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TW202526021A - 包括高度活性反式擴增複製酶之系統及組合物 - Google Patents

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馬里奧 佩科維奇
堤姆 貝塞特
埃維林 內特
艾塞古爾 伊迪茲
路易沙 齊默曼
史蒂芬妮 艾爾巴
艾貢 雅各斯
史蒂芬妮 克魯姆
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德商拜恩迪克公司
德商Ｔｒｏｎ約翰尼斯谷騰堡美茵茨大學大學醫學中心轉譯腫瘤非營利有限公司
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Abstract

本文描述了使用相比於對應未經修飾的聚合酶具有增加的反式擴增活性的經修飾RNA依賴性RNA聚合酶的可複製RNA系統，及其在治療和預防疾病的方法中的用途。

Description

包括高度活性反式擴增複製酶之系統及組合物
本發明涵蓋包含兩種核酸分子(例如RNA分子) (第一核酸分子以及第二RNA分子)的系統、套組及組合物，第一核酸分子包含編碼經修飾RNA依賴性RNA聚合酶(複製酶)的開放閱讀框，該經修飾RNA依賴性RNA聚合酶(複製酶)相對於對應未經修飾聚合酶具有增加的反式複製活性：而第二RNA分子是可複製RNA分子，其包含至少一個功能性核苷酸序列，即編碼胺基酸序列的核苷酸序列，例如感興趣基因(GOI)或其片段，或該核苷酸序列本身在細胞中具有活性(諸如miRNA、前-miRNA、核酶、反義等)。本發明進一步涵蓋編碼此等經修飾RNA依賴性RNA聚合酶的核酸分子，以及經修飾RNA依賴性RNA聚合酶。本發明進一步涵蓋使用此類系統和組合物治療或預防癌症或感染或其他疾病和病症的方法，以及此類系統和組合物在此類治療和預防方法中的用途。
α病毒(alphavirus)屬於披膜病毒科(virus family Togaviridae)，是有包膜的正股RNA病毒。α病毒可感染昆蟲、魚類和哺乳動物，諸如豢養動物與人類。α病毒在受感染細胞的細胞質中複製(關於α病毒生命週期的回顧，參見José et al., 2009, Future Microbiol. 4:837-856)。α病毒的基因體RNA為5'加帽、3'聚腺苷酸化且長度在11至12個千核苷酸之間(J. H. Strauss and E. G. Strauss, Microbiol. Rev., vol. 58, no. 3, pp. 491-562, 1994；J. Y.-S. Leung, M. M.-L. Ng, and J. J. H. Chu, Adv. Virol., vol. 2011, p. 249640, 2011)。它具有兩個開放閱讀框(ORF)。第一個ORF編碼大的多蛋白nsP1234，其建構RNA轉錄、修飾和複製所必需的複製複合體，即RNA依賴性RNA聚合酶或複製酶。第二個ORF受亞基因體啟動子(SGP)控制，編碼形成病毒顆粒所需的結構蛋白(C. M. Rice and J. H. Strauss Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 78, no. 4, pp. 2062-6, Apr. 1981)。這個雙順反子mRNA側接保守序列元件(CSE)，這些CSE形成亞基因體轉錄和複製所需的RNA結構(J. H. Strauss and E. G. Strauss,  Microbiol. Rev., vol. 58, no. 3, pp. 491-562, 1994)。
α病毒感染會導致病毒性非結構蛋白由基因體RNA直接轉譯，而結構蛋白可由亞基因體轉錄本轉譯(Gould et al., Antiviral Res. 87:111-124, 2010)。感染早期，新近轉譯的nsP1234以自體蛋白水解方式被切割成短壽命的α病毒多蛋白中間體nsP123和非結構蛋白4 (nsP4)。nsP123與nsP4蛋白交互作用，形成核心病毒RNA依賴性RNA聚合酶(M. K. Pietilä, K. Hellström, and T. Ahola, Virus Res., 2017)。(+)基因體RNA的反義RNA合成被誘導，生成至少一個互補的(-)基因體拷貝作為正股RNA合成的模板。就在反義RNA模板生成後，nsP123被病毒nsP2蛋白酶依序加工成nsP1和nsP23，後者最終加工成nsP2和nsP3。它們與nsP4一起形成穩定的複製酶蛋白或複製複合體(L. Carrasco, M. A. Sanz, and E. González-Almela, Viruses, vol. 10, no. 2, 2018)。繼而，這些複製複合體轉錄並擴增正義(positive-sense)基因體和亞基因體RNA (sgRNA)。在感染後期，只有結構蛋白的sgRNA被轉錄，這對於病毒RNA的衣殼化(encapsidation)、最終組裝和病毒釋放是必要的。
為了生成基於α病毒的自我擴增RNA或saRNA載體，異源的感興趣基因(GOI)替換基因體α病毒RNA內的結構基因。複製酶多蛋白仍會增強大量新近合成的saRNA拷貝所引起的GOI表現。在這類系統中，由於缺乏結構蛋白，病毒粒子(virion)形成和病毒傳播會受到阻礙(J. H. Aberle, S. W. Aberle, R. M. Kofler, and C. W. Mandl, J. Virol., vol. 79, no. 24, pp. 15107-13, Dec. 2005)。但是，saRNA的RNA複製過程與受α病毒感染的細胞中的基因體複製相同。再者，因為雙股RNA (dsRNA)複製中間體會活化先天免疫系統，所以用saRNA瞬時轉染會引發強烈的免疫反應。這相當於觸發和增強宿主免疫反應的內在自我輔助活性(N. P. Restifo et al., Nat. Med., vol. 5, no. 7, pp. 823-827, Jul. 1999；Perri et al., J. Virol., vol. 77, no. 19, pp. 10394-403, Oct. 2003)。這使得saRNA除了作為遞送抗原的媒介物之外，還變成了作為RNA疫苗的合適且有吸引力的候選物(A. J. Geall et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 109, no. 36, pp. 14604-9, 2012；J. B. Ulmer and A. J. Geall, Curr. Opin. Immunol., vol. 41, pp. 18-22, 2016)。
反式擴增或taRNA是一種分裂載體系統，包含兩個基於α病毒序列的RNA分子。例如，一者是編碼複製酶多蛋白的經加帽、無複製能力的活體外轉錄(IVT) mRNA。GOI編碼的IVT RNA側接病毒5' CSE和3' CSE，因此它能夠被複製酶蛋白反式複製(稱為反式複製子(TR)及/或奈米反式複製子(NTR)) (J. O. Rayner, S. A. Dryga, and K. I. Kamrud, Reviews in Medical Virology, vol. 12, no. 5. pp. 279-296, 2002)。將兩個RNA構建體遞送至細胞中之後，以mRNA為模板的病毒複製酶蛋白會辨識共轉移TR/NTR的5'CSE和3'CSE並進行反式擴增。
然而，仍迫切需要提供高拷貝數的功能性RNA的改良系統和組合物，以供提供核苷酸序列諸如用於表現感興趣的基因。本發明滿足了這種需求。
本發明大體上是有關與相應未經修飾聚合酶的反式複製活性相比，具有增加的反式複製活性的經修飾RNA依賴性RNA聚合酶；以及編碼此類經修飾聚合酶的核酸分子，並且有關包含兩個核酸分子的反式複製系統，一個核酸分子編碼經修飾聚合酶，而另一個核酸分子編碼功能性核苷酸序列且能夠被經修飾聚合酶反式複製。
因此，本文提供一種編碼經修飾RNA依賴性RNA聚合酶(複製酶)的核酸分子，其中與相應未經修飾聚合酶的反式複製活性相比，該聚合酶具有增加的反式複製活性。在一個實施例中，可以純化或分離核酸分子。在一個實施例中，核酸分子未編碼任何病毒結構蛋白。
在一個實施例中，經修飾聚合酶可以具有與其順式複製活性相比增加的反式複製活性。在一個實施例中，與相應未經修飾聚合酶的順式複製活性相比，經修飾聚合酶可以具有減少的順式複製活性。在一個實施例中，分別與相應未經修飾聚合酶的反式複製活性和順式複製活性相比，經修飾聚合酶可以具有增加的反式複製活性和減少的順式複製活性。
經修飾聚合酶可以衍生自病毒。例如，經修飾聚合酶可以衍生自正股自我複製型病毒。在一個實施例中，經修飾聚合酶可以衍生自α病毒。α病毒可選自由委內瑞拉馬腦炎病毒、東部馬腦炎病毒、西部馬腦炎病毒、屈公病毒(Chikungunya virus)、塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)、辛德比斯病毒(Sindbis virus)、巴爾馬森林病毒(Barmah Forest virus)、米德爾堡病毒(Middelburg virus)，和恩杜穆病毒(Ndumu virus)組成之群。在一個較佳實施例中，經修飾聚合酶可以衍生自委內瑞拉馬腦炎病毒。
在一個實施例中，經修飾聚合酶與相應未經修飾聚合酶具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%但非100%胺基酸序列同一性，較佳地至少95%序列同一性(諸如至少98%序列同一性)。與相應未經修飾聚合酶相比，經修飾聚合酶可包含至少一個胺基酸插入、取代及/或缺失。在一個實施例中，與相應未經修飾聚合酶相比，經修飾聚合酶可以包含1至10個胺基酸插入、取代及/或缺失，視情況2至5個胺基酸插入、取代及/或缺失，較佳地2至5個胺基酸取代。在一個實施例中，經修飾聚合酶可以在nsP2蛋白中(例如在SEQ ID NO：8的序列中)及/或nsP3蛋白中(例如在SEQ ID NO：9的序列中)包含至少一個胺基酸插入、取代及/或缺失。在一個實施例中，相應未經修飾聚合酶包含SEQ ID NO：1中所示的胺基酸序列。
在某些實施例中，經修飾聚合酶可以在對應於SEQ ID NO：1的位置1589的胺基酸位置處包含取代、在對應於SEQ ID NO：1的位置747的胺基酸位置處包含取代，或在對應於SEQ ID NO：1的位置1360的胺基酸位置處包含取代。
在某些實施例中，經修飾聚合酶可以在對應於SEQ ID NO：1的位置1589的胺基酸位置處具有絲胺酸(S)，及/或在對應於SEQ ID NO：1的位置747的胺基酸位置處具有麩醯胺酸(Q)，及/或在對應於SEQ ID NO：1的位置1360的胺基酸位置處具有精胺酸(R)。在一個實施例中，經修飾聚合酶可以在對應於SEQ ID NO：1的位置1589的胺基酸位置處具有絲胺酸(S)。在一個實施例中，經修飾聚合酶可以在對應於SEQ ID NO：1的位置747的胺基酸位置處具有麩醯胺酸(Q)，並且在對應於SEQ ID NO：1的位置1360的胺基酸位置處具有精胺酸(R)。在一個實施例中，經修飾聚合酶可以在對應於SEQ ID NO：1的位置747的胺基酸位置處具有麩醯胺酸(Q)、在對應於SEQ ID NO：1的位置1360的胺基酸位置處具有精胺酸(R)，並在對應於SEQ ID NO：1的位置1589的胺基酸位置處具有絲胺酸(S)。
在一個實施例中，核酸可以包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中所示胺基酸序列的編碼序列。在一個較佳實施例中，核酸包含SEQ ID NO：4中所示胺基酸序列的編碼序列。
在一個實施例中，經修飾聚合酶可以是VEEV衍生的經修飾聚合酶，其在對應於SEQ ID NO：1的位置747、1360和1589的各個胺基酸位置處包含取代突變，例如該等取代突變是E747Q，G1360R和T1589S。
相比於包含SEQ ID NO：2中所示胺基酸序列及/或SEQ ID NO：3中所示胺基酸序列的經修飾聚合酶，經修飾聚合酶可以具有增加的反式複製活性。
在一個實施例中，核酸可進一步包含功能性核苷酸序列，諸如編碼感興趣胺基酸序列的至少一個額外開放閱讀框，較佳地其中感興趣胺基酸序列不是病毒結構蛋白。病毒結構蛋白可以是衍生自正股自我複製型病毒(較佳為α病毒)的蛋白質。
在一個較佳實施例中，核酸可以是RNA，諸如mRNA。在一個實施例中，核酸可以是能夠被編碼的聚合酶複製的可複製RNA，或者可以是不能被編碼的聚合酶複製的可複製RNA。在一個較佳實施例中，核酸分子是僅編碼經修飾聚合酶的非可複製mRNA。
在一個實施例中，核酸是RNA分子，其可以包含至少一個經修飾的核苷酸或核鹼基，例如經修飾的尿苷。在一個實施例中，RNA分子中至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (較佳約100%)的尿苷可以是假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)，或5-甲基-尿苷(m5U)，較佳地為N1-甲基-假尿苷(1mψ)。
在一個實施例中，核酸可以是包含5'帽、5'調節區、5'複製辨識序列、3'複製辨識序列及/或聚(A)序列的RNA分子。5'帽可以是天然存在的5'帽或5'帽類似物。例如，5'帽類似物可以是ARCA、β-S-ARCA、β-S-ARCA(D1)、β-S-ARCA(D2)、CleanCap、Cap0、Cap1或AU(Cap1)中之一者。在一個實施例中，核酸可以是包含至少一個經修飾的尿苷和具有序列NpppNU之5'帽的RNA分子，其中5'帽中的U是未經修飾的尿苷。在一個實施例中，5'帽可以具有序列NpppAU，其中A表示經修飾或未經修飾的腺苷核苷酸。
在一個實施例中，核酸可以是包含5'帽的RNA分子，該5'帽包含有Capl和包含RNA分子的位置+1、+2、+3、+4與+5的帽近端序列，其中： (i) Cap1包含m7G(5')ppp(5')(2'OMeN1)pN2，其中N1是分子的位置+1，而N2是分子的位置+2，且其中N1和N2各自獨立地選自：A、C、G或U；且 (ii) 帽近端序列包含Cap1的N1和N2，以及 (a) 選自由以下組成之群的序列：A3A4X5；C3A4X5；A3C4A5和A3U4G5；或 (b) 包含X3Y4X5的序列； 其中X3或X5各自獨立地選自A、G、C或U；且其中Y4不是C。
在一個實施例中，核酸可以包含自我複製型RNA病毒的經修飾5'調節區，該經修飾調節區包含在5'調節區(SEQ ID NO：5)的位置67、244、245、246、248中之一或多者處的點突變。視情況，5'調節區可進一步包含在5'調節區(SEQ ID NO：5)的位置4處的點突變。在某些實施例中，點突變是G4A、A67C、G244A、C245A、G246A及/或C248A。
在一個實施例中，核酸可包含5'複製辨識序列，其特徵在於與天然5'複製辨識序列相比，移除了至少一個起始密碼子。在一個實施例中，5'複製辨識序列包含與自我複製型病毒的非結構蛋白或其一部分的開放閱讀框同源的序列，其中與自我複製型病毒的非結構蛋白或其一部分的開放閱讀框同源的序列的特徵在於，與天然病毒序列相比，其包含移除至少一個起始密碼子。在一個實施例中，與自我複製型病毒的非結構蛋白或其一部分的開放閱讀框同源的序列的特徵在於，其包含至少移除自我複製型病毒之非結構蛋白的開放閱讀框的天然起始密碼子。在一個實施例中，與自我複製型病毒的非結構蛋白或其一部分的開放閱讀框同源的序列的特徵在於，其包含移除自我複製型病毒之非結構蛋白的開放閱讀框的天然起始密碼子以外的至少一個起始密碼子。在一個實施例中，與自我複製型病毒的非結構蛋白或其一部分的開放閱讀框同源的序列的特徵在於其不含起始密碼子。與非結構蛋白或其一部分的開放閱讀框同源的序列進一步包含至少一個核苷酸改變，其補償因為移除至少一個起始密碼子而被引入至少一個莖環內的核苷酸配對破壞。
在一個實施例中，核酸可以包含3'複製辨識序列。在一個實施例中，5'及/或3'複製辨識序列可以衍生自自我複製型病毒，較佳地相同的自我複製型病毒物種。
在一個實施例中，核酸可以包含有包含約80至約150個A殘基的聚(A)序列，或間斷的聚(A)序列。
在一個實施例中，反式複製活性是複製能夠被經修飾聚合酶複製並且不編碼任何RNA依賴性RNA聚合酶的RNA分子的能力。
在某些實施例中，第一核酸分子可進一步包含功能性核苷酸序列，例如編碼感興趣胺基酸序列的核苷酸序列或包含miRNA或前miRNA序列的核苷酸序列，或核酶序列，或反義序列，在下文更詳細揭示。
本文也提供包含兩個核酸分子的系統，其中第一核酸分子是編碼經修飾聚合酶的上述核酸分子，且其中第二核酸分子是包含功能性核苷酸序列且不包含編碼RNA依賴性RNA聚合酶之核苷酸序列的可複製RNA分子，該第二核酸分子能夠被第一核酸分子所編碼的經修飾聚合酶反式複製。在一個較佳實施例中，第一核酸分子和第二核酸分子各自是RNA分子。第二核酸也可稱為反式複製子，因為它是被另一個核酸分子編碼的複製酶反式複製的可複製RNA。相反，順式複製子被其自身編碼的複製酶複製。
在一個實施例中，第二核酸內包含的功能性核苷酸序列可以是編碼感興趣胺基酸序列的核苷酸序列。感興趣胺基酸序列可以選自由以下組成之群：免疫原性蛋白，較佳地衍生自細菌、病毒、真菌或寄生蟲的免疫原性蛋白或其片段；抗體或其片段；治療性蛋白；多能性因子或分化因子；牛痘病毒免疫逃脫蛋白，較佳地E3或B18；包含托斯卡納病毒NS蛋白或托斯卡納病毒NS蛋白的功能變體的病毒衍生因子；流感NS1蛋白，較佳地禽流感(AIV) NS1蛋白；以及報導蛋白。在一個實施例中，免疫原性蛋白或其片段可以是抗原或其表位，較佳地T細胞表位。免疫原性蛋白或片段可用於疫苗接種。治療性蛋白可以提供細胞中缺失的酶促活性，例如肺臟細胞中的CFTR活性或肝臟細胞中的N-乙醯基麩胺酸合成酶(NAGS)。Chaturvedi et al., 2016, Scientifica (Cairo) 2016:9828672揭示了許多酶活性，缺失這些酶活性是人類疾病的起因，而這些酶可以由第二核酸編碼並表現。感興趣胺基酸序列的特性不受限制，並且包括但不限於可以出於任何原因表現的任何胺基酸序列。在某些實施例中，感興趣胺基酸序列可能選自由以下組成之群：免疫原性蛋白；抗體或其片段；治療性蛋白；多能性因子或分化因子；以及可以共遞送一或多個免疫逃脫蛋白。該一或多種免疫逃脫蛋白可能選自：牛痘病毒免疫逃脫蛋白，較佳地E3或B18；包含托斯卡納病毒NS蛋白或托斯卡納病毒NS蛋白的功能變體的病毒衍生因子；以及流感NS1蛋白，較佳地禽流感(AIV) NS1蛋白。一或多個免疫逃脫蛋白可能在一或多個其他各別的核酸分子(較佳地mRNA分子)上共遞送。可以透過在第二可複製核酸分子上(較佳地在5'UTR和亞基因體啟動子之間)納入編碼一或多個免疫逃脫蛋白的序列來共遞送一或多個免疫逃脫蛋白。
在一個實施例中，功能性核苷酸序列可以是包含miRNA或前miRNA序列、或核酶序列、或反義序列的核苷酸序列。當第二核酸是RNA分子時，若第二核酸存在於細胞中，則可以將miRNA、前miRNA、核酶或反義序列從第二核酸切除。在一個實施例中，miRNA、前miRNA、核酶或反義序列能夠調節細胞中的基因表現。
同樣地，在某些實施例中，第一核酸分子可進一步包含功能性核苷酸序列，例如編碼感興趣胺基酸序列的核苷酸序列或包含miRNA或前miRNA序列、或核酶序列、或反義序列的核苷酸序列。
在一個實施例中，第一核酸分子是可被其編碼的RNA依賴性RNA聚合酶複製的可複製RNA分子，或不是可被RNA依賴性RNA聚合酶複製的可複製RNA分子。在一個實施例中，第一核酸分子可以是mRNA分子。
在一個實施例中，功能性核苷酸序列可以側接5'非轉譯區(UTR)及/或3'UTR。
在一個實施例中，第二核酸是RNA分子並且可以包含至少一種經修飾的核苷酸或核鹼基，例如經修飾的尿苷。在一個實施例中，RNA分子中至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的尿苷可以是假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)，或5-甲基-尿苷(m5U)，較佳地N1-甲基-假尿苷(1mψ)。
在一個實施例中，第二核酸可以是包含5'帽、5'調節區、5'複製辨識序列、3'複製辨識序列及/或聚(A)序列的RNA分子。5'帽可以是天然存在的5'帽或5'帽類似物。例如，5'帽類似物可以是ARCA、β-S-ARCA、β-S-ARCA(D1)、β-S-ARCA(D2)、CleanCap、Cap0、Cap1或AU(Cap1)中之一者。在一個實施例中，核酸可以是包含至少一個經修飾的尿苷和具有序列NpppNU之5'帽的RNA分子，其中5'帽中的U是未經修飾的尿苷。在一個實施例中，5'帽可以具有序列NpppAU，其中A表示經修飾的或未經修飾的腺苷核苷酸。
在一個實施例中，第二核酸可以是包含5'帽的RNA分子，該5'帽包含有Cap1和包含RNA分子的位置+1、+2、+3、+4與+5的帽近端序列，其中： (i) Cap1包含m7G(5')ppp(5')(2'OMeN1)pN2，其中N1是分子的位置+1，而N2是分子的位置+2，且其中N1和N2各自獨立地選自：A、C、G或U；且 (ii) 帽近端序列包括Cap1的N1和N2，以及： (a) 選自由以下組成之群的序列：A3A4X5；C3A4X5；A3C4A5和A3U4G5；或 (b) 包含X3Y4X5的序列； 其中X3或X5各自獨立地選自A、G、C或U；且其中Y4不是C。
在一個實施例中，第二核酸可以包含自我複製型RNA病毒之經修飾5'調節區，該經修飾調節區包含在5'調節區(SEQ ID NO：5)的位置67、244、245、246、248中的一或多者處的點突變。視情況，5'調節區可進一步包含在5'調節區(SEQ ID NO：5)的位置4處的點突變。在某些實施例中，點突變是G4A、A67C、G244A、C245A、G246A及/或C248A。
在一個實施例中，第二核酸可包含5'複製辨識序列，其特徵在於與天然5'複製辨識序列相比，移除了至少一個起始密碼子。在一個實施例中，5'複製辨識序列包含與自我複製型病毒的非結構蛋白或其一部分的開放閱讀框同源的序列，其中與自我複製型病毒的非結構蛋白或其一部分的開放閱讀框同源的序列的特徵在於，與天然病毒序列相比，其包含移除至少一個起始密碼子。在一個實施例中，與自我複製型病毒的非結構蛋白或其一部分的開放閱讀框同源的序列的特徵在於，其包含至少移除自我複製型病毒之非結構蛋白的開放閱讀框的天然起始密碼子。在一個實施例中，與自我複製型病毒的非結構蛋白或其一部分的開放閱讀框同源的序列的特徵在於，其包含移除自我複製型病毒之非結構蛋白的開放閱讀框的天然起始密碼子以外的至少一個起始密碼子。在一個實施例中，與自我複製型病毒的非結構蛋白或其一部分的開放閱讀框同源的序列的特徵在於其不含起始密碼子。與非結構蛋白或其一部分的開放閱讀框同源的序列進一步包含至少一個核苷酸改變，其補償因為移除至少一個起始密碼子而被引入至少一個莖環內的核苷酸配對破壞。
