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TW202523322A - 吉西他濱抗癌衍生物及其抗癌醫藥用途和製備方法 - Google Patents

吉西他濱抗癌衍生物及其抗癌醫藥用途和製備方法 Download PDF

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TW202523322A
TW202523322A TW113106422A TW113106422A TW202523322A TW 202523322 A TW202523322 A TW 202523322A TW 113106422 A TW113106422 A TW 113106422A TW 113106422 A TW113106422 A TW 113106422A TW 202523322 A TW202523322 A TW 202523322A
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carcinoma
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TW113106422A
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English (en)
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李安蓉
齊天陽
段建新
繁英 孟
孟滕
劉星
張夢雲
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大陸商深圳艾欣達偉醫藥科技有限公司
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Abstract

本發明提供具有下式H11的吉西他濱抗癌衍生物及其抗癌醫藥用途和製備方法，該吉西他濱抗癌衍生物有潛力被開發為AKR1C3活化的抗癌藥物。

Description

吉西他濱抗癌衍生物及其抗癌醫藥用途和製備方法
本發明涉及對吉西他濱的進一步開發，得到具有靶向性的AKR1C3酶活化的吉西他濱抗癌衍生物，屬於癌症治療藥物研發領域。
段建新（Jian-xin Duan）等人的發明：硝基苄基衍生物抗癌試劑，PCT申請號PCT/US2016/025665，公開號WO2016/161342A1，對應中國申請號201680020013.2，公開號CN108136214A公開了一系列的硝基苄基衍生物： ， 其實際是將硝基苄基結構通過L 1與抗癌藥物殘基連接得到AKR1C3活化的抗癌藥物，並限定了連接基L 1對於不同的抗癌藥物殘基D具有不同的結構。
特別的，在這個發明申請中，發明人設計了如下結構的吉西他濱與硝基苄基結構結合的衍生物： 。 以及具體的3個化合物： 、 、 。
進一步合成了TH3057化合物並測試了該化合物對於高表達AKR1C3酶的H460細胞系的細胞增殖抑制活性IC 50值以及添加了AKR1C3酶抑制劑情形下，該化合物對於高表達AKR1C3酶的H460細胞系的細胞增殖抑制活性IC 50值分別為0.2 μmol/L和5 μmol/L。
發明人繼續進一步的研究發現，上述發明中設計的吉西他濱與硝基苄基結構結合的衍生物並不全都是AKR1C3活化的抗癌藥物，或者說與TH3057類似的化合物，連接基L 1連接的吉西他濱殘基與硝基苄基結構得到的化合物並不全都是AKR1C3活化的抗癌藥物，這些化合物通過測試證明並不全都能被AKR1C3酶活化或活化比極低，因此發明人在上述發明的化合物的基礎上設計並合成了一系列確證能被AKR1C3酶活化或活化比更高的吉西他濱抗癌衍生物，並且這些化合物較TH3057而言，可能有更優良的潛力被開發為AKR1C3活化的抗癌藥物，特別是其中的化合物H11，因此本發明為開發得到更高特異性活化比的AKR1C3活化的抗癌藥物提供了一種新的可能或思路。
本發明提供新的結構的吉西他濱抗癌衍生物，該衍生物是AKR1C3活化的抗癌藥物。
具有結構式III的吉西他濱抗癌衍生物，或其藥學上可接受的鹽或前藥或溶劑合物或同位素變體： （III） 其中， R 1選自H、鹵素， 表示R 1可以取代苯環上的任意4個位置且取代數目為1、2、3或4； R 2選自苯基、鹵素取代的苯基、C1-C3烷基或鹵素取代的C1-C3烷基； R 3選自C1-C6烷基或鹵素取代的C1-C6烷基、苄基。 鹵素選自F、Cl、Br以及I。 烷基包括直鏈以及支鏈的烷基和環烷基。
優選的，R 1選自H或單取代的F； 優選的，R 2為選自苯基、氟苯基、甲基或三氟甲基； 優選的，R 3選自甲基、乙基、丙基、丁基、苄基，或溴取代的甲基、乙基、丙基、丁基； 更優選的， R 1選自H或單取代的F， R 2為選自苯基、氟苯基、甲基或三氟甲基， R 3選自甲基、乙基、丙基、丁基、苄基，或溴取代的甲基、乙基、丙基、丁基。
進一步優選的，上述結構式III選自具有以下結構式的吉西他濱抗癌衍生物，或其藥學上可接受的鹽或前藥或溶劑合物或同位素變體： （H11）。
本申請中吉西他濱是廣義的，包括上市藥物吉西他濱（GEMZAR、澤菲）中含有的以下化合物： 也包括其立體構型異構體及消旋體。 其中，所述鹽為鹼式鹽（特指與鹼反應生產的鹽）或酸式鹽（特指與酸反應生產的鹽）。
即本發明提供化合物的藥學上可接受的鹽，所述鹽可以為鹼式鹽，包括所述化合物與無機鹼（例如鹼金屬氫氧化物、鹼土金屬氫氧化物等）或與有機鹼（例如單乙醇胺、二乙醇胺或三乙醇胺等）形成的鹽。或者，所述鹽可以為酸式鹽，包括所述化合物與無機酸（例如鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硝酸、高氯酸、硫酸或磷酸等）或與有機酸（例如甲磺酸、三氟甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、富馬酸、草酸、馬來酸、檸檬酸等）形成的鹽。
選擇和製備化合物的藥學上可接受的鹽和溶劑化物等是本領域公知技術，對於吉西他濱及其衍生物而言，由於結構中含有伯胺以及仲胺，優選的鹽為與酸反應生成的鹽，比如鹽酸鹽和單磷酸鹽。
本文所述化合物還可以溶劑合物的形式使用，所述溶劑合物為水合物、醇合物等，醇合物包括乙醇合物。
所述前藥選自酯或醯胺。
由於具有結構式III的吉西他濱抗癌衍生物中含有羥基，因此可以與羧酸、磺酸、醯氯等形成對應的酯；由於結構中含有伯胺以及仲胺，因此可以與羧酸、磺酸、醯氯等形成對應的醯胺。
本發明中關於同位素變體或異構體的概念以專利申請PCT/US2016/062114，公開號WO2017087428，對應中國申請號2016800446081，公開號CN108290911A中對同位素變體以及手性異構體的概念為准。
由於具有結構式III的吉西他濱抗癌衍生物的代謝關鍵位點有兩處： ， 因此發明人推測可能的氘同位素取代化合物結構如下： 。
本發明還提供一種含有上述化合物的藥品或製劑。
本發明還提供上述具有結構式III的吉西他濱抗癌衍生物及其藥學上可接受的鹽或前藥或溶劑合物或同位素變體在製備治療癌症患者或腫瘤患者或由癌症或腫瘤引發的病症或細胞增生性疾病的藥物中的用途。
優選地，該藥品或製劑用於治療患者的腫瘤、癌症疾病，其中腫瘤、癌症包括： 肺癌、非小細胞肺癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、骨癌、食道癌、乳腺癌、前列腺癌、睾丸癌、結腸癌、卵巢癌、膀朧癌、子宮頸癌、黑色素瘤、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊性腺癌、囊性癌、髓狀癌、支氣管癌、骨細胞癌、上皮癌、膽管癌、絨毛膜癌、胚癌、精原細胞癌、維爾姆斯癌、膠質細胞癌、星形細胞瘤、成神經管細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血細胞瘤、聲帶神經瘤、腦膜瘤、成神經細胞瘤、成視神經細胞瘤、成視網膜細胞瘤、神經纖維瘤、纖維肉瘤、成纖維細胞瘤、纖維瘤、纖維腺瘤、纖維軟骨瘤、纖維囊瘤、纖維粘液瘤、纖維骨瘤、纖維粘液肉瘤、纖維乳頭狀瘤、粘液肉瘤、粘液囊瘤、粘液軟骨瘤、粘液軟骨肉瘤、粘液軟骨纖維肉瘤、粘液腺瘤、成粘液細胞瘤、脂肉瘤、脂肪瘤、脂肪腺瘤、成脂細胞瘤、脂肪軟骨瘤、脂肪纖維瘤、脂肪血管瘤、粘液脂瘤、軟骨肉瘤、軟骨瘤、軟骨肌瘤、脊索瘤、絨毛膜腺瘤、絨毛上皮瘤、成絨毛膜細胞瘤、骨肉瘤、成骨細胞瘤、骨軟骨纖維瘤、骨軟骨肉瘤、骨軟骨瘤、骨囊瘤、骨牙質瘤、骨纖維瘤、骨纖維肉瘤、血管肉瘤、血管瘤、血管脂肪瘤、血管軟骨瘤、成血管細胞瘤、血管角質瘤、血管神經膠質瘤、血管內皮瘤、血管纖維瘤、血管肌瘤、血管脂肪瘤、血管淋巴管瘤、血管脂肪平滑肌瘤、血管肌脂瘤、血管肌神經瘤、血管粘液瘤、血管網狀內皮瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉芽瘤、淋巴管瘤、淋巴瘤、淋巴粘液瘤、淋巴肉瘤、淋巴管纖維瘤、淋巴細胞瘤、淋巴上皮瘤、成淋巴細胞瘤、內皮瘤、成內皮細胞瘤、滑膜瘤、滑膜肉瘤、間皮瘤、結締組織瘤、尤因瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、成平滑肌瘤、平滑肌纖維瘤、橫紋肌瘤、橫紋肌肉瘤、橫紋肌粘液瘤、急性淋巴白血病、急性骨髓性白血病、慢性病貧血、紅細胞增多症、淋巴瘤、子宮內膜癌、膠質瘤、結直腸癌、甲狀腺癌、尿路上皮癌或多發性骨髓瘤。
所述癌症或腫瘤為原發性腦癌、腦腫瘤或轉移至腦的轉移性癌症或腫瘤。
優選的，該藥品或製劑單藥或聯用治療非小細胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌。
已上市的吉西他濱藥物製劑的相關情況如下。
中國注射用鹽酸吉西他濱，澤菲，國藥准字 H20030105，其適應症表述為可用於治療以下疾病： 局部晚期或已轉移的非小細胞肺癌，包括單藥和與順鉑聯合治療； 局部晚期或已轉移的胰腺癌，包括單藥； 吉西他濱與紫杉醇聯合，可用於治療經輔助/新輔助化療後復發，不能切除的、局部復發或轉移性乳腺癌。除非臨床上有禁忌，否則既往化療中應使用過蒽環類抗生素。
