胞中。 條項87)    如條項86之方法，其包含消除或減少β2M基因的一個或兩個等位基因在該細胞中之表現。 條項88)    如條項86或87之方法，其包含可選地藉由基因編輯、可選地藉由CRISPR-cas9基因編輯消除CIITA、RFXANK、及/或RFXAP基因的兩個等位基因在該細胞中之表現。 條項89)    如條項86至88中任一項之方法，其中該經修飾之細胞係幹細胞，可選地係胚胎幹細胞或誘導性多能幹細胞。 條項90)    如條項89之方法，其包含將該細胞分化為祖細胞、終末分化細胞、或體細胞。 條項91)    如條項86至88中任一項之方法，其中該經修飾之細胞係祖細胞、終末分化細胞、或體細胞。 條項92)    一種經修飾之細胞，其中該經修飾之細胞係根據如條項86至91中任一項之方法所製造。 條項93)    一種載體，其使用於如條項86至92中任一項之方法中，可選地其中該載體係慢病毒載體。 條項94)    如條項93之慢病毒載體，其中該慢病毒載體係腺病毒載體。 條項95)    如條項93或94之慢病毒載體，其中該慢病毒載體包含具有對應於SEQ ID NO: 1至8中任一項之核苷酸序列的gRNA。 條項96)    一種治療或預防有需要之對象之疾病的方法，該方法包含向該對象投予如條項15至42中任一項之經修飾之細胞、或衍生自如條項15至42中任一項之經修飾之細胞的分化細胞、後代、子細胞、或細胞群體。 條項97)    如條項96之方法，其中該經修飾之細胞係衍生自非單離自該對象的細胞。 條項98)    一種治療或預防對象的疾病的方法，該方法包含：根據如條項86至92中任一項之方法體外生產經修飾之細胞，以及向該對象投予經修飾之細胞。 條項99)    一種醫藥組成物，其用於如條項98之方法中，其中該醫藥組成物包含如條項15至42中任一項之經修飾之細胞、以及醫藥賦形劑。 參考文獻
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無
［ 圖 1］ ： TAP1 、 TAP2 、及 B2M 剔除對 HLA A/B/C 表現的影響HLA I類相關基因(TAP1, TAP2, β2M)基因編輯後經典HLA I類分子的細胞表面表現。單獨剔除β2M有效消除了HLA-A/B/C表現。KO：剔除。WT：野生型。 ［ 圖 2］ ：經修飾之 HeLa 細胞的同種異體反應性細胞毒性 T 淋巴球 ( 同種異體 CTL) 依賴性細胞裂解作用（基於螢光素酶的殺傷檢定）如藉由基於螢光素酶的殺傷檢定(xCelligence)測量T細胞所介導之殺傷。剔除β2M保護經修飾之HeLa細胞免受細胞毒性T細胞(CTL)所介導之細胞裂解的影響。KO：剔除；MFI：平均螢光強度；WT：野生型。使用衍生自兩個供體的同種異體CTL。 ［ 圖 3］ ：在 IFN-γ 刺激之存在或不存在下，天然非 HLA II 類陽性細胞類型（ HeLa 細胞）中的 HLA I 類及 HLA II 類表現。RFXAP-KO及RFXANK-KO而非CIITA-KO導致經典HLA I類表現(HLA A/B/C)之降低，如藉由流式細胞術所評定。在IFN-γ刺激之存在下，CIITA-KO、RFXAP-KO、或RFXANK-KO皆導致HLA II類表現(HLA-DR)降低。KO：剔除。 ［ 圖 4］ ：天然 HLA II 類陽性抗原呈現細胞中降低的 HLA II 類表現證明對 HLA II 類特異性同種異體反應性 CTL 殺傷的額外保護。［ 圖 4A］ ：具有β2M基因KO的HLA I類消融B細胞系中基因剔除後的HLA II類表現（Raji B2M-/-細胞，殖株A5）。［ 圖 4B］ ：藉由RFXANK、RFXAP、及CIITA降低HLA II類表現，導致對富含HLA II類特異性殺傷的同種異體反應性CTL的抗性增加。