在一個實施例中，第二核酸可以包含3'複製辨識序列。在一個實施例中，5'及/或3'複製辨識序列可以衍生自自我複製型病毒，較佳地相同的自我複製型病毒物種。
在一個實施例中，第二核酸可包含有包含約80至約150個A殘基的聚(A)序列，或間斷的聚(A)序列。
在一個實施例中，系統可進一步包含第三或更多可複製RNA分子，其可被第一核酸分子編碼的RNA依賴性RNA聚合酶複製，視情況其中第三或更多可複製RNA分子包含與第一核酸分子和第二核酸中所含者不同的功能性核苷酸序列。本文所述的所有關於第二RNA分子的實施例也可以適用於第三或其他可複製RNA分子。
本文也提供一種組合物，其包含編碼本文所述的經修飾RNA依賴性RNA聚合酶的核酸分子(系統的第一核酸分子)及/或包含本文所述的系統的第二核酸分子；以及能夠與核酸分子之一者或兩者形成顆粒的試劑。較佳地，核酸分子是RNA分子。
在一個實施例中，試劑可以是或包含聚亞烷基亞胺或脂質。在一個實施例中，試劑可以是或包含脂質，較佳地包含陽離子頭基。在一個實施例中，試劑可以是或包含pH反應性脂質。在一個實施例中，試劑可以是或包含聚乙二醇化脂質。在一個實施例中，試劑可結合至聚肌胺酸(pSar)、聚(噁唑啉) (POX)；聚(噁嗪) (POZ)、聚(乙烯基吡咯啶酮) (PVP)；聚( N-(2-羥基丙基)-甲基丙烯醯胺) (pHPMA)；聚(去氫丙胺酸) (pDha)；聚(胺基乙氧基乙氧基乙酸) (pAEEA)或聚(2-甲基胺基乙氧基乙氧基乙酸) (pmAEEA)。因此，試劑可以是或包含「接枝」或「隱形」脂質，即結合至選自由以下組成之群的聚合物的脂質：聚乙二醇(PEG)；聚(胺基乙氧基乙氧基乙酸) (pAEEA)、聚肌胺酸(pSar)、聚(2-甲基胺基乙氧基乙氧基乙酸) (pmAEEA)；聚(噁唑啉) (POX)；聚(噁嗪) (POZ)、聚(乙烯基吡咯啶酮) (PVP)；聚( N-(2-羥基丙基)-甲基丙烯醯胺) (pHPMA)；和聚(去氫丙胺酸) (pDha)。試劑可以是或包含結合至pAEEA或pSar的脂質。在一些情況下，試劑不含結合至PEG的脂質。
在一個實施例中，由RNA分子和試劑形成的顆粒可以是脂質奈米顆粒(LNP)、脂質複合物(LPX)，脂質體或基於聚合物的聚合複合物(PLX)。
在一個實施例中，顆粒可進一步包含至少一種磷脂醯絲胺酸。
在一個實施例中，顆粒可以是奈米顆粒，其中： (i) 奈米顆粒中的正電荷數不超過奈米顆粒中的負電荷數，及/或 (ii) 奈米顆粒具有中性或淨負電荷，及/或 (iii) 奈米顆粒中正電荷與負電荷的電荷比為1.4：1或更小，及/或 (iv) 奈米顆粒的zeta電位為0或更小。
較佳地，奈米顆粒中正電荷與負電荷的電荷比在1.4：1至1：8之間，較佳地在1.2：1至1：4之間。
在一個實施例中，奈米顆粒可包含至少一種脂質，較佳地包含至少一種陽離子脂質。在一個實施例中，正電荷由至少一種陽離子脂質所貢獻，而負電荷由核酸分子(例如RNA分子)所貢獻。在一個實施例中，奈米顆粒可進一步包含至少一種輔助脂質。較佳地，輔助脂質是中性脂質。
在一個實施例中，至少一種陽離子脂質包含1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基銨丙烷(DOTMA)、1,2-二油醯基氧基-3-二甲基胺基丙烷(DODMA)，及/或1,2-二油醯基-3-三甲基銨-丙烷(DOTAP)。在一個實施例中，至少一種輔助脂質包含1,2-二-(9Z-十八烯醯基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、膽固醇(Chol)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DOPC)，及/或1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)。在一個實施例中，至少一種陽離子脂質與至少一種輔助脂質的莫耳比為10：0至3：7，較佳地9：1至3：7、4：1至1：2、4：1至2：3、7：3至1：1，或2：1至1：1，較佳地約1：1。
在一個實施例中，奈米顆粒是包含莫耳比為10：0至1：9，較佳地8：2至3：7，且更佳地7：3至5：5的DODMA和DOPE的脂質複合物，且其中DODMA中的正電荷與RNA中的負電荷的電荷比為1.8：2至0.8：2，更佳地1.6：2至1：2，甚至更佳地1.4：2至1.1：2，且甚至更佳地約1.2：2。在一個實施例中，奈米顆粒是包含莫耳比為10：0至1：9，較佳地8：2至3：7，更佳地7：3至5：5的DODMA和膽固醇的脂質複合物，且其中DODMA中的正電荷與RNA中的負電荷的電荷比為1.8：2至0.8：2，更佳地1.6：2至1：2，甚至更佳地1.4：2至1.1：2，且甚至更佳地約1.2：2。在一個實施例中，奈米顆粒是包含莫耳比為10：0至1：9，較佳地8：2至3：7，更佳地7：3至5：5的DODMA和DSPC的脂質複合物，且其中DODMA中的正電荷與RNA中的負電荷的電荷比為1.8：2至0.8：2，更佳地1.6：2至1：2，甚至更佳地1.4：2至1.1：2，且甚至更佳地約1.2：2。在一個實施例中，奈米顆粒是包含莫耳比為40：48：10：2的DODMA：膽固醇：DOPE：PEGcerC16的脂質複合物。
在一個實施例中，奈米顆粒是包含莫耳比為10：0至1：9，較佳地8：2至3：7，且更佳地7：3至5：5的DOTMA和DOPE的脂質複合物，且其中DOTMA中的正電荷與RNA中的負電荷的電荷比為1.8：2至0.8：2，更佳地1.6：2至1：2，甚至更佳地1.4：2至1.1：2，且甚至更佳地約1.2：2。在一個實施例中，奈米顆粒是包含莫耳比為10：0至1：9，較佳地8：2至3：7，且更佳地7：3至5：5的DOTMA和膽固醇的脂質複合物，且其中DOTMA中的正電荷與RNA中的負電荷的電荷比為1.8：2至0.8：2，更佳地1.6：2至1：2，甚至更佳地1.4：2至1.1：2，且甚至更佳地約1.2：2。
在一個實施例中，奈米顆粒是包含莫耳比為10：0至1：9，較佳地8：2至3：7，且更佳地7：3至5：5的DOTAP和DOPE的脂質複合物，且其中DOTMA中的正電荷與RNA中的負電荷的電荷比為1.8：2至0.8：2，更佳地1.6：2至1：2，甚至更佳地1.4：2至1.1：2，且甚至更佳地約1.2：2。
在一個實施例中，試劑可以包含脂質且形成的顆粒是與核酸分子(例如RNA分子)複合及/或囊封核酸分子的LNP。在一個實施例中，試劑可以包含脂質且形成的顆粒是囊封核酸分子(例如RNA分子)的囊泡，其視情況為單層脂質體。在一個實施例中，包含核酸分子(例如RNA分子)的組合物是LNP組合物，諸如RNA-LNP組合物。能夠與核酸分子形成顆粒的試劑可以是或包含陽離子可電離脂質、中性(例如輔助)脂質、類固醇(例如膽固醇)，和聚合物結合型脂質。
在一個實施例中，試劑可以是或包含聚亞烷基亞胺。
在一個實施例中，聚亞烷基亞胺中的氮原子(N)數目與核酸分子(例如RNA分子)中的磷原子(P)數目的莫耳比(N：P比)可以是2.0至15.0，較佳地6.0至12.0。在一個實施例中，聚亞烷基亞胺中的氮原子(N)數目與核酸分子(例如RNA分子)中的磷原子(P)數目的莫耳比(N：P比)可以是至少約48，視情況約48至300、約60至200，或約80至150。
在一個實施例中，組合物的離子強度可以是50 mM或更低，較佳地其中單價陽離子的濃度可以是25 mM或更低，且二價陽離子的濃度可以是20 μM或更低。
在一個實施例中，形成的顆粒是聚合複合物。
在一個實施例中，聚亞烷基亞胺包含以下通式(I)： ， 其中 R為H、醯基或包含下列通式(II)的基團： ， 其中R 1為H或包含以下通式(III)的基團： ， n、m和l獨立地選自2至10的整數；且 p、q和r是整數，其中p、q和r的總和使得聚合物的平均分子量為1.5·10 2至10 7Da，較佳地5000至10 5Da，更佳地10000至40000 Da，更佳地15000至30000 Da，甚至更佳地20000至25000 Da。較佳地n、m和l獨立選自2、3、4和5，較佳地選自2和3。較佳地R 1為H或醯基。
在一個實施例中，聚亞烷基亞胺可包含聚乙烯亞胺及/或聚丙烯亞胺，較佳地聚乙烯亞胺。在一個實施例中，聚亞烷基亞胺中至少92%的N原子是可質子化的。
在一個實施例中，組合物可進一步包含一或多種基於肽的佐劑，其中基於肽的佐劑視情況包含免疫調節分子，諸如細胞激素、淋巴因子及/或共刺激分子。
在一個實施例中，組合物可進一步包含一或多種添加劑，其中添加劑視情況選自由緩衝物質、醣類、穩定劑、低溫保護劑、凍乾保護劑和螯合劑組成之群。較佳地，緩衝物質包含選自由4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、2-(N-嗎啉)乙磺酸(MES)、3-N-嗎啉-2-羥基丙磺酸(MOPSO)、乙酸、乙酸鹽緩衝劑與類似物、磷酸與磷酸鹽緩衝劑，以及檸檬酸與檸檬酸鹽緩衝劑組成之群中的至少一者。較佳地，醣類包含選自由單醣、雙醣、三醣、寡糖和多醣組成之群中的至少一者，較佳地選自葡萄糖、海藻糖和蔗糖。較佳地，低溫保護劑包含選自由二醇(諸如乙二醇、丙二醇)和甘油組成之群中的至少一者。較佳地，螯合劑包含EDTA。
在一個實施例中，組合物可進一步包含醫藥上可接受的載劑。在一個實施例中，組合物可以被配製用於皮內、皮下及/或肌肉內投藥，諸如藉由注射。
本文也提供一種醫藥組合物，其包含本文所述的第一核酸分子及/或第二核酸分子，以及醫藥上可接受的載劑。在一個實施例中，醫藥組合物可以配製用於皮內、皮下及/或肌肉內投藥，諸如藉由注射。本文所述所有關於核酸分子的實施例可以等同地應用於醫藥組合物的那些核酸分子。
本文也提供了包含本文所述的第一核酸分子及/或第二核酸分子的套組。在包含第一核酸分子和第二核酸分子兩者之套組的實施例中，兩種核酸分子可以在套組內所含的不同容器中。套組可進一步包含其使用說明書。本文所述的關於核酸分子的所有實施例可以等同地應用於包含在套組內的那些核酸分子。
編碼本文所述的經修飾RNA依賴性RNA聚合酶的核酸、包含功能性核苷酸序列的第二核酸、本文所述的系統、本文所述的組合物、本文所述的醫藥組合物或本文所述的套組可用於治療，例如用於治療或預防疾病的方法中，較佳地其中個體是哺乳動物，更佳地其中哺乳動物是人類，該方法包含向個體分別投予核酸、第二核酸、系統、組合物、醫藥組合物或套組。
在一個實施例中，投藥可以包含皮內、皮下或肌肉內投藥，諸如藉由皮內、皮下或肌肉內注射。在一個實施例中，投藥包含藉由肌肉內注射投藥，較佳地使用針頭。注射可以使用針或使用無針注射裝置。
在一個實施例中，核酸分子可以同時或分別投予，較佳地藉由相同的投藥路徑。
在一個實施例中，疾病是細菌、病毒、寄生蟲或真菌感染，或癌症。個體較佳是人類。
本文提供一種用於在個體中治療或預防細菌、病毒、寄生蟲或真菌感染的方法，該方法包含向個體投予編碼本文所述的經修飾RNA依賴性RNA聚合酶的核酸、包含功能性核苷酸序列的第二核酸、本文所述的系統、本文所述的組合物、本文所述的醫藥組合物，及/或本文所述的套組。
本文也提供了用於在個體中治療或預防癌症的方法，該方法包含向個體投予編碼本文所述的經修飾RNA依賴性RNA聚合酶的核酸、包含功能性核苷酸序列的第二核酸、本文所述的系統、本文所述的組合物、本文所述的醫藥組合物，及/或本文所述的套組。
本文也提供一種經修飾RNA依賴性RNA聚合酶，其包含SEQ ID NO：4中所示的胺基酸序列。在一個實施例中，可以純化經修飾聚合酶。
本文也提供一種包含本文所述的第一核酸和第二核酸或包含經修飾聚合酶的細胞，該經修飾聚合酶包含SEQ ID NO：4中所示的胺基酸序列。在一個實施例中，可以分離細胞。
本文也提供一種編碼經修飾RNA依賴性RNA聚合酶的DNA分子及/或編碼第一核酸分子及/或第二核酸分子的DNA分子(其為RNA分子)。本文也提供一種藉由活體外轉錄適當的DNA分子(其為RNA分子)來產生第一核酸分子及/或第二核酸分子的方法。
儘管下面詳細說明了本發明，但是應當理解，本發明不限於本文所述的特定方法、方案和試劑，因為這些可以會有所改變。還應理解，本文所使用的術語僅作為說明特定實施例為目的，並不希望限制本發明的範疇，本發明的範疇將僅由隨附申請專利範圍所囿限。除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語與技藝中具有通常技術者一般理解的含義相同。
較佳地，本文所用的術語如「A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)」, H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kölbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995)中所述來定義。
除非另有說明，否則本發明的實施將採用常規化學、生物化學、細胞生物學、免疫學和重組DNA技術，這些技術在該領域的文獻中進行了解釋(參見例如Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al.eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989)。
在下文中，將說明本發明的要件。這些要件與特定實施例一起列出，然而應當理解，它們可能按任何方式和按任何數量組合以創造出更多實施例。不同描述的實例和較佳實施例不應被解釋為將本發明僅侷限於明確描述的實施例。此說明應當被理解為揭示並涵蓋將明確描述的實施例與任何數量的揭示及/或偏好要件相結合的實施例。此外，除非上下文另有說明，否則此申請案中所有描述的要件的任何排列與組合都應被認為是本說明書所揭示的。
術語「約」表示大約或幾乎，並且在本文中闡述數值或範圍的上下文中較佳地表示引用或請求的數值或範圍的+/- 10%。
除非本文另有說明或與上下文明顯矛盾，否則在說明本發明的上下文中(尤其是在申請專利範圍的上下文中)所用的術語「一(a和an)」和「該(the)」以及類似的參考用語將被解釋為涵蓋單數和複數。此處對數值範圍的引用僅旨在用作單獨提到落入該範圍內的各個單獨數值的速記方法。除非本文另有說明，否則每個單獨數值都被併入說明書中，就好像它在本文中被單獨引用一樣。除非本文另有說明或與上下文明顯矛盾，否則本文所述的所有方法都可以按任何合適的順序進行。本文提供的任何和所有實例或例示性語言(例如，「諸如」)的使用僅旨在更為充分說明本發明而並非對申請專利範圍的範疇構成限制。說明書中的任何語言都不應被解釋為表示對實施本發明至關重要的任何未要求保護的要件。
除非另有明確說明，否則在本份文件的上下文中使用術語「包含」來表示除了「包含」所介紹的列表成員之外，還可能視情況存在其他成員。然而，預期作為本發明的特定實施例，術語「包含」涵蓋不存在其他成員的可能性，即為了這個實施例的目的，「包含」應被理解為具有「由…組成」之意。
由上位術語表徵的組分的相對量的指示是指該上位術語涵蓋的所有特定變體或成員的總量。如果上位術語定義的某個組分被指定以某一個相對量存在，並且如果此組分進一步被表徵為該上位術語涵蓋的特定變體或成員，則表示沒有被上位術語涵蓋的額外其他變體或成員存在，使得上位術語所涵蓋的組分的總相對量超過指定的相對量；更佳地，根本不存在該上位術語涵蓋的其他變體或成員。
在本說明書的全文通篇中引用了若干份文件。在此引用的每份文件(包括所有專利、專利申請案、科學出版物、製造商的說明書、說明書等)，無論是上文還是下文，均以全文引用的方式併入。本文中的任何內容均不應被解釋為承認本發明無權先於這些揭示內容。
如本文所用，諸如「減少」或「抑制」的術語表示導致整體降低的能力，例如在程度上降低5%或更多、10%或更多、20%或更多，更佳地50%或更多，且最佳地75%或更多。術語「抑制」或類似片語包括完全或基本上完全抑制，即減少至零或基本上減少至零。
諸如「增加」或「增強」的術語較佳地是有關增加或增強約至少10%，較佳地至少20%，較佳地至少30%，更佳地至少40%，更佳地至少50%，甚至更佳地至少80%，且最佳地至少100%。
術語「淨電荷」是指整個物體(諸如化合物或顆粒)上的電荷。
具有總淨正電荷的離子是陽離子，而具有總淨負電荷的離子是陰離子。因此，本文中的陰離子是具有比質子更多的電子的離子，從而賦予其淨負電荷；而陽離子是電子比質子少的離子，因此帶有淨正電荷。
就給定化合物或顆粒而言，諸如「帶電荷」、「淨電荷」、「帶負電荷」或「帶正電荷」的術語是指給定化合物或顆粒在pH 7.0下溶解或懸浮在水中時的淨電荷。
術語「核酸」還包含核酸在核苷酸鹼基上、糖上或磷酸根上的化學衍生化，以及含有非天然核苷酸和核苷酸類似物的核酸。在一些實施例中，核酸是去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。一般而言，核酸分子或核酸序列是指較佳為去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的核酸。核酸包含基因體DNA、cDNA、mRNA、病毒RNA、經重組製備的和化學合成的分子。核酸可能以單股或雙股與線性或共價閉合環狀分子的形式存在。
本文中「核酸序列」是指核酸(例如；核糖核酸(RNA)或去氧核糖核酸(DNA))中的核苷酸序列。該術語可能指整個核酸分子(諸如整個核酸分子的單股)或其一部分(例如片段)。
術語「RNA」或「RNA分子」是有關包含核糖核苷酸殘基並且較佳地完全或基本上由核糖核苷酸殘基組成的分子。術語「核糖核苷酸」是有關在β-D-呋喃核糖基的2'-位置處帶有羥基的核苷酸。術語「RNA」包含雙股RNA、單股RNA、經分離的RNA (諸如部分或完全純化的RNA)、基本上純的RNA、合成RNA，及重組產生的RNA (諸如因為添加、缺失、取代及/或改變一或多個核苷酸而與天然存在的RNA不同的經修飾RNA)。這種改變可能包括在RNA的一或多個核苷酸處將非核苷酸材料添加到諸如RNA的末端或RNA內部。RNA中的核苷酸可能還包含非標準核苷酸，諸如非天然存在的核苷酸或化學合成的核苷酸或去氧核苷酸。這些經改變的RNA可被認為是類似物，特別是天然存在的RNA的類似物。
RNA可能是單股或雙股的。在一些實施例中，單股RNA是較佳的。術語「單股RNA」通常是指沒有互補核酸分子(通常沒有互補RNA分子)與其締合的RNA分子。單股RNA可能含有自我互補序列，其允許RNA的部分折起並形成二級結構模體，包括但不限於鹼基對、莖、莖環和凸起。單股RNA可以呈負股[(-)股]或正股[(+)股]存在。(+)股是包含或編碼遺傳訊息的股。遺傳訊息可能是例如編碼蛋白質的多核苷酸序列。當(+)股RNA編碼蛋白質時，(+)股可能直接作為轉譯(蛋白質合成)的模板。(-)股是(+)股的互補序列。就雙股RNA而言，(+)股和(-)股是兩個各別的RNA分子，而這兩個RNA分子彼此締合形成雙股RNA (「雙股螺旋RNA」)。
術語RNA的「穩定性」與RNA的「半衰期」有關。「半衰期」是有關消除一半活性、數量或分子數目所需的一段時間。在本發明上下文中，RNA的半衰期指示該RNA的穩定性。RNA的半衰期可能會影響RNA的「表現持續時間」。可以預期具有長半衰期的RNA會表現一段較長的時間。
術語「轉譯效率」是有關RNA分子在特定一段時間內提供的轉譯產物數量。
提到核酸序列時，「片段」是有關核酸序列的一部分，即；代表在5'端及/或3'端處縮短的核酸序列的序列。較佳地，核酸序列的片段包含該核酸序列至少80%，較佳地至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的核苷酸殘基。保留RNA穩定性及/或轉譯效率的那些RNA分子片段是較佳的。
提到胺基酸序列(肽或蛋白質)時，「片段」是有關胺基酸序列的一部分，即代表在N端及/或C端處縮短的胺基酸序列的序列。在C端處縮短的片段(N端片段)可例如藉由轉譯缺少開放閱讀框3'端的截短型開放閱讀框來獲得。在N端處縮短的片段(C端片段)可例如藉由轉譯缺少開放閱讀框5'端的截短型開放閱讀框來獲得，只要該截短型開放閱讀框包含用於啟動轉譯的起始密碼子即可。胺基酸序列的片段包含該胺基酸序列例如至少1%、至少2%、至少3%、至少4%、至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%的胺基酸殘基。
就例如核酸與胺基酸序列而言，術語「變體」在本文中包括任何變體，特別是突變體、病毒株變體、剪接變體、構形(conformaiton)、同型、對偶基因變體、物種變體和物種同源物，特別是那些天然存在的。對偶基因變體是有關基因正常序列的改變，其意義通常不明。完整的基因定序通常可以辨識給定基因的許多對偶基因變體。就核酸分子而言，術語「變體」包括簡併核酸序列，其中簡併核酸是由於遺傳密碼的簡併性而在密碼子序列上與參考核酸有別的核酸。物種同源物是與給定核酸或胺基酸序列具有不同物種來源的核酸或胺基酸序列。病毒同源物是具有與給定核酸或胺基酸序列具有不同病毒來源的核酸或胺基酸序列。
與參考核酸相比，核酸變體可包括單一或多個核苷酸缺失、添加、突變、取代及/或插入。缺失包括從參考核酸移除一或多個核苷酸。添加變體包含一或多個核苷酸(諸如1、2、3、5、10、20、30、50或更多個核苷酸)的5'端及/或3'端融合體。在取代的情況下，序列中的至少一個核苷酸被移除，並且至少有一個其他核苷酸被插入其位置(諸如置換和轉換)。突變可包括無鹼基位點、交聯位點，以及經化學改變或修飾的鹼基。插入包括將至少一種核苷酸添加到參考核酸中。
與參考核酸相比，「核苷酸改變」可以指單一或多個核苷酸缺失、添加、突變、取代及/或插入。在一些實施例中，與參考核酸相比之下，「核苷酸改變」選自由單一核苷酸的缺失、單一核苷酸的添加、單一核苷酸的突變、單一核苷酸的取代及/或單一核苷酸的插入組成之群。與參考核酸相比之下，核酸變體可以包含一或多個核苷酸改變。
特定核酸序列的變體較佳地具有該特定序列的至少一種功能性質，並且較佳地在功能上與該特定序列等效，例如展現出與特定核酸序列的性質相同或相似的核酸序列。
如下所述，一些實施例的特徵特別在於與其他核酸序列同源的核酸序列。這些同源序列是其他核酸序列的變體。
較佳地，給定核酸序列和該給定核酸序列之變體的核酸序列之間，或蛋白質的給定胺基酸序列與該給定胺基酸序列的變體的胺基酸序列之間的同一性程度將為至少約70%，較佳地至少75%、較佳地至少80%、更佳地至少85%、甚至更佳地至少90%或最佳地至少95%、96%、97%、98%或99%。較佳地針對某一區域的同一性程度為至少約30、至少約50、至少約70%、至少約90%、至少約100、至少約150、至少約200、至少約250、至少約300，或至少約400個核苷酸。在較佳實施例中，同一性程度是針對參考核酸序列的整個長度提供。
「序列相似性」表示相同或代表保守胺基酸取代的胺基酸百分率。兩個胺基酸或核酸序列之間的「序列同一性」表示序列之間相同的胺基酸或核苷酸的百分率。