美國GEMZAR，其適應症表述為 GEMZAR® is a nucleoside metabolic inhibitor indicated: • in combination with carboplatin, for the treatment of advanced ovarian cancer that has relapsed at least 6 months after completion of platinum-based therapy. (1.1) • in combination with paclitaxel, for first-line treatment of metastatic breast cancer after failure of prior anthracycline-containing adjuvant chemotherapy, unless anthracyclines were clinically contraindicated. (1.2) • in combination with cisplatin, for the treatment of non-small cell lung cancer. (1.3) • as a single agent for the treatment of pancreatic cancer. (1.4) 翻譯為中文如下： GEMZAR®是一種核苷代謝抑制劑，適用於： •與卡鉑聯合，用於治療在鉑基治療完成後至少6個月復發的晚期卵巢癌。 •與紫杉醇聯合，用於既往含蒽環類藥物輔助化療失敗後轉移性乳腺癌的一線治療，除非蒽環類藥物在臨床上有禁忌。 •與順鉑聯合，用於治療非小細胞肺癌。 •單用，治療胰腺癌。
具有結構式III的西他濱抗癌衍生物及其製備的藥物或製劑作為吉西他賓衍生物，且在AKR1C3活化後代謝出吉西他濱而發揮抗腫瘤作用，因此發明人初步推測其可能具有與上市藥物吉西他濱類似的適應症。
本發明還提供治療癌症或腫瘤的方法，其包含施加上述的藥品或製劑的步驟；以及測定患者的癌細胞或組織的AKR1C3還原酶含量或表達水平的步驟， 如測得該AKR1C3還原酶含量或表達水平等於或大於預定值，則向該患者投予上述的藥品或製劑。
優選的，可以使用AKR1C3抗體來測定AKR1C3還原酶含量或表達水平。
本發明還提供另一種治療癌症或腫瘤的方法，其包含施加上述的藥品或製劑的步驟；以及AKR1C3還原酶含量或表達水平調節步驟， 當調節使得該AKR1C3還原酶含量或表達水平等於或大於預定值，則向該患者投予上述的藥品或製劑。
AKR1C3還原酶含量測定可以使用的方法包括ELISA法、IHC法等。
可使用商業化的人醛酮還原酶1C3(AKR1C3)ELISA檢測試劑盒對血漿、血液等液體樣品進行直接檢測，其他樣本進行處理後進行檢測。
IHC法即免疫組織化學方法，適用於對實體腫瘤樣本進行檢測。
檢測AKR1C3表達水平是指檢測相應的mRNA的表達水平，研究證明不同實體瘤的癌細胞的AKR1C3酶含量、AKR1C3 RNA表達水平具有顯著的相關性，不同血液癌細胞系的AKR1C3酶含量、AKR1C3 RNA表達水平具有顯著的相關性，因此通過檢測ARKR1C3 RNA含量（或表達水平）也能預測或表徵酶的含量，進而指導用藥，檢測AKR1C3的RNA（信使RNA即mRNA）含量或表達水平可以使用q-PCR技術。
檢測AKR1C3酶含量水平或q-PCR表達的方法參見申請人的專利申請公開文本WO2022183483A1、WO2022048492A1或相關研究論文（Reddi D, Seaton BW, Woolston D, et al. AKR1C3 expression in T acute lymphoblastic leukemia/lymphoma for clinical use as a biomarker. Sci Rep. 2022;12(1):5809. Published 2022 Apr 6. doi:10.1038/s41598-022-09697-6）。
本申請中的預定值需要經過臨床試驗得到，以類似的AKR1C3酶活化的抗癌前藥AST-3424（OBI-3424）為例，其預定值為IHC測試方法H-score 135（Tsimberidou, A.M., Verschraegen, C.F., Wesolowski, R. et al. Phase 1 dose-escalation study evaluating the safety, pharmacokinetics, and clinical activity of OBI-3424 in patients with advanced or metastatic solid tumors. Br J Cancer 129, 266–274 (2023). https://doi.org/10.1038/s41416-023-02280-4）。
有研究表明，放療後的頭頸癌患者的腫瘤組織的AKR1C3酶含量升高，因此通過放療輻射的放射線照射患者的腫瘤組織有可能提高AKR1C3酶的表達水平，放射線包括放射性同位素產生的α、β、γ射線和各類x射線治療機或加速器產生的x射線、電子線、質子束及其他粒子束等。
已有研究發現某些化學成分也能促進AKR1C3酶在人體內的表達，如kukui（學名：Aleurites moluccana L. Willd.）果仁油（日本專利申請JP2021145582A，發明名稱AKR1C1、AKR1C2和AKR1C3的產生促進劑）、丁酸鈉（Frycz BA, Murawa D, Borejsza-Wysocki M, et al. Transcript level of AKR1C3 is down-regulated in gastric cancer. Biochem Cell Biol. 2016;94(2):138-146. doi:10.1139/bcb-2015-0096）。
這種方法主要是針對患者的AKR1C3還原酶含量較低的情況，通過一定的調節治療/給藥過程，將該患者的AKR1C3還原酶含量水平調節到合適的水平。
關於本文所述藥品或製劑，所製得的藥品包含特定劑量範圍的所示化合物或其鹽或溶劑合物，和/或所製得的藥物為特定劑型、特定給藥方式施用。
關於本文藥品或製劑還可包含藥學上可接受的輔料或賦形劑。所述藥物可以為臨床施用的任何劑型，例如片劑、栓劑、分散片、腸溶片、咀嚼片、口崩片、膠囊、糖衣劑、顆粒劑、乾粉劑、口服溶液劑、注射用小針、注射用凍乾粉針或大輸液。根據具體劑型和施用方式，所述藥物中的藥學上可接受的輔料或賦形劑可以包括下述的一種或多種：稀釋劑、增溶劑、崩解劑、懸浮劑、潤滑劑、粘合劑、填充劑、矯味劑、甜味劑、抗氧化劑、表面活性劑、防腐劑、包裹劑、和色素等。
“施加”、“投予”藥物應是達到“治療有效量”，“治療有效量”是指當投予癌症患者時將具有預定治療作用，例如緩解、改善、緩和或消除該患者的癌症的一或多種表現的量。治療作用在投予一次劑量時未必會發生，且可能僅在投予一系列劑量之後發生。因此，可借由一或多次投藥來投予治療有效量。
“治療”病況或患者是指採取步驟來獲得有益的或所需的結果，包括臨床結果。出於本發明的目的，有益的或所需的臨床結果包括(但不限於)癌症的一或多種症狀的緩解或改善；疾病程度的減輕；疾病進展的延遲或減慢；疾病狀態的改善、緩和或穩定化；或其他有益的結果。在一些情況下，癌症的治療可以引起部分反應或穩定疾病。
“治療癌症或腫瘤”的對象是指任何適當物種：哺乳動物、魚類，例如哺乳動物，諸如鼠類、犬類動物、貓類動物、馬類動物或人類，優選地，所述患者是哺乳動物，更優選是人。
還提供吉西他濱衍生物H11的製備方法，包括化合物H11-D在酸性條件下水解以及鹼化操作： 。
本反應是脫去Boc保護基團的水解反應，水解反應在酸性條件下進行，一般使用的酸為非氧化性的無機酸或有機酸，並且反應多在有機溶劑中進行以利於析出反應中生成的鹽，常用的酸和反應溶劑體系有：鹽酸-二氧六環、三氟乙酸-二氯甲烷等。反應的條件比較溫和，一般室溫即可。
所述酸性條件由TFA提供，優選為將H11-D投入到TFA與DCM的混合體系中。
由於產物H11具有-NH 2基團，因此在酸性條件中是以鹽的形式存在，因此需要鹼化，即使用相應的鹼將酸性水解後的鹽轉化為游離的胺，所述鹼化操作過程包括：向反應體系中加入鹼使得體系呈鹼性，考慮到H11的酸鹼穩定性，使用的鹼不宜過強，最終鹼化後的pH值不宜過低：鹼化操作使用的鹼包括鹼金屬氫氧化物、碳酸氫鹽、碳酸鹽，如NaOH、KOH、NaHCO 3、KHCO 3、K 2CO 3、Na 2CO 3等，優選為在水解後將上述鹼的水溶液投入至反應體系的pH為8。
pH為8是指測試時使用pH試紙（一般pH試紙，不是精密pH試紙）進行測量，由於試紙比色過程的肉眼觀察誤差，其實際的值可能為大於7而小於10，因此如測得pH為大於7而小於10則應認定為與上述 反應體系的pH為8 等同。
還提供吉西他濱衍生物H11-D的製備方法，包括以下操作： 操作一，H11-A1與POX 3、有機胺攪拌反應； 操作二，反應完全後加入H11-A2與有機胺攪拌反應； 操作三，反應完全後加入異丙胺、有機胺攪拌反應； 操作四，加入水或者酸性鹽溶液進行後處理， ， 其中，X為Cl或者Br。
有機胺可以是三乙胺、三甲胺、二乙胺、二甲胺等。
酸性鹽即水溶液為酸性的鹽，比如部分弱鹼強酸鹽（鹼性弱的鹼與酸性強的酸形成的鹽）：硫酸銨、氯化銨。
優選的，操作一、二、三中的有機胺均為三乙胺，反應的溶劑均為二氯甲烷。
優選的，操作三中的加入異丙胺為加入其四氫呋喃溶液，操作四中的酸性鹽溶液為飽和NH 4Cl溶液。
本申請文本中未具體解釋或說明的詞彙以藥物化學、有機化學、生物化學、藥理學的教科書為准。
以下參照具體的實施例來說明本發明。本領域技術人員能夠理解，這些實施例僅用於說明本發明，其不以任何方式限制本發明的範圍。
下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的藥材原料、試劑材料等，如無特殊說明，均為市售購買產品。
一、H460癌細胞抑制試驗
使用體外人類腫瘤細胞系細胞毒性檢測。
H460非小細胞肺癌人類腫瘤細胞系（AKR1C3 高表達細胞系）的體外增殖資料報告於下文化合物表中。
IC 50值是經過以下步驟得到：
特定而言，以2×10 3個細胞/100 µL /孔密度將指數生長的細胞接種於96孔板中且在37℃下在5％CO 2、95％空氣及100％相對濕度中培育24小時。測試化合物單獨用藥：細胞鋪板24小時以後，化合物單獨作用，每孔補99 µL的生長培養基，然後加入1µL 200X準備的單用化合物，輕輕震盪確保混合均勻，然後放入37℃，5%CO 2培養箱中。繼續培養72小時後，使用CTG檢測活細胞數目。CTG檢測方法如下：將細胞待測板放置室溫平衡30分鐘，每孔棄掉100 µL培養基。每孔加25 µL CTG 試劑(CelltiterGlo試劑盒)，放置快速振盪器振盪2分鐘，室溫避光放置30分鐘。用多功能酶標儀讀取化學發光信號值，讀值時間為1000ms。使用電腦軟體計算導致50％生長抑制的藥物濃度(IC 50)，且結果列示於表1中，得到IC 50(nM)對應的數值。
類似的，為了進一步驗證化合物是否受到人源AKR1C3（醛固酮類還原酶家族1成員C3）的活化，某些化合物對H460癌細胞增殖試驗是使用特異性AKR1C3酶抑制劑AST-3021（3 µM）的預處理的條件下進行。具體實驗步驟如下：細胞鋪板24小時以後，每孔補98 µL的生長培養基，然後加入1 µL 200X化合物AST-3021到每一個孔中，輕輕震盪確保混合均勻，放入培養箱2小時後，加入1µL 200X準備的測試化合物，輕輕震盪確保混合均勻，然後放入37℃，5%CO 2培養箱中。所用抑制劑為Flanagan等人，Bioorganic and Medicinal Chemistry(2014)第967-977頁中的化合物36即 ，本申請中簡稱為AST-3021。此種情況下測試的數值為表1中+AST-3021 IC 50(nM)對應的數值。
