TW202535417A - Ast-3424聯用治療白血病及淋巴瘤 - Google Patents

Abstract

治療方法，使用含有AST-3424、AST-3423或AST-2870及其鹽、酯、溶劑合物、同位素異構體的藥物與含有阿糖胞苷或柔紅黴素及其鹽、酯、溶劑合物、同位素異構體的藥物聯用治療白血病、淋巴瘤患者。在柔紅黴素或阿糖胞苷濃度遠低於其臨床用藥劑量的情況下，不必限定患者具有較高（過表達、過量）的AKR1C3蛋白或RNA表達，AST-3424與阿糖胞苷或柔紅黴素聯用對於白血病、淋巴瘤細胞體外增殖抑制作用仍然效果顯著，聯用對AKR1C3蛋白或RNA表達高低不同的細胞系均具有較好的體外增殖抑制作用。為此，上述聯用方案有望開發為治療白血病、淋巴瘤的新的治療方案，而不需要限制患者的AKR1C3酶表達水平。

Description

AST-3424聯用治療白血病及淋巴瘤

本發明涉及腫瘤的治療方法，特別是AST-3424與藥物聯用治療白血病及淋巴瘤，屬於腫瘤治療領域。

以過表達醛酮還原酶1C3（AKR1C3）為標靶的DNA烷化劑前藥AST-3424（WO2016145092，WO2017087428），CAS號為2097713-69-2，其結構如下： AST-3424的化學結構式

AST-3424（又名OBI-3424、TH-3424）進入癌細胞內被癌細胞過表達的AKR1C3酶活化而釋放代謝產物AST-2660（又名AST-2660）。AST-3424本身對癌細胞毒性較小，在其動物模型、體外藥理實驗中，其藥理效果均與AKR1C3酶表達相關：前藥AST-3424在AKR1C3酶、NADPH作用下代謝出AST-2660，酶的表達量與藥效正相關（Meng F, Li WF, Jung D, et al. A novel selective AKR1C3-activated prodrug AST-3424/OBI-3424 exhibits broad anti-tumor activity. Am J Cancer Res. 2021;11(7):3645-3659；Evans K, Duan J, Pritchard T, et al. OBI-3424, a Novel AKR1C3-Activated Prodrug, Exhibits Potent Efficacy against Preclinical Models of T-ALL. Clin Cancer Res. 2019;25(14):4493-4503. doi:10.1158/1078-0432.CCR-19-0551；Wang Y, Liu Y, Zhou C, et al. An AKR1C3-specific prodrug with potent anti-tumor activities against T-ALL. Leuk Lymphoma. 2020;61(7):1660-1668. doi:10.1080/10428194.2020.1728746；He P, Wang C, Wang Y, et al. A Novel AKR1C3 Specific Prodrug TH3424 With Potent Antitumor Activity in Liver Cancer [retracted in: Clin Pharmacol Ther. 2021 Jul;110(1):262]. Clin Pharmacol Ther. 2021，110(1):229-237. doi:10.1002/cpt.2171）。 AST-3424代謝為AST-2660（圖中2660）的化學反應式

在臨床試驗中（美國NCT03592264，去勢前列腺癌和肝癌；美國NCT04315324，T-ALLT淋巴細胞急性白血病；中國CTR20191399，各種實體瘤；CTR20201915，T淋巴細胞急性白血病和B淋巴細胞急性白血病）均包含探索AKR1C3與AST-3424藥物療效的關係，進一步的，在公開的I期臨床試驗結果（Safety, pharmacokinetics, and clinical activity of OBI-3424, an AKR1C3‑activated prodrug, in patients with advanced or metastatic solid tumors: A phase 1 dose-escalation study.J Clin Oncol 40, 2022 (suppl 16; abstr 3030)，DOI：10.1200/JCO.2022.40.16_suppl.3030）中顯示IHC方法檢測的AKR1C3表達分數（H-score）只有在高於一定的數值時，患者才有藥效回應，並決定在後續的臨床試驗中將挑選H-score大於或等於135的患者入組。

在聯用實驗中也重複了類似的結論，即AST-3424與阿比特龍聯用對於AKR1C3高表達的VCap細胞的CDX模型、與潑尼松龍聯用對於AKR1C3高表達的VCap細胞的CDX模型、與5-氟尿嘧啶聯用對於AKR1C3高表達的SNU-16細胞的CDX模型、與舒尼替尼聯用對於AKR1C3高表達的A498細胞的CDX模型、與吉西他濱聯用對於AKR1C3高表達的A498細胞的CDX模型均具有比單藥優異的療效（Meng F, Li WF, Jung D, et al. A novel selective AKR1C3-activated prodrug AST-3424/OBI-3424 exhibits broad anti-tumor activity. Am J Cancer Res. 2021;11(7):3645-3659）。

特別的最新的研究發現，AST-3424對於AKR1C3高表達的HCC細胞系HepG2、PLC/PRF/5均具有優異的抑制作用，而且在聯用奧沙利鉑（OXA）或5-氟尿嘧啶（5-Fu）後抑制作用更強，具有協同作用，通過不同實驗手段發現AST-3424單藥與OXA或5-Fu聯合療法可通過抑制細胞增殖、誘導S期細胞停滯、促進細胞凋亡誘導、抑制細胞轉移等方式，對肝癌細胞發揮體外抗腫瘤的協同作用：

通過West-bolt測試顯示其機制可能與P21蛋白的上調有關，而可能與β-連環蛋白（β-catenin）表達無關；

使用流式細胞術檢測不同階段細胞的百分比表明AST-3424單藥治療和與OXA或5-Fu的聯合治療可以阻斷S期的細胞，通過流式細胞術檢測AST-3424單藥治療和OXA或5-Fu聯合治療後細胞凋亡的誘導表明AST-3424單藥治療和與OXA或5-Fu的聯合治療可能通過上調Bax和Caspase3蛋白以及下調PARP蛋白來誘導細胞凋亡；

進行Transwell細胞遷移和侵襲試驗表明AST-3424單藥治療和OXA或5-Fu聯合治療可抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲，其機制可能與MMP-9蛋白的下調有關；

