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TW202521161A - 苯丙胺酸解氨酶與ｐｏｅｇｍａ之結合物及其使用方法 - Google Patents

苯丙胺酸解氨酶與ｐｏｅｇｍａ之結合物及其使用方法 Download PDF

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TW202521161A
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傑佛瑞 博桂格
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Abstract

本揭示案提供苯丙胺酸解氨酶與聚(寡(乙二醇)甲基丙烯酸酯(POEGMA)之結合物及其使用方法。具體而言，本文所揭示之POEGMA-PAL結合物在投與至個體後經免疫遮蔽以減少免疫反應。

Description

苯丙胺酸解氨酶與POEGMA之結合物及其使用方法
本揭示案提供苯丙胺酸解氨酶與聚(寡(乙二醇)甲基丙烯酸酯) (POEGMA)之結合物及其治療使用方法。具體而言，本文所揭示之POEGMA-PAL結合物提供一種用於治療苯丙酮尿症(PKU)之方法，其與當前用於治療PKU之方法相比具有降低之免疫原性。
苯丙胺酸羥化酶(PAH)缺乏症，通常亦稱為苯丙酮尿症(PKU)，為一種罕見的與PAH活性不存在或缺乏相關之體染色體隱性遺傳病症。PAH缺乏症會阻止身體處理苯丙胺酸，苯丙胺酸為所有含蛋白質食物中都存在的必需胺基酸。此缺乏症係由將苯丙胺酸轉化為酪胺酸之肝酶PAH缺乏活性引起的。在沒有此酶之情況下，血液中之苯丙胺酸水準升高且可在患有該病症之個體中引起神經認知及精神症狀。此外，過量苯丙胺酸及其代謝物之排洩可產生黴味體味及皮膚疾患，諸如濕疹，且酪胺酸酶之相關抑制及低酪胺酸水準可導致皮膚及毛髮色素沉著減少。
PAH缺乏症導致對必需胺基酸苯丙胺酸之飲食攝入的不耐受，因此，維持苯丙胺酸水準低於推薦臨限值之終生飲食管理係重要的。若無有效療法，大多數患有PKU之個體會發展成嚴重且不可逆之智力殘疾。培伐利酶(Pegvaliase) ( 例如，PALYNZIQ ®)為聚乙二醇化苯丙胺酸解氨酶(PAL)酶替代療法，其經批准用於降低在現有管理下苯丙胺酸濃度不受控制＞ 600 μmol/L的患有PKU之成人的苯丙胺酸濃度。
PAL為廣泛分佈於植株(Koukol 等人, J. Biol. Chem. 236:2692-2698 (1961)；Hanson 等人, The Enzymes 7:75-166 (1972)；Poppe 等人, Curr. Org. Chem. 7:1297-1315 (2003))、一些真菌(Rao 等人, Can. J. Biochem. 4512:1863-1872 (1967)；Abell 等人, Methods Enzymol. 142:242-253 (1987))及細菌(Bezanson 等人, Can. J. Microbiol. 16:147-151 (1970)；Xiang 等人, J. Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002)；Hill 等人, Chem. Commun. 1358-1359 (2003))中之非哺乳動物酶，且可在大腸桿菌( Escherichia coli)中重組產生。來自藍細菌物種多變魚腥藻( Anabaena variabilis) (Av)之PAL已在細菌中選殖且表現，且在 活體外及 活體內展現PAL酶活性(參見 例如美國專利第7,531,341號；第7,534,595號；第7,537,923號；及第7,560,263號，該等專利中之每一者以全文引用方式併入本文)。培伐利酶包含藉由聚乙二醇(PEG)之共價連接衍生化之重組 多變魚腥藻PAL (rAvPAL)，該rAvPAL與批准前可用之基於PEG的療法相比降低培伐利酶之免疫原性、改良培伐利酶之半衰期且最佳化培伐利酶之藥物動力學概況(同上)。然而，培伐利酶仍引發一些免疫反應，且使用培伐利酶與大於30%之中斷率相關。
因此，存在進一步開發用於患有PKU之個體的基於PAL之療法的機會。換言之，仍需要提供進一步改良之PKU治療，其具有降低之免疫原性、改良之半衰期及/或最佳化藥物動力學概況。本文所揭示之結合物及方法提供一種替代聚合物，其模擬PEG之物理化學性質而不損害治療藥物動力學，且最小化限制先前聚乙二醇化藥物諸如培伐利酶之功效的抗PEG免疫反應。
在一個態樣中，本揭示案提供苯丙胺酸解氨酶(PAL)與聚(寡(乙二醇)甲基丙烯酸酯)) (POEGMA)之結合物(聚-寡乙二醇甲基丙烯酸酯(POEGMA)修飾之重組細菌苯丙胺酸解氨酶；在本文中「POEGMA-PAL結合物」)及其治療使用方法。本文所揭示之POEGMA-PAL結合物提供用於PAL之遞送系統，該遞送系統a)引發對抗PEG抗體之較低免疫遺傳反應，且b)展示比當前基於PAL之療法更快的藥物動力學。此外，POEGMA-PAL結合物可經調配為低黏度溶液，用於皮下遞送比當前基於PAL之療法可獲得的更高劑量。
在一個實施例中，本揭示案提供一種結合物「POEGMA-PAL結合物」，其包含一或多種包含聚(寡乙二醇甲基丙烯酸酯)之聚合物( 例如，1-21)；及苯丙胺酸解氨酶(PAL)，其中該一或多種聚合物經由一或多個離胺酸殘基直接或間接結合至PAL。
在一個實施例中，本揭示案之POEGMA-PAL結合物由式(I)表示： (I)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶； R 1為連接體； R 2為端帽； x為1至約21之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數，且 「NH」中之N為PAL之離胺酸殘基的側鏈之氮。
在式(I)中，該一或多種包含聚(寡乙二醇甲基丙烯酸酯)之聚合物可由式(V)表示： (V)， 其中： 為與直接結合至式(I)中之PAL之氮(N)的連接； R 1為連接體； R 2為端帽； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
在一個實施例中，PAL之19-21個離胺酸殘基結合至連接體-POEGMA。在一個實施例中，PAL之各次單元上的至少4個離胺酸殘基結合至連接體-POEGMA。在一個實施例中，PAL之各次單元上的至少5個離胺酸殘基結合至連接體-POEGMA。在一個實施例中，PAL之各次單元上的4-6個離胺酸殘基結合至連接體-POEGMA。各連接體-POEGMA可相同或可不同。
在一個實施例中，POEGMA-PAL結合物由式(I')表示： (I’)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶，其為包含四個次單元之同四聚體蛋白； R 2為端帽； m為約3至約12之整數； x為1至約21之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
在一個實施例中，POEGMA-PAL結合物由式(Ia)表示： (Ia)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶； R 2為端帽； x為1至約21之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
在一個實施例中，POEGMA-PAL結合物由式(Ia-1)表示： (Ia-1)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶； x為1至約21之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
在一個實施例中，POEGMA-PAL結合物由式(Ia-1-1)表示： (Ia-1-1)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶，其為包含四個次單元之同四聚體蛋白； x為1至約21之整數；且 y為約50至約500之整數。
在一個實施例中，POEGMA-PAL結合物如 表A中所描繪。
在式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)、(Ia-1-1)中之每一者或(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者的某些實施例中，PAL可為任何原核苯丙胺酸解氨酶。在一些實施例中，PAL衍生自 多變魚腥藻(AvPAL)。在一個實施例中，AvPAL之各次單元包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列。在一個實施例中，AvPAL為重組AvPAL (rAvPAL)。在一個實施例中，AvPAL為AvPAL變異體。在一個實施例中，AvPAL變異體之各次單元包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之胺基酸序列。
在式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)及(Ia-1-1)及式(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者的一些實施例中，包含聚(寡乙二醇甲基丙烯酸酯)之聚合物結合至PAL之各次單元上的一或多個( 例如，1-5或1-6個)離胺酸殘基，其中PAL之各次單元之離胺酸殘基獨立地包含K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109中之一或多者。在式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)及(Ia-1-1)或式(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者的一些實施例中，包含聚(寡乙二醇甲基丙烯酸酯)之聚合物結合至PAL之各次單元上的二或更多個離胺酸殘基( 例如，PAL之各次單元上的2-5或2-6個殘基)，其中PAL之各次單元之離胺酸殘基獨立地包含K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109中之二或更多者。在式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)及(Ia-1-1)之一些實施例中，包含聚(寡乙二醇甲基丙烯酸酯)之聚合物結合至PAL之各次單元上的三或更多個離胺酸殘基( 例如，PAL之各次單元上的3-5或3-6個殘基)，其中PAL之各次單元之離胺酸殘基獨立地包含K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109中之三或更多者。在式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)及(Ia-1-1)或式(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者的一些實施例中，包含聚(寡乙二醇甲基丙烯酸酯)之聚合物結合至PAL之各次單元上的四或更多個離胺酸殘基( 例如，4-5或4-6個)，其中PAL之各次單元之離胺酸殘基獨立地包含K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109中之四或更多者。在式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)及(Ia-1-1)或式(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者的一些實施例中，包含聚(寡乙二醇甲基丙烯酸酯)之聚合物結合至PAL之各次單元上的五或更多個離胺酸殘基( 例如，5或6個殘基)，其中PAL之各次單元之離胺酸殘基獨立地包含K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109中之四或更多者。
在一些實施例中，一或多種包含聚(寡乙二醇甲基丙烯酸酯)之聚合物中之三者個別地結合至各次單元上的離胺酸殘基K189、K195及K522中之每一者。在一些實施例中，一或多種包含聚(寡乙二醇甲基丙烯酸酯)之聚合物中之五種聚合物個別地結合至各次單元上的離胺酸殘基K189、K195、K522、K413及K145中之每一者。
在式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)及(Ia-1-1)或式(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者的某些實施例中，R 1為CH 2、C(O)-C 1-12烷基-NH、C(O)-(O-CH 2-CH 2) n，其中n為2或3，或Gly-Gly-Phe-Gly (SEQ ID NO:5)。在一個實施例中，R 1為C(O)-(CH 2) 5-NH。
在式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)及(Ia-1-1)或式(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者的某些實施例中，R 2為異丁腈、4-氰基戊酸、4-甲氧基-2,4-二甲基戊腈或-OH (羥基)。在一個實施例中，R 2為異丁腈。
在式(I)、(I')、(Ia)及(Ia-1)之某些實施例中，z為2至約8。在一個實施例中，z為2。在一個實施例中，x為約5至約21、約8至約21、約10至約21、約16至約21或約19至約21之整數。在一個實施例中，x為19。在一個實施例中，x為20。在一個實施例中，x為21。在一個實施例中，y為約150至約300，諸如約175至200之整數。在一個實施例中，y為約200。
在另一態樣中，本揭示案提供一種組合物，其包含複數個式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)或(Ia-1-1)或式(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者之POEGMA-PAL結合物。在此種組合物中，x、y及z可在不同的結合物之間變化且可在組合物中之單一結合物中變化。因此，包含複數個POEGMA-PAL結合物之組合物之特徵可在於z ave為約2至約8，x ave為約8至約21或約16至約21，且y ave為約150至約300，諸如約175至約200。在一些實施例中，z ave為2。在一些實施例中，z ave之標準偏差為0 ( 亦即，在組合物之所有POEGMA-PAL結合物中，z為2)。在一些實施例中，包含複數個POEGMA-PAL結合物之組合物之特徵可在於數均分子量(M n)為約1100 kDa至約1300 kDa。在一些實施例中，包含複數個POEGMA-PAL結合物之組合物之特徵可在於數均分子量(M n)為約1200 kDa。在一些實施例中，包含複數個POEGMA-PAL結合物之組合物之特徵可在於數均分子量(M w)為約1100 kDa至約1300 kDa。在一些實施例中，包含複數個POEGMA-PAL結合物之組合物之特徵可在於數均分子量(M w)為約1200 kDa。在一些實施例中，包含複數個POEGMA-PAL結合物之組合物之特徵可在於多分散性指數(PI)為約1至約1.1。
在另一態樣中，本揭示案提供一種醫藥組合物，其包含複數個式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)、(Ia-1-1)及/或式(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者的POEGMA-PAL結合物及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。在某些實施例中，醫藥組合物包含約20 mg/mL至約60 mg/mL之複數個式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)、(Ia-1-1)及/或式(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者的POEGMA-PAL結合物及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。在某些實施例中，醫藥組合物包含約20 mg/mL至約60 mg/mL之複數個式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)、(Ia-1-1)及/或式(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者的POEGMA-PAL結合物及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑，且具有等於或小於約70 cP之黏度，諸如約1 cP至約70 cP之黏度。在某些實施例中，醫藥組合物包含約20 mg/mL至約40 mg/mL之複數個式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)、(Ia-1-1)及/或式(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者的POEGMA-PAL結合物及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑，且具有等於或小於約20 cP之黏度，諸如約1 cP至約20 cP之黏度。
在又另一態樣中，本揭示案提供一種治療個體之PAH缺乏症之方法，該方法包含向個體投與治療有效量的式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)、(Ia-1-1)中之任一者及/或式(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者的POEGMA-PAL結合物。
在又另一態樣中，本揭示案提供一種治療個體之苯丙酮尿症(PKU)之方法，該方法包含向個體投與治療有效量的式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)、(Ia-1-1)中之任一者及/或式(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者的POEGMA-PAL結合物。
在又另一態樣中，本揭示案提供一種降低有需要的個體之血液苯丙胺酸濃度之方法，該方法包含向個體投與治療有效量的式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)、(Ia-1-1)中之任一者及/或式(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者的POEGMA-PAL結合物。
在一個實施例中，POEGMA-PAL結合物以包含複數個POEGMA-PAL結合物及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑之醫藥組合物的形式投與。在某些實施例中，降低個體之血液苯丙胺酸濃度對於治療個體之PKU為有效的。在一些實施例中，投與為皮下投與。在一些實施例中，經由 例如皮下注射向個體投與約0.5 mL至約1.5 mL之醫藥組合物。
在又另一態樣中，本揭示案提供一種套組，其中該套組包含注射器及醫藥組合物，該醫藥組合物包含複數個式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)、(Ia-1-1)中之任一者及/或式(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者的POEGMA-PAL結合物及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。在一個實施例中，注射器填充有0.5至1.5 mL之醫藥組合物。
在又另一態樣中，本揭示案提供一種製備式(I)之POEGMA-PAL結合物之方法： (I)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶，其為包含四個次單元之同四聚體蛋白； R 1為連接體； R 2為端帽； x為1至約21之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數， 該方法包含： a. 使寡乙二醇甲基丙烯酸酯與式(II)化合物： (II)， 其中R 3為RAFT鏈轉移劑且R 4為結合部分在有效產生式(III)聚合物之條件下接觸： (III)， b. 使式(III)聚合物與端基改質劑接觸，以移除RAFT鏈轉移劑且產生式(IV)之預結合聚合物： (IV)； 其中R 2為端帽；及 c. 使式(IV)之預結合聚合物經由PAL變異體上之一或多個離胺酸殘基( 例如，1-21個殘基)與原核苯丙胺酸解氨酶(PAL)變異體結合。
在一個實施例中，R 1為CH 2、C(O)-C 1-12烷基-NH、C(O)-(O-CH 2-CH 2) n，其中n為2或3，或Gly-Gly-Phe-Gly (SEQ ID NO:5)。在一個實施例中，R 1為C(O)-C 1-12烷基-NH。在一個實施例中，如本文所述製備之式(I)結合物為式(I')結合物： (I’)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶，其為包含四個次單元之同四聚體蛋白； R 2為端帽； m為約3至約12之整數； x為1至約21之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
在一個實施例中，R 1為C(O)-(CH 2) 5-NH。在一個實施例中，如本文所述製備之式(I)結合物為式(Ia)結合物： (Ia)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶，其為包含四個次單元之同四聚體蛋白； R 2為端帽； x為1至約21之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
在一個實施例中，R 2為異丁腈、4-氰基戊酸、4-甲氧基-2,4-二甲基戊腈及羥基(-OH)。在一個實施例中，R 2為異丁腈。
在一個實施例中，如本文所述製備之式(I)結合物為式(Ia-1)結合物： (Ia-1)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶，其為包含四個次單元之同四聚體蛋白； x為1至約21之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
在一個實施例中，z為2至約8。在一個實施例中，z為2。在一個實施例中，如本文所述製備之式(I)結合物為式(Ia-1-1)結合物： ， (Ia-1-1) 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶，其為包含四個次單元之同四聚體蛋白； x為1至約21之整數；且 y為約50至約500之整數。
在一個實施例中，R 4為 、 、 或 ，其中 表示與R 1之連接。
在本文所揭示之描繪PAL的式中之任一者中，PAL可來源於 多變魚腥藻(AvPAL)。在一個實施例中，AvPAL之各次單元包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列。在一個實施例中，AvPAL為重組AvPAL (rAvPAL)。在一個實施例中，AvPAL為AvPAL變異體。在一個實施例中，AvPAL變異體之各次單元包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之胺基酸序列。
在任何實施例中，x可為約8至約21，諸如約10至約21、約16至約21或約19至約21之整數。在任何實施例中， 例如在式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)及(Ia-1-1)中之任一者中，y可為約150至約300，諸如約175至約200之整數。
在一個實施例中，R 3為三硫代碳酸酯。在一個實施例中，R 3為 ，其中星號(*)表示與化合物或聚合物之其餘部分的連接。
在一個實施例中，有效產生式(III)聚合物之條件包含使寡乙二醇甲基丙烯酸酯與式(II)化合物在DMSO及光源存在下接觸。在一個實施例中，該光源為藍色LED光。
在一個實施例中，端基改質劑為偶氮雙異丁腈(AIBN)、4'-偶氮雙(4-氰基戊酸)、2,2'-偶氮雙(4-甲氧基-2,4-二甲基戊腈)或UV光。在一個實施例中，使式(III)聚合物與AIBN接觸以產生式(IV)之預結合聚合物係在DMSO存在下進行。
相關申請案之交互參照 本申請案主張2024年8月21日提出申請之美國臨時專利申請案第63/685,484號、2024年7月12日提出申請之美國臨時專利申請案第63/670,613號及2023年11月17日提出申請之美國臨時專利申請案第63/600,515號之權益，該等申請案中之每一者之揭示內容係以全文引用之方式併入本文中。
序列表 本申請案含有電子序列表，該序列表已以XML檔案格式與本申請案一起提交，其全部內容係以全文引用之方式併入本文中。與本申請案一起提交之序列表XML檔案命名為「11808-545-185_SEQ_LISTING.xml」，創建於2024年11月8日，且大小為8,430個位元組。
本文描述苯丙胺酸解氨酶(PAL)與聚(寡(乙二醇)甲基丙烯酸酯) (POEGMA)之結合物、包含該等結合物之組合物及醫藥組合物、及對於治療PKU為有效的使用該等結合物降低個體之血液苯丙胺酸濃度的方法。與PKU之當前治療( 例如，培伐利酶或PALYNZIQ ®)相比，本文所述之POEGMA-PAL結合物展現縮短的起效時間。此外，包含高濃度POEGMA-PAL結合物之組合物可在低黏度下製備，從而提供可經由注射、尤其經由體積有限之注射途徑( 例如，皮下、肌內)向個體提供更高劑量之機制。此外，與培伐利酶相比，本文所揭示之POEGMA-PAL結合物展現降低之抗原性。因此，經歷用如本文所揭示之POEGMA-PAL結合物治療之個體與先前治療方案相比可經歷較少不良效應且/或可因較高劑量及/或改良的藥物動力學而得到更有效的治療。
定義除非另有說明，否則本申請案(包括說明書及申請專利範圍)中所用之以下術語具有下文給出之定義。
除非上下文另有明確指示，否則單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個指示物。
本文所引用之所有出版物、專利及專利申請案(無論上文或下文)皆以全文引用方式併入。
在一些實施例中，用相應化學名稱揭示化學結構。在衝突之情況下，化學結構控制含義，而非名稱。
術語「烷基」係指在碳原子之間缺乏雙鍵或三鍵且在某些實施例中具有一至十二個碳原子(C 1-12烷基)，諸如一至10個、一至6個、一至5個、一至4個或一至三個碳原子之單價脂族烴基。該術語包括(舉例而言)直鏈、支鏈及環狀烴基，諸如甲基(-CH 3)、乙基(-CH 2CH 3)、正丙基(-CH 2CH 2CH 3)、異丙基(-CH(CH 3) 2)、環丙基(-C 3H 5)、正丁基(-CH 2CH 2CH 2CH 3)、異丁基(-CH 2CH(CH 3) 2)、二級丁基(CH(CH 3)(CH 3CH 2))、三級丁基(-C(CH 3) 3)、正戊基(-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 3)及新戊基(-CH 2C(CH 3) 3)。