將+AST-3021 IC 50(nM)對應的數值除以IC 50(nM)對應的數值即為特異性活化比，特異性活化比的相對大小可以評價這個化合物是否為人源AKR1C3（醛固酮類還原酶家族1成員C3）所活化的細胞毒化合物：當特異性活化比小於1時，認為該化合物不被人源AKR1C3（醛固酮類還原酶家族1成員C3）所活化；當特異性活化比大於1時，認為該化合物被人源AKR1C3（醛固酮類還原酶家族1成員C3）所活化，且數值越大，說明活化的程度越強，AKR1C3的選擇性越好。
表1：各化合物±AST-3021的IC 50值與特異性活化比(+AST-3021 IC 50/IC 50)對比資料
實驗結果表明，人源AKR1C3能夠啟動以上化合物H2~H11，即該系列化合物為AKR1C3活化的抗癌吉西他濱前藥。特別的，通過上表左邊的化合物與右邊對比化合物D1~D8的比較可知，R 1上連接的N原子為亞胺結構（-NH-）所得的結構式（I）的化合物較R 1上連接的N原子為叔胺基所得到的結構式（對比I）的化合物，其體外細胞毒性更高（在N上連接的碳原子數目接近且結構類似的情況下比較）：大體上，表中IC 50(nM)對應的數值和表中+AST-3021 IC 50(nM)對應的數值均更低（即結構式I的化合物具有更強的細胞毒性）。
如果上表中左邊的化合物用如下通式化合物（I）表示，右邊化合物用如下通式化合物（對比I）或（對比II）表示，則化合物（I）較化合物（對比I）具有更高的AKR1C3特異性活化比。 （I）、 （對比I）、 （對比II）。
上述結構中R 1至R 7是指代廣義的取代基，在本申請中不作定義，僅僅是為了說明本申請化合物與對比化合物中磷酸酯連接基團中不同情況： （對應本申請的化合物III）、 （對比I）、 （對比II） 所形成的化合物的活性差異。
更進一步，通過實驗還證實了結構式（對比II）的化合物完全不被AKR1C3活化，其可能不是AKR1C3酶的底物。
也就是說，本發明糾正了發明申請硝基苄基衍生物抗癌試劑，PCT申請號PCT/US2016/025665，公開號WO2016/161342A1，對應中國申請號201680020013.2，公開號CN108136214A所指出的硝基苄基衍生物： ， 均為AKR1C3活化的抗癌藥物的部分不準確觀點，即明確了對於吉西他濱-硝基苄基衍生物而言，結構式（對比II）的化合物完全不被AKR1C3活化，並且通過實例比較發現結構式（I）的化合物的腫瘤細胞增殖抑制活性比結構式（對比I）的化合物高。
二、AKR1C3活化依賴的細胞增殖抑制活性實驗
2.1 吉西他濱及化合物H11在AKR1C3抑制劑AST-3021存在與否時對H460癌細胞的抑制試驗
實驗方案如下， 1）將H460細胞懸液加入96孔板，每孔100 µL，細胞密度為2000/孔。 2) 細胞在37℃，5%CO 2培養箱中培養過夜。 3)化合物處理 聯合用藥：細胞鋪板24小時以後，每孔補98 µL的生長培養基。加入1 µL AST-3021到每一個孔中（終濃度3 µM），輕輕震盪確保混合均勻，放入培養箱2小時後，加入1 µL不同濃度的測試化合物，輕輕震盪確保混合均勻，然後放入37℃，5%CO 2培養箱中。 單獨用藥：細胞鋪板24小時以後，每孔補99 µL的生長培養基。加入1 µL不同濃度的測試化合物，輕輕震盪確保混合均勻，然後放入37℃，5%CO 2培養箱中。 4)將細胞板放置培養箱72小時。 5)將細胞待測板放置室溫平衡30分鐘，每孔棄掉100 µL培養基。 6)每孔加入25 µL CTG 試劑，放置快速振盪器振盪2分鐘，室溫避光放置30分鐘。 7)用多功能酶標儀讀取化學發光信號值，讀值時間1000ms。 8)用GraphPad Prism 5 software計算IC 50，利用以下非線性擬合公式來得到化合物的IC 50(半數抑制濃度)。
為了進一步驗證化合物為人源AKR1C3（醛固酮類還原酶家族1成員C3）所特異性活化，特異性AKR1C3酶抑制劑AST-3021 (3 μM) 對細胞進行預處理後加入化合物，檢測AST-3021 存在與否，H460腫瘤細胞的增殖是否受到影響。
化合物吉西他濱及H11對H460腫瘤細胞在AKR1C3抑制劑AST-3021存在與否情況下的抑制作用IC 50資料，如表2和表3所示，吉西他濱對應的IC 50曲線圖如圖1所示，表3中，實驗編號3對應的化合物H11的IC 50曲線圖如圖2所示。
表2：吉西他濱對H460癌細胞在AKR1C3抑制劑存在與否情況下抑制作用IC 50資料
化合物 IC 50（nmol/L） 特異性活化比
未添加AST-3021 添加AST-3021
吉西他濱 13.19 14.21 1.08
表3：化合物H11對H460癌細胞在AKR1C3抑制劑存在與否情況下抑制作用IC 50資料
實驗編號 化合物 IC 50（nmol/L） 特異性活化比
未添加AST-3021 添加AST-3021
1 H11 16.25 1473.00 90.65
2 H11 30.29 2348.00 77.52
3 H11 35.70 2942.00 80.41
測試結果表明，吉西他濱在是否添加AST-3021的情況下其IC 50值接近，特異性活化比只有1.08，表明吉西他濱抑制癌細胞的活性不是依賴AKR1C3的表達。而化合物H11在是否添加AST-3021的情況下其IC 50值相差較大，三次不同時間測試的結果均顯示其特異性活化比達到75倍以上，結合吉西他濱在是否添加AST-3021的情況下其IC 50特異性活化比關係，說明化合物H11是AKR1C3活化依賴的抗癌化合物，其體外活性與AKR1C3酶的表達關係非常緊密。
2.2 化合物H11在AKR1C3抑制劑AST-3021存在與否時對HepG2癌細胞的抑制試驗
我們選用人源AKR1C3 中高表達的HepG2 細胞，使用2.1中同樣的測試方法，測試化合物H11對HepG2癌細胞在AKR1C3抑制劑AST-3021存在與否情況下的IC 50資料，如表4所示，實驗編號5對應的IC 50曲線圖如圖3所示。
表4：化合物H11對HepG2癌細胞在AKR1C3抑制劑存在與否情況下抑制作用IC 50資料
實驗編號 化合物 IC 50（nmol/L） 特異性活化比
未添加AST-3021 添加AST-3021
4 H11 42.85 3350.00 78.18
5 H11 39.82 1582.00 39.73
6 H11 80.89 1660.00 20.52
測試結果表明，化合物H11在是否添加AST-3021的情況下其IC 50值相差較大，三次不同時間測試的結果均顯示其特異性活化比達到20倍以上，說明化合物H11對HepG2癌細胞是AKR1C3活化依賴的抗癌化合物，其體外活性與AKR1C3酶的表達關係非常緊密。
2.3 化合物H11對不同胰腺癌細胞系癌細胞/不同白血病癌細胞系的體外增殖抑制實驗
參照上述實施例2.1過程中單藥的操作過程，對不同胰腺癌細胞系/不同白血病癌細胞系的體外增殖抑制作用進行測試，具體IC 50結果如下表15、16。
表15：化合物H11對具有不同AKR1C3 RNA表達水平的13種胰腺癌細胞系的體外增殖抑制作用結果
表16：化合物H11對具有不同AKR1C3 RNA/蛋白表達水平的15種白血病細胞系的體外增殖抑制作用結果
表中AKR1C3 Expression是AKR1C3 RNA Expression，且AKR1C3 RNA以LOG2(FPKM)表示。
FPKM，Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments每千個鹼基的轉錄每百萬映射讀取的fragments。
表中Normalized AKR1C3 Protein Expression是通過Westernblot實驗測定，並將各個癌細胞的AKR1C3蛋白條帶灰度值與參比蛋白β-tubulin條帶灰度值的比值作為蛋白表達相對值（Normalized AKR1C3 Protein Expression）。
根據上述化合物H11在不同胰腺癌、不同白血病癌細胞中的體外增殖抑制活性資料可知，H11化合物的細胞增殖抑制活性與AKR1C3 RNA含量以及AKRC3蛋白表達強弱高度相關，呈現依賴性。
三、化合物H11與吉西他濱在胰腺癌PA1222模型的體內藥效實驗對比
實驗說明：從HuPrime®胰腺癌異種移植模型PA1222（AKR1C3 高表達胰腺癌PDX 模型，H-score=204.28，AKR1C3 RNA Log2 FPKM=7.386）荷瘤小鼠收取腫瘤組織，切成直徑為2-3mm的瘤塊接種於BALB/c裸小鼠右前肩胛處皮下。待腫瘤平均體積約為102 mm 3時，根據腫瘤大小隨機分組，表5為測試藥在HuPrime®胰腺癌PA1222腫瘤模型中的抗腫瘤作用實驗設計方案。
表5：測試藥在HuPrime®胰腺癌PA1222腫瘤模型中的抗腫瘤作用實驗設計
組別 動物數 給藥組 劑量(mg/kg) 給藥方式 給藥週期
1 5 10%無水乙醇+10%聚氧乙烯（35）蓖麻油+80% 葡萄糖注射液D5W（pH 7.7-8.0） - 尾靜脈注射i.v. Q2D×3 weeks
2 5 吉西他濱 80 腹腔注射i.p. Q3Dx4
3 5 H11 240 灌胃給藥p.o. QD×21
4 5 H11 160 腹腔注射i.p. QD×5，2 days off，2 weeks off；QD×5
5 5 H11 160 尾靜脈注射i.v. Q2D×3 weeks
注：1.給藥體積為10 μL/g。2. Q3Dx4; 每三天給藥一次，連續給藥4次；Q2Dx3; 每兩天給藥一次，連續給藥3周；QDx21; 每天給藥一次，連續給藥21天；QD×5，2 days off，2 weeks off；QD×5：每天給藥一次，連續給藥5天，停兩天，停兩周，再連續給藥5天，每天一次。
首次給藥後的第32天，即Day 32結束第2組、第3組、第4組及第5組，取瘤，稱瘤重，拍照瘤組織，速凍瘤組織。Day 57，結束第1組，取瘤，稱瘤重，拍照瘤組織，速凍瘤組織。根據相對腫瘤抑制率TGI（%）進行療效評價，根據動物體重變化和死亡情況進行安全性評價。
療效評價標準及計算方式如下： 相對腫瘤增殖率，T/C %，即在某一時間點，治療組和對照組相對腫瘤體積或瘤重的百分比值。計算公式如下：T/C % = T RTV/ C RTV× 100%（T RTV：治療組平均RTV ；C RTV：溶媒對照組平均RTV；RTV=V t/V 0，V 0為分組時該動物的瘤體積，V t為治療後該動物的瘤體積）； 相對腫瘤抑制率，TGI（%），計算公式如下：TGI% =（1-T/C）× 100%。（T和C分別為治療組和對照組在某一特定時間點的平均相對腫瘤體積（RTV））。
在首次給藥後的第32天對胰腺癌PA1222模型中各組藥效進行分析，其結果如表6所示。記錄不同天數腫瘤的平均體積大小，並取平均值，結果如表7所示，將給藥開始後前32天的平均腫瘤體積繪製成曲線圖，如圖4所示。