通過研究AST-3424單藥治療和OXA或5-Fu聯合治療對TGF-β信號通路的影響，實驗結果表明AST-3424單藥治療和OXA或5-Fu聯合治療可以通過抑制TGF-β信號通路來降低增殖效應，並且僅在AST-3424和OXA聯合使用時抑制作用顯著。

已有的研究均表明AST-3424發揮藥效的強弱均與AKR1C3酶表達相關，高表達AKR1C3酶的患者或者動物模型才具有較好藥效，並且已發表的藥物聯用（阿比特龍、潑尼松龍、5-氟尿嘧啶、舒尼替尼、奧沙利鉑）體外細胞增殖實驗、CDX動物模型也與AKR1C3酶表達相關。這些研究均顯示AST-3424無論單藥或聯用治療均需要患者的AKR1C3酶表達達到較高程度（通過試劑盒檢測，比如IHC/q-PCR方法）。

發明人在聯用研究中發現，AST-3424與阿糖胞苷或柔紅黴素聯用對於白血病、淋巴瘤細胞體外增殖抑制作用與細胞系的AKR1C3表達水平無關，聯用對表達高低不同的細胞系均具有較好的體外增殖抑制作用。為此，上述聯用方案有望開發為治療白血病、淋巴瘤的新的治療方案，而不需要根據先前研究文獻揭示的需要限制患者的AKR1C3酶過表達或高表達（常常對應較高的RNA定量值，較高的IHC的H-score打分）。

新的治療方案則較大幅度的降低了獲益患者的用藥門檻，檢測結果是陽性有表達即可以施用本聯用方案，只要醫學專用人員判定施用本方案進行治療對患者有獲益或獲益可能。

治療方法，使用含有AST-3424、AST-3423或AST-2870及其鹽、酯、溶劑合物、同位素異構體的藥物與含有阿糖胞苷或柔紅黴素及其鹽、酯、溶劑合物、同位素異構體的藥物聯用治療白血病、淋巴瘤患者。“AST-3424、AST-3423或AST-2870及其鹽、酯、溶劑合物、同位素異構體”是7個並列的選項，分別為AST-3424，AST-3423，AST-2870，AST-3424、AST-3423或AST-2870的鹽，AST-3424、AST-3423或AST-2870的酯，AST-3424、AST-3423或AST-2870的溶劑合物，AST-3424、AST-3423或AST-2870的同位素異構體。“阿糖胞苷或柔紅黴素及其鹽、酯、溶劑合物、同位素異構體”是6個並列的選項，分別為阿糖胞苷，柔紅黴素，阿糖胞苷或柔紅黴素的鹽，阿糖胞苷或柔紅黴素的酯，阿糖胞苷或柔紅黴素的溶劑合物，阿糖胞苷或柔紅黴素的同位素異構體。

AST-3424、AST-3423或AST-2870及其鹽、酯、溶劑合物、同位素異構體的製藥用途，其用於製備與含有柔紅黴素或阿糖胞苷及其鹽、酯、溶劑合物、同位素異構體的藥物聯用治療白血病或淋巴瘤的藥物。

根據專利WO2016145092，WO2017087428公開的數據，AST-3423為AST-3424的對映異構體，AST-3424為S構型，AST-3423為R構型，而AST-2870（TH2870）是消旋體，三者具有類似的AKR1C3酶活化性質，均在NADPH與AKR1C3作用下被催化並釋放出發揮藥效的細胞毒物質AST-2660。

關於本文所述藥物是指藥品或製劑，所製得的藥品包含特定劑量範圍的有效成分或其鹽、溶劑合物，和/或所製得的藥物為特定劑型、特定給藥方式施用。

所製得的藥品、藥物、製劑還可包含藥學上可接受的輔料或賦形劑。所述藥物可以為臨床施用的任何劑型，例如片劑、栓劑、分散片、腸溶片、咀嚼片、口崩片、膠囊、糖衣劑、顆粒劑、乾粉劑、口服溶液劑、注射用小針、注射用凍乾粉針或大輸液。根據具體劑型和施用方式，所述藥物中的藥學上可接受的輔料或賦形劑可以包括下述的一種或多種：稀釋劑、增溶劑、崩解劑、懸浮劑、潤滑劑、粘合劑、填充劑、矯味劑、甜味劑、抗氧化劑、表面活性劑、防腐劑、包裹劑、和色素等。

單藥，即單藥治療。聯用，即聯合用藥治療。單藥治療是指在一個療程中僅使用一種抗癌藥物。聯合治療是指在一個療程中同時或先後使用兩種或兩種以上的抗癌藥物。

一般而言，聯合治療需要根據病情特點、聯用藥物種類探索不同的給藥劑量、給藥週期，只有根據上述情況，探索得到的聯合用藥治療方案才可能取得較單一用藥治療好的治療效果。

單藥和聯用治療方案的藥物給藥劑量、給藥週期、給藥方案通過臨床試驗探索得到。

關於本文所述化合物，化學結構中含有機胺結構和P=O雙鍵結構，因此所述化合物還可能被以鹽的形式進行給藥，即本發明提供所示化合物的藥學上可接受的鹽，所述鹽可以為鹼式鹽，包括所述化合物與無機鹼（例如鹼金屬氫氧化物、鹼土金屬氫氧化物等）或與有機鹼（例如單乙醇胺、二乙醇胺或三乙醇胺等）形成的鹽。或者，所述鹽可以為酸式鹽，包括所述化合物與無機酸（例如鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硝酸、高氯酸、硫酸或磷酸等）或與有機酸（例如甲磺酸、三氟甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、富馬酸、草酸、馬來酸、檸檬酸等）形成的鹽。同理，其也有可能與某些酸或者醇發生反應而成為酯，因此所述化合物還可能被以酯的形式進行給藥。由於各種原因，這些化合物也可能會與某些溶劑形成溶劑合物，所述溶劑合物為水合物或醇合物，因此所述化合物還可能被以溶劑合物的形式進行給藥。選擇和製備化合物的可接受的鹽、酯和溶劑化物等是本領域公知技術。