在一個實施例中，術語「烷基」包括(舉例而言)直鏈、支鏈及環狀烴基，諸如甲基(-CH 3)、乙基(-CH 2CH 3)、正丙基 (-CH 2CH 2CH 3)、異丙基(-CH(CH 3) 2)、環丙基(-C 3H 5)、正丁基(-CH 2CH 2CH 2CH 3)、異丁基(-CH 2CH(CH 3) 2)、二級丁基(CH(CH 3)(CH 3CH 2))、三級丁基(-C(CH 3) 3)、正戊基(-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 3)、新戊基(-CH 2C(CH 3) 3)、己基(-CH 2(CH 2) 4CH 3)、庚基(-CH 2(CH 2) 5CH 3)、辛基(-CH 2(CH 2) 6CH 3)、壬基(-CH 2(CH 2) 7CH 3)、癸基(-CH 2(CH 2) 8CH 3)、十一烷基(-CH 2(CH 2) 9CH 3)及十二烷基(-CH 2(CH 2) 10CH 3)。
「野生型」(wt)係指生物體之天然遺傳形式之術語。野生型不同於突變體形式(具有基因突變之生物體)。
如本文所用，「聚合物」係指一系列連接在一起之單體基團。本文所述之POEGMA聚合物係由如下所示之m-PEGMA (聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)單體製備： ，其中z為2至約10之整數。
如本文所用，「POEGMA」係指如下所示之聚(寡乙二醇甲基丙烯酸酯)： ， 其中y為約50至約500之整數，且z為2至約10之整數。
「連接體」係指將兩個基團連接在一起之化學部分( 例如，PAL及POEGMA中的離胺酸殘基之側鏈之氮)。連接體可為可裂解的或不可裂解的。可裂解連接體可為可水解的、可酶促裂解的、pH敏感的、光不穩定的或二硫化物連接體、氟化酯、苯基酯、胺基甲酸酯、碳酸酯等。
「可水解連接體」係指在生理條件下經歷水解之化學鍵聯或鍵，諸如共價鍵。鍵水解之趨勢可不僅視連接鍵在其間斷開之兩個中心原子的鍵聯之一般類型而定，而且視連接至此等中心原子之取代基而定。水解敏感鍵聯之非限制性實例包括羧酸之酯、磷酸酯、縮醛、縮酮、醯氧基烷基醚、亞胺、原酸酯及一些醯胺鍵聯。
「酶可裂解連接體」係指經受一或多種酶降解之鍵聯。一些水解敏感鍵聯亦可經酶降解。舉例而言，酯酶可作用於羧酸酯或磷酸酯，且蛋白酶可作用於肽鍵及一些醯胺鍵聯。
「pH敏感性連接體」係指在一個pH下穩定且在另一pH下經受降解之鍵聯。舉例而言，pH敏感性連接體在中性或鹼性條件下可為穩定的，但在弱酸性條件下不穩定。
「光不穩定連接體」係指在暴露於光時裂解之鍵聯，諸如共價鍵。光不穩定連接體包括芳香族部分以吸收入射光，然後觸發鍵之重排以裂解由光不穩定連接體連接之兩個基團。
術語「多肽」及「蛋白質」係指胺基酸殘基之聚合物且不限於產物之最小長度。因此，肽、寡肽、二聚體、多聚體及諸如此類包括在定義內。該定義涵蓋全長蛋白質及其片段兩者。該等術語亦包括多肽之表現後修飾，例如糖基化、乙醯化、磷酸化及諸如此類。此外，如本文所用之「多肽」係指蛋白質，其包括對天然序列之修飾，諸如缺失、添加及取代(性質上通常為保守的)，只要蛋白質保持所需活性即可。此類多肽在本文中可稱為「突變體」。此等修飾可為有意的，如經由定點誘變，或可為偶然的，諸如經由產生蛋白質的宿主產生之突變或由於PCR擴增引起之錯誤。
本文使用習用符號來描繪多肽及蛋白質(包括酶)序列：多肽序列之左端為胺基末端；多肽序列之右端為羧基末端。
如本文所用，「原核PAL」或「PAL」係指(1)來自原核生物體之野生型PAL，包括但不限於來自以下之PAL：海藻鏈黴菌( Streptomyces maritimus)、點狀念珠藻( Nostoc punctiforme)、多變魚腥藻、構巢囊藻(Anacystis nidulans) (Lofflehardt, Z. Naturforsch. 31(11-12):693-9 (1976)、發光光桿菌( Photorabdus luminescens) TT01 (Williams等人, Microbiology 151 :2543-2550 (2005)及輪枝鏈黴菌( Streptomyces verticillatus) (Bezanson等人, Can. J. Microbiol. 16(3): 147-51 (1970)；(2)此類野生型PAL酶之片段、突變體、變異體或類似物，其保留對苯丙胺酸之相似( 例如，至少50%)催化活性，且可例如展現增加的催化活性、更大的生物化學穩定性、增加的半衰期及/或降低的免疫原性，及(3)此類野生型PAL酶或其片段、突變體、變異體或類似物之化學修飾形式，其與提供其他有利效應(諸如例如但不限於增加的半衰期及/或降低的免疫原性)之其他化學部分連接。舉例而言，出於治療目的，對製備或使用原核PAL及其片段、突變體、變異體、類似物或化學修飾形式以及此類酶之組合物之方法的任何提及均意欲指製備、使用或調配所有此類野生型原核PAL或其片段、突變體、變異體、類似物或化學修飾之方法。在本文所揭示之任何實施例中，PAL可為任何原核苯丙胺酸解氨酶，例如國際專利公開案第WO 2008/153776 A1號、第WO 2011/097335 A2號及第WO 2022/45924 A1號中揭示之任何PAL，其各自以全文引用方式併入本文。在一個實施例中，PAL為來自多變魚腥藻之原核PAL ( 例如，具有SEQ ID NO:1之次單元胺基酸序列)或其生物活性片段、突變體、變異體或類似物：MKTLSQAQSKTSSQQFSFTGNSSANVIIGNQKLTINDVARVARNGTLVSLTNNTDILQGIQASCDYINNAVESGEPIYGVTSGFGGMANVAISREQASELQTNLVWFLKTGAGNKLPLADVRAAMLLRANSHMRGASGIRLELIKRMEIFLNAGVTPYVYEFGSIGASGDLVPLSYITGSLIGLDPSFKVDFNGKEMDAPTALRQLNLSPLTLLPKEGLAMMNGTSVMTGIAANCVYDTQILTAIAMGVHALDIQALNGTNQSFHPFIHNSKPHPGQLWAADQMISLLANSQLVRDELDGKHDYRDHELIQDRYSLRCLPQYLGPIVDGISQIAKQIEIEINSVTDNPLIDVDNQASYHGGNFLGQYVGMGMDHLRYYIGLLAKHLDVQIALLASPEFSNGLPPSLLGNRERKVNMGLKGLQICGNSIMPLLTFYGNSIADRFPTHAEQFNQNINSQGYTSATLARRSVDIFQNYVAIALMFGVQAVDLRTYKKTGHYDARACLSPATERLYSAVRHVVGQKPTSDRPYIWNDNEQGLDEHIARISADIAAGGVIVQAVQDILPCLH (SEQ ID NO: 1)。
在某些實施例中，POEGMA-PAL結合物包含與野生型原核PAL相比展現苯丙胺酸轉化活性及/或降低之免疫原性的PAL變異體。在某些實施例中，POEGMA-PAL結合物包含與野生型原核PAL相比具有更大生化穩定性及/或生化半衰期之PAL變異體。在某些實施例中，POEGMA-PAL結合物包含多變魚腥藻PAL (AvPAL)變異體。
PAL (及其變異體，諸如AvPAL)為分子量為62 kDa/次單元之同型四聚體蛋白。在某些實施例中，POEGMA-PAL結合物包含AvPAL變異體，其中各次單元上之一或多個胺基酸殘基已經另一胺基酸殘基取代。在一些實施例中，AvPAL變異體之一或多個半胱胺酸殘基經絲胺酸殘基取代。在一些實施例中，AvPAL變異體中經一或多個絲胺酸殘基取代之一或多個半胱胺酸殘基選自由位置503及565處之半胱胺酸殘基組成之群。在某些實施例中，各AvPAL次單元之胺基酸序列為SEQ ID NO: 2，其中位置503處之半胱胺酸殘基已經絲胺酸殘基取代：MKTLSQAQSKTSSQQFSFTGNSSANVIIGNQKLTINDVARVARNGTLVSLTNNTDILQGIQASCDYINNAVESGEPIYGVTSGFGGMANVAISREQASELQTNLVWFLKTGAGNKLPLADVRAAMLLRANSHMRGASGIRLELIKRMEIFLNAGVTPYVYEFGSIGASGDLVPLSYITGSLIGLDPSFKVDFNGKEMDAPTALRQLNLSPLTLLPKEGLAMMNGTSVMTGIAANCVYDTQILTAIAMGVHALDIQALNGTNQSFHPFIHNSKPHPGQLWAADQMISLLANSQLVRDELDGKHDYRDHELIQDRYSLRCLPQYLGPIVDGISQIAKQIEIEINSVTDNPLIDVDNQASYHGGNFLGQYVGMGMDHLRYYIGLLAKHLDVQIALLASPEFSNGLPPSLLGNRERKVNMGLKGLQICGNSIMPLLTFYGNSIADRFPTHAEQFNQNINSQGYTSATLARRSVDIFQNYVAIALMFGVQAVDLRTYKKTGHYDARA S LSPATERLYSAVRHVVGQKPTSDRPYIWNDNEQGLDEHIARISADIAAGGVIVQAVQDILPCLH (SEQ ID NO: 2)，其中位置503處之半胱胺酸殘基為粗體且加下劃線。
在某些實施例中，各AvPAL次單元之胺基酸序列為SEQ ID NO:3，其中位置565處之半胱胺酸殘基已經絲胺酸殘基取代：MKTLSQAQSKTSSQQFSFTGNSSANVIIGNQKLTINDVARVARNGTLVSLTNNTDILQGIQASCDYINNAVESGEPIYGVTSGFGGMANVAISREQASELQTNLVWFLKTGAGNKLPLADVRAAMLLRANSHMRGASGIRLELIKRMEIFLNAGVTPYVYEFGSIGASGDLVPLSYITGSLIGLDPSFKVDFNGKEMDAPTALRQLNLSPLTLLPKEGLAMMNGTSVMTGIAANCVYDTQILTAIAMGVHALDIQALNGTNQSFHPFIHNSKPHPGQLWAADQMISLLANSQLVRDELDGKHDYRDHELIQDRYSLRCLPQYLGPIVDGISQIAKQIEIEINSVTDNPLIDVDNQASYHGGNFLGQYVGMGMDHLRYYIGLLAKHLDVQIALLASPEFSNGLPPSLLGNRERKVNMGLKGLQICGNSIMPLLTFYGNSIADRFPTHAEQFNQNINSQGYTSATLARRSVDIFQNYVAIALMFGVQAVDLRTYKKTGHYDARACLSPATERLYSAVRHVVGQKPTSDRPYIWNDNEQGLDEHIARISADIAAGGVIVQAVQDILP S LH (SEQ ID NO: 3)，其中位置565處之半胱胺酸殘基為粗體且加下劃線。
在某個實施例中，各AvPAL次單元之胺基酸序列為SEQ ID NO:4，其中位置503及565處之半胱胺酸殘基已經絲胺酸殘基取代：MKTLSQAQSKTSSQQFSFTGNSSANVIIGNQKLTINDVARVARNGTLVSLTNNTDILQGIQASCDYINNAVESGEPIYGVTSGFGGMANVAISREQASELQTNLVWFLKTGAGNKLPLADVRAAMLLRANSHMRGASGIRLELIKRMEIFLNAGVTPYVYEFGSIGASGDLVPLSYITGSLIGLDPSFKVDFNGKEMDAPTALRQLNLSPLTLLPKEGLAMMNGTSVMTGIAANCVYDTQILTAIAMGVHALDIQALNGTNQSFHPFIHNSKPHPGQLWAADQMISLLANSQLVRDELDGKHDYRDHELIQDRYSLRCLPQYLGPIVDGISQIAKQIEIEINSVTDNPLIDVDNQASYHGGNFLGQYVGMGMDHLRYYIGLLAKHLDVQIALLASPEFSNGLPPSLLGNRERKVNMGLKGLQICGNSIMPLLTFYGNSIADRFPTHAEQFNQNINSQGYTSATLARRSVDIFQNYVAIALMFGVQAVDLRTYKKTGHYDARA S LSPATERLYSAVRHVVGQKPTSDRPYIWNDNEQGLDEHIARISADIAAGGVIVQAVQDILP S LH (SEQ ID NO: 4)，其中位置503及565處之半胱胺酸殘基為粗體且加下劃線。
PAL變異體亦可包括融合蛋白，其中PAL酶已融合至另一異源多肽，諸如保留補救抗原決定基之免疫球蛋白或其片段之天然或經修飾的恆定區，在此項技術中已知會增加半衰期。
如本文所用，「變異體」、「類似物」或「衍生物」為與給定化合物( 例如，肽)具有多於約70%序列相似性但小於100%序列相似性之化合物， 例如PAL酶。此類變異體、類似物或衍生物可包含非天然胺基酸殘基，包括(舉例而言)但不限於高精胺酸、鳥胺酸、青黴胺及正纈胺酸，以及天然胺基酸殘基。此類變異體、類似物或衍生物亦可包含一個或複數個D-胺基酸殘基且可在二或更多個胺基酸殘基之間含有非肽互連。
「接觸」係指使至少兩種不同物質接觸以使其可反應之過程。然而，應瞭解，所得反應產物可直接自所添加試劑之間的反應產生，或自可在反應混合物中產生之中間物產生。
如本文所用，「治療(Treatment)」或「治療(treating)」係指預防性治療或治療性治療或診斷性治療。「預防性」治療係為了降低發展病理之風險之目的，向不表現出疾病或病理徵象或僅表現出早期徵象的個體投與之治療。如本文所揭示之包含POEGMA-PAL結合物之醫藥組合物可作為預防性治療來給予，以降低發展病理( 例如，PKU)之可能性，或最小化病理(若發生)之嚴重程度。「治療性」治療係為了減少或消除病理徵象或症狀之目的，向表現出彼等徵象或症狀的個體投與之治療。該等徵象或症狀可為生物化學、細胞、組織學、功能、主觀或客觀的。POEGMA-PAL結合物組合物可作為治療性治療給予或用於診斷。
如本文所用，術語「預防(prevent)」、「預防(preventing)」及「預防(prevention)」係指藉由投與本文所提供之療法或療法之組合，完全或部分抑制疾病及/或與其相關的症狀( 例如，與個體中之苯丙胺酸水準升高相關的疾病或症狀，諸如PKU)之發展、復發、發作或傳播。
「醫藥組合物」係指適於個體動物(包括人類及哺乳動物)之醫藥用途之組合物。
「醫藥學上可接受」及「藥理學上可接受」係指在生物學上或其他方面並非不期望之材料， 亦即，該材料可投與個體而不會引起任何不期望之生物效應，亦不會以有害方式與含有其之組合物的任何組分相互作用。
如本文所用，術語「個體」及「患者」涵蓋哺乳動物及非哺乳動物。哺乳動物之實例包括但不限於哺乳動物類別之任何成員：人類、非人類靈長類動物(諸如黑猩猩)及其他猿及猴物種；農場動物，諸如牛、馬、綿羊、山羊、豬；家畜，諸如兔、狗及貓；實驗室動物，包括囓齒動物，諸如大鼠、小鼠及豚鼠及諸如此類。非哺乳動物之實例包括但不限於鳥類、魚及諸如此類。該術語不表示特定年齡或性別。如本文所用，術語「個體」及「患者」可互換使用。如本文所用，在某些實施例中，個體為哺乳動物，諸如非靈長類動物( 例如，牛、豬、馬、貓、狗、大鼠等)或靈長類動物( 例如，猴或人類)，在某些實施例中為人類。在一些實施例中，個體為哺乳動物，且在某些實施例中為人類。在一些實施例中，個體患有與苯丙胺酸水準升高相關之疾病或症狀，諸如高苯丙胺酸血症(HPA)或PKU ( 例如，經典PKU、中度PKU、輕度PKU或其任何亞群體)。在一些實施例中，個體為針對升高之苯丙胺酸水準接受酶取代療法或(「EST」， 例如rAvPAL或rAvPAL-PEG)之個體( 例如，患有PKU之個體)。
在一些實施例中，個體具有約300 μmol/L至約350 μmol/L之血液苯丙胺酸水準。在一些實施例中，個體具有約350 μmol/L至約400 μmol/L之血液苯丙胺酸水準。在一些實施例中，個體具有約400 μmol/L至約450 μmol/L之血液苯丙胺酸水準。在一些實施例中，個體具有約450 μmol/L至約500 μmol/L之血液苯丙胺酸水準。在一些實施例中，個體具有約500 μmol/L至約550 μmol/L之血液苯丙胺酸水準。在一些實施例中，個體具有約550 μmol/L至約600 μmol/L之血液苯丙胺酸水準。在一些實施例中，個體具有大於約350 μmol/L之血液苯丙胺酸水準。在一些實施例中，個體具有大於約360 μmol/L之血液苯丙胺酸水準。在一些實施例中，個體具有大於約370 μmol/L之血液苯丙胺酸水準。在一些實施例中，個體具有大於約380 μmol/L之血液苯丙胺酸水準。在一些實施例中，個體具有大於390 μmol/L之血液苯丙胺酸水準。在一些實施例中，個體具有大於約400 μmol/L之血液苯丙胺酸水準。在一些實施例中，個體具有大於約600 μmol/L之血液苯丙胺酸水準。如本文所用，術語「治療有效」係指有效地對投與結合物之個體之健康產生預期有益效應的POEGMA-PAL結合物之劑量或量。在一些實施例中，治療有效量之POEGMA-PAL結合物降低個體之血液、血漿或血清(在某些實施例中為血漿)中之L-苯丙胺酸(Phe)水準，由此為個體提供益處。在一些實施例中，當與未經治療之個體進行比較時，治療有效量之POEGMA-PAL結合物使經治療之個體( 例如，投與POEGMA-PAL結合物之個體)的血漿苯丙胺酸水準降低大於約10%、30%、50%、70%、90%、95%、98%或99%。在一些實施例中，與未經治療之個體相比，治療有效量的POEGMA-PAL結合物在經治療之個體中維持靜止條件下之血漿苯丙胺酸水準。在一些實施例中，與未經治療之個體相比，治療有效量之POEGMA-PAL結合物使存活時間或無病時間延長至少約10%、20%、50%、100%、2倍、5倍或10倍。視為「治療有效」之POEGMA-PAL結合物之量將因個別個體而異，且將視若干因素而定，包括個體之總體身體狀況、飲食及疾病狀態。熟習此項技術者使用可公開獲得之材料及程序可容易地確定治療有效量的包含如本文所揭示之POEGMA-PAL結合物之醫藥組合物。
5.1 POEGMA-PAL 結合物本文所揭示之POEGMA-PAL結合物為培伐利酶之第二代產物且解決與先前技術部分中所述之PEG相關之挑戰。本文所揭示之POEGMA-PAL結合物使用聚-寡乙二醇甲基丙烯酸酯(POEGMA)，其為約45 KDa之瓶刷聚合物，由酯化至合成甲基丙烯酸酯主鏈以最小化抗PEG抗體對環氧乙烷殘基之反應性的短三乙二醇甲酯之約200個重複組成，如 圖1中所描繪。本文所揭示之POEGMA-PAL結合物使用負責降低血液苯丙胺酸水準之蛋白質/酶組分rAvPAL (如本文所揭示之SEQ ID NO:4)。
本文所揭示之POEGMA-PAL結合物為經修飾之PAL酶，其將苯丙胺酸轉化為氨及反式-肉桂酸。不希望受理論束縛，據信POEGMA-PAL結合物充當患有PAH缺乏症之個體( 例如，PKU個體及HPA個體)之PAH酶活性缺乏的替代物，且降低血液苯丙胺酸濃度。
如本文所揭示，POEGMA-PAL結合物出乎意料地展現改良之免疫原性及藥物動力學。不希望受理論束縛，據信POEGMA-PAL結合物結構使溶劑可及抗原重複之可及性及數量最小化，以改良免疫原性、生物利用度(及藥物動力學概況)及目前市售用於治療PKU及HPA之產品( 例如，培伐利酶)遇到的劑量調配物限制。此進而提供具有改良之給藥方案、更短之起效時間、改良之安全性概況及減少之注射負擔的酶替代療法。
在一個態樣中，本揭示案提供一種POEGMA-PAL結合物，其包含： a. 包含聚(寡乙二醇甲基丙烯酸酯) (POEGMA)之聚合物；及 b. 苯丙胺酸解氨酶(PAL)， 其中該聚合物直接或間接結合至該PAL。
在一個實施例中，POEGMA-PAL結合物由式(I)表示： (I)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶，其為包含四個次單元之同四聚體蛋白； R 1為連接體； R 2為端帽； x為1至約32之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
在一個實施例中，x為約1至約28。在一個實施例中，x為約1至約24。在一個實施例中，x為約16至約32。在一個實施例中，x為約16至約28。在一個實施例中，x為約16至約24。
在一個實施例中，POEGMA-PAL結合物由式(I)表示： (I)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶，其為包含四個次單元之同四聚體蛋白； R 1為連接體； R 2為端帽； x為1至約21之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
如熟習此項技術者應理解，式(I)亦可描繪如下： ， 其中z'為3至約11之整數。
式(I)描繪經由NH-R 1結合至PAL之POEGMA。如熟習此項技術者將認識到，式(I)中描繪之「NH」之「N」為PAL之離胺酸殘基的側鏈之氮，式(I)之含POEGMA部分與其結合。
「式(I)之含聚合物部分」包括R 1及其所結合之POEGMA ( 亦即，R 1及R 1之右側全部)，且在本文中將稱為「連接體-POEGMA」，如下式(V)中所示： (V)， 其中： 為與直接結合至式(I)中之PAL之氮(N)的連接； R 1為連接體； R 2為端帽； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
式(I)及式(V)中連接體R 1右側且不包括該連接體之部分在本文中將稱為POEGMA，且如下式(VI)中所示表示： (VI)， 其中： #為與式(I)及(V)中之R 1之連接； R 2為端帽； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
在式(I)之一個實施例中，PAL為來自原核生物體之野生型PAL，包括但不限於來自以下之PAL：海藻鏈黴菌、點狀念珠藻、多變魚腥藻、構巢囊藻、發光光桿菌TT01及輪枝鏈黴菌。在一個實施例中，PAL為野生型PAL酶之片段、突變體、變異體或類似物，其保留類似( 例如，至少50%)或增加之苯丙胺酸催化活性。在一個實施例中，PAL為來自多變魚腥藻(SEQ ID NO:1)之原核PAL或其生物活性片段、突變體、變異體或類似物。在某些實施例中，PAL為多變魚腥藻PAL (AvPAL)變異體。在一個實施例中，PAL為AvPAL變異體，其中一或多個胺基酸殘基已經另一胺基酸殘基取代。在一些實施例中，AvPAL變異體之一或多個半胱胺酸殘基經絲胺酸殘基取代。在一些實施例中，AvPAL變異體中經一或多個絲胺酸殘基取代之一或多個半胱胺酸殘基選自由位置503及565處之半胱胺酸殘基組成之群。在一個實施例中，PAL之各次單元具有根據SEQ ID NO:2之胺基酸序列。在一個實施例中，PAL之各次單元具有根據SEQ ID NO:3之胺基酸序列。在一個實施例中，PAL之各次單元具有根據SEQ ID NO:4之胺基酸序列。
式(I)及(V)中之連接體R 1之化學結構不受特別限制且可為將POEGMA共價結合至PAL之任何結構。在一個實施例中，R 1為C 1-12烷基、C(O)-C 1-12烷基-NH、C(O)-(O-CH 2-CH 2) n，其中n為2或3，或肽可裂解間隔子，諸如Gly-Gly-Phe-Gly (SEQ ID NO:5)。在一個實施例中，R 1為C(O)-C 1-12烷基-NH。在一個實施例中，R 1為C(O)-(CH 2) 5-NH。
在一個實施例中，R 1為CH 2、C(O)-C 1-12烷基-NH、C(O)-(O-CH 2-CH 2) n，其中n為2或3，或肽可裂解間隔子，諸如Gly-Gly-Phe-Gly (SEQ ID NO:5)。在一個實施例中，R 1為C(O)-C 1-12烷基-NH。在一個實施例中，R 1為C(O)-(CH 2) 5-NH。
式(I)、(V)及(VI)中之端帽R 2之特性同樣不受特別限制，且熟習此項技術者將認識到可適用於本文所揭示的結合物之任何數量之端帽。在一個實施例中，R 2為CN取代之烷基。在一個實施例中，R 2為異丁腈、4-氰基戊酸、4-甲氧基-2,4-二甲基戊腈或-OH (羥基)。在一個實施例中，R 2為異丁腈。
式(I)中之變數x係指結合至單一PAL酶的式(V)之連接體-POEGMA的數量。
在一個實施例中，x為約1至約32、約2至約32、約3至約32、約4至約32、約5至約32、約6至約32、約7至約32、約8至約32、約9至約32、約10至約32、約11至約32、約12至約32、約13至約32、約14至約32、約15至約32、約16至約32、約17至約32、約18至約32、約19至約32、約20至約32、約21至約32、約22至約32、約23至約32、約24至約32、約25至約32、約26至約32、約27至約32、約28至約32、約29至約32或約31至約32之整數。
在一個實施例中，x為約1至約28、約2至約28、約3至約28、約4至約28、約5至約28、約6至約28、約7至約28、約8至約28、約9至約28、約10至約28、約11至約28、約12至約28、約13至約28、約14至約28、約15至約28、約16至約28、約17至約28、約18至約28、約19至約28、約20至約28、約21至約28、約22至約28、約23至約28、約24至約28、約25至約28、約26至約28或約27至約28之整數。
在一個實施例中，x為約1至約24、約2至約24、約3至約24、約4至約24、約5至約24、約6至約24、約7至約24、約8至約24、約9至約24、約10至約24、約11至約24、約12至約24、約13至約24、約14至約24、約15至約24、約16至約24、約17至約24、約18至約24、約19至約24、約20至約24、約21至約24、約22至約24或約23至約24之整數。
在一個實施例中，x為約5至約21、約8至約21、約10至約21、約16至約21或約19至約21之整數。在一個實施例中，x為19。在一個實施例中，x為20。在一個實施例中，x為21。
式(I)、(V)及(VI)中之變數y係指POEGMA中存在之聚(乙烯)甲基醚甲基丙烯酸酯單體之數量( 亦即聚合度)。y通常視聚合度而定且可由熟習此項技術者調整。在一個實施例中，y為約50至約500之整數。在一個實施例中，y為約150至約300。在一個實施例中，y為約175至約200。
在一個實施例中，y為約175至約250之整數。在某些實施例中，y為約200。
式(I)、(V)及(VI)中之變數z係指POEGMA之側鏈中存在的乙二醇部分之數量。在一個實施例中，z為2至約10之整數。在一個實施例中，z為2至約8。在一個實施例中，z為2至約5。在一個實施例中，z為2。
在一個實施例中，z為2至約9之整數。在一個實施例中，z為2至約7之整數。在一個實施例中，z為2至約6之整數。在一個實施例中，z為2至約4之整數。在一個實施例中，z為3。在某些實施例中，z為2。
在式(I)、(V)及(VI)之一個實施例中，x為約8至32，y為150至300，且z為2至約10，或x為約8至32，y為150至300，且z為2至約8，或x為約8至32，y為150至300，且z為2至約5，或x為約8至32，y為150至300，且z為2。
在式(I)、(V)及(VI)之一個實施例中，x為約8至28，y為150至300，且z為2至約10，或x為約8至28，y為150至300，且z為2至約8，或x為約8至28，y為150至300，且z為2至約5，或x為約8至28，y為150至300，且z為2。
在式(I)、(V)及(VI)之一個實施例中，x為約8至24，y為150至300，且z為2至約10，或x為約8至24，y為150至300，且z為2至約8，或x為約8至24，y為150至300，且z為2至約5，或x為約8至24，y為150至300，且z為2。
在式(I)、(V)及(VI)之一個實施例中，x為約8至21，y為150至300，且z為2至約10，或x為約8至21，y為150至300，且z為2至約8，或x為約8至21，y為150至300，且z為2至約5，或x為約8至21，y為150至300，且z為2。
在式(I)、(V)及(VI)之一個實施例中，x為約10至21，y為150至300，且z為2至約10，或x為約10至21，y為150至300，且z為2至約8，或x為約10至21，y為150至300，且z為2至約5，或x為約10至21，y為150至300，且z為2。
在式(I)、(V)及(VI)之一個實施例中，x為約16至21，y為150至300，且z為2至約10，或x為約16至21，y為150至300，且z為2至約8，或x為約16至21，y為150至300，且z為2至約5，或x為約16至21，y為150至300，且z為2。