術語「同一%」或類似術語特別是指於兩個待比較序列之間進行最佳比對時，相同的胺基酸或核苷酸的百分率，其中該百分率純粹是統計的，且兩個序列之間的差異在序列的整個長度上可能是隨機分布，且待比較序列與參考序列相比之下可能包含添加或缺失，以獲得兩個序列之間的最佳比對。兩個序列的比較通常透過在最佳比對後相對於區段或「比較窗口」比較序列來進行，以鑑定出對應序列的局部區域。用於比較的最佳比對可能手動進行或借助Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482的局部同源性演算法、借助Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443的局部同源性演算法和借助Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 88, 2444的相似性檢索演算法，或借助使用該等演算法的電腦程式(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA)來進行。
例如透過確定待比較序列對應的相同位置的數量，將該數量除以所比較的位置的數量並將該結果乘以100來獲得同一性百分率。
例如，可使用網站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi上可取得的BLAST程式「BLAST 2 sequences」。
如果核酸與另一核酸彼此互補，則兩個序列彼此「能夠雜合」或「雜合」。如果核酸與另一個核酸能夠彼此形成穩定的雙股螺旋，則兩個序列彼此「互補」。如本文所用，雜合較佳地在允許多核苷酸之間特異性雜合的條件(嚴苛條件)下進行。嚴苛條件描述於例如Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989或Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York，並指例如於雜合緩衝液(3.5 x SSC、0.02% Ficoll、0.02%聚乙烯吡咯啶酮、0.02%牛血清白蛋白、2.5 mM NaH 2PO 4(pH 7)、0.5% SDS、2 mM EDTA)中在65℃下的雜合。SSC為0.15 M氯化鈉/0.15 M檸檬酸鈉，pH 7。雜合後，洗滌DNA已轉移至其的膜，例如在2 x SSC中於室溫下，然後在0.1-0.5 x SSC/0.1 x SDS中於室溫下至多到68℃進行洗滌。
互補性百分率表示核酸分子中可以與第二核酸序列形成氫鍵(例如Watson-Crick鹼基配對)的連續殘基的百分率(例如10個中的5、6、7、8、9、10個為50%、60%、70%、80%、90%和100%互補)。「完全互補(perfectly complementary或(fully complementary)」表示核酸序列的所有連續殘基將與第二核酸序列中相同數量的連續殘基形成氫鍵。較佳地，互補性程度為至少70%，較佳地至少75%，較佳地至少80%，更佳地至少85%，甚至更佳地至少90%或最佳地至少95%、96%、97%、98%或99%。最佳地，互補性程度是100%。
術語「衍生物」包含核酸在核苷酸鹼基上、在糖上或在磷酸根上的任何化學衍生化。術語「衍生物」也包含含有非天然存在的核苷酸與核苷酸類似物的核酸。較佳地，核酸的衍生化增加其穩定性。
「衍生自核酸序列的核酸序列」是指核酸變體是自其衍生而來的核酸。較佳地，作為特定序列的變體的序列在替換RNA分子中的特定序列時保有RNA穩定性及/或轉譯效率。
「nt」是核苷酸的縮寫；或對於核苷酸來說，較佳地核酸分子中的連續核苷酸。
術語「密碼子」是指編碼核酸中的鹼基三聯體，其指定在核醣體處的蛋白質合成期間接下來將添加哪個胺基酸。
術語「轉錄(transcription和transcribing)」是有關在期間具有特定核酸序列的核酸分子(「核酸模板」)被RNA聚合酶讀取，使得RNA聚合酶產生單股RNA分子的一個過程。在轉錄期間，核酸模板中的遺傳訊息被轉錄。核酸模板可能是DNA；然而，例如在從α病毒核酸模板轉錄的情況下，模板通常是RNA。隨後，轉錄的RNA可被轉譯成蛋白質。術語「轉錄」可包含「活體外轉錄」，其中術語「活體外轉錄」是有關其中RNA (特別是mRNA)在無細胞株統中活體外合成的一個過程。較佳地，施加選殖載體來產生轉錄本。這些選殖載體通常被稱為轉錄載體並且被術語「載體」涵蓋。選殖載體較佳是質體。RNA較佳是活體外轉錄的RNA (IVT-RNA)並且可能藉由活體外轉錄適當DNA模板來獲得。用於控制轉錄的啟動子可以是任何RNA聚合酶的任何啟動子。用於活體外轉錄的DNA模板可能藉由選殖核酸(特別是cDNA)，並將其引入用於活體外轉錄的合適載體中來獲得。cDNA可能藉由逆轉錄RNA來獲得。
轉錄期間產生的單股核酸分子通常具有模板互補序列的核酸序列。
術語「模板」或「核酸模板」或「模板核酸」通常指可被複製或被轉錄的核酸序列。
「從核酸序列轉錄的核酸序列」和類似術語是指核酸序列，在適當的情況下作為完整RNA分子的一部分，其為模板核酸序列的轉錄產物。通常，轉錄的核酸序列是單股RNA分子。
「核酸的3'端」是指具有游離羥基的末端。在雙股核酸(特別是DNA)的圖示中，3'端始終位於右手側。「核酸的5'端」是指具有游離磷酸根的末端。在雙股核酸(特別是DNA)的圖示中，5'端始終位於左手側。 5'端              5'--P-NNNNNNN-OH-3'       3'端 3'-HO-NNNNNNN-P--5'
「上游」描述了核酸分子的第一元件相對於該核酸分子的第二元件的相對定位，其中兩個元件包含在同一核酸分子中，並且其中第一元件位於比核酸分子的第二元件更接近該核酸分子的5'端。第二元件則稱為在該核酸分子的第一元件的「下游」。位於第二元件「上游」的元件可以同義地稱為位於該第二元件的「5'」。就雙股核酸分子來說，像是「上游」和「下游」的指示是針對(+)股提供的。
術語「功能性鍵聯」或「在功能上連接」是有關功能性關係內的連結。如果核酸與另一核酸序列在功能上相關，則該核酸是「在功能上連接」。例如，如果啟動子影響編碼序列的轉錄，則其與編碼序列在功能上連接。功能性連接的核酸通常彼此相鄰，在適當情況下被其他核酸序列隔開，並且在特定的實施例中藉由RNA聚合酶轉錄以產生單一RNA分子(共同轉錄本)。
在具體實施例中，核酸與表現控制序列在功能上連接，該表現控制序列可能與核酸同源或異源。
術語「表現控制序列」可包含啟動子、核醣體結合序列和控制基因轉錄或衍生RNA轉譯的其他控制元件。在具體實施例中，可以調節表現控制序列。表現控制序列的精確結構可能因物種或細胞類型而異，但通常包括分別參與起始轉錄和轉譯的5'-非轉錄序列以及5'-和3'-非轉譯序列。更具體地，5'-非轉錄表現控制序列包括啟動子區域，其涵蓋用於在功能上連接的基因的轉錄控制的啟動子序列。表現控制序列還可能包括增強子序列或上游活化子序列。DNA分子的表現控制序列通常包括5'-非轉錄序列以及5'-和3'-非轉譯序列，諸如TATA匣、加帽序列、CAAT序列與類似者。α病毒RNA的表現控制序列可能包括亞基因體啟動子及/或一或多個保守序列元件。特定表現控制序列可以是α病毒屬的亞基因體啟動子，如本文所述。
本文具體說明的核酸序列(特別是可轉錄和編碼核酸序列)可能與任何表現控制序列(特別是啟動子)組合，表現控制序列可能與該等核酸序列同源或異源，其中術語「同源」是指核酸序列也與表現控制序列天然地在功能上連接，而術語「異源」是指核酸序列不與表現控制序列天然地在功能上連接。
如果可轉錄的核酸序列(特別是編碼肽或蛋白質的核酸序列)和表現控制序列以受到表現控制序列控制或影響而使得可轉錄(特別是編碼)核酸序列轉錄或表現的方式彼此共價連接的話，則它們彼此「在功能上」連接。如果核酸序列將被轉譯成功能性肽或蛋白質，則誘導與編碼序列在功能上連接的表現控制序列會導致該編碼序列的轉錄，而不造成編碼序列中的框移或編碼序列無法被轉譯成期望的肽或蛋白質。
術語「啟動子」或「啟動子區」是指藉由提供RNA聚合酶的辨識與結合位點來控制轉錄本(例如包含編碼序列的轉錄本)合成的核酸序列。啟動子區可能包括參與調節該基因轉錄的其他因子的其他辨識或結合位點。啟動子可能控制原核或真核基因的轉錄。啟動子可能是「誘導型」並且回應誘導子而啟動轉錄，或者如果轉錄不受誘導子控制則可能是「組成型」。如果不存在誘導子，則誘導型啟動子僅在很小的程度上表現或完全不表現。在誘導子存在的情況下，基因被「打開」或轉錄量增加。這通常是透過特定轉錄因子的結合來媒介的。特定啟動子可以是例如本文所述之α病毒的亞基因體啟動子。其他特異性啟動子是基因體正股或負股啟動子，例如α病毒的基因體正股或負股啟動子。
術語「核心啟動子」是指啟動子所包含的核酸序列。核心啟動子通常是正確啟動轉錄所需的啟動子的最小部分。核心啟動子通常包括轉錄起始位點和RNA聚合酶的結合位點。
「聚合酶」通常指能夠催化從單體結構單元合成聚合分子的分子實體。「RNA聚合酶」是能夠催化從核糖核苷酸結構單元合成RNA分子的分子實體。「DNA聚合酶」是能夠催化從去氧核糖核苷酸結構單元合成DNA分子的分子實體。就DNA聚合酶和RNA聚合酶的情況來說，分子實體通常是蛋白質或多個蛋白質的組裝體或複合體。通常DNA聚合酶是基於模板核酸合成DNA分子，模板核酸通常是DNA分子。通常RNA聚合酶基於模板核酸合成RNA分子，該模板核酸是DNA分子(在這種情況下RNA聚合酶是DNA依賴性RNA聚合酶，DdRP)或RNA分子(在這種情況下RNA聚合酶是RNA依賴性RNA聚合酶，RdRP)。
「RNA依賴性RNA聚合酶」或「RdRP」或「複製酶」是催化RNA從RNA模板轉錄的酵素。在α病毒RNA依賴性RNA聚合酶的情況下，依序合成基因體RNA的(-)股互補序列和(+)股基因體RNA會導致RNA複製。因此，RNA依賴性RNA聚合酶同義地稱為「RNA複製酶」或簡稱為「複製酶」。在自然界中，RNA依賴性RNA聚合酶通常由逆轉錄病毒以外的所有RNA病毒編碼。編碼RNA依賴性RNA聚合酶的病毒典型代表是α病毒。
術語「經修飾RNA依賴性RNA聚合酶」或「經修飾複製酶」是RNA依賴性RNA聚合酶」或「RdRP」或「複製酶」，其中胺基酸序列相對於起始(未經修飾) RNA依賴性RNA聚合酶的胺基酸序列已經改變。
「RNA複製」一般是指基於給定RNA分子(模板RNA分子)的核苷酸序列進行合成的RNA分子。合成的RNA分子可能例如與模板RNA分子相同或互補。一般來說，RNA複製可能經由DNA中間體的合成發生，或者可能藉由RNA依賴性RNA聚合酶(RdRP)媒介的RNA依賴性RNA複製直接發生。就α病毒而言，RNA複製不是經由DNA中間體發生的，而是由RNA依賴性RNA聚合酶(RdRP)媒介的：模板RNA股(第一股RNA)或其一部分充當合成與第一股RNA或其一部分互補的第二股RNA的模板。第二股RNA或其一部分又可能視情況充當合成與第二股RNA或其一部分互補的第三股RNA的模板。從而第三股RNA與第一股RNA或其一部分相同。因此RNA依賴性RNA聚合酶能夠直接合成模板的互補股RNA，並且能夠間接合成同一股RNA (經由互補股中間體)。
術語「模板RNA」是指可以藉由RNA依賴性RNA聚合酶轉錄或複製的RNA。該術語包括「複製子」、「反式複製子」、「順式複製子」、「可複製RNA」，所有這些都可以互換使用。本文所用的「TR」只是反式複製子的縮寫。如已知的，複製子可以衍生自例如α病毒，並且因此含有病毒元件，包括亞基因體啟動子和可操作地連接的編碼病毒結構蛋白的核苷酸序列。編碼病毒結構蛋白的核苷酸序列可以被替換為例如編碼感興趣胺基酸序列的核苷酸序列，使得其轉譯受到可操作地連接的亞基因體啟動子控制。複製子還可以是其中編碼感興趣胺基酸序列的核苷酸序列被置放在複製子中不同位置的複製子，這允許不僅刪除編碼病毒結構蛋白的核苷酸序列而且還刪除亞基因體啟動子。這種其中亞基因體啟動子被刪除(連同編碼病毒結構蛋白的核苷酸序列)的複製子在本文中被稱為「奈米反式複製子」或「NTR」。NTR也可能藉由從5'複製辨識序列起移除所有起始密碼子而由TR改造而來，如先前在WO2017/162460A1中所述。
術語「基因」指負責產生一或多種細胞產物及/或實現一或多種細胞間或細胞內功能的特定核酸序列。更具體地，該術語是有關核酸部分(通常為DNA；但在RNA病毒的情況下為RNA)，其包含編碼特定蛋白質或功能性或結構性RNA分子的核酸。
如本文所用，「經分離的分子」意指基本上不含其他分子(諸如其他細胞材料)的分子。術語「經分離的核酸」在本文表示核酸已(i)在活體外擴增，例如藉由聚合酶鏈反應(PCR)、(ii)藉由選殖重組產生、(iii)例如藉由切割和凝膠電泳分離來純化，或(iv)例如藉由化學合成來合成的。經分離的核酸是可藉由重組技術進行操作的核酸。
術語「載體」在此以其最普遍的含義使用並且包含用於核酸的任何中間媒介物，其例如使得該核酸能夠被引入原核及/或真核宿主細胞中並且在適當的情況下被併入基因體。此類載體較佳在細胞中複製及/或表現。載體包含質體、噬菌體、病毒基因體及其片段。
在本發明的上下文中，術語「重組」表示「透過遺傳工程做出」。較佳地，「重組物體」(諸如重組細胞)不是天然存在的。
如本文所用，術語「天然存在的」是指物體可以在自然界中被發現到。例如，存在於生物體(包括病毒)中且可以從自然界的來源中分離且未經人為在實驗室中有目的修飾的肽或核酸是天然存在的。術語「在自然界中被發現到」表示「存在於自然界中」，並包括已知物體以及尚未被發現及/或尚未從自然界中被分離出來，但將來可能從天然來源中被發現及/或被分離出來的物體。
如本文所用，術語「表現」以其最普遍的含義使用並且包含RNA及/或蛋白質的產生。它還包含核酸的部分表現。此外，表現可能是瞬時的或穩定的。就RNA而言，術語「表現」或「轉譯」是有關一種在細胞核醣體中的過程，藉由該過程一股編碼RNA (例如信使RNA)指導胺基酸序列組裝而做出肽或蛋白質。
如本文所用，術語「mRNA」表示「信使RNA」並且有關編碼胺基酸序列(較佳地肽或蛋白質)，並且可以在活體內或活體外被轉譯以產生胺基酸序列的轉錄本。例如，可以藉由使用DNA模板來生成mRNA。通常，mRNA包含5'-UTR、蛋白質編碼區、3'-UTR和聚(A)序列。可複製RNA分子(諸如自我擴增RNA (saRNA)或順式複製子、或反式複製子(TR)或奈米反式複製子(NTR))可以被理解為一類的mRNA。mRNA可能藉由活體外轉錄從DNA模板生成。活體外轉錄方法是習於技藝者已知的。例如，有多種市售活體外轉錄套組。可以透過併入穩定化修飾及/或加帽來修飾mRNA。在可複製RNA分子包含非編碼核苷酸序列(諸如miRNA或前miRNA序列、或核酶序列、或反義序列)的實施例中，此類可複製RNA分子也可被認為是mRNA，儘管沒有發生RNA分子轉譯。
術語「聚(A)序列」或「聚(A)尾」或「聚(A)結構」在本文中是指通常位於RNA分子的3'端處的不間斷或間斷的腺苷酸殘基序列。不間斷的序列的特徵在於連續的腺苷酸殘基。在自然界中，不間斷的聚(A)序列是典型的。雖然聚(A)序列在真核DNA中通常並未編碼，但在細胞核中的真核轉錄期間於轉錄後透過模板獨立性RNA聚合酶被附接到RNA的游離3'端，本文所涵蓋DNA編碼的聚(A)序列。在一個較佳實施例中，本文所述的RNA分子包含不間斷的聚(A)序列。
如本文所用，提到核酸分子時，術語「一級結構」是指核苷酸單體的線性序列。
提到核酸分子時，術語「二級結構」是指反映鹼基配對的核酸分子的二維表示；例如；在單股RNA分子的情況下特別是分子內鹼基配對。儘管各個RNA分子只有單一條多核苷酸股，但該分子通常以(分子內)鹼基對區域為特徵。術語「二級結構」包含結構模體，包括但不限於鹼基對、莖、莖環、凸起、環(諸如內環和多分支環)。核酸分子的二級結構可以透過顯示鹼基配對的二維圖(平面圖)來表示(有關RNA分子二級結構的更多細節，參見Auber et al., 2006; J. Graph Algorithms Appl. 10:329-351)。某些RNA分子的二級結構在某些實施例中可能是相關的。
核酸分子的二級結構(特別是單股RNA分子的二級結構)可以透過使用用於RNA二級結構預測的網路伺服器進行預測來確定(http://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html)。較佳地，提到核酸分子時，「二級結構」具體指透過該預測所確定的二級結構。也可以使用MFOLD結構預測(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold)來執行或確認該預測。
如本文所用，「鹼基對」是二級結構的一種結構模體，其中兩個核苷酸鹼基透過鹼基上的供體位點與受體位點之間的氫鍵彼此締合。互補鹼基A：U和G：C透過鹼基上供體位點和受體位點之間的氫鍵形成穩定的鹼基對；A：U和G：C鹼基對被稱為Watson-Crick鹼基對。較弱的鹼基對(被稱為Wobble鹼基對)是由鹼基G和U (G：U)形成。鹼基對A：U和G：C被稱為經典鹼基對。其他鹼基對如G：U (在RNA中經常出現)和其他罕見鹼基對(例如A：C；U：U)被稱為非經典鹼基對。
如本文所用，「核苷酸配對」是指兩個核苷酸彼此締合，使得它們的鹼基形成鹼基對(經典或非經典鹼基對，較佳地經典鹼基對，最佳地Watson-Crick鹼基對)。
提到核酸分子時，術語「莖環」或「髮夾」或「髮夾環」均可互換地指核酸分子的特定二級結構，通常是單股核酸分子，諸如單股RNA分子。莖環所代表的特定二級結構由包含莖和(末端)環的連續核酸序列組成，也稱為髮夾環，其中莖由兩個相鄰的完全或部分互補的序列元件形成；它們被一個短序列(例如3-10個核苷酸)分隔，短序列形成莖環結構的環。兩個相鄰的完全或部分互補序列可定義為例如莖環元件莖1和莖2。這兩個相鄰的完全或部分互補序列(例如莖環元件莖1和莖2)彼此形成鹼基對時形成莖環，導致雙股核酸序列在其末端包含由位於莖環元件莖1和莖2之間的短序列形成的不配對環。因此，莖環包含兩個莖(莖1和莖2)，其在核酸分子的二級結構層次上彼此形成鹼基對，並且在核酸分子的一級結構層次上被一個不是莖1或莖2一部分的短序列隔開。為說明起見，莖環的二維表示類似棒棒糖狀結構。莖環結構的形成需要存在可以自身折起以形成配對的雙股序列；配對的雙股由莖1和莖2形成。長度、能夠與莖2的核苷酸形成鹼基對(較佳地經典鹼基對，更佳地Watson-Crick鹼基對)的莖1的核苷酸與數量，和不能與莖2的核苷酸形成此等鹼基對(錯配或凸起)的莖1的核苷酸的數量通常決定了配對莖環元件的穩定性。最佳環長度可以是3-10個核苷酸，更佳地4-7個核苷酸，諸如4個核苷酸、5個核苷酸、6個核苷酸或7個核苷酸。如果給定核酸序列以莖環為特徵，則相應的互補核酸序列通常也以莖環為特徵。莖環通常由單股RNA分子形成。例如，α病毒基因體RNA的5'複製辨識序列中存在多個莖環。
如本文所用，提到核酸分子的特定二級結構(例如莖環)時，「破壞(disruption或disrupt)」表示特定二級結構不存在或被改變。通常，二級結構可能由於作為二級結構一部分的至少一個核苷酸改變而被破壞。例如，莖環可能因為形成莖的一或多個核苷酸改變使得核苷酸不能配對而被破壞。
如本文所用，「補償二級結構破壞(compensates for secondary structure disruption或compensating for secondary structure disruption)」是指核酸序列中一或多個核苷酸的改變；更典型地，它是指核酸序列中一或多個第二核苷酸的改變，該核酸序列還包含一或多個第一核苷酸改變，其特徵如下：當一或多個第一核苷酸改變時，於一或多個第二核苷酸改變不存在的情況下導致核酸序列的二級結構破壞，一或多個第一核苷酸改變與一或多個第二核苷酸改變的共存則不會導致核酸序列的二級結構被破壞。共存表示一或多個第一核苷酸改變與一或多個第二核苷酸改變兩者均存在。通常，一或多個第一核苷酸改變與一或多個第二核苷酸改變一起存在於同一核酸分子中。在一個具體實施例中，補償二級結構破壞的一或多個核苷酸改變是補償一或多個核苷酸配對破壞的一或多個核苷酸改變。因此在一個實施例中，「補償二級結構破壞」表示「補償核苷酸配對破壞」，即一或多個核苷酸配對破壞，例如一或多個莖環內的一或多個核苷酸配對破壞。該一或多個核苷酸配對破壞可能透過移除至少一個起始密碼子而被引入。補償二級結構破壞的一或多個核苷酸改變中的每一者都是核苷酸改變，其各自可以獨立地選自一或多個核苷酸的缺失、添加、取代及/或插入。在例示性實例中，當核苷酸配對A：U已透過A取代C而被破壞時(C和U通常不適合形成核苷酸對)；那麼補償核苷酸配對破壞的核苷酸改變可以是用G取代U，因此能夠形成C：G核苷酸配對。因而以G取代U可以補償核苷酸配對破壞。在一個替代實施例中，當核苷酸配對A：U已透過A取代為C而被破壞時；那麼補償核苷酸配對破壞的核苷酸變化可能是用A取代C，從而恢復原始A：U核苷酸配對的形成。大體上，既未恢復原始核酸序列也不產生新的AUG三聯體的那些補償二級結構破壞的核苷酸變化是較佳的。在上述一組實例中，偏好U至G取代更甚於C至A取代。
提到核酸分子時，術語「三級結構」是指核酸分子的三維結構，如由原子座標定義的。
核酸分子(諸如RNA，例如rRNA)可能編碼蛋白質。因此，可轉錄核酸序列或其轉錄本可能含有編碼蛋白質的開放閱讀框(ORF)。
如本文所用，術語「編碼蛋白質的核酸」表示核酸如果存在於適當環境中(較佳地存在於細胞內)時，可以在轉譯過程期間指導胺基酸組裝以產生蛋白質。較佳地，編碼RNA能夠與細胞轉譯機器交互作用，允許編碼RNA轉譯以產生蛋白質。
術語「肽」包含寡肽和多肽，並且是指包含兩個或更多個，較佳地3個或更多個，較佳地4個或更多個，較佳地6個或更多個，較佳地8個或更多個，較佳地10個或更多，較佳地13個或更多，較佳地16個或更多個，較佳地20個或更多個，以及至多較佳地50個，較佳地100個或較佳地150個連續胺基酸經由肽鍵彼此連接的物質。術語「肽」和「蛋白質」在本文中通常作為同義詞使用。
術語「肽」和「蛋白質」可以包含含有不僅胺基酸組分而且含有非胺基酸組分(諸如糖和磷酸結構)，並且還包含含有鍵(諸如酯、硫醚或二硫鍵)的物質。
術語「多蛋白」指單一肽，其包含至少2個，較佳地至少3個，較佳地至少4個蛋白質(較佳地作為中間體)的胺基酸序列。單一肽被蛋白酶切割以產生單一蛋白質。包含在多蛋白中的蛋白質已經可以在多蛋白的範圍內發揮作用或可以在從多蛋白切割後獲得功能。此外，蛋白質的功能可能會在從多蛋白切割後改變。切割多蛋白的蛋白酶可以包含在多蛋白本身中，即多蛋白具有自體蛋白水解活性。多蛋白通常透過轉譯RNA的單一開放閱讀框而產生。
如本文所用，術語「起始密碼子(initiation codon和start codon)」同義指RNA分子的密碼子(鹼基三聯體)，其可能是由核醣體轉譯的第一個密碼子。這種密碼子通常編碼真核生物中的胺基酸甲硫胺酸與原核生物中的經修飾甲硫胺酸。真核生物和原核生物中最常見的起始密碼子是AUG。除非本文具體說明意指AUG以外的起始密碼子，否則提到RNA分子時，術語「起始密碼子(initiation codon和start codon)」是指密碼子AUG。術語「起始密碼子(initiation codon和start codon)」也用於指去氧核糖核酸的對應鹼基三聯體，即編碼RNA起始密碼子的鹼基三聯體。如果信使RNA的起始密碼子是AUG，則編碼AUG的鹼基三聯體是ATG。術語「起始密碼子(initiation codon和start codon)」較佳地指功能性起始密碼子或起始密碼子，即指被核醣體用作為或將用作為起始轉譯的密碼子的起始密碼子或起始密碼子。RNA分子中可能有不被核醣體用作為起始轉譯的密碼子的AUG密碼子，例如由於密碼子到帽的距離短。這些密碼子不涵蓋在術語功能性起始密碼子或起始密碼子內。
