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TW202521566A - 一種靶向cd38和cll1的雙特異性嵌合抗原受體及其應用 - Google Patents

一種靶向cd38和cll1的雙特異性嵌合抗原受體及其應用 Download PDF

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TW202521566A
TW202521566A TW113144210A TW113144210A TW202521566A TW 202521566 A TW202521566 A TW 202521566A TW 113144210 A TW113144210 A TW 113144210A TW 113144210 A TW113144210 A TW 113144210A TW 202521566 A TW202521566 A TW 202521566A
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chimeric antigen
antigen receptor
seq
amino acid
Prior art date
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TW113144210A
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唐嘉行
殷文劼
董琦
沈連軍
曹衛
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大陸商亘喜生物科技（上海）有限公司
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Publication date
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Abstract

本發明屬於免疫細胞治療領域，具體涉及一種靶向CD38和CLL1的雙特異性嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體融合蛋白從N末端到C末端至少包括：i）特異性識別CLL1和CD38的抗原結合域；ii）跨膜結構域；iii）至少一個共刺激結構域；iv）訊號轉導結構域；利用上述嵌合抗原受體製備的雙靶向CAR T細胞對CLL1陽性和/或CD38陽性靶細胞顯示高特異性的體外細胞毒性。

Description

一種靶向CD38和CLL1的雙特異性嵌合抗原受體及其應用
本發明屬於免疫細胞治療領域。具體地，涉及靶向CD38和CLL1的雙特異性嵌合抗原受體及其應用。
急性骨髓性白血病(AML)是骨髓系血細胞癌症，其特徵在於惡性造血細胞的克隆性擴增，這些惡性造血細胞在骨髓和血液中積累並干擾正常血細胞。AML的生物學和臨床複雜性來源於AML的多種亞型，大大增加了AML治療的難度。AML常用的治療方法包括化學治療和造血幹細胞移植，但是由於AML最常見於老年人，大部分患者無法接受密集的化學療法，同時幹細胞移植供體來源較少，因此患者生存率極差且復發率較高。需要尋求新的治療手段來治療。
嵌合抗原受體(CAR)是模擬T細胞受體功能的人工受體，其融合了抗體的抗原識別片段（或抗原對應配體）以及T細胞的下游訊號結構域。在該嵌合受體作用下，將T細胞特異性靶向到腫瘤細胞表面表達的腫瘤相關或特異性抗原，誘導CAR-T細胞活化，增殖和隨後的腫瘤殺傷。
CD38抗原是一種45kDa大小的II型跨膜糖蛋白（第二型跨膜糖蛋白），能夠催化環腺苷二磷酸核糖的合成和降解，CD38還與細胞凋亡和細胞增殖的調節有關，並具有重要的黏附特性。大多數AML原始細胞具有較高的CD38表達使其成為AML治療的潛在靶點。
C型凝集素樣-1（CLL1）是醣蛋白受體和參與免疫調節的C型凝集素樣受體大家族的成員。CLL1主要在造血細胞，主要在包括單核細胞、DC和粒細胞的先天免疫細胞和骨髓祖細胞中表達。CLL-1也在急性骨髓性白血病(AML)母細胞、白血病幹細胞（例如CD34+/CD38-）以及一小部分造血祖細胞（CD34+/CD38+或者CD34+/CD33+）中發現，但是在正常的造血幹細胞(CD34+/CD38-或者CD34+/CD33-)上不表達。
由於缺乏合適的靶向表面抗原，CAR‑T細胞在治療AML遲遲未能突破。因為靶向的AML抗原經常在健康的造血幹細胞/祖細胞 (HSPC)上共同表達，導致所有髓系後代細胞的缺失。人們正在尋求創造性的解決方案來克服這些障礙，從而使CART療法成為AML患者的可行選擇。
為了解決上述提到的問題，本發明提供如下技術方案：
本發明第一個方面公開了一種靶向CD38和CLL1的雙特異性嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體融合蛋白從N末端到C末端至少包括： i）特異性結合CD38和/或CLL1的抗原結合域； ii）跨膜結構域； iii）至少一個共刺激結構域； iv）訊號轉導結構域。
優選地，上述抗原結合域為單價或多價，即所述抗原結合域含有單個抗原決定簇或多個抗原決定簇，可以特異性地結合單個抗原表位或多個抗原表位。
優選地，上述抗原結構域包括單域抗體；其他還可以選用如駱駝Ig、IgNAR、Fab片段、Fab'片段、F(ab')z片段、F(ab')3片段、Fv、單鏈抗體（例如 scFv、di-scFv、(scFv)z)、微型抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、二硫鍵穩定的Fv 蛋白(“dsFv”)，嵌合抗體、人源化抗體、單結構域抗體、雙特異性抗體或多特異性抗體、結合配體或蛋白結構域。
優選地，抗原結構域有兩個單域抗體，例如，VHH1，其表示第一抗原結合域的單域抗體，VHH2，其表示第二抗原結合域的單域抗體；所述第一抗原結合域靶向並結合CD38，所述第二抗原結合域靶向並結合CLL1。
所述第一抗原結合域和所述第二抗原結合域從氨基末端到羧基末端以選自下組之一的模式排列： i）VHH1‑VHH2；或 ii）VHH2‑VHH1。
本申請優選單域抗體為重鏈單域抗體。
作為本申請一種優選的實施例，其中所述VHH1的CDR1胺基酸序列如SEQ ID NO: 6所示；所述VHH1的CDR2包括胺基酸序列如SEQ ID NO: 8所示；所述VHH1的CDR3胺基酸序列如SEQ ID NO: 11所示。
作為另一個優選的實施例，所述VHH1的CDR1、CDR2、CDR3胺基酸序列分別還包括與SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的胺基酸序列；或者與其所源自的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個、2個、3個、4個或5個胺基酸的置換、缺失或添加)，優選地，所述置換為保守置換。
作為本申請一種優選的實施例，其中所述VHH1的CDR1胺基酸序列如SEQ ID NO: 7所示；所述VHH1的CDR2包括胺基酸序列如SEQ ID NO: 9所示；所述VHH1的CDR3胺基酸序列如SEQ ID NO: 12所示。
作為另一個優選的實施例，所述VHH1的CDR1、CDR2、CDR3胺基酸序列分別還包括與SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的胺基酸序列；或者與其所源自的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個、2個、3個、4個或5個胺基酸的置換、缺失或添加)，優選地，所述置換為保守置換。
作為本申請一種優選的實施例，其中所述VHH1的CDR1胺基酸序列如SEQ ID NO: 7所示；所述VHH1的CDR2包括胺基酸序列如SEQ ID NO: 10所示；所述VHH1的CDR3胺基酸序列如SEQ ID NO: 13所示。
作為另一個優選的實施例，所述VHH1的CDR1、CDR2、CDR3胺基酸序列分別還包括與SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的胺基酸序列；或者與其所源自的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個、2個、3個、4個或5個胺基酸的置換、缺失或添加)，優選地，所述置換為保守置換。
優選地，所述VHH1包括SEQ ID NO: 1- 3所示的胺基酸序列、或由其組成。
作為另一個優選的實施例，所述VHH1的胺基酸序列還包括分別與SEQ ID NO:1-3具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的胺基酸序列；或者與其所源自的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個、2個、3個、4個或5個胺基酸的置換、缺失或添加)，優選地，所述置換為保守置換。
優選地，上述VHH2的CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17所示。
作為另一個優選的實施例，所述VHH2的CDR1、CDR2、CDR3胺基酸序列還包括分別與SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的胺基酸序列；或者與其所源自的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個、2個、3個、4個或5個胺基酸的置換、缺失或添加)，優選地，所述置換為保守置換。
優選地，上述VHH2的CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18所示。
作為另一個優選的實施例，所述VHH2的CDR1、CDR2、CDR3胺基酸序列還包括分別與SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的胺基酸序列；或者與其所源自的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個、2個、3個、4個或5個胺基酸的置換、缺失或添加)，優選地，所述置換為保守置換。
優選地，所述VHH2包括SEQ ID NO: 4或5所示的胺基酸序列、或由其組成。