術語“同位素變體”是指在組成此類化合物的原子中的一或多者處含有非天然比例的同位素的化合物。在某些實施例中，化合物的“同位素變體”含有非天然比例的一或多種同位素，包括(但不限於)氫( ¹H)、氘( ²H)、氚( ³H)、碳-11( ¹¹C)、碳-12( ¹²C)、碳-13( ¹³C)、碳-14 ( ¹⁴C)、氮-13 ( ¹³N)、氮-14 ( ¹⁴N)、氮-15( ¹⁵N)、氧-14( ¹⁴O)、氧-15( ¹⁵O)、氧-16 ( ¹⁶O)、氧-17 ( ¹⁷O)、氧-18 ( ¹⁸O)、氟-17( ¹⁷F)、氟-18( ¹⁸F)、磷-31( ³¹P)、磷-32 ( ³²P)、磷-33 ( ³³P)、硫-32 ( ³²S)、硫-33( ³³S)、硫-34( ³⁴S)、硫-35( ³⁵S)、硫-36( ³⁶S)、氯-35( ³⁵Cl)、氯-36 ( ³⁶Cl)、氯-37( ³⁷Cl)、溴-79( ⁷⁹Br)、溴-81( ⁸¹Br)、碘-123( ¹²³I)、碘-125( ¹²⁵I)、碘-127( ¹²⁷I)、碘-129( ¹²⁹I)及碘-131( ¹³¹I)。在某些實施例中，化合物的“同位素變體”呈穩定形式，亦即非放射性。在某些實施例中，化合物的“同位素變體”含有非天然比例的一或多種同位素，包括(但不限於)氫( ¹H)、氘( ²H)、碳-12( ¹²C)、碳-13( ¹³C)、氮-14( ¹⁴N)、氮-15( ¹⁵N)、氧-16( ¹⁶O)、氧-17( ¹⁷O)、氧-18( ¹⁸O)、氟-17( ¹⁷F)、磷-31( ³¹P)、硫-32( ³²S)、硫-33( ³³S)、硫-34( ³⁴S)、硫-36( ³⁶S)、氯-35( ³⁵Cl)、氯-37( ³⁷Cl)、溴-79( ⁷⁹Br)、溴-81( ⁸¹Br)及碘-127( ¹²⁷I)。在某些實施例中，化合物的“同位素變體”呈不穩定形式，亦即放射性。在某些實施例中，化合物的“同位素變體”含有非天然比例的一或多種同位素，包括(但不限於)氚( ³H)、碳-11( ¹¹C)、碳-14( ¹⁴C)、氮-13( ¹³N)、氧-14( ¹⁴O)、氧-15( ¹⁵O)、氟-18( ¹⁸F)、磷-32( ³²P)、磷-33( ³³P)、硫-35( ³⁵S)、氯-36( ³⁶Cl)、碘-123( ¹²³I)、碘-125( ¹²⁵I)、碘-129 ( ¹²⁹I)及碘-131( ¹³¹I)。應理解，在如本文提供的化合物中，在根據本領域技術人員的判斷為可行時，任何氫可為例如 ²H即D，或任何碳可為例如 ¹³C，或任何氮可為例如 ¹⁵N，及任何氧可為 ¹⁸O。在某些實施例中，化合物的“同位素變體”含有非天然比例的氘（D）。

白血病，白血病（Leukemia），亦稱作血癌，是一種造血系統的惡性腫瘤。病源是由於細胞內去氧核糖核酸的變異形成的骨髓中造血組織的不正常工作。白血病有多種類型，白血病的類型主要由血液內不正常的血細胞的類型來區分，學術上，有多種分類方法，常用的分類法有 FAB分類法，以及由世界衛生組織推動新的 WHO分類法 。這些分類法可以提供病人預後以及處置的指導。臨床上，一般分急性白血病和慢性白血病，包括： 急性淋巴細胞性白血病，Acute Lymphoblastic Leukemia，簡稱ALL，根據白血病細胞表面不同的分化抗原利用免疫學技術，可以診斷並分為不同的亞型，一般分為T、B細胞系，即急性T淋巴細胞性白血病T-ALL和急性B淋巴細胞性白血病B-ALL）； 急性骨髓性白血病，也稱為急性髓細胞白血病，Acute myeloid leukemia，簡稱AML是一種骨髓性白細胞（而非淋巴性白細胞）異常增殖的血癌； 慢性淋巴細胞性白血病，Chronic Lymphocytic Leukemia，簡稱慢淋(CLL)，主要包括慢性B淋巴細胞性白血病（B-CLL），慢性T淋巴細胞性白血病（T-CLL）也有但少見； 慢性骨髓細胞性白血病（俗稱“慢粒”），也稱為慢性髓細胞白血病，Chronic myeloid leukemia，簡稱CML； 淋巴瘤，起源於淋巴結或其他淋巴組織的惡性腫瘤，可分為霍奇金病（簡稱HD）和非霍奇金淋巴瘤（簡稱NHL）兩大類。非霍奇金淋巴瘤分成B細胞淋巴瘤和T細胞以及NK細胞淋巴瘤兩個大類。

B細胞淋巴瘤又分成前體B細胞淋巴瘤和成熟B細胞淋巴瘤兩大類，其中前體B細胞淋巴瘤指的是前體B淋巴母細胞淋巴瘤，而成熟B細胞淋巴瘤臨床上比較常見的是小細胞淋巴瘤、漿細胞骨髓瘤、結外邊緣區B細胞淋巴瘤、結型邊緣區B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、彌漫性B細胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤等。

在T細胞和NK細胞淋巴瘤的分類中，也包括前體T細胞淋巴瘤和成熟T細胞淋巴瘤，其中前體T細胞淋巴瘤，主要指的是前體T淋巴母細胞淋巴瘤，成熟T細胞淋巴瘤常見的有T細胞幼淋巴細胞性白血病、成人T細胞淋巴瘤、結外NK-T淋巴瘤、間變性大細胞淋巴瘤、周圍T細胞淋巴瘤、間變性大細胞淋巴瘤等。