表6：在HuPrime®胰腺癌PA1222模型中各組藥效分析表
實驗組 首次給藥後的第32天（即Day 32，10/4/2021）
腫瘤體積 （ ±S） 相對腫瘤體積（ ±S） TGI (%) T/C (%) P Value （相較於對照組）
第1組            629.85±136.87 6.21±1.36 - - -
第1組                   1247.07±307.89（Day 56） 12.15±2.89 - - -
第2組                  6.79±4.33 0.06±0.04 99.03% 0.97% ＜0.001
第3組           44.61±22.14 0.47±0.27 92.35% 7.65% ＜0.001
第4組 202.58±45.40 2.01±0.41 67.62% 32.38% ＜0.05
第5組 0.00±0.00 0.00±0.00 100.00% 0.00% ＜0.001
注：1. 資料以“平均值 ± 標準誤差”表示；2. T/C % = T RTV/ C RTV× 100%；TGI% =（1-T/C）× 100%；
表7：在HuPrime®胰腺癌PA1222模型中各組小鼠腫瘤體積隨治療時間的變化
腫瘤體積（mm 3）（ ±S）
時間 第1組 第2組         第3組 第4組 第5組
給藥開始後0天 102.69±6.88 102.95±6.86 102.83±6.64 101.91±5.96 102.11±6.00
給藥開始後4天 144.96±13.68 104.07±9.22 123.16±3.48 105.94±8.67 98.46±3.72
給藥開始後7天 177.74±24.98 74.43±5.22 90.07±4.65 96.63±11.34 79.97±3.69
給藥開始後11天 243.12±34.25 38.92±4.90 54.28±5.75 116.07±22.87 40.67±3.20
給藥開始後14天 299.90±51.57 24.66±3.94 41.73±7.84 139.61±22.61 22.37±2.70
給藥開始後18天 358.17±54.38 17.66±4.82 34.60±7.08 153.86±27.60 11.52±4.90
給藥開始後21天 399.99±56.79 12.13±3.15 29.52±12.59 188.69±33.45 11.56±3.08
給藥開始後25天 490.19±78.73 10.23±3.05 30.71±15.00 198.68±40.97 6.73±2.81
給藥開始後28天 540.46±97.48 7.97±3.70 30.59±12.12 195.90±41.71 0.00±0.00
給藥開始後32天 629.85±136.87 6.79±4.33 44.61±22.14 202.58±45.40 0.00±0.00
給藥開始後35天 669.64±145.73 / / / /
給藥開始後39天 799.46±184.86 / / / /
給藥開始後42天 912.51±196.70 / / / /
給藥開始後46天 1004.17±295.28 / /　 /　 /　
給藥開始後49天 1064.65±273.52 /　 /　 /　 /　
給藥開始後53天 1154.21±310.62 /　 /　 /　 /　
給藥開始後56天 1247.07±307.89 /　 /　 /　 /　
為了驗證測試藥對實驗動物體重變化的影響，基於上述實驗方法，在不同時間點同時記錄實驗動物的體重變化情況，如表8所示，並計算其體重增長率，繪製成曲線圖，如圖5所示。
表8：不同天數小鼠平均體重（g）
天數 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
第1組 22.2 / 22.4 / 22.4 / / 22.9 22.9 / 22.6 22.9 23.0 / 22.4 / / / 22.8 /
第2組 21.1 / / 21.2 21.0 / 21.2 21.4 / 21.5 / 21.3 / / 21.9 / / / 22.1 /
第3組 21.8 21.5 21.5 21.6 21.9 22.3 21.7 21.6 21.7 22.5 21.6 21.9 22.0 21.9 21.6 21.6 22.1 21.8 21.9 21.8
第4組 21.4 22.0 21.5 22.0 21.7 / / 22.3 / / / 22.5 / / 22.9 / / / 22.7 /
第5組 21.6 / 21.8 / 21.4 / / 20.9 21.6 / 21.3 22.1 22.2 / 22.0 / 22.3 / 22.1 /
天數 20 21 22 23 24 25 26 28 32 33 35 39 40 42 46 47 49 53 56 57
第1組 22.6 23.0 / / / 23.6 / 23.1 23.4 23.5 23.3 23.7 24.1 23.6 24.1 24.2 23.5 24.2 23.7 22.9
第2組 / 22.6 / / / 22.3 / 22.1 23.1 / / / / / / / / / / /
第3組 21.9 21.8 / / / 22.6 / 22.4 22.9 / / / / / / / / / / /
第4組 / 22.9 22.6 22.5 22.6 22.5 / 22.6 23.3 / / / / / / / / / / /
第5組 22.1 22.3 / / / 22.6 / 22.5 23.2 / / / / / / / / / / /
上述實驗資料表明： 測試藥吉西他濱（80 mg/kg，第2組）、H11 240 mg/kg（第3組，QD×21）以及H11 160 mg/kg, i.v.（第5組，Q2D×3weeks）治療組在首次給藥後的第32天（Day 32）有極其顯著的抑瘤作用，相對腫瘤抑制率TGI（%）分別為99.03%、92.35%以及100%，腫瘤完全抑制率分別為60%、20%和100%。H11 160 mg/kg, i.p.（第4組，QD×5，2 days off，2 weeks off；QD×5）治療組在首次給藥後的第32天（Day 32）有顯著的抑瘤作用，相對腫瘤抑制率TGI(%)為67.62%。同時，測試藥H11 160 mg/kg, i.v.（第5組，Q2D×3weeks）的抑瘤效果優於H11 160 mg/kg, i.p.（第4組，QD×5，2 days off，2 weeks off；QD×5），兩組間統計學比較（第5組和第4組）具有顯著性差異（p＜0.001）。測試藥H11 160 mg/kg, i.v.（第5組，Q2D×3weeks）的抑瘤效果優於H11 240 mg/kg, p.o.（第3組，QD×21），兩組間統計學比較（第5組和第3組）有顯著性差異（p＜0.05）。測試藥H11 160 mg/kg, i.v.（第5組，Q2D×3weeks），H11 240 mg/kg, p.o.（第3組，QD×21）的抑瘤效果和測試藥吉西他濱（80 mg/kg，第2組）治療組相比沒有明顯差異，兩組間統計學比較（Group 5 vs Group 2以及Group 3 vs Group 2）均沒有顯著性差異（p值均大於0.05）。
測試藥吉西他濱80 mg/kg治療組、H11 240 mg/kg（第3組，QD×21）治療組、H11 160 mg/kg, i.p.（第4組，QD×5，2 days off，2 weeks off；QD×5）治療組以及測試藥H11 160 mg/kg, i.v.（第5組，Q2D×3weeks）治療組以及對照組的小鼠都沒有出現任何明顯的體重下降的現象，治療期間耐受良好。
四、代謝穩定性評價實驗
4.1 化合物H11及陽性對照品維拉帕米在肝微粒體中的代謝穩定性研究
實驗方案： （一）溶液準備 按照下表9配置主要溶液： 表9：主要溶液的製備
試劑 物料濃度 體積 終濃度
磷酸鹽緩衝液 100 mM 216.25 μL 100 mM
微粒體 20 mg/mL 6.25 μL 0.5 mg/mL
（二）分別進行兩組實驗 a)輔因子(NADPH):在培養液中加入25μL 10 mM NADPH。肝微粒體的終濃度為0.5 mg/mL, NADPH的終濃度為1 mM。 b)不加輔因子(NADPH):加入25μL 100 mM磷酸鹽緩衝液。肝微粒體的終濃度為0.5 mg/mL。混合物在37℃預熱10分鐘。 （三）加入2.5 μL的100 μM對照化合物或試驗化合物溶液即可開始反應。本研究以維拉帕米為陽性對照。試驗化合物和對照化合物的最終濃度均為1 μM。培養液在37°C的水中培養。 （四）分別於0.5、5、15、30和60分鐘從反應溶液中取30 μL的等份。加入5體積的冷乙腈和IS (內標，含有100 nM的阿普唑侖，200 nM的咖啡因和100 nM的甲苯丁醯胺)，反應停止。樣品在3,220 g的轉速下離心40分鐘。取100 μL上清液與100 μL超純水混合，等份，進行LC-MS/MS分析。 （五）資料分析 所有計算均使用Microsoft Excel進行。從提取的離子色譜圖中確定峰面積。斜率值k由母藥剩餘百分比與孵育時間曲線的自然對數線性回歸確定。 （1）體外半衰期(體外t 1/2)由斜率值確定：體外t 1/2=-0.693/k。 （2）將體外t 1/2(min)轉化為體外固有清除率(體外CL int, µL/min/1×10 6個細胞)，使用以下公式(重複測定的平均值)：CL int= - kV/N，其中V =培養體積(0.2 mL)，N =每孔肝細胞數(0.1×10 6個細胞)。 （3）擴大清除率Scale-up CL int(mL/min/kg)、肝清除率Predicted Hepatic CL H(mL/min/kg)和肝攝取率Hepatic Extraction Ratio (ER)使用如下的計算公式： Scale-up CLint = (0.693/T 1/2)×(1/(肝細胞濃度(0.5×10 6個細胞/ml)))×比例因子(表10)； Predicted Hepatic CL H= (QH×Scale-up CL int×fub) / (QH + Scale-up CL int×fub)； ER = Predicted Hepatic CL H/QH； 其中，QH為表10中的肝血流量(mL/min/kg)，fub為血漿中未結合藥物的分數，假設為1。
表10：在人類、猴子、犬、大鼠和小鼠肝細胞內在清除預測（Intrinsic Clearance Prediction）的比例因子（Scaling Factors）
物種 肝微粒體蛋白質 每千克體重肝臟重量 比例因子 （Scaling Factor） 肝血流量（Hepatic Blood Flow） (mL/min/kg)
每克肝臟
人類 40 25.7 1028 21
猴子 40 30 1200 44