作為另一個優選的實施例，所述VHH2的胺基酸序列還包括分別與SEQ ID NO:4或5具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的胺基酸序列；或者與其所源自的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個、2個、3個、4個或5個胺基酸的置換、缺失或添加)，優選地，所述置換為保守置換。
優選地，上述跨膜結構域包括選自下列的分子：CD8α、CD28、IgG1、IgG4、4‑1BB，PD‑1、CD34、OX40、CD3ε、IL‑2受體、IL‑7受體中的一種。
更優選地，所述跨膜結構域選為CD8α或CD28，所述CD8α的跨膜結構域包括SEQ ID NO: 19所示的胺基酸序列、或由其組成；所述CD28的跨膜結構域包括SEQ ID NO: 20所示的胺基酸序列、或由其組成。
作為另一個優選的實施例，所述跨膜結構域的胺基酸序列還包括分別與SEQ ID NO:19或20具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的胺基酸序列；或者與其所源自的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個、2個、3個、4個或5個胺基酸的置換、缺失或添加)，優選地，所述置換為保守置換。
優選地，所述胞內訊號傳導結構域包括下列分子：CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、TCRζ、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD79a、CD79b、CD278、FcεRI、DAP10、DAP12、CD66d中的一種或其組合。
更優選地，上述胞內訊號傳導結構域優選為CD3ζ的胞漿訊號傳導序列。所述CD3ζ的胞漿訊號傳導序列具有如SEQ ID NO：21所示的胺基酸序列。
作為另一個優選的實施例，所述CD3ζ的胞漿訊號傳導序列的胺基酸序列還包括與SEQ ID NO:21具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的胺基酸序列；或者與其所源自的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個、2個、3個、4個或5個胺基酸的置換、缺失或添加)，優選地，所述置換為保守置換。
作為另一個優選的實施例，上述CD3ζ的胞漿訊號傳導序列還包括其野生型、或其突變體/修飾體。
優選地，上述共刺激訊號結構域包括選自下列的分子：4‑1BB(CD137)、CD27、CD19、CD4、CD28、ICOS(CD278)、CD8α、CD82β、BAFFR、HVEM、LIGHT、KIRDS2、SLAMF7、NKp30、NKp46、CD40、CDS、ICAM‑1、B7‑H3、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD7、CD226中的一種或其組合。
更優選地，所述共刺激訊號結構域優選為4‑1BB或CD28。所述4‑1BB的共刺激訊號結構包括SEQ ID NO: 22所示的胺基酸序列、或由其組成；所述CD28的共刺激訊號結構包括SEQ ID NO: 23所示的胺基酸序列、或由其組成。
作為另一個優選的實施例，所述共刺激訊號結構的胺基酸序列還包括分別與SEQ ID NO:22或23具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的胺基酸序列；或者與其所源自的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個、2個、3個、4個或5個胺基酸的置換、缺失或添加)，優選地，所述置換為保守置換。
上述嵌合抗原受體還包括鉸鏈區。
優選地，所述鉸鏈區優選為CD8α。所述CD8α的鉸鏈區具有如SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列。
作為另一個優選的實施例，所述鉸鏈區的胺基酸序列還包括與SEQ ID NO:24具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的胺基酸序列；或者與其所源自的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個、2個、3個、4個或5個胺基酸的置換、缺失或添加)，優選地，所述置換為保守置換。
上述嵌合抗原受體還包括訊號肽。
優選地，所述訊號肽包括選自下列的分子：T細胞受體的α鏈及β鏈、CD3ζ、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD9、CD28、CD16、CD22、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、GITR、GM‑CSF。
更優選地，所述訊號肽優選為CD8α。所述CD8α的訊號肽具有如SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列。
根據上述訊號肽、抗原結合域、鉸鏈區、跨膜結構域、共刺激訊號結構域和訊號傳導序列串聯得到，具體結構為： L-VHH1-L1-VHH2-F-H-TM-C-CD3ζ    (Ia) 式中， 各「-」獨立地為連接肽或肽鍵； L為訊號肽序列； VHH1為特異性結合CD38或CLL1的抗原結合域； VHH2為特異性結合CLL1或CD38的抗原結合域； L1為連接肽； F為無或者Flag標籤序列（Flag Tag）； H為鉸鏈區； TM為跨膜結構域； C為共刺激訊號結構域； CD3ζ為源於CD3ζ的胞漿訊號傳導序列，還包括其野生型、或其突變體/修飾體。
優選地，組成CAR-T的具體結構為： L-VHH1-L1-VHH2- H-TM-C-CD3ζ 各「-」獨立地為連接肽或肽鍵； L為CD8a訊號肽分子； VHH1為特異性結合CD38或CLL1的抗原結合域； VHH2為特異性結合CLL1或CD38的抗原結合域； L1為連接肽； H為CD8a的鉸鏈區； TM為CD8a的跨膜結構域； C為4-1BB共刺激結構域； CD3ζ為源於CD3ζ的胞漿訊號傳導序列。
優選地，組成CAR-NK的具體結構為： L-VHH1-L1-VHH2-F-H-TM-C-CD3ζ 各「-」獨立地為連接肽或肽鍵； L為CD8a訊號肽分子； VHH1為特異性結合CD38或CLL1的抗原結合域； VHH2為特異性結合CLL1或CD38的抗原結合域； L1為連接肽； F為Flag標籤序列（Flag Tag）； H為CD8a的鉸鏈區； TM為CD28的跨膜結構域； C為CD28的共刺激結構域； CD3ζ為源於CD3ζ的胞漿訊號傳導序列。
優選地，上述連接肽選自以下胺基酸序列的接頭：SGG、GGS、SGGS、SSGGS、GGGG、SGGGG、GGGGS、SGGGGS、GGGGGS、SGGGGGS、SGGGGG、GSGGGGS、GGGGGGGS、SGGGGGGG、SGGGGGGGS、SGGGGSGGGGS或GGGGSGGGGSGGGGS。
優選地，所述融合蛋白表達標籤為Flag tag，由SEQ ID NO：27的胺基酸序列所示。
作為另一個優選的實施例，所述Flag tag的胺基酸序列還包括與SEQ ID NO:27具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的胺基酸序列；或者與其所源自的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個、2個、3個、4個或5個胺基酸的置換、缺失或添加)，優選地，所述置換為保守置換。
本發明第二個方面公開了一種核酸分子，所述核酸分子為編碼上述嵌合抗原受體的核苷酸序列。
優選地，優選編碼SEQ ID NO:2與SEQ ID NO:5所示胺基酸的核酸分子C9B5，所述C9B5的核苷酸序列由SEQ ID NO:30所示。
所述的核酸分子還包括SEQ ID NO: 28-29、或31-51任一項所示的核苷酸序列。
本發明第三個方面公開了一種重組載體，所述載體包含所述的嵌合抗原受體，或所述的核酸分子。
優選地，所述重組載體包括DNA載體、RNA載體、質體、轉座子載體、CRISPR/Cas9載體或病毒載體。
更優選地，所述病毒載體包括慢病毒載體、腺病毒載體、逆轉錄病毒載體。
本發明第四個方面公開了工程改造的免疫細胞，所述工程改造的免疫細胞包括和/或表達所述的嵌合抗原受體，所述核酸分子，或所述的重組表達載體。
優選地，所述免疫細胞利用FAST- CAR技術製備。
更優選地，所述FAST CAR將啟動、轉導和擴增步驟轉化為一個單一的「同步啟動-轉導」步驟，其中所述工程化免疫細胞經歷了少於72小時的離體擴增。
作為另一個優選的實施例，利用FAST- CAR技術製備的工程化免疫細胞可以減少在生產過程中由於CD38 CAR識別免疫細胞表面CD38抗原從而引發的自相殘殺；或由於其他CAR識別免疫細胞表面對應的靶點抗原（例如，CD70 CAR識別T細胞表面CD70抗原）引起的自相殘殺的影響，同時所述免疫細胞可應用任何CAR靶向抗原和不同的腫瘤標記中。
作為另一個優選的實施例，利用FAST- CAR技術製備的工程化免疫細胞與經歷離體擴增1周或更多周的可比群體中的細胞相比，觀察到經過FAST-CAR技術製備的免疫細胞表型更年輕。特徵在於其中Tn/scm（CD45RO-，CCR7+）和Tcm（CD45RO+，CCR7+）占比更高。
作為另一個優選的實施例，利用FAST- CAR技術製備的工程化免疫細胞，與經歷離體擴增1周或更多周的可比群體中的細胞相比，觀察到經過FAST-CAR技術製備的免疫細胞體外擴增和持續殺傷能力更強。
優選地，所述免疫細胞包含T細胞、NK細胞、iNKT細胞、CTL細胞、單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和/或NKT細胞。
更優選地，所述免疫細胞優選地可以為T細胞和NK細胞。
本發明第五個方面公開了上述的嵌合抗原受體、核酸分子、重組表達載體或工程改造的免疫細胞在製備用於治療腫瘤藥物或藥物組合物中的應用。所述腫瘤可以是癌症。優選地，所述腫瘤為表達CD38和CLL1的腫瘤或癌症。
更優選地，所述腫瘤為急性骨髓性白血病。
優選地，所述藥物組合物還包括藥學上可接受的載體、輔劑。