特別的，所述白血病包括淋巴細胞白血病（包括急性淋巴細胞性白血病和慢性淋巴細胞性白血病），淋巴瘤包括淋巴母細胞淋巴瘤。

進一步的，所述白血病為急性淋巴細胞白血病，優選為急性T淋巴細胞白血病，淋巴瘤為T淋巴母細胞淋巴瘤。

特別的，白血病包括急性淋巴細胞性白血病Acute lymphoblastic leukemia、急性淋巴細胞T細胞白血病T-ALL、T淋巴細胞白血病T-cell leukemia、急性淋巴細胞白血病Acute lymphoblastic leukemia；淋巴瘤包括T淋巴母細胞瘤，具體為T淋巴母細胞性淋巴瘤，T cell lymphoblastic lymphoma。

聯用治療中柔紅黴素、阿糖胞苷給藥劑量低於其單藥臨床用藥劑量。

柔紅黴素，臨床使用的是其鹽酸鹽即鹽酸柔紅黴素，劑型為注射用無菌粉針，臨用前加入注射用生理鹽水溶解後供靜脈注射或滴注，臨床上主要用於治療： (1) 急性粒細胞性白血病，無論是單一使用柔紅黴素或者與其它抗腫瘤藥物合用，柔紅黴素均適用於治療該病的各個分期。亦用於治療早幼粒性白血病； (2) 急性淋巴細胞性白血病，用柔紅黴素治療該病，緩解率很高，但由於其副作用大及尚有其它有效治療方法，故柔紅黴素只適用於那些對其它藥物已產生耐藥的病例； (3) 其他腫瘤，已觀察到柔紅黴素對神經母細胞瘤及橫紋肌肉瘤有良好的療效。

阿糖胞苷，臨床使用的是注射用阿糖胞苷（使用阿糖胞苷或阿糖胞苷鹽酸鹽），劑型為凍乾粉，臨用前加入苯甲醇與水配製的苯甲醇注射液（一般與凍乾粉一併售賣）後供靜脈注射或皮下注射，主要適用於成人和兒童急性非淋巴細胞性白血病的誘導緩解和維持治療。其對其它類型的白血病也有治療作用，如：急性淋巴細胞性白血病、慢性髓細胞性白血病（急變期）。可單獨或與其它抗腫瘤藥聯合應用，聯合用藥療效更好。

所述白血病患者的血液樣本的AKR1C3對應的RNA檢測為陽性，所述淋巴瘤患者的腫瘤組織樣本的AKR1C3蛋白檢測為陽性； 或 所述白血病患者被檢測為AKR1C3對應的RNA陽性，所述淋巴瘤患者被檢測出AKR1C3蛋白陽性。

在先前的研究和實驗論文中都表明AST-3424單藥或聯用治療方案均限定動物模型或患者是AKR1C3過量或過表達，而本治療方案/製藥用途涉及的AST-3424與柔紅黴素/阿糖胞苷聯用治療白血病/淋巴瘤卻只需要對應的AKR1C3蛋白或RNA檢測為陽性即有表達即可，在陽性情況下依然有顯著的療效。

過量，即過表達Overexpression，是指相對於正常細胞，癌細胞的表達水平比正常細胞高，此種情況即為過量或過表達；或者基於統計，人為設定閾值，過量或過表達即為超出這個閾值。AKR1C3在不同腫瘤（實體瘤或血液癌）過量或過表達的情況參見文獻Evans K, Duan J, Pritchard T, et al. OBI-3424, a Novel AKR1C3-Activated Prodrug, Exhibits Potent Efficacy against Preclinical Models of T-ALL. Clin Cancer Res. 2019;25(14):4493-4503. doi:10.1158/1078-0432.CCR-19-0551（公開了急性淋巴細胞白血病的AKR1C3表達情況）和Guise CP, Abbattista MR, Singleton RS, et al. The bioreductive prodrug PR-104A is activated under aerobic conditions by human aldo-keto reductase 1C3. Cancer Res. 2010;70(4):1573-1584. doi:10.1158/0008-5472.CAN-09-3237（公開了不同實體瘤的AKR1C3表達情況）。

在以往的AKR1C3酶活化的抗癌前藥中，經常需要在用藥前測試AKR1C3酶表達水平並明確治療方案只對高表達或過量表達AKR1C3的患者有效，而本次提供的新的聯用藥物組合其藥物效果與AKR1C3幾乎沒有相關性，患者只需要有AKR1C3表達，即檢測結果為陽性即可能有效果。

進一步的，所述白血病患者的血液樣本的AKR1C3對應的RNA檢測Log ₂FPKM定量值，其值大於或等於0.71，所述淋巴瘤患者的腫瘤組織樣本的AKR1C3蛋白定量是western blot(WB)法檢測的蛋白條帶中AKR1C3蛋白條帶與參比蛋白條帶的比值，其值大於或等於0.84； 或 所述白血病患者被檢測為AKR1C3對應的RNA，檢測Log ₂FPKM定量值，其值大於或等於0.71，所述淋巴瘤患者被檢測出AKR1C3蛋白定量是western blot(WB)法檢測的蛋白條帶中AKR1C3蛋白條帶與參比蛋白條帶的比值，其值大於或等於0.84， 滿足上述情況下，效果可能更好。