術語「開放閱讀框的起始密碼子(start codon of the open reading frame或initiation codon of the open reading frame)」是指在編碼序列中(例如在自然界中發現的核酸分子的編碼序列中)充當蛋白質合成的起始密碼子的鹼基三聯體。在RNA分子中，開放閱讀框的起始密碼子前面通常有一個5'非轉譯區(5'-UTR)，但這不是嚴格要求的。
如本文所用，術語「開放閱讀框的天然起始密碼子(native start codon of the open reading frame或native initiation codon of the open reading frame)」是指在天然編碼序列中充當蛋白質合成的起始密碼子的鹼基三聯體。天然編碼序列可能是例如自然界中發現的核酸分子的編碼序列。在一些實施例中，自然界中發現的核酸分子變體，其特徵在於天然起始密碼子(其存在於天然編碼序列中)已被移除(使得其不存在於變體核酸分子中)。
如本文所用，「第一AUG」意指信使RNA分子最上游的AUG鹼基三聯體，較佳地被核醣體用作為或將用作為密碼子以起始轉譯的信使RNA分子最上游的AUG鹼基三聯體。因此，「第一ATG」是指編碼第一AUG的編碼DNA序列的ATG鹼基三聯體。在一些情況下，mRNA分子的第一個AUG是開放閱讀框的起始密碼子，也就是在核醣體蛋白質合成期間用作為起始密碼子的密碼子。
提到核酸變體的某個元件時，術語「包含移除」或「以移除為特徵」和類似術語表示與參考核酸分子相比，該某個元件在核酸變體中沒有功能或不存在。在不受限制的情況下，移除可以包含刪除某個元件的全部或部分、取代某個元件的全部或部分，或改變某個元件的功能或結構性質。移除核酸序列的功能元件要求在包含移除的核酸變體的位置處不展現出功能。例如，以移除某個起始密碼子為特徵的RNA變體要求核醣體蛋白質合成不在以移除為特徵的RNA變體的位置處起始。移除核酸序列的結構元件要求結構元件不存在於包含移除的核酸變體的位置處。例如，以移除某個AUG鹼基三聯體(即在某個位置處的AUG鹼基三聯體)為特徵的RNA變體可能以例如移除某個AUG鹼基三聯體的部分或全部(例如ΔAUG)，或以任何一或多個不同核苷酸取代某個AUG鹼基三聯體的一或多個核苷酸(A、U、G)，使得所得到的變體的核苷酸序列不包含該AUG鹼基三聯體為特徵。一個核苷酸的適當取代是將AUG鹼基三聯體轉化為GUG、CUG或UUG鹼基三聯體，或轉化為AAG、ACG或AGG鹼基三聯體，或轉化為AUA、AUC或AUU鹼基三聯體者。可以相應地挑選更多核苷酸的合適取代。
如本文所用，術語「自我複製型病毒」包括能夠在宿主細胞中自主複製的RNA病毒。自我複製型病毒可能具有單股RNA (ssRNA)基因體，並包括α病毒、黃病毒、麻疹病毒(MV)和棒狀病毒。α病毒和黃病毒具有正極性基因體，而麻疹病毒(MV)和棒狀病毒的基因體是負股ssRNA。通常，自我複製型病毒是具有(+)股RNA基因體的病毒，其可以在感染細胞後直接轉譯，而這種轉譯提供RNA依賴性RNA聚合酶，然後該酶從受感染的RNA產生反義和有義轉錄本。在下文中，透過參考α病毒衍生的載體作為自我複製型病毒衍生的載體的實例來說明本發明。然而，應理解「自我複製型病毒」不限於α病毒衍生的載體。
如本文所用，術語「α病毒」應廣義地理解並且包括具有α病毒特徵的任何病毒顆粒。α病毒的特徵包括存在(+)股RNA，其編碼適合在宿主細胞中複製的遺傳訊息，包括RNA聚合酶活性。許多α病毒的更多特徵描述於例如Strauss & Strauss, 1994, Microbiol. Rev. 58:491-562中。術語「α病毒」包括自然界中發現的α病毒及其任何變體或衍生物。在一些實施例中，在自然界中沒有發現到變體或衍生物。
在一個實施例中，α病毒是自然界中發現的α病毒。通常，自然界中發現的α病毒對任何一或多種真核生物體(諸如動物(包括諸如人類的脊椎動物和諸如昆蟲的節肢動物))具有感染性。自然界中發現的α病毒較佳地選自由以下組成之群：巴爾馬森林病毒複合體(包含巴爾馬森林病毒)；東部馬腦炎複合體(包含七種抗原類型的東部馬腦炎病毒)；米德爾堡病毒複合體(包含米德爾堡病毒)；恩杜穆病毒複合體(包含恩杜穆病毒)；塞姆利基森林病毒複合體(包括貝巴魯病毒(Bebaru virus)、屈公病毒、馬亞羅病毒(Mayaro virus)及其亞型烏納病毒(Una virus)、奧尼永尼永病毒(O’Nyong Nyong virus)及其亞型伊博-奧拉病毒(Igbo-Ora virus)、羅斯河病毒(Ross River virus)及其亞型貝巴魯病毒(Bebaru virus)、給塔病毒(Getah virus)、鷺山病毒(Sagiyama virus)、塞姆利基森林病毒及其亞型米池病毒(Me Tri virus)；委內瑞拉馬腦炎複合體(包括卡巴蘇病毒(Cabassou virus)、沼澤地病毒(Everglades virus)、莫索達斯佩德拉斯病毒(Mosso das Pedras virus)、穆坎博病毒(Mucambo virus)、帕拉馬納病毒(Paramana virus)、皮庫納病毒(Pixuna virus)、里奧內格羅病毒(Rio Negro virus)、特羅卡拉病毒(Trocara virus)及其亞型比茹橋病毒(Bijou Bridge virus)、委內瑞拉馬腦炎病毒)；西部馬腦炎複合體(包括奧拉病毒(Aura virus)、巴班肯病毒(Babanki virus)、茲拉加奇病毒病毒(Kyzylagach viru)、辛德比斯病毒、奧克爾布病毒(Ockelbo virus)、瓦塔羅阿病毒(Whataroa virus)、博吉溪病毒(Buggy Creek virus)、摩根堡病毒(Fort Morgan virus)、高地J病毒(Highlands J virus)、西部馬腦炎病毒)；以及一些未分類的病毒，包括鮭魚胰臟病病毒(Salmon pancreatic disease virus)；睡眠病病毒(Sleeping Disease virus)；南象海豹病毒(Southern elephant seal virus)；托納特病毒(Tonate virus)。更佳地，α病毒選自由塞姆利基森林病毒複合體(包含如上所述的病毒類型，包括塞姆利基森林病毒)、西部馬腦炎複合體(包含如上所述的病毒類型，包括辛德比斯病毒)、東部馬腦炎病毒(包含如上所述的病毒類型)、委內瑞拉馬腦炎複合體(包含如上所述的病毒類型，包括委內瑞拉馬腦炎病毒)組成之群。
在進一步的實施例中，α病毒是塞姆利基森林病毒。在其他替代實施例中，α病毒是辛德比斯病毒。在一個較佳實施例中，α病毒是委內瑞拉馬腦炎病毒。
在一些實施例中，α病毒不是自然界中發現的α病毒。通常，自然界中未發現的α病毒是自然界中發現的α病毒的變體或衍生物，其與自然界中發現的α病毒的區別在於核苷酸序列(即基因體RNA)中的至少一個突變。與自然界中發現的α病毒相比，核苷酸序列中的突變可能選自一或多個核苷酸的插入、取代或缺失。核苷酸序列中的突變可能與由該核苷酸序列編碼的多肽或蛋白質中的突變相關或不相關。例如，自然界中未發現的α病毒可能是減毒的α病毒。自然界中未發現的減毒α病毒是通常在其核苷酸序列中具有至少一個突變的α病毒，它因為該突變而與自然界中發現的α病毒不同，並且其不是完全不具有傳染性，就是具有傳染性但具有較低致病能力或一點致病能力都沒有。作為說明性實例，TC83是減毒α病毒，其與自然界中發現的委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)不同(McKinney et al., 1963, Am. J. Trop. Med. Hyg. 12:597-603)。
α病毒屬的成員也可能根據其在人類中的相對臨床特徵進行分類：主要與腦炎有關的α病毒，以及主要與發燒、皮疹和多關節炎有關的α病毒。
術語「α病毒的」表示在α病毒中發現的，或衍生自α病毒或例如透過基因工程衍生自α病毒。
如本文所用，「SFV」代表塞姆利基森林病毒。如本文所用，「SIN」或「SINV」代表辛德比斯病毒。如本文所用，「VEE」或「VEEV」代表委內瑞拉馬腦炎病毒。
術語「α病毒的」或「衍生自α病毒」是指α病毒來源的實體。為了說明，α病毒的蛋白質可能指α病毒中發現的蛋白質及/或指由α病毒編碼的蛋白質；而α病毒的核酸序列可能指α病毒中發現的核酸序列及/或指由α病毒編碼的核酸序列。較佳地，「α病毒的」核酸序列是指「α病毒的基因體的」及/或「α病毒的基因體RNA的」核酸序列。
術語「α病毒RNA」是指α病毒基因體RNA (即(+)股)、α病毒基因體RNA的互補序列(即(-)股)及亞基因體轉錄本(即(+)股)中的任何一或多者。
如本文所用，「α病毒基因體」是指α病毒的基因體(+)股RNA。
術語「天然α病毒序列」和類似術語通常指天然存在的α病毒(自然界中發現的α病毒)的(例如核酸)序列。在一些實施例中，術語「天然α病毒序列」還包括減毒α病毒的序列。
術語「5'複製辨識序列」較佳地指連續核酸序列，較佳地核糖核酸序列，其與自我複製型病毒基因體(諸如α病毒基因體)的5'片段相同或同源。「5'複製辨識序列」是一種可以被諸如α病毒複製酶的複製酶辨識的核酸序列。術語5'複製辨識序列包括天然5'複製辨識序列及其功能等效物，諸如例如自然界中發現的自我複製型病毒(例如在自然界中發現的α病毒)的5'複製辨識序列的功能變體。功能等效物包括5'複製辨識序列的衍生物，其特徵在於移除了至少一個如本文所述的起始密碼子。5'複製辨識序列是合成α病毒基因體RNA的(-)股互補序列所必需的，並且是基於(-)股模板合成(+)股病毒基因體RNA所必需的。天然5'複製辨識序列通常至少編碼nsP1的N端片段；但不包含編碼nsP1234的整個開放閱讀框。有鑑於天然5'複製辨識序列通常至少編碼nsP1的N端片段，天然5'複製辨識序列通常包含至少一個起始密碼子，通常為AUG。在一個實施例中，5'複製辨識序列包含α病毒基因體或其變體的保守序列元件1 (CSE 1)和α病毒基因體或其變體的保守序列元件2 (CSE 2)。5'複製辨識序列通常能夠形成四個莖環(SL)，即SL1、SL2、SL3、SL4。這些莖環的編號始於5'複製辨識序列的5'端。
術語「保守序列元件」或「CSE」是指α病毒RNA中發現的核苷酸序列。這些序列元件被稱為「保守的」，因為同種異源物存在於不同α病毒的基因體中，且不同α病毒的同種異源CSE較佳地共享高百分率的序列同一性及/或相似的二級或三級結構。術語CSE包括CSE 1、CSE 2、CSE 3和CSE 4。
術語「CSE 1」或「44-nt CSE」同義指從(-)股模板合成(+)股所需的核苷酸序列。術語「CSE 1」是指(+)股上的序列；以及CSE 1的互補序列(在(-)股上)充當(+)股合成的啟動子。較佳地，術語CSE 1包括α病毒基因體最5'的核苷酸。CSE 1通常形成保守的莖環結構。在不希望受特定理論囿限的情況下，咸信對於CSE 1來說，二級結構比一級結構(即線性序列)更為重要。在模型α病毒辛德比斯病毒的基因體RNA中，CSE 1由44個核苷酸的連續序列組成，其由基因體RNA最5'的44個核苷酸形成(Strauss & Strauss, 1994, Microbiol. Rev. 58:491-562)。
術語「CSE 2」或「51-nt CSE」同義指從(+)股模板合成(-)股所需的核苷酸序列。(+)股模板通常是α病毒基因體RNA或RNA複製子(注意，不包含CSE 2的亞基因體RNA轉錄本不作為(-)股合成的模板)。在α病毒基因體RNA中，CSE 2通常位於nsP1的編碼序列內。在模型α病毒辛德比斯病毒的基因體RNA中，51-nt CSE位於基因體RNA的核苷酸位置155-205處(Frolov et al., 2001, RNA, vol. 7, pp. 1638-1651)。CSE 2通常形成兩個保守的莖環結構。這些莖環結構被指定為莖環3 (SL3)和莖環4 (SL4)，因為從α病毒基因體RNA的5'端開始計數它們分別是α病毒基因體RNA的第三個與第四個保守莖環。在不希望受特定理論囿限的情況下，咸信對於CSE2來說，二級結構比一級結構(即線性序列)更為重要。
術語「CSE 3」或「連接序列」同義指衍生自α病毒基因體RNA並且包含亞基因體RNA的起始位點的核苷酸序列。在(-)股中，這個序列的互補序列發揮促進亞基因體RNA轉錄的作用。在α病毒基因體RNA中，CSE 3通常與編碼nsP4之C端片段的區域重疊，並延伸至位於編碼結構蛋白的開放閱讀框上游的短非編碼區。
術語「CSE 4」或「19-nt保守序列」或「19-nt CSE」同義指α病毒基因體RNA的核苷酸序列，緊鄰α病毒體3'非轉譯區中的聚(A)序列上游。CSE 4通常由19個連續核苷酸組成。在不希望受特定理論囿限的情況下，CSE 4被認為充當起始(-)股合成的核心啟動子(José et al., 2009, Future Microbiol. 4:837-856)；及/或CSE 4和α病毒基因體RNA的聚(A)尾被認為共同發揮作用以實現有效率的(-)股合成(Hardy & Rice, 2005, J. Virol. 79:4630-4639)。
術語「亞基因體啟動子」或「SGP」如本文所用是指核酸序列(例如編碼序列)上游(5')的核酸序列，其透過提供RNA聚合酶(通常是RNA依賴性RNA聚合酶) (特別是功能性α病毒非結構蛋白)的辨識和結合位點來控制該核酸序列的轉錄。SGP可能包括其他因子的進一步辨識或結合位點。亞基因體啟動子通常是正股RNA病毒(諸如α病毒)的遺傳元件。α病毒的亞基因體啟動子是包含在病毒基因體RNA中的核酸序列。亞基因體啟動子一般特徵在於，其允許在RNA依賴性RNA聚合酶(例如功能性α病毒非結構蛋白)存在下啟動轉錄(RNA合成)。RNA(-)股，即α病毒基因體RNA的互補序列，用作合成(+)股亞基因體轉錄本的模板，且(+)股亞基因體轉錄本的合成通常在亞基因體啟動子處或附近起始。如本文所用，術語「亞基因體啟動子」不限於包含此類亞基因體啟動子的核酸中的任何特定定位。在一些實施例中，SGP與CSE 3相同或與CSE 3重疊或包含CSE 3。
術語「亞基因體轉錄本」或「亞基因體RNA」同義是指因為使用RNA分子作為模板(「模板RNA」)進行轉錄而獲得的RNA分子，其中模板RNA包含控制亞基因體轉錄本轉錄的亞基因體啟動子。亞基因體轉錄本可在RNA依賴性RNA聚合酶(特別是功能性α病毒非結構蛋白)存在下取得。例如，術語「亞基因體轉錄本」可能是指使用α病毒基因體RNA的(-)股互補序列作為模板在被α病毒感染的細胞中製備的RNA轉錄本。然而，如本文所用，術語「亞基因體轉錄本」不限於此，還包括可使用異源RNA作為模板獲得的轉錄本。例如，亞基因體轉錄本也可以透過使用含有SGP的複製子的(-)股互補序列作為模板來獲得。因此，術語「亞基因體轉錄本」可能指可透過轉錄α病毒基因體RNA的片段獲得的RNA分子，以及可透過轉錄可複製RNA的片段獲得的RNA分子。
術語「異源」用於說明由多個不同元件組成的事物。例如，將一名個體的細胞引入不同個體體內就構成異源移植。異源基因是源自於個體以外的來源的基因。
可用於鑑定序列改變的方法中的細胞是任何合適的細胞，其中RNA (在有或沒有任何核苷酸修飾的情況下)可被複製及/或轉譯。細胞可能是哺乳動物細胞，例如人類細胞。細胞可能組成性地表現複製酶(該複製酶辨識存在於可複製RNA中的序列以進行複製)，或者可以瞬時表現這樣的複製酶。
下文提供本文所述的個別特徵的具體及/或較佳變體。本文也考慮作為尤佳實施例的那些實施例，它們透過組合針對本文所述的兩個或更多個特徵描述的兩個或更多個特定及/或較佳變體而產生的。 編碼經修飾 RNA 依賴性 RNA 聚合酶的核酸 ( 第一核酸分子 )
本文提供包含編碼經修飾RNA依賴性RNA聚合酶(複製酶)的開放閱讀框的(第一)核酸分子，該經修飾聚合酶與相應未經修飾聚合酶相比具有增加的反式擴增活性。與相應未經修飾聚合酶相比之下，這個核酸可以與反式複製子組合使用(例如在下文所述提供的系統中)，該反式複製子能夠被經修飾聚合酶複製，使得產生反式複製子的多個拷貝，從而產生數量增加的功能性核苷酸序列。
核酸可以是DNA或RNA，較佳地為RNA (例如mRNA)。在一個實施例中，第一核酸分子是RNA複製子，其可以被其編碼的複製酶進行複製。在這個實施例中，核酸分子包含可以被經修飾聚合酶辨識的核苷酸序列，使得核酸(RNA)被複製。第一核酸分子可進一步包含其他特徵。
在一個實施例中，第一核酸分子是不能被其編碼的複製酶複製，較佳地不能被自我複製型病毒的任何複製酶複製的RNA分子。在這個實施例中，RNA分子可能缺少如本文所述複製通常所需的序列。
在一個較佳實施例中，核酸是非可複製RNA分子。在一個較佳實施例中，核酸分子是非可複製mRNA分子且較佳地包含典型真核mRNA的進一步特徵，諸如5'帽或聚(A)尾，如本文所述。
在一個實施例中，第一核酸分子進一步包含功能性核苷酸序列，例如編碼感興趣蛋白的開放閱讀框。 包含兩個核酸分子的系統
本文提供一種系統，其包含兩個核酸分子是指物理實體的組合，其中該等實體可以例如作為各別組合物或作為單一組合物來實現。在一個較佳實施例中，該系統是包含核酸分子以及與核酸分子形成顆粒之其他組分(諸如脂質)的組合物。該系統還可以透過組合兩個不同組合物來製造，其中第一組合物包含第一核酸分子，而第二組合物包含第二核酸分子。在另一個實施例中，兩種核酸分子也可能存在於各別組合物中，各組合物包含用於複合核酸分子的脂質或聚合物。在這個實施例中，各組合物可分別用於例如隨後諸如透過投予向個體提供核酸分子。在一個實施例中，該系統是包含第一核酸分子和第二核酸分子的組合物。
在一個較佳實施例中，該系統可以包含一或多個細胞，其中兩個核酸分子存在於同一細胞中或可存在於不同細胞中，較佳地存在於同一細胞中。在一個較佳實施例中，這些細胞可以在個體體內或可以被投予給個體。 RNA
本文所述的核酸分子較佳地是RNA分子並且可能視情況以其他特徵為特徵，例如5'-帽、5'-UTR、3'-UTR、聚(A)序列及/或改造用於優化轉譯及/或穩定RNA分子的密碼子使用，如下詳述。 5' 帽
在一些實施例中，本文所述的RNA包含5'帽。
天然真核mRNA包含7-甲基鳥苷帽，其經由5'至5'-三磷酸酯橋連接至mRNA，形成cap0結構(m7GpppN)。在大多數真核mRNA和一些病毒mRNA中，進一步的修飾可以發生在第一個核苷酸與後續核苷酸的2'-羥基基團(2'-OH) (例如2'-羥基基團可能被甲基化形成2'-O-Me)，分別產生「cap1」與「cap2」五'端。Diamond et al., (2014) Cytokine & growth Factor Reviews, 25:543-550報導cap0-mRNA無法像cap1-mRNA那樣有效率地被轉譯，其中2'-O-Me在mRNA 5'端處倒數第二個位置的角色是決定因素。缺少2'-O-met已被證明會觸發先天免疫性並活化IFN反應。Daffis et al. (2010) Nature, 468:452-456；以及Züst et al. (2011) Nature Immunology, 12:137-143。
RNA加帽在例如Decroly et al. (2012) Nature Reviews 10: 51-65；以及Ramanathan et al., (2016) Nucleic Acids Res; 44(16): 7511-7526中充分研究與說明。例如，在一些實施例中，可能合適的5'-帽結構是cap0 (第一個核鹼基的甲基化，例如m7GpppN)、cap1 (m7GpppN的相鄰核苷酸的核糖的額外甲基化)、cap2 (m7GpppN下游第二個核苷酸的核糖的額外甲基化)、cap3 (m7GpppN下游第三個核苷酸的核糖的額外甲基化)、cap4 (m7GpppN下游第四個核苷酸的核糖的額外甲基化)、ARCA (「抗反向帽類似物」)、經修飾的ARCA (例如經硫代磷酸酯修飾的ARCA)、肌苷、N1-甲基-鳥苷、2'-氟-鳥苷、7-去氮-鳥苷、8-側氧基-鳥苷、2-胺基-鳥苷、LNA-鳥苷，和2-疊氮基-鳥苷。
如本文所用，術語「5'帽」是指RNA (例如mRNA)的5'端上發現的結構，並且通常包括經由5'-5'三磷酸酯鍵聯連接至RNA (例如mRNA)的鳥苷核苷酸(也被稱為Gppp或G(5')ppp(5'))。在一些實施例中，包括在5'帽中的鳥苷核苷可能經修飾，例如藉由在鹼基(鳥嘌呤)上的一或多個位置處(例如在位置7處)的甲基化，及/或藉由在核糖的一或多個位置處的甲基化來進行修飾。在一些實施例中，包括在5'帽中的鳥苷核苷包含核糖處的3' O甲基化(3'OMeG)。在一些實施例中，包括在5'帽中的鳥苷核苷包含在鳥嘌呤7位置處的甲基化(m7G)。在一些實施例中，包括在5'帽中的鳥苷核苷包含在鳥嘌呤7位置處的甲基化與核糖處的3' O甲基化(m7(3'OMeG))。應理解，上段所使用的符號，例如「(m 2 7,3'-O)G」或「m7(3'OMeG)」適用於本文所述的其他結構。
在一些實施例中，提供本文所揭示之帶有5'-帽的RNA可能藉由活體外轉錄來達到，其中5'-帽被共轉錄表現成RNA股，或者可能轉錄後使用加帽酶附接至RNA。在一些實施例中，與使用適當參考比較物的共轉錄加帽相比，用所揭示之帽進行的共轉錄加帽增進了RNA的加帽效率。在一些實施例中，改善加帽效率可以增加RNA的轉譯效率及/或轉譯速率，及/或增加所編碼的多肽的表現。在一些實施例中，對多核苷酸的改變產生不可水解的帽結構，其可以例如防止脫帽並增加RNA半衰期。
在一些實施例中，T7 RNA聚合酶偏好G作為起始位點。因此，在一些這樣的實施例中，本發明提供帽(例如本文所述的三核苷酸帽和四核苷酸帽)，其中三核苷酸帽(例如N 2)或四核苷酸帽(例如N 3)的3'端是G。
在一些實施例中，應理解本文提供的所有化合物或結構(例如5'帽)涵蓋游離鹼或包含適當相對離子(例如Na +)的鹽形式(例如Na +鹽)。描述為鹽的化合物或結構(例如5'帽)也涵蓋游離鹼並包括適當相對離子(例如Na +)。
在一些實施例中，所採用的5'帽是cap0、cap1或cap2結構。參見例如Ramanathan et al.的圖1和Decroly et al.的圖1，其全部內容各自以引用的方式併入本文。參見例如Ramanathan et al.的圖1和Decroly et al.的圖1。在一些實施例中，本文所述的RNA包含cap1結構。在一些實施例中，本文所述的RNA包含cap2。
在一些實施例中，本文所述的RNA包含cap0結構。在一些實施例中，cap0結構包含在鳥嘌呤的7位置處被甲基化的鳥苷核苷((m 7)G)。在一些實施例中，這樣的cap0結構經由5'-至5'-三磷酸酯鍵聯連接至RNA並且在本文中也稱為(m 7)Gppp。在一些實施例中，cap0結構包含在鳥苷核糖的2'-位置處被甲基化的鳥苷核苷。在一些實施例中，cap0結構包含在鳥苷核糖的3'位置處被甲基化的鳥苷核苷。在一些實施例中，包括在5'帽中的鳥苷核苷包含在鳥嘌呤的7-位置與核糖的2'-位置處的甲基化((m 2 7,2'-O)G)。在一些實施例中，包括在5'帽中的鳥苷核苷包含在鳥嘌呤的7-位置和核糖的2'-位置處的甲基化((m 2 7,3'-O)G)。