在式(I)、(V)及(VI)之一個實施例中，x為約16至24，y為150至300，且z為2至約10，或x為約16至21，y為150至300，且z為2至約8，或x為約16至21，y為150至300，且z為2至約5，或x為約16至21，y為150至300，且z為2。
在式(I)、(V)及(VI)之一個實施例中，x為約16至28，y為150至300，且z為2至約10，或x為約16至21，y為150至300，且z為2至約8，或x為約16至21，y為150至300，且z為2至約5，或x為約16至21，y為150至300，且z為2。
在式(I)、(V)及(VI)之一個實施例中，x為約19至21，y為150至300，且z為2至約10，或x為約19至21，y為150至300，且z為2至約8，或x為約19至21，y為150至300，且z為2至約5，或x為約19至21，y為150至300，且z為2。
在式(I)、(V)及(VI)之一個實施例中，x為約8至21，y為175至200，且z為2至約10，或x為約8至21，y為175至200，且z為2至約10，或x為約8至21，y為175至200，且z為2至約10，或x為約8至21，y為175至200，且z為2。
在式(I)、(V)及(VI)之一個實施例中，x為約10至21，y為175至200，且z為2至約10，或x為約10至21，y為175至200，且z為2至約10，或x為約10至21，y為175至200，且z為2至約10，或x為約19至21，y為175至200，且z為2。
在式(I)、(V)及(VI)之一個實施例中，x為約16至21，y為175至200，且z為2至約10，或x為約16至21，y為175至200，且z為2至約10，或x為約16至21，y為175至200，且z為2至約10，或x為約16至21，y為175至200，且z為2。
在式(I)、(V)及(VI)之一個實施例中，x為約19至21，y為175至200，且z為2至約10，或x為約19至21，y為175至200，且z為2至約10，或x為約19至21，y為175至200，且z為2至約10，或x為約19至21，y為175至200，且z為2。
在式(I)、(V)及(VI)之一個實施例中，x為19，y為50至500，且z為2至約10；或x為20，y為50至500，且z為2至約10；或x為21，y為50至500，且z為2至約10。在式(I)、(V)及(VI)之一個實施例中，x為19，y為150至300，且z為2至約10；或x為20，y為150至300，且z為2至約10；或x為21，y為150至300，且z為2至約10。在式(I)、(V)及(VI)之一個實施例中，x為19，y為175至200，且z為2至約10；或x為20，y為175至200，且z為2至約10；或x為21，y為175至200，且z為2至約10。
在式(I)、(V)及(VI)之一個實施例中，x為19，y為50至500，且z為2至約8；或x為20，y為50至500，且z為2至約10；或x為21，y為50至500，且z為2至約8。在式(I)、(V)及(VI)之一個實施例中，x為19，y為150至300，且z為2至約8；或x為20，y為150至300，且z為2至約10；或x為21，y為150至300，且z為2至約8。在式(I)、(V)及(VI)之一個實施例中，x為19，y為175至200，且z為2至約8；或x為20，y為175至200，且z為2至約10；或x為21，y為175至200，且z為2至約8。
在式(I)、(V)及(VI)之一個實施例中，x為19，y為50至500，且z為2至約5；或x為20，y為50至500，且z為2至約10；或x為21，y為50至500，且z為2至約5。在式(I)、(V)及(VI)之一個實施例中，x為19，y為150至300，且z為2至約5；或x為20，y為150至300，且z為2至約10；或x為21，y為150至300，且z為2至約5。在式(I)、(V)及(VI)之一個實施例中，x為19，y為175至200，且z為2至約5；或x為20，y為175至200，且z為2至約10；或x為21，y為175至200，且z為2至約5。
在式(I)、(V)及(VI)之一個實施例中，x為19，y為50至500，且z為2；或x為20，y為50至500，且z為2；或x為21，y為50至500，且z為2。在式(I)、(V)及(VI)之一個實施例中，x為19，y為150至300，且z為2；或x為20，y為150至300，且z為2；或x為21，y為150至300，且z為2。在式(I)、(V)及(VI)之一個實施例中，x為19，y為175至200，且z為2；或x為20，y為175至200，且z為2；或x為21，y為175至200，且z為2。
在式(I)、(V)及(VI)之一個實施例中，x為約20，y為約200，且z為2。
在一個實施例中，R 1為C(O)-C 1-12烷基-NH。在一個實施例中，式(I)之結合物由式(I')表示： (I’)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶，其為包含四個次單元之同四聚體蛋白； R 2為端帽； m為約3至約12之整數； x為1至約32之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
在一個實施例中，x為約1至約28。在一個實施例中，x為約1至約24。在一個實施例中，x為約16至約32。在一個實施例中，x為約16至約28。在一個實施例中，x為約16至約24。
在一個實施例中，R 1為C(O)-C 1-12烷基-NH。在一個實施例中，式(I)之結合物由式(I')表示： (I’)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶，其為包含四個次單元之同四聚體蛋白； R 2為端帽； m為約3至約12之整數； x為1至約21之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
在一個實施例中，R 1為C(O)-C 1-6烷基-NH。在一個實施例中，式(I)之POEGMA-PAL結合物由式(Ia)表示： (Ia)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶，其為包含四個次單元之同四聚體蛋白； R 2為端帽； x為1至約32之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
在一個實施例中，x為約1至約28。在一個實施例中，x為約1至約24。在一個實施例中，x為約16至約32。在一個實施例中，x為約16至約28。在一個實施例中，x為約16至約24。
在一個實施例中，R 1為C(O)-C 1-6烷基-NH。在一個實施例中，式(I)之POEGMA-PAL結合物由式(Ia)表示： (Ia)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶，其為包含四個次單元之同四聚體蛋白； R 2為端帽； x為1至約21之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
在一個實施例中，式(I)之POEGMA-PAL結合物由式(Ia-1)表示： (Ia-1)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶，其為包含四個次單元之同四聚體蛋白； x為1至約32之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
在一個實施例中，x為約1至約28。在一個實施例中，x為約1至約24。在一個實施例中，x為約16至約32。在一個實施例中，x為約16至約28。在一個實施例中，x為約16至約24。
在一個實施例中，式(I)之POEGMA-PAL結合物由式(Ia-1)表示： (Ia-1)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶，其為包含四個次單元之同四聚體蛋白； x為1至約21之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
在一個實施例中，式(I)之POEGMA-PAL結合物由式(Ia-1-1)表示： (Ia-1-1)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶，其為包含四個次單元之同四聚體蛋白； x為1至約32之整數；且 y為約50至約500之整數。
在一個實施例中，x為約1至約28。在一個實施例中，x為約1至約24。在一個實施例中，x為約16至約32。在一個實施例中，x為約16至約28。在一個實施例中，x為約16至約24。
在一個實施例中，式(I)之POEGMA-PAL結合物由式(Ia-1-1)表示： (Ia-1-1)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶，其為包含四個次單元之同四聚體蛋白； x為1至約21之整數；且 y為約50至約500之整數。
在式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)、(Ia-1-1)及/或 表A中描述的(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者的一個實施例中，PAL為來自原核生物體之野生型PAL，包括但不限於來自以下之PAL：海藻鏈黴菌、點狀念珠藻、多變魚腥藻、構巢囊藻、發光光桿菌TT01及輪枝鏈黴菌。在一個實施例中，PAL為野生型PAL酶之片段、突變體、變異體或類似物，其保留類似( 例如，至少50%)或增加之苯丙胺酸催化活性。在一個實施例中，PAL為來自多變魚腥藻(SEQ ID NO:1)之原核PAL或其生物活性片段、突變體、變異體或類似物。在某些實施例中，PAL為多變魚腥藻PAL (AvPAL)變異體。在一個實施例中，PAL為AvPAL變異體，其中一或多個胺基酸殘基已經另一胺基酸殘基取代。在一些實施例中，AvPAL變異體之一或多個半胱胺酸殘基經絲胺酸殘基取代。在一些實施例中，AvPAL變異體中經一或多個絲胺酸殘基取代之一或多個半胱胺酸殘基選自由位置503及565處之半胱胺酸殘基組成之群。在一個實施例中，PAL之各次單元具有根據SEQ ID NO:2之胺基酸序列。在一個實施例中，PAL具有根據SEQ ID NO:3之胺基酸序列。在一個實施例中，PAL之各次單元具有根據SEQ ID NO:4之胺基酸序列。
在式(I')及(Ia)之一個實施例中，R 2為異丁腈、4-氰基戊酸、4-甲氧基-2,4-二甲基戊腈或羥基(-OH)。在一個實施例中，R 2為異丁腈。
x、y及z可如上文針對式(I)、(V)及(VI)所定義。在式(I')、(Ia)、(Ia-1)及(Ia-1-1)之一個實施例中，x為約5至約32、約8至約32、約10至約32、約16至約32、或約19至約32、約24至約32或約28至約32之整數。在式(I')、(Ia)、(Ia-1)及(Ia-1-1)之一個實施例中，x為約5至約28、約8至約28、約10至約28、約16至約28、約19至約28或約24至約28之整數。在式(I')、(Ia)、(Ia-1)及(Ia-1-1)之一個實施例中，x為約5至約24、約8至約24、約10至約24、約16至約24或約19至約24之整數。在一個實施例中，y為約50至約500，諸如約150至約300或約175至約200之整數。在一個實施例中，z為2至約10，諸如2至約8或2至約5之整數。在一個實施例中，z為2。本揭示案涵蓋x、y及z之任何組合。
x、y及z可如上文針對式(I)、(V)及(VI)所定義。在式(I')、(Ia)、(Ia-1)及(Ia-1-1)之一個實施例中，x為約5至約21、約8至約21、約10至約21、約16至約21或約19至約21之整數。在一個實施例中，x為19。在一個實施例中，x為20。在一個實施例中，x為21。在一個實施例中，y為約50至約500，諸如約150至約300或約175至約200之整數。在一個實施例中，z為2至約10，諸如2至約8或2至約5之整數。在一個實施例中，z為2。本揭示案涵蓋x、y及z之任何組合。
在式(I')、(Ia)、(Ia-1)及(Ia-1-1)之一個實施例中，PAL之5-10個離胺酸殘基各自結合至連接體-POEGMA。在式(I')、(Ia)、(Ia-1)及(Ia-1-1)之一個實施例中，PAL之至少10個離胺酸殘基各自結合至連接體-POEGMA。在式(I')、(Ia)、(Ia-1)及(Ia-1-1)之一個實施例中，PAL之10-16個離胺酸殘基各自結合至連接體-POEGMA。在式(I')、(Ia)、(Ia-1)及(Ia-1-1)之一個實施例中，PAL之至少16個離胺酸殘基各自結合至連接體-POEGMA。在一個實施例中，PAL之16-21個離胺酸殘基各自結合至連接體-POEGMA。在一個實施例中，PAL之至少19個離胺酸殘基各自結合至連接體-POEGMA。在一個實施例中，PAL之19-21個離胺酸殘基各自結合至連接體-POEGMA。在一個實施例中，PAL之各次單元上的至少5個離胺酸殘基各自結合至連接體-POEGMA。在一個實施例中，PAL之各次單元上的5或6個離胺酸殘基各自結合至連接體-POEGMA。
在一個實施例中，PAL之16-32個離胺酸殘基各自結合至連接體-POEGMA。在一個實施例中，PAL之16-28個離胺酸殘基各自結合至連接體-POEGMA。在一個實施例中，PAL之16-24個離胺酸殘基各自結合至連接體-POEGMA。在一個實施例中，PAL之18-22個離胺酸殘基各自結合至連接體-POEGMA。在一個實施例中，PAL之至少20個離胺酸殘基各自結合至連接體-POEGMA。在一個實施例中，PAL之至少21個離胺酸殘基各自結合至連接體-POEGMA。在一個實施例中，PAL之至少22個離胺酸殘基各自結合至連接體-POEGMA。在一個實施例中，PAL之至少23個離胺酸殘基各自結合至連接體-POEGMA。在一個實施例中，PAL之至少24個離胺酸殘基各自結合至連接體-POEGMA。在一個實施例中，PAL之各次單元上的至少6個離胺酸殘基各自結合至連接體-POEGMA。在一個實施例中，PAL之各次單元上的6或7個離胺酸殘基各自結合至連接體-POEGMA。在一個實施例中，PAL之各次單元上的至少7個離胺酸殘基各自結合至連接體-POEGMA。在一個實施例中，PAL之各次單元上的7或8個離胺酸殘基各自結合至連接體-POEGMA。
在式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)及(Ia-1-1)之一些實施例中，結合至連接體-POEGMA之PAL之各次單元上的離胺酸殘基獨立地( 例如，對於各次單元可不同)包含K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109中之一或多者( 例如1-9者)，但熟習此項技術者將理解，在一些實施例中，PAL之其他離胺酸殘基亦可結合至連接體-POEGMA。在式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)及(Ia-1-1)之一些實施例中，結合至連接體-POEGMA之PAL之各次單元上的離胺酸殘基獨立地( 例如，對於各次單元可不同)包含K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109中之二或更多者( 例如，2-9者)，但熟習此項技術者將理解，在一些實施例中，PAL之其他離胺酸殘基亦可結合至連接體-POEGMA。在式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)及(Ia-1-1)之一些實施例中，結合至連接體-POEGMA之PAL之各次單元上的離胺酸殘基獨立地( 例如，對於各次單元可不同)包含K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109中之三或更多者( 例如，3-9者)，但熟習此項技術者將理解，在一些實施例中，PAL之其他離胺酸殘基亦可結合至連接體-POEGMA。在式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)及(Ia-1-1)之一些實施例中，結合至連接體-POEGMA之PAL之各次單元上的離胺酸殘基獨立地( 例如，對於各次單元可不同)包含K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109中之四或更多者( 例如，4-9者)，但熟習此項技術者將理解，在一些實施例中，PAL之其他離胺酸殘基亦可結合至連接體-POEGMA。
在式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)及(Ia-1-1)之一些實施例中，結合至連接體-POEGMA之PAL之各次單元上的離胺酸殘基獨立地( 例如，對於各次單元可不同)包含K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109中之五或更多者( 例如，5-9者)，但熟習此項技術者將理解，在一些實施例中，PAL之其他離胺酸殘基亦可結合至連接體-POEGMA。在式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)及(Ia-1-1)之一些實施例中，結合至連接體-POEGMA之PAL之各次單元上的離胺酸殘基獨立地( 例如，對於各次單元可不同)包含K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109中之六或更多者( 例如，6-9者)，但熟習此項技術者將理解，在一些實施例中，PAL之其他離胺酸殘基亦可結合至連接體-POEGMA。在式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)及(Ia-1-1)之一些實施例中，結合至連接體-POEGMA之PAL之各次單元上的離胺酸殘基獨立地( 例如，對於各次單元可不同)包含K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109中之七或更多者( 例如，7或8者)，但熟習此項技術者將理解，在一些實施例中，PAL之其他離胺酸殘基亦可結合至連接體-POEGMA。
在一些實施例中，PAL之至少一個次單元( 例如，1-4個次單元)中之K189、K195及K522中的每一者結合至連接體-POEGMA。在一些實施例中，PAL之至少兩個次單元( 例如，2-4個次單元)中之K189、K195及K522中的每一者結合至連接體-POEGMA。在一些實施例中，PAL之至少三個次單元( 例如，3或4個次單元)中之K189、K195及K522中的每一者結合至連接體-POEGMA。在一些實施例中，PAL之各次單元中之K189、K195及K522中的每一者結合至連接體-POEGMA。
在一些實施例中，PAL之至少一個次單元( 例如，1-4個次單元)中之K189、K195、K522、K413及K145中的每一者結合至連接體-POEGMA。在一些實施例中，PAL之至少兩個次單元( 例如，2-4個次單元)中之K189、K195、K522、K413及K145中的每一者結合至連接體-POEGMA。在一些實施例中，PAL之至少三個次單元( 例如，3或4個次單元)中之K189、K195、K522、K413及K145中的每一者結合至連接體-POEGMA。在一些實施例中，PAL之各次單元中之K189、K195、K522、K413及K145中的每一者結合至連接體-POEGMA。
在一個實施例中，式(I)之POEGMA-PAL結合物由如 表A中所示之式(Ia-1-11)-式(Ia-1-46)中之任一者表示：
表A：例示性POEGMA-PAL結合物
Ia-1-11
Ia-1-12
Ia-1-13
Ia-1-14
Ia-1-15
Ia-1-16
Ia-1-17
Ia-1-18
Ia-1-19
Ia-1-20
Ia-1-21
Ia-1-22
Ia-1-23
Ia-1-24
Ia-1-25
Ia-1-26
Ia-1-27
Ia-1-28
Ia-1-29
Ia-1-30
Ia-1-31
Ia-1-32
Ia-1-33
Ia-1-34
Ia-1-35
Ia-1-36
Ia-1-37
Ia-1-38
Ia-1-39
Ia-1-40
Ia-1-41
Ia-1-42
Ia-1-43
Ia-1-44
Ia-1-45
Ia-1-46
5.2 製備POEGMA-PAL結合物之方法如本文所揭示之任何實施例所述之POEGMA-PAL結合物可藉由製備POEGMA聚合物且隨後使POEGMA聚合物與PAL結合來製備。因此，在另一態樣中，本揭示案提供一種製備式(I)之POEGMA-PAL結合物之方法，其中該方法包含： a. 提供式(IV)之預結合聚合物： (IV)， 其中： y為約50至約500之整數； z為2至約10之整數； R 1為連接體； R 2為端帽；且 R 4為結合部分；及 b. 使式(IV)之預結合聚合物與PAL在有效地將式(IV)之預結合聚合物結合至PAL之條件下接觸，由此產生式(I)之POEGMA-PAL結合物： (I)， 其中PAL為原核苯丙胺酸解氨酶，其為包含四個次單元之同四聚體蛋白。
在一個實施例中，PAL為來自原核生物體之野生型PAL，包括但不限於來自以下之PAL：海藻鏈黴菌、點狀念珠藻、多變魚腥藻、構巢囊藻、發光光桿菌TT01及輪枝鏈黴菌。在一個實施例中，PAL為野生型PAL酶之片段、突變體、變異體或類似物，其保留類似( 例如，至少50%)或增加之苯丙胺酸催化活性。在一個實施例中，PAL為來自多變魚腥藻(SEQ ID NO:1)之原核PAL或其生物活性片段、突變體、變異體或類似物。在某些實施例中，PAL為多變魚腥藻PAL (AvPAL)變異體。在一個實施例中，PAL為AvPAL變異體，其中一或多個胺基酸殘基已經另一胺基酸殘基取代。在一些實施例中，AvPAL變異體之一或多個半胱胺酸殘基經絲胺酸殘基取代。在一些實施例中，AvPAL變異體中經一或多個絲胺酸殘基取代之一或多個半胱胺酸殘基選自由位置503及565處之半胱胺酸殘基組成之群。在一個實施例中，PAL之各次單元具有根據SEQ ID NO:2之胺基酸序列。在一個實施例中，PAL具有根據SEQ ID NO:3之胺基酸序列。在一個實施例中，PAL之各次單元具有根據SEQ ID NO:4之胺基酸序列。
式(IV)之預結合聚合物可藉由此項技術中已知之任何方法(諸如鏈增長聚合)來製備。在一個實施例中，使用自由基加成-片段化轉移(RAFT)聚合製備式(IV)之預結合聚合物。
在一個實施例中，式(I)之POEGMA-PAL結合物可藉由包含以下之方法來製備： a. 使聚乙二醇甲基丙烯酸酯與式(II)化合物在有效產生式(III)聚合物之條件下接觸，如 方案I中所示： ， 方案I其中： y為約50至約500之整數； z為2至約10之整數； R 1為連接體； R 3為RAFT鏈轉移劑；且 R 4為結合部分； b. 使式(III)聚合物與端基改質劑接觸，以產生式(IV)之預結合聚合物，如 方案II中所示： ； 方案II其中R 2為端帽；及 c. 使式(IV)之預結合聚合物與PAL在有效地在R 1與PAL之一或多個離胺酸殘基側鏈( 例如，1-21個離胺酸殘基側鏈)之間產生鍵的結合條件下接觸，如 方案III中所示： ， 方案III其中PAL為原核苯丙胺酸解氨酶，且x為1至約21之整數。
在 方案I、 II及 III中，連接體R 1可為CH 2、C(O)-C 1-12烷基-NH、C(O)-(O-CH 2-CH 2) n，其中n為2或3，或Gly-Gly-Phe-Gly (SEQ ID NO:5)。
在一個實施例中，R 1為C(O)-(CH 2) 5-NH。在一個實施例中，上述方法可用於產生式(Ia)之POEGMA-PAL結合物： (Ia)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶； R 2為端帽； x為1至約21之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
在一個實施例中，端帽R 2為異丁腈、4-氰基戊酸、4-甲氧基-2,4-二甲基戊腈或羥基(-OH)。在一個實施例中，R 2為異丁腈。在一個實施例中，上述方法可用於產生式(Ia-1)之POEGMA-PAL結合物： (Ia-1)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶； R 2為端帽； x為1至約21之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
方案I及 II之式(II)及(III)中之R 3可為任何RAFT鏈轉移劑。熟習此項技術者將熟悉可使用之多種RAFT鏈轉移劑，以及使用此類劑有效聚合之條件。
在一個實施例中，RAFT鏈轉移劑為二硫代胺基甲酸酯、三硫代碳酸酯、黃原酸酯或二硫酯。在一個實施例中，RAFT鏈轉移劑R 3為三硫代碳酸酯。在一個實施例中，RAFT鏈轉移劑R 3為 ，其中星號(*)表示與化合物或聚合物之其餘部分的連接。在一個實施例中，RAFT鏈轉移劑R 3為 ，其中星號(*)表示與化合物或聚合物之其餘部分的連接。在一個實施例中，有效產生式(III)聚合物之條件可包含使寡乙二醇甲基丙烯酸酯與式(II)化合物在DMSO及光源存在下接觸。在一個實施例中，該光源為藍色LED光。
藉由使式(III)聚合物與端基改質劑接觸，如 方案II中所示，可自式(III)聚合物移除R 3以產生具有端帽R 2之式(IV)之預結合聚合物。端基改質劑之特性不受特別限制，且熟習此項技術者將認識到用於適當地對聚合物加帽之適宜方法及試劑。
在一個實施例中，可使式(III)聚合物與4'-偶氮雙(4-氰基戊酸)接觸以移除R 3且併入4-氰基戊酸作為端帽R 2。在一個實施例中，可使式(III)聚合物與2,2'-偶氮雙(4-甲氧基-2,4-二甲基戊腈)接觸以移除R 3且併入4-甲氧基-2,4-二甲基戊腈作為端帽R 2。在一個實施例中，可使式(III)聚合物與UV光接觸以移除R 3且併入羥基(-OH)作為端帽R 2。在一個實施例中，使式(III)聚合物與偶氮雙異丁腈(AIBN)視情況在DMSO存在下接觸，以產生具有異丁腈端帽之式(IV-1)之預結合聚合物，如以下 方案II-1中所示： ， 方案II-1其中： y為約50至約500之整數； z為2至約10之整數； R 1為連接體； R 3為RAFT鏈轉移劑；且 R 4為結合部分。
在 方案I、 II及 III中描繪之式中之任一者中，x、y及z可如上文針對式(I)、(V)及(VI)所定義。在一些實施例中，x可為1至約21、約8至約21或約16至約21之整數；y可為約50至約500、約150至約300或約175至約200之整數；且z可為2至約10、2至約8或2至約5之整數。在一個實施例中，z為2。本揭示案涵蓋x、y及z之任何組合。
式(II)化合物、式(III)聚合物及式(IV)之預結合聚合物中之結合部分R 4不受特別限制，且可為可與PAL之離胺酸側鏈反應以在連接體R 1與離胺酸側鏈之間產生鍵的任何反應性部分。可用於將連接體-POEGMA結合至PAL之非限制性結合化學物質之實例包括四氟苯基酯(TFP)、五氟苯基酯(PFP)、對硝基苯酚碳酸酯(p-NPC)及N-羥基琥珀醯亞胺酯(NHS)。舉例而言，R 4可選自由以下組成之群： 、 、 及 ，其中 表示與R 1之連接。
熟習此項技術者將熟悉可有效地將具有特定結合部分R 4之式(IV)之預結合聚合物與PAL結合的條件，且將能夠在不進行過度實驗的情況下進行此類反應。下文進一步闡述可根據本文所揭示之方法使用的各種結合技術之例示性但非限制性實例。此外，特定適宜反應條件亦在實例中論述。
在一個實施例中，R 4為 ，其中 表示與R 1之連接，且式(I)之POEGMA-PAL結合物可藉由包含以下之方法製備：使聚乙二醇甲基丙烯酸酯與式(IIa)化合物接觸以製備式(IIIa)聚合物，如以下 方案Ia中所示： 。 方案Ia
接著可使式(IIIa)聚合物與端基改質劑接觸以移除R 3，以產生具有端帽R 2之式(IVa)之預結合聚合物，如以下 方案IIa中所示： ， 方案IIa