上述的嵌合抗原受體與以下的一種或多種組合在製備用於治療和/或預防癌症的藥物組合中的用途： （1）增加包含CAR核酸或CAR多肽的細胞的功效的作用劑； （2）改善與施用包含CAR核酸或CAR多肽的細胞相關的一種或多種副作用的作用劑； （3）治療與CD38和CLL1相關疾病的另外的作用劑。
優選地，所述治療和/或預防還包括與第二療法組合使用，所述第二療法選自手術、化療、放療、免疫療法、基因療法、DNA療法、RNA療法、奈米療法、病毒療法、輔助療法及其任意組合。
本發明相對于現有技術具有如下的顯著優點及效果： （1）本發明的雙靶向CAR T細胞對CLL1陽性和/或CD38陽性靶細胞顯示高特異性的體外細胞毒性。 （2）本發明使用FAST技術生產的雙靶向CAR T細胞不受基於CD38-CAR的自相殘殺的影響； （3）本發明使用FAST技術生產的雙靶向CAR T細胞比傳統技術生產的雙靶向CAR T細胞表型更年輕，並在體外實驗中表現出更持久的腫瘤殺傷能力和擴增能力； （4）本發明使用FAST技術生產的雙靶向CAR T細胞能在較低劑量條件下有效抑制體內CD38和CLL1陽性腫瘤的生長，並顯示出持久抗腫瘤藥效。
下面通過具體實施例對本發明進行進一步的闡述，應該理解，下述實施例僅是為了用於說明本發明，並不對發明內容進行限定。
實施例中所用原料和設備均為本領域技術人員熟知，且均為市場上能夠購買到或容易獲得或製造而得。
如本文所用，術語「抗原」是指能夠被選擇性結合劑結合的分子或其片段。例如，抗原可以是可被選擇性結合劑例如受體結合的配體。作為另一個實例，抗原可以是可被選擇性結合劑例如免疫蛋白（例如抗體）結合的抗原分子。抗原也可以指能夠在動物中使用以產生能夠與該抗原結合的抗體的分子或其片段。在一些情況下，抗原可以結合至底物（例如細胞膜）。或者，抗原可以不與底物結合（例如，分泌的分子；例如分泌的多肽）。
術語「抗體」(Ab)應包括但不限於免疫球蛋白，其特異性結合抗原並包含通過二硫鍵互連的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈，或其抗原結合部分。每條H鏈包含重鏈可變區(本文縮寫為VH)和重鏈恒定區。重鏈恒定區包含三個恒定結構域CH1、CH2和CH3。每條輕鏈包含輕鏈可變區(本文縮寫為VL)和輕鏈恒定區。輕鏈恒定區包含一個恒定結構域CL。VH和VL區可以進一步細分為稱為互補決定區(CDR)的高變區，其散佈有更保守的稱為框架區(FR)的區域。每個VH和VL包含三個CDR和四個FR，從氨基末端到羧基末端按照以下順序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。
應理解，本文中胺基酸名稱採用國際通用的單英文字母標識，與其相對應的胺基酸名稱三英文字母簡寫分別是：Ala(A)、Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、Cys(C)、Gln(Q)、Glu(E)、 Gly(G)、His(H)、I1e(I)、Leu(L)、Lys(K)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)、Ser(S)、Thr(T)、Trp(W)、Tyr(Y)、Val(V)。
術語「互補性決定區」或「CDR」是指免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的高度可變區，如Kabat等人所定義(Kabat等人，Sequences of proteins of immunological interest, 5th ed. US Department of Health and Human Services, NIH, 1991和後來的版本)。本申請採用Kabat編號系統對CDR進行定義。有三種重鏈CDR和三種輕鏈CDR。此處，取決於情況，術語「CDR」和「CDRs」用於指包含一種或多種或者甚至全部的對抗體與其識別的抗原或表位的結合親和力起作用的主要胺基酸殘基的區域。在另一具體實施方式中，CDR區或CDR是指IMGT定義的免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的高度可變區。
抗體的製備
本發明的抗體可以本領域已知的各種方法來製備，例如通過基因工程重組技術來獲得。例如，通過化學合成或PCR擴增獲得編碼本發明抗體的重鏈和輕鏈基因的 DNA分子。將所得 DNA分子插入表達載體內，然後轉染宿主細胞。然後，在特定條件下培養轉染後的宿主細胞，並表達本發明的抗體。
本發明的抗原結合片段可以通過水解完整的抗體分子獲得（參見 Morimoto等人, J. Biochem. Biophys. Methods 24:107-117 (1992)和 Brennan等人, Science 229:81 (1985)）。另外，這些抗原結合片段也可以直接由重組宿主細胞產生（綜述於Hudson, Curr. Opin. Immunol. 11: 548-557 (1999); Little等人，Immunol. Today, 21: 364-370 (2000)）。比如，Fab'片段可以直接從宿主細胞中獲得；可以將Fab'片段化學偶聯形成F(ab')z片段 (Carter等人, Bio/Technology, 10: 163-167(1992))。另外，Fv、Fab或F(ab')z片段也可以直接從重組宿主細胞培養液中直接分離得到。本領域的普通技術人員完全知曉製備這些抗原結合片段的其它技術。
保守置換
如本文中所使用的，術語「保守置換」意指不會不利地影響或改變包含胺基酸序列的蛋白/多肽的預期性質的胺基酸置換。例如，可通過本領域內已知的標準技術例如定點誘變和 PCR介導的誘變引入保守置換。保守胺基酸置換包括用具有相似側鏈的胺基酸殘基替代胺基酸殘基的置換，例如用在物理學上或功能上與相應的胺基酸殘基相似（例如具有相似大小、形狀、電荷、化學性質，包括形成共價鍵或氫鍵的能力等）的殘基進行的置換。已在本領域內定義了具有相似側鏈的胺基酸殘基的家族。這些家族包括具有鹼性側鏈（例如，離胺酸、精胺酸和組胺酸）、酸性側鏈（例如天冬胺酸、麩胺酸）、不帶電荷的極性側鏈（例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸）、非極性側鏈（例如丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸）、β分支側鏈（例如，蘇胺酸、纈胺酸、異亮胺酸）和芳香族側鏈（例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸）的胺基酸。因此，優選用來自相同側鏈家族的另一個胺基酸殘基替代相應的胺基酸殘基。
嵌合抗原受體(CAR)
本發明的嵌合抗原受體(CAR)包括細胞外結構域、跨膜結構域、和細胞內結構域。胞外結構域包括靶點特異性結合元件（也稱為抗原結合結構域）和鉸鏈區。細胞內結構域包括共刺激訊號傳導區和CD3ζ鏈部分。
靶點特異性結合元件（也稱為抗原結合結構域）指的是能夠基於抗原結合特異性進行抗原識別的元件。
對於絞鏈區和跨膜區（跨膜結構域），CAR可被設計以包括融合至CAR的胞外結構域的跨膜結構域。在一些例子中，可選擇跨膜結構域，或通過胺基酸置換進行修飾，以避免將這樣的結構域結合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜結構域，從而最小化與受體複合物的其他成員的相互作用。
在CAR的胞外結構域和跨膜結構域之間，或在CAR的胞漿結構域和跨膜結構域之間，可併入接頭。如本文所用的，術語「接頭」通常指起到將跨膜結構域連接至多肽鏈的胞外結構域或胞漿結構域作用的任何寡肽或多肽。接頭可包括0-300個胺基酸，優選地2至100個胺基酸和最優選地3至50個胺基酸。
共刺激訊號傳導區指包括共刺激分子的細胞內結構域的一部分。共刺激分子為淋巴細胞對抗原的有效應答所需要的細胞表面分子，而不是抗原受體或它們的配體。
本發明的CAR當在T細胞中表達時，抗原結合結構域與鉸鏈區和跨膜區、來自共刺激分子和CD3ζ鏈中的一個或多個的細胞內結構域融合。
在另一優選例中，抗原結合結構域與CD8a鉸鏈區和CD8a跨膜區、4-1BB訊號傳導結構域和CD3ζ訊號結構域組合的細胞內結構域融合。
在另一優選例中，抗原結合結構域與CD8a鉸鏈區和CD28跨膜區、CD28訊號傳導結構域和CD3ζ訊號結構域組合的細胞內結構域融合。
靶向CD38和CLL1的雙特異性CAR
雙特異性是指同一個CAR可以特異結合、免疫識別兩個不同的抗原，CAR結合任意一個抗原都能產生免疫反應。
在另一優選例中，所述靶向CD38和CLL1的雙特異性CAR如本發明第一方面所述。
在本發明的一個較佳的實施方式中，本發明提供的CAR的胞外結構域包括靶向CD38和CLL1的抗原結合結構域。
在另一優選例中，本發明提供一個針對CD38和CLL1抗原的雙特異性嵌合抗原受體。同時靶向CD38和CLL1的CAR結構組分可以包括訊號肽，抗CD38的單域抗體，抗CLL1的單域抗體，鉸鏈區，跨膜區，和胞內T細胞訊號區。
雙靶向CAR-T治療範圍更廣泛。同時靶向CD38和CLL1的CAR-免疫細胞可以減少因單一表面抗原下調或者缺失造成的抗原逃逸的可能性。另外，針對CD38和CLL1的靶標組合的雙特異性嵌合抗原受體，顯示高特異性的體外細胞毒性。
自然殺手細胞（natural killer cell，NK細胞）
NK細胞是機體內重要的免疫細胞，NK細胞形態上屬於大顆粒淋巴細胞，來源於骨髓，是除T細胞、B細胞之外的第三大類淋巴細胞，約占血液中所有免疫細胞（白血球數量）的15%，屬於天然免疫系統的核心細胞，主要分佈于外周血、肝臟和脾臟，在人體內NK細胞主要特徵為CD3-CD56+淋巴細胞群，其中血液中主要為CD16+CD56dim亞型（根據細胞上CD56分子表達密度的差異，將NK細胞分為CD56dim和CD56bright兩個亞群；CD56dim占NK細胞90％以上，主要為細胞毒作用，表達中度親和力的IL-2受體（IL-2R），具有更強的殺傷活性；CD56bright可產生大量細胞因數，主要起免疫調節作用，高表達IL-2R）。
嵌合抗原受體T細胞（CAR-T細胞）
如本文所用，術語「CAR-T細胞」、 「CAR-T」、 「本發明CAR-T細胞」。嵌合抗原受體T細胞（CAR-T細胞）是將能識別某種腫瘤抗原的抗體的抗原結合部與CD3-ζ鏈或FcεRIγ的胞內部分在體外偶聯為一個嵌合蛋白，通過基因轉導的方法轉染患者的T細胞，使其表達嵌合抗原受體(CAR)。患者的T細胞被「重編碼」後，生成大量腫瘤特異性的CAR-T細胞。基本原理就是利用病人自身的免疫細胞來清除癌細胞。