犬 55 32 1760 31
大鼠 61 40 2440 68
小鼠 47 88 4136 90
注：比例因子（Scaling Factors）=(每克肝臟微粒體蛋白)×(每千克體重肝臟重量)。
實驗結果： 採用上述實驗方案分別檢測並計算化合物H11和陽性對照品維拉帕米（Verapamil）在人、猴、犬、大鼠和小鼠肝微粒體中的代謝穩定性資料，表11為化合物H11和維拉帕米在人、猴、犬、大鼠和小鼠肝微粒體中的隨時間剩餘百分比變化資料，表12為化合物H11和維拉帕米在人、猴、犬、大鼠和小鼠肝微粒體中的代謝穩定性資料。
表11：化合物H11和維拉帕米在人、猴、犬、大鼠和小鼠肝微粒體中的隨時間剩餘百分比變化資料
化合物 物種 是否加入輔因子 剩餘百分比(%)
0.5分鐘 5分鐘 15分鐘 30分鐘 60分鐘
維拉帕米 （Verapamil） 人 加入NADPH 100.00 40.59 9.10 2.75 BLOD
不加入NADPH 100.00 - - - 104.85
猴 加入NADPH 100.00 5.34 BLOD BLOD BLOD
不加入NADPH 100.00 - - - 104.77
犬 加入NADPH 100.00 31.34 5.52 0.66 BLOD
不加入NADPH 100.00 - - - 93.24
大鼠 加入NADPH 100.00 27.74 2.94 BLOD BLOD
不加入NADPH 100.00 - - - 103.79
小鼠 加入NADPH 100.00 10.79 BLOD BLOD BLOD
不加入NADPH 100.00 - - - 98.85
H11 人 加入NADPH 100.00 86.00 63.82 43.87 26.14
不加入NADPH 100.00 - - - 100.86
猴 加入NADPH 100.00 46.01 13.27 0.59 0.09
不加入NADPH 100.00 - - - 105.87
犬 加入NADPH 100.00 90.20 71.99 52.53 32.12
不加入NADPH 100.00 - - - 92.14
大鼠 加入NADPH 100.00 85.67 56.17 29.55 13.20
不加入NADPH 100.00 - - - 103.20
小鼠 加入NADPH 100.00 85.55 55.03 36.05 16.85
不加入NADPH 100.00 - - - 93.32
注：BLOD表示低於檢測限度。
表12：化合物H11和維拉帕米在人、猴、犬、大鼠和小鼠肝微粒體中的代謝穩定性資料
化合物 物種 體外半衰期 t 1/2(min) 體外固有清除率CL int(μL/min/mg) 擴大清除率Scale-up CL int(mL/min/Kg) 肝清除率Predicted Hepatic CL H(mL/min/kg) 肝攝取率Hepatic Extraction Ratio (ER)
維拉帕米 （Verapamil） 人 3.46 400.78 412.00 19.98 0.95
猴 1.06 1304.60 1565.52 42.80 0.97
犬 2.69 515.70 907.63 29.98 0.97
大鼠 2.43 569.96 1390.69 64.83 0.95
小鼠 1.40 989.53 4092.70 88.06 0.98
H11 人 31.01 44.71 45.97 14.41 0.69
猴 5.06 274.95 329.94 38.81 0.88
犬 36.33 38.16 67.17 21.21 0.68
大鼠 20.11 68.99 168.33 48.43 0.71
小鼠 23.30 59.52 246.18 65.90 0.73
實驗結論： 陽性對照維拉帕米在孵育過程中剩餘百分比隨孵育時間的延長而明顯下降（表12），資料結果符合該陽性藥物特性，因此本實驗的肝微粒體的活性正常，對檢測藥物H11的實驗結果是可信的。
實驗結果表明，H11在人、猴、犬、大鼠和小鼠肝微粒體孵育以後計算得到的固有清除率分別為44.71μL/min/10 6、274.95μL/min/10 6、38.16μL/min/10 6、68.99μL/min/10 6和59.52μL/min/10 6細胞。H11在猴肝微粒體中清除率較高，穩定性比較差；在人、犬、大鼠和小鼠肝微粒體中等清除，具有一定的穩定性。
4.2 化合物H11的血漿穩定性研究
實驗方案： （一）溶液的製備 在DMSO中配製1 mM待測試化合物工作溶液。在乙腈中製備1 mM的丙胺太林（Propantheline）工作溶液。在DMSO中配製1 mM的洛伐他汀（Mevinolin）工作溶液。丙胺太林作為人、猴、狗和小鼠血漿穩定性試驗的陽性對照。洛伐他汀為大鼠血漿穩定性試驗的陽性對照。 （二）試驗過程 A.向培養板中加入每個細胞的血漿398µL, 37℃預熱培養板15分鐘。 B.預培養完成後，將2 µL工作液(試驗液或對照液)加到上述398µL的血漿中，最終濃度為5µM。有機溶劑的最終濃度為0.5%。試驗一式兩份。 C.反應樣品在37℃孵育。 D.分別在0、15、30、60和120分鐘從反應樣品中提取50µL。加入450μL內部標準的冷乙腈即可停止反應。 E.所有樣品渦旋10分鐘，然後3,220 g離心30分鐘以沉澱蛋白質。取上清液100μL轉移到新平板上。根據LC-MS信號回應和峰形，用超純水稀釋上清液。 （三）資料分析 樣品採用LC-MS/MS進行分析，所有計算均使用Microsoft Excel進行。從提取的離子色譜圖中測定峰面積比。 （1）每個時間點剩餘化合物的百分比由以下公式計算： 剩餘百分比t min(%)=峰面積比t min/峰面積比0 min ×100， 其中，峰面積比t min為對照化合物與測試化合物在t min時的峰面積比，峰面積比0 min為對照化合物與測試化合物在零時間點的峰面積比。 （2）體外半衰期(體外t 1/2)由斜率值確定： t 1/2=-0.693/k， 其中，斜率值k由母藥剩餘百分比與孵育時間曲線的自然對數線性回歸確定。
實驗結果： 採用上述實驗方案分別檢測並計算化合物H11和陽性對照品丙胺太林（Propantheline）、洛伐他汀（Mevinolin）在人、猴、犬、大鼠和小鼠血漿中的代謝穩定性資料，表13為化合物H11和陽性對照品丙胺太林、洛伐他汀在人、猴、犬、大鼠和小鼠血漿中的隨時間剩餘百分比變化資料。
表13：化合物H11和丙胺太林、洛伐他汀在血漿中的隨時間剩餘百分比變化資料
化合物 物種 剩餘百分比(%) t 1/2(min)
0分鐘 15分鐘 30分鐘 60分鐘 120分鐘
丙胺太林 （Propantheline） 人 100.00 81.24 59.99 32.76 7.75 36.64
猴 100.00 90.53 77.57 70.39 49.22 121.02
犬 100.00 101.04 87.98 85.64 66.64 202.71
洛伐他汀（Mevinolin） 大鼠 100.00 5.27 0.52 0.45 0.34 3.53
丙胺太林（Propantheline） 小鼠 100.00 69.89 43.11 15.28 2.03 21.83
H11 人 100.00 95.74 94.17 102.77 99.46 ∞
猴 100.00 100.61 92.99 103.66 98.48 ∞
犬 100.00 104.14 103.37 102.42 103.04 ∞
大鼠 100.00 108.59 105.39 100.74 109.53 ∞
小鼠 100.00 102.19 96.83 104.70 97.53 ∞
實驗結論： 陽性對照丙胺太林、洛伐他汀的實驗資料結果符合該陽性藥物特性，因此本實驗使用的不同血漿的活性正常，對檢測藥物H11的實驗結果是可信的。
研究資料表明，H11在小鼠、大鼠、犬、猴和人血漿中37℃孵育至少2小時是穩定的，無明顯的代謝。
五、最大耐受劑量(Maximal tolerance dose, MTD)實驗
實驗過程： 按照下表14研究方案對小鼠進行分組並給藥，給藥濃度及劑量水平如表14所示，在第1天至第5天和第14天至第19天，用不同劑量水平的溶媒對照或化合物H11進行腹腔注射，給藥體積為10ml/kg。第1、3、4組動物於第22天處死並屍檢，第2組動物於第16天處死並屍檢。 表14:研究方案
組別 處理藥品 給藥劑量水平 （mg/kg/天） 濃度（mg/ml） 小鼠動物數量 （雄性/雌性）
1 空白載體 a / / 2/2
2 H11 80 8 3/3
3 H11 160 16 3/3
4 H11 320 32 3/3
注：a，常規的10%的聚氧乙烯(35)蓖麻油和10%的乙醇溶於5%葡萄糖注射液。
評估的參數包括籠旁觀察、詳細的臨床觀察和給藥後觀察(大約劑量後1~2小時)、體重和體重變化、攝食量和大體病理學。
實驗結果： （1）動物死亡情況 實驗期間，所有實驗動物均存活至計畫剖檢。 （2）臨床症狀 未見化合物相關的異常的臨床表現。 （3）對動物體重和攝食量的影響 未見化合物相關的異常的體重和攝食量改變。 （4）病理學檢查結果 化合物相關的病理學檢查主要包括≥160mg/kg可見脾變大， 320mg/kg劑量組還可見腎被膜白色改變，其他未見異常。
實驗結論： 本實驗條件下，小鼠每天一次，連續5天，共計兩輪腹腔注射給予化合物H11，動物安全性良好，除剖檢可見脾變大及320mg/kg劑量組腎被膜改變外，其他均未見異常，因此，該實驗條件下的最大耐受量可以達到320 mg/kg（腹腔注射給藥，每天1次，連續給藥5天），而文獻報導吉西他濱的MTD為120 mg/kg（腹腔注射給藥，每隔3天1次，連續給藥4次）（Cancer Chemotherapy and Pharmacology 38(4):335-42），明顯的，作為吉西他濱的前藥，H11相對於吉西他濱具有更大的耐受劑量，更安全。
六、化合物H11與吉西他濱相關耐藥機制研究
吉西他濱（dFdC）是親水性的，通過各種核苷轉運蛋白(NTs) 轉運到細胞中，包括人濃縮型核苷轉運蛋白（hCNTs）和人平衡型核苷轉運蛋白（hENTs）。已知吉西他濱通過5種人核苷轉運蛋白，hCNT1，hCNT2，hCNT3以及hENT1和hENT2轉運到細胞中，其中hENT1 蛋白能夠雙向運輸吉西他濱進入或外排出細胞，以維持細胞內吉西他濱的濃度平衡（文獻1、文獻2）。
有研究表明hENT1 蛋白的缺失會顯著抑制吉西他濱轉運進入細胞，並且hENT1蛋白的低表達能夠作為臨床患者對吉西他濱治療預後不佳的指標（文獻3）。
吉西他濱進入細胞後，通過去氧胞苷激酶（dCK）磷酸化成單磷酸吉西他濱（dFdCMP），隨後通過嘧啶核苷單磷酸激酶（NMPK，也稱為 UMP/CMP）和核苷二磷酸激酶（NDPK），逐步磷酸化形成二磷酸吉西他濱（dFdCDP）和三磷酸吉西他濱（dFdCTP），並最終進入細胞核行使抑制DNA 合成的功能。在上述吉西他濱活化的過程中，dCK介導的從dFdC形成單磷酸化dFdCMP是最主要的限速步驟，決定了吉西他濱的後續磷酸化及是否能夠被徹底啟動，並最終進入細胞核行使抑制DNA合成的功能（文獻1、文獻4、文獻5、文獻6）。