接著可使式(IVa)之預結合聚合物與PAL在有效地將至少一種式(IVa)之預結合聚合物結合至PAL之至少一個離胺酸側鏈的條件下接觸，由此產生式(I)之POEGMA-PAL結合物，如以下 方案IIIa中所示： 。 方案IIIa
在上述 方案Ia、 IIa及 IIIa中之每一者中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶； R 1為連接體； x為1至約21之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
在一個實施例中，PAL為來自原核生物體之野生型PAL，包括但不限於來自以下之PAL：海藻鏈黴菌、點狀念珠藻、多變魚腥藻、構巢囊藻、發光光桿菌TT01及輪枝鏈黴菌。在一個實施例中，PAL為野生型PAL酶之片段、突變體、變異體或類似物，其保留類似( 例如，至少50%)或增加之苯丙胺酸催化活性。在一個實施例中，PAL為來自多變魚腥藻(SEQ ID NO:1)之原核PAL或其生物活性片段、突變體、變異體或類似物。在某些實施例中，PAL為多變魚腥藻PAL (AvPAL)變異體。在一個實施例中，PAL為AvPAL變異體，其中一或多個胺基酸殘基已經另一胺基酸殘基取代。在一些實施例中，AvPAL變異體之一或多個半胱胺酸殘基經絲胺酸殘基取代。在一些實施例中，AvPAL變異體中經一或多個絲胺酸殘基取代之一或多個半胱胺酸殘基選自由位置503及565處之半胱胺酸殘基組成之群。在一個實施例中，PAL之各次單元具有根據SEQ ID NO:2之胺基酸序列。在一個實施例中，PAL具有根據SEQ ID NO:3之胺基酸序列。在一個實施例中，PAL之各次單元具有根據SEQ ID NO:4之胺基酸序列。
在某些實施例中，使式(IVa)之預結合聚合物與PAL在有效地將二或更多個式(IVa)之預結合聚合物個別地結合至PAL的二或更多個( 例如，2-21個)離胺酸側鏈的條件下接觸。在一個實施例中，使式(IVa)之預結合聚合物與PAL在有效地將式(IVa)之預結合聚合物各自個別地結合至PAL的約5至約21、約8至約21、約10至約21、約16至約21或約19至約21個離胺酸側鏈。在某些實施例中，使式(IVa)之預結合聚合物與PAL在有效地將式(IVa)之預結合聚合物各自個別地結合至PAL的約19至約21個離胺酸側鏈。
在某些實施例中，使式(IVa)之預結合聚合物與PAL在有效地將一或多個( 例如，1-21個)式(IVa)之預結合聚合物個別地結合至PAL的各次單元之一或多個離胺酸側鏈。在某些實施例中，使式(IVa)之預結合聚合物與PAL在有效地將二或更多個( 例如，2-21個)式(IVa)之預結合聚合物個別地結合至PAL的各次單元之二或更多個離胺酸側鏈。在某些實施例中，使式(IVa)之預結合聚合物與PAL在有效地將三或更多個( 例如，3-21個)式(IVa)之預結合聚合物個別地結合至PAL的各次單元之三或更多個離胺酸側鏈。在某些實施例中，使式(IVa)之預結合聚合物與PAL在有效地將四或更多個( 例如，4-21個)式(IVa)之預結合聚合物個別地結合至PAL的各次單元之四或更多個離胺酸側鏈。
在一個實施例中，使式(IVa)之預結合聚合物與PAL在有效地將一或多個( 例如，1-5或1-6個)連接體-POEGMA結合至PAL之各次單元上的一或多個離胺酸之條件下接觸，其中PAL之各次單元上的一或多個離胺酸獨立地( 例如，對於各次單元可不同)包含K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109中之一或多者( 例如，1-9者)，但在一些實施例中，熟習此項技術者將理解，PAL之其他離胺酸殘基亦可結合至連接體-POEGMA。在一個實施例中，使式(IVa)之預結合聚合物與PAL在有效地將二或更多個( 例如，2-5或2-6個)連接體-POEGMA各自個別地結合至PAL之各次單元上的二或更多個離胺酸之條件下接觸，其中PAL之各次單元上的二或更多個離胺酸獨立地( 例如，對於各次單元可不同)包含K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109中之二或更多者( 例如，2-9者)，但在一些實施例中，熟習此項技術者將理解，PAL之其他離胺酸殘基亦可結合至連接體-POEGMA。在一個實施例中，使式(IVa)之預結合聚合物與PAL在有效地將三或更多個( 例如，3-5或3-6個)連接體-POEGMA各自個別地結合至PAL之各次單元上的三或更多個離胺酸之條件下接觸，其中PAL之各次單元上的三或更多個離胺酸獨立地( 例如，對於各次單元可不同)包含K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109中之三或更多者( 例如，3-9者)，但在一些實施例中，熟習此項技術者將理解，PAL之其他離胺酸殘基亦可結合至連接體-POEGMA。在一個實施例中，使式(IVa)之預結合聚合物與PAL在有效地將四或更多個( 例如，4-5或4-6個)連接體-POEGMA結合至PAL之各次單元上的四或更多個離胺酸之條件下接觸，其中PAL之各次單元上的四或更多個離胺酸獨立地( 例如，對於各次單元可不同)包含K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109中之四或更多者( 例如，4-9者)，但在一些實施例中，熟習此項技術者將理解，PAL之其他離胺酸殘基亦可結合至連接體-POEGMA。在一個實施例中，使式(IVa)之預結合聚合物與PAL在有效地將五或更多個( 例如，5或6個)連接體-POEGMA各自個別地結合至PAL之各次單元上的五或更多個離胺酸之條件下接觸，其中PAL之各次單元上的五或更多個離胺酸獨立地( 例如，對於各次單元可不同)包含K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109中之四或更多者( 例如，5-9者)，但在一些實施例中，熟習此項技術者將理解，PAL之其他離胺酸殘基亦可結合至連接體-POEGMA。
在一些實施例中，該等條件有效地將K189、K195及K522中之每一者結合至PAL之至少一個( 例如，1-4個)次單元中的連接體-POEGMA。在一些實施例中，該等條件有效地將K189、K195及K522中之每一者結合至PAL之至少兩個( 例如，2-4個)次單元中的連接體-POEGMA。在一些實施例中，該等條件有效地將K189、K195及K522中之每一者結合至PAL之至少三個( 例如，3或4個)次單元中的連接體-POEGMA。在一些實施例中，該等條件有效地將K189、K195及K522中之每一者結合至PAL之各次單元中的連接體-POEGMA。
在一些實施例中，使式(IVa)之預結合聚合物與PAL在有效地將K189、K195、K522、K413及K145中之每一者結合至PAL之至少一個( 例如，1-4個)次單元中的連接體-POEGMA之條件下接觸。在一些實施例中，該等條件有效地將K189、K195、K522、K413及K145中之每一者結合至PAL之至少兩個( 例如，2-4個)次單元中的連接體-POEGMA。在一些實施例中，該等條件有效地將K189、K195、K522、K413及K145中之每一者結合至PAL之至少三個( 例如，3或4個)次單元中的連接體-POEGMA。在一些實施例中，該等條件有效地將K189、K195、K522、K413及K145中之每一者結合至PAL之各次單元中的連接體-POEGMA。
有效地使含有NHS結合部分之式(IVa)之預結合聚合物結合的條件為熟習此項技術者所熟知。舉例而言，式(I)之POEGMA-PAL結合物可藉由使PAL與式(IVa)之預結合聚合物在pH為約7至約9之溶劑( 例如，水性緩衝液)中接觸來製備。
在一個實施例中，R 4為 ，其中 表示與R 1之連接，且式(I)之POEGMA-PAL結合物可藉由包含以下之方法製備：使聚乙二醇甲基丙烯酸酯與式(IIb)化合物接觸以製備式(IIIb)聚合物，如以下 方案Ib中所示： 。 方案Ib
接著可使式(IIIb)聚合物與端基改質劑接觸以移除R 3，以產生具有端帽R 2之式(IVb)之預結合聚合物，如以下 方案IIb中所示： 。 方案IIb
接著可使式(IVb)之預結合聚合物與PAL在有效地將式(IVb)聚合物結合至PAL的條件下接觸，由此產生式(I)之POEGMA-PAL結合物，如以下 方案IIIb中所示： 。 方案IIIb
在 方案Ib、 IIb及 IIIb中之每一者中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶； R 1為連接體； x為1至約21之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
在一個實施例中，PAL為來自原核生物體之野生型PAL，包括但不限於來自以下之PAL：海藻鏈黴菌、點狀念珠藻、多變魚腥藻、構巢囊藻、發光光桿菌TT01及輪枝鏈黴菌。在一個實施例中，PAL為野生型PAL酶之片段、突變體、變異體或類似物，其保留類似( 例如，至少50%)或增加之苯丙胺酸催化活性。在一個實施例中，PAL為來自多變魚腥藻(SEQ ID NO:1)之原核PAL或其生物活性片段、突變體、變異體或類似物。在某些實施例中，PAL為多變魚腥藻PAL (AvPAL)變異體。在一個實施例中，PAL為AvPAL變異體，其中一或多個胺基酸殘基已經另一胺基酸殘基取代。在一些實施例中，AvPAL變異體之一或多個半胱胺酸殘基經絲胺酸殘基取代。在一些實施例中，AvPAL變異體中經一或多個絲胺酸殘基取代之一或多個半胱胺酸殘基選自由位置503及565處之半胱胺酸殘基組成之群。在一個實施例中，PAL之各次單元具有根據SEQ ID NO:2之胺基酸序列。在一個實施例中，PAL具有根據SEQ ID NO:3之胺基酸序列。在一個實施例中，PAL之各次單元具有根據SEQ ID NO:4之胺基酸序列。
在某些實施例中，使式(IVb)之預結合聚合物與PAL在有效地將二或更多個式(IVb)之預結合聚合物個別地結合至PAL的二或更多個( 例如，2-21個)離胺酸側鏈的條件下接觸。在一個實施例中，使式(IVb)之預結合聚合物與PAL在有效地將式(IVb)之預結合聚合物各自個別地結合至PAL的約5至約21、約8至約21、約10至約21、約16至約21或約19至約21個離胺酸側鏈。在一個實施例中，使式(IVb)之預結合聚合物與PAL在有效地將式(IVb)之預結合聚合物各自個別地結合至PAL的約19至約21個離胺酸側鏈。
在某些實施例中，使式(IVb)之預結合聚合物與PAL在有效地將一或多個( 例如，1-21個)式(IVb)之預結合聚合物個別地結合至PAL的各次單元之一或多個離胺酸側鏈。在某些實施例中，使式(IVb)之預結合聚合物與PAL在有效地將二或更多個( 例如，2-21個)式(IVb)之預結合聚合物個別地結合至PAL的各次單元之二或更多個離胺酸側鏈。在某些實施例中，使式(IVb)之預結合聚合物與PAL在有效地將三或更多個( 例如，3-21個)式(IVb)之預結合聚合物個別地結合至PAL的各次單元之三或更多個離胺酸側鏈。在某些實施例中，使式(IVb)之預結合聚合物與PAL在有效地將四或更多個( 例如，4-21個)式(IVb)之預結合聚合物個別地結合至PAL的各次單元之四或更多個離胺酸側鏈。
在一個實施例中，使式(IVb)之預結合聚合物與PAL在有效地將一或多個( 例如，1-5或1-6個)連接體-POEGMA結合至PAL之各次單元上的一或多個離胺酸之條件下接觸，其中PAL之各次單元上的一或多個離胺酸獨立地( 例如，對於各次單元可不同)包含K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109中之一或多者( 例如，1-9者)，但在一些實施例中，熟習此項技術者將理解，PAL之其他離胺酸殘基亦可結合至連接體-POEGMA。在一個實施例中，使式(IVb)之預結合聚合物與PAL在有效地將二或更多個( 例如，2-5或2-6個)連接體-POEGMA結合至PAL之各次單元上的二或更多個離胺酸之條件下接觸，其中PAL之各次單元上的二或更多個離胺酸獨立地( 例如，對於各次單元可不同)包含K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109中之二或更多者( 例如，2-9者)，但在一些實施例中，熟習此項技術者將理解，PAL之其他離胺酸殘基亦可結合至連接體-POEGMA。在一個實施例中，使式(IVb)之預結合聚合物與PAL在有效地將三或更多個( 例如，3-5或3-6個)連接體-POEGMA各自個別地結合至PAL之各次單元上的三或更多個離胺酸之條件下接觸，其中PAL之各次單元上的三或更多個離胺酸獨立地( 例如，對於各次單元可不同)包含K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109中之三或更多者( 例如，3-9者)，但在一些實施例中，熟習此項技術者將理解，PAL之其他離胺酸殘基亦可結合至連接體-POEGMA。在一個實施例中，使式(IVb)之預結合聚合物與PAL在有效地將四或更多個( 例如，4-5或4-6個)連接體-POEGMA各自個別地結合至PAL之各次單元上的四或更多個離胺酸之條件下接觸，其中PAL之各次單元上的四或更多個離胺酸獨立地( 例如，對於各次單元可不同)包含K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109中之四或更多者( 例如，4-9者)，但在一些實施例中，熟習此項技術者將理解，PAL之其他離胺酸殘基亦可結合至連接體-POEGMA。在一個實施例中，使式(IVb)之預結合聚合物與PAL在有效地將五或更多個( 例如，5或6個)連接體-POEGMA各自個別地結合至PAL之各次單元上的五或更多個離胺酸之條件下接觸，其中PAL之各次單元上的五或更多個離胺酸獨立地( 例如，對於各次單元可不同)包含K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109中之四或更多者( 例如，5-9者)，但在一些實施例中，熟習此項技術者將理解，PAL之其他離胺酸殘基亦可結合至連接體-POEGMA。
在一些實施例中，該等條件有效地將K189、K195及K522中之每一者結合至PAL之至少一個( 例如，1-4個)次單元中的連接體-POEGMA。在一些實施例中，該等條件有效地將K189、K195及K522中之每一者結合至PAL之至少兩個( 例如，2-4個)次單元中的連接體-POEGMA。在一些實施例中，該等條件有效地將K189、K195及K522中之每一者結合至PAL之至少三個( 例如，3或4個)次單元中的連接體-POEGMA。在一些實施例中，該等條件有效地將K189、K195及K522中之每一者結合至PAL之各次單元中的連接體-POEGMA。
在一些實施例中，使式(IVb)之預結合聚合物與PAL在有效地將K189、K195、K522、K413及K145中之每一者結合至PAL之至少一個( 例如，1-4個)次單元中的連接體-POEGMA之條件下接觸。在一些實施例中，該等條件有效地將K189、K195、K522、K413及K145中之每一者結合至PAL之至少兩個( 例如，2-4個)次單元中的連接體-POEGMA。在一些實施例中，該等條件有效地將K189、K195、K522、K413及K145中之每一者結合至PAL之至少三個( 例如，3或4個)次單元中的連接體-POEGMA。在一些實施例中，該等條件有效地將K189、K195、K522、K413及K145中之每一者結合至PAL之各次單元中的連接體-POEGMA。
有效地使含有四氟苯基酯結合部分之式(IVb)之預結合聚合物結合的條件為熟習此項技術者所熟知。舉例而言，式(I)之POEGMA-PAL結合物可藉由使PAL與式(IVb)之預結合聚合物在pH為約7至約9的溶劑( 例如，水性緩衝液)中接觸來製備。
在一個實施例中，R 4為 ，其中 表示與R 1之連接，且式(I)之POEGMA-PAL結合物可藉由包含以下之方法製備：使聚乙二醇甲基丙烯酸酯與式(IIc)化合物接觸以製備式(IIIc)聚合物，如以下 方案Ic中所示： 。 方案Ic
接著可使式(IIIc)聚合物與端基改質劑接觸以移除R 3，以產生具有端帽R 2之式(IVc)之預結合聚合物，如以下 方案IIc中所示： 。 方案IIc
接著可使式(IVc)之預結合聚合物與PAL在有效地將式(IVc)聚合物結合至PAL的條件下接觸，由此產生式(I)之POEGMA-PAL結合物，如以下 方案IIIc中所示： 。 方案IIIc
在 方案 Ic、 IIc及 IIIc中之每一者中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶； R 1為連接體； x為1至約21之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
在一個實施例中，PAL為來自原核生物體之野生型PAL，包括但不限於來自以下之PAL：海藻鏈黴菌、點狀念珠藻、多變魚腥藻、構巢囊藻、發光光桿菌TT01及輪枝鏈黴菌。在一個實施例中，PAL為野生型PAL酶之片段、突變體、變異體或類似物，其保留類似( 例如，至少50%)或增加之苯丙胺酸催化活性。在一個實施例中，PAL為來自多變魚腥藻(SEQ ID NO:1)之原核PAL或其生物活性片段、突變體、變異體或類似物。在某些實施例中，PAL為多變魚腥藻PAL (AvPAL)變異體。在一個實施例中，PAL為AvPAL變異體，其中一或多個胺基酸殘基已經另一胺基酸殘基取代。在一些實施例中，AvPAL變異體之一或多個半胱胺酸殘基經絲胺酸殘基取代。在一些實施例中，AvPAL變異體中經一或多個絲胺酸殘基取代之一或多個半胱胺酸殘基選自由位置503及565處之半胱胺酸殘基組成之群。在一個實施例中，PAL之各次單元具有根據SEQ ID NO:2之胺基酸序列。在一個實施例中，PAL具有根據SEQ ID NO:3之胺基酸序列。在一個實施例中，PAL之各次單元具有根據SEQ ID NO:4之胺基酸序列。
在某些實施例中，使式(IVc)之預結合聚合物與PAL在有效地將二或更多個式(IVc)之預結合聚合物個別地結合至PAL的二或更多個( 例如，2-21個)離胺酸側鏈的條件下接觸。在一個實施例中，使式(IVc)之預結合聚合物與PAL在有效地將式(IVc)之預結合聚合物各自個別地結合至PAL的約5至約21、約8至約21、約10至約21、約16至約21或約19至約21個離胺酸側鏈。在一個實施例中，使式(IVc)之預結合聚合物與PAL在有效地將式(IVc)之預結合聚合物各自個別地結合至PAL的約19至約21個離胺酸側鏈。
在某些實施例中，使式(IVc)之預結合聚合物與PAL在有效地將一或多個( 例如，1-21個)式(IVc)之預結合聚合物個別地結合至PAL的各次單元之一或多個離胺酸側鏈。在某些實施例中，使式(IVc)之預結合聚合物與PAL在有效地將二或更多個( 例如，2-21個)式(IVc)之預結合聚合物個別地結合至PAL的各次單元之二或更多個離胺酸側鏈。在某些實施例中，使式(IVc)之預結合聚合物與PAL在有效地將三或更多個( 例如，3-21個)式(IVc)之預結合聚合物個別地結合至PAL的各次單元之三或更多個離胺酸側鏈。在某些實施例中，使式(IVc)之預結合聚合物與PAL在有效地將四或更多個( 例如，4-21個)式(IVc)之預結合聚合物個別地結合至PAL的各次單元之四或更多個離胺酸側鏈。
在一個實施例中，使式(IVc)之預結合聚合物與PAL在有效地將一或多個( 例如，1-5或1-6個)連接體-POEGMA結合至PAL之各次單元上的一或多個離胺酸之條件下接觸，其中PAL之各次單元上的一或多個離胺酸獨立地( 例如，對於各次單元可不同)包含K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109中之一或多者( 例如，1-9者)，但在一些實施例中，熟習此項技術者將理解，PAL之其他離胺酸殘基亦可結合至連接體-POEGMA。在一個實施例中，使式(IVc)之預結合聚合物與PAL在有效地將二或更多個( 例如，2-5或2-6個)連接體-POEGMA各自個別地結合至PAL之各次單元上的二或更多個離胺酸之條件下接觸，其中PAL之各次單元上的二或更多個離胺酸獨立地( 例如，對於各次單元可不同)包含K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109中之二或更多者( 例如，2-9者)，但在一些實施例中，熟習此項技術者將理解，PAL之其他離胺酸殘基亦可結合至連接體-POEGMA。在一個實施例中，使式(IVc)之預結合聚合物與PAL在有效地將三或更多個( 例如，3-5或3-6個)連接體-POEGMA各自個別地結合至PAL之各次單元上的三或更多個離胺酸之條件下接觸，其中PAL之各次單元上的三或更多個離胺酸獨立地( 例如，對於各次單元可不同)包含K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109中之三或更多者( 例如，3-9者)，但在一些實施例中，熟習此項技術者將理解，PAL之其他離胺酸殘基亦可結合至連接體-POEGMA。在一個實施例中，使式(IVc)之預結合聚合物與PAL在有效地將四或更多個( 例如，4-5或4-6個)連接體-POEGMA各自個別地結合至PAL之各次單元上的四或更多個離胺酸之條件下接觸，其中PAL之各次單元上的四或更多個離胺酸獨立地( 例如，對於各次單元可不同)包含K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109中之四或更多者( 例如，4-9者)，但在一些實施例中，熟習此項技術者將理解，PAL之其他離胺酸殘基亦可結合至連接體-POEGMA。在一個實施例中，使式(IVc)之預結合聚合物與PAL在有效地將五或更多個( 例如，5或6個)連接體-POEGMA各自個別地結合至PAL之各次單元上的五或更多個離胺酸之條件下接觸，其中PAL之各次單元上的五或更多個離胺酸獨立地( 例如，對於各次單元可不同)包含K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109中之五或更多者( 例如，5-9者)，但在一些實施例中，熟習此項技術者將理解，PAL之其他離胺酸殘基亦可結合至連接體-POEGMA。
在一些實施例中，該等條件有效地將K189、K195及K522中之每一者結合至PAL之至少一個( 例如，1-4個)次單元中的連接體-POEGMA。在一些實施例中，該等條件有效地將K189、K195及K522中之每一者結合至PAL之至少兩個( 例如，2-4個)次單元中的連接體-POEGMA。在一些實施例中，該等條件有效地將K189、K195及K522中之每一者結合至PAL之至少三個( 例如，3或4個)次單元中的連接體-POEGMA。在一些實施例中，該等條件有效地將K189、K195及K522中之每一者結合至PAL之各次單元中的連接體-POEGMA。
在一些實施例中，使式(IVc)之預結合聚合物與PAL在有效地將K189、K195、K522、K413及K145中之每一者結合至PAL之至少一個( 例如，1-4個)次單元中的連接體-POEGMA之條件下接觸。在一些實施例中，該等條件有效地將K189、K195、K522、K413及K145中之每一者結合至PAL之至少兩個( 例如，2-4個)次單元中的連接體-POEGMA。在一些實施例中，該等條件有效地將K189、K195、K522、K413及K145中之每一者結合至PAL之至少三個( 例如，3或4個)次單元中的連接體-POEGMA。在一些實施例中，該等條件有效地將K189、K195、K522、K413及K145中之每一者結合至PAL之各次單元中的連接體-POEGMA。
有效地使含有五氟苯基酯結合部分之式(IVc)之預結合聚合物結合的條件為熟習此項技術者所熟知。舉例而言，式(I)之POEGMA-PAL結合物可藉由使PAL與式(IVc)之預結合聚合物在pH為約7至約9的溶劑( 例如，水性緩衝液)中接觸來製備。
在一個實施例中，R 4為 ，其中 表示與R 1之連接，且式(I)之POEGMA-PAL結合物可藉由包含以下之方法製備：使聚乙二醇甲基丙烯酸酯與式(IId)化合物接觸以製備式(IIId)聚合物，如以下 方案Id中所示： 。 方案Id
接著可使式(IIId)聚合物與端基改質劑接觸以移除R 3，以產生具有端帽R 2之式(IVd)之預結合聚合物，如以下 方案IId中所示： 。 方案IId
接著可使式(IVd)之預結合聚合物與PAL在有效地將式(IVd)之預結合聚合物結合至PAL的條件下接觸，由此產生式(I)之POEGMA-PAL結合物，如以下 方案IIId中所示： 。 方案IIId
在 方案 Id、 IId及 IIId中之每一者中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶； R 1為連接體； x為1至約21之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
在一個實施例中，PAL為來自原核生物體之野生型PAL，包括但不限於來自以下之PAL：海藻鏈黴菌、點狀念珠藻、多變魚腥藻、構巢囊藻、發光光桿菌TT01及輪枝鏈黴菌。在一個實施例中，PAL為野生型PAL酶之片段、突變體、變異體或類似物，其保留類似( 例如，至少50%)或增加之苯丙胺酸催化活性。在一個實施例中，PAL為來自多變魚腥藻(SEQ ID NO:1)之原核PAL或其生物活性片段、突變體、變異體或類似物。在某些實施例中，PAL為多變魚腥藻PAL (AvPAL)變異體。在一個實施例中，PAL為AvPAL變異體，其中一或多個胺基酸殘基已經另一胺基酸殘基取代。在一些實施例中，AvPAL變異體之一或多個半胱胺酸殘基經絲胺酸殘基取代。在一些實施例中，AvPAL變異體中經一或多個絲胺酸殘基取代之一或多個半胱胺酸殘基選自由位置503及565處之半胱胺酸殘基組成之群。在一個實施例中，PAL之各次單元具有根據SEQ ID NO:2之胺基酸序列。在一個實施例中，PAL具有根據SEQ ID NO:3之胺基酸序列。在一個實施例中，PAL之各次單元具有根據SEQ ID NO:4之胺基酸序列。
在某些實施例中，使式(IVd)之預結合聚合物與PAL在有效地將二或更多個式(IVd)之預結合聚合物個別地結合至PAL的二或更多個( 例如，2-21個)離胺酸側鏈的條件下接觸。在一個實施例中，使式(IVd)之預結合聚合物與PAL在有效地將式(IVd)之預結合聚合物各自個別地結合至PAL的約5至約21、約8至約21、約10至約21、約16至約21或約19至約21個離胺酸側鏈。在一個實施例中，使式(IVd)之預結合聚合物與PAL在有效地將式(IVd)之預結合聚合物各自個別地結合至PAL的約19至約21個離胺酸側鏈。
在某些實施例中，使式(IVd)之預結合聚合物與PAL在有效地將一或多個( 例如，1-21或1-8個)式(IVd)之預結合聚合物個別地結合至PAL的各次單元之一或多個離胺酸側鏈。在某些實施例中，使式(IVd)之預結合聚合物與PAL在有效地將二或更多個( 例如，2-21或2-8個)式(IVd)之預結合聚合物個別地結合至PAL的各次單元之二或更多個離胺酸側鏈。在某些實施例中，使式(IVd)之預結合聚合物與PAL在有效地將三或更多個( 例如，3-21或3-8個)式(IVd)之預結合聚合物個別地結合至PAL的各次單元之三或更多個離胺酸側鏈。在某些實施例中，使式(IVd)之預結合聚合物與PAL在有效地將四或更多個( 例如，4-21或4-8個)式(IVd)之預結合聚合物個別地結合至PAL的各次單元之四或更多個離胺酸側鏈。