也就是說，本聯用方案拓寬了AST-3424治療患者的獲益人群，先前技術文獻（Evans K, Duan J, Pritchard T, et al. OBI-3424, a Novel AKR1C3-Activated Prodrug, Exhibits Potent Efficacy against Preclinical Models of T-ALL. Clin Cancer Res. 2019;25(14):4493-4503. doi:10.1158/1078-0432.CCR-19-0551；Guise CP, Abbattista MR, Singleton RS, et al. The bioreductive prodrug PR-104A is activated under aerobic conditions by human aldo-keto reductase 1C3. Cancer Res. 2010;70(4):1573-1584. doi:10.1158/0008-5472.CAN-09-3237；Safety, pharmacokinetics, and clinical activity of OBI-3424, an AKR1C3‑activated prodrug, in patients with advanced or metastatic solid tumors: A phase 1 dose-escalation study.J Clin Oncol 40, 2022 (suppl 16; abstr 3030)，DOI：10.1200/JCO.2022.40.16_suppl.3030）揭示的AST-3424治療白血病或實體瘤的獲益人群嚴格限定為AKR1C3蛋白或RNA表達過量或過表達（常常對應較高的RNA定量值，較高的IHC的H-score打分），而新的治療方案則較大幅度的降低了獲益患者的用藥門檻。在對患者給予本聯用治療方案治療白血病/淋巴瘤前，進行AKR1C3測定其結果並不需要是先前文獻限定的過表達/過量，檢測結果是陽性有表達即可以施用本聯用方案，只要醫學專用人員判定施用本方案進行治療對患者有獲益或獲益可能。

本申請還提供一種藥物聯用物，其包括如下物質作為活性成分： AST-3424、AST-3423或AST-2870及其鹽、酯、溶劑合物、同位素異構體，以及 柔紅黴素及其鹽、酯、溶劑合物、同位素異構體，或 阿糖胞苷及其鹽、酯、溶劑合物、同位素異構體； 將所述活性成分共同配製或分開配製，用於配伍使用、同時使用或分開使用。

本申請的藥物聯用物至少包括兩種活性成分，如AST-3424和柔紅黴素、AST-3424和阿糖胞苷。當然，還可以包括藥學上可用的輔料。

通常，作為本申請所述的藥物聯用物特徵的兩種活性成分可將所述活性成分共同配製（單劑量單位）或分開配製（套裝）。

共同配製或分開配製的兩種活性成分通常可同時給藥；或鑒於它們各自製劑的性質，相隔一定時間間隔分開給藥，所述時間間隔有利於所述兩種活性成分配伍作用的最佳化。

藥物聯用物可以是一種複方藥物，其為一種活性成分為上述AST-3424、AST-3423、AST-2870或其鹽、酯、溶劑合物、同位素異構體和另一種活性成分為柔紅黴素、阿糖胞苷或其鹽、酯、溶劑合物、同位素異構體組成的藥物組合物。此種情況下，上述活性成分共同配製，同時使用。

藥物聯用物也可以是一種類似於輝瑞新冠藥物Paxlovid的套裝，用於同時售賣或分開售賣。此種情況下，上述活性成分分開配製，但分開配製成的兩種或兩種以上的藥物既可同時給藥，也可根據各自製劑的性質，相隔一定時間間隔分開給藥。

作為本申請的一個具體實施方式，分開配製時，配製成的一種藥物為含有活性成分AST-3424、AST-3423、AST-2870或其鹽、酯、溶劑合物、同位素異構體以及藥學上可用的輔料，另一種藥物為含有活性成分柔紅黴素、阿糖胞苷或其鹽、酯、溶劑合物、同位素異構體以及藥學上可用的輔料。上述兩種藥物組成的藥物聯用物，可以同時給藥，也可根據各自製劑的性質，相隔一定時間間隔分開給藥。

藥物聯用物中，柔紅黴素、阿糖胞苷的聯用劑量低於其單藥臨床用藥劑量。

本申請還提供一種藥物製劑，其由上述藥物聯用物的活性成分與藥學上可用的輔料製備而成。

作為本申請的一個特定實施例，上述藥物製劑的劑型選自顆粒劑、片劑、丸劑、膠囊劑或注射劑。

本申請還提供上述藥物聯用物和/或上述藥物製劑在製備抗腫瘤藥物中的用途。

作為本申請的一個特定實施例，上述腫瘤選自白血病、淋巴瘤。

作為一種優選，白血病包括淋巴細胞白血病，淋巴瘤包括淋巴母細胞淋巴瘤；優選的，所述白血病為急性淋巴細胞白血病，更優選為急性T淋巴細胞白血病，淋巴瘤為T淋巴母細胞淋巴瘤。

一、體外細胞實驗

1.1 單藥體外細胞增殖抑制實驗

操作步驟 第一天將細胞接種在96孔細胞培養板中（180 μL/孔）。 第二天，加入20 μL 10倍測試濃度的化合物工作液（AST-3424），輕輕震盪細胞板，將其放置在37ºC培養箱中繼續培養。 第三天，加入20 μL 10倍測試濃度的化合物（阿糖胞苷和柔紅黴素）溶液，輕輕震盪細胞板，將其放置在37ºC培養箱中繼續培養72小時。 孵育結束後按照CellTiter Glo試劑說明書要求在細胞版中加入配製好的試劑（50 μL/孔），充分混勻後室溫避光孵育10分鐘。 將細胞板放入讀板儀進行分析，設定讀取化學發光並記錄資料。

數據處理

每孔中的讀數需要被轉換成細胞存活率。細胞存活率可以使用下列公式計算得出：

處理後的資料將用GraphPad Prism 5分析軟體來做非線性回歸分析，得到劑量效應曲線，如圖1所示，並計算出化合物對細胞的半數殺傷濃度（IC ₅₀），如下表1所示。

表1：不同藥物對不同細胞系細胞的增殖抑制作用資料

細胞系	不同化合物的IC 50值，單位為nmol/L
阿糖胞苷	鹽酸柔紅黴素	AST-3424
SUP-T1	856	30.6	2.47
CCRF-CEM	82.2	30.7	3.68
Jurkat, Clone E6-1	100	41.0	4620
PF-382	26.4	14.2	4.09
MOLT-4	120	24.2	8.04

阿糖胞苷，柔紅黴素以及化合物AST-3424在CCRF-CEM，PF-382，Jurkat, Clone E6-1，SUP-T1，MOLT-4這五株細胞中都表現出了良好的抑制作用。並且除Jurkat, Clone E6-1細胞外，其餘4株細胞中，AST-3424 的體外細胞毒性均優於柔紅黴素和阿糖胞苷。