在一些實施例中，cap1結構包含在鳥嘌呤的7位置處被甲基化((m 7)G)且視情況在核糖的2'或3'位置處被甲基化的鳥苷核苷，以及在RNA中2'O甲基化的第一個核苷酸((m 2'-O)N 1)。在一些實施例中，cap1結構包含在鳥嘌呤的7位置處被甲基化((m 7)G)和核糖的3'位置處被甲基化的鳥苷核苷，以及RNA中的2'O甲基化的第一個核苷酸((m 2'-O)N 1)。在一些實施例中，cap1結構經由5'-至5'-三磷酸酯鍵聯連接至RNA並且在本文中也被稱為例如((m 7)Gppp( 2'-O)N 1)或(m 2 7,3'-O)Gppp( 2'-O)N 1)，其中N 1如本文所定義和描述。在一些實施例中，cap1結構包含第二個核苷酸N 2，其在位置2處並且選自A、G、C或U，例如(m 7)Gppp( 2'-O)N 1pN 2或(m 2 7,3'-O)Gppp( 2'-O)N 1pN 2，其中N和N 2各自如本文所定義和描述。
在一些實施例中，cap2結構包含在鳥嘌呤的7位置處被甲基化((m 7)G)且視情況在核糖的2'或3'位置處被甲基化的鳥苷核苷，以及在RNA中2'O甲基化的第一個與第二個核苷酸((m 2'-O)N 1p(m 2'-O)N 2)。在一些實施例中，cap2結構包含在鳥嘌呤的位置7處被甲基化((m 7)G)和核糖的3'位置處被甲基化的鳥苷核苷，以及RNA中的2'O甲基化的第一核苷酸和第二核苷酸。在一些實施例中，cap2結構經由5'-至5'-三磷酸酯鍵聯連接至RNA並且在本文中也稱為例如((m 7)Gppp( 2'-O)N 1p( 2'-O)N 2)或(m 2 7,3'-O)Gppp( 2'-O)N 1p( 2'-O)N 2)，其中N 1和N 2各自如本文所定義和描述。
在一些實施例中，5'帽是二核苷酸帽結構。在一些實施例中，5'帽是包含N 1的二核苷酸帽結構，其中N 1如本文所定義和描述。在一些實施例中，5'帽是二核苷酸帽G*N 1，其中N 1如上文和本文所定義，並且： G*包含式(I)的結構： (I) 或其鹽， 其中 各R 2和R 3為-OH或-OCH 3；和 X為O或S。
在一些實施例中，R 2是-OH。在一些實施例中，R 2是-OCH 3。在一些實施例中，R 3是-OH。在一些實施例中，R 3是-OCH 3-。在一些實施例中，R 2是-OH且R 3是-OH。在一些實施例中，R 2是-OH且R 3是-CH 3。在一些實施例中，R 2是-CH 3且R 3是-OH。在一些實施例中，R 2是-CH 3且R 3是-CH 3。
在一些實施例中，X為O。在一些實施例中，X為S。
在一些實施例中，5'帽是二核苷酸cap0結構(例如(m 7)GpppN 1、(m 2 7,2'-O)GpppN 1、(m 2 7,3'-O)GpppN 1、(m 7)GppSpN 1、(m 2 7,2'-O)GppSpN 1，或(m 2 7,3'-O)GppSpN 1)，其中N 1如本文所定義和描述。在一些實施例中，5'帽是二核苷酸cap0結構(例如(m 7)GpppN 1、(m 2 7,2'-O)GpppN 1、(m 2 7,3'-O)GpppN 1、(m 7)GppSpN 1、(m 2 7,2'-O)GppSpN 1，或(m 2 7,3'-O)GppSpN 1)，其中N 1為G。在一些實施例中，5'帽為二核苷酸cap0結構(例如(m 7)GpppN 1、(m 2 7,2'-O)GpppN 1、(m 2 7,3'-O)GpppN 1、(m 7)GppSpN 1、(m 2 7,2'-O)GppSpN 1，或(m 2 7,3'-O)GppSpN 1)，其中N 1為A、U，或C。在一些實施例中，5'帽為二核苷酸cap1結構(例如(m 7)Gppp(m 2'-O)N 1、(m 2 7,2'-O)Gppp(m 2'-O)N 1、(m 2 7,3'-O)Gppp(m 2'-O)N 1、(m 7)GppSp(m 2'-O)N 1、(m 2 7,2'-O)GppSp(m 2’-O)N 1，或(m 2 7,3'-O)GppSp(m 2'-O)N 1)，其中N 1如本文所定義和描述。在一些實施例中，5'帽是選自由(m 7)GpppG (「Ecap0」)、(m 7)Gppp(m 2'-O)G (「Ecap1」)、(m 2 7,3'-O)GpppG (「ARCA」或「D1」)，以及(m 2 7,2'-O)GppSpG (「β-S-ARCA」)組成之群。在一些實施例中，5'帽為(m 7)GpppG (「Ecap0」)，其具有以下結構： 或其鹽。
在一些實施例中，5'帽為(m 7)Gppp(m 2'-O)G (「Ecap1」)，其具有以下結構： 或其鹽。
在一些實施例中，5'帽為(m 2 7,3'-O)GpppG (「ARCA」或「D1」)，其具有以下結構： 或其鹽。
在一些實施例中，5'帽為(m 2 7,2'-O)GppSpG (「β-S-ARCA」)，其具有以下結構： 或其鹽。
在一些實施例中，5'帽是三核苷酸帽結構。在一些實施例中，5'帽是三核苷酸帽結構，包含N 1pN 2，其中N 1與N 2如本文所定義和描述。在一些實施例中，5'帽是三核苷酸帽G*N 1pN 2，其中N 1與N 2如本文所定義和描述，且： G*包含式(I)的結構： (I) 或其鹽，其中R 2、R 3，與X如本文所定義和描述。
在一些實施例中，5'帽是三核苷酸cap0結構(例如(m 7)GpppN 1pN 2、(m 2 7,2'-O)GpppN 1pN 2，或(m 2 7,3'-O)GpppN 1pN 2)，其中N 1與N 2如本文所定義和描述。在一些實施例中，5'帽是三核苷酸cap1結構(例如(m 7)Gppp(m 2'-O)N 1pN 2、(m 2 7,2'-O)Gppp(m 2'-O)N 1pN 2、(m 2 7,3'-O)Gppp(m 2'-O)N 1pN 2)，其中N 1與N 2如本文所定義和描述。在一些實施例中，5'帽是三核苷酸cap2結構(例如(m 7)Gppp(m 2'-O)N 1p(m 2'-O)N 2、(m 2 7,2'-O)Gppp(m 2'-O)N 1p(m 2'-O)N 2、(m 2 7,3'-O)Gppp(m 2'-O)N 1p(m 2'-O)N 2)，其中N 1與N 2如本文所定義和描述。在一些實施例中，5'帽是選自由(m 2 7,3'-O)Gppp(m 2'-O)ApG (「CleanCap AG 3' OMe」，「CC413」)、(m 2 7,3'-O)Gppp(m 2'-O)GpG (「CleanCap GG」)、(m 7)Gppp(m 2'-O)ApG、(m 7)Gppp(m 2'-O)GpG、(m 2 7,3'-O)Gppp(m 2 6,2'-O)ApG，及(m 7)Gppp(m 2'-O)ApU組成之群。在一些實施例中，5'帽是選自由(m 2 7,3'-O)Gppp(m 2'-O)ApG (「CleanCap AG」，「CC413」)、(m 2 7,3'-O)Gppp(m 2'-O)GpG (「CleanCap GG」)、(m 7)Gppp(m 2'-O)ApG與(m 2 7,3'-O)Gppp(m 2 6,2'-O)ApG、(m 7)Gppp(m 2'-O)ApU，及(m 2 7,3'-O)Gppp(m 2'-O)CpG組成之群。
在一些實施例中，5'帽為(m 2 7,3'-O)Gppp(m 2'-O)ApG (「CleanCap AG 3' OMe」，「CC413」)，其具有以下結構： 或其鹽。
在一些實施例中，5'帽為(m 2 7,3'-O)Gppp(m 2'-O)GpG (「CleanCap GG」)，其具有以下結構： 或其鹽。
在一些實施例中，5'帽為(m 7)Gppp(m 2'-O)ApG，其具有以下結構： 或其鹽。
在一些實施例中，5'帽為(m 7)Gppp(m 2'-O)GpG，其具有以下結構： 或其鹽。
在一些實施例中，5'帽為(m 2 7,3'-O)Gppp(m 2 6,2'-O)ApG，其具有以下結構： 或其鹽。
在一些實施例中，5'帽為(m 7)Gppp(m 2'-O)ApU，其具有以下結構： 或其鹽。
在一些實施例中，5'帽為(m 2 7,3'-O)Gppp(m 2'-O)CpG，其具有以下結構： 或其鹽。
在一些實施例中，5'帽為四核苷酸帽結構。在一些實施例中，5'帽為四核苷酸帽結構，包含N 1pN 2pN 3，其中N 1、N 2，與N 3如本文所定義和描述。在一些實施例中，5'帽為四核苷酸帽G*N 1pN 2pN 3，其中N 1、N 2，與N 3如本文所定義和描述，且： G*包含式(I)的結構： (I) 或其鹽，其中R 2、R 3，與X如本文所定義和描述。
在一些實施例中，5'帽為四核苷酸cap0結構(例如(m 7)GpppN 1pN 2pN 3、(m 2 7,2'-O)GpppN 1pN 2pN 3，或(m 2 7,3'-O)GpppN 1N 2pN 3)，其中N 1、N 2，與N 3如本文所定義和描述)。在一些實施例中，5'帽為四核苷酸Cap1結構(例如(m 7)Gppp(m 2'-O)N 1pN 2pN 3、(m 2 7,2'-O)Gppp(m 2'-O)N 1pN 2pN 3、(m 2 7,3'-O)Gppp(m 2'-O)N 1pN 2N 3)，其中N 1、N 2，與N 3如本文所定義和描述。在一些實施例中，5'帽為四核苷酸Cap2結構(例如(m 7)Gppp(m 2'-O)N 1p(m 2'-O)N 2pN 3、(m 2 7,2'-O)Gppp(m 2'-O)N 1p(m 2'-O)N 2pN 3、(m 2 7,3'-O)Gppp(m 2'-O)N 1p(m 2'-O)N 2pN 3)，其中N 1、N 2，與N 3如本文所定義和描述。在一些實施例中，5'帽選自由(m 2 7,3'-O)Gppp(m 2'-O)Ap(m 2'-O)GpG、(m 2 7,3'-O)Gppp(m 2'-O)Gp(m 2'-O)GpC、(m 7)Gppp(m 2'-O)Ap(m 2'-O)UpA，及(m 7)Gppp(m 2'-O)Ap(m 2'-O)GpG組成之群。
在一些實施例中，5'帽為(m 2 7,3'-O)Gppp(m 2'-O)Ap(m 2'-O)GpG，其具有以下結構： 或其鹽。
在一些實施例中，5'帽為(m 2 7,3'-O)Gppp(m 2'-O)Gp(m 2'-O)GpC，其具有以下結構： 或其鹽。
在一些實施例中，5'帽為(m 7)Gppp(m 2'-O)Ap(m 2'-O)UpA，其具有以下結構： 或其鹽。
在一些實施例中，5'帽為(m 7)Gppp(m 2'-O)Ap(m 2'-O)GpG，其具有以下結構： 或其鹽。
尤其偏好的帽為β-S-ARCA(D1) (m 2 7,2'-OGppSpG)或m 2 7,3'-OGppp(m 1 2'-O)ApG。 UTR
術語「非轉譯區」或「UTR」是有關DNA分子中被轉錄但未被轉譯成胺基酸序列的一個區域，或是有關RNA分子(諸如mRNA分子)中的相應區域。非轉譯區(UTR)可以存在於開放閱讀框的5' (上游) (5'-UTR)及/或開放閱讀框的3' (下游) (3'-UTR)。
如果存在的話，3'-UTR位於基因的3'端處，蛋白質編碼區終止密碼子的下游，但術語「3'-UTR」較佳地不包括聚(A)尾。因此，3'-UTR位於聚(A)尾(如果存在的話)的上游，例如直接鄰近聚(A)尾。
如果存在的話，5'-UTR位於基因的5'端處，蛋白質編碼區起始密碼子的上游。5'-UTR位於5'-帽(如果存在的話)的下游，例如直接鄰近5'-帽。
5'-非轉譯區及/或3'-非轉譯區可能在功能上連接至開放閱讀框，以便這些區域以使得包含該開放閱讀框的RNA的穩定性及/或轉譯效率增加的方式與開放閱讀框締合。
在一些實施例中，RNA分子包含5'-UTR及/或3'-UTR。在一些實施例中，如本文所述的至少一個miRNA序列位於或包含在第二RNA分子的3'-UTR內。
UTR與RNA的穩定性和轉譯效率有關。除了如本文所述涉及5'-帽及/或3'聚(A)-尾的結構修飾之外，還可以透過挑選特定5'及/或3'非轉譯區(UTR)來增進兩者。UTR內的序列元件通常被認為會影響轉譯效率(主要是5'-UTR)和RNA穩定性(主要是3'-UTR)。偏好5'-UTR有活性存在以增加RNA分子的轉譯效率及/或穩定性。獨立地或額外地，偏好3'-UTR有活性存在以增加RNA分子的轉譯效率及/或穩定性。
提到第一核酸序列(例如UTR)時，術語「有活性以增加轉譯效率」及/或「有活性以增加穩定性」表示與不存在該第一核酸序列的情況下該第二核酸序列的轉譯效率及/或穩定性相比之下，第一核酸序列在與第二核酸序列的共同轉錄本中能夠以該第二核酸序列的轉譯效率及/或穩定性增加的方式來修飾該第二核酸序列的轉譯效率及/或穩定性。
在一個實施例中，RNA分子包含對於功能性α病毒複製酶衍生而來的α病毒來說是異源的或非天然的5'-UTR及/或3'-UTR。這使得非轉譯區可以根據期望的轉譯效率和RNA穩定性進行設計。因此，異源或非天然UTR允許高度的靈活性，並且這種靈活性與天然α病毒UTR相比是有利的。
較佳地，本文的RNA分子包含非病毒來源的5'-UTR及/或3'-UTR；特別是並非α病毒來源的。在一個實施例中，RNA分子包含衍生自真核5'-UTR的5'-UTR及/或衍生自真核3'-UTR的3'-UTR。
5'-UTR可包含超過一種視情況被連接子分隔之核酸序列的任何組合。3'-UTR可包含超過一種視情況被連接子分隔之核酸序列的任何組合。
術語「連接子」是有關被添加在兩個核酸序列之間以連接該兩個核酸序列的核酸序列。有關連接子序列沒有特別限制。
3'-UTR通常具有200至2000個核苷酸的長度，例如500至1500個核苷酸。免疫球蛋白mRNA的3'-非轉譯區相對較短(少於約300個核苷酸)，而其他基因的3'-非轉譯區相對較長。例如，tPA的3'-非轉譯區的長度為約800個核苷酸，因子VIII的3'-非轉譯區的長度為約1800個核苷酸，而促紅血球生成素的3'-非轉譯區的長度為約560個核苷酸。在一些實施例中，第二RNA分子的3'-UTR進一步包含至少一種如本文所述的miRNA序列。各個miRNA序列的長度可能是10-200個核苷酸，視情況10-100、10-90、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、10-30、20-100、20-90、20-80、20-70、20-60、20-50、20-40或20-30個核苷酸，視情況長度為10-50個核苷酸，較佳地10-30個核苷酸。
哺乳動物 mRNA的3'-非轉譯區通常具有稱為AAUAAA六核苷酸序列的同源區。這個序列可能是聚(A)附接訊號，並且經常位於聚(A)附接位點上游10至30個鹼基處。3'-非轉譯區可能含有一或多個反向重複序列，這些重複序列可以折疊形成莖環結構，莖環結構作為核糖核酸外切酶的屏障或與已知可增加RNA穩定性的蛋白質(例如RNA結合蛋白)交互作用。
人類β-球蛋白3'-UTR (特別是人類β-球蛋白3'-UTR的兩個連續相同的拷貝)有助於高轉錄穩定性和轉譯效率(Holtkamp et al., 2006, Blood 108:4009-4017)。因此，在一個實施例中，RNA分子包含人類β-球蛋白3'-UTR的兩個連續相同拷貝。因此，其在5'→3'方向上包含：(a)視情況選用的5'-UTR；(b)開放閱讀框；(c) 3'-UTR；該3'-UTR包含人類β-球蛋白3'-UTR的兩個連續相同拷貝、其片段，或人類β-球蛋白3'-UTR或其片段的變體。
在一個實施例中，RNA分子包含3'-UTR，其有活性以增加轉譯效率及/或穩定性，但其並非人類β-球蛋白3'-UTR、其片段，或人類β-球蛋白3'-UTR或其片段的變體。
在一個實施例中，RNA分子包含5'-UTR，其有活性以增加轉譯效率及/或穩定性。
在一些實施例中，RNA分子可以包含3'-UTR序列，其為兩個序列元件的組合(FI元件)，這兩個序列元件是衍生自「胺基端分裂強化子」(AES) mRNA (稱為F)和粒線體編碼的12S核醣體RNA (稱為I)，位在編碼序列與聚(A)尾之間以確保最大蛋白含量更高且mRNA持續存在更久。這些是藉由對賦予RNA穩定性和增加總蛋白表現的序列進行離體篩選方法來進行鑑定的(參見WO 2017/060314，以引用的方式併入本文)。 聚 (A) 序列
在一些實施例中，RNA分子(例如第一RNA分子及/或第二RNA分子)包含聚(A)序列。如果RNA分子包含保守序列元件4 (CSE 4)，則RNA分子的聚(A)序列較佳地存在於CSE 4的下游，最佳地直接鄰近CSE 4。在一些實施例中，聚(A)序列是3'聚(A)序列。
在一個實施例中，聚(A)序列包含至少20個、較佳地至少26個、較佳地至少40個、較佳地至少80個、較佳地至少100個且較佳地至多500個、較佳地至多400個、較佳地至多300個、較佳地至多200個，且特別是至多150個A核苷酸，特別是約120個A核苷酸，或基本上由其組成或由其組成。在這個上下文中，「基本上由…組成」表示按「聚(A)序列」中的核苷酸數量計，聚(A)序列中的大多數核苷酸，通常至少50%，且較佳地至少75%是A核苷酸(腺苷酸)，但允許其餘核苷酸是A核苷酸以外的核苷酸，諸如U核苷酸(尿苷酸)，G核苷酸(鳥苷酸)或C核苷酸(胞苷酸)。在這個上下文中，「由…組成」表示按聚(A)序列中的核苷酸數量計，聚(A)序列中所有核苷酸，即100%是A核苷酸。術語「A核苷酸」或「A」是指腺苷酸。
已經證明，約120個A核苷酸的3'聚(A)序列對經轉染真核細胞中的RNA含量，以及從存在於聚(A)序列上游(5')的開放閱讀框轉譯的蛋白質含量具有有益影響( Holtkamp et al., 2006, Blood, vol. 108, pp. 4009-4017)。
在α病毒中，至少11個連續腺苷酸殘基或至少25個連續腺苷酸殘基的3'聚(A)序列被認為對於有效率合成負股是重要的。特別是，在α病毒中，至少25個連續腺苷酸殘基的3'聚(A)序列被認為與保守序列元件4 (CSE 4)一起發揮作用，促進(-)股合成(Hardy & Rice, 2005, J. Virol. 79:4630-4639)。
基於在與編碼股互補的股中包含重複dT核苷酸(去氧胸苷酸)的DNA模板，3'聚(A)序列在RNA轉錄期間(即活體外轉錄RNA的製備期間)可被附接。編碼聚(A)序列的DNA序列(編碼股)稱為聚(A)匣。
第一及/或第二RNA分子可包含間斷的3'聚(A)序列。在一個較佳實施例中，存在於DNA編碼股中的3'聚(A)匣基本上由dA核苷酸組成，但被具有分布相等的四種核苷酸(dA、dC、dG和dT)的隨機序列打斷。這種隨機序列的長度可能是5到50，較佳地10到30，更佳地10到20個核苷酸。這樣的匣揭示於WO 2016/005004 A1中。WO 2016/005004 A1中揭示的任何聚(A)匣都可能用於本文中。基本上由dA核苷酸組成，但被具有分布相等的四個核苷酸(dA、dC、dG、dT)且長度為例如5至50個核苷酸的隨機序列中斷的聚(A)匣顯示，在DNA層次上大腸桿菌內質體DNA的不斷增殖，而在RNA層次上仍與幫助RNA穩定性和轉譯效率有關的有益性質相關。
因此，在一個較佳實施例中，本文所述的RNA分子中所包含的3'聚(A)序列基本上由A核苷酸組成，但被具有分布相等的四個核苷酸(A、C、G、U)的隨機序列中斷。這樣的隨機序列的長度可能是5到50，較佳地10到30，更佳地10到20個核苷酸。在一些實施例中，第一及/或第二RNA分子包含由A30-L-A70組成的間斷3'聚(A)序列，其中連接子(L)的長度為10個核苷酸。在一些實施例中，除了A核苷酸以外，並沒有核苷酸在聚(A)序列3'端處側接聚(A)序列，即聚(A)序列在其3'端處未被A以外的核苷酸掩蔽或跟隨。
在一些實施例中，聚(A)序列可能包含至少20、至少30、至少40、至少80、或至少100且至多500、至多400、至多300、至多200，或至多150個核苷酸。在一些實施例中，聚(A)序列可能基本上由至少20、至少30、至少40、至少80、或至少100且至多500、至多400、至多300、至多200，或至多150個核苷酸組成。在一些實施例中，聚(A)序列可能由至少20、至少30、至少40、至少80、或至少100且至多500、至多400、至多300、至多200，或最多150個核苷酸組成。在一些實施例中，聚(A)序列包含至少100個核苷酸。在一些實施例中，聚(A)序列包含約150個核苷酸。在一些實施例中，聚(A)序列包含約120個核苷酸。
在一些實施例中，本文所述的RNA中所包括的聚(A)序列是間斷的聚(A)序列，例如如WO2016/005324中所述，為了本文所述目的，其全部內容以引用的方式併入本文。在一些實施例中，聚(A)序列包含一段至少20個腺苷殘基(包括例如至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個或更多個腺苷殘基)，隨後是連接子序列(例如，在一些實施例中包含非A核苷酸)和另一段至少20個腺苷殘基(包括例如至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個或更多個腺苷殘基)。在一些實施例中，這樣一個連接子序列的長度可以是3-50個核苷酸，或長度為5-25個核苷酸，或長度為10-15個核苷酸。在一些實施例中，聚(A)序列包含一段約30個腺苷殘基，隨後是長度為約5-15個核苷酸的連接子序列(例如，在一些實施例中包含非A核苷酸)和另一段約70個腺苷殘基。 密碼子使用
一般來說，遺傳密碼的簡併性將允許RNA序列中存在的某些密碼子(編碼胺基酸的鹼基三聯體)被其他密碼子(鹼基三聯體)取代，同時保持相同的編碼能力(以便替換編碼與被替換密碼子相同的胺基酸的密碼子)。在一些實施例中，RNA分子包含的開放閱讀框的至少一個密碼子不同於該開放閱讀框源自的物種中相應開放閱讀框中的相應密碼子。在那個實施例中，開放閱讀框的編碼序列被稱為「經改造的(adapted)」或「經修飾的」。可以改造第一及/或第二RNA所包含的開放閱讀框的編碼序列。
例如，當開放閱讀框的編碼序列被改造時，可能挑選常用的密碼子：WO 2009/024567 A1描述了改造核酸分子的編碼序列，其涉及用更常用的密碼子取代罕見密碼子。由於密碼子使用的頻率取決於宿主細胞或宿主生物體，因此該類型的改造適於使核酸序列適合在特定宿主細胞或宿主生物體中表現。一般而言，儘管並非總是需要改造開放閱讀框的所有密碼子，但更頻繁使用的密碼子通常在宿主細胞或宿主生物體中更有效率地轉譯。
例如，當開放閱讀框的編碼序列被改造時，可以透過挑選每個胺基酸具有最高GC豐富含量的密碼子來改變G (鳥苷酸)殘基和C (胞苷酸)殘基的含量。據報導，具有豐富GC的開放閱讀框的RNA分子具有減少免疫活化並改善RNA轉譯和半衰期的潛力(Thess et al., 2015, Mol. Ther. 23:1457-1465)。
特別地，非結構蛋白的編碼序列可以根據需要進行改造。這種自由是可能的，因為編碼非結構蛋白的開放閱讀框不與複製子的5'複製辨識序列重疊。 RNA 修飾