在一個實施例中，使式(IVd)之預結合聚合物與PAL在有效地將一或多個( 例如，1-5或1-6個)連接體-POEGMA結合至PAL之各次單元上的一或多個離胺酸之條件下接觸，其中PAL之各次單元上的一或多個離胺酸獨立地( 例如，對於各次單元可不同)包含K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109中之一或多者( 例如，1-9者)，但在一些實施例中，熟習此項技術者將理解，PAL之其他離胺酸殘基亦可結合至連接體-POEGMA。在一個實施例中，使式(IVd)之預結合聚合物與PAL在有效地將二或更多個( 例如，2-5或2-6個)連接體-POEGMA各自個別地結合至PAL之各次單元上的二或更多個離胺酸之條件下接觸，其中PAL之各次單元上的二或更多個離胺酸獨立地( 例如，對於各次單元可不同)包含K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109中之二或更多者( 例如，2-9者)，但在一些實施例中，熟習此項技術者將理解，PAL之其他離胺酸殘基亦可結合至連接體-POEGMA。在一個實施例中，使式(IVd)之預結合聚合物與PAL在有效地將三或更多個( 例如，3-5或3-6個)連接體-POEGMA各自個別地結合至PAL之各次單元上的三或更多個離胺酸之條件下接觸，其中PAL之各次單元上的三或更多個離胺酸獨立地( 例如，對於各次單元可不同)包含K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109中之三或更多者( 例如，3-9者)，但在一些實施例中，熟習此項技術者將理解，PAL之其他離胺酸殘基亦可結合至連接體-POEGMA。在一個實施例中，使式(IVd)之預結合聚合物與PAL在有效地將四或更多個( 例如，4-5或4-6個)連接體-POEGMA各自個別地結合至PAL之各次單元上的四或更多個離胺酸之條件下接觸，其中PAL之各次單元上的四或更多個離胺酸獨立地( 例如，對於各次單元可不同)包含K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109中之四或更多者( 例如，4-9者)，但在一些實施例中，熟習此項技術者將理解，PAL之其他離胺酸殘基亦可結合至連接體-POEGMA。在一個實施例中，使式(IVd)之預結合聚合物與PAL在有效地將五或更多個( 例如，5或6個)連接體-POEGMA各自個別地結合至PAL之各次單元上的五或更多個離胺酸之條件下接觸，其中PAL之各次單元上的五或更多個離胺酸獨立地( 例如，對於各次單元可不同)包含K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109中之四或更多者( 例如，5-9者)，但在一些實施例中，熟習此項技術者將理解，PAL之其他離胺酸殘基亦可結合至連接體-POEGMA。
在一些實施例中，該等條件有效地將K189、K195及K522中之每一者結合至PAL之至少一個( 例如，1-4個)次單元中的連接體-POEGMA。在一些實施例中，該等條件有效地將K189、K195及K522中之每一者結合至PAL之至少兩個( 例如，2-4個)次單元中的連接體-POEGMA。在一些實施例中，該等條件有效地將K189、K195及K522中之每一者結合至PAL之至少三個( 例如，3或4個)次單元中的連接體-POEGMA。在一些實施例中，該等條件有效地將K189、K195及K522中之每一者結合至PAL之各次單元中的連接體-POEGMA。
在一些實施例中，使式(IVd)之預結合聚合物與PAL在有效地將K189、K195、K522、K413及K145中之每一者結合至PAL之至少一個( 例如，1-4個)次單元中的連接體-POEGMA之條件下接觸。在一些實施例中，該等條件有效地將K189、K195、K522、K413及K145中之每一者結合至PAL之至少兩個( 例如，2-4個)次單元中的連接體-POEGMA。在一些實施例中，該等條件有效地將K189、K195、K522、K413及K145中之每一者結合至PAL之至少三個( 例如，3或4個)次單元中的連接體-POEGMA。在一些實施例中，該等條件有效地將K189、K195、K522、K413及K145中之每一者結合至PAL之各次單元中的連接體-POEGMA。
在 方案Ia、 Ib、 Ic、 Id、 IIa、 IIb、 IIc、 IId、 IIIa、 IIIb、 IIIc及IIId中描繪之式中的任一者中，x、y及z可如上文針對式(I)、(V)及(VI)所定義。本揭示案涵蓋x、y及z之任何組合。
有效地使含有對硝基苯基碳酸酯結合部分之式(IVd)之預結合聚合物結合的條件為熟習此項技術者所熟知。舉例而言，式(I)之POEGMA-PAL結合物可藉由使PAL與式(IVd)之預結合聚合物在pH為約7至約9的溶劑( 例如，水性緩衝液)中接觸來製備。
5.3 POEGMA-PAL 結合物之組合物如熟習此項技術者將瞭解，如本文( 例如，在第5.1節中)所揭示之POEGMA-PAL結合物係作為包含複數個POEGMA-PAL結合物，諸如式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)及(Ia-1-1)中的任一者及式(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中的任一者之POEGMA-PAL結合物之組合物提供。在此類組合物中，x (結合至各PAL酶之連接體-POEGMA的數量)、y (各連接體-POEGMA中存在之聚(乙烯)甲基醚甲基丙烯酸酯單體的數量)及z (各連接體-POEGMA之各側鏈中存在之乙二醇部分的數量)可隨結合物而變化。此外，在單一結合物中，y及z可變化，或在一些實施例中，僅y變化。因此，包含複數個POEGMA-PAL結合物之組合物可藉由與各PAL酶結合之連接體-POEGMA的平均數量(x ave)、各連接體-POEGMA中存在之聚(乙烯)甲基醚甲基丙烯酸酯單體的平均數量(y ave)及各連接體-POEGMA之各側鏈中存在之乙二醇部分的平均數量(z ave)。包含複數個如本文所述之POEGMA-PAL結合物( 例如，式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)或(Ia-1-1)之POEGMA-PAL結合物)的組合物之特徵可在於x ave為約1至約21、約8至約21、約16至約21或約19至約21。在一個實施例中，x ave為約19。在一個實施例中，x ave為約20。在一個實施例中，x ave為約21。包含複數個POEGMA-PAL結合物之組合物可展現出約50至約500、約150至約300或約175至約200之y ave。包含複數個POEGMA-PAL結合物之組合物可展現出約2至約10、約2至約8或約2至約5之z ave。在一個實施例中，包含複數個POEGMA-PAL結合物之組合物展現出約2之z ave。在一些實施例中，z ave之標準偏差為0 ( 例如，在組合物之所有POEGMA-PAL結合物中，z為2)。
在一個實施例中，包含複數個如本文所述之POEGMA-PAL結合物( 例如，式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)或(Ia-1-1)之POEGMA-PAL結合物)的組合物之特徵可在於x ave為約1至約32、約2至約32、約3至約32、約4至約32、約5至約32、約6至約32、約7至約32、約8至約32、約9至約32、約10至約32、約11至約32、約12至約32、約13至約32、約14至約32、約15至約32、約16至約32、約17至約32、約18至約32、約19至約32、約20至約32、約21至約32、約22至約32、約23至約32、約25至約32、約26至約32、約27至約32、約28至約32、約29至約32、約20至約32或約31至約32。
在一個實施例中，包含複數個如本文所述之POEGMA-PAL結合物( 例如，式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)或(Ia-1-1)之POEGMA-PAL結合物)的組合物之特徵可在於x ave為約1至約28、約2至約28、約3至約28、約4至約28、約5至約28、約6至約28、約7至約28、約8至約28、約9至約28、約10至約28、約11至約28、約12至約28、約13至約28、約14至約28、約15至約28、約16至約28、約17至約28、約18至約28、約19至約28、約20至約28、約21至約28、約22至約28、約23至約28、約24至約28、約25至約28、約26至約28或約27至約28。
在一個實施例中，包含複數個如本文所述之POEGMA-PAL結合物( 例如，式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)或(Ia-1-1)之POEGMA-PAL結合物)的組合物之特徵可在於x ave為約1至約24、約2至約24、約3至約24、約4至約24、約5至約24、約6至約24、約7至約24、約8至約24、約9至約24、約10至約24、約11至約24、約12至約24、約13至約24、約14至約24、約15至約24、約16至約24、約17至約24、約18至約24、約19至約24、約20至約24、約21至約24、約22至約24或約23至約24。
在一個實施例中，包含複數個如本文所述之POEGMA-PAL結合物( 例如，式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)或(Ia-1-1)之POEGMA-PAL結合物)的組合物之特徵可在於x ave為約1至約21、約2至約21、約3至約21、約4至約21、約5至約21、約6至約21、約7至約21、約8至約21、約9至約21、約10至約21、約11至約21、約12至約21、約13至約21、約14至約21、約15至約21、約16至約21、約17至約21、約18至約21或約19至約21。
包含複數個POEGMA-PAL結合物之組合物可展現出約50至約500、約150至約300、約175至約250或約175至約200之y ave。包含複數個POEGMA-PAL結合物之組合物可展現出約2至約10、約2至約9、約2至約8、約2至約7、約2至約6、約2至約5、約2至約4或約2至約3之z ave。在一個實施例中，包含複數個POEGMA-PAL結合物之組合物展現出約2至約5之az ave。在某些實施例中，包含複數個POEGMA-PAL結合物之組合物展現出約2之z ave。在一些實施例中，z ave之標準偏差為0 ( 例如，在組合物之所有POEGMA-PAL結合物中，z為2)。一般而言，本文針對x、y及z提及之組合亦適用於x ave、y ave及z ave。
包含複數個如本文所述之POEGMA-PAL結合物( 例如，式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)或(Ia-1-1)或式(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者之POEGMA-PAL結合物)的組合物中之各POEGMA-PAL結合物可如本文( 例如，在第5.1節中)所述結合。結合位點可在組合物中之每一個別POEGMA-PAL結合物之間變化，如實例中所闡述。
在一個實施例中，組合物中之各POEGMA-PAL結合物獨立地包含結合至連接體-POEGMA之5-32個PAL離胺酸殘基。在一個實施例中，組合物中之各POEGMA-PAL結合物獨立地包含結合至連接體-POEGMA之至少5個PAL離胺酸殘基、至少8個PAL離胺酸殘基、至少12個PAL離胺酸殘基、至少16個PAL離胺酸殘基、至少20個PAL離胺酸殘基、至少24個PAL離胺酸殘基或至少28個PAL離胺酸殘基。在一個實施例中，組合物中之各POEGMA-PAL結合物獨立地包含結合至連接體-POEGMA之10-32、10-28或10-24個PAL離胺酸殘基。在一個實施例中，組合物中之各POEGMA-PAL結合物獨立地包含結合至連接體-POEGMA之16-32、16-28或16-24個PAL離胺酸殘基。在一個實施例中，組合物中之各POEGMA-PAL結合物獨立地包含結合至連接體-POEGMA之19-32、19-28或19-24個PAL離胺酸殘基。在一個實施例中，組合物中之各POEGMA-PAL結合物獨立地包含結合至連接體-POEGMA之各PAL次單元上的4-7個離胺酸殘基。在一個實施例中，組合物中之各POEGMA-PAL結合物獨立地包含結合至連接體-POEGMA之各PAL次單元上的4-8個離胺酸殘基。在一個實施例中，組合物中之各POEGMA-PAL結合物獨立地包含結合至連接體-POEGMA之各PAL次單元上的5-7個離胺酸殘基。
在一個實施例中，組合物中之各POEGMA-PAL結合物獨立地包含結合至連接體-POEGMA之5-10個PAL離胺酸殘基。在一個實施例中，組合物中之各POEGMA-PAL結合物獨立地包含結合至連接體-POEGMA之至少10個PAL離胺酸殘基。在一個實施例中，組合物中之各POEGMA-PAL結合物獨立地包含結合至連接體-POEGMA之10-16或10-21個PAL離胺酸殘基。在一個實施例中，組合物中之各POEGMA-PAL結合物獨立地包含結合至連接體-POEGMA之至少16個PAL離胺酸殘基。在一個實施例中，組合物中之各POEGMA-PAL結合物獨立地包含結合至連接體-POEGMA之16-21個PAL離胺酸殘基。在一個實施例中，組合物中之各POEGMA-PAL結合物獨立地包含結合至連接體-POEGMA之至少19個PAL離胺酸殘基。在一個實施例中，組合物中之各POEGMA-PAL結合物獨立地包含結合至連接體-POEGMA之19-21個PAL離胺酸殘基。在一個實施例中，組合物中之各POEGMA-PAL結合物獨立地包含結合至連接體-POEGMA之各PAL次單元上的至少4個離胺酸殘基。在一個實施例中，組合物中之各POEGMA-PAL結合物獨立地包含結合至連接體-POEGMA之各PAL次單元上的至少5個離胺酸殘基。在一個實施例中，組合物中之各POEGMA-PAL結合物獨立地包含結合至連接體-POEGMA之各PAL次單元上的4-6個離胺酸殘基。
在一個實施例中，組合物中之各POEGMA-PAL結合物獨立地包含結合至連接體-POEGMA之一或多個PAL次單元上的一或多個( 例如，1-5或1-6個)離胺酸殘基( 例如，對於各次單元可不同)，其中該等離胺酸殘基中之至少一個( 例如，1-9個)選自由K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109組成之群，但熟習此項技術者將理解，在一些實施例中，PAL之其他離胺酸殘基亦可結合至連接體-POEGMA。在一個實施例中，組合物中之各POEGMA-PAL結合物獨立地包含結合至連接體-POEGMA之一或多個PAL次單元( 例如，1-4個PAL次單元)上的二或更多個( 例如，2-5或2-6個)離胺酸殘基(對於各次單元可不同)，其中該二或更多個離胺酸殘基選自由K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109組成之群，但熟習此項技術者將理解，在一些實施例中，PAL之其他離胺酸殘基亦可結合至連接體-POEGMA。在一個實施例中，組合物中之各POEGMA-PAL結合物獨立地包含結合至連接體-POEGMA之一或多個PAL次單元上的三或更多個( 例如，3-5或3-6個)離胺酸殘基( 例如，對於各次單元可不同)，其中該三或更多個離胺酸殘基選自由K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109組成之群，但熟習此項技術者將理解，在一些實施例中，PAL之其他離胺酸殘基亦可結合至連接體-POEGMA。在一個實施例中，組合物中之各POEGMA-PAL結合物獨立地包含結合至連接體-POEGMA之一或多個PAL次單元上的四或更多個( 例如，4、5或6個)離胺酸殘基( 例如，對於各次單元可不同)，其中該四或更多個離胺酸殘基選自由K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109組成之群，但熟習此項技術者將理解，在一些實施例中，PAL之其他離胺酸殘基亦可結合至連接體-POEGMA。在一個實施例中，組合物中之各POEGMA-PAL結合物獨立地包含結合至連接體-POEGMA之一或多個PAL次單元上的五或更多個( 例如，5或6個)離胺酸殘基( 例如，對於各次單元可不同)，其中該五或更多個離胺酸殘基選自由K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109組成之群，但熟習此項技術者將理解，在一些實施例中，PAL之其他離胺酸殘基亦可結合至連接體-POEGMA。
在一個實施例中，組合物中之各POEGMA-PAL結合物獨立地包含結合至連接體-POEGMA之一或多個PAL次單元上的六或更多個( 例如，6-8個)離胺酸殘基( 例如，對於各次單元可不同)，其中該六或更多個離胺酸殘基選自由K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109組成之群，但熟習此項技術者將理解，在一些實施例中，PAL之其他離胺酸殘基亦可結合至連接體-POEGMA。
在一個實施例中，組合物中之各POEGMA-PAL結合物獨立地包含結合至連接體-POEGMA之一或多個PAL次單元上的七或更多個( 例如，7或8個)離胺酸殘基( 例如，對於各次單元可不同)，其中該七或更多個離胺酸殘基選自由K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109組成之群，但熟習此項技術者將理解，在一些實施例中，PAL之其他離胺酸殘基亦可結合至連接體-POEGMA。
在一些實施例中，在組合物中之至少60%的POEGMA-PAL結合物中，PAL之至少一個次單元中的K189、K195及K522中之每一者結合至連接體-POEGMA。在一些實施例中，在組合物中之至少60%的POEGMA-PAL結合物中，PAL之至少兩個次單元中的K189、K195及K522中之每一者結合至連接體-POEGMA。在一些實施例中，在組合物中之至少60%的POEGMA-PAL結合物中，PAL之至少三個次單元中的K189、K195及K522中之每一者結合至連接體-POEGMA。在一些實施例中，在組合物中之至少60%的POEGMA-PAL結合物中，PAL之各次單元中的K189、K195及K522中之每一者結合至連接體-POEGMA。
在一些實施例中，在組合物中之至少60%的POEGMA-PAL結合物中，PAL之至少一個次單元中的K189、K195、K522、K413及K145中之每一者結合至連接體-POEGMA。在一些實施例中，在組合物中之至少60%的POEGMA-PAL結合物中，PAL之至少兩個次單元中的K189、K195、K522、K413及K145中之每一者結合至連接體-POEGMA。在一些實施例中，在組合物中之至少60%的POEGMA-PAL結合物中，PAL之至少三個次單元中的K189、K195、K522、K413及K145中之每一者結合至連接體-POEGMA。在一些實施例中，在組合物中之至少60%的POEGMA-PAL結合物中，PAL之各次單元中的K189、K195、K522、K413及K145中之每一者結合至連接體-POEGMA。
在另一態樣中，包含複數個POEGMA-PAL結合物之組合物之特徵可在於分子量，諸如數均分子量(M n)、重均分子量(M w)或峰值分子量(M p)。熟習此項技術者將熟悉用於量測M n、M w及M p之方法。舉例而言，在一個實施例中，M n、M w及M p係藉由凝膠滲透層析或具有多角度靜態光散射之尺寸排阻層析(SEC-MALS)來量測。在一個實施例中，包含複數個如本文所揭示之POEGMA-PAL結合物之組合物可具有約1100 kDa至約1300 kDa，諸如約1200 kDa至約1300 kDa之M n，如藉由SEC-MALS所量測。在一個實施例中，包含複數個如本文所揭示之POEGMA-PAL結合物之組合物可具有約1200 kDa之M n，如藉由SEC-MALS所量測。在一個實施例中，包含複數個如本文所揭示之POEGMA-PAL結合物之組合物可具有約1100 kDa至約1300 kDa，諸如約1200 kDa至約1300 kDa之M w，如藉由SEC-MALS所量測。在一個實施例中，包含複數個如本文所揭示之POEGMA-PAL結合物之組合物可具有約1200 kDa之M w，如藉由SEC-MALS所量測。
在一個實施例中，包含複數個如本文所揭示之POEGMA-PAL結合物之組合物可具有約1100 kDa至約1700 kDa，諸如約1100 kDa至約1300 kDa、約1100 kDa至約1400 kDa、約1100 kDa至約1500 kDa或約1100 kDa至約1600 kDa之M n，如藉由SEC-MALS所量測。在一個實施例中，包含複數個如本文所揭示之POEGMA-PAL結合物之組合物可具有約1100 kDa之M n，如藉由SEC-MALS所量測。在一個實施例中，包含複數個如本文所揭示之POEGMA-PAL結合物之組合物可具有約1200 kDa之M w，如藉由SEC-MALS所量測。在一個實施例中，包含複數個如本文所揭示之POEGMA-PAL結合物之組合物可具有約1300 kDa之M w，如藉由SEC-MALS所量測。在一個實施例中，包含複數個如本文所揭示之POEGMA-PAL結合物之組合物可具有約1400 kDa之M w，如藉由SEC-MALS所量測。在一個實施例中，包含複數個如本文所揭示之POEGMA-PAL結合物之組合物可具有約1500 kDa之M w，如藉由SEC-MALS所量測。在一個實施例中，包含複數個如本文所揭示之POEGMA-PAL結合物之組合物可具有約1600 kDa之M w，如藉由SEC-MALS所量測。在一個實施例中，包含複數個如本文所揭示之POEGMA-PAL結合物之組合物可具有約1700 kDa之M w，如藉由SEC-MALS所量測。
在另一態樣中，包含複數個POEGMA-PAL結合物之組合物的特徵可在於其多分散性指數(PDI)，其為組合物之重均分子量(M w)除以組合物之數均分子量(M n)。有利地，當使用RAFT製備預結合聚合物( 例如，式(IV))時，所得預結合聚合物之組合物之M w與其M n實質上相同，由此具有約1之PDI。因此，在POEGMA與PAL結合後，包含複數個POEGMA-PAL結合物之組合物的特徵可在於約1之PDI。在某些實施例中，包含複數個POEGMA-PAL結合物之組合物之特徵可在於PDI為約1至約1.1。在某些實施例中，包含複數個POEGMA-PAL結合物之組合物之特徵可在於PDI為約1至約1.05。不希望受理論束縛，據信根據本文所揭示之方法( 例如，RAFT聚合，諸如RAFT光聚合)製備POEGMA-PAL組合物允許高度控制聚合製程，且尤其聚合度( 例如，式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)、(Ia-1-1)、(III)、(IV)及(V)中之y值)。
5.4 POEGMA-PAL 結合物之醫藥組合物如本文所述之POEGMA-PAL結合物可用於治療有需要之個體的疾病、疾患或病症。因此，在另一態樣中，本揭示案提供一種醫藥組合物，其包含治療有效量之如第5.3節中之任何實施例中所述的組合物，該組合物包含複數個式(I)之POEGMA-PAL結合物： (I)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶； R 1為連接體； R 2為端帽； x為1至約21之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數， 及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。
在另一實施例中，本揭示案提供一種醫藥組合物，其包含治療有效量之如第5.3節中之任何實施例中所述的組合物，該組合物包含複數個式(I)之POEGMA-PAL結合物： (I)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶； R 1為連接體； R 2為端帽； x為1至約32之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數， 及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。
在式(I)中，連接體R 1可為CH 2、C(O)-C 1-12烷基-NH、C(O)-(O-CH 2-CH 2) n，其中n為2或3，或肽可裂解間隔子，諸如Gly-Gly-Phe-Gly (SEQ ID NO:5)。在一個實施例中，R 1為C(O)-C 1-12烷基-NH。
在一個實施例中，R 1為C(O)-C 1-12烷基-NH。在一個實施例中，該醫藥組合物包含治療有效量之如第5.3節中之任何實施例中所述的組合物，該組合物包含複數個式(I')之POEGMA-PAL結合物： (I’)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶； R 2為端帽； m為約3至約12之整數； x為1至約21之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
在另一實施例中，該醫藥組合物包含治療有效量之如第5.3節中之任何實施例中所述的組合物，該組合物包含複數個式(I’)之POEGMA-PAL結合物： (I’)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶； R 2為端帽； m為約3至約12之整數； x為1至約32之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
在上述式中之任一者中，m為3、4、5、6、7、8、9、10、11或12，諸如3至10、3至8或3至5之整數。在一個實施例中，m為5。
在一個實施例中，R 1為C(O)-(CH 2) 5-NH。在一個實施例中，該醫藥組合物包含治療有效量之如第5.3節中之任何實施例中所述的組合物，該組合物包含複數個式(Ia)之POEGMA-PAL結合物： (Ia)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶； R 2為端帽； x為1至約21之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
在另一實施例中，該醫藥組合物包含治療有效量之如第5.3節中之任何實施例中所述的組合物，該組合物包含複數個式(Ia)之POEGMA-PAL結合物： (Ia)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶； R 2為端帽； x為1至約32之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
在式(I)、(I’)或(Ia)中之一個實施例中，R 2為異丁腈、4-氰基戊酸、4-甲氧基-2,4-二甲基戊腈或羥基(-OH)。在一個實施例中，R 2為異丁腈。
在一個實施例中，該醫藥組合物包含治療有效量之如第5.3節中之任何實施例中所述的組合物，該組合物包含複數個式(Ia-1)之POEGMA-PAL結合物： (Ia-1)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶； x為1至約21之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
在另一實施例中，該醫藥組合物包含治療有效量之如第5.3節中之任何實施例中所述的組合物，該組合物包含複數個式(Ia-1)之POEGMA-PAL結合物： (Ia-1)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶； x為1至約32之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
在式(I)、(I')、(Ia)或(Ia-1)之一個實施例中，z為2至約10，諸如2至約8或2至約5。在一個實施例中，z為2。在一個實施例中，該醫藥組合物包含治療有效量之如第5.3節中之任何實施例中所述的組合物，該組合物包含複數個式(Ia-1-1)之POEGMA-PAL結合物： (Ia-1-1)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶； x為1至約21之整數；且 y為約50至約500之整數。