1.2 藥物聯用體外細胞增殖抑制實驗

操作步驟 第一天將細胞接種在96孔細胞培養板中（180 μL/孔）。 第二天，加入10 μL 20倍測試濃度AST-3424溶液（兩個濃度IC ₂₅或IC10的20倍濃度）輕輕震盪細胞板，將其放置在37ºC培養箱中繼續培養。 第三天，在聯合用藥的孔內分別加入10 μL 20倍測試濃度化合物（阿糖胞苷或柔紅黴素）（各三個濃度IC ₅₀、IC ₂₅和IC ₅的20倍濃度），在單獨用藥的孔內加入10 μL含2% DMSO的培養基，輕輕震盪細胞板，將其放置在37ºC培養箱中繼續培養72小時。 孵育結束後按照CellTiter Glo試劑說明書要求在細胞版中加入配製好的試劑（50 μL/孔），充分混勻後室溫避光孵育10分鐘。 將細胞板放入讀板儀進行分析，設定讀取化學發光並記錄資料。

數據處理 每孔中的讀數需要被轉換成細胞存活率，根據1.1節中的公示進行計算。 將最終的不同實驗條件下的存活率製作為柱狀圖，如圖2-6分別展示了AST-3424 和柔紅黴素、阿糖胞苷單藥及聯用對SUP-T1，CCRF-CEM，PF-382，Jurkat, Clone E6-1，MOLT-4這5個細胞系細胞增殖的影響。

實驗結論

分析圖2，AST-3424與柔紅黴素、阿糖胞苷單藥及聯用藥對SUP-T1細胞增殖的影響可知： 1、單藥AST-3424 0.13nM（nM表示濃度為nmol/L，下同）和1nM對SUP-T1細胞增殖無影響； 2、三個濃度柔紅黴素分別與0.13nM或1nMAST-3424聯用均導致細胞存活率降低，且呈現AST-3424劑量依賴性的降低；與兩個濃度的AST-3424聯用，80nM柔紅黴素聯用效果強於0.1nM和20nM柔紅黴素聯用效果； 3、三個濃度阿糖胞苷分別與0.13nM或1nM AST-3424聯用均導致細胞存活率的降低。0.64nM和400nM阿糖胞苷分別與AST-3424聯用呈現AST-3424劑量依賴性的降低。

分析圖3，AST-3424與柔紅黴素、阿糖胞苷單藥及聯用藥對CCRF-CEM細胞增殖的影響可知： 1、單藥0.1nM和1nM AST-3424對CCRF-CEM細胞增殖無影響； 2、相較單藥32nM柔紅黴素組，藥物與0.1nM或1nMAST-3424的聯用導致細胞存活率的降低，但無AST-3424的劑量依賴性；與兩個濃度的AST-3424聯用，32nM柔紅黴素聯用效果強於16nM柔紅黴素；與0.03nM柔紅黴素聯用無效果； 3、相較80nM阿糖胞苷單藥，藥物分別和0.1nM或1nM AST-3424的聯用均導致細胞存活率的降低，且呈現AST-3424劑量依賴性的降低；與兩個濃度的AST-3424聯用，80nM阿糖胞苷聯用效果強於40nM阿糖胞苷，0.6nM阿糖胞苷聯用無效果。

分析圖4，AST-3424與柔紅黴素、阿糖胞苷單藥及聯用藥對PF-382細胞增殖的影響可知： 1、單藥0.64和2.5nM AST-3424 對PF-382細胞增殖無顯著影響； 2、三個濃度柔紅黴素分別與0.64nM或2.5nM AST-3424的聯用均導致細胞存活率降低，且呈現AST-3424劑量依賴性的降低； 3、三個濃度阿糖胞苷分別與0.64nM或2.5nMAST-3424的聯用均導致細胞存活率降低，且呈現AST-3424劑量依賴性的降低。

分析圖5，AST-3424與柔紅黴素、阿糖胞苷單藥及聯用藥對Jurkat,CloneE6-1細胞增殖的影響可知： 1、單藥AST-3424  0.64nM和16nM對Jurkat，CloneE6-1細胞增殖無顯著影響； 2、三個濃度柔紅黴素分別與0.64nM或16nM AST-3424聯用均導致細胞存活率降低，且呈現AST-3424劑量依賴性的降低； 3、三個濃度阿糖胞苷分別與0.64nM或16nM AST-3424的聯用均導致細胞存活率降低，且呈現AST-3424劑量依賴性的降低。

分析圖6，AST-3424與柔紅黴素、阿糖胞苷單藥及聯用藥對MOLT-4細胞增殖的影響可知： 1、單藥3.2nM和6.4nM AST-3424 對MOLT-4細胞增殖無顯著影響； 2、40nM柔紅黴素對細胞的增殖影響非常顯著，無法判斷聯合用藥的細胞存活率的影響； 3、相較單藥5nM和20nM柔紅黴素組，兩個濃度柔紅黴素分別和3.2nM或6.4nM AST-3424的聯用均導致細胞存活率降低，且呈現AST-3424劑量依賴性的降低；與兩個濃度的AST-3424聯用，20nM柔紅黴素聯用效果強於5nM柔紅黴素； 4、三個濃度阿糖胞苷分別與3.2nM或6.4nM AST-3424的聯用均導致細胞存活率降低，且呈現AST-3424劑量依賴性的降低。與兩個濃度的AST-3424聯用，80nM和120nM阿糖胞苷聯用效果強於3.2nM阿糖胞苷。