同時，大量進入細胞內的吉西他濱會由胞苷脫氫酶（CDA）介導的脫氨作用，誘導形成失活狀態的2’，2’-二氟去氧尿苷（dFdU），並被外排出細胞膜。
綜上所述，由於吉西他濱的上述代謝特性，其在抑制腫瘤細胞增殖的過程中可能會產生耐藥性，腫瘤細胞對吉西他濱的耐藥主要涉及到三個方面： 1. hENT1蛋白對吉西他濱進入細胞的轉運功能； 2. dCK介導的從dFdC磷酸化形成dFdCMP的限速過程； 3. CDA介導的吉西他濱脫氨作用。
本發明開發的一系列化合物是吉西他濱小分子前藥，根據實施例二實驗可以看出，該前藥是通過AKR1C3酶特異性啟動的。
為了進一步研究本發明開發的一系列AKR1C3酶特異性啟動的吉西他濱小分子前藥是否也存在與吉西他濱類似的代謝途徑或耐藥性，發明人進一步進行了如下的機理研究： 1、利用核苷轉運蛋白的抑制劑Dipyridamole開展化合物H11與吉西他濱在H460細胞中的核苷轉運蛋白（Nucleoside Transport, NT）依賴性的細胞毒性研究； 2、利用dCK 的抑制劑2’-deoxycytidine開展化合物H11與吉西他濱在H460細胞中的dCK依賴性的細胞毒性研究； 3、利用胞苷脫氫酶（CDA）的抑制劑Tetrahydrouridine開展化合物H11在H460細胞中的CDA依賴性的細胞毒性研究。
6.1化合物H11與吉西他濱在H460細胞中的核苷轉運蛋白依賴性的細胞毒性研究
參照上述實施例2.1過程中聯合用藥、單藥的操作過程，進行化合物H11與吉西他濱單藥/聯合核苷轉運蛋白的抑制劑Dipyridamole（CAS No. : 58-32-2）的體外增殖抑制作用進行測試，具體IC 50結果如下表17，抑制曲線如圖6所示。
表17：化合物H11與吉西他濱單藥/聯合核苷轉運蛋白的抑制劑Dipyridamole的體外增殖抑制實驗結果
測試化合物 IC 50(nM)/倍數差異
單獨給藥 + 4 µM Dipyridamole + 8 µM Dipyridamole + 16 µM Dipyridamole
Gemcitabine 13.39/1 250.9/18.74 340.3/25.41 518.5/38.72
H11 33.79/1 11.98/0.35 12.66/0.37 12.71/0.38
另申請人單藥測試Dipyridamole對H460細胞的IC 50值在30µM左右，與上述聯用濃度差別較大，而且根據圖6可知，不同濃度的Dipyridamole聯用後抑制率曲線幾乎沒有變化，意味著上述濃度的Dipyridamole對H460細胞增殖幾乎無影響。
上述實驗結果表明，在H460中，吉西他濱顯示出核苷轉運蛋白依賴性的細胞毒性，化合物H11表現出非核苷轉運蛋白依賴性的細胞毒性。吉西他濱進入細胞需要依賴核苷轉運蛋白的轉運才能抵達細胞，發揮抗腫瘤作用，而H11進入細胞發揮抗腫瘤作用不依賴於核苷轉運蛋白。
本發明開發的一系列吉西他濱前藥化合物均是通過磷酸酯基連接硝基苄基和吉西他濱分子上的羥甲基形成的吉西他濱磷酸酯前藥，因此，本發明開發的一系列吉西他濱前藥均有可能克服吉西他濱由於核苷轉運蛋白的轉運功能受損而產生的耐藥性。
6.2 化合物H11與吉西他濱在H460細胞中去氧胞苷激酶（dCK）依賴性的細胞毒性研究
參照上述實施例2.1過程中聯合用藥、單藥的操作過程，進行化合物H11與吉西他濱單藥/聯合去氧胞苷激酶（dCK）抑制劑2'-deoxycytidine（CAS No. : 951-77-9）的體外增殖抑制作用進行測試，具體IC 50結果如下表18，抑制曲線如圖7所示。
表18：化合物H11與吉西他濱單藥/聯合聯合去氧胞苷激酶抑制劑2'-deoxycytidine的體外增殖抑制實驗結果
測試化合物 IC 50(nM) 倍數差異
單獨給藥 + 10 µM 2'-deoxycytidine
Gemcitabine 16.63 1316 79.09
H11 45.68 68.43 1.5
另申請人單藥測試2'-deoxycytidine對H460細胞的IC 50值在600µM左右，與上述聯用濃度差別巨大，意味著上述濃度的Dipyridamole對H460細胞增殖幾乎無影響。
上述實驗結果表明，在H460中，吉西他濱表現出dCK依賴性的細胞毒性，而化合物H11表現出非dCK依賴性的細胞毒性。進一步說明H11的活化產物能夠避開dCK 介導的磷酸化過程，有效地減少了H11啟動產物被磷酸化的步驟。
本發明開發的一系列吉西他濱前藥化合物均是通過磷酸酯基連接硝基苄基和吉西他濱分子上的羥甲基形成的吉西他濱磷酸酯前藥，均可以通過AKR1C3酶啟動直接釋放出單磷酸吉西他濱（dFdCMP），這樣在有效提高特異性的腫瘤靶向殺傷能力的同時，避免了 dCK 介導的從dFdC被磷酸化形成dFdCMP 的限速過程。因此，本發明開發的一系列吉西他濱前藥化合物可通過腫瘤細胞高表達的AKR1C3而增加腫瘤細胞特異性的靶向殺傷能力，同時能夠有效地克服腫瘤細胞對吉西他濱的耐藥。
6.3 化合物H11在H460細胞中胞苷脫氫酶（CDA）依賴性的細胞毒性研究
參照上述實施例2.1過程中聯合用藥、單藥的操作過程，進行化合物H11與吉西他濱單藥/聯合胞苷脫氫酶（CDA）抑制劑Tetrahydrouridine（CAS No. : 18771-50-1）的體外增殖抑制作用進行測試，具體IC 50結果如下圖8所示。
另申請人單藥測試2'-deoxycytidine對H460細胞的IC 50值在900µM以上，與上述聯用濃度差別巨大，意味著上述濃度的Dipyridamole對H460細胞增殖幾乎無影響。
上述實驗結果表明，在H460中，化合物H11與吉西他濱一樣，均顯示出非CDA依賴性的細胞毒性，CDA不能將H11的活化產物脫氨，因此無法抑制H11的細胞毒性。本發明開發的一系列吉西他濱前藥化合物在經過AKR1C3酶特異性啟動後，所釋放出的活化產物相同，因此，本發明開發的一系列吉西他濱前藥均不會被CDA所抑制，均能夠發揮抗腫瘤作用。
上述研究結果均表明，本發明開發的一系列吉西他濱前藥化合物是AKR1C3特異性啟動的小分子前藥，其癌細胞增殖抑制活性依賴於AKR1C3的表達水平（包括RNA以及蛋白）。
在高特異性的殺傷腫瘤過程中，同時能夠有效地躲避細胞造成吉西他濱失活的多個步驟，換言之本發明提供的化合物可通過腫瘤細胞高表達的AKR1C3而增加腫瘤細胞特異性的靶向殺傷能力，同時具有能夠有效地克服腫瘤細胞對吉西他濱的耐藥的可能。
進一步，動物模型（PDX）也初步證明了H11化合物具有優於或相當於吉西他濱的胰腺癌治療效果。
在安全性方面，作為吉西他濱的前藥，H11相對於吉西他濱具有更大的耐受劑量，更安全：H11化合物的MTD為320mg/kg，而吉西他濱為120mg/kg。
在穩定性方面，使用人肝微粒體、血液進行實驗，顯示H11具有良好的穩定性，完全具備開發為人用藥物的潛力。
七、化合物的合成
所用試劑及儀器解釋如下： DCM，二氯甲烷；TEA，三乙胺；TFA，三氟乙酸；LCMS，液質聯用。 合成過程中未注明來源的化學試劑、藥品均為分析純或化學純，均從商業的試劑公司購買得到。其他出現的英文簡寫以有機化學領域中的解釋為准。
化合物H11的合成
在N 2保護下，將H11-A1(6.0 g, 12.9 mmol）與POCl 3(1.2 mL, 12.9 mmol) 加入到乾燥的DCM (60 mL) 中，於-10 oC下滴加入TEA (2.2 mL, 15.5 mmol) 的DCM (10 mL)溶液，攪拌。H11-A1購買或參照其他研究文獻或專利(PCT申請號PCT/US2016/025665，公開號WO2016/161342A1，對應中國申請號201680020013.2，公開號CN108136214A)合成。
一段時間後，反應完全，滴加入H11-A2 (4.6 g, 12.9 mmol，參照文獻合成或購買)和TEA (2.2 mL, 15.5 mmol) 的DCM溶液，攪拌。
將異丙胺的四氫呋喃溶液 (2 M, 13.2 mL, 25.9 mmol) 滴加至體系，再加入TEA (5.4 mL, 10.1 mmol)，室溫攪拌。滴加入飽和NH 4Cl溶液，過濾，濾液分液，水相用DCM萃取，鹽水洗滌有機相，Na 2SO 4乾燥，濃縮後反相快速柱色譜可得H11-D (2.0 g (85%以上含量)和2.0 g (50%含量)，總收率為25.2%)，為淡黃色固體。MS: Calculated 923.8, found 924.2 ([M+H] +)。
在N 2保護下，將H11-D (1.5 g, 1.62 mmol)加入到DCM (15 mL)中，加入TFA (18.7 g，165.2 mmol)，室溫攪拌後，監測反應完畢。用飽和NaHCO 3水溶液調至pH = 8，DCM萃取，鹽水洗滌有機相，Na 2SO 4乾燥，濃縮，高效液相中性製備（使用的流動相添加酸或者鹼調節體系為中性）分離得到H11 (550 mg，收率為47.0 %)，為白色固體。
1H-NMR (400 MHz, CD 3OD) δ8.04 (dd, J= 8.4, 3.6 Hz, 1H), 7.60-7.48 (m, 4H), 7.39 (d, J= 8.8 Hz, 1H), 7.31 (s, 1H), 7.18 (t, J= 8.8 Hz, 2H), 6.94-6.91 (m, 2H), 6.26-6.13 (m, 1H), 5.84 (dd, J = 7.6, 4.4 Hz, 1H), 5.12-5.09 (m, 2H), 4.34-4.17 (m, 3H), 4.04-4.01 (m, 1H), 3.37-3.31 (m, 1H), 1.15-1.12 (m, 6H). MS: Calculated MS, 723.2, found, 724.0 ([M+H] +)。
其他化合物的合成
同化合物H11合成的方法類似，改變異丙胺為其他結構的有機胺，如甲胺、乙胺、正丙胺、2-溴乙胺、異丁胺、2-甲基-2-丙胺、2,2-二甲基-1-丙胺、苄胺、環己胺、環戊胺、環丁胺、環丙胺、2,2,2-三氟乙胺；改變H11-A2為其他對應的原料，如下結構式： ， 式中，取代基R 2、R 6、R 7與 結構相對應。
參照上述化合物H11合成步驟可以得到其他類似的化合物，以下給出其他化合物及H11的波譜資料：
化合物H2 高效液相中性製備分離得產物（27.6mg,11.7%），為白色固體。 1H-NMR(400MHz,CD 3OD)δ8.06-8.03(m,1H),7.55-7.49(m,4H),7.42-7.39(m,1H),7.31(s,1H),7.21-7.15(m,2H),6.95-6.91(m,2H),6.23-6.17(m,1H),5.85-5.83(m1H),5.12-5.10(m,2H),4.34-4.16(m,3H),4.04-4.02(m,1H),2.97-2.89(m,2H),1.13-1.08(m,3H).MS:Calculated 709.5,found 710.2([M+H] +).