在另一實施例中，該醫藥組合物包含治療有效量之如第5.3節中之任何實施例中所述的組合物，該組合物包含複數個式(Ia-1-1)之POEGMA-PAL結合物： (Ia-1-1)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶； x為1至約32之整數；且 y為約50至約500之整數。
在式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)或(Ia-1-1)或式(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者的一個實施例中，PAL為來自原核生物體之野生型PAL，包括但不限於來自以下之PAL：海藻鏈黴菌、點狀念珠藻、多變魚腥藻、構巢囊藻、發光光桿菌TT01及輪枝鏈黴菌。在一個實施例中，PAL為野生型PAL酶之片段、突變體、變異體或類似物，其保留類似( 例如，至少50%)或增加之苯丙胺酸催化活性。在一個實施例中，PAL為來自多變魚腥藻(SEQ ID NO:1)之原核PAL或其生物活性片段、突變體、變異體或類似物。在某些實施例中，PAL為多變魚腥藻PAL (AvPAL)變異體。在一個實施例中，PAL為AvPAL變異體，其中一或多個胺基酸殘基已經另一胺基酸殘基取代。在一些實施例中，AvPAL變異體之一或多個半胱胺酸殘基經絲胺酸殘基取代。在一些實施例中，AvPAL變異體中經一或多個絲胺酸殘基取代之一或多個半胱胺酸殘基選自由位置503及565處之半胱胺酸殘基組成之群。在一個實施例中，PAL之各次單元具有根據SEQ ID NO:2之胺基酸序列。在一個實施例中，PAL之各次單元具有根據SEQ ID NO:3之胺基酸序列。在一個實施例中，PAL之各次單元具有根據SEQ ID NO:4之胺基酸序列。
x、y及z可如上文針對式(I)、(V)及(VI)所定義。在式(I')、(Ia)、(Ia-1)及(Ia-1-1)之一個實施例中，x為約5至約32、約8至約32、約10至約32、約16至約32、約19至約32、約24至約32或約28至約32之整數。在式(I')、(Ia)、(Ia-1)及(Ia-1-1)之一個實施例中，x為約5至約28、約8至約28、約10至約28、約16至約28、約19至約28、約24至約28之整數。在式(I')、(Ia)、(Ia-1)及(Ia-1-1)之一個實施例中，x為約5至約24、約8至約24、約10至約24、約16至約24或約19至約24之整數。在一個實施例中，y為約50至約500，諸如約150至約300或約175至約200之整數。在一個實施例中，z為2至約10，諸如2至約8或2至約5之整數。在一個實施例中，z為2。本揭示案涵蓋x、y及z之任何組合。
在式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)及(Ia-1-1)之任何實施例中，x可為5至約21，諸如約8至約21、約10至約21、約16至約21或約19至約21之整數。在任何實施例中，y可為約50至約500，諸如約150至約300或約175至約200之整數。在式(I)、(I')、(Ia)及(Ia-1)之任何實施例中，z可為約2至約10、約2至約8或2至約5。在一個實施例中，z為2。本揭示案涵蓋x、y及z之任何組合。
包含治療有效量之如第5.3節中之任何實施例中所述的組合物(包含複數個POEGMA-PAL結合物)之醫藥組合物可包含任何醫藥學上可接受之賦形劑或賦形劑之組合。可與複數個如本文所揭示之POEGMA-PAL結合物一起包括在醫藥組合物中之醫藥學上可接受之賦形劑的非限制性實例包括液體，諸如水、鹽水、甘油、聚乙二醇、玻尿酸、乙醇、環糊精、改性環糊精及諸如此類 。適用於非液體調配物之賦形劑亦為熟習此項技術者已知的。
輔助劑(諸如潤濕劑或乳化劑、緩衝劑、表面活性劑及諸如此類)可存在於包含複數個POEGMA-PAL結合物之醫藥組合物中。緩衝劑可為藥理學上可接受之溶液，且其賦予醫藥組合物所需pH ( 例如，在生理學上可接受範圍內之pH)。緩衝溶液之實例包括但不限於鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、Tris緩衝鹽水、漢克氏緩衝鹽水(Hank's buffered saline)及諸如此類。
端視預期投與模式而定，包含複數個POEGMA-PAL結合物之醫藥組合物可呈液體劑型之形式，諸如液體、溶液、懸浮液、乳膏、軟膏、洗劑或諸如此類。在某些實施例中，劑型為適於單次投與精確劑量之POEGMA-PAL結合物之單位劑型。在某些實施例中，醫藥組合物呈液體形式。在某些實施例中，醫藥組合物呈懸浮液形式。
對於非經腸投與，組合物通常將採取液體溶液或懸浮液形式、適於在注射前在液體中重構、溶解或懸浮之固體或凍乾形式，或呈乳液形式。無菌可注射懸浮液可根據此項技術中已知之技術使用合適載劑、分散或潤濕劑及懸浮劑來調配。無菌可注射調配物亦可為於無毒非經腸可接受之稀釋劑或溶劑中之無菌可注射溶液或懸浮液。可採用之可接受之媒劑及溶劑為水、林格氏溶液(Ringer's solution)及等滲氯化鈉溶液。此外，無菌、不揮發油、脂肪酯或多元醇通常用作溶劑或懸浮介質。此外，非經腸投與可涉及使用緩慢釋放或持續釋放系統。
包含POEGMA-PAL結合物之醫藥組合物可包含緩衝劑以將醫藥組合物( 例如，溶液)之pH維持在期望範圍內。適宜緩衝劑之非限制性實例包括tris-HCl、乙酸鈉、磷酸鈉及檸檬酸鈉。亦可使用此等緩衝劑之混合物。可用於醫藥組合物中之緩衝劑的量很大程度上視所用之特定緩衝液及醫藥組合物( 例如，溶液)之pH而定。在一個實施例中，醫藥組合物之pH為約pH 6.0-8.5。在一個實施例中，醫藥組合物之pH為約pH 7.0-8.0。在一個實施例中，醫藥組合物之pH為約pH 7.0-7.6。
視情況，醫藥組合物可包含一或多種穩定劑，其為穩定本揭示案之POEGMA-PAL組合物之分子。如本文所用之術語「穩定(stabilize)」或「穩定(stabilizes)」意欲包括例如但不限於增加POEGMA-PAL結合物的組合物之保存期限、保護POEGMA-PAL結合物之組合物的PAL酶免受蛋白水解消化、將POEGMA-PAL結合物之組合物之PAL酶維持在活性構形，且在高溫下儲存後保持PAL酶活性。可包括在本文所揭示之醫藥組合物中之合適穩定劑包括但不限於L-苯丙胺酸(Phe)及其結構類似物，諸如反式-肉桂酸(t-CA)、苯甲酸、酪胺酸(Tyr)及諸如此類。
在一個實施例中，本揭示案之POEGMA-PAL醫藥組合物包含複數個根據本文所揭示之任何實施例的POEGMA-PAL結合物( 例如，式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)或(Ia-1-1)、或式(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者)，以液體組合物形式提供。在一個實施例中，本揭示案之POEGMA-PAL醫藥組合物包含複數個根據本文所揭示之任何實施例的POEGMA-PAL結合物( 例如，式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)或(Ia-1-1)、或式(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者)，以注射用溶液形式提供。
在某些實施例中，本揭示案之POEGMA-PAL醫藥組合物包含複數個根據本文所揭示之任何實施例的POEGMA-PAL結合物( 例如，式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)、(Ia-1-1)、或(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者)、氯化鈉、反式-肉桂酸、胺丁三醇及胺丁三醇鹽酸鹽。
如本文所論述且如實例中所證明，本文所述之POEGMA-PAL結合物( 例如，式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)或(Ia-1-1)、或式(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者)可以高濃度製備，同時維持低黏度，由此提供可經由注射，尤其經由其中體積有限之注射途徑( 例如，經調配用於皮下或肌內投與)向個體提供更高劑量之機制。舉例而言，在一個實施例中，包含20 mg/mL或更少之複數個POEGMA-PAL結合物(在tris緩衝液(20 mM，含136 mM NaCl)中)之醫藥組合物展現出10 cP或更低的黏度。在一個實施例中，包含20 mg/mL或更少之複數個POEGMA-PAL結合物之醫藥組合物展現出1 cP至10 cP的黏度。在一個實施例中，包含20 mg/mL至60 mg/mL之複數個POEGMA-PAL結合物(在tris緩衝液(20 mM，含136 mM NaCl)中)之醫藥組合物展現出70 cP或更低的黏度。在一個實施例中，包含20 mg/mL至60 mg/mL之複數個POEGMA-PAL結合物之醫藥組合物展現出1 cP至70 cP的黏度。黏度可藉由此項技術中之任何已知方法，例如使用黏度計來量測。
因此，本文提供醫藥組合物，其包含複數個如本文所揭示之式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)或(Ia-1-1)、或式(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者的POEGMA-PAL結合物及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑。在一個實施例中，醫藥組合物包含約20 mg/mL至約60 mg/mL之複數個如本文所揭示的式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)或(Ia-1-1)、或式(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者的POEGMA-PAL結合物及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑。在一個實施例中，醫藥學上可接受之賦形劑為水性緩衝液。在一個實施例中，緩衝液為Tris緩衝液。在某些實施例中，醫藥組合物包含約20 mg/mL至約60 mg/mL之複數個如本文所揭示的式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)或(Ia-1-1)、或式(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者的POEGMA-PAL結合物及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑，且具有約1 cP至約70 cP，諸如約5 cP至約70 cP之黏度。在某些實施例中，醫藥組合物包含約20 mg/mL至約60 mg/mL之複數個如本文所揭示的式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)、(Ia-1-1)、或(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者的POEGMA-PAL結合物及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑，且具有約4 cP至約65 cP之黏度。在某些實施例中，醫藥組合物包含約20 mg/mL至約40 mg/mL之複數個如本文所揭示的(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)或(Ia-1-1)、或式(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者的POEGMA-PAL結合物及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑，且具有約5 cP至約20 cP之黏度。
在一個實施例中，醫藥組合物係以單位劑型提供，其中該單位劑型含有約0.5 mL至約1.5 mL之醫藥組合物，該醫藥組合物包含約20 mg/mL至約60 mg/mL之複數個如本文所揭示的式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)或(Ia-1-1)、或式(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者的POEGMA-PAL結合物及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑。在一個實施例中，醫藥組合物以套組提供，該套組包含一或多個單位劑型，及用於向個體投與( 例如，注射)該醫藥組合物之裝置，該一或多個單位劑型含有約0.5 mL至約1.5 mL之醫藥組合物，該醫藥組合物包含約20 mg/mL至約60 mg/mL之複數個如本文所揭示的式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)或(Ia-1-1)、或式(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者的POEGMA-PAL結合物及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑。在一個實施例中，用於投與之裝置為注射器。在一個實施例中，注射器包含0.5 mL至1.5 mL之醫藥組合物。
在一個實施例中，POEGMA-PAL醫藥組合物包含複數個式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)及(Ia-1-1)中之任一者及式(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者的POEGMA-PAL結合物，以液體組合物， 例如懸浮液或溶液形式提供。在一個實施例中，POEGMA-PAL醫藥組合物包含複數個式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)及(Ia-1-1)中之任一者及式(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者的POEGMA-PAL結合物，以注射用溶液形式提供。在一個實施例中，注射為皮下注射。在一個實施例中，POEGMA-PAL醫藥組合物包含濃度為約20 mg/mL的複數個式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)及(Ia-1-1)中之任一者及式(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者的POEGMA-PAL結合物。在一個實施例中，POEGMA-PAL醫藥組合物包含濃度為約20 mg/mL的複數個式(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者的POEGMA-PAL結合物。
5.5 POEGMA-PAL 結合物之治療用途有利地，且如實例中所證明，本文所揭示之POEGMA-PAL結合物(包含PAL及與其結合之複數個式(V)之瓶刷聚合物連接體-POEGMA)似乎比其他已知的基於PAL之療法(諸如培伐利酶)引起的免疫反應低。POEGMA-PAL結合物及其醫藥組合物另外展示出與其他已知的基於PAL之療法(諸如培伐利酶)相比改良之藥物動力學( 例如，更快的T max)。又進一步，本文所揭示之POEGMA-PAL結合物之醫藥組合物可以比其他已知的基於PAL之療法(諸如培伐利酶)更高的濃度調配，且仍展現適合經由注射體積有限之方法( 例如，皮下及肌內注射)投與之黏度。
PKU係以PAH缺乏為標誌之病症。熟習此項技術者應理解，PAH缺乏症包括不同嚴重程度之PKU及高苯丙胺酸血症(HPA) (Camp等人, Mol Genet Metab. 112(2):87-122(2014)；Kayaalp等人, Am J Hum Genet. 61:1309-17 (1997)；及Guldberg等人, Am J Hum Genet. 63:71-9(1998)，其各自以全文引用方式併入本文)，該等病症阻止身體處理苯丙胺酸(苯丙胺酸為一種在所有含蛋白質食物中發現的必需胺基酸)，這歸因於將苯丙胺酸轉化為酪胺酸之肝酶PAH之活性降低或缺乏。PAH缺乏症包括特徵在於PAH活性完全或接近完全缺乏之病症，其中個體可耐受小於20 mg/kg/天之膳食苯丙胺酸以將苯丙胺酸之血液濃度保持在≤ 300 μmol/L之安全水準( 例如，經典PKU)以及具有較高耐受水準之不太嚴重形式，諸如中度PKU， 例如具有約45-50 mg/kg/天膳食苯丙胺酸之耐受性，輕度PKU， 例如具有約55 mg/kg/天膳食苯丙胺酸之耐受性，或輕度高苯丙胺酸血症(HPA)-灰色區， 例如具有約70 mg/kg/天膳食苯丙胺酸之耐受性。
在一個態樣中，本文揭示一種治療個體之PAH缺乏症的方法，該方法包含向個體投與醫藥組合物， 例如，包含根據第5.3節中之任何實施例之組合物，該組合物包含治療有效量的複數個式(I)之POEGMA-PAL結合物： (I)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶； R 1為連接體； R 2為端帽； x為1至約32之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
在一個實施例中，連接體R 1為C(O)-C 1-12烷基-NH。在一個實施例中，R 1為C(O)-(CH 2) 5-NH。因此，在一個實施例中，治療個體之PAH缺乏症的方法包含向個體投與醫藥組合物， 例如，包含根據第5.3節中之任何實施例之組合物，該組合物包含治療有效量的複數個式(Ia)之POEGMA-PAL結合物： (Ia)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶； R 2為端帽； x為1至約32之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
在一個實施例中，端帽R 2為4-氰基戊酸、4-甲氧基-2,4-二甲基戊腈或羥基(-OH)。在一個實施例中，R 2為異丁腈。因此，在一個實施例中，治療個體之PAH缺乏症的方法包含向個體投與醫藥組合物， 例如，包含根據第5.3節中之任何實施例之組合物，該組合物包含治療有效量的複數個式(Ia-1)之POEGMA-PAL結合物： (Ia-1)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶； x為1至約32之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
在一個實施例中，z為2至約10。在一個實施例中，z為2至約8，諸如2至約5之整數。在某些實施例中，z為2。
在一個實施例中，治療個體之PAH缺乏症的方法包含向個體投與醫藥組合物， 例如，包含根據第5.3節中之任何實施例之組合物，該組合物包含治療有效量的複數個式(Ia-1-1)之POEGMA-PAL結合物： (Ia-1-1)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶； x為1至約32之整數；且 y為約50至約500之整數。
x及y可如上文針對式(I)、(V)及(VI)所定義。在式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)及(Ia-1-1)之某些實施例中，x可為約5至約32、約8至約32、約10至約32、約16至約32、約19至約32、約24至約32、約28至約32、約5至約28、約8至約28、約10至約28、約16至約28、約19至約28、約24至約28、約5至約24、約8至約24、約10至約24、約16至約24、約19至約24、約5至約21、約8至約21、約10至約21、約16至約21或約19至約21之整數。在一個實施例中，x為約19。在一個實施例中，x為約20。在一個實施例中，x為約21。在一個實施例中，y為約150至約300或約175至約200之整數。本揭示案涵蓋x及y之任何組合。
在一個實施例中，治療個體之PAH缺乏症的方法包含向個體投與醫藥組合物， 例如，包含根據第5.3節中之任何實施例之組合物，該組合物包含治療有效量的複數個 表A中示出的式(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之一或多者之POEGMA-PAL結合物。
在使用式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)及(Ia-1-1)中之任一者或式(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者治療PAH缺乏症的一個實施例中，個體患有PKU或HPA。在一些實施例中，個體之血液苯丙胺酸水準為約300 μmol/L至約350 μmol/L。在一些實施例中，個體之血液苯丙胺酸水準為約350 μmol/L至約400 μmol/L 在一些實施例中，個體之血液苯丙胺酸水準為約400 μmol/L至約450 μmol/L。在一些實施例中，個體之血液苯丙胺酸水準為約450 μmol/L至約500 μmol/L。在一些實施例中，個體之血液苯丙胺酸水準為約500 μmol/L至約550 μmol/L。在一些實施例中，個體之血液苯丙胺酸水準為約550 μmol/L至約600 μmol/L。在一些實施例中，個體之血液苯丙胺酸水準大於約350 μmol/L。在一些實施例中，個體之血液苯丙胺酸水準大於約360 μmol/L。在一些實施例中，個體之血液苯丙胺酸水準大於約370 μmol/L。在一些實施例中，個體之血液苯丙胺酸水準大於約380 μmol/L。在一些實施例中，個體之血液苯丙胺酸水準大於390 μmol/L。在一些實施例中，個體之血液苯丙胺酸水準大於約400 μmol/L。在一些實施例中，個體之血液苯丙胺酸水準大於約600 μmol/L。
在一個實施例中，PKU為經典PKU， 例如，個體具有小於約20 mg/kg/天之膳食苯丙胺酸之耐受性以將苯丙胺酸的血液濃度保持在安全水準， 例如≤ 300 μmol/L。在一個實施例中，PKU為中度PKU， 例如，個體具有約45-50 mg/kg/天之膳食苯丙胺酸之耐受性以將苯丙胺酸的血液濃度保持在安全水準， 例如≤ 300 μmol/L。在一個實施例中，PKU為輕度PKU， 例如，個體具有約55 mg/kg/天之膳食苯丙胺酸之耐受性以將苯丙胺酸的血液濃度保持在安全水準， 例如≤ 300 μmol/L。在一個實施例中，HPA為中度HPA灰色區， 例如，個體具有約70 mg/kg /天之膳食苯丙胺酸之耐受性以將苯丙胺酸的血液濃度保持在安全水準， 例如≤ 300 μmol/L。在一個實施例中，向個體投與醫藥組合物以治療PAH缺乏症，該醫藥組合物包含濃度為約20 mg/mL至約60 mg/mL的複數個式(I)、(Ia)、(Ia-1)、(Ia-1-1)、或(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者的POEGMA-PAL結合物。在一個實施例中，醫藥組合物以約0.5 mL至約1.5 mL之量向個體投與。在一個實施例中，藉由注射向個體投與醫藥組合物。在一個實施例中，注射為皮下注射。在一個實施例中，使用包含醫藥組合物之預填充注射器向個體投與醫藥組合物。在一個實施例中，POEGMA-PAL結合物中之PAL的各次單元具有根據SEQ ID NO:4之胺基酸序列。
本文亦考慮複數個根據第5.1節中之任何實施例的POEGMA-PAL結合物，諸如式(I)、(Ia)、(Ia-1)、(Ia-1-1)、或(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者的POEGMA-PAL結合物、根據第5.3節中之任何實施例的組合物或根據第5.4節中之任何實施例的醫藥組合物在製造用於治療個體之PAH缺乏症之藥劑中的用途。
本文亦考慮用於治療個體之PAH缺乏症的方法之複數個根據第5.1節中之任何實施例的POEGMA-PAL結合物，諸如式(I)、(Ia)、(Ia-1)、(Ia-1-1)、或(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者的POEGMA-PAL結合物、根據第5.3節中之任何實施例的組合物或根據第5.4節中之任何實施例的醫藥組合物。
在另一態樣中，本揭示案提供一種治療PKU之方法。舉例而言，本文所揭示之POEGMA-PAL結合物可用於降低個體之血液苯丙胺酸濃度的方法中，其中該等方法包含向患者投與POEGMA-PAL結合物。
因此，在另一態樣中，本揭示案提供一種治療個體之PKU的方法，該方法包含向個體投與醫藥組合物， 例如，包含根據第5.3節中之任何實施例之組合物，該組合物包含治療有效量的複數個式(I)之POEGMA-PAL結合物： (I)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶； R 1為連接體； R 2為端帽； x為1至約32之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
在一個實施例中，個體患有PKU，且向個體投與複數個POEGMA-PAL結合物可有效地治療PKU。在一個實施例中，POEGMA-PAL之投與係經由注射，諸如皮下或肌內注射。在一個實施例中，醫藥組合物包含濃度為約20 mg/mL至約60 mg/mL之複數個POEGMA-PAL結合物。在一個實施例中，醫藥組合物包含濃度為約20 mg/mL至約60 mg/mL的複數個POEGMA-PAL結合物，且以約0.5 mL至約1.5 mL之量向個體投與。在一個實施例中，醫藥組合物包含濃度為約20 mg/mL至約60 mg/mL的複數個POEGMA-PAL結合物，且使用包含醫藥組合物之預填充注射器以約0.5 mL至約1.5 mL之量向個體投與。
在一個實施例中，POEGMA-PAL結合物具有如根據第5.1節中之任何實施例所述之式(Ia-1-1)。在一個實施例中，x為約19至約21之整數。在一個實施例中，y為約175至約200之整數。在一個實施例中，POEGMA-PAL結合物中之PAL的各次單元具有根據SEQ ID NO:4之胺基酸序列。
在一個實施例中，連接體R 1為C(O)-C 1-12烷基-NH。在一個實施例中，R 1為C(O)-(CH 2) 5-NH。因此，在一個實施例中，治療個體之PKU的方法包含向個體投與醫藥組合物， 例如，包含根據第5.3節中之任何實施例之組合物，該組合物包含治療有效量的複數個式(Ia)之POEGMA-PAL結合物： (Ia)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶； R 2為端帽； x為1至約32之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
在一個實施例中，端帽R 2為4-氰基戊酸、4-甲氧基-2,4-二甲基戊腈或羥基(-OH)。在一個實施例中，R 2為異丁腈。因此，在一個實施例中，治療個體之PKU的方法包含向個體投與醫藥組合物， 例如，包含根據第5.3節中之任何實施例之組合物，該組合物包含治療有效量的複數個式(Ia-1)之POEGMA-PAL結合物： (Ia-1)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶； x為1至約32之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
在一個實施例中，z為2至約10。在一個實施例中，z為2至約8，諸如2至約5之整數。在某些實施例中，z為2。