二、細胞系和藥物說明

2.1 細胞系說明1、MOLT-4與MOLT-3來源於一名19歲的男性急性淋巴細胞性白血病的復發患者，該患者前期接受過多種藥物聯合化療。MOLT-4細胞系為T淋巴細胞起源，p53基因的第248位元密碼子有一個G→A突變，不表達p53，不表達免疫球蛋白或EB病毒；可產生高水平的末端去氧核糖轉移酶；表達CD1 (49%), CD2 (35%), CD3 A (26%) B (33%) C (34%), CD4 (55%), CD5 (72%), CD6 (22%), CD7 (77%)。該細胞是人急性淋巴母細胞白血病細胞，對應疾病是人急性T淋巴母細胞白血病即T-ALL。 2、PF-382，人急性淋巴細胞T細胞白血病細胞，對應疾病是人急性淋巴細胞T細胞白血病，即T-ALL。 3、Jurkat, Clone E6-1 是Jurkat-FHCRC細胞系的克隆，Jurkat細胞系的衍生物，該細胞系是從一名 14歲男性急性T細胞白血病患者的外周血中建立的。該細胞是人T淋巴細胞白血病細胞，對應疾病是T-ALL。 4、SUP-T1，人T淋巴母細胞瘤細胞，對應疾病是T淋巴母細胞性淋巴瘤，英文為T-cell Lymphoblastic Lymphoma（TLBL）。 5、CCRF-CEM，人急性淋巴細胞白血病T淋巴血清培養細胞，細胞是1964年11月從一位四歲白人女性急性淋巴細胞白血病患者的外周血白血球衣中得到。該細胞是人急性T淋巴細胞白血病細胞，對應疾病是急性T淋巴細胞白血病即T-ALL。

2.2 細胞 AKR1C3 表達水平資料

使用文獻報導的方法測試而來上述5種白血病細胞和淋巴瘤細胞的AKR1C3酶表達和RNA表達水平，結果如下表2所示。

表2：不同細胞系的AKR1C3蛋白和RNA表達資料

細胞系	RNA表達	蛋白表達	IC 50（nmol/L） 1	IC 50（nmol/L） 2
SUP-T1	5.96	6.08	2.47	3.7
CCRF-CEM	4.10	3.95	3.68	14.9
Jurkat, Clone E6-1	0.71	0.84	4620	24.0
PF-382	5.16	4.9	4.09	3.0
MOLT-4	1.91	4.19	8.04	10.0

AKR1C3 RNA表達是根據文獻（Meng, F., Li, W. F., Jung, D., Wang, C. C., Qi, T., Shia, C. S., Hsu, R. Y., Hsieh, Y. C., & Duan, J. (2021). A novel selective AKR1C3-activated prodrug AST-3424/OBI-3424 exhibits broad anti-tumor activity. American journal of cancer research, 11(7), 3645-3659.）的記載方法，使用RNA-Seq分析細胞中AKR1C3的RNA表達水平（AKR1C3 RNA expression level ），並使用Log ₂FPKM進行定量，表格中的資料就是Log ₂FPKM進行定量的數值。

AKR1C3蛋白表達量的檢測是western blot(WB)法檢測的蛋白條帶中AKR1C3蛋白條帶與參比蛋白條帶的比值。本實施例中，是通過Image J軟體對AKR1C3和α-Tubulin的蛋白條帶進行灰度值處理測定，然後計算AKR1C3/α-Tubulin的比值作為蛋白的相對表達定量值，並在不同細胞系之間比較。

上標1表示資料為AST-3424的本次實驗測試結果，參見1.1單藥體外細胞增殖抑制實驗部分。

上標2表示資料為AST-3424的以往實驗測試結果。

2.3 藥物說明

柔紅黴素、阿糖胞苷均是臨床實際中用於治療白血病或其他腫瘤的藥物，通過調查比對並折算結果如下表3所示，發現聯用方案的給藥量是遠遠小於臨床用藥劑量的。

表3：柔紅黴素與阿糖胞苷的臨床用藥資料

化合物	臨床常用給藥劑量	實際查詢給藥劑量	血漿Cmax/穩態濃度(μg/mL）	換算後莫耳濃度（μM）	實際加藥莫耳濃度（μM）
柔紅黴素	30-60 mg/m 2，連續3天給藥	44 mg/m 2，day1，3，5給藥	26 μg/mL（Cmax）	49	≤0.08
阿糖胞苷	3 g/m 2，q12h，給藥2-6天	1.8-3 g/m 2，給藥12次	8-24 μg/mL  （穩態濃度）	32-97	≤2

總結

柔紅黴素和阿糖胞苷分別與不同濃度的AST-3424 聯用均導致實驗使用的癌細胞存活率降低，且呈現AST-3424劑量依賴性的降低。

MOLT-4， PF-382 和Jurkat Clone E6-1細胞中的聯用效果優於 SUP-T1 和CCRF-CEM。

在特定的細胞系白血病、淋巴瘤細胞系中，當細胞系檢測出具有不同的AKR1C3表達時：AKR1C3蛋白與RNA定量值範圍為0.84-6.08，0.71-5.96，在如此大的表達水平範圍內，AST-3424與柔紅黴素或阿糖胞苷體外聯用效果強弱與AKR1C3表達水平無關。

體外聯用實驗的柔紅黴素和阿糖胞苷測試濃度遠低於臨床用藥劑量。

總之，實驗揭示了新的治療方案治療白血病/淋巴瘤患者不必限定患者具有較高（過表達、過量）的AKR1C3蛋白或RNA表達，AKR1C3蛋白或RNA檢測結果陽性就有可能使用本治療方案而獲益。也就是新的治療方案較大幅度的降低了獲益患者的用藥門檻，檢測結果是陽性有表達即可以施用本聯用方案，只要醫學專用人員判定施用本方案進行治療對患者有獲益或獲益可能。

無

圖1為三種藥物對5種細胞系細胞的增殖抑制曲線；

圖2為AST-3424和柔紅黴素、阿糖胞苷單藥及聯用藥對SUP-T1細胞增殖的影響實驗結果；

圖3為AST-3424和柔紅黴素、阿糖胞苷單藥及聯用藥對CCRF-CEM細胞增殖的影響實驗結果；

圖4為AST-3424和柔紅黴素、阿糖胞苷單藥及聯用藥對PF-382細胞增殖的影響實驗結果；

圖5為AST-3424和柔紅黴素、阿糖胞苷單藥及聯用藥對Jurkat,CloneE6-1細胞增殖的影響實驗結果；

圖6為AST-3424和柔紅黴素、阿糖胞苷單藥及聯用藥對MOLT-4細胞增殖的影響實驗結果。

圖2中Ara-c表示阿糖胞苷，Daunorubicin表示柔紅黴素，自左至右第4、5、6個柱狀圖分別表示0.1nM、20nM、80nM的柔紅黴素單藥給藥的細胞成活百分比，而在其右邊的7、8、9則對應表示0.1nM、20nM、80nM的柔紅黴素分別與0.13nM的AST-3424聯用的細胞成活百分比，在其右邊的10、11、12則對應表示0.1nM、20nM、80nM的柔紅黴素分別與1nM的AST-3424聯用的細胞成活百分比，其餘的圖2至圖6的內容與此類似。