在本文所述的任何核酸分子是RNA分子的實施例中，此類RNA分子可能具有經修飾的核苷酸/核苷/骨架修飾。如本文所用，術語「RNA修飾」可能指包括骨架修飾以及糖修飾或鹼基修飾的化學修飾。
在這個上下文中，如本文定義的經修飾RNA分子可能含有核苷酸類似物/修飾，例如骨架修飾、糖修飾或鹼基修飾。骨架修飾可以是其中包含在如本文定義之RNA分子中的核苷酸骨架的磷酸酯被化學修飾的修飾。糖修飾可以是如本文定義之RNA分子的核苷酸的糖的化學修飾。此外，鹼基修飾可以是RNA分子的核苷酸的鹼基部分的化學修飾。在這個上下文中，核苷酸類似物或修飾較佳地選自適用於轉錄及/或轉譯的核苷酸類似物。
糖修飾：可被併入如本文所述的經修飾RNA分子中的經修飾核苷和核苷酸可在糖部分中進行修飾。例如，2'羥基基團(OH)可以被修飾或被許多不同的「氧基」或「去氧」取代基替換。「氧基」-2'羥基基團修飾的實例包括但不限於烷氧基或芳氧基(-OR，例如R＝H、烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)、-0(CH2CH2 0)nCH2CH2 OR；「鎖」核酸(LNA)，其中2'羥基例如藉由亞甲基橋連接至相同核糖的4'碳；以及胺基(-O-胺基，其中胺基例如NRR可以是烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基或二雜芳基胺基、乙二胺、聚胺基)或胺基烷氧基。「去氧」修飾包括氫、胺基(例如NH2；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基、二雜芳基胺基或胺基酸)；或者胺基可以透過連接子附接至糖，其中連接子包含原子C、N和O中的一或多者。糖基團可以含有一或多個碳，其具有與核糖中之相應碳相反的立體化學構形。因此，經修飾的RNA分子可以包括含有例如阿拉伯糖作為糖的核苷酸。
骨架修飾：磷酸酯骨架可在經修飾核苷和核苷酸中進一步修飾，其可被併入如本文所述的經修飾RNA分子中。骨架的磷酸酯可以用不同取代基替換一或多個氧原子來進行修飾。此外，經修飾核苷和核苷酸可包括以如本文所述的經修飾磷酸酯完全替換未經修飾的磷酸酯部分。經修飾磷酸酯的實例包括但不限於硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸酯、硼烷磷酸酯、膦酸氫酯、胺基磷酸酯、膦酸烷基酯或膦酸芳基酯和磷酸三酯。二硫代磷酸酯的兩個非連接氧均被硫替換。磷酸酯連接子還可以用氮(橋聯胺基磷酸酯)、硫(橋聯硫代磷酸酯)和碳(橋聯亞甲基膦酸酯)替換連接氧來進行修飾。
鹼基修飾：可以被併入如本文所述的經修飾RNA分子中的經修飾核苷和核苷酸可以在核鹼基部分中進一步修飾。RNA中發現的核鹼基的實例包括但不限於腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。例如，本文所述的核苷和核苷酸可以在大溝面上進行化學修飾。在一些實施例中，大溝化學修飾可包括胺基、硫醇基、烷基或鹵基。
在具體實施例中，核苷酸類似物/修飾選自鹼基修飾，其較佳地選自2-胺基-6-氯嘌呤核糖苷-5'-三磷酸、2-胺基嘌呤-核糖苷-5'-三磷酸；2-胺基腺苷-5'-三磷酸、2'-胺基-2'-去氧-胞苷三磷酸、2-硫胞苷-5'-三磷酸、2-硫尿苷-5'-三磷酸、2'-氟胸苷-5'-三磷酸、2'-0-甲基肌苷-5'-三磷酸、4-硫-尿苷-5'-三磷酸、5-胺基烯丙基胞苷-5'-三磷酸、5-胺基烯丙基尿苷-5'-三磷酸、5-溴胞苷-5'-三磷酸、5-溴尿苷-5'-三磷酸、5-溴-2'-去氧胞苷-5'-三磷酸、5-溴-2'-去氧尿苷-5'-三磷酸、5-碘胞苷-5'-三磷酸、5-碘-2'-去氧胞苷-5'-三磷酸、5-碘尿苷-5'-三磷酸、5-碘-2'-去氧尿苷-5'-三磷酸、5-甲基胞苷-5'-三磷酸、5-甲基尿苷-5'-三磷酸、5-丙炔基-2'-去氧胞苷-5'-三-磷酸、5-丙炔基-2'-去氧尿苷-5'-三磷酸、6-氮雜胞苷-5'-三磷酸、6-氮雜尿苷-5'-三磷酸、6-氯嘌呤核糖苷-5'-三磷酸、7-去氮-腺苷-5'-三磷酸、7-去氮鳥苷-5'-三磷酸、8-氮雜腺苷-5'-三磷酸、8-疊氮基腺苷-5'-三磷酸、苯并咪唑-核糖苷-5'-三磷酸、N1-甲基腺苷-5'-三磷酸、N1-甲基鳥苷-5'-三磷酸、N6-甲基腺苷-5'-三磷酸、06-甲基鳥苷-5'-三磷酸、N6-甲基鳥苷-5'-三磷酸、假-尿苷-5'-三磷酸，或嘌呤黴素-5'-三磷酸、黃苷-5'-三磷酸。尤其偏好對核苷酸進行由以下組成之鹼基經修飾核苷酸之群的鹼基修飾：5-甲基胞苷-5'-三磷酸、7-去氮鳥苷-5'-三磷酸、5-溴胞苷-5'-三磷酸和假尿苷-5'-三磷酸。在一些實施例中，經修飾的核苷包括吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮雜-尿苷、2-硫-5-氮雜-尿苷、2-硫尿苷、4-硫-假尿苷、2-硫-假尿苷、5-羥基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧基甲基-尿苷、1-羧基甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸基甲基尿苷、1-牛磺酸基甲基-假尿苷、5-牛磺酸基甲基-2-硫尿苷、l-牛磺酸基甲基-4-硫-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫-1-甲基-假尿苷、2-硫-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫-1-甲基-1-去氮-假尿苷、二氫尿苷、二氫-假尿苷、2-硫-二氫尿苷、2-硫-二氫假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫-尿苷、4-甲氧基-假尿苷和4-甲氧基-2-硫-假尿苷。
在一些實施例中，經修飾核苷包括5-氮雜-胞苷、假異胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙醯基胞苷、5-甲醯基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羥基甲基胞苷、1-甲基-假異胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假異胞苷、2-硫-胞苷；2-硫-5-甲基-胞苷、4-硫-假異胞苷、4-硫-1-甲基-假異胞苷、4-硫-1-甲基-1-去氮-假異胞苷、1-甲基-1-去氮雜-假異胞苷、澤布拉林(zebularine)、5-氮雜-澤布拉林、5-甲基-澤布拉林、5-氮雜-2-硫-澤布拉林、2-硫-澤布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假異胞苷及4-甲氧基-l-甲基-假異胞苷。
在其他實施例中，經修飾核苷包括2-胺基嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、7-去氮-腺嘌呤、7-去氮-8-氮雜-腺嘌呤、7-去氮-2-胺基嘌呤、7-去氮-8-氮雜-2-胺基嘌呤、7-去氮雜-2,6-二胺基嘌呤、7-去氮雜-8-氮雜-2,6-二胺基-嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-異戊烯基腺苷、N6-(順式羥基異戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷、N6-甘胺醯基胺甲醯基腺苷、N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷、2-甲基硫-N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲基硫-腺嘌呤和2-甲氧基腺嘌呤。在其他實施例中，經修飾核苷包括肌苷、1-甲基-肌苷、維奧苷(wyosine)、威布辛(wybutosine)、7-去氮-鳥苷、7-去氮-8-氮雜-鳥苷、6-硫-鳥苷、6-硫-7-去氮-鳥苷、6-硫-7-去氮-8-氮雜-鳥苷、7-甲基-鳥苷、6-硫-7-甲基-鳥苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鳥苷、1-甲基鳥苷、N2-甲基鳥苷、N2,N2-二甲基鳥苷、8-側氧基-鳥苷、7-甲基-8-側氧基-鳥苷、1-甲基-6-硫-鳥苷、N2-甲基-6-硫-鳥苷和N2,N2-二甲基-6-硫-鳥苷。
在一些實施例中，核苷酸可以在大溝面上被修飾並且可以包括用甲基或鹵基替換尿嘧啶的C-5上的氫。在具體實施例中，經修飾核苷是5'-0-(l-硫代磷酸酯)-腺苷、5'-0-(l-硫代磷酸酯)-胞苷、5'-0-(l-硫代磷酸酯)-鳥苷、5'-0-(l-硫代磷酸酯)-尿苷或5'-0-(l-硫代磷酸鹽)-假尿苷。
在更多實施例中，經修飾RNA可能包含選自以下的核苷修飾：6-氮雜-胞苷、2-硫-胞苷、α-硫-胞苷、假-異-胞苷、5-胺基烯丙基-尿苷、5-碘-尿苷、N1-甲基-假尿苷、5,6-二氫尿苷、α-硫-尿苷、4-硫-尿苷、6-氮雜-尿苷、5-羥基-尿苷、去氧-胸苷、5-甲基-尿苷、吡咯并-胞苷、肌苷、α-硫-鳥苷、6-甲基-鳥苷、5-甲基-胞嘧啶、8-側氧基-鳥苷、7-去氮-鳥苷、N1-甲基-腺苷、2-胺基-6-氯-嘌呤、N6-甲基-2-胺基-嘌呤、假-異-胞苷、6-氯-嘌呤、N6-甲基-腺苷、α-硫-腺苷、8-疊氮基-腺苷、7-去氮-腺苷。
在某些較佳實施例中，RNA包含替換至少一個(例如每個)尿苷的經修飾核苷。
如本文所用，術語「尿嘧啶」描述可出現在RNA之核酸中的核鹼基之一。尿嘧啶的結構為： 。
如本文所用，術語「尿苷」描述可出現在RNA中的核苷之一。尿苷的結構為： 。
UTP (尿苷5'-三磷酸)具有以下結構： 。
假-UTP (假尿苷5'-三磷酸)具有以下結構： 。
「假尿苷」是經修飾核苷的一個實例，它是尿苷的一種異構體，其中尿嘧啶經由碳-碳鍵而不是氮-碳糖苷鍵附接到戊糖環上。
另一個例示性的經修飾核苷是N1-甲基假尿苷(m1ψ)，其具有以下結構： 。
N1-甲基-假UTP具有以下結構： 。
另一個例示性的經修飾核苷是5-甲基-尿苷(m5U)，其具有以下結構： 。
在某些較佳實施例中，本文所述RNA中的一或多個尿苷被經修飾的核苷替換。在一些實施例中，經修飾的核苷是經修飾的尿苷。
在某些較佳實施例中，RNA包含替換至少一個尿苷的經修飾核苷。在一些實施例中，RNA包含替換每個尿苷的經修飾核苷。
在某些較佳實施例中，經修飾的核苷獨立地選自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些實施例中，經修飾的核苷包含假尿苷(ψ)。在一些實施例中，經修飾的核苷包含N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些實施例中，經修飾的核苷包含5-甲基-尿苷(m5U)。在一些實施例中，RNA可包含超過一種類型的經修飾核苷，而經修飾核苷獨立地選自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些實施例中，經修飾的核苷包含假尿苷(ψ)和N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些實施例中，經修飾的核苷包含假尿苷(ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些實施例中，經修飾的核苷包含N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些實施例中，經修飾的核苷包含假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。
在某些較佳實施例中，替換RNA中的一或多個(例如全部)尿苷的經修飾核苷可能是以下中的任一或多者：3-甲基-尿苷(m 3U)、5-甲氧基-尿苷(mo 5U)、5-氮雜-尿苷、6-氮雜-尿苷、2-硫-5-氮雜-尿苷、2-硫尿苷(s 2U)、4-硫-尿苷(s 4U)、4-硫-假尿苷、2-硫-假尿苷、5-羥基-尿苷(ho 5U)、5-胺基烯丙基-尿苷、5-鹵代-尿苷(例如5-碘-尿苷或5-溴-尿苷)、尿苷5-氧基乙酸(cmo 5U)、尿苷5-氧基乙酸甲酯(mcmo 5U)、5-羧基甲基-尿苷(cm 5U)、1-羧基甲基-假尿苷、5-羧基羥基甲基-尿苷(chm 5U)、5-羧基羥基甲基-尿苷甲酯(mchm 5U)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm 5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫-尿苷(mcm 5s 2U)、5-胺基甲基-2-硫-尿苷(nm 5s 2U)、5-甲基胺基甲基-尿苷(mnm 5U)、1-乙基-假尿苷、5-甲基胺基甲基-2-硫-尿苷(mnm 5s 2U)、5-甲基胺基甲基-2-硒-尿苷(mnm 5se 2U)、5-胺甲醯基甲基-尿苷(ncm 5U)、5-羧基甲基胺基甲基-尿苷(cmnm 5U)、5-羧基甲基胺基甲基-2-硫-尿苷(cmnm 5s 2U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸基甲基-尿苷(τm 5U)、1-牛磺酸基甲基-假尿苷、5-牛磺酸基甲基-2-硫-尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸基甲基-4-硫-假尿苷、5-甲基-2-硫-尿苷(m 5s 2U)、1-甲基-4-硫-假尿苷(m 1s 4ψ)、4-硫-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m 3ψ)、2-硫-1-甲基假尿苷、1-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫-1-甲基-1-去氮-假尿苷、二氫尿苷(D)、二氫假尿苷、5,6-二氫尿苷、5-甲基-二氫尿苷(m 5D)、2-硫-二氫尿苷、2-硫-二氫假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-胺基-3-羧基丙基)尿苷(acp 3U)、1-甲基-3-(3-胺基-3-羧基丙基)假尿苷(acp 3ψ)、5-(異戊烯基胺基甲基)尿苷(inm 5U)、5-(異戊烯基胺基甲基)-2-硫-尿苷(inm 5s 2U)、α-硫-尿苷、2'-O-甲基-尿苷(Um)、5,2'-O-二甲基-尿苷(m 5Um)、2'-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫-2'-O-甲基-尿苷(s 2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2'-O-甲基-尿苷(mcm 5Um)、5-胺甲醯基甲基-2'-O-甲基-尿苷(ncm 5Um)、5-羧基甲基胺基甲基-2'-O-甲基-尿苷(cmnm 5Um)、3,2'-O-二甲基-尿苷(m 3Um)、5-(異戊烯基胺基甲基)-2'-O-甲基-尿苷(inm 5Um)、1-硫-尿苷、去氧胸苷、2'-F-阿拉伯糖-尿苷、2'-F-尿苷、2'-OH-阿拉伯糖-尿苷、5-(2-羰基甲氧基乙烯基)尿苷、5-[3-(1-E-丙烯基胺基)尿苷或本技藝中已知的任何其他經修飾尿苷。在一些實施例中，第一RNA分子和第二RNA分子包含替換至少一個尿苷，較佳地替換每個尿苷的經修飾核苷；較佳地其中經修飾的核苷獨立地選自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些實施例中，第一RNA分子而非第二RNA分子包含替換至少一個尿苷，較佳地替換每個尿苷的經修飾核苷；較佳地其中經修飾的核苷獨立地選自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些實施例中，第二RNA分子而非第一RNA分子包含替換至少一個尿苷，較佳地替換每個尿苷的經修飾核苷；較佳地其中經修飾的核苷獨立地選自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。
在一個實施例中，RNA包含其他經修飾的核苷或包含更多經修飾的核苷，例如經修飾的胞苷，諸如那些上文所述的經修飾胞苷。例如在一個實施例中，在RNA中5-甲基胞苷部分或完全取代胞苷，較佳完全取代胞苷。在一個實施例中，RNA包含5-甲基胞苷和選自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)中的一或多者。在一個實施例中，RNA包含5-甲基胞苷和N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些實施例中，RNA包含替換每個胞苷的5-甲基胞苷和替換每個尿苷的N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。 經修飾的複製酶
本文提供一種編碼經修飾RNA依賴性RNA聚合酶(經修飾複製酶)的核酸分子，其中與相應未經修飾的(起始) RNA依賴性RNA聚合酶(複製酶)的反式複製活性相比，經修飾RNA依賴性RNA聚合酶(經修飾複製酶)具有增加的反式複製活性。在一個實施例中，經修飾聚合酶與其順式複製活性相比可以具有增加的反式複製活性。在一個實施例中，與相應未經修飾聚合酶的順式複製活性相比，經修飾聚合酶可以具有減少的順式複製活性。在一個實施例中，分別與相應的未經修飾聚合酶的反式複製活性和順式複製活性相比，經修飾聚合酶可以具有增加的反式複製活性和減少的順式複製活性。
例如，可以在簡單的螢光素酶報導基因分析中測量反式擴增活性。這樣的報導分析可能包含用以下轉染細胞：(a)編碼(i)經修飾的複製酶或(ii)相應未經修飾複製酶的核酸分子(例如mRNA)；以及(b)編碼螢光素酶蛋白的可複製RNA分子，其能夠透過經修飾或未經修飾的複製酶進行反式複製。與未經修飾的複製酶相比，經修飾複製酶的反式擴增活性增加可以藉由螢光素酶活性增加(例如相對發光較高，例如由螢光素酶表現增加所致)來鑑定。
與相應未經修飾聚合酶的順式複製活性相比，經修飾聚合酶還可能具有減少的順式複製活性。這也可以使用類似的螢光素酶報導分析系統來測量。在這種情況下，報導分析可能包含用(a)編碼經修飾複製酶和螢光素酶蛋白的自我擴增RNA (saRNA)分子(即順式複製子)，或(b)編碼相應未經修飾複製酶與螢光素酶蛋白的saRNA分子轉染的細胞；其中saRNA能夠藉由複製酶順式複製。與未經修飾複製酶相比，經修飾複製酶的順式複製活性減少可以藉由螢光素酶活性減少(例如相對發光較低，例如由螢光素酶表現減少所致)來鑑定。
實例中更為詳細說明了螢光素酶報導分析。定量PCR (qPCR)分析也可用於透過直接測量產生的可複製RNA分子數量來比較反式或順式複製/擴增活性(例如如實例中所述)。
在一個實施例中，經修飾聚合酶是衍生自病毒編碼的非結構蛋白。
術語「非結構蛋白」是有關由病毒編碼但並非病毒顆粒一部分的蛋白質。這個術語通常包括病毒用於複製自身的各種酶與轉錄因子，諸如RNA複製酶或其他模板定向聚合酶。術語「非結構蛋白」包括非結構蛋白的各種與每種共轉譯或轉譯後修飾形式，包括經醣類修飾(諸如醣基化)和經脂質修飾形式，且較佳地是有關「α病毒非結構蛋白」。
在一些實施例中，術語「α病毒非結構蛋白」是指α病毒來源的任何一或多種單獨的非結構蛋白(nsP1、nsP2、nsP3、nsP4)，或是指包含α病毒來源的一種非結構蛋白以外之多肽序列的多蛋白。在一些實施例中，「α病毒非結構蛋白」是指nsP123及/或nsP4。在其他實施例中，「α病毒非結構蛋白」是指nsP1234。在一個實施例中，由開放閱讀框編碼的感興趣蛋白是由nsP1、nsP2、nsP3和nsP4全部組成作為一種單一的、視情況可切割的多蛋白：nsP1234。在一個實施例中，由開放閱讀框編碼的感興趣蛋白由nsP1、nsP2和nsP3組成，作為單一的、視情況可切割的多蛋白：nsP123。在那個實施例中，nsP4可能是另一種感興趣蛋白並且可能由另一個開放閱讀框編碼。
在一些實施例中，非結構蛋白能夠例如在宿主細胞中形成複合體或締合體。在一些實施例中，「α病毒非結構蛋白」是指nsP123 (同義P123)和nsP4的複合體或締合體。在一些實施例中，「α病毒非結構蛋白」是指nsP1、nsP2和nsP3的複合體或締合體。在一些實施例中，「α病毒非結構蛋白」是指nsP1、nsP2、nsP3和nsP4的複合體或締合體。在一些實施例中，「α病毒非結構蛋白」是指選自由nsP1、nsP2、nsP3和nsP4組成之群中的任何一或多者的複合體或締合體。在一些實施例中，α病毒非結構蛋白包含至少nsP4。
術語「複合體」或「締合體」是指空間鄰近的兩個或更多個相同或不同的蛋白質分子。複合體的蛋白質較佳地彼此直接或間接物理或物理化學接觸。複合體或締合體可以由多個不同的蛋白質(異多聚體)及/或特定蛋白質的多個拷貝(同多聚體)組成。在α病毒非結構蛋白的情況下，術語「複合體或締合體」描述大量的至少兩個蛋白質分子，其中至少一者是α病毒非結構蛋白。複合體或締合體可以由一種特定蛋白質的多個拷貝(同多聚體)及/或多種不同蛋白質(異多聚體)組成。在多聚體的情況下，「多」表示超過一，諸如兩、三、四、五、六、七、八、九、十或超過十。
術語「功能性非結構蛋白」包括具有複製酶功能的非結構蛋白。因此，「功能性非結構蛋白」包括α病毒複製酶。「複製酶功能」包含RNA依賴性RNA聚合酶(RdRP)的功能，即能夠基於(+)股RNA模板催化合成(-)股RNA的酶，及/或能夠基於(-)股RNA模板催化合成(+)股RNA的酶。因此，術語「功能性非結構蛋白」可以指使用(+)股(例如基因體) RNA作為模板合成(-)股RNA的蛋白質或複合體、或指使用基因體RNA的(-)股互補序列作為模板合成(+)股RNA的蛋白質或複合體，及/或使用基因體RNA的(-)股互補序列作為模板合成亞基因體轉錄本的蛋白質或複合體。功能性非結構蛋白可能額外具有一或多種附加功能，諸如例如蛋白酶(用於自體切割)、解旋酶、末端腺苷酸轉移酶(用於聚(A)尾添加)、甲基轉移酶和鳥苷酸轉移酶(用於提供帶有5'-帽的核酸)、核定位位點、三磷酸酶(Gould et al., 2010, Antiviral Res. 87:111-124；Rupp et al., 2015, J. Gen. Virol. 96:2483-500)。
在一些實施例中，術語「功能性非結構蛋白」是「功能性複製酶」的同義詞。
術語「複製酶」包括RNA依賴性RNA聚合酶。術語「複製酶」包括「α病毒複製酶」，包括來自天然存在的α病毒(自然界中發現的α病毒)的RNA依賴性RNA聚合酶，其包括自然界中發現的所有病毒株、分離株、變體；及來自α病毒的變體或衍生物的RNA依賴性RNA聚合酶，諸如來自減毒α病毒的RNA依賴性RNA聚合酶；以及藉由天然前驅細胞誘變產生的變體RNA依賴性RNA聚合酶。