CAR-NK過繼細胞療法（ACT）是指將NK細胞經過嵌合抗原受體（CAR）基因修飾，賦予NK細胞靶向識別腫瘤細胞的能力，經過體外擴展後注入人體從而達到腫瘤治療的效果。目前臨床上使用的NK細胞主要有五種來源：人外周血（PB）、臍帶血（UCB）、人胚胎幹細胞（hESCs）、誘導多能幹細胞（iPSCs）以及NK-92細胞系。
NK-92細胞系是目前在CAR-NK中研究最為廣泛的細胞系，於1992年從1例50歲的非霍奇金氏淋巴瘤男性患者體內分離得到，生長呈IL-2依賴性。與原代NK細胞相比，NK-92細胞系最大的優勢在於其表面的抑制性受體（如KIR）表達很低，抑制性受體訊號的缺失使得其對多種腫瘤的殺傷能力要優於原代NK細胞或者經細胞因數活化的其他殺傷細胞。此外，NK-92在實體瘤治療中也有一定的潛力。CAR-T在實體瘤中效果不佳的重要原因是腫瘤細胞高表達PD-L1與T細胞表面的抑制分子PD-1結合進而抑制了其殺傷活性，而NK-92表面抑制性受體的缺失使之能夠避免類似抑制訊號的干擾。但是NK-92也存在著一些明顯的缺點，例如潛在的致瘤性和EB病毒易感性等，因此，NK-92必須經過輻照後才能夠使用。
FAST-CAR平臺
包括本文所述的「FAST技術」是一種工程化免疫細胞製備技術。
在傳統的CAR-T生產過程中，首先使用CD3和/或CD28抗體啟動患者的T細胞，然後以病毒載體轉導，以表達一種或多種CAR。這些經過改造的CAR-T細胞在被注射回人體前會在體外進行擴增，生產過程整體通常需要1到6周。
FasTCAR平臺，能夠使用來自慢病毒且具有高品質、並表現出高基因轉導效率的XLenti載體，同時啟動和轉導處於靜息狀態的T細胞。在轉導後，一種或多種CAR會整合到T細胞基因組中並穩定表達。基於我們的臨床前研究，經過轉導的 T 細胞具有較高的擴增和腫瘤細胞清除活性，去除了體外細胞擴增步驟的必要性，可直接成劑、給患者使用。基於這樣的創新，FasTCAR技術能將啟動、轉導和擴增步驟轉化為一個單一的「同步啟動-轉導」步驟。該技術能將自體CAR-T細胞生產時間從行業標準的1到6周，顯著縮短到72小時內生產完畢。
載體
編碼期望分子的核酸序列可利用在本領域中已知的重組方法獲得，諸如例如通過從表達基因的細胞中篩選文庫，通過從已知包括該基因的載體中得到該基因，或通過利用標準的技術，從包含該基因的細胞和組織中直接分離。可選地，感興趣的基因可被合成生產。
本發明也提供了其中插入本發明的表達盒的載體。源于逆轉錄病毒諸如慢病毒的載體是實現長期基因轉移的合適工具，因為它們允許轉基因長期、穩定的整合並且其在子細胞中增殖。慢病毒載體具有超過源自致癌逆轉錄病毒諸如鼠科白血病病毒的載體的優點，因為它們可轉導非增殖的細胞，諸如肝細胞。它們也具有低免疫原性的優點。
簡單概括，通常可操作地連接本發明的表達盒或核酸序列至啟動子，並將其併入表達載體。該載體適合於複製和整合真核細胞。典型的克隆載體包含可用於調節期望核酸序列表達的轉錄和翻譯終止子、初始序列和啟動子。
本發明的表達構建體也可利用標準的基因傳遞方案，用於核酸免疫和基因療法。基因傳遞的方法在本領域中是已知的。見例如美國專利號5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通過引用全文併入。在另一個實施方式中，本發明提供了基因療法載體。
該核酸可被包載入許多類型的載體。例如，該核酸可被克隆入載體，其包括但不限於質體、噬菌粒、噬菌體衍生物、動物病毒和粘粒。特定的感興趣載體包括表達載體、複製載體、探針產生載體和測序載體。
進一步地，表達載體可以以病毒載體形式提供給細胞。病毒載體技術在本領域中是公知的並在例如Sambrook等(2001, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)和其他病毒學和分子生物學手冊中進行了描述。可用作載體的病毒包括但不限於逆轉錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒和慢病毒。通常，合適的載體包含在至少一種有機體中起作用的複製起點、啟動子序列、方便的限制酶位點和一個或多個可選擇的標記（例如，WO01/96584；WO01/29058；和美國專利號6,326,193）。
已經開發許多基於病毒的系統，用於將基因轉移入哺乳動物細胞。例如，逆轉錄病毒提供了用於基因傳遞系統的方便的平臺。可利用在本領域中已知的技術將選擇的基因插入載體並包裝入逆轉錄病毒顆粒。該重組病毒可隨後被分離和傳遞至體內或離體的物件細胞。許多逆轉錄病毒系統在本領域中是已知的。在一些實施方式中，使用腺病毒載體。許多腺病毒載體在本領域中是已知的。在一個實施方式中，使用慢病毒載體。
額外的啟動子元件，例如增強子，可以調節轉錄開始的頻率。通常地，這些位於起始位點上游的30-110bp區域中，儘管最近已經顯示許多啟動子也包含起始位點下游的功能元件。啟動子元件之間的間隔經常是柔性的，以便當元件相對於另一個被倒置或移動時，保持啟動子功能。在胸苷激酶(tk)啟動子中，啟動子元件之間的間隔可被增加隔開50bp，活性才開始下降。取決於啟動子，表現出單個元件可合作或獨立地起作用，以起動轉錄。
合適的啟動子的一個例子為即時早期巨細胞病毒(CMV)啟動子序列。該啟動子序列為能夠驅動可操作地連接至其上的任何多核苷酸序列高水準表達的強組成型啟動子序列。合適的啟動子的另一個例子為延伸生長因數-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他組成型啟動子序列，包括但不限於類人猿病毒40(SV40)早期啟動子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)長末端重複(LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、鳥類白血病病毒啟動子、艾伯斯坦-巴爾(Epstein-Barr)病毒即時早期啟動子、魯斯氏肉瘤病毒啟動子、以及人基因啟動子，諸如但不限於肌動蛋白啟動子、肌球蛋白啟動子、血紅素啟動子和肌酸激酶啟動子。進一步地，本發明不應被限於組成型啟動子的應用。誘導型啟動子也被考慮為本發明的一部分。誘導型啟動子的使用提供了分子開關，其能夠當這樣的表達是期望的時，打開可操作地連接誘導型啟動子的多核苷酸序列的表達，或當表達是不期望的時關閉表達。誘導型啟動子的例子包括但不限於金屬硫蛋白啟動子、糖皮質激素啟動子、孕酮啟動子和四環素啟動子。
為了評估CAR多肽或其部分的表達，被引入細胞的表達載體也可包含可選擇的標記基因或報導基因中的任一個或兩者，以便於從通過病毒載體尋求被轉染或感染的細胞群中鑒定和選擇表達細胞。在其他方面，可選擇的標記可被攜帶在單獨一段DNA上並用於共轉染程式。可選擇的標記和報導基因兩者的側翼都可具有適當的調節序列，以便能夠在宿主細胞中表達。有用的可選擇標記包括例如抗生素抗性基因，諸如neo等等。
報導基因用於鑒定潛在轉染的細胞並用於評價調節序列的功能性。通常地，報導基因為以下基因：其不存在於受體有機體或組織或由受體有機體或組織進行表達，並且其編碼多肽，該多肽的表達由一些可容易檢測的性質例如酶活性清楚表示。在DNA已經被引入受體細胞後，報導基因的表達在合適的時間下進行測定。合適的報導基因可包括編碼螢光素酶、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯轉移酶、分泌型鹼性磷酸酶或綠色螢光蛋白的基因（例如，Ui-Tei等，2000FEBS Letters479:79-82）。合適的表達系統是公知的並可利用已知技術製備或從商業上獲得。通常，顯示最高水準的報導基因表達的具有最少5個側翼區的構建體被鑒定為啟動子。這樣的啟動子區可被連接至報導基因並用於評價試劑調節啟動子-驅動轉錄的能力。
將基因引入細胞和將基因表達入細胞的方法在本領域中是已知的。在表達載體的內容中，載體可通過在本領域中的任何方法容易地引入宿主細胞，例如，哺乳動物、細菌、酵母或昆蟲細胞。例如，表達載體可通過物理、化學或生物學手段轉移入宿主細胞。
將多核苷酸引入宿主細胞的物理方法包括磷酸鈣沉澱、脂質轉染法、粒子轟擊、微 注射、電穿孔等等。生產包括載體和/或外源核酸的細胞的方法在本領域中是公知的。見例如Sambrook等(2001, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)。將多核苷酸引入宿主細胞的優選方法為磷酸鈣轉染。
將感興趣的多核苷酸引入宿主細胞的生物學方法包括使用DNA和RNA載體。病毒載體，特別是逆轉錄病毒載體，已經成為最廣泛使用的將基因插入哺乳動物例如人細胞的方法。其他病毒載體可源自慢病毒、痘病毒、單純皰疹病毒I、腺病毒和腺伴隨病毒等等。見例如美國專利號5,350,674和5,585,362。
將多核苷酸引入宿主細胞的化學手段包括膠體分散系統，諸如大分子複合物、奈米膠囊、微球、珠；和基於脂質的系統，包括水包油乳劑、膠束、混合膠束和脂質體。用作體外和體內傳遞工具(delivery vehicle)的示例性膠體系統為脂質體（例如，人造膜囊）。
在使用非病毒傳遞系統的情況下，示例性傳遞工具為脂質體。考慮使用脂質製劑，以將核酸引入宿主細胞（體外、離體(ex vivo)或體內）。在另一方面，該核酸可與脂質相關聯。與脂質相關聯的核酸可被封裝入脂質體的水性內部中，散佈在脂質體的脂雙層內，經與脂質體和寡核苷酸兩者都相關聯的連接分子附接至脂質體，陷入脂質體，與脂質體複合，分散在包含脂質的溶液中，與脂質混合，與脂質聯合，作為懸浮液包含在脂質中，包含在膠束中或與膠束複合，或以其他方式與脂質相關聯。與組合物相關聯的脂質、脂質/DNA或脂質/表達載體不限於溶液中的任何具體結構。例如，它們可存在于雙分子層結構中，作為膠束或具有「坍縮的(collapsed)」結構。它們也可簡單地被散佈在溶液中，可能形成大小或形狀不均一的聚集體。脂質為脂肪物質，其可為天然發生或合成的脂質。例如，脂質包括脂肪小滴，其天然發生在細胞質以及包含長鏈脂肪族烴和它們的衍生物諸如脂肪酸、醇類、胺類、氨基醇類和醛類的該類化合物中。
藥物組合物
本發明的分離的核酸分子、載體、宿主細胞、本發明的經改造的免疫細胞或免疫細胞組合物可以配製成醫學領域已知的任何劑型，例如，片劑、丸劑、混懸劑、乳劑、溶液、凝膠劑、膠囊劑、粉劑、顆粒劑、絕劑、錠劑、栓劑、注射劑（包括注射液、注射用無菌粉末與注射用濃溶液）、吸入劑、噴霧劑等。優選劑型取決於預期的給藥方式和治療用途。本發明的藥物組合物應當是無菌的並在生產和儲存條件下穩定。一種優選的劑型是注射劑。此類注射劑可以是無菌注射溶液。此外，可以將無菌注射溶液製備為無菌凍幹粉劑（例如，通過真空乾燥或冷凍乾燥）以便於儲存和使用。此類無菌凍幹粉劑可在使用前分散於合適的載體中，例如注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化鈉溶液（例如0.9%(w/v)NaCI）、葡萄糖溶液（例如5%葡萄糖）、含有表面活性劑的溶液（例如0.01%聚山梨醇20）、pH緩衝溶液（例如磷酸鹽緩衝溶液）、Ringer 氏溶液及其任意組合。