在一個實施例中，治療個體之PKU的方法包含向個體投與醫藥組合物， 例如，包含根據第5.3節中之任何實施例之組合物，該組合物包含治療有效量的複數個式(Ia-1-1)之POEGMA-PAL結合物： (Ia-1-1)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶； x為1至約32之整數；且 y為約50至約500之整數。
x及y可如上文針對式(I)、(V)及(VI)所定義。在式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)及(Ia-1-1)之某些實施例中，x可為約5至約32、約8至約32、約10至約32、約16至約32、約19至約32、約24至約32、約28至約32、約5至約28、約8至約28、約10至約28、約16至約28、約19至約28、約24至約28、約5至約24、約8至約24、約10至約24、約16至約24、約24至約24、約5至約21、約8至約21、約10至約21、約16至約12或約19至約21之整數。在一個實施例中，x為約19。在一個實施例中，x為約20。在一個實施例中，x為約21。在一個實施例中，y為約150至約300或約175至約200之整數。本揭示案涵蓋x及y之任何組合。
在一個實施例中，治療個體之PKU的方法包含向個體投與醫藥組合物， 例如，包含根據第5.3節中之任何實施例之組合物，該組合物包含治療有效量的複數個 表A中示出的式(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之一或多者之POEGMA-PAL結合物。
在使用式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)及(Ia-1-1)中之任一者或式(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者治療PKU的一個實施例中，個體之血液苯丙胺酸水準大於360 μmol/L。在一些實施例中，個體之血液苯丙胺酸水準為約300 μmol/L至約350 μmol/L。在一些實施例中，個體之血液苯丙胺酸水準為約350 μmol/L至約400 μmol/L 在一些實施例中，個體之血液苯丙胺酸水準為約400 μmol/L至約450 μmol/L。在一些實施例中，個體之血液苯丙胺酸水準為約450 μmol/L至約500 μmol/L。在一些實施例中，個體之血液苯丙胺酸水準為約500 μmol/L至約550 μmol/L。在一些實施例中，個體之血液苯丙胺酸水準為約550 μmol/L至約600 μmol/L。在一些實施例中，個體之血液苯丙胺酸水準大於約350 μmol/L。在一些實施例中，個體之血液苯丙胺酸水準大於約370 μmol/L。在一些實施例中，個體之血液苯丙胺酸水準大於約380 μmol/L。在一些實施例中，個體之血液苯丙胺酸水準大於390 μmol/L。在一些實施例中，個體之血液苯丙胺酸水準大於約400 μmol/L。在一些實施例中，個體之血液苯丙胺酸水準大於約600 μmol/L。
在一個實施例中，PKU為經典PKU， 例如，個體具有小於約20 mg/kg/天之膳食苯丙胺酸之耐受性以將苯丙胺酸的血液濃度保持在安全水準， 例如≤ 300 μmol/L。在一個實施例中，PKU為中度PKU， 例如，個體具有約45-50 mg/kg/天之膳食苯丙胺酸之耐受性以將苯丙胺酸的血液濃度保持在安全水準， 例如≤ 300 μmol/L。在一個實施例中，PKU為輕度PKU， 例如，個體具有約55 mg/kg/天之膳食苯丙胺酸之耐受性以將苯丙胺酸的血液濃度保持在安全水準， 例如≤ 300 μmol/L。在一個實施例中，向個體投與醫藥組合物以治療PKU，該醫藥組合物包含濃度為約20 mg/mL至約60 mg/mL的複數個式(I)、(Ia)、(Ia-1)、(Ia-1-1)、或(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者的POEGMA-PAL結合物。在一個實施例中，醫藥組合物以約0.5 mL至約1.5 mL之量向個體投與。在一個實施例中，藉由注射向個體投與醫藥組合物。在一個實施例中，注射為皮下注射。在一個實施例中，使用包含醫藥組合物之預填充注射器向個體投與醫藥組合物。在一個實施例中，POEGMA-PAL結合物中之PAL的各次單元具有根據SEQ ID NO:4之胺基酸序列。
本文亦考慮複數個根據第5.1節中之任何實施例的POEGMA-PAL結合物，諸如式(I)、(Ia)、(Ia-1)、(Ia-1-1)、或(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者的POEGMA-PAL結合物、根據第5.3節中之任何實施例的組合物或根據第5.4節中之任何實施例的醫藥組合物在製造用於治療個體之PKU之藥劑中的用途。
本文亦考慮用於治療個體之PKU的方法之複數個根據第5.1節中之任何實施例的POEGMA-PAL結合物，諸如式(I)、(Ia)、(Ia-1)、(Ia-1-1)、或(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者的POEGMA-PAL結合物、根據第5.3節中之任何實施例的組合物或根據第5.4節中之任何實施例的醫藥組合物。
在另一態樣中，本揭示案提供一種降低個體之血液苯丙胺酸濃度的方法，該方法包含向個體投與根據第5.4節中之任何實施例之醫藥組合物，該醫藥組合物包含治療有效量的複數個式(I)之POEGMA-PAL結合物： (I)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶； R 1為連接體； R 2為端帽； x為1至約21之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
在另一實施例中，降低個體之血液苯丙胺酸濃度的方法包含向個體投與治療有效量的複數個式(I)之POEGMA-PAL結合物： (I)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶； R 1為連接體； R 2為端帽； x為1至約32之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
在一個實施例中，個體患有PKU，且向個體投與複數個POEGMA-PAL結合物可有效地治療PKU。在一個實施例中，POEGMA-PAL之投與係經由注射，諸如皮下或肌內注射。在一個實施例中，醫藥組合物包含濃度為約20 mg/mL至約60 mg/mL之複數個POEGMA-PAL結合物。在一個實施例中，醫藥組合物包含濃度為約20 mg/mL至約60 mg/mL的複數個POEGMA-PAL結合物，且以約0.5 mL至約1.5 mL之量向個體投與。在一個實施例中，醫藥組合物包含濃度為約20 mg/mL至約60 mg/mL的複數個POEGMA-PAL結合物，且使用包含醫藥組合物之預填充注射器以約0.5 mL至約1.5 mL之量向個體投與。
在一個實施例中，POEGMA-PAL結合物具有如根據第5.1節中之任何實施例所述之式(Ia-1-1)。在一個實施例中，x為約19至約21之整數。在一個實施例中，y為約175至約200之整數。在一個實施例中，POEGMA-PAL結合物中之PAL的各次單元具有根據SEQ ID NO:4之胺基酸序列。
在一個實施例中，連接體R 1為C(O)-C 1-12烷基-NH。在一個實施例中，R 1為C(O)-(CH 2) 5-NH。因此，在一個實施例中，降低個體之血液苯丙胺酸濃度( 例如，以治療PKU)的方法包含向個體投與如第5.4節中之任何實施例所述的醫藥組合物，該醫藥組合物包含治療有效量的複數個式(Ia)之POEGMA-PAL結合物： (Ia)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶； R 2為端帽； x為1至約21之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
在另一個實施例中，降低個體之血液苯丙胺酸濃度( 例如，以治療PKU)的方法包含向個體投與醫藥組合物，該醫藥組合物包含治療有效量的複數個式(Ia)之POEGMA-PAL結合物： (Ia)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶； R 2為端帽； x為1至約32之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
在一個實施例中，端帽R 2為4-氰基戊酸、4-甲氧基-2,4-二甲基戊腈或羥基(-OH)。在一個實施例中，R 2為異丁腈。因此，在一個實施例中，降低個體之血液苯丙胺酸濃度( 例如，以治療PKU)的方法包含向個體投與醫藥組合物， 例如，包含根據第5.3節中之任何實施例之組合物，該組合物包含治療有效量的複數個式(Ia-1)之POEGMA-PAL結合物： (Ia-1)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶； x為1至約21之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
在另一個實施例中，降低個體之血液苯丙胺酸濃度( 例如，以治療PKU)的方法包含向個體投與醫藥組合物，該醫藥組合物包含治療有效量的複數個式(Ia-1)之POEGMA-PAL結合物： (Ia-1)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶； x為1至約32之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
在一個實施例中，z為2至約10。在一個實施例中，z為2至約8，諸如2至約5之整數。在某些實施例中，z為2。
在一個實施例中，降低個體之血液苯丙胺酸濃度( 例如，以治療PKU)的方法包含向個體投與醫藥組合物， 例如，包含根據第5.3節中之任何實施例之組合物，該組合物包含治療有效量的複數個式(Ia-1-1)之POEGMA-PAL結合物： (Ia-1-1)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶； x為1至約21之整數；且 y為約50至約500之整數。
在另一個實施例中，降低個體之血液苯丙胺酸濃度( 例如，以治療PKU)的方法包含向個體投與醫藥組合物，該醫藥組合物包含治療有效量的複數個式(Ia-1-1)之POEGMA-PAL結合物： (Ia-1-1)， 其中： PAL為原核苯丙胺酸解氨酶； x為1至約32之整數；且 y為約50至約500之整數。
x及y可如上文針對式(I)、(V)及(VI)所定義。在式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)及(Ia-1-1)之某些實施例中，x可為約5至約21、8至約21、約10至約21、約16至約21或約19至約21之整數。在一個實施例中，y為約150至約300或約175至約200之整數。本揭示案涵蓋x及y之任何組合。
在某些實施例中，x為約5至約32、約8至約32、約10至約32、約16至約32、約19至約32、約24至約32、約28至約32、約5至約28、約8至約28、約10至約28、約16至約28、約19至約28、約24至約28、約5至約24、約8至約24、約10至約24、約16至約24、約19至約24、約5至約21、約8至約21、約10至約21、約16至約12或約19至約21之整數。在一個實施例中，x為約19。在一個實施例中，x為約20。在一個實施例中，x為約21。在一個實施例中，y為約150至約300或約175至約200之整數。
在一個實施例中，降低個體之血液苯丙胺酸濃度的方法包含向個體投與醫藥組合物， 例如，包含根據第5.3節中之任何實施例之組合物，該組合物包含治療有效量的複數個 表A中示出的式(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之一或多者之POEGMA-PAL結合物。
在使用式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)及(Ia-1-1)中之任一者或式(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者降低血液苯丙胺酸濃度的一個實施例中，個體之血液苯丙胺酸水準大於約300 μmol/L至約350 μmol/L。在一些實施例中，個體之血液苯丙胺酸水準為約350 μmol/L至約400 μmol/L 在一些實施例中，個體之血液苯丙胺酸水準為約400 μmol/L至約450 μmol/L。在一些實施例中，個體之血液苯丙胺酸水準為約450 μmol/L至約500 μmol/L。在一些實施例中，個體之血液苯丙胺酸水準為約500 μmol/L至約550 μmol/L。在一些實施例中，個體之血液苯丙胺酸水準為約550 μmol/L至約600 μmol/L。在一些實施例中，個體之血液苯丙胺酸水準大於約350 μmol/L。在一些實施例中，個體之血液苯丙胺酸水準大於約360 μmol/L。在一些實施例中，個體之血液苯丙胺酸水準大於約370 μmol/L。在一些實施例中，個體之血液苯丙胺酸水準大於約380 μmol/L。在一些實施例中，個體之血液苯丙胺酸水準大於390 μmol/L。在一些實施例中，個體之血液苯丙胺酸水準大於約400 μmol/L。在一些實施例中，個體之血液苯丙胺酸水準大於約600 μmol/L。
在一個實施例中，個體患有PKU。在一個實施例中，PKU為經典PKU， 例如，個體具有小於約20 mg/kg/天之膳食苯丙胺酸之耐受性以將苯丙胺酸的血液濃度保持在安全水準， 例如≤ 300 μmol/L。在一個實施例中，PKU為中度PKU， 例如，個體具有約45-50 mg/kg/天之膳食苯丙胺酸之耐受性以將苯丙胺酸的血液濃度保持在安全水準， 例如≤ 300 μmol/L。在一個實施例中，PKU為輕度PKU， 例如，個體具有約55 mg/kg/天之膳食苯丙胺酸之耐受性以將苯丙胺酸的血液濃度保持在安全水準， 例如≤ 300 μmol/L。
在一個實施例中，個體患有HPA。在一個實施例中，HPA為中度HPA灰色區， 例如，個體具有約70 mg/kg /天之膳食苯丙胺酸之耐受性以將苯丙胺酸的血液濃度保持在安全水準， 例如≤ 300 μmol/L。
本文亦考慮複數個根據第5.1節中之任何實施例的POEGMA-PAL結合物，諸如式(I)、(Ia)、(Ia-1)、(Ia-1-1)、或(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者的POEGMA-PAL結合物、根據第5.3節中之任何實施例的組合物或根據第5.4節中之任何實施例的醫藥組合物在製造用於降低個體之苯丙胺酸血漿水準之藥劑中的用途。
本文亦考慮用於降低個體之苯丙胺酸血漿水準的方法之複數個根據第5.1節中之任何實施例的POEGMA-PAL結合物諸如式(I)、(Ia)、(Ia-1)、(Ia-1-1)、或(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者的POEGMA-PAL結合物、根據第5.3節中之任何實施例的組合物或根據第5.4節中之任何實施例的醫藥組合物。
在式(I)、(I')、(Ia)、(Ia-1)、(Ia-1-1)、或(Ia-1-11)-(Ia-1-46)中之任一者的一個實施例中，PAL為來自原核生物體之野生型PAL，包括但不限於來自以下之PAL：海藻鏈黴菌、點狀念珠藻、多變魚腥藻、構巢囊藻、發光光桿菌TT01及輪枝鏈黴菌。在一個實施例中，PAL為野生型PAL酶之片段、突變體、變異體或類似物，其保留類似( 例如，至少50%)或增加之苯丙胺酸催化活性。在一個實施例中，PAL為來自多變魚腥藻(SEQ ID NO:1)之原核PAL或其生物活性片段、突變體、變異體或類似物。在某些實施例中，PAL為多變魚腥藻PAL (AvPAL)變異體。在一個實施例中，PAL為AvPAL變異體，其中一或多個胺基酸殘基已經另一胺基酸殘基取代。在一些實施例中，AvPAL變異體之一或多個半胱胺酸殘基經絲胺酸殘基取代。在一些實施例中，AvPAL變異體中經一或多個絲胺酸殘基取代之一或多個半胱胺酸殘基選自由各次單元中的位置503及565處之半胱胺酸殘基組成之群。在一個實施例中，PAL之各次單元具有根據SEQ ID NO:2之胺基酸序列。在一個實施例中，PAL之各次單元具有根據SEQ ID NO:3之胺基酸序列。在一個實施例中，PAL之各次單元具有根據SEQ ID NO:4之胺基酸序列。
POEGMA-PAL結合物對個體之給藥頻率將端視所治療之疾患而變化。在某些實施例中，POEGMA-PAL結合物(或包含其之醫藥組合物)可約每週兩次、約每週一次、約每兩週一次、約每月一次或低於約每月一次向個體投與。應理解，在任何個體中，由於不同個體對POEGMA-PAL結合物之反應之變化，經確定為最具治療性之給藥頻率可與本文所揭示之頻率不同。術語「約」意欲反映此類變化。
在某些實施例中，POEGMA-PAL結合物可以比天然PAL低之頻率向個體投與，同時仍向個體提供相等或更大的治療益處。在某些實施例中，POEGMA-PAL結合物可以比聚乙二醇化PAL低之頻率向個體投與，同時仍向個體提供相等或更大的治療益處。在某些實施例中，POEGMA-PAL結合物可以比培伐利酶低之頻率向個體投與，同時仍向個體提供相等或更大的治療益處。
在某些實施例中，降低個體之血液苯丙胺酸濃度( 例如，以治療PKU或PAH缺乏症)之方法可進一步包含 例如定期(諸如每2週、每4週、每6週、每8週或每10週)監測個體之血液苯丙胺酸水準。
在本文所提供方法之另一實施例中，向個體投與低或經改良之蛋白質飲食，或低或經改良之苯丙胺酸飲食與本文所揭示之醫藥組合物的組合，使得血漿苯丙胺酸水準降低 例如至少約25%。關於管理苯丙胺酸水準( 例如HPA及PKU)升高之患者群體的進一步資訊參見 例如美國專利第7,531,341號及第7,534,595號，在某些實施例中，該等專利可與本文所提供之方法結合使用。美國專利第7,531,341號及第7,534,595號中之每一者以全文引用方式併入本文。
6. 實例 實例1：POEGMA聚合物合成 第一例示性45 kDa POEGMA-C6-NHS合成：使用可逆加成-片段化鏈轉移(RAFT)聚合來合成45 kDa POEGMA-C6-NHS。除鏈轉移劑(CTA)外，所有試劑均購自Sigma-Aldrich：ECT-ahx-NHS (6-(4-氰基-4-(((乙硫基)硫羰基)硫基)戊醯胺基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯)，其由Sai生產。將三乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯(4.31 mmol)、CTA (19.6 μmol)及無水DMSO (4 mL)混合於聚合燒瓶(5 mL RBF)中。將聚合燒瓶用隔膜密封且用氮氣吹掃以移除氧氣。接著將燒瓶轉移至配備有藍色LED光源之攪拌盤。將燒瓶及光源封裝在錫箔中，且將燒瓶暴露於高強度藍色LED光2.5小時。經由乙醚沉澱純化所得聚合物且在真空下乾燥以產生POEGMA-C6-NHS
45 kDa POEGMA-C6-NHS 末端基團去除(EGR)：將POEGMA-C6-NHS (22.2 μmol)及偶氮雙異丁腈(2.2 mmol)溶解於無水DMSO (5 mL)中且轉移至反應燒瓶中。將反應燒瓶用隔膜密封且用氮氣吹掃以移除氧氣。將吹掃之容器轉移至60℃油浴且使其反應2小時。2小時後，將反應溶液暴露於氧氣以淬滅且經由乙醚沉澱純化且在真空下乾燥，以產生不含來自聚合中所用之RAFT鏈轉移劑之三硫代碳酸酯的POEGMA-C6-NHS。
第二例示性45 kDa POEGMA-C6-NHS合成： 化合物(5)之合成開始於使用1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺(EDC)及4-二甲基胺基吡啶(DMAP)之醯胺偶合以偶合6-胺基己酸三級丁酯(1)及鏈轉移劑4-氰基-4-(((乙硫基)硫羰基)硫基)戊酸(2)，以形成化合物3，然後將其在酸存在下Boc去保護以產生化合物4。合成之最後一步為NHS偶合以形成6-(4-氰基-4-(((乙硫基)硫羰基)硫基)戊醯胺基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(5)。接著自化合物5及6開始，在兩個步驟中獲得NHS-POEGMA，如下所示： 步驟1涉及在惰性氛圍下，在自由基引發劑AIBN存在下，化合物(5)及化合物(6)之聚合反應。一旦反應完成，即使用MTBE使POEGMA沉澱且過濾。所得粗產物藉由再沉澱、藉由首先將其溶解於DMSO中、接著使用MTBE沉澱來進一步純化。在步驟2中，在惰性氛圍下使用含AIBN之DMSO移除三硫代碳酸酯端基。反應完成後，使用MTBE使POEGMA-NHS沉澱，過濾，且使用步驟1中定義之再沉澱條件純化。
實例2：POEGMA-PAL生物結合及純化在燒瓶中稱取POEGMA-C6-NHS且在冷的無菌diH 2O中以約450 mg/mL溶劑化。將「準備好結合之」PAL緩衝液中之適當量的PAL蛋白等分至容器中，以及相當於所添加之聚合物溶液之體積的「準備好結合之」緩衝液。接著將聚合物溶液添加至在「準備好結合之」PAL緩衝液中稀釋之PAL蛋白中。添加與聚合物之PAL之次單元上表面暴露的離胺酸相比4倍莫耳過量。將反應物在室溫下在定軌振盪器上放置1小時，以允許POEGMA-C6-NHS聚合物之NHS與表面暴露的離胺酸反應且轉移至5℃儲存隔夜。經由使用100 kDa分子量截止之Hydrostart膜之切向流過濾(TFF)純化最終結合物溶液。在此過程中，將緩衝液組合物替換為由19.98 mM Tris及136 mM NaCl組成之緩衝液，pH為約7.4 (1X TBS)。
實例3：黏度評估經由m-VROC黏度計評估經純化之POEGMA-PAL結合物之黏度。在500 μL注射器中以20 ± 2 mg/mL之濃度測試於1X TBS中之結合物。亦在500 μL注射器中以各種濃度測試於1X TBS中溶劑化之POEGMA-C6-NHS。針對各樣品調整施加至注射器之剪切力，使得黏度計在其壓力限值臨限值之約80-90%下操作。
圖2報告20 kDa PEG-PAL (R h= 7 nm)、30 kDa POEGMA-PAL (R h= 2.5 nm)、45 kDa POEGMA-PAL (R h= 4 nm)及60 kDa POEGMA-PAL (R h= 6 nm)在增加濃度下之黏度。雖然PEG-PAL溶液之黏度隨著濃度增加而快速增加，但POEGMA-PAL溶液之黏度以低得多之速率增加，且即使在大於300 mg/mL PAL之濃度下，其稠度與醋(約20 cP)相似。類似地， 圖3報告具有等效濃度之PAL (20 mg/mL)但結合至不同聚合物之兩種溶液之黏度(培伐利酶對POEGMA-PAL)。值得注意的是，培伐利酶溶液具有約100 cP之黏度，而POEGMA-PAL溶液具有小於約10 cP之低得多的黏度。如熟習此項技術者將認識到，可經由皮下注射向個體投與之液體體積有限，然而，由於溶液之高黏度，一小體積遞送大劑量之治療劑通常會出現問題，因為高黏度流體不易流過注射器及針頭，且可能會在注射部位引起疼痛。然而，藉由將PEG調配為與POEGMA之結合物，可注射溶液可含有高劑量之PAL，而不會表現出易於經由皮下注射投與之高黏度。
圖4報告20 mg/mL、40 mg/mL及60 mg/mL 45 kDa POEGMA-PAL溶液之黏度與臨床劑量的培伐利酶之黏度(100 cP)的比較。60 mg/mL POEGMA-PAL溶液之黏度比用於遞送最高臨床劑量之培伐利酶之20 mg/mL PEG-PAL溶液低35%。因此，使用本文所揭示之POEGMA-PAL結合物將允許獲得每劑量三倍高濃度之POEGMA-PAL，由此將所需注射之每日次數自三次減少至一次(或更少)。
實例4：抗聚合物IgG評估使用Meso Scale Discovery®平臺來評估小鼠及人類血清樣品中之抗聚合物IgG。所進行之實驗方案示於 圖5中。在室溫下，在振盪下將MSD GOLD鏈黴抗生物素蛋白板用PBS封閉緩衝液中之150 μL酪蛋白封閉45 ± 15分鐘。在1x DPBS中以4 μg/mL之最終濃度製備生物素化POEGMA包衣溶液。在1x DPBS中以0.25 μg/mL之最終濃度製備線性PEG (20 kDa)包衣溶液。在1x DPBS中以4 μg/mL之最終濃度製備MPC溶液。在移除封閉緩衝液後，在室溫下在振盪下將50 μL生物素化POEGMA包衣溶液或線性PEG包衣溶液施加至MSD孔達60 ± 10分鐘。使用洗板機將MSD板洗滌3次以移除未結合之聚合物。在PBS中之酪蛋白中以1:10 MRD製備血清樣品。在室溫下，在振盪下將50 μL經製備之血清樣品施加至MSD孔達60 ± 10分鐘。使用洗板機將MSD板洗滌3次。在PBS中之酪蛋白中分別以0.1 μg/mL及0.5 μg/mL之最終濃度製備磺基標記之AffiniPure F(ab')₂片段山羊抗小鼠IgG (小鼠分析之偵測抗體)及AffiniPure F(ab')₂片段山羊抗人類IgG (人類分析之偵測抗體)。在室溫同時避光下，在振盪下將50 μL偵測抗體施加至MSD孔達60 ± 10分鐘。使用洗板機將MSD板洗滌3次。自含表面活性劑之4x MSD讀取緩衝液T製備1x MSD讀取緩衝液。將150 μL 1x MSD讀取緩衝液添加至MSD孔中，且在添加緩衝液後10分鐘內使用MESO QuickPlex SQ讀取板。
圖6報告小鼠單株抗PEG IgG與線性PEG、MPC及兩種不同POEGMA聚合物(E3及E9)中之每一者之交叉反應性。雖然PEG展現高免疫原性，但抗PEG IgG似乎不強烈地結合至POEGMA聚合物。
為了測試POEGMA在未經治療之個體及經培伐利酶治療之個體中的抗原性，使用Meso Scale Discovery®平臺來評估未經處理之人類血清樣品中預先存在之抗PEG及抗POEGMA IgG。在室溫下，在振盪下將MSD GOLD鏈黴抗生物素蛋白板用PBS封閉緩衝液中之150 μL酪蛋白封閉45 ± 15分鐘。在1x DPBS中以4 μg/mL之最終濃度製備生物素化POEGMA (45 kDa)包衣溶液。在1x DPBS中以0.25 ug/mL之最終濃度製備生物素化PEG (20kDa)包衣溶液。在移除封閉緩衝液後，在室溫下在振盪下將50 μL各別生物素化聚合物包衣溶液施加至MSD孔達60 ± 10分鐘。經由抽吸將MSD板洗滌3次以移除未結合之聚合物。在PBS中之酪蛋白中以1:10 MRD製備血清樣品。在室溫下，在振盪下將50 μl經製備之血清樣品施加至MSD孔達60 ± 10分鐘。接著經由抽吸將MSD板洗滌3次。將AffiniPure F(ab')₂片段山羊抗人類IgG在PBS中之酪蛋白中稀釋至0.5 ug/mL。在室溫同時避光下，在振盪下將50 μL偵測抗體施加至MSD孔達60 ± 10分鐘。經由抽吸將MSD板洗滌3次。自含表面活性劑之4x MSD讀取緩衝液T製備1x MSD讀取緩衝液。將150 μL 1x MSD讀取緩衝液添加至MSD孔中，且在添加緩衝液後10分鐘內使用MESO QuickPlex SQ讀取板。 圖7報告PEG (頂圖)及45 kDa POEGMA聚合物(底圖)以及來自經培伐利酶治療之個體之抗PEG IgG與來自經培伐利酶治療之個體之現有抗PEG IgG的交叉反應性。與PEG相比，POEGMA聚合物不與存在於經培伐利酶治療之個體之血漿中的抗PEG IgG發生交叉反應 。圖8報告與如本文所揭示之45 kDa POEGMA聚合物相比，線性PEG在未經治療的個體中之抗原性，表明預先存在的抗POEGMA抗原性之效價水準及發生率均低於抗PEG。
實例5：動物研究藉由皮下(SC)注射，每週一、週三及週五，持續8週向雄性PAH enu2-/-小鼠(n = 5)投與45 kDa POEGMA-PAL (5 mL/kg)、10 kDa線性PEG-PAL (5 mL/kg)、培伐利酶(5 mL/kg)或媒劑(1xTBS； 5 mL/kg)。亦根據相同時間線向野生型小鼠投與媒劑。POEGMA-PAL之劑量水準在週一及週三為10 mg/kg且在週五為20 mg/kg。在各投與之前量測且記錄各小鼠之體重。