使用來自兩個供體的Raji B2M-/-細胞，殖株A5中富含的CTL。KO：剔除。C2TA：CIITA。細胞類型= Raji細胞。 ［ 圖 5］ ： HLA-E 及 HLA-G 過表現透過慢病毒轉導產生表現β2M-融合的HLA-E及HLA-G的B2M-KO iPSC系。藉由抗PE-HLA-E及抗APC-HLA-G抗體染色及流式分析確認HLA-E及HLA-G表面表現。 ［ 圖 6］ ： HLA-E 及 HLA-G 協同作用4個不同供體的經工程改造之幹細胞的NK殺傷。藉由XCELLigence檢定測量NK所介導之細胞裂解。針對各NK供體，使用1:2的E:T比。圖表表示將效應NK細胞添加至不同iPSC細胞後20小時處的資料。盒形圖示出7A中資料中所有供體的經工程改造之幹細胞的NK殺傷之分佈。 ［ 圖 7］ ：截短的 HLA-E 的工程改造及表現HLA-E及截短的細胞質域之結構。ECD：胞外域。TM：跨膜域。 ［ 圖 8］ ：截短的 HLA-E 在 iPSC 中之表現經修飾之HLA-E分子係在iPSC中表現。以1:20使用PE-HLA-E抗體，藉由流式細胞術評定表現。 ［ 圖 9］ ：截短的 HLA-E 改善 NK 逃避HLA-E-C2在逃避NK所介導之免疫方面比全長HLA-E更有效，如藉由經修飾之iPSC的NK誘導之細胞裂解（XCELLigence檢定）所測量。來自5個NK供體的資料。圖表表示將效應NK細胞添加至iPSC (ET: 1:2)後20小時的資料。CD47表現未比HLA-E/HLA-G組合更能改善NK逃避。 ［ 圖 10］ ：替代性經修飾之 HLA-E 對 NK 逃避的影響與野生型HLA-E相比，經修飾之HLA-E-C1未改善NK抗性。2x NK供體，NK誘導的細胞裂解（XCELLigence檢定），E:T=1:2。 ［ 圖 11］ ：經修飾之幹細胞系中的 β2M 及 HLA I 類表現流式細胞術評定β2M及HLA I類表現。經修飾之細胞：殖株1E11。對照細胞：SA121（胚胎幹細胞系）。 ［ 圖 12］ ：分化為內皮細胞後經修飾之幹細胞系中的 HLA II 類、 HLA-E 及 CD47 的表現經修飾之細胞：殖株1E11。對照細胞：SA121。未經修飾之野生型ESC源性CD144+內皮細胞經干擾素γ (IFNγ)處理後，誘導HLA II類表現。RFXAP KO USC源性CD144+內皮細胞在IFNγ處理後未證明HLA II類誘導。下圖：USC系中的HLA-E及CD47表現。 ［ 圖 13］ ：經修飾之幹細胞對同種異體反應性 CTL 所介導之細胞裂解的抗性CD8+ T細胞殺傷測定。已藉由β2M剔除、RFXAP剔除、以及HLA-E及CD47過表現修飾的幹細胞(ESC)對引發之同種異體反應性T細胞殺傷具有抗性，E:T = 4.1。E:T = 4.1。WT：野生型。 ［ 圖 14］ ：經修飾之幹細胞對同種異體反應性 NK 細胞殺傷的抗性已藉由β2M剔除、RFXAP剔除、以及HLA-E及CD47過表現修飾的幹細胞(ESC)對引發之同種異體反應性NK細胞殺傷具有抗性。NK細胞殺傷測定，E:T = 1:2。WT：野生型。 ［ 圖 15］ ：經修飾之幹細胞的多能性用β2M KO、RFXAP KO、HLA-E過表現、及CD47過表現修飾的通用幹細胞殖株(1E11)係經成功分化為內胚層、中胚層、及外胚層細胞。ESC：胚胎幹細胞。 ［ 圖 16］ ：經修飾之幹細胞分化為心肌細胞經修飾之細胞能夠分化為心肌細胞，如藉由NKX2.5及TNNT2表現所測量。第15天分化，代表性殖株。用B2M KO、RFXAP KO、HLA-E過表現、及CD47過表現修飾的通用幹細胞殖株(1E11)。WT：野生型；ESC：胚胎幹細胞。 ［ 圖 17］ ：經修飾之幹細胞分化為心肌細胞後穩定的 CD47 及 HLA-E 過表現用β2M KO、RFXAP KO、HLA-E過表現、及CD47過表現修飾的通用幹細胞系(1E11)。SA121：未經修飾之親代對照細胞。WT：野生型；ESC：胚胎幹細胞。 ［ 圖 18］ ：經修飾之幹細胞分化為肝細胞經修飾之細胞能夠分化為肝細胞，如藉由ASGPR1表現（一種成熟的肝細胞標記物）所測量。第22天分化。用β2M KO、RFXAP KO、HLA-E過表現、及CD47過表現修飾的通用幹細胞系(1E11)。WT：野生型。 ［ 圖 19］ ：經修飾之幹細胞分化為肝細胞後穩定的 CD47 及 HLA-E 過表現分化為肝細胞後，細胞保留免疫耐受基因CD47及HLA-E之過表現。第22天分化。用β2M KO、RFXAP KO、HLA-E過表現、及CD47過表現修飾的通用幹細胞系(1E11)。WT：野生型；heap：肝細胞。
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Claims (58)

  1. 一種經修飾之人類白血球抗原(human leukocyte antigen, HLA)-E重鏈多肽，其相對於野生型HLA-E重鏈多肽包含截短的細胞質域。
  2. 如請求項1之經修飾之HLA-E重鏈多肽，其中該野生型HLA-E重鏈分子具有與SEQ ID NO: 10同一的胺基酸序列。
  3. 如請求項1或2之經修飾之HLA-E重鏈多肽，其中該截短的細胞質域與HLA-E重鏈野生型細胞質域相比被截短至少21個胺基酸殘基，可選地其中該截短的細胞質域與HLA-E野生型細胞質域相比被截短21個胺基酸殘基。
  4. 如請求項3之經修飾之HLA-E重鏈多肽，其中該HLA-E重鏈野生型細胞質域由與SEQ ID NO: 15同一的胺基酸序列所組成。
  5. 如前述請求項中任一項之經修飾之HLA-E重鏈多肽，其中該截短的細胞質域包含由8個或更少的胺基酸殘基所組成之胺基酸序列。
  6. 如前述請求項中任一項之經修飾之HLA-E重鏈多肽，其中該截短的細胞質域包含約6個胺基酸殘基或由約6個胺基酸殘基所組成。
  7. 如前述請求項中任一項之經修飾之HLA-E重鏈多肽，其中該截短的細胞質域之該胺基酸序列由與SEQ ID NO: 17或其功能片段至少70%同一的胺基酸序列所組成，可選地其中該截短的細胞質域之該胺基酸序列由與SEQ ID NO: 17 100%同一的胺基酸序列所組成。
  8. 如前述請求項中任一項之經修飾之HLA-E重鏈多肽，其中該截短的細胞質域之該胺基酸序列由胺基酸序列RKKSSGGK所組成。
  9. 如前述請求項中任一項之經修飾之HLA-E重鏈多肽，其中該HLA-E重鏈多肽包含與SEQ ID NO: 14或其功能片段至少70%同一、可選地與SEQ ID NO: 14 100%同一的胺基酸序列。
  10. 如前述請求項中任一項之經修飾之HLA-E重鏈多肽，其單離自身體。
  11. 一種經修飾之HLA-E蛋白，其包含如請求項1至10中任一項之經修飾之HLA-E重鏈分子。
  12. 如請求項11之經修飾之HLA-E蛋白，其包含β‐2微球蛋白(β2M)。
  13. 如請求項11或12之經修飾之HLA-E蛋白，其包含具有與SEQ ID NO: 28至少70%同一、可選地與SEQ ID NO: 28 100%同一的胺基酸序列的單鏈肽。
  14. 一種載體，其編碼如請求項1至10中任一項之經修飾之HLA-E重鏈多肽、或如請求項11至13中任一項之經修飾之HLA-E蛋白。
  15. 一種經修飾之細胞，其中該經修飾之細胞表現如請求項11至13中任一項之經修飾之HLA-E蛋白。
  16. 如請求項15之經修飾之細胞，其中該經修飾之HLA-E蛋白在該細胞之表面上表現。