本發明的分離的核酸分子、載體、宿主細胞、本發明的經改造的免疫細胞或免疫細胞組合物可以通過本領域已知的任何合適的方法來施用，包括但不限於，口服、口腔、舌下、眼球、局部、腸胃外、直腸、葉鞘內、內胞漿網槽內、腹股溝、膀胱內、局部（如，粉劑、藥膏或滴劑），或鼻腔途徑。但是，對於許多治療用途而言，優選的給藥途徑/方式是胃腸外給藥（例如靜脈注射或推注，皮下注射，腹膜內注射，肌內注射）。本領域技術人員應理解，給藥途徑和/或方式將根據預期目的而發生變化。在某些實施方案中，分離的核酸分子、核酸構建體、載體、宿主細胞、本發明的經改造的免疫細胞或免疫細胞組合物通過靜脈注射或推注給予。
本發明的藥物組合物可以包括「治療有效量」或「預防有效量」的分離的核酸分子、核酸構建體、載體、宿主細胞、本發明的經改造的免疫細胞或免疫細胞組合物。「預防有效量」是指足以預防、阻止或延遲疾病的發生的量。「治療有效量」是指足以治癒或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其併發症的量。分離的核酸分子、核酸構建體、載體、宿主細胞、本發明的經改造的免疫細胞或免疫細胞組合物的治療有效量可根據如下因素發生變化：待治療的疾病的嚴重度、患者自己的免疫系統的總體狀態、患者的一般情況例如年齡，體重和性別，藥物的施用方式，以及同時施用的其他治療等等。
在本發明中，可調整給藥方案以獲得最佳目的反應（例如治療或預防反應）。例如，可以單次給藥，可以在一段時間內多次給藥，或者可以隨治療情況的緊急程度按比例減少或增加劑量。
治療性應用
因此，本發明也提供了刺激對哺乳動物的靶細胞群或組織的T細胞-介導的免疫應答的方法，其包括以下步驟：給哺乳動物施用本發明的CAR-T細胞。
在一個實施方式中，本發明包括一類細胞療法，分離病人自體T細胞（或者異源供體來源的NK細胞），啟動並進行基因改造產生CAR-T、CAR-NK細胞，隨後注入病人體內。這種方式患移植物抗宿主病概率極低，抗原被T細胞或NK細胞以MHC非依賴的方式識別。此外，一種CAR-T、CAR-NK就可以治療表達該抗原的所有癌症。不像抗體療法，CAR-T、CAR-NK細胞能夠體內複製，產生可導致持續腫瘤控制的長期持久性。
在一個實施方式中，本發明的CAR-T細胞可經歷穩固的體內T細胞擴展並可持續延長的時間量。另外，CAR介導的免疫應答可為過繼免疫療法步驟的一部分，其中CAR中的抗原結合結構域誘導CAR-修飾的免疫細胞對抗原表達靶細胞的特異性的免疫應答。例如，抗CD38和/或CLL1的CAR-T、CAR-NK細胞引起抗表達CD38和/或CLL1的細胞的特異性免疫應答。
儘管本文公開的資料具體公開了包括CD38和/或CLL1抗原識別結合域、鉸鏈和跨膜區、4-1BB或CD28共刺激結構域和CD3 ζ胞內訊號域的慢病毒載體，但本發明應被解釋為包括對構建體組成部分中的每一個的任何數量的變化。
本發明的CAR-修飾T細胞也可用作對哺乳動物離體免疫和/或體內療法的疫苗類型。優選地，哺乳動物為人。
對於離體免疫，以下中的至少一項在將細胞施用進入哺乳動物前在體外發生：i)擴增細胞，ii)將編碼CAR的核酸引入細胞，和/或iii)冷凍保存細胞。
離體程式在本領域中是公知的，並在以下更完全地進行討論。簡單地說，細胞從哺乳動物（優選人）中分離並用表達本文公開的CAR的載體進行基因修飾（即，體外轉導或轉染）。CAR-修飾的細胞可被施用給哺乳動物接受者，以提供治療益處。哺乳動物接受者可為人，和CAR-修飾的細胞可相對於接受者為自體的。可選地，細胞可相對於接受者為同種異基因的、同基因的(syngeneic)或異種的。
除了就離體免疫而言使用基於細胞的疫苗之外，本發明也提供了體內免疫以引起針對患者中抗原的免疫應答的組合物和方法。
本發明提供了治療腫瘤的方法，其包括施用給需要其的物件治療有效量的本發明的 CAR-修飾的T細胞。
本發明的CAR-修飾的T細胞可被單獨施用或作為藥物組合物與稀釋劑和/或與其他組合部分諸如IL-2、IL-17或其他細胞因數或細胞群結合施用。簡單地說，本發明的藥物組合物可包括如本文所述的靶細胞群，與一種或多種藥學或生理學上可接受載體、稀釋劑或賦形劑結合。這樣的組合物可包括緩衝液諸如中性緩衝鹽水、硫酸鹽緩衝鹽水等等；碳水化合物諸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白質；多肽或胺基酸諸如甘胺酸；抗氧化劑；螯合劑諸如EDTA或谷胱甘肽；佐劑（例如，氫氧化鋁）；和防腐劑。本發明的組合物優選配製用於靜脈內施用。
本發明的藥物組合物可以以適於待治療（或預防）的疾病的方式施用。施用的數量和頻率將由這樣的因素確定，如患者的病症、和患者疾病的類型和嚴重度——儘管適當的劑量可由臨床試驗確定。
實施例1：細胞培養及構建
KG1-LucG細胞、HL60-LucG細胞、U937-LucG細胞、THP1-LucG細胞、Molm13-LucR細胞、Molm13-CLL1-LucR細胞和K562-LucG細胞均使用RPMI 1640培養基培養；293T和野生型，與表達CD38，表達CLL1，同時表達CLL1和CD38的Hela細胞（Hela-WT，Hela-CD38，Hela-CLL1，Hela-CLL1-CD38），使用DMEM培養基培養。以上所有培養基均添加10％(v/v)胎牛血清和100U/ml的青黴素和鏈黴素，2mML-穀氨醯胺，1mM丙酮酸鈉。細胞在37℃，5%CO 2和飽和濕度下培養。
其中，表達CD38的Hela細胞是通過慢病毒載體將CD38抗原轉入Hela細胞後獲得的穩轉細胞系，能夠特異性的表達CD38蛋白分子；表達CLL1的Hela細胞是通過慢病毒載體將CLL1抗原轉入Hela細胞後獲得的穩轉細胞系，能夠特異性的表達CLL1蛋白分子；同時表達CLL1和CD38的Hela細胞是在表達CLL1的Hela細胞上再次通過慢病毒載體將CD38抗原轉入後獲得的穩轉細胞系，能夠特異性的表達CLL1和CD38蛋白分子。Molm13-LucR細胞是使用表達firefly luciferase-RFP（T2A連接）的慢病毒感染後篩選得到的穩轉細胞系。KG1-LucG細胞、HL60-LucG細胞、U937-LucG細胞、THP1-LucG細胞和K562-LucG細胞是使用表達firefly luciferase-GFP（T2A連接）的慢病毒感染後篩選得到的穩轉細胞系。Molm13-CLL1-LucR細胞是通過慢病毒載體將CLL1抗原轉入Molm13-LucR細胞後獲得的穩轉細胞系，能夠特異性的表達CLL1蛋白分子。
所使用的靶細胞表面抗原的表達情況如圖1所示。Hela-CD38為過表達CD38的細胞，Hela-CLL1為過表達CLL1的細胞，Hela-CLL1-CD38為過表達CLL1和CD38的細胞，Hela-WT和K562為CLL1 和CD38雙陰細胞，Molm13為CD38單陽細胞，HL60、KG1、U937、THP1和Molm13-CLL1為CLL1和CD38雙陽細胞。
實施例2：雙CAR載體構建和病毒製備
同時靶向CLL1和CD38的CAR（Dual CAR）結構如圖2所示，由CD8α訊號肽，識別CD38（或CLL1）的VHH，G4S序列，識別CLL1（或CD38）的VHH，Flag 標籤，鉸鏈與跨膜區，共刺激訊號區，CD3z訊號區組成。將Dual CAR基因置於EF1α(EF-1α)的啟動子下，形成Dual CAR表達載體。Dual CAR表達載體根據VHH序列的組成分別編號為C7B5，C7B8，C9B5，C9B8，B5C7，B5C9，B8C7，B8C9，C7B3，C9B3，B3C7，B3C9。
其中B3、B5、B8、C7、C9分別表示具有B3羊駝抗體胺基酸序列（SEQ ID NO：1）、B5羊駝抗體胺基酸序列（SEQ ID NO：2）、B8羊駝抗體胺基酸序列（SEQ ID NO：3）、C7羊駝抗體胺基酸序列（SEQ ID NO：4）、C9羊駝抗體胺基酸序列（SEQ ID NO：5）的單域抗體。
編號 描述 序列
1 B3羊駝抗體胺基酸序列 QVQLVESGGGLVQAGGSLRLACTASGNIFASQVMNWYRQAPGSPRELVATITPGGRTTYADSAKGRFTVATDNAKATAYLQLTSLTPEDTGVYYCHVRLFPATDYWGQGTQVTVSS
2 B5羊駝抗體胺基酸序列 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFRLDYYAIGWFRQAPGKEREAISCIDITGMHTNYGDSVMGRFTISRDDAKRTVYLQMNSLEAEDTGIYYCAPAQYAACSALGVKVSFTSWGQGTQVTVSP
3 B8羊駝抗體胺基酸序列 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFRLDYYAIGWFRQAPGKEREAIACIDITGFHTNYGDSVSGRFTISRDNAGTTVYLQMNSLEAEDTGIYYCAPARYAACSALDVKLSFTSWGQGTQVTVSS
4 C7羊駝抗體胺基酸序列 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMGWARQVPGKEVEWVSGIYSDGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYHCATDPTVHSDLPVWGQGTLVTVSS
5 C9羊駝抗體胺基酸序列 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMGWARQVPGKDVEWVSGIYSDGSTYYADSVKGRFTISRYNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCATDPTLENQTTAWGQGTQVTVSS
將2.5×10 6個293T細胞接種在150cm 2的培養皿中的10％FBS的DMEM培養基中，在轉染前將細胞在37℃，5％CO 2和飽和濕度下培養過夜。