化合物H3 高效液相中性製備分離得產物（71mg,29.2%），為白色固體。 1H-NMR(400MHz,CD 3OD)δ8.06-8.03(m,1H),7.56-7.41(m,5H),7.31(s,1H),7.18(t, J=8.8Hz,2H),6.94-6.91(m,2H),6.23-6.17(m,2H),5.85-5.82(m,2H),5.12-5.10(m,2H),4.34-4.21(m,4H),4.03-4.02(m,1H),2.87-2.81(m,2H),1.51-1.45(m,2H),0.90-0.86(m,3H).MS:Calculated 723.2,found 724.0([M+H] +).
化合物H4 高效液相中性製備分離得產物（53.2mg,16.7%），為白色固體。 1H-NMR(400MHz,CD 3OD)δ8.04(dd, J=8.4,3.2Hz,1H),7.61-7.46(m,4H),7.42-7.40(m,1H),7.32(s,1H),7.20-7.16(m,2H),6.94-6.91(m,2H),6.24-6.20(m,1H),5.87(d, J=7.6Hz,1H),5.14(d, J=8.4Hz,2H),4.38-4.18(m,3H),4.06-4.03(m,1H),3.42-3.38(m,2H),3.28-3.25(m,2H).MS:Calculated 787.1,found 788.0 and 790.0([M+H] +).
化合物H6 高效液相製備分離得產物（17.1mg,13.2%），為白色固體。 1H-NMR(300MHz,CD 3OD)δ8.07(d, J=8.7Hz,1H),7.69(d, J=8.7Hz,2H),7.61-7.58(m,1H),7.45(d, J=8.2Hz,1H),7.30(s,1H),7.16(d, J=8.1Hz,2H),6.23-6.22(m,1H),5.85(d, J=7.5Hz,1H),5.11(d, J=8.4Hz,2H),4.32-4.20(m,Hz,3H),4.06-4.05(m,1H),2.96-2.90(m,2H),1.11(t,J=6.7Hz,3H).MS:Calculated 665.1,found 666.0([M+H] +).
化合物H7 高效液相中性製備分離得產物（50.0mg,15.7%），為白色固體。 1H-NMR(400MHz,CD 3OD)δ8.03(dd, J=8.4,3.2Hz,1H),7.59-7.41(m,5H),7.32(s,1H),7.18(t, J=8.8Hz,2H),6.93-6.91(m,2H),6.21-6.16(m,1H),5.86-5.84(m,1H),5.11(d, J=8.4Hz,2H),4.30-4.24(m,3H),4.05-4.0(s,1H),2.72-2.68(m,2H),1.74-1.61(m,1H),0.88-0.86(m,6H).MS:Calculated 737.2,found 738.2([M+H] +).
化合物H8 高效液相中性製備分離得產物（49.5mg,15.3%），為白色固體。 1H-NMR(400MHz,CD 3OD)δ8.00(dd, J=8.4,3.2Hz,1H),7.56-7.43(m,4H),7.33-7.14(m,9H),6.92-6.88(m,2H),6.21-6.16(m,1H),5.80-5.78(m,1H),5.05-5.02(m,2H),4.34-4.00(m,6H).MS:Calculated 771.2,found 772.1([M+H] +).
化合物H9 高效液相中性製備分離得產物(80.0 mg，收率為25.5 %)，為白色固體。 1H-NMR (400 MHz, CD 3OD) δ 8.03 (dd, J= 8.4, 3.2 Hz, 1H), 7.67 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 7.54 (dd, J= 16.0, 7.6 Hz, 1H), 7.37-7.35 (m, 1H), 7.31 – 7.20 (m, 6H), 7.12 (d, J= 8.0 Hz, 2H), 6.22 - 6.17 (m, 1H), 5.80 (t, J= 8.0 Hz, 1H), 5.08 -5.02 (m, 2H), 4.35 -4.10 (m, 3H), 4.10-4.01 (m, 3H).  MS: Calculated MS, 727.1, found, 728.1 ([M+H] +).
化合物H10 高效液相中性製備分離得產物（65.1mg,21.3%），為白色固體。 1H-NMR(400MHz,CD 3OD)δ8.06(dd, J=8.4,3.2Hz,1H),7.69(d, J=8.7Hz,2H),7.61-7.60(m,1H),7.44(d, J=8.5Hz,1H),7.31(s,1H),7.15(d, J=8.4Hz,2H),6.23-6.19(m,1H),5.86(dd, J=7.6,2.4Hz,1H),5.11(d, J=8.0Hz,2H),4.35-4.16(m,3H),4.05-4.04(m,1H),2.72-267m,2H),1.73-1.62(m,1H),0.89-0.86(m,6H).MS:Calculated 693.2,found 694.1([M+H] +).
化合物H11 高效液相中性製備分離得產物(550 mg，47.0 %) ，為白色固體。 1H-NMR (400 MHz, CD 3OD) δ8.04 (dd, J= 8.4, 3.6 Hz, 1H), 7.60-7.48 (m, 4H), 7.39 (d, J= 8.8 Hz, 1H), 7.31 (s, 1H), 7.18 (t, J= 8.8 Hz, 2H), 6.94-6.91 (m, 2H), 6.26-6.13 (m, 1H), 5.84 (dd, J = 7.6, 4.4 Hz, 1H), 5.12-5.09 (m, 2H), 4.34-4.17 (m, 3H), 4.04-4.01 (m, 1H), 3.37-3.31 (m, 1H), 1.15-1.12 (m, 6H).MS: Calculated MS, 723.2, found, 724.0 ([M+H] +).
化合物D1 高效液相製備分離得產物(15 mg，收率為9.6%)，為白色固體。 1H-NMR (400 MHz, CD 3OD) δ 8.05 (dd, J= 8.4, 6.4 Hz, 1H), 7.61-7.50 (m, 4H), 7.45-7.40 (m, 1H), 7.30 (d, J= 2.0 Hz, 1H), 7.18 (t, J= 8.8 Hz, 2H), 6.96-6.90 (m, 2H), 6.27-6.16 (m, 1H), 5.88-5.83 (m, 1H), 5.19 (dd, J= 8.8, 2.4 Hz, 2H), 4.43-4.30 (m, 2H), 4.28-4.13 (m, 3H), 4.07-4.02 (m, 1H), 1.38-1.27 (m, 3H). MS : Calculated MS, 710.1 found, 710.7 ([M+H] +).
化合物D2 高效液相中性製備分離得產物（4.5mg,4.1%），為白色固體。 1H-NMR(400MHz,CD 3OD)δ8.06-8.03(m,1H),7.56-7.39(m,5H),7.28(s,1H),7.17(t, J=8.8Hz,2H),6.95-6.92(m,2H),6.23-6.15(m,1H),5.85(t, J=7.2Hz,1H),5.12-5.05(m,2H),4.31-4.14(m,3H),4.05-4.03(m,1H),3.12-3.06(m,4H),1.11-107(m,6H).MS:Calculated 737.2,found 738.0([M+H] +).
化合物D3 高效液相中性製備分離得產物（6.6 mg,收率21.1%），為白色固體。 1H-NMR(300MHz,CD 3OD)δ8.05(d, J=7.8Hz,1H),7.61-7.39(m,5H),7.30(s,1H),7.18(t, J=8.7Hz,2H),6.95-6.92(m,2H),6.25-6.16(m,1H),5.86-5.82(m,1H),5.10(d, J=8.7Hz,2H),4.28-4.14(m,3H),4.04(m,1H),2.68(d, J=10.2Hz,6H).MS:Calculated 709.2,found 710.0([M+H] +).
化合物D4 高效液相中性製備分離得產物（14.2mg,6.9%），為白色固體。 1H-NMR(400MHz,CD 3OD)δ8.05(t, J=8.0Hz,1H),7.60-7.47(m,4H),7.40(t, J=7.2Hz,1H),7.30(d, J=4.4Hz,1H),7.18(t, J=8.8Hz,2H),6.96-6.92(m,2H),6.22-6.20(m,1H),5.87-5.84(m,1H),5.24-5.20(m,2H),4.55-4.33(m,2H),4.24–4.15(m,1H),4.05-4.03(m,1H),2.22(d, J=16.0Hz,4H).MS:Calculated 707.2,found 707.9([M+H] +).