  17. 如請求項15或16之經修飾之細胞，其包含在該細胞表面上缺失或減少的內源性HLA I類蛋白之表現，可選地包含在該細胞表面上缺失或減少的HLA-A、HLA-B及HLA-C蛋白之表現，可選地如藉由流式細胞術所測量。
  18. 如請求項15至17中任一項之經修飾之細胞，其相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，包含缺失或減少的內源性β2M基因之表現。
  19. 如請求項15至18中任一項之經修飾之細胞，其相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，包含引入或增加的外源性HLA-G蛋白之表現，可選地其中該外源性HLA-G蛋白係在該細胞表面上表現，可選地如藉由流式細胞術所測量。
  20. 如請求項15至19中任一項之經修飾之細胞，其包含編碼如請求項1至10中任一項之經修飾之HLA-E重鏈多肽、或如請求項11至13中任一項之經修飾之HLA-E蛋白的外源性多核苷酸。
  21. 如請求項15至20中任一項之經修飾之細胞，其包含編碼HLA-G蛋白的外源性多核苷酸。
  22. 如請求項21之經修飾之細胞，其中該HLA-G蛋白包含重鏈，該重鏈包含與SEQ ID NO: 11或其功能片段至少70%同一的胺基酸序列。
  23. 如請求項15至22中任一項之經修飾之細胞，其中相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞包含缺失或減少的以下項之表現： a)     II類主要組織相容性複合體反式活化子(CIITA)基因， b)     調節因子X相關聯之含錨蛋白蛋白(RFXANK)基因，及/或 c)     調節因子X相關聯之蛋白(RFXAP)基因。
  24. 如請求項15至23中任一項之經修飾之細胞，其中該經修飾之細胞係哺乳類細胞。
  25. 如請求項15至24中任一項之經修飾之細胞，其中該經修飾之細胞係人類細胞。
  26. 如請求項15至25中任一項之經修飾之細胞，其中該經修飾之細胞係未分化細胞。
  27. 如請求項15至26中任一項之經修飾之細胞，其中該經修飾之細胞係幹細胞。
  28. 如請求項15至25中任一項之經修飾之細胞，其中該細胞係分化細胞。
  29. 如請求項28之經修飾之細胞，其中該細胞係T細胞。
  30. 如請求項15至29中任一項之經修飾之細胞，其中相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞在用IFN-γ刺激後包含在該細胞表面上降低的內源性HLA II類蛋白表現，可選地其中HLA II類蛋白表現係藉由流式細胞術所判定。
  31. 如請求項15至30中任一項之經修飾之細胞，其中相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞在用IFN-γ刺激後包含降低的HLA-DR、HLA-DQ、及/或HLA-DP表現，可選地如藉由流式細胞術所判定。
  32. 如請求項15至31中任一項之經修飾之細胞，其中相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞包含降低的內源性HLA I類蛋白之表現，可選地如藉由流式細胞術所判定。
  33. 如請求項15至32中任一項之經修飾之細胞，其中該經修飾之細胞在該細胞表面上不表現內源性HLA I類蛋白，可選地如藉由流式細胞術所判定。
  34. 如請求項15至33中任一項之經修飾之細胞，其中相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞包含在該細胞表面上增加的HLA-G蛋白之表現，可選地如藉由流式細胞術所判定。