第二天將輔助質體和Dual CAR表達載體加入含有13.8 mL Opti MEM培養基的離心管中，然後向管中加入80μg PEI得到混合物。將混合物在室溫下靜置20分鐘，然後補充12mLOpti MEM培養基以獲得轉染培養基。對於轉染，去除培養基後，將293T細胞與轉染培養基一起溫育4-6小時，然後將轉染培養基替換為含有2％FBS的20mL DMEM培養基。72小時後，收集培養基並在3000g、4℃下離心15min。上清液進一步在27000g、4℃下離心2小時。收集沉澱物並用400μL預冷的X-VIVO培養基重懸以獲得Dual CAR慢病毒懸浮液，並在4℃下保持過夜。第二天，將病毒懸浮液等分以供進一步使用。
實施例3：Dual-CAR T細胞製備
T細胞均使用X-VIVO培養基培養。將Pan T細胞與 CD3/CD28 Dynabeads以1：1的比例（CD3/CD28 Dynabeads：T細胞）以及300IU/mL IL2一起溫育以啟動細胞。2天后，將啟動的細胞進行電轉敲除CD38基因再進行病毒轉染製備Dual-CAR T。
具體操作如下：將0.25 nmol靶向CD38基因的gRNA和16.5 ug的Cas9蛋白混合均勻後在37℃下孵育15 min製備RNP；孵育期間在82 uL Nucleofector Solution中加入18 uL supplement buffer配製成100 uL lonza P3電轉緩衝液；同時使用磁力柱去除CD3/CD28 Dynabeads，並取出1×10 7個啟動的T細胞，400 g離心5 min後收集細胞沉澱；孵育結束後使用100 uL lonza P3電轉緩衝液重懸1×10 7個T細胞沉澱再加入RNP中混合均勻，隨後轉移至電轉杯中放入lonza 2B電轉儀，使用FI-115程式進行電轉，電轉後的細胞與300IU/mL IL2一起溫育過夜。
電轉後第2天在37℃下以1× 10 6個細胞/mL的細胞密度用 Dual CAR病毒轉染T細胞，將轉染後的細胞繼續培養擴增，在擴增過程中和凍存時使用CLL1和CD38抗原檢測Dual-CAR T細胞的CAR陽性率，每隔2-3天更換一半培養基，在去除CD3/CD28 Dynabeads後第8天收穫得到Dual-CAR T細胞。
圖3展示了使用抗原檢測Dual-CAR T細胞的CAR陽性率，病毒轉染後的T細胞表面能夠同時使用CLL1抗原和CD38抗原檢測到CLL1 CAR及CD38 CAR的表達。
實施例4：Dual-CAR T細胞體外殺傷
對獲得的Dual-CAR T細胞進行體外殺傷實驗。使用過表達CLL1和CD38的Hela過表達細胞系進行RTCA殺傷分析或者使用螢光素酶標記的腫瘤靶細胞進行檢測。
通過將螢光素酶基因轉入靶細胞，克隆篩選後獲得穩轉細胞株(HL60、Molm13、U937和K562)。進行實驗時，加入螢光素底物，螢光素酶與螢光素反應即可產生螢光，通過檢測螢光的強度可以測定螢光素酶的活性，檢測細胞的存活比率，即可得到CAR-T細胞的殺傷效應。
結果顯示，將CAR-T細胞與各靶細胞（CLL1/CD38雙陽、CLL1單陽、CD38單陽）共培養後，靶細胞都會裂解，表明Dual-CAR T對CLL1/CD38雙陽、CLL1單陽、CD38單陽的細胞都有殺傷作用。
具體結果如圖4顯示，雙特異CAR-T對單陽CLL1陽性靶細胞(Hela-CLL1)或單陽的CD38陽性靶細胞(Hela-CD38)均有顯著殺傷，並對CLL1和CD38雙陽的靶細胞Hela-CLL1-CD38也有顯著殺傷。說明CLL1與CD38組合的雙特異性CAR-T細胞對單靶和雙靶細胞都有殺傷作用。並且Dual-CAR T對於CLL1和CD38雙陰的靶細胞Hela沒有殺傷效果。
圖5顯示，Dual-CAR T可以對表達CD38和CLL1的腫瘤靶細胞HL60、U937和Molm13有顯著殺傷，同時對CLL1與CD38雙陰細胞K562不具有殺傷作用。
實施例5：Dual-CAR T細胞體外多輪殺傷
在第一天將Dual-CAR T復甦，在37 ℃下以1×10 6個細胞/mL的細胞密度和300IU/mL IL2一起溫育培養。在第二天分別取出1×10 5個細胞樣品使用CLL1和CD38抗原檢測Dual CAR陽性細胞得占比。
根據細胞CAR陽性率取出2×10 5的CAR陽性的Dual-CAR T細胞分別與6×10 5個HL60-LucG和KG1-LucG細胞共培養（E:T=1:3）進行多輪殺傷分析。在每一輪進行至第3天時，取出部分共培養細胞通過流式細胞術進行分析，分析流程見圖6，具體方法描述如下：從主細胞群中圈出7AAD陰性的活細胞群，再通過GFP訊號區分T細胞（GFP陰性）與靶細胞（GFP陽性），在T細胞群中使用CLL1和CD38抗原標記分析CAR陽性率。根據流式細胞術和細胞計數結果，取出相同數量的Dual-CAR T細胞，並補加腫瘤細胞至固定的效靶比（E:T為1:3）進行下一輪殺傷實驗。
針對HL60靶細胞的多輪殺傷結果如圖7所示。圖7A展示Dual-CAR T細胞在每輪結束時靶細胞（HL60）殘餘細胞擴增倍數；圖7B展示Dual-CAR T細胞在針對HL60的多輪殺傷過程中CAR陽性率的變化；圖7C展示Dual-CAR T細胞在針對HL60的多輪殺傷過程中CAR T細胞總擴增倍數。
從圖7A中可觀察到C7B3和C9B5對於HL60細胞的抑制能力強於其他Dual-CAR T；在第三輪結束時大部分的Dual-CAR T已不能抑制HL60細胞且CAR陽性率開始下降（圖7B）；從圖7C中可觀察到在針對HL60進行的多輪殺傷中，C7B3的擴增要明顯優於其他Dual-CAR T。
針對KG1靶細胞的多輪殺傷結果如圖8所示。圖8A展示Dual-CAR T細胞在每輪結束時靶細胞（KG1）殘餘細胞擴增倍數；圖8B展示Dual-CAR T細胞在針對KG1的多輪殺傷過程中CAR陽性率的變化；圖8C展示Dual-CAR T細胞在針對KG1的多輪殺傷過程中CAR T細胞總擴增倍數。
在第三輪結束時所有Dual-CAR T細胞都不能很好地抑制KG1細胞，但C9B5和C9B8對於KG1細胞的抑制能力強於其他Dual-CAR T（圖8A）。從圖8C中可觀察到在針對KG1進行的多輪殺傷中，C9B5和C9B8的擴增要優於其他Dual-CAR T細胞。
針對THP1靶細胞的多輪殺傷結果如圖9所示。圖9A展示Dual-CAR T細胞在每輪結束時靶細胞（THP1）殘餘細胞擴增倍數；圖9B展示Dual-CAR T細胞在針對THP1的多輪殺傷過程中CAR陽性率的變化；圖9C展示Dual-CAR T細胞在針對THP1的多輪殺傷過程中CAR T細胞總擴增倍數。
在第五輪結束時所有Dual-CAR T細胞都不能很好地抑制THP1細胞，但C7B5、C9B5和C9B8維持CAR表達的能力強於其他Dual-CAR T（圖9B）。從圖9C中可觀察到在針對THP1進行的多輪殺傷中， C9B8、C7B5和C9B5的擴增要優於其他Dual-CAR T細胞。
實施例6：NK細胞及培養方法
NK92細胞完全培養基是Alpha MEM中添加12.5% FBS、12.5% Horse Serum、1% Pen/strep、1% sodium pyruvate、1% L-glutamine、100U IL2. HL60、 Molm13、KG-1、THP-1、K562細胞完全培養基是RPMI1640中添加10% FBS、1% Pen/strep、1% sodium pyruvate、1% L-glutamine。細胞在37℃，5％CO 2和飽和濕度下培養。
實施例7：CAR-NK慢病毒包裝及轉染
復甦293T接種1個150cm 2培養皿，置於CO 2培養箱中培養72h。兩次傳代後接種於150cm 2培養皿，用於轉染。將慢病毒表達載體、輔助質體gag/pol、Rev、VSV‑G構成的四質體系統與PEI轉染試劑混合後，加至一定體積的無血清DMEM中，混勻放置15min；將上述混合液加至鋪有293T細胞的150cm 2培養皿中，輕輕混勻，於37℃、5%CO 2細胞培養箱中培養6h。6h後更換新鮮培養基，繼續培養，於48、72h後收集慢病毒培養上清進行感染。將收穫上清轉移至離心管，離心4000rpm，10min，去除細胞碎片。將所有離心後的LVV上清轉移至0.45μm濾器中過濾澄清，濾液再轉移至新的離心管中。將澄清後的慢病毒上清液加入到超速離心管中並于天平上配平。將配平後的超速離心管放入吊杯中，吊杯放入轉子對應位置，隨後一起放入超速離心機中離心，離心溫度4℃，轉速100000g，離心時間90min，升速度和降速度設置為最高。超速離心結束後棄去上清，每管加入0.5mL 培養基，2-8℃重懸2h。收穫的病毒加入1e6 NK92混合于24孔板中，置於CO 2培養箱中培養72h。
實施例8：CAR-NK流式檢測及分選
取出細胞懸液，用DPBS洗三次，離心300g，5min，棄去上清，加入抗體混合液（anti-FLAG-APC，1：100加入DPBS中），混勻置於4℃，染色30min，用DPBS洗三次，離心300g，5min。用DPBS重懸後，用於流式檢測和流式分選。分選時，圈選PE陽性的細胞，收集於5ml流式管中，分選結束後，離心300g，5min，棄去上清，用預熱的培養基重懸細胞，置於37℃、5%CO 2細胞培養箱。
分選後的CAR-NK92細胞，通過anti-FLAG-APC抗體染色，進行流式檢測CAR的表達。
流式檢測的結果如圖10所示，經過分選後的各CAR-NK92細胞CAR陽性率達均到了98%以上。
實施例9：CAR-NK殺傷實驗
使用螢光素酶標記的腫瘤靶細胞進行殺傷能力的檢測。通過將螢光素酶基因轉入靶細胞，獲得Molm13、HL60、THP-1和KG1的螢光素酶基因表達的穩轉細胞株。進行實驗時，加入螢光素底物，螢光素酶與螢光素反應即可產生螢光，通過檢測螢光的強度可以測定螢光素酶的活性，通過檢測細胞的存活比率，即可得到各效應細胞的殺傷效應。
結果如圖11所示，所有CAR-NK92在各靶細胞上均顯示出比NK92更明顯的殺傷，提示CAR介導的殺傷作用。
實施例10：CAR-NK多輪殺傷實驗
在實驗前一天，取帶有螢光靶細胞THP1重懸計數，調整細胞密度為8×10 4/ml，以100ul每孔鋪96孔板。實驗當天，取相應數量NK92、CAR-NK92細胞加入孔中。放入Cellcyte中開始實驗，通過明場和螢光通道每4個小時進行一次拍照。每兩天為一輪，一輪殺傷結束後，去掉部分上清，轉移至新的鋪好靶細胞的板子上，放入Cellcyte開始新一輪殺傷。Killing Index是通過調整過零時刻和細胞正常生長誤差之後，以螢光細胞數量的減少來計算殺傷。
多輪殺傷實驗結果如圖12所示，各CAR-NK92細胞都顯示出了比NK92細胞更強的殺傷能力，提示CAR介導的殺傷在持續發揮作用。