具體地，提供了經修飾的功能性RNA依賴性RNA聚合酶，其與相應未經修飾聚合酶的反式複製活性相比具有增加的反式複製活性。在一個實施例中，經修飾聚合酶與相應未經修飾聚合酶可具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%但並非100%胺基酸序列同一性。與相應未經修飾聚合酶相比，經修飾聚合酶可包含至少一個胺基酸插入、取代及/或缺失。在一個實施例中，經修飾聚合酶可在nsP2蛋白及/或nsP3蛋白中包含至少一個胺基酸插入、取代及/或缺失。在一個實施例中，相應未經修飾聚合酶包含SEQ ID NO：1中所示的胺基酸序列。與相應未經修飾聚合酶相比，經修飾聚合酶較佳地包含至少一個胺基酸取代。例如，與未經修飾聚合酶的nsP2及/或nsP3蛋白質序列相比，經修飾聚合酶可在nsP2及/或nsP3蛋白質序列中包含至少一個胺基酸取代(即突變)。
在某些實施例中，經修飾聚合酶可在對應於SEQ ID NO：1的位置1589的胺基酸位置處包含取代、在對應於SEQ ID NO：1的位置747的胺基酸位置處包含取代，或在對應於SEQ ID NO：1的位置1360的胺基酸位置處包含取代。就感興趣的特定序列來說，對應於SEQ ID NO：1的特定位置的胺基酸位置可以藉由將感興趣的序列與SEQ ID NO：1進行比對(例如使用比對程式，諸如BLASTp)，並且挑選和SEQ ID NO：1的指定位置比對最為接近的位置。
在某些實施例中，經修飾聚合酶可以在對應於SEQ ID NO：1的位置1589的胺基酸位置處具有絲胺酸(S)，及/或在對應於SEQ ID NO：1的位置747的胺基酸位置處具有麩醯胺酸(Q)，及/或在對應於SEQ ID NO：1的位置1360的胺基酸位置處具有精胺酸(R)。在一個實施例中，經修飾聚合酶可以在對應於SEQ ID NO：1的位置1589的胺基酸位置處具有絲胺酸(S)。在一個實施例中，經修飾聚合酶可以在對應於SEQ ID NO：1的位置747的胺基酸位置處具有麩醯胺酸(Q)，並且在對應於SEQ ID NO：1的位置1360的胺基酸位置處具有精胺酸(R)。在一個實施例中，經修飾聚合酶可以在對應於SEQ ID NO：1的位置747的胺基酸位置處具有麩醯胺酸(Q)、在對應於SEQ ID NO：1的位置1360的胺基酸位置處具有精胺酸(R)，以及在對應於SEQ ID NO：1的位置1589的胺基酸位置處具有絲胺酸(S)。
在一個實施例中，核酸可以包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中所示胺基酸序列的編碼序列。在一個較佳實施例中，核酸包含SEQ ID NO：4中所示胺基酸序列的編碼序列。
在一個實施例中，經修飾聚合酶可以是VEEV衍生的經修飾聚合酶，其在對應於SEQ ID NO：1的位置747、1360和1589的各個胺基酸位置處包含取代突變，例如該等取代突變是E747Q，G1360R和T1589S。
與包含SEQ ID NO：2中所示胺基酸序列及/或SEQ ID NO：3中所示胺基酸序列的經修飾聚合酶相比，經修飾聚合酶可具有增加的反式複製活性。
除了本文提供的經修飾複製酶之外，術語「複製酶」包括α病毒複製酶的所有變體，特別是經轉譯後修飾的變體、構形、同型和同源物，其由經α病毒感染的細胞表現或由已被編碼α病毒複製酶的核酸轉染的細胞表現。此外，術語「複製酶」包含已經產生的和可以透過重組方法產生的所有形式的複製酶。例如，包含有利於在實驗室中偵測及/或純化複製酶的標籤(例如；myc-標籤、HA-標籤或寡組胺酸標籤(His-標籤))的複製酶可以透過重組方法產生。
視情況，α病毒複製酶額外透過與α病毒保守序列元件1 (CSE 1)或其互補序列、保守序列元件2 (CSE 2)或其互補序列、保守序列元件3 (CSE 3)或其互補序列，保守序列元件4 (CSE 4)或其互補序列中的任一或多者結合的能力在功能上被定義。較佳地，複製酶能夠結合至CSE 2 [即結合至(+)股]及/或結合至CSE 4 [即結合至(+)股]，或結合至CSE 1的互補序列[即結合至(-)股]及/或CSE 3的互補序列[即結合至(-)股]。
α病毒複製酶的來源不限於任何特定的α病毒。在一個較佳實施例中，α病毒複製酶包含塞姆利基森林病毒的非結構蛋白，塞姆利基森林病毒包括天然存在的塞姆利基森林病毒和塞姆利基森林病毒的變體或衍生物，諸如減毒塞姆利基森林病毒。在替代性較佳實施例中，α病毒複製酶包含辛德比斯病毒的非結構蛋白，辛德比斯病毒包括天然存在的辛德比斯病毒和辛德比斯病毒的變體或衍生物，諸如減毒的辛德比斯病毒。在替代性較佳實施例中，α病毒複製酶包含委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)的非結構蛋白，VEEV包括天然存在的VEEV和VEEV的變體或衍生物，諸如減毒的VEEV。在替代性較佳實施例中，α病毒複製酶包含屈公病毒(CHIKV)的非結構蛋白，屈公病毒包括天然存在的CHIKV和CHIKV的變體或衍生物，諸如減毒的CHIKV。在這些其他病毒中，可以在對應於SEQ ID NO：1所述的胺基酸位置處進行相同的修飾。
複製酶還可以包含超過一種病毒(例如超過一種α病毒)的非結構蛋白。因此，包含α病毒非結構蛋白且具有複製酶功能的異源複合體或締合體同樣包含在本文中。僅出於說明性目的，複製酶可能包含第一α病毒的一或多個非結構蛋白(例如nsP1、nsP2)和第二α病毒的一或多個非結構蛋白(nsP3、nsP4)。超過一種不同α病毒的非結構蛋白可能由不同開放閱讀框編碼，或者可能由單一開放閱讀框編碼作為多蛋白(例如nsP1234)。
在一些實施例中，功能性非結構蛋白能夠在表現功能性非結構蛋白的細胞中形成膜複製複合體及/或液泡。
如果功能性非結構蛋白(即具有複製酶功能的非結構蛋白)是由本文提供的核酸分子所編碼，則偏好複製子的亞基因體啟動子(如果存在的話)與該複製酶相容。在這個上下文中，相容表示複製酶能夠辨識亞基因體啟動子(如果存在的話)。在一個實施例中，當亞基因體啟動子對於複製酶所衍生而來的病毒來說是天然的，即這些序列的天然起源是相同的病毒時，則這可以實現。在一個替代實施例中，亞基因體啟動子對於病毒複製酶所衍生而來的病毒來說不是天然的，前提是病毒複製酶能夠辨識亞基因體啟動子。換句話說，複製酶與亞基因體啟動子相容(跨病毒相容性)。關於源自不同α病毒的亞基因體啟動子和複製酶的跨病毒相容性的實例是本領域已知的。只要有跨病毒相容性，則亞基因體啟動子和複製酶的任何組合都是可能的。習於技藝者可以透過將待測試的複製酶與RNA一起在適合從亞基因體啟動子合成RNA的條件下培育來輕鬆測試跨病毒相容性，其中RNA具有待測試的亞基因體啟動子。如果製備了亞基因體轉錄本，則確定亞基因體啟動子與複製酶是相容的。跨病毒相容性的各種實例是已知的。
複製子較佳地可以透過經修飾的功能性非結構蛋白來複製。具體地，編碼經修飾的功能性非結構蛋白的RNA複製子可以被該複製子編碼的經修飾功能性非結構蛋白複製，或者不編碼功能性非結構蛋白的RNA複製子可以被該經修飾功能性非結構蛋白複製。在一個較佳實施例中，第二核酸(例如可複製RNA分子)包含功能性核苷酸序列。這個實施例特別適合一些用於產生感興趣蛋白的方法。 可複製 RNA ( 第二核酸分子 )
可複製RNA分子或可複製RNA (rRNA)是可被RNA依賴性RNA聚合酶(複製酶)複製的RNA，其憑藉包含可被複製酶辨識的核苷酸序列而使得RNA得以複製。rRNA的複製產生(在沒有DNA中間體的情況下)一或多個相同或基本上相同的rRNA拷貝。「在沒有DNA中間體的情況下」表示在形成rRNA拷貝的過程中不形成rRNA的去氧核糖核酸(DNA)拷貝或互補序列，及/或在形成rRNA拷貝或其互補序列的過程中不使用去氧核糖核酸(DNA)分子作為模板。複製酶功能通常由功能性非結構蛋白提供，例如功能性α病毒非結構蛋白。
在本文中，至少第二核酸分子是可複製RNA分子。可複製RNA分子較佳地是被反式複製，例如透過不是根據可複製RNA分子編碼的複製酶，而是透過根據第一核酸分子編碼的功能性複製酶。較佳地，可複製RNA分子不包含功能性複製酶。第一核酸分子還可能是可複製RNA分子。較佳地，第一核酸分子是非可複製RNA分子。任何其他核酸分子(例如第三RNA分子)可以是可複製RNA分子。
術語「RNA複製子」、「複製子」、「可複製RNA分子」和「可複製的RNA」可以互換使用。
術語「可被複製」和「能夠被複製」通常描述可以被製備的核酸的一或多個相同或基本上相同的拷貝。當與術語「複製酶」一起使用時，諸如在「能夠被複製酶複製」中，術語「可被複製」和「能夠被複製」描述核酸分子(例如RNA複製子)相對於複製酶的功能特徵。這些功能特徵包括(i)複製酶能夠辨識複製子和(ii)複製酶能夠充當RNA依賴性RNA聚合酶(RdRP)中的至少一者。較佳地，複製酶能夠(i)辨識複製子和(ii)充當RNA依賴性RNA聚合酶。在一個較佳實施例中，術語「可被複製」表示RNA含有可被經修飾的功能性複製酶辨識或結合的序列，諸如保守序列元件1 (CSE 1)或其互補序列、保守序列元件2 (CSE 2)或其互補序列、保守序列元件3 (CSE 3)或其互補序列及/或保守序列元件4 (CSE 4)或其互補序列中的任一或多者。
用語「能夠辨識」描述了複製酶在物理上能夠與複製子締合，且較佳地複製酶能夠結合至複製子(通常是非共價)。術語「結合」可以表示複製酶具有結合至保守序列元件1 (CSE 1)或其互補序列(如果複製子包含)、保守序列元件2 (CSE 2)或其互補序列(如果複製子包含)、保守序列元件3 (CSE 3)或其互補序列(如果複製子包含)、保守序列元件4 (CSE 4)或其互補序列(如果複製子包含)中的任一或多者的能力。較佳地，複製酶能夠結合至CSE 2 [即結合至(+)股]及/或結合至CSE 4 [即結合至(+)股]，或結合至CSE 1的互補序列[即結合至(-)股]及/或結合至CSE 3的互補序列[即結合至(-)股]。
在一個實施例中，用語「能夠充當RdRP」表示複製酶能夠催化合成病毒基因體(+)股RNA的(-)股互補序列，其中(+)股RNA具有模板功能，及/或複製酶能夠催化合成(+)股病毒基因體RNA，其中(-)股RNA具有模板功能。一般而言，用語「能夠充當RdRP」還可以包括複製酶能夠催化合成(+)股亞基因體轉錄本，其中(-)股RNA具有模板功能，且其中(+)股亞基因體轉錄本的合成通常在亞基因體啟動子處起始。在一個實施例中，病毒是α病毒。
用語「能夠結合」和「能夠充當RdRP」是指在正常生理條件下的能力。特別是，它們指的是表現非結構蛋白或已被編碼功能性非結構蛋白的核酸轉染的細胞內的條件。細胞較佳是真核細胞。結合能力及/或充當RdRP的能力可以透過實驗進行測試，例如在無細胞活體外系統中或在真核細胞中。視情況，該真核細胞是來自代表複製酶起源的特定病毒對其具有感染性的物種的細胞。例如，當使用來自對人類具有感染性的特定病毒的病毒複製酶時，正常生理條件是人類細胞中的條件。更佳地，真核細胞(在一個實例中是人類細胞)來自提供/代表複製酶來源的特定病毒對其具有感染性的相同組織或器官。 複製所需序列元件與蛋白質編碼區的分離 (uncoupling)
在一個實施例中，本文所述的可複製RNA (rRNA)可包含自我複製單股正義病毒的經修飾調節區，其相比於參考經修飾調節區包含核苷酸序列改變，該等序列改變恢復或增進包含至少一種經修飾核苷酸的rRNA分子的功能。這些改變可能透過本文所述用於鑑定此類序列改變的方法來鑑定。在一個實施例中，經修飾的調節區是α病毒調節區，例如5'或3'調節區。在一個實施例中，5'調節區是VEEVα病毒5'調節區。
多功能α病毒衍生的載體難以開發，因為編碼nsP1234的開放閱讀框與α病毒基因體的5'複製辨識序列(nsP1的編碼序列)重疊，且通常還與包含CSE 3 (nsP4的編碼序列)的亞基因體啟動子重疊。
本文所述的rRNA大體上包含複製酶複製所需的序列元件，特別是5'複製辨識序列。在一個實施例中，一或多個非結構蛋白的編碼序列受到IRES控制，因此IRES位於非結構蛋白的編碼序列上游。因此，在一個實施例中，通常與α病毒非結構蛋白的N端片段的編碼序列重疊的5'複製辨識序列位於IRES上游，且不與一或多個非結構蛋白的編碼序列重疊。
在一個實施例中，5'複製辨識序列的編碼序列(諸如nsP1編碼序列)與位於IRES上游的感興趣的基因框內融合。
在一個實施例中，5'複製辨識序列不編碼任何蛋白質或其片段，諸如α病毒非結構蛋白或其片段。因此，在本文所述的rRNA中，複製酶和蛋白質編碼區複製所需的序列元件可能被分離。與天然病毒基因體RNA (例如天然α病毒基因體RNA)相比，可以透過移除5'複製辨識序列中的至少一個起始密碼子來達到分離。
因此，rRNA可能包含5'複製辨識序列，其中5'複製辨識序列的特徵在於相比於天然病毒5'複製辨識序列(例如天然α病毒5'複製辨識序列)，其包含移除至少一個起始密碼子。
特徵在於與天然病毒5'複製辨識序列相比包含移除至少一個起始密碼子的5'複製辨識序列在本文中可稱為「經修飾的5'複製辨識序列」。如下文所述，5'複製辨識序列的特徵可能視情況在於存在一或多種額外核苷酸改變。
在一個實施例中，rRNA包含3'複製辨識序列。3'複製辨識序列是可以被功能性複製酶辨識的核酸序列。換句話說，功能性複製酶能夠辨識3'複製辨識序列。較佳地，3'複製辨識序列位於複製子的3'端(如果複製子不包含聚(A)尾)，或緊鄰聚(A)尾的上游(如果複製子包含聚(A)尾)。通常，rRNA在複製子的3'端處包含至少10個A殘基，較佳地15-20個A殘基。在一個實施例中，3'複製辨識序列由CSE 4組成或包含CSE 4。
在一個實施例中，5'複製辨識序列和3'複製辨識序列能夠在功能性複製酶存在的情況下指導rRNA的複製。因此，當這些辨識序列存在時，在功能性複製酶存在的情況下指導rRNA的複製。
功能性經修飾複製酶偏好由能夠辨識各rRNA的5'複製辨識序列和3'複製辨識序列的第一rRNA提供。在一個實施例中，當3'複製辨識序列對於功能性α病毒複製酶所衍生而來的α病毒來說是天然的，並且當5'複製辨識序列對於功能性α病毒複製酶所衍生而來的α病毒來說是天然的，或為對功能性α病毒複製酶衍生而來的α病毒來說是天然5'複製辨識序列的變體時，這可以實現。天然表示這些序列的天然來源是相同的α病毒。在一個替代實施例中，5'複製辨識序列及/或3'複製辨識序列對於功能性α病毒複製酶衍生而來的α病毒來說不是天然的，前提是功能性α病毒複製酶能夠辨識各rRNA的5'複製辨識序列和3'複製辨識序列。換句話說，功能性α病毒複製酶與5'複製辨識序列和3'複製辨識序列相容。當非天然功能性α病毒複製酶能夠辨識相應的序列或序列元件時，則功能性α病毒複製酶被稱為是相容的(跨病毒相容性)。只要存在跨病毒相容性，(3'/5')複製辨識序列和CSE分別與功能性α病毒複製酶的任意組合都是可能的。習於技藝者可以透過將待測試的功能性α病毒複製酶與RNA一起在適於RNA複製的條件下(例如在適當的宿主細胞中)培育來輕鬆測試跨病毒相容性，其中RNA具有待測試的3'-和5'複製辨識序列。如果發生複製，則確定(3'/5')複製辨識序列和功能性α病毒複製酶是相容的。
移除5'複製辨識序列內的至少一個起始密碼子提供了幾個優點。在編碼nsP1* (nsP1的N端片段)的核酸序列中不存在起始密碼子通常將會導致nsP1*不被轉譯。此外，由於nsP1*不被轉譯，因此包含在功能性核苷酸序列內的編碼感興趣蛋白(「GOI 2」)的開放閱讀框是核醣體可接近的最上游開放閱讀框；因而當rRNA存在於細胞中時，轉譯在編碼包含在功能性核苷酸序列內的感興趣蛋白的開放閱讀框(RNA)的第一個AUG處啟動。
移除至少一個起始密碼子可以透過本領域已知的任何合適方法來實現。例如，可以在電腦中設計編碼rRNA的合適DNA分子(即特徵在於移除起始密碼子)，並隨後在活體外合成(基因合成)；或者可以透過編碼rRNA的DNA序列的定點誘變來獲得合適的DNA分子。在任何情況下，各別的DNA分子可以充當活體外轉錄的模板，從而提供rRNA。
與天然5'複製辨識序列相比，移除至少一個起始密碼子不受特別限制並且可能選自任何核苷酸修飾，包括一或多個核苷酸的取代(包括在DNA層次上起始密碼子A及/或T及/或G的取代)；一或多個核苷酸的缺失(包括在DNA層次上起始密碼子A及/或T及/或G的缺失)，以及一或多個核苷酸的插入(包括在DNA層次上起始密碼子的A和T之間及/或T和G之間插入一或多個核苷酸)。無論核苷酸修飾是取代、插入或缺失，核苷酸修飾都不得形成新的起始密碼子(作為說明性實例：在DNA層次上，插入不得是ATG插入)。
特徵在於移除至少一個起始密碼子的rRNA的5'複製辨識序列(即經修飾的5'複製辨識序列)較佳地是於自然界中發現的α病毒基因體的5'複製辨識序列的變體。在一個實施例中，經修飾的5'複製辨識序列較佳地特徵在於相對自然界中發現的至少一種α病毒基因體的5'複製辨識序列，序列同一性程度為80%或更多，較佳地85%或更多，更佳地90%或更多，甚至更佳地95%或更多。
在一個實施例中，特徵在於移除至少一個起始密碼子的rRNA的5'複製辨識序列包含與α病毒的5'端(即α病毒基因體的5'端)處的約250個核苷酸同源的序列。在一個較佳實施例中，它包含與α病毒5'端(即α病毒基因體5'端)處約250至500個，較佳地約300至500個核苷酸同源的序列。「在α病毒基因體的5'端處」表示始於α病毒基因體的最上游核苷酸處開始並包含此最上游核苷酸的核酸序列。換句話說，α病毒基因體的最上游核苷酸被指定為核苷酸1號，而例如「α病毒基因體5'端處的250個核苷酸」表示α病毒基因體的核苷酸1至250。在一個實施例中，rRNA的5'複製辨識序列的特徵在於相對於自然界中發現的至少一種α病毒基因體的5'端至少250個核苷酸，序列同一性程度為80%或更多，較佳地85%或更多，更佳地90%或更多，甚至更佳地95%或更多。至少250個核苷酸包括例如250個核苷酸、300個核苷酸、400個核苷酸、500個核苷酸。
在自然界中發現的α病毒的5'複製辨識序列通常以至少一個起始密碼子及/或保守的二級結構模體為特徵。例如，塞姆利基森林病毒(SFV)的天然5'複製辨識序列包含五個特定的AUG鹼基三聯體。根據Frolov et al., 2001, RNA 7:1638-1651，依據MFOLD分析表明塞姆利基森林病毒的天然5'複製辨識序列經預測會形成四個莖環(SL)，稱為莖環1至4 (SL1、SL2、SL3、SL4)。根據Frolov et al.，依據MFOLD分析也表明不同的α病毒(辛德比斯病毒)的天然5'複製辨識序列經預測會形成四個莖環：SL1、SL2、SL3、SL4。
已知α病毒基因體的5'端包含能夠藉由功能性α病毒複製酶複製α病毒基因體的序列元件。在一個實施例中，rRNA的5'複製辨識序列包含與α病毒的保守序列元件1 (CSE 1)同源的序列及/或與α病毒的保守序列元件2 (CSE 2)同源的序列。
α病毒基因體RNA的保守序列元件2 (CSE 2)通常由SL3和SL4表示，其前面是SL2，SL2包含至少編碼α病毒非結構蛋白nsP1的第一個胺基酸殘基的天然起始密碼子。然而在發明說明中，在一些實施例中，α病毒基因體RNA的保守序列元件2 (CSE 2)是指從SL2跨至SL4並且包含編碼α病毒非結構蛋白nsP1的第一個胺基酸殘基的天然起始密碼子的一個區域。在一個較佳實施例中，rRNA包含CSE 2或與CSE 2同源的序列。在一個實施例中，rRNA包含與CSE 2同源的序列，其較佳地以相對於自然界中發現的至少一種α病毒的CSE 2序列的序列同一性程度為80%或更多，較佳地85%或更多，更佳地90%或更多，甚至更佳地95%或更多為特徵。
在一個實施例中，5'複製辨識序列包含與α病毒的CSE 2同源的序列。α病毒的CSE 2可能包含來自α病毒的非結構蛋白的開放閱讀框的片段。
因此，在一個實施例中，rRNA的特徵可以在於其包含與來自α病毒的非結構蛋白或其片段的開放閱讀框同源的序列。與非結構蛋白或其片段的開放閱讀框同源的序列通常是自然界中發現的α病毒的非結構蛋白或其片段的開放閱讀框的變體。在一個實施例中，與非結構蛋白或其片段的開放閱讀框同源的序列較佳地特徵在於與自然界中發現的至少一種α病毒的非結構蛋白或其片段的開放閱讀框的序列同一性程度為80%或更多，較佳地85%或更多，更佳地90%或更多，甚至更佳地95%或更多。
在一個實施例中，與rRNA所包含的與非結構蛋白的開放閱讀框同源的序列不包含非結構蛋白的天然起始密碼子，並且更佳地不包含非結構蛋白的任何起始密碼子。在一個實施例中，與CSE 2同源的序列的特徵在於與天然α病毒CSE 2序列相比移除了所有起始密碼子。因而，與CSE 2同源的序列較佳地不包含任何起始密碼子。
當與開放閱讀框同源的序列不包含任何起始密碼子時，與開放閱讀框同源的序列本身不是開放閱讀框，因為它並未充當轉譯模板。
在一個實施例中，5'複製辨識序列包含與來自α病毒的非結構蛋白或其片段的開放閱讀框同源的序列，其中與來自α病毒的非結構蛋白或其片段的開放閱讀框同源的序列的特徵在於與天然α病毒序列相比其包含移除至少一個起始密碼子。
在一個實施例中，與來自α病毒的非結構蛋白或其片段的開放閱讀框同源的序列的特徵在於，其包含移除非結構蛋白的開放閱讀框的至少天然起始密碼子。較佳地，其特徵在於其包含移除至少編碼nsP1的開放閱讀框的天然起始密碼子。
天然起始密碼子是AUG鹼基三聯體，當RNA存在於宿主細胞中時，宿主細胞中核醣體上的轉譯於此開始。換言之，天然起始密碼子是在核醣體蛋白質合成期間被轉譯的第一個鹼基三聯體，例如在已經接種了包含天然起始密碼子的RNA的宿主細胞中。在一個實施例中，宿主細胞是真核物種的細胞，其為包含天然α病毒5'複製辨識序列的特定α病毒的天然宿主。在一個實施例中，宿主細胞是細胞株「BHK21 [C13] (ATCC® CCL10™)」的BHK21細胞，可獲自美國典型培養物保藏中心，Manassas, Virginia, USA.。
許多α病毒的基因體已被完全定序並且可以公開取得，而這些基因體所編碼的非結構蛋白的序列也可以公開取得。此類序列資訊允許在電腦上確定天然起始密碼子。
在一個實施例中，與來自α病毒的非結構蛋白或其片段的開放閱讀框同源的序列的特徵在於，其包含移除非結構蛋白的含開放閱讀框的天然起始密碼子以外的一或多個起始密碼子。在一個實施例中，該等核酸序列的額外特徵在於移除天然起始密碼子。例如，除了移除天然起始密碼子之外，還可能移除任何一個或兩個或三個或四個或超過四個(例如五個)起始密碼子。
如果本文所述的rRNA的特徵在於移除非結構蛋白的開放閱讀框的天然起始密碼子，並且視情況移除天然起始密碼子以外的一或多個起始密碼子，則與開放閱讀框同源的序列本身並不是開放閱讀框，因為它並未充當轉譯模板。
較佳地除了移除天然起始密碼子以外，被移除的天然起始密碼子以外的一或多個起始密碼子較佳地選自具有起始轉譯潛力的AUG鹼基三聯體。具有起始轉譯潛力的AUG鹼基三聯體可被稱為「潛在起始密碼子」。給定的AUG鹼基三聯體是否具有起始轉譯潛力可以透過電腦或基於細胞的活體外分析來確定。
在一個實施例中，透過電腦確定給定的AUG鹼基三聯體是否具有起始轉譯潛力：在那個實施例中，檢查核苷酸序列，如果AUG鹼基三聯體是AUGG序列的一部分(較佳為Kozak序列的一部分)，則確定AUG鹼基三聯體具有起始轉譯潛力。