  35. 如請求項15至34中任一項之經修飾之細胞，其中相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞包含在細胞表面上降低的HLA-A、B、及C多肽表現，可選地如藉由流式細胞術所判定。
  36. 如請求項15至35中任一項之經修飾之細胞，其中該經修飾之細胞在該細胞表面上不表現HLA-A、B、或C多肽表現，可選地如藉由流式細胞術所判定。
  37. 如請求項15至36中任一項之經修飾之細胞，其中相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該經修飾之細胞對同種異體細胞毒性淋巴球所介導之殺傷具有抗性，可選地如藉由基於即時之殺傷檢定所判定。
  38. 如請求項15至37中任一項之經修飾之細胞，其中相對於相同細胞類型的未經修飾之細胞，該細胞對同種異體NK細胞細胞裂解具有抗性，可選地如藉由基於即時之殺傷檢定所判定。
  39. 如請求項15至38中任一項之經修飾之細胞，其中該經修飾之細胞係低免疫原性的。
  40. 如請求項15至39中任一項之經修飾之細胞，其中該經修飾之細胞不活化NK細胞所介導之免疫，可選地如藉由基於即時之殺傷檢定所判定。
  41. 如請求項15至40中任一項之經修飾之細胞，其中該經修飾之細胞不活化NK細胞、T細胞、及/或巨噬細胞所介導之免疫。
  42. 如請求項15至41中任一項之經修飾之細胞，其中引入或增加的基因或蛋白質表現係藉由流式細胞術、西方墨點法、qPCR、或免疫螢光所判定。
  43. 如請求項15至42中任一項之經修飾之細胞，其中基因或蛋白質表現、或其缺乏係藉由流式細胞術、西方墨點法、qPCR、或免疫螢光所判定。
  44. 一種細胞群體，其包含如請求項15至43中任一項之經修飾之細胞。
  45. 一種醫藥組成物，其包含如請求項15至43中任一項之經修飾之細胞、或如請求項44之細胞群體。
  46. 如請求項45之醫藥組成物，其包含醫藥賦形劑。
  47. 一種製造醫藥組成物的方法，其包含將如請求項15至43中任一項之經修飾之細胞與醫藥賦形劑組合。
  48. 一種如請求項15至43中任一項之經修飾之細胞在製造用於治療或預防對象之疾病之藥劑中的用途。
  49. 一種用於製造經修飾之細胞的方法，其包含將如請求項1至10中任一項之經修飾之HLA-E重鏈多肽、或如請求項11至13中任一項之經修飾之HLA-E蛋白之表現引入細胞中。
  50. 如請求項49之方法，其包含消除或減少內源性β2M基因的一個或兩個等位基因在該細胞中之表現。
  51. 如請求項50之方法，其包含消除CIITA、RFXANK、及/或RFXAP基因的兩個等位基因在該細胞中之表現。
  52. 如請求項50或51之方法，其中該細胞係幹細胞，可選地係胚胎幹細胞。
  53. 一種經修飾之細胞，其中該經修飾之細胞係根據如請求項49至52中任一項之方法所製造。
  54. 一種載體，其使用於如請求項49至52中任一項之方法中。
  55. 一種治療或預防有需要之對象之疾病的方法，該方法包含向該對象投予如請求項15至43中任一項之經修飾之細胞、或衍生自如請求項15至43中任一項之經修飾之細胞的分化細胞、後代、子細胞、或細胞群體。
  56. 如請求項55之方法，其中該經修飾之細胞係衍生自非單離自該對象的細胞。
  57. 一種治療或預防對象之疾病的方法，該方法包含： a)     根據如請求項49至52中任一項之方法體外生產經修飾之細胞，以及 b)     向該對象投予該經修飾之細胞。
  58. 一種醫藥組成物，其用於如請求項55至57中任一項之方法中，其中該醫藥組成物包含如請求項15至43中任一項之經修飾之細胞、以及醫藥賦形劑。
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