實施例11：Fast Dual-CAR T細胞製備
從健康供體採集外周血，通過密度梯度離心機以500‑600g離心 20‑30分鐘分離PBMC。結合CD28抗體和CD3抗體(CD3/CD28 Dynabeads) 的磁珠用於分選和富集T細胞。進一步將與CD3/CD28 Dynabeads結合的T細胞和300IU/mL IL2一起溫育以啟動細胞。同時在37 ℃下以0.1‑10× 10 6個細胞/mL的細胞密度用Dual-CAR病毒過夜轉染，第二天用鹽水緩衝液洗滌後直接凍存。無需進一步擴增，即可獲得FAST Dual-CAR T細胞。在該過程中，細胞被啟動，這些細胞也被稱為F Dual-CAR T細胞。
實施例12：Fast Dual-CAR T細胞表型
由於T細胞表面存在CD38蛋白，CD38 CAR的表達會導致自相殘殺，從而導致表達CD38的T細胞被清除。為分析FAST技術生產的Dual-CAR T是否會發生嚴重的自相殘殺，在F Dual-CAR T細胞復甦後進行CAR陽性標定的同時，也關注細胞活率、擴增情況以及細胞表面CD38表達。
將F Dual-CAR T細胞復甦後在37 ℃條件以及300IU/mL IL2的存在下以1× 10 6個細胞/mL的細胞密度進行培養，在復甦後的D2、D3、D5、D8分別對細胞計數，並取出1× 10 5個細胞樣品使用CLL1和CD38抗原檢測Dual-CAR陽性細胞占比，同時使用靶向CD38的抗體分析T細胞表面CD38的表達。
復甦後F Dual-CAR T細胞數據如圖13所示。圖13A顯示為T細胞表面CD38 +百分比，F-C9B5具有有F-NT相似的CD38 +比例，F-B8C9在復甦前期CD38 +細胞占比較少，但在復甦後第五天恢復至與F-NT相似水準，而F-C7B3則未能在細胞表面檢測到CD38 +細胞。各組F Dual-CAR T在復甦後CAR陽性率逐漸上調（圖13B）。F-C9B5具有有F-NT相似的細胞擴增和活率，而F-B8C9和F-C7B3擴增和活率較低（圖13C、B），結合CD38 +百分比推測可能是由於自相殘殺導致細胞活率和擴增倍數降低。
在F Dual-CAR T復甦後第三天，使用CD45RO和CCR7對F Dual-CAR T和C Dual-CAR T（傳統生產技術）細胞分 化表型進行分析。將Stem memory-like T cells (Tscm)定義為CD45RO -CCR7 +，central memory T cells (Tcm)定義為CD45RO +CCR7 +，effector memory T cells (Tem)定義為CD45RO +CCR7 －，終末分化的effector T cells (Teff)定義為CD45RO －CCR7 －。如圖14所示，F-C9B5細胞具有較大比例的年輕的Tscm和Tcm表型，而C-C9B5細胞則大部分處於分化後期的Tem和Teff表型。
實施例13：Fast Dual-CAR T細胞和C Dual-CAR T細胞體外殺傷實驗
第一天將Fast Dual-CAR T復甦，在37 ℃下以1× 10 6個細胞/mL的細胞密度和300IU/mL IL2一起溫育培養。在第二天將C Dual-CAR T復甦，在37 ℃下以1× 106個細胞/mL的細胞密度和300IU/mL IL2一起溫育培養。在第三天分別與表達螢火蟲螢光素酶的K562、HL60、Molm13和THP1共培養，分別在共培養4小時和24小時後檢測殺傷效果。結果如圖15所示，F-C9B5與C-C9B5具有相似的殺傷靶細胞的效果。
實施例14：F Dual-CAR T細胞和C Dual-CAR T細胞體外多輪殺傷
在第一天將F CAR T復甦，在37 ℃下以1× 10 6個細胞/mL的細胞密度和300IU/mL IL2一起溫育培養。在第二天將C CAR T復甦，在37 ℃下以1× 10 6個細胞/mL的細胞密度和300IU/mL IL2一起溫育培養。在第三天分別取出2× 10 5個CAR陽性的F Dual-CAR T細胞和C Dual-CAR T細胞分別與1× 10 6個HL60、Molm13和THP1細胞（E:T均為1:5）共培養進行多輪殺傷分析。在每一輪進行至第3天時，取出1/6共培養細胞直接加入1× 10 6個對應靶細胞進行下一輪殺傷實驗。同時取出部分共培養細胞計數並通過流式細胞術分析殘餘靶細胞比例和CAR +細胞比例，結合計數結果可計算CAR T細胞累計擴增倍數。
多輪殺傷結果如圖16所示，無論針對何種靶細胞，F-C9B5都能獲得比C-C9B5更持久的體外殺傷靶細胞的能力（圖16B）和更多的擴增倍數（圖16A）。
實施例15：F Dual-CAR T細胞和C Dual-CAR T細胞小鼠體內藥效比較
選取4-6周大的NOG-dKO小鼠，尾靜脈注射2×10 6Molm13-CLL1-LucR細胞。三天后通過小動物活體成像檢測腫瘤負荷，當天分組並分別注射F-C9B5細胞和C-C9B5細胞，T細胞處理後每週兩次通過小動物活體成像評估小鼠腫瘤負荷。
結果如圖17所示，相比NT對照組，注射CAR T細胞的小鼠腫瘤生長均受到抑制；F-C9B5細胞存在劑量相關的藥效，且能在較低劑量條件下獲得比C-C9B5更持久的持久的腫瘤抑制作用。各組CAR T細胞的回輸對小鼠的體重都沒有產生顯著的影響。
至此，本領域技術人員應認識到，雖然本文已詳盡示出和描述了本發明的多個示例性實施例，但是，在不脫離本發明精神和範圍的情況下，仍可根據本發明公開的內容直接確定或推導出符合本發明原理的許多其他變型或修改。因此，本發明的範圍應被理解和認定為覆蓋了所有這些其他變型或修改。
無
圖1為實施例1所述靶細胞表面抗原表達示意圖；
圖2為實施例2所述Dual-CAR的結構示意圖；
圖3為實施例3使用抗原檢測Dual-CAR T細胞的CAR陽性率；
圖4為實施例4中Dual-CAR T對Hela-WT和CLL1、CD38過表達Hela細胞的殺傷結果示意圖；
圖5為實施例4中Dual-CAR T對表達CLL1、CD38的靶細胞殺傷結果示意圖；
圖6為實施例5中CAR‑T細胞體外多輪殺傷流式細胞術分析流程示意圖；
圖7為實施例5中Dual-CAR T對HL60細胞多輪殺傷結果示意圖；
圖8為實施例5中Dual-CAR T對KG1細胞多輪殺傷結果示意圖；
圖9為實施例5中Dual-CAR T對THP1細胞多輪殺傷結果示意圖；
圖10為實施例8中CAR-NK92分選後的CAR陽性率的示意圖；
圖11為實施例9中CAR-NK92對腫瘤細胞的殺傷結果的示意圖；
圖12為實施例10中CAR-NK92的多輪殺傷結果的示意圖；
圖13為實施例12中F Dual-CAR T復甦後CD38表達、CAR表達、擴增和活率變化示意圖；
圖14為實施例12中F Dual-CAR T和C Dual-CAR T細胞分化表型比較示意圖；
圖15為實施例13中F Dual-CAR T和C Dual-CAR T細胞體外殺傷結果示意圖；
圖16為實施例14中F Dual-CAR T和C Dual-CAR T細胞體外多輪殺傷結果示意圖；
圖17為實施例15中F Dual-CAR T和C Dual-CAR T細胞小鼠體內藥效實驗圖。
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Claims (53)

  1. 一種靶向CD38和CLL1的雙特異性嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體融合蛋白從N末端到C末端至少包括： i）特異性識別CLL1和CD38的抗原結合域； ii）跨膜結構域； iii）至少一個共刺激結構域； iv）訊號轉導結構域。
  2. 如請求項1所述的嵌合抗原受體，其中所述抗原結合域為單價或多價。
  3. 如請求項2所述的嵌合抗原受體，其中所述抗原結構域包括單域抗體。
  4. 如請求項3所述的嵌合抗原受體，其中所述單域抗體經過人源化改造處理。
  5. 如請求項4所述的嵌合抗原受體，其中所述抗原結合域包括兩個單域抗體VHH1和VHH2，其中VHH1表示第一抗原結合域的單域抗體，VHH2表示第二抗原結合域的單域抗體； 所述第一抗原結合域靶向CD38，所述第二抗原結合域靶向CLL1； 所述第一抗原結合域和所述第二抗原結合域從氨基末端到羧基末端以選自下組之一的模式排列： i）VHH1‑VHH2；或 ii）VHH2‑VHH1。
  6. 如請求項5所述的嵌合抗原受體，其中所述VHH1的CDR1胺基酸序列如SEQ ID NO: 6所示；所述VHH1的CDR2包括胺基酸序列如SEQ ID NO: 8所示；所述VHH1的CDR3胺基酸序列如SEQ ID NO: 11所示。
  7. 如請求項5所述的嵌合抗原受體，其中所述VHH1的CDR1胺基酸序列如SEQ ID NO: 7所示；所述VHH1的CDR2包括胺基酸序列如SEQ ID NO: 9所示；所述VHH1的CDR3胺基酸序列如SEQ ID NO: 12所示。
  8. 如請求項5所述的嵌合抗原受體，其中所述VHH1的CDR1胺基酸序列如SEQ ID NO: 7所示；所述VHH1的CDR2包括胺基酸序列如SEQ ID NO: 10所示；所述VHH1的CDR3胺基酸序列如SEQ ID NO: 13所示。
  9. 如請求項6至8任一項所述的嵌合抗原受體，其中所述VHH1包括SEQ ID NO: 1- 3所示的胺基酸序列、或由其組成。
  10. 如請求項5所述的嵌合抗原受體，其中所述VHH2的CDR1胺基酸序列如SEQ ID NO: 14所示；所述VHH2的CDR2胺基酸序列如SEQ ID NO: 15所示；所述VHH2的CDR3胺基酸序列如SEQ ID NO: 17所示。
  11. 如請求項5所述的嵌合抗原受體，其中所述VHH2的CDR1胺基酸序列如SEQ ID NO: 14所示；所述VHH2的CDR2胺基酸序列如SEQ ID NO: 16所示；所述VHH2的CDR3胺基酸序列如SEQ ID NO: 18所示。
  12. 如請求項10或11所述的嵌合抗原受體，其中所述VHH2包括SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 5所示的胺基酸序列、或由其組成。
  13. 如請求項1所述的嵌合抗原受體，其中所述跨膜結構域為CD8α或CD28。
  14. 如請求項13所述的嵌合抗原受體，其中所述CD8α的跨膜結構域包括SEQ ID NO: 19所示的胺基酸序列、或由其組成；所述CD28的跨膜結構域包括SEQ ID NO: 20所示的胺基酸序列、或由其組成。