Claims (17)

1. 一種治療方法，使用含有AST-3424、AST-3423或AST-2870及其鹽、酯、溶劑合物、同位素異構體的藥物與含有阿糖胞苷或柔紅黴素及其鹽、酯、溶劑合物、同位素異構體的藥物聯用治療白血病、淋巴瘤患者。
2. 如請求項1所述的治療方法，所述白血病包括淋巴細胞白血病，所述淋巴瘤包括淋巴母細胞淋巴瘤；優選的，所述白血病為急性淋巴細胞白血病，更優選為急性T淋巴細胞白血病，所述淋巴瘤為T淋巴母細胞淋巴瘤。
3. 如請求項1所述的治療方法，聯用治療中，柔紅黴素、阿糖胞苷給藥劑量低於其單藥臨床用藥劑量。
4. 如請求項1所述的治療方法，其中 所述白血病患者的血液樣本的AKR1C3對應的RNA檢測為陽性，所述淋巴瘤患者的腫瘤組織樣本的AKR1C3蛋白檢測為陽性； 或 所述白血病患者被檢測為AKR1C3對應的RNA陽性，所述淋巴瘤患者被檢測出AKR1C3蛋白陽性。
5. 如請求項4所述的治療方法，其中 所述白血病患者的血液樣本的AKR1C3對應的RNA檢測Log ₂FPKM定量值，其值大於或等於0.71， 所述淋巴瘤患者的腫瘤組織樣本的AKR1C3蛋白定量是western blot(WB)法檢測的蛋白條帶中AKR1C3蛋白條帶與參比蛋白條帶的比值，其值大於或等於0.84； 或 所述白血病患者被檢測為AKR1C3對應的RNA，檢測Log ₂FPKM定量值，其值大於或等於0.71， 所述淋巴瘤患者被檢測出AKR1C3蛋白定量是western blot(WB)法檢測的蛋白條帶中AKR1C3蛋白條帶與參比蛋白條帶的比值，其值大於或等於0.84。
6. 一種AST-3424、AST-3423或AST-2870及其鹽、酯、溶劑合物、同位素異構體的製藥用途，其用於製備與含有柔紅黴素或阿糖胞苷及其鹽、酯、溶劑合物、同位素異構體的藥物聯用治療白血病或淋巴瘤的藥物。
7. 如請求項6所述的製藥用途，所述白血病包括淋巴細胞白血病，所述淋巴瘤包括淋巴母細胞淋巴瘤；優選的，所述白血病為急性淋巴細胞白血病，更優選為急性T淋巴細胞白血病，所述淋巴瘤為T淋巴母細胞淋巴瘤。
8. 如請求項6所述的製藥用途，聯用治療中，柔紅黴素、阿糖胞苷給藥劑量低於其單藥臨床用藥劑量。
9. 如請求項6所述的製藥用途，其中 所述白血病患者的血液樣本的AKR1C3對應的RNA檢測為陽性，所述淋巴瘤患者的腫瘤組織樣本的AKR1C3蛋白檢測為陽性； 或 所述白血病患者被檢測為AKR1C3對應的RNA陽性，所述淋巴瘤患者被檢測出AKR1C3蛋白陽性。
10. 如請求項9所述的製藥用途，其中 所述白血病患者的血液樣本的AKR1C3對應的RNA檢測Log ₂FPKM定量值，其值大於或等於0.71， 所述淋巴瘤患者的腫瘤組織樣本的AKR1C3蛋白定量是western blot(WB)法檢測的蛋白條帶中AKR1C3蛋白條帶與參比蛋白條帶的比值，其值大於或等於0.84； 或 所述白血病患者被檢測為AKR1C3對應的RNA，檢測Log ₂FPKM定量值，其值大於或等於0.71， 所述淋巴瘤患者被檢測出AKR1C3蛋白定量是western blot(WB)法檢測的蛋白條帶中AKR1C3蛋白條帶與參比蛋白條帶的比值，其值大於或等於0.84。
11. 一種藥物聯用物，其特徵在於，包括如下物質作為活性成分： AST-3424、AST-3423或AST-2870及其鹽、酯、溶劑合物、同位素異構體，以及 柔紅黴素及其鹽、酯、溶劑合物、同位素異構體，或 阿糖胞苷及其鹽、酯、溶劑合物、同位素異構體； 其中，將所述活性成分共同配製或分開配製，用於配伍使用、同時使用或分開使用。
12. 如請求項11所述的藥物聯用物，其中，所述柔紅黴素、阿糖胞苷的聯用劑量低於其單藥臨床用藥劑量。
13. 一種藥物製劑，其特徵在於，其由請求項11所述藥物聯用物的活性成分與藥學上可用的輔料製備而成。
14. 如請求項13所述的藥物製劑，其中，所述藥物製劑的劑型選自顆粒劑、片劑、丸劑、膠囊劑或注射劑。
15. 一種請求項11所述的藥物聯用物和/或請求項13所述的藥物製劑在製備抗腫瘤藥物中的用途。
16. 如請求項15所述的用途，其中，所述腫瘤選自白血病、淋巴瘤。
17. 如請求項16所述的用途，其中，所述白血病包括淋巴細胞白血病，所述淋巴瘤包括淋巴母細胞淋巴瘤；優選的，所述白血病為急性淋巴細胞白血病，更優選為急性T淋巴細胞白血病，所述淋巴瘤為T淋巴母細胞淋巴瘤。