在POEGMA-PAL投與時段期間每週二及週四自各動物取樣，藉由在加熱燈下短暫加溫小鼠後，使用無菌手術刀片在尾之皮膚上製造大約0.1 cm長之橫向切口以誘導血管舒張。將隨後的血液收集至單個鋰肝素化毛細管(Microvette® CB 300管，Sarstedt Inc，# 16.443.100)中，立即將其離心以產生血漿。將血漿傾析至乾淨的標記管中且儲存在-80℃下。
在最終時間點(給藥後9週)，用經由鼻錐遞送之異氟烷(3%用於誘導，1.5%用於維持)深度麻醉各動物。經由心臟穿刺收集終末血液樣品且置於含有肝素鋰之管(BD Biosciences, #365965)中。將血液樣品離心以產生血漿，將其傾析至乾淨的標記管中且儲存在-80℃下。接著藉由放血、實施開胸術對動物實施安樂死。將所有生物樣品在乾冰上轉移至分析實驗室。
經由液-液萃取、隨後親水相互作用層析分離及多反應監測質譜(MS)分析來測定血漿苯丙胺酸濃度。經由在NaCl中之5% BSA中連續稀釋參考苯丙胺酸標準品來生成標準曲線及QC。將校準範圍設定為4 μg/mL至1000 μg/mL，其中品質控制標準品為15 μg/mL及200 μg/mL。將血漿、標準品及QC之10 μL等分試樣用重同位素標記之苯丙胺酸標準化，且用300 μL乙腈萃取。將上清液以1:5稀釋於0.1%甲酸2 mM乙酸銨85:5:10乙腈:甲醇:水中。將萃取物注射且在55℃下在Atlantis Premier BEH Z-HILIC 1.7μm；2.1×50mm管柱上分離且使用溶析梯度進行分離。在躍遷166.1-＞120.1 m/z (對於IS為172.1-＞ 126 m/z)時定量苯丙胺酸。使用所生成之迴歸曲線，使用歸一化峰面積計數來計算濃度。QC及校準品之準確度準則為標稱值之+/- 20%。
血漿PAL濃度係經由溶液中胰蛋白酶消化，然後使用反相液相層析及多反應監測MS分析進行靶向肽定量來確定。藉由在小鼠血漿中連續稀釋PAL產生之品質控制及校準樣品。校準範圍設定為50 μM至5000 μM，其中品質控制標準品為150 μM、1500 μM及3750 μM。向2 μL各樣品、標準品或QC中摻入重同位素標記之肽標準品。接著將標準化樣品還原且分別用參(2-羧乙基)膦(TCEP)及氯乙醯胺烷基化，隨後溶液中胰蛋白酶消化隔夜。使用Sepak C18 SPE板純化且濃縮經消化之肽提取物。在55℃下將最終提取物注射至Acquity Peptide BEH C18上；1.7 μm；2.1 × 150 mm管柱上，且使用溶析梯度進行分離。在以下遷移時定量替代PAL肽及相應重標記IS肽：PAL 466.3-＞573.3 m/z；PAL IS 471.3-＞583.3 m/z。使用所生成之迴歸曲線，使用歸一化峰面積計數來計算濃度。QC及校準品之準確度準則為標稱值之+/- 20%。
圖9及 圖10分別報告了在採集各小鼠之血漿之各時間點的血漿苯丙胺酸(Phe)及血漿PAL水準。與線性10 kDa PEG-PAL (R h= 13 nm)相比，培伐利酶(R h= 20 nm)在小鼠中維持較低苯丙胺酸水準，此表明最大化PAL結合物之大小改良功效。然而，類似大小之POEGMA-PAL (R h= 13-14 nm)表現優於培伐利酶，此證明POEGMA-PAL之藥物動力學快兩倍。
進行相同實驗以瞭解45 kDa POEGMA-PAL對較大60 kDa POEGMA-PAL之功效。藉由皮下(SC)注射，每週三次向雄性PAH enu2-/-小鼠(n = 8)投與45 kDa POEGMA-PAL (10 mL/kg)、60 kDa POEGMA-PAL (10 mL/kg)、培伐利酶(20 mL/kg)或媒劑(1×TBS；5 mL/kg)。亦根據相同時間線向野生型小鼠投與媒劑。在POEGMA-PAL或媒劑投與之前量測且記錄各小鼠之體重。如上所述對血液進行取樣、儲存及分析。 圖11及 圖12分別繪示了在採集各小鼠之血漿之各時間點的血漿苯丙胺酸(Phe)及血漿PAL水準。
在1週治療後，培伐利酶展示出暴露及功效損失，隨後在兩週內逐漸恢復至反應。在相同治療方案下，45k POEGMA-PAL反應更快：在初始功效損失後苯丙胺酸減少(長期藥效學效應)之時間減少50%。
實例6：肽作圖利用減法肽作圖來瞭解聚合物結合後培伐利酶與45k POEGMA-PAL之間離胺酸位點佔據之差異。將45kDa POEGMA-PAL、培伐利酶及未結合之rAvPAL之等分試樣用50 mM Tris緩衝液稀釋4倍。Bio-Rad P6凝膠過濾旋轉管柱用於去除未結合之rAvPAL之小分子量污染物。使用nanodrop A280對各等分試樣進行總蛋白質量測。經由添加尿素使恆定量之蛋白質變性，且在室溫下培育1小時。將變性樣品用50 mM Tris稀釋10倍且在37℃下使用胰蛋白酶/LysC消化20小時。用DTT還原經消化之樣品且藉由添加於水中之15%甲酸來酸化。
使用DDA top15採集，藉由LC-MS分析經消化之樣品。在Acquity UPLC Peptide BEH C18管柱，300A，1.7 μm，1 mm x 150 mm管柱上進行10 μL進樣，且在60分鐘內進行分離。將含有未結合離胺酸之PAL胰蛋白酶肽之XIC面積計數歸一化為來自同一樣品之不含結合位點(離胺酸)之PAL胰蛋白酶肽之XIC面積計數。對於含有離胺酸結合位點之給定肽，將結合樣品(PEG或POEGMA)之歸一化XIC面積計數除以未結合樣品(rAvPAL)之歸一化XIC面積。此值表示給定結合位點之%位點佔據，如以下等式中所示： 具有結合位點之肽：HASK 無結合位點之肽(歸一化肽)：FREEPEP HASK之XIC面積計數：[HASK] FREEPEP之XIC面積計數：[FREEPEP] 樣品下標： 45kDa POEGMA-PAL：PEGMA 培伐利酶：PEG rAvPAL：PAL
結果示於 圖13中，其中x軸列出不同離胺酸殘基且y軸報告平均%佔據。
實例7：評價IV及SC劑量之化合物1-A及培伐利酶後雄性ENU2小鼠中之血漿PAL及苯丙胺酸之單劑量研究向雄性C57BL6 PAH enu2小鼠皮下(SC)或靜脈內(IV)投與20 mg/kg (基於PAL) 45 kDa POEGMA-PAL或培伐利酶之單次注射。對於SC治療之小鼠，在給藥後4小時、8小時、24小時、48小時、72小時及168小時收集血液樣品，且對於IV治療之小鼠為5分鐘、30分鐘、4小時、24小時、72小時168小時。接著如 實例5中所述處理及分析此等樣品。
研究結果示於 圖14中。
在所有取樣時間點，在IV及SC單一劑量後，化合物1-A之血漿PAL暴露通常高於培伐利酶。在IV及SC投與後，培伐利酶及化合物1-A之PAL濃度-時間概況展現單相消除概況。化合物1-A及培伐利酶兩者之血漿PAL及苯丙胺酸水準顯示負相關，其中隨著PAL水準增加，觀察到苯丙胺酸降低。與投與途徑無關，培伐利酶之血漿苯丙胺酸水準通常在168小時時返回至基線(大約2 mM)，此時PAL水準低於定量限(BQL)。相比之下，與培伐利酶相比，用IV或SC化合物1-A治療之小鼠中之苯丙胺酸水準返回至大約1 mM，其中PAL水準在168小時保持略高。
非隔室計算之藥物動力學參數之匯總示於 表1中。在ENU2小鼠中單次IV投與20 mg/kg後，與培伐利酶相比，化合物1-A顯示出稍高的C max(1.1倍)。類似地，觀察到化合物1-A之半衰期比培伐利酶長1.1倍。化合物1-A後PAL自血漿中之清除慢於培伐利酶。單次IV劑量後化合物1-A之AUC inf高2.0倍指示ENU2小鼠中之總體暴露大於培伐利酶。
在ENU2小鼠中單次SC投與20 mg/kg後，雖然化合物1-A及培伐利酶之峰值PAL血漿濃度之吸收率相似，但觀察到化合物1-A之C max為培伐利酶之1.8倍。化合物1-A之總體暴露(AUC inf)為培伐利酶之2.6倍。此外，化合物1-A展現比培伐利酶慢得多之PAL血漿清除率(0.39倍)，導致PAL之終末血漿半衰期長1.54倍。與培伐利酶之57.6%相比，化合物1-A在SC給藥後顯示改良之生物利用度為73.2%。
總之，在IV及SC單一劑量後，與培伐利酶相比，化合物1-A展現總體更高之暴露(C max，AUC)及更長之終末半衰期，此證明PKU之ENU2小鼠模型中之藥物動力學改良。此外，與培伐利酶相比，化合物1-A在168小時時間點展示出優異的藥效學效應(降低苯丙胺酸)。
表1 ：雄性ENU2小鼠中單次20 mg/kg SC及IV注射後化合物1-A及培伐利酶之血漿PK參數之概述
組 劑量(mg/kg) T max a(h) C max(μg/mL) AUC last (h* μg/mL) AUC inf(h* μg/mL) Vz 或Vz/F b(ml/kg) CL 或CL/F c(mL/h/kg) T1/2 (h) F%
化合物1-A (SC) 20 N 3 3 3 3 3 3 3 73.2
平均值 24 383 30800 33100 35.5 0.607 40.6
SD 0 14.4 2430 2820 2.05 0.0504 1.3
培伐利酶(SC) 20 N 3 3 3 3 3 3 3 57.6
平均值 24 211 11700 12700 59.7 1.57 26.3
SD 0 14 1470 740 4.14 0.0934 2.43
化合物1-A (IV) 20 N 3 3 3 3 3 3 3 -
平均值 - 886 43000 45200 23.7 0.452 36.9
SD - 71.8 7010 8290 1.19 0.0751 4.88
培伐利酶(IV) 20 N 3 3 3 3 3 3 3 -
平均值 - 810 20300 22200 42.5 0.902 32.7
SD - 51.7 2490 333 2.95 0.0135 2.7
a報告T max之中值
實例8：培伐利酶及化合物1-A在食蟹猴中之單劑量PK/PD研究向食蟹猴投與4 mg/kg (基於PAL) 45 kDa POEGMA-PAL或培伐利酶之單次皮下(SC)注射。在給藥後立即(t=0)及在給藥後3小時、6小時、9小時、12小時、18小時、24小時、30小時、36小時、48小時、60小時、72小時、84小時、96小時、120小時、144小時、168小時、192小時、216小時、264小時、312小時、360小時、432小時及504小時收集血液樣品。接著，類似於 實例5中所述，處理且分析此等樣品。
研究結果示於 圖15中。
在20 mg/kg之單次SC投與後，培伐利酶之PAL吸收稍慢，其中達到峰值血漿PAL濃度之中位時間為42小時，而化合物1-A為36小時。化合物1-A之PAL之峰值血漿濃度高於培伐利酶。在峰值濃度之後，化合物1-A展現PAL濃度之快速下降，而培伐利酶藥物動力學概況表明比化合物1-A更長的吸收期。培伐利酶及化合物1-A之藥物動力學概況展現PAL濃度之單相下降。培伐利酶藥物動力學概況顯示在給藥後216小時後PAL急劇下降，而該下降對於化合物1-A而言似乎係自然的。自給藥後264小時開始，培伐利酶之血漿PAL濃度為BLQ，而對於化合物1-A，血漿PAL濃度在給藥後312小時達到BLQ。
血漿PAL曲線通常顯示在食蟹猴中之培伐利酶及化合物1-A與血漿苯丙胺酸水準呈反比關係，其中隨著PAL濃度增加而觀察到苯丙胺酸減少。在單劑量之培伐利酶及化合物1-A後，食蟹猴中之苯丙胺酸水準自給藥後6小時開始降至BQL (＜10 μM)，且在培伐利酶組中直至給藥後216小時及在化合物1-A組中直至給藥後192小時仍保持為BQL。當在培伐利酶及化合物1-A治療之動物中PAL血漿濃度達到BQL時，苯丙胺酸水準增加至接近基線值。
非隔室計算之藥物動力學參數之概述在 表2中示出。在健康食蟹猴中單次IV投與4 mg/kg後，與培伐利酶相比，化合物1-A顯示出更高之C max(1.5倍)。化合物1-A之總體暴露(AUCinf)略高於培伐利酶(1.1倍)。
表2 ：在雄性食蟹猴中單次4 mg/kg SC投與後培伐利酶及化合物1-A之血漿PK參數之概述
組 劑量(mg/kg) T max(h) C max(μg/mL) AUC last(h*μg/mL) AUC inf(h*μg/mL) Vz/F (ml/kg) CL/F (ml/h/kg) T 1/2(h)
培伐利酶 4 N 2 2 2 2 2 2 2
平均值 42 14.2 8895.3 9189.3 63.8 0.437 101.7
SD 8.48 1.04 710.4 736.6 0.586 0.035 9.08
1-A 4 N 3 3 3 3 3 3 3
平均值 36 21.1 10107.3 10142.5 27.9 0.403 48.6
SD 0 3.45 1917.9 1921.5 2.29 0.072 5.07
a報告T max之中值
在進行中之研究中，每週兩次，持續8週向食蟹猴投與2 mL之培伐利酶(3 mg/kg)或化合物1-A (1 mg/kg PAL或3 mg/kg PAL)。 * * * * *
在本申請案中，參考了各種公開案、專利、專利申請案及其他文件。此等公開案、專利、專利申請案及其他文件之揭示內容出於所有目的特此以引用之方式併入本申請案中，包括為了更充分地描述本文所揭示之標的物所屬之現有技術。儘管已參考上文提供之實例描述了所揭示之標的物，但應理解，可在不背離所揭示之標的物之精神的情況下進行各種修改。熟習此項技術者在閱讀本說明書後將明瞭許多變化。
圖1繪示如本文所揭示之POEGMA-PAL結合物之一個實施例。 圖2報告與PEG-PAL相比，逐漸濃縮之POEGMA-PAL組合物之黏度。 圖3報告培伐利酶對POEGMA-PAL之黏度。 圖4報告20 mg/mL、40 mg/mL及60 mg/mL 45 kDa POEGMA-PAL溶液之黏度與培伐利酶之黏度的比較。 圖5繪示為確定POEGMA-PAL與抗PEG IgG之交叉反應性而進行之例示性實驗。 圖6報告與PEG-PAL相比，小鼠單株抗PEG IgG與用於本文所揭示之POEGMA-PAL結合物中的兩種不同POEGMA聚合物之交叉反應性。 圖7報告PEG (頂圖)及POEGMA-PAL (底圖)與來自經培伐利酶處理之個體之現有抗PEG IgG的交叉反應性。 圖8報告PEG及POEGMA-PAL與來自未經處理之個體之現有抗PEG IgG的交叉反應性。 圖9報告投與45 kDa如本文所揭示之POEGMA-PAL之雄性PAH enu2-/-小鼠中的血漿苯丙胺酸(Phe)血漿水準。 圖10報告投與45 kDa如本文所揭示之POEGMA-PAL之雄性PAH enu2-/-小鼠中的血漿PAL血漿水準。 圖11報告投與45 kDa如本文所揭示之POEGMA-PAL之雄性PAH enu2-/-小鼠中的血漿苯丙胺酸(Phe)。 圖12報告投與45 kDa如本文所揭示之POEGMA-PAL之雄性PAH enu2-/-小鼠中的血漿PAL水準。 圖13報告PAL上與本文所揭示之POEGMA-PAL結合物中的POEGMA-連接體結合之離胺酸殘基之分佈。 圖14報告在皮下或靜脈內投與20 mg/kg 45 kDa POEGMA-PAL或培伐利酶後，C57BL6 PAH enu2小鼠中之血漿PAL及苯丙胺酸濃度。 圖15報告在皮下投與4 mg/kg 45 kDa POEGMA-PAL或培伐利酶後，食蟹猴中之血漿PAL及苯丙胺酸濃度。
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Claims (75)

  1. 一種結合物，其包含： a. 一或多種包含聚(寡乙二醇甲基丙烯酸酯)之聚合物；及 b. 苯丙胺酸解氨酶(PAL)， 其中該一或多種聚合物經由一或多個離胺酸殘基直接或間接結合至該PAL。
  2. 如請求項1之結合物，其中該結合物由式(I)表示： (I)， 其中： PAL為該原核苯丙胺酸解氨酶，其為包含四個次單元之同四聚體蛋白； R 1為連接體； R 2為端帽； x為1至約21之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
  3. 如請求項2之結合物，其中R 1為C 1-12烷基、C(O)-C 1-12烷基-NH、C(O)-(O-CH 2-CH 2) n，其中n為2或3，或Gly-Gly-Phe-Gly (SEQ ID NO:5)。
  4. 如請求項1之結合物，其中該結合物由式(I’)表示： (I’)， 其中： PAL為該原核苯丙胺酸解氨酶，其為包含四個次單元之同四聚體蛋白； R 2為端帽； m為3至12之整數； x為1至約21之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。
  5. 如請求項4之結合物，其中m為約19至約21之整數。
  6. 如請求項4或請求項5之結合物，其中各次單元上之至少五個離胺酸殘基結合至該等包含聚(寡乙二醇甲基丙烯酸酯)之聚合物中的至少五者。
  7. 如請求項2或請求項4至6之結合物，其中R 1為C(O)-(CH 2) 5-NH。
  8. 如請求項2至7中任一項之結合物，其中R 2為異丁腈、4-氰基戊酸、4-甲氧基-2,4-二甲基戊腈及羥基(-OH)。
  9. 如請求項2至8中任一項之結合物，其中R 2為異丁腈。
  10. 如請求項2至9中任一項之結合物，其中z為2至約8之整數。
  11. 如請求項2至9中任一項之結合物，其中z為2。
  12. 如請求項2至11中任一項之結合物，其中x為約8至約21之整數。
  13. 如請求項2至12中任一項之結合物，其中x為約16至約21之整數。
  14. 如請求項2至13中任一項之結合物，其中x為約19至約21之整數。
  15. 如請求項2至14中任一項之結合物，其中y為約150至約300之整數。
  16. 如請求項2至14中任一項之結合物，其中y為約175至約200之整數。
  17. 如請求項2至16中任一項之結合物，其中該式(I)結合物為式(Ia-1)結合物： (Ia)。
  18. 如請求項2至16中任一項之結合物，其中該式(I)結合物為式(Ia-1)結合物： (Ia-1)。
  19. 如請求項2至16中任一項之結合物，其中該式(I)結合物為式(Ia-1-1)結合物： (Ia-1-1)。
  20. 如請求項2至19中任一項之結合物，其中該結合物為如 表A中所描繪之結合物。
  21. 如請求項2至20中任一項之結合物，其中該PAL來源於多變魚腥藻( Anabaena variabilis) (AvPAL)，其中視情況該AvPAL之各次單元包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列。
  22. 如請求項21之結合物，其中該AvPAL為重組AvPAL (rAvPAL)。
  23. 如請求項21或請求項22之結合物，其中該AvPAL為AvPAL變異體。
  24. 如請求項23之結合物，其中該AvPAL變異體之各次單元包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之胺基酸序列。
  25. 如請求項1至24中任一項之結合物，其中一或多種包含聚(寡乙二醇甲基丙烯酸酯)之聚合物個別地結合至PAL之各次單元的一或多個離胺酸殘基，其中PAL之各次單元之該等離胺酸殘基包含K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109中的一或多者。
  26. 如請求項1至24中任一項之結合物，其中二或更多種包含聚(寡乙二醇甲基丙烯酸酯)之聚合物個別地結合至PAL之各次單元的二或更多個離胺酸殘基，其中PAL之各次單元之該等離胺酸殘基包含K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109中的二或更多者。
  27. 如請求項1至24中任一項之結合物，其中三或更多種包含聚(寡乙二醇甲基丙烯酸酯)之聚合物個別地結合至PAL之各次單元的三或更多個離胺酸殘基，其中PAL之各次單元之該等離胺酸殘基包含K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109中的三或更多者。
  28. 如請求項1至24中任一項之結合物，其中四或更多種包含聚(寡乙二醇甲基丙烯酸酯)之聚合物個別地結合至PAL之各次單元的四或更多個離胺酸殘基，其中PAL之各次單元之該等離胺酸殘基包含K189、K195、K522、K413、K145、K32、K115、K335及K109中的四或更多者。
  29. 如請求項25至28中任一項之結合物，其中三種包含聚(寡乙二醇甲基丙烯酸酯)之聚合物個別地結合至PAL之各次單元上的離胺酸殘基K189、K195及K522中之每一者。
  30. 如請求項25至29中任一項之結合物，其中該一或多種包含聚(寡乙二醇甲基丙烯酸酯)之聚合物的五種聚合物個別地結合至PAL之各次單元上的離胺酸殘基K189、K195、K522、K413及K145中之每一者。
  31. 一種組合物，其包含如請求項1至30中任一項之結合物。
  32. 如請求項31之組合物，其中結合至各PAL酶之連接體-POEGMA的平均數量(x ave)為約8至約21。
  33. 如請求項31或請求項32之組合物，其中結合至各PAL酶之連接體-POEGMA的平均數量(x ave)為約16至約21。
  34. 如請求項31至33中任一項之組合物，其中存在於各POEGMA中之聚(乙烯)甲基醚甲基丙烯酸酯單體的平均數量(y ave)為約150至約300。
  35. 如請求項31至34中任一項之組合物，其中存在於各POEGMA中之聚(乙烯)甲基醚甲基丙烯酸酯單體的平均數量(y ave)為約175至約200。
  36. 如請求項31至35中任一項之組合物，其中存在於各POEGMA中之聚(乙烯)甲基醚甲基丙烯酸酯單體的平均數量(y ave)為約200。
  37. 如請求項31至36中任一項之組合物，其中存在於各POEGMA之各側鏈中的乙二醇部分之平均數量(z ave)為約2至約8。
  38. 如請求項31至37中任一項之組合物，其中存在於各POEGMA之各側鏈中的乙二醇部分之平均數量(z ave)為約2。
  39. 如請求項31至38中任一項之組合物，其特徵在於數均分子量為約1200 kDa，如藉由SEC-MALS所量測。
  40. 如請求項31至39中任一項之組合物，其特徵在於數均分子量為至少約1200 kDa，如藉由SEC-MALS所量測。
  41. 如請求項31至40中任一項之組合物，其特徵在於多分散性指數為約1至約1.1。
  42. 如請求項31至41中任一項之組合物，其中20 mg或更少之該組合物於1 mL Tris緩衝液(20 mM，含136 mM NaCl)中之混合物具有10 cP或更低之黏度，如藉由黏度計所量測。
  43. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至30中任一項之結合物或如請求項31至42中任一項之組合物及醫藥學上可接受之賦形劑。
  44. 如請求項43之醫藥組合物，其中如請求項1至30中任一項之結合物係以約20 mg/mL至約60 mg/mL之濃度存在。
  45. 如請求項43或請求項44之醫藥組合物，其具有不超過約10 cP之黏度，如藉由黏度計所量測。
  46. 一種套組，其包含注射器，該注射器包含如請求項43至45中任一項之醫藥組合物。
  47. 如請求項46之套組，其中該注射器包含0.5至1.5 mL之該醫藥組合物。
  48. 一種製備式(I)結合物之方法： (I)， 其中： PAL為該原核苯丙胺酸解氨酶； R 1為連接體； R 2為端帽； x為1至約21之整數； y為約50至約500之整數；且 z為2至約10之整數。 該方法包含： a 使寡乙二醇甲基丙烯酸酯與式(II)化合物： (II)， 其中R 3為RAFT鏈轉移劑且R 4為結合部分在有效產生式(III)聚合物之條件下接觸： (III)， b. 使該式(III)聚合物與端基改質劑接觸，以移除R 3且產生式(IV)之預結合聚合物： (IV)； 其中R 2為端帽；及 c. 使該式(IV)之預結合聚合物經由該PAL變異體上之一或多個離胺酸殘基與原核苯丙胺酸解氨酶(PAL)變異體接觸，以產生該式(I)之POEGMA-PAL結合物。
  49. 如請求項48之方法，其中R 1為CH 2、C(O)-C 1-12烷基-NH、C(O)-(O-CH 2-CH 2) n，其中n為2或3，或Gly-Gly-Phe-Gly (SEQ ID NO:5)。
  50. 如請求項48或49中任一項之方法，其中R 1為C(O)-C 1-12烷基-NH。
  51. 如請求項48至50中任一項之方法，其中R 1為C(O)-(CH 2) 5-NH。
  52. 如請求項48至51中任一項之方法，其中R 2為異丁腈、4-氰基戊酸、4-甲氧基-2,4-二甲基戊腈及羥基(-OH)。
  53. 如請求項48至52中任一項之方法，其中該端基改質劑為偶氮雙異丁腈(AIBN)。
  54. 如請求項53之方法，其中R 2為異丁腈。
  55. 如請求項48至54中任一項之方法，其中R 3為三硫代碳酸酯。
  56. 如請求項48至55中任一項之方法，其中R 3為 ，其中星號(*)表示與該化合物或聚合物之其餘部分之連接。
  57. 如請求項48至56中任一項之方法，其中有效產生式(III)聚合物之該等條件包含使寡乙二醇甲基丙烯酸酯與式(II)化合物在DMSO及光源存在下接觸。
  58. 如請求項57之方法，其中該光源為藍色LED光。
  59. 如請求項48至58中任一項之方法，其中使該式(III)聚合物與AIBN接觸以產生式(IV)之預結合聚合物係在DMSO存在下進行。
  60. 如請求項48至59中任一項之方法，其中R 4為 、 、 或 ，其中 表示與R 1之連接。
  61. 如請求項48至60中任一項之方法，其中x為約8至約21之整數。
  62. 如請求項48至61中任一項之方法，其中x為約16至約21之整數。
  63. 如請求項48至62中任一項之方法，其中z為2。
  64. 如請求項48至63中任一項之方法，其中y為約175至約200之整數。
  65. 如請求項48至64中任一項之方法，其中y為約200。
  66. 一種治療個體之苯丙胺酸羥化酶缺乏症(PAH)之方法，其包含向該個體投與治療有效量的如請求項1至42中任一項之結合物、如請求項31至42中任一項之組合物或如請求項42至45中任一項之醫藥組合物。
  67. 一種治療個體之苯丙酮尿症(PKU)之方法，其包含向該個體投與治療有效量的如請求項1至42中任一項之結合物、如請求項31至42中任一項之組合物或如請求項42至45中任一項之醫藥組合物。
  68. 一種降低個體之苯丙胺酸血液水準之方法，其包含向該個體投與治療有效量的如請求項1至42中任一項之結合物、如請求項31至42中任一項之組合物或如請求項42至45中任一項之醫藥組合物。
  69. 如請求項66至68中任一項之方法，其中該投與係藉由皮下注射進行。
  70. 如請求項66至69中任一項之方法，其中藉由皮下注射向該個體投與約0.5 mL至約1.5 mL之該醫藥組合物。
  71. 如請求項1至42中任一項之結合物、如請求項31至42中任一項之組合物或如請求項42至45中任一項之醫藥組合物，其用於治療個體之苯丙酮尿症(PKU)。
  72. 如請求項1至42中任一項之結合物、如請求項31至42中任一項之組合物或如請求項42至45中任一項之醫藥組合物，其用於治療個體之苯丙胺酸羥化酶(PAH)缺乏症。
  73. 如請求項1至42中任一項之結合物、如請求項31至42中任一項之組合物或如請求項42至45中任一項之醫藥組合物，其用於降低個體之苯丙胺酸血液濃度。
  74. 如請求項71至73中任一項之供使用之結合物、組合物或醫藥組合物，其中該方法包含藉由皮下注射向該個體投與該結合物、該組合物或該醫藥組合物。
  75. 如請求項71至74中任一項之供使用之結合物、組合物或醫藥組合物，其中該方法包含藉由皮下注射向該個體投與約0.5 mL至約1.5 mL之該結合物、該組合物或該醫藥組合物。
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