  15. 如請求項1所述的嵌合抗原受體，其中所述胞內訊號傳導結構域包括選自下列的分子：CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、TCRζ、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD79a、CD79b、CD278、FcεRI、DAP10、DAP12、CD66d中的一種或其組合。
  16. 如請求項15所述的嵌合抗原受體，其中所述胞內訊號傳導結構域優選為CD3ζ的胞漿訊號傳導序列。
  17. 如請求項16所述的嵌合抗原受體，其中所述CD3ζ的胞漿訊號傳導序列包括SEQ ID NO: 21所示的胺基酸序列、或由其組成。
  18. 如請求項16所述的嵌合抗原受體，其中所述CD3ζ的胞漿訊號傳導序列還包括其野生型、或其突變體/修飾體。
  19. 如請求項18所述的嵌合抗原受體，其中所述共刺激訊號結構域包括選自下列的分子：4‑1BB(CD137)、CD27、CD19、CD4、CD28、ICOS(CD278)、CD82β、BAFFR、HVEM、LIGHT、KIRDS2、SLAMF7、NKp30、NKp46、CD40、ICAM‑1、B7‑H3、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD7、CD226中的一種或其組合。
  20. 如請求項19所述的嵌合抗原受體，其中所述共刺激訊號結構域優選為4‑1BB或CD28。
  21. 如請求項20所述的嵌合抗原受體，其中所述4‑1BB的共刺激訊號結構包括SEQ ID NO: 22所示的胺基酸序列、或由其組成；所述CD28的共刺激訊號結構包括SEQ ID NO: 23所示的胺基酸序列、或由其組成。
  22. 如請求項21所述的嵌合抗原受體，其中所述嵌合抗原受體還包括鉸鏈區。
  23. 如請求項22所述的嵌合抗原受體，其中所述鉸鏈區優選為CD8α。
  24. 如請求項23所述的嵌合抗原受體，其中所述CD8α的鉸鏈區具有如括SEQ ID NO: 24所示的胺基酸序列。
  25. 如請求項24所述的嵌合抗原受體，其中所述嵌合抗原受體還包括訊號肽；所述訊號肽選自下列的分子：T細胞受體的α鏈及β鏈、CD3ζ、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD9、CD28、CD16、CD22、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、GITR、GM‑CSF中的一種或其組合。
  26. 如請求項25所述的嵌合抗原受體，其中所述訊號肽優選為CD8α。
  27. 如請求項26所述的嵌合抗原受體，其中所述CD8α的訊號肽包括SEQ ID NO: 25所示的胺基酸序列、或由其組成。
  28. 如請求項27所述的嵌合抗原受體，其中其具體結構為： L-VHH1-L1-VHH2- H-TM-C-CD3ζ 各「-」獨立地為連接肽或肽鍵； L為CD8a訊號肽分子； VHH1為特異性結合CD38或CLL1的抗原結合域； VHH2為特異性結合CLL1或CD38的抗原結合域； L1為連接肽； H為CD8a的鉸鏈區； TM為CD8a的跨膜結構域； C為4-1BB共刺激結構域； CD3ζ為源於CD3ζ的胞漿訊號傳導序列。
  29. 如請求項27所述的嵌合抗原受體，其具體結構為： L-VHH1-L1-VHH2-F-H-TM-C-CD3ζ 各「-」獨立地為連接肽或肽鍵； L為CD8a訊號肽分子； VHH1為特異性結合CD38或CLL1的抗原結合域； VHH2為特異性結合CLL1或CD38的抗原結合域； L1為連接肽； F為Flag標籤序列（Flag Tag）； H為CD8a的鉸鏈區； TM為CD28的跨膜結構域； C為CD28的共刺激結構域； CD3ζ為源於CD3ζ的胞漿訊號傳導序列。
  30. 如請求項28或29所述的嵌合抗原受體，其中所述連接肽選自以下胺基酸序列的接頭：SGG、GGS、SGGS、SSGGS、GGGG、SGGGG、GGGGS、SGGGGS、GGGGGS、SGGGGGS、SGGGGG、GSGGGGS、GGGGGGGS、SGGGGGGG、SGGGGGGGS、SGGGGSGGGGS或GGGGSGGGGSGGGGS。
  31. 如請求項30所述的嵌合抗原受體，其中所述連接肽優選為GGGGSGGGGSGGGGS，由SEQ ID NO: 26的胺基酸序列所示。
  32. 如請求項29所述的嵌合抗原受體，其中所述融合蛋白表達標籤Flag tag由SEQ ID NO: 27的胺基酸序列所示。
  33. 一種核酸分子，所述核酸分子為編碼請求項6至12任一項所述嵌合抗原受體的核苷酸序列。
  34. 如請求項33所述的核酸分子，優選編碼SEQ ID NO:2與SEQ ID NO:5所示胺基酸的核酸分子C9B5，所述C9B5的核苷酸序列由SEQ ID NO:30所示。
  35. 如請求項33所述的核酸分子，其中所述的核酸分子還包括SEQ ID NO: 28-29、或31-51任一項所示的核苷酸序列。
  36. 一種重組載體，其中所述重組載體包含請求項6至12任一項所述的嵌合抗原受體，或請求項33至35任一項所述的核酸分子。
  37. 如請求項36所述的重組載體，其特徵在於，所述重組載體包括DNA載體、RNA載體、質體、轉座子載體、脂質體、CRISPR/Cas9載體或病毒載體。
  38. 如請求項37所述的重組載體，其中所述病毒載體包含慢病毒載體、腺病毒載體、逆轉錄病毒載體。
  39. 一種工程改造的免疫細胞，其中所述工程改造的免疫細胞包含請求項6至12任一項所述的嵌合抗原受體，或請求項33至35任一項所述的核酸分子，或請求項36至38任一項所述的重組表達載體。
  40. 如請求項39所述的工程改造的免疫細胞，其中所述免疫細胞利用FAST- CAR技術製備。
  41. 如請求項40所述的工程改造的免疫細胞，其中所述FAST CAR將啟動、轉導和擴增步驟轉化為一個單一的「同步啟動-轉導」步驟，其中所述工程化免疫細胞經歷了少於72小時的離體擴增。
  42. 如請求項41所述的工程改造的免疫細胞，其中可以減少在生產過程中由於CD38 CAR識別免疫細胞表面CD38抗原引起的自相殘殺的影響，或由於其他CAR識別免疫細胞表面對應的靶點抗原引起的自相殘殺的影響，如CD70 CAR識別T細胞表面CD70抗原引起的T細胞的凋亡； 所述免疫細胞可應用任何CAR靶向抗原和不同的腫瘤標記中。
  43. 如請求項41所述的工程改造的免疫細胞，其中與經歷離體擴增1周或更多周的可比群體中的細胞相比，所述免疫細胞的細胞表型更年輕。
  44. 如請求項43所述的所述的工程改造的免疫細胞，其中所述年輕的特徵在於所述免疫細胞中T n/scm（CD45RO -，CCR7 +）和Tcm（CD45RO +，CCR7 +）占比更高。
  45. 如請求項41所述的所述的工程改造的免疫細胞，其中與經歷離體擴增1周或更多周的可比群體中的細胞相比，觀察到所述免疫細胞的體外擴增和持續殺傷能力更強。
  46. 如請求項39所述的工程改造的免疫細胞，其中所述免疫細胞包含T細胞、NK細胞、iNKT細胞、CTL細胞、單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和/或NKT細胞。
  47. 如請求項46所述的工程改造的免疫細胞，其中所述免疫細胞優選為T細胞和NK細胞。
  48. 如請求項6至12任一項所述的嵌合抗原受體、請求項33至35任一項所述的核酸分子、請求項36至38所述的重組表達載體或請求項39至47任一項所述的工程改造的免疫細胞在製備用於治療腫瘤的藥物中的應用。
  49. 如請求項48所述的應用，其中所述腫瘤為表達CD38和/或CLL1的腫瘤。
  50. 如請求項49所述的應用，其中所述腫瘤為急性骨髓性白血病。
  51. 如請求項48所述的應用，其中所述藥物還包括藥學上可接受的載體、輔劑。
  52. 如請求項6至12任一項所述的嵌合抗原受體與以下的一種或多種組合在製備用於治療和/或預防癌症的藥物組合中的用途： （1）增加包含CAR核酸或CAR多肽的細胞的功效的作用劑； （2）改善與施用包含CAR核酸或CAR多肽的細胞相關的一種或多種副作用的作用劑； （3）治療與CD38和CLL1相關疾病的另外的作用劑。
  53. 如請求項52所述的應用，其中所述治療和/或預防還包括與第二療法組合使用，所述第二療法選自手術、化療、放療、免疫療法、基因療法、DNA療法、RNA療法、奈米療法、病毒療法、輔助療法及其任意組合。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US20190135894A1 (en) * 2015-06-25 2019-05-09 iCell Gene Therapeuticics LLC COMPOUND CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR (cCAR) TARGETING MULTIPLE ANTIGENS, COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
AU2018347601B2 (en) * 2017-10-12 2025-09-04 Icell Gene Therapeutics, Llc Compound chimeric antigen receptor (cCAR) targeting multiple antigens, compositions and methods of use thereof
WO2019246593A2 (en) * 2018-06-22 2019-12-26 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods to target cll-1 and cd123 for the treatment of acute myeloid leukemia and related disorders
CN113286874A (zh) * 2018-10-12 2021-08-20 美商生物细胞基因治疗有限公司 嵌合抗原受体(CARs)组合物及使用方法
CN115197330B (zh) * 2021-04-14 2023-04-28 广州百暨基因科技有限公司 同时靶向cll1和cd33的嵌合抗原受体及其应用

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