化合物D5 高效液相中性製備分離得產物（53.5mg,26.7%），為白色固體。 1H-NMR(400MHz,CD 3CD3OD)δ8.07(dd, J=8.4,3.2Hz,1H),7.70(d, J=8.8Hz,2H),7.60(t, J=7.2Hz,1H),7.45(d, J=8.4Hz,1H),7.29(s,1H),7.17(d, J=7.6Hz,2H),6.25-6.18(m,1H),5.87-5.84(m,1H),5.12-5.08(m,2H),4.30-4.23(m,3H),4.06-4.05(m,1H),2.70-2.66(m,6H).MS:Calculated 665.1,found 666.0([M+H] +).
化合物D6 高效液相中性製備分離得產物（45.0mg,19.1%），為白色固體。 1H-NMR(400MHz,CD 3OD)δ8.04-8.00(m,1H),7.55-7.16(m,13H),6.92-6.97(m,2H),6.24-6.17(m,1H),5.80-5.76(m,1H),5.32-5.28(m,2H),4.56-4.42(m,2H),4.23-4.15(m,1H),4.07-4.05(m,1H).MS:Calculated 758.1,found 759.1([M+H] +).
化合物D7 高效液相中性製備分離得產物（92.0mg,29.3%），為白色固體。 1H-NMR(400MHz,CD 3OD)δ8.04(dd, J=8.4,2.8Hz,1H),7.67(d, J=8.8Hz,2H),7.43-7.33(m,4H),7.25-7.17(m,4H),7.12(d, J=8.0Hz,2H),6.23-6.16(m,1H),5.78(t, J=8.0Hz,1H),5.30(dd, J=9.2,6.4Hz,2H),4.56-4.43(m,2H),4.23-4.16(m,1H),4.07-4.06(m,1H).MS:Calculated 714.1,found 715.0([M+H] +).
化合物D8 合成後不穩定，未進行測試。
無
圖1為不同濃度的吉西他濱在是否存在AKR1C3抑制劑AST-3021情況下對H460癌細胞的抑制率曲線，其中，橫坐標conc.Log(nM)表示nmol/L單位下濃度數值的以10為底數的對數值，縱坐標inhibition%表示抑制率百分比。
圖2為不同濃度的化合物H11在是否存在AKR1C3抑制劑AST-3021情況下對H460癌細胞的抑制率曲線，其中，橫坐標conc.Log(nM)表示nmol/L單位下濃度數值的以10為底數的對數值，縱坐標inhibition%表示抑制率百分比。
圖3為不同濃度的化合物H11在是否存在AKR1C3抑制劑AST-3021情況下對HepG2癌細胞的抑制率曲線，其中，橫坐標conc.Log(nM)表示nmol/L單位下濃度數值的以10為底數的對數值，縱坐標inhibition%表示抑制率百分比。
圖4為化合物H11和吉西他濱在胰腺癌PA1222模型的體內藥效實驗中不同天數的腫瘤體積變化曲線。
圖5為化合物H11和吉西他濱在胰腺癌PA1222模型的體內藥效實驗中在不同天數小鼠體重變化率曲線。
圖6為化合物H11與吉西他濱單藥/聯合核苷轉運蛋白抑制劑對H460癌細胞的抑制率曲線，其中，橫坐標conc.Log(nM)表示nmol/L單位下濃度數值的以10為底數的對數值，縱坐標inhibition%表示抑制率百分比。
圖7為化合物H11與吉西他濱單藥/聯合聯合去氧胞苷激酶抑制劑對H460癌細胞的抑制率曲線，其中，橫坐標conc.Log(nM)表示nmol/L單位下濃度數值的以10為底數的對數值，縱坐標inhibition%表示抑制率百分比。
圖8為化合物H11與吉西他濱單藥/聯合胞苷脫氫酶抑制劑對H460癌細胞的抑制率曲線，其中，橫坐標conc.Log(nM)表示nmol/L單位下濃度數值的以10為底數的對數值，縱坐標inhibition%表示抑制率百分比。

Claims (15)

  1. 一種具有結構式III的吉西他濱抗癌衍生物，或其藥學上可接受的鹽或前藥或溶劑合物或同位素變體： （III） 其中， R 1選自H、鹵素， 表示R 1可以取代苯環上的任意4個位置且取代數目為1、2、3或4； R 2選自苯基、鹵素取代的苯基、C1-C3烷基或鹵素取代的C1-C3烷基；以及 R 3選自C1-C6烷基或鹵素取代的C1-C6烷基、苄基。
  2. 如請求項1所述的吉西他濱抗癌衍生物，其中： R 1選自H或單取代的F；或 R 2為選自苯基、氟苯基、甲基或三氟甲基；或 R 3選自甲基、乙基、丙基、丁基、苄基，或溴取代的甲基、乙基、丙基、丁基；或 R 1選自H或單取代的F， R 2為選自苯基、氟苯基、甲基或三氟甲基， R 3選自甲基、乙基、丙基、丁基、苄基，或溴取代的甲基、乙基、丙基、丁基。
  3. 如請求項1所述的吉西他濱抗癌衍生物，選自具有以下結構式的吉西他濱抗癌衍生物，或其藥學上可接受的鹽或前藥或溶劑合物或同位素變體： （H11）。
  4. 如請求項1所述的吉西他濱抗癌衍生物，其中， 所述鹽為鹼式鹽或酸式鹽，優選為銨鹽、碳酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、鹽酸鹽； 所述溶劑合物為水合物或醇合物，所述醇合物為乙醇合物； 所述前藥選自酯或醯胺。
  5. 一種含有請求項1至4任一項所述的吉西他濱抗癌衍生物或其藥學上可接受的鹽或前藥或溶劑合物或同位素變體的藥品或製劑。
  6. 一種如請求項1至4中任一項所述的吉西他濱抗癌衍生物或其藥學上可接受的鹽或前藥或溶劑合物或同位素變體在製備治療癌症患者或腫瘤患者或由癌症或腫瘤引發的病症或細胞增生性疾病的藥物中的用途。
  7. 如請求項5所述的藥品或製劑，該藥品或製劑用於治療患者的腫瘤或癌症疾病，其中腫瘤、癌症包括： 肺癌、非小細胞肺癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、骨癌、食道癌、乳腺癌、前列腺癌、睾丸癌、結腸癌、卵巢癌、膀朧癌、子宮頸癌、黑色素瘤、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊性腺癌、囊性癌、髓狀癌、支氣管癌、骨細胞癌、上皮癌、膽管癌、絨毛膜癌、胚癌、精原細胞癌、維爾姆斯癌、膠質細胞癌、星形細胞瘤、成神經管細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血細胞瘤、聲帶神經瘤、腦膜瘤、成神經細胞瘤、成視神經細胞瘤、成視網膜細胞瘤、神經纖維瘤、纖維肉瘤、成纖維細胞瘤、纖維瘤、纖維腺瘤、纖維軟骨瘤、纖維囊瘤、纖維粘液瘤、纖維骨瘤、纖維粘液肉瘤、纖維乳頭狀瘤、粘液肉瘤、粘液囊瘤、粘液軟骨瘤、粘液軟骨肉瘤、粘液軟骨纖維肉瘤、粘液腺瘤、成粘液細胞瘤、脂肉瘤、脂肪瘤、脂肪腺瘤、成脂細胞瘤、脂肪軟骨瘤、脂肪纖維瘤、脂肪血管瘤、粘液脂瘤、軟骨肉瘤、軟骨瘤、軟骨肌瘤、脊索瘤、絨毛膜腺瘤、絨毛上皮瘤、成絨毛膜細胞瘤、骨肉瘤、成骨細胞瘤、骨軟骨纖維瘤、骨軟骨肉瘤、骨軟骨瘤、骨囊瘤、骨牙質瘤、骨纖維瘤、骨纖維肉瘤、血管肉瘤、血管瘤、血管脂肪瘤、血管軟骨瘤、成血管細胞瘤、血管角質瘤、血管神經膠質瘤、血管內皮瘤、血管纖維瘤、血管肌瘤、血管脂肪瘤、血管淋巴管瘤、血管脂肪平滑肌瘤、血管肌脂瘤、血管肌神經瘤、血管粘液瘤、血管網狀內皮瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉芽瘤、淋巴管瘤、淋巴瘤、淋巴粘液瘤、淋巴肉瘤、淋巴管纖維瘤、淋巴細胞瘤、淋巴上皮瘤、成淋巴細胞瘤、內皮瘤、成內皮細胞瘤、滑膜瘤、滑膜肉瘤、間皮瘤、結締組織瘤、尤因瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、成平滑肌瘤、平滑肌纖維瘤、橫紋肌瘤、橫紋肌肉瘤、橫紋肌粘液瘤、急性淋巴白血病、急性骨髓性白血病、慢性病貧血、紅細胞增多症、淋巴瘤、子宮內膜癌、膠質瘤、結直腸癌、甲狀腺癌、尿路上皮癌或多發性骨髓瘤。
  8. 如請求項5所述的藥品或製劑， 該藥品或製劑單藥或聯用治療非小細胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌。
  9. 如請求項5所述的藥品或製劑，其中所述癌症或腫瘤為原發性腦癌、腦腫瘤或轉移至腦的轉移性癌症或腫瘤。
  10. 一種吉西他濱衍生物H11的製備方法，包括化合物H11-D在酸性條件下水解以及鹼化操作： 。
  11. 如請求項10所述的製備方法，所述酸性條件由TFA提供，優選為將H11-D投入到TFA與DCM的混合體系中。
  12. 如請求項10所述的製備方法，所述鹼化操作過程包括：向反應體系中加入鹼使得體系呈鹼性， 其中，使用的鹼包括鹼金屬的氫氧化物、碳酸氫鹽、碳酸鹽，其以水溶液被加入， 並且在水解後將上述鹼的水溶液投入至反應體系的pH為8。
  13. 一種吉西他濱衍生物H11-D的製備方法，包括以下操作： 操作一，H11-A1與POX 3、有機胺攪拌反應； 操作二，反應完全後加入H11-A2與有機胺攪拌反應； 操作三，反應完全後加入異丙胺、有機胺攪拌反應；以及 操作四，加入水或者酸性鹽溶液進行後處理， ； 其中，X為Cl或者Br。
  14. 如請求項13所述的製備方法，其中，操作一、二、三中的有機胺均為三乙胺，反應的溶劑均為二氯甲烷。
  15. 如請求項13所述的製備方法，其中，操作三中加入的異丙胺為其四氫呋喃溶液，操作四中的酸性鹽溶液為飽和NH 4Cl溶液。
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