在一個實施例中，在基於細胞的活體外分析中確定給定的AUG鹼基三聯體是否具有起始轉譯潛力：特徵在於移除天然起始密碼子並且在移除天然起始密碼子的該位置的下游包含給定的AUG鹼基三聯體的rRNA被引入宿主細胞中。在一個實施例中，宿主細胞是真核物種的細胞，其是包含天然α病毒5'複製辨識序列的特定α病毒的天然宿主。在一個較佳實施例中，宿主細胞是細胞株「BHK21 [C13] (ATCC® CCL10™)」的BHK21細胞，可獲自美國典型培養物保藏中心，Manassas, Virginia, USA.。偏好在移除天然起始密碼子的位置和給定AUG鹼基三聯體之間不存在其他AUG鹼基三聯體。如果，在將rRNA (其特徵在於移除天然起始密碼子並包含給定AUG鹼基三聯體)轉移到宿主細胞中後，在給定的AUG鹼基三聯體處起始轉譯，則確定給定的AUG鹼基三聯體具有起始轉譯潛力。轉譯是否起始可以藉由本領域已知的任何合適方法來確定。例如，rRNA可能在給定AUG鹼基三聯體下游並且與給定AUG鹼基三聯體框內編碼有助於偵測轉譯產物(如果有的話)的標籤，例如myc標籤或HA標籤；是否存在具有編碼標籤的表現產物可以藉由例如西部墨點法來確定。在這個實施例中，偏好在給定AUG鹼基三聯體和編碼標籤的核酸序列之間不存在其他AUG鹼基三聯體。基於細胞的活體外分析可以針對超過一個給定AUG鹼基三聯體單獨進行：在每種情況下，偏好在移除天然起始密碼子的位置和給定AUG鹼基三聯體之間不存在其他AUG鹼基三聯體。這可以透過移除天然起始密碼子移除位置和給定AUG鹼基三聯體之間的所有AUG鹼基三聯體(如果有的話)來達到。因此，給定AUG鹼基三聯體是移除天然起始密碼子位置下游的第一個AUG鹼基三聯體。
較佳地，rRNA的5'複製辨識序列的特徵在於移除所有潛在的起始密碼子。因此，5'複製辨識序列較佳地不包含可被轉譯成蛋白質的開放閱讀框。
在一個實施例中，rRNA的5'複製辨識序列的特徵在於二級結構，其相當於病毒基因體RNA的5'複製辨識序列的(預測)二級結構。為此，rRNA可能包含一或多個核苷酸改變，其補償因為移除至少一種起始密碼子而被引入一或多個莖環內的核苷酸配對破壞。
在一個實施例中，rRNA的5'複製辨識序列的特徵在於二級結構，其相當於α病毒基因體RNA的5'複製辨識序列的二級結構。在一個較佳實施例中，rRNA的5'複製辨識序列的特徵在於二級結構，其相當於α病毒基因體RNA的5'複製辨識序列的預測二級結構。RNA分子的二級結構較佳地透過用於RNA二級結構預測的網路伺服器http：//rna.urmc.rochester.edu/RNAstructionWeb/Servers/Predict1/Predict1.html來預測。
透過將特徵在於移除至少一個起始密碼子的rRNA的5'複製辨識序列的二級結構或預測二級結構與天然α病毒5'複製辨識序列進行比較，可以確定核苷酸配對破壞存在或不存在。例如，與天然α病毒5'複製辨識序列相比，在給定位置處可能不存在至少一個鹼基對(例如莖環內的鹼基對，特別是莖環的莖內的鹼基對)。
在一個實施例中，5'複製辨識序列的一或多個莖環未被刪除或破壞。更佳地，莖環3和4未被刪除或破壞。較佳地，5'複製辨識序列的莖環沒有一者被刪除或破壞。
在一個實施例中，移除至少一個起始密碼子並不會破壞5'複製辨識序列的二級結構。在一個替代實施例中，移除至少一個起始密碼子確實會破壞5'複製辨識序列的二級結構。在這個實施例中，與天然5'複製辨識序列相比，移除至少一個起始密碼子可能會導致在給定位置處不存在至少一個鹼基對(例如莖環內的鹼基對)。如果莖環內不存在鹼基對，則與天然5'複製辨識序列相比，移除至少一個起始密碼子被確定為在莖環內引入核苷酸配對破壞。莖環內的鹼基對通常是莖環的莖中的鹼基對。
在一個實施例中，rRNA包含一或多種核苷酸改變，其補償因為移除至少一個起始密碼子而被引入一或多個莖環內的核苷酸配對破壞。
如果移除至少一個起始密碼子會在莖環內引入核苷酸配對破壞，則與天然5'複製辨識序列相比，可以引入一或多個預期會補償核苷酸配對破壞的核苷酸改變，且由此獲得的二級結構或預測二級結構可能與天然5'複製辨識序列進行比較。
基於一般常識和本文的揭示內容，習於技藝者可以預期某些核苷酸改變會補償核苷酸配對破壞。例如，與天然5'複製辨識序列相比，如果特徵在於移除至少一個起始密碼子的rRNA的給定5'複製辨識序列的二級結構或預測二級結構的給定位置處的鹼基對遭到破壞，則在該位置處恢復鹼基對的核苷酸改變(較佳地在未重新引入起始密碼子的情況下)預期會補償核苷酸配對破壞。
在一個實施例中，rRNA的5'複製辨識序列不與可轉譯核酸序列重疊或不包含可轉譯核酸序列，即可轉譯成肽或蛋白質，特別是nsP，特別是nsP1，或其任一者的片段。關於「可轉譯」的核苷酸序列，它需要存在起始密碼子；起始密碼子編碼肽或蛋白質最N端的胺基酸殘基。在一個實施例中，rRNA的5'複製辨識序列不與編碼nsP1的N端片段的可轉譯核酸序列重疊，或不包含編碼nsP1的N端片段的可轉譯核酸序列。
在一些情況下，rRNA包含至少一個亞基因體啟動子。在一個較佳實施例中，rRNA的亞基因體啟動子不與可轉譯核酸序列重疊或不包含可轉譯核酸序列，可轉譯核酸序列即可轉譯成肽或蛋白質，特別是nsP，特別是nsP4，或其任一者的片段。在一個實施例中，rRNA的亞基因體啟動子不與編碼nsP4的C端片段的可轉譯核酸序列重疊，或不包含編碼nsP4的C端片段的可轉譯核酸序列。具有不與可轉譯核酸序列重疊或不包含可轉譯核酸序列(例如可轉譯成nsP4的C端片段)的亞基因體啟動子的rRNA可以透過刪除nsP4的編碼序列的一部分(通常是編碼nsP4之N端部分的該部分)，及/或透過移除nsP4編碼序列之一部分中未被刪除的AUG鹼基三聯體來產生。如果nsP4的編碼序列或其一部分中的AUG鹼基三聯體被移除，則被移除的AUG鹼基三聯體較佳地是潛在的起始密碼子。或者，如果亞基因體啟動子不與編碼nsP4的核酸序列重疊，則可能刪除編碼nsP4的整個核酸序列。
在一個實施例中，rRNA不包含僅編碼nsP1的N端片段的開放閱讀框，且視情況不包含僅編碼nsP4的C端片段的開放閱讀框。
在一些實施例中，rRNA不包含α病毒基因體5'端的莖環2 (SL2)。根據Frolov et al.上文，莖環2是在α病毒基因體5'端處發現的保守二級結構，位於CSE 2的上游，但對於複製來說是可有可無的。
rRNA較佳是單股RNA分子。rRNA通常是(+)股RNA分子。在一個實施例中，rRNA是經分離的核酸分子。rRNA包含至少一個經修飾的核苷酸，並且較佳地包含一或多個序列改變，特別是透過本文揭示用於鑑定恢復或改善包含至少一種經修飾核苷酸的rRNA的功能的序列改變的方法所偵測到的序列改變。
在一個實施例中，rRNA包含SEQ ID NO：5的自我複製型RNA病毒的經修飾5'調節區，其較佳地是VEEV特立尼達驢病毒株(登錄號L01442)的5'調節區的經修飾形式，且該經修飾的調節區在5'調節區(SEQ ID NO：5)的位置67、244、245、246、248中的一或多者處包含點突變。較佳地，5'調節區進一步在5'調節區(SEQ ID NO：5)的位置4處包含點突變。點突變較佳地為G4A、A67C、G244A、C245A、G246A或C248A。 實施例的安全性特徵
單獨或呈任何適當組合的以下特徵是較佳的：
複製子不形成顆粒。這意味著，在本文所述的複製子接種宿主細胞後，宿主細胞不會產生病毒顆粒，諸如下一代病毒顆粒。在一個實施例中，RNA複製子完全不含編碼任何病毒結構蛋白(例如α病毒結構蛋白，諸如核心核衣殼蛋白C、包膜蛋白P62及/或包膜蛋白E1)的遺傳訊息。較佳地，複製子不包含病毒包裝訊號，例如α病毒包裝訊號。例如，可以例如透過缺失或突變移除包含在SFV的nsP2編碼區域中的α病毒包裝訊號(White et al., 1998, J. Virol. 72:4320-4326)。移除α病毒包裝訊號的適當方法包括改造nsP2編碼區的密碼子使用。遺傳密碼的簡併可能允許刪除包裝訊號的功能而不影響所編碼的nsP2的胺基酸序列。 功能性核苷酸序列
本文所述的核酸分子(較佳地RNA分子)之一或兩者可包含功能性核苷酸序列。例如，除了編碼經修飾的聚合酶之外，第一核酸分子(較佳地RNA分子)可進一步包含功能性核苷酸序列及/或第二核酸分子(較佳地RNA分子)可進一步包含功能性核苷酸序列。舉例來說，功能性核苷酸序列可編碼用於治療或預防疾病或病症的感興趣胺基酸序列(例如基因產物、蛋白質、肽或其片段)，或可包含本身具有一些生物活性的序列：諸如miRNA或前-miRNA序列，或核酶序列，或反義序列，也可用於治療或預防疾病或病症。 感興趣的胺基酸序列
感興趣的胺基酸序列可能例如選自由以下組成之群：免疫原性蛋白，較佳地衍生自細菌、病毒、真菌或寄生蟲的免疫原性蛋白或其片段；細胞內干擾素(IFN)訊號傳導抑制劑；抗體或其片段；治療性蛋白；多能性因子或分化因子；牛痘病毒免疫逃脫蛋白，較佳地E3或B18；包含托斯卡納病毒NS蛋白或托斯卡納病毒NS蛋白的功能變體的病毒衍生因子；和報導蛋白。在一個實施例中，免疫原性蛋白或其片段可以是抗原或其表位，較佳地T細胞表位。治療性蛋白可以在細胞中提供缺失的酶促活性。感興趣的胺基酸序列較佳地不包括自我複製型病毒的功能性非結構蛋白，例如功能性α病毒非結構蛋白。 編碼至少一個感興趣的基因產物的至少一個開放閱讀框
在一個實施例中，第一及/或第二核酸分子(較佳地RNA分子，較佳地第二RNA分子)包含至少一個功能性核苷酸序列，例如編碼感興趣的胺基酸序列(基因產物) (諸如感興趣蛋白)的開放閱讀框。如本文所用，胺基酸序列、蛋白質、肽和基因產物可互換使用。較佳地，感興趣的胺基酸序列(蛋白質)由異源核酸序列編碼。編碼感興趣蛋白的基因同義地稱為「感興趣的基因」或「轉基因」。在各個實施例中，感興趣蛋白由異源核酸序列編碼。如本文所用，術語「異源」較佳地指核酸序列在功能上或結構上不與病毒核酸序列(例如α病毒核酸序列)天然連接。
在一些實施例中，第一及/或第二RNA分子可能包含超過一個編碼感興趣蛋白的開放閱讀框，其各自可獨立地選擇受到亞基因體啟動子控制與否。或者，多蛋白或融合多肽包含由2A自我切割肽(例如來自口蹄疫病毒2A蛋白)或蛋白酶切割位點或內含肽分隔的單獨多肽。
在一個實施例中，第一及/或第二RNA包含醫藥活性RNA或由醫藥活性RNA組成。「醫藥活性RNA」可能是編碼醫藥活性肽或蛋白質的RNA。較佳地，本文所述的RNA分子編碼醫藥活性肽或蛋白質。在一些實施例中，本文的系統編碼醫藥活性肽或蛋白質。較佳地，第一RNA分子編碼如本文所述的複製酶，且能夠被第一RNA分子編碼的複製酶反式複製的第二可複製RNA分子編碼醫藥活性肽或蛋白質。較佳地，開放閱讀框編碼醫藥活性肽或蛋白質。較佳地，RNA包含編碼醫藥活性肽或蛋白質的開放閱讀框，視情況受到亞基因體啟動子控制。
當以治療有效量投予給個體時，「醫藥活性肽或蛋白質」對個體的病況或疾病狀態有正面或有利的作用。較佳地，醫藥活性肽或蛋白質具有治癒或姑息性質並且可以被投予以改善、緩和、緩解、逆轉、延遲疾病或病症的一或多種症狀的發作或減輕疾病或病症的一或多種症狀的嚴重性。醫藥活性肽或蛋白質或醫藥活性miRNA可能具有防治性質並且可用於延遲疾病的發作或減輕此類疾病或病理狀況的嚴重性。術語「醫藥活性肽或蛋白質」包括完整蛋白質或多肽，並且還可以指其醫藥活性片段。它還可以包括肽或蛋白質的醫藥活性類似物。術語「醫藥活性肽或蛋白質」包括作為抗原的肽和蛋白質，即肽或蛋白質在個體體內引發可以是治療性的或部分或完全保護性的免疫反應。
在一個實施例中，醫藥活性肽或蛋白質是或包含免疫活性化合物或抗原或表位。
術語「免疫活性化合物」是有關改變免疫反應的任何化合物，較佳地透過誘導及/或抑制免疫細胞的成熟、誘導及/或抑制細胞激素生物合成，及/或透過刺激B細胞產生抗體來改變體液免疫性。在一個實施例中，免疫反應涉及刺激抗體反應(通常包括免疫球蛋白G (IgG))。免疫活性化合物具有有效的免疫刺激活性，包括但不限於抗病毒和抗腫瘤活性，並且還可以下調免疫反應的其他方面，例如將免疫反應從Th2免疫反應轉移，這可用於治療廣泛的Th2媒介的疾病。
術語「抗原」或「免疫原」涵蓋任何會引發免疫反應的物質。具體而言，「抗原」是有關與抗體或T淋巴球(T細胞)特異性反應的任何物質。術語「抗原」包含有包含至少一個表位的任何分子。較佳地，本文的抗原是視情況在加工後誘導免疫反應的分子，該免疫反應較佳對該抗原具有特異性。可以使用任何合適的抗原，其為免疫反應的候選物，其中免疫反應可能是體液免疫反應以及細胞免疫反應。在本文實施例的上下文中，抗原較佳地由細胞呈現，較佳地由抗原呈現細胞在MHC分子的環境中呈現，這導致針對抗原的免疫反應。抗原較佳地是對應於天然存在的抗原或衍生自天然存在的抗原的產物。此類天然存在的抗原可能包括或可能衍生自過敏原、病毒、細菌、真菌、寄生蟲和其他傳染原與病原體，或者抗原也可能是腫瘤抗原。抗原可能對應於天然存在的產物，例如病毒蛋白或其部分。在較佳實施例中，抗原是表面多肽，即天然展示在細胞、病原體、細菌、病毒、真菌、寄生蟲、過敏原或腫瘤的表面上的多肽。抗原可能會引發針對細胞、病原體、細菌、病毒、真菌、寄生蟲、過敏原或腫瘤的免疫反應。
術語「病原體」是指能夠在生物體(較佳地脊椎動物生物體)體內引起疾病的病原性生物材料。病原體包括微生物(諸如細菌)、單細胞真核生物體(原生動物)、真菌、寄生蟲，與病毒。
術語「表位」、「抗原肽」、「抗原表位」、「免疫原性肽」和「MHC結合肽」在本文中可互換使用，並且是指分子(諸如抗原)中的抗原決定位，即指被免疫系統辨識(例如被T細胞辨識，特別是當存在於MHC分子的背景下時)的免疫活性化合物中的一部分或其片段。蛋白質的表位較佳地包含該蛋白質的連續或不連續部分，且長度較佳地在5和100個胺基酸之間、較佳地在5和50個胺基酸之間、更佳地在8和30個胺基酸之間，最佳地在10和25個胺基酸之間，例如表位的長度較佳為9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個胺基酸。表位可能結合至MHC分子，諸如細胞表面上的MHC分子，因此可以是「MHC結合肽」或「抗原肽」。術語「主要組織相容性複合體」和縮寫「MHC」包括MHC第I類和MHC第II類分子並且是有關存在於所有脊椎動物中的基因複合體。MHC蛋白或分子對於免疫反應中淋巴球與抗原呈現細胞或罹病細胞之間的訊號傳導很重要，其中MHC蛋白或分子結合肽並將其呈現以供T細胞受體辨識。MHC編碼的蛋白質在細胞表面上表現，並向T細胞展示自身抗原(細胞本身的肽片段)和非自身抗原(例如入侵微生物的片段)。此類免疫原性部分偏好結合至MHC第I類或第II類分子。如本文所用，如果使用本領域已知的任何分析可偵測到這種結合，則稱免疫原性部分「結合至」MHC第I類或第II類分子。術語「MHC結合肽」是有關與MHC第I類及/或MHC第II類分子結合的肽。在MHC第I類/肽複合體的情況下，結合肽通常為8-10個胺基酸長，儘管更長或更短的肽可能是有效的。在第II類MHC/肽複合體的情況下，結合肽通常為10-25個胺基酸長，特別是13-18個胺基酸長，而較長且較短的肽可能是有效的。
在一個實施例中，感興趣蛋白包含適合目標生物體疫苗接種的表位。習於技藝者將會知道，免疫生物學和疫苗接種的原理之一是基於：透過用抗原來免疫生物體而產生針對疾病的免疫保護反應，該抗原與待治療的疾病在免疫學上相關。抗原選自包含自身抗原和非自身抗原之群。非自身抗原較佳地為細菌抗原、病毒抗原、真菌抗原、過敏原或寄生蟲抗原。抗原偏好包含能夠在目標生物體中引發免疫反應的表位。例如，表位可能引發針對細菌、病毒、真菌、寄生蟲、過敏原或腫瘤的免疫反應，諸如細胞毒性T細胞反應。
在一些實施例中，非自身抗原是細菌抗原。在一些實施例中，抗原引發針對感染動物(包括鳥類、魚類和哺乳動物，包括豢養動物)的細菌的免疫反應。較佳地，引發免疫反應所針對的細菌是病原性細菌。
在一些實施例中，非自身抗原是病毒抗原。病毒抗原可能是例如病毒表面蛋白的肽，例如衣殼多肽或刺突多肽，諸如冠狀病毒的肽。在一些實施例中，抗原引發針對感染動物(包括鳥類、魚類和哺乳動物，包括豢養動物)的病毒的免疫反應。較佳地，引發免疫反應所針對的病毒是病原性病毒，諸如伊波拉病毒。
在一些實施例中，非自身抗原是真菌的多肽或蛋白質。在一些實施例中，抗原引發針對感染動物(包括鳥類、魚類和哺乳動物，包括豢養動物)的真菌的免疫反應。較佳地，引發免疫反應所針對的真菌是病原性真菌。
在一些實施例中，非自身抗原是單細胞真核寄生蟲的多肽或蛋白質。在一些實施例中，抗原引發針對單細胞真核寄生蟲(較佳地病原性單細胞真核寄生蟲)的免疫反應。病原性單細胞真核寄生蟲可能例如來自瘧原蟲屬(例如惡性瘧原蟲( P. falciparum)、間日瘧原蟲( P. vivax)、三日瘧原蟲( P. malariae)或卵形瘧原蟲( P. ovale))、來自利甚曼原蟲屬，或來自錐蟲屬(例如克氏錐蟲( T. cruzior)或布氏錐蟲( T. brucei))。
在一些實施例中，醫藥活性肽或蛋白質不需要是引發免疫反應的抗原。適當的醫藥活性蛋白質或肽也可能選自由細胞激素和免疫系統蛋白質組成之群，諸如免疫活性化合物(例如介白素、群落刺激因子(CSF)、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)、顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、紅血球生成素、腫瘤壞死因子(TNF)、干擾素、整合素、位址素(addressin)、選滯蛋白(seletin)、歸巢受體、T細胞受體、嵌合抗原受體(CAR)、免疫球蛋白)、激素(胰島素、甲狀腺激素、兒茶酚胺、促性腺素、生長激素、催乳素、催產素、多巴胺、牛生長激素、瘦素以及類似物)、生長激素(例如人類生長激素)、生長因子(例如表皮生長因子、神經生長因子、類胰島素生長因子以及類似物)、生長因子受體、酶(組織血漿蛋白原活化因子、鏈球菌激酶、膽固醇生物合成或降解酶、類固醇生成酶、激酶、磷酸二酯酶、甲基化酶、去甲基化酶、去氫酶、纖維素酶、蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、芳香酶、細胞色素、腺苷酸或鳥苷酸環化酶、神經醯胺酶以及類似物)、受體(類固醇激素受體、肽受體)、結合蛋白(生長激素或生長因子結合蛋白以及類似物)、轉錄和轉譯因子、腫瘤生長抑制蛋白(如抑制血管生成的蛋白質)、結構蛋白(諸如膠原蛋白、絲纖維蛋白、纖維蛋白原、彈性蛋白、微管蛋白、肌動蛋白和肌球蛋白)、血液蛋白(凝血酶、血清白蛋白、因子VII、因子VIII、胰島素、因子IX、因子X、組織血漿蛋白原活化因子、蛋白C、馮維勒布蘭德因子(von Wilebrand factor)、抗凝血酶III、葡萄糖腦苷酶、紅血球生成素顆粒球群落刺激因子(GCSF)或經修飾的因子VIII，抗凝血劑以及類似物。在一個實施例中，醫藥活性蛋白是涉入調節淋巴穩態的細胞激素，較佳地涉入並較佳地誘導或增強T細胞的發育、引發、擴增、分化及/或存活的細胞激素。在一個實施例中，細胞激素是介白素，例如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15或IL-21。
由開放閱讀框編碼的另一種合適的感興趣蛋白是干擾素(IFN)訊號傳導的抑制劑。雖然已報導過引入RNA進行表現的細胞的活力可能會降低，特別是如果細胞用RNA轉染多次的話，但發現IFN抑制劑可以增強其中要表現RNA的細胞的活力(WO 2014/071963 A1)。較佳地，抑制劑是第I型IFN訊號傳導的抑制劑。防止細胞外IFN與IFN受體接合並抑制細胞內IFN訊號傳導會使得RNA在細胞中穩定表現。或者或另外，防止細胞外IFN與IFN受體接合並抑制細胞內IFN訊號傳導會增強細胞的存活，特別是如果細胞經RNA重複轉染的話。在不希望受理論囿限的情況下，設想細胞內IFN訊號傳導可導致轉譯抑制及/或RNA降解。這可以透過抑制一或多種IFN誘導型抗病毒活性效應蛋白來解決。IFN誘導型抗病毒活性效應蛋白可以選自由RNA依賴性蛋白激酶(PKR)、2',5'-寡腺苷酸合成酶(OAS)和RNaseL組成之群。抑制細胞內IFN訊號傳導可能包含抑制PKR依賴性路徑及/或OAS依賴性路徑。
此外，合適的感興趣蛋白是能夠抑制PKR依賴性路徑及/或OAS依賴性路徑的蛋白質。抑制PKR依賴性路徑可能包含抑制eIF2-α磷酸化。抑制PKR可能包含用至少一種PKR抑制劑來處理細胞。PKR抑制劑可能是PKR的病毒抑制劑。PKR的病毒抑制劑偏好是牛痘病毒E3。如果肽或蛋白質(例如E3、K3)要抑制細胞內IFN訊號傳導，則偏好肽或蛋白質的細胞內表現。牛痘病毒E3是一種25 kDa dsRNA結合蛋白(由基因E3L編碼)，其結合並隔離dsRNA以防止PKR和OAS活化。E3可以直接結合至PKR並抑制其活性，導致elF2-α的磷酸化減少。再一個偏好的病毒抑制劑是牛痘病毒B18，特別是B18R。牛痘病毒B18是一種可溶性IFN-α抑制劑，分子量為41 kDa。其他適當的IFN訊號傳導抑制劑是單純皰疹病毒ICP34.5、托斯卡納病毒NS、家蠶核多面體病毒PK2和HCV NS34A。WO 2019/053003中揭露了編碼托斯卡納病毒NS的RNA分子。
其他合適的感興趣蛋白包括多能性因子。術語「多能性因子」或「重新編程轉錄因子」是有關分子，特別是肽或蛋白質，當其視情況與其他試劑(諸如其他重新編程因子)一起在體細胞中表現時，導致該等體細胞重新編程或去分化為具有幹細胞特徵(特別是多能性)的細胞。重新編程因子的具體實例包括OCT4、SOX2、c-MYC、KLF4、LIN28和NANOG。
由RNA分子編碼的感興趣蛋白可以是分化因子。這個因子可用於(轉)分化，意味著在將這樣的因子引入較佳地已經分化的細胞中後，細胞被(重新)編程為(不同的)特定細胞類型。轉分化尤其表示不發生細胞從一種細胞類型重新編程為另一種細胞類型的多能性狀態。這種感興趣蛋白的實例是MYOD1，它也可以用作將纖維母細胞重新編程為肌肉細胞的轉分化因子。
在一個實施例中，開放閱讀框編碼報導蛋白，例如細胞表面表現的蛋白(諸如CD90)。在那個實施例中，開放閱讀框包含報導基因。某些基因可能被選作為報導基因，因為它們賦予表現它們的細胞或生物體的特徵可以容易地被辨識和測量，或者因為它們是可選擇標記。報導基因通常被用作為指示某個基因是否已被細胞或生物體群攝入或表現。較佳地，報導基因的表現產物是目視可偵測的。常見的目視可偵測報導蛋白通常具有螢光或發光蛋白。特定報導基因的實例包括編碼水母綠色螢光蛋白(GFP)的基因(它使表現該蛋白的細胞在藍光下發出綠光)、酵素螢光素酶(Luc) (其催化與螢光素的反應產生光)，以及紅色螢光蛋白(RFP)。這些特定報導基因的任何變體都是可行的，只要變體具有目視可偵測的性質即可。例如eGFP是GFP的點突變變體。報導蛋白實施例特別適於測試表現。 編碼感興趣蛋白的至少一個開放閱讀框的位置
視情況受到亞基因體啟動子控制，第一核酸分子及/或第二核酸分子(較佳地RNA分子)適於表現編碼感興趣蛋白的一或多個基因。例如，在這樣的實施例中，第一RNA分子必須編碼兩種基因產物，經修飾聚合酶和(一或多種)額外的感興趣蛋白。各個實施例都是可行的。一或多個開放閱讀框(各自編碼感興趣蛋白)可以存在於第一RNA及/或第二RNA，較佳地第二RNA上。各個RNA最上游的開放閱讀框被稱為「第一開放閱讀框」。在一個實施例中，在第一RNA上，編碼一或多個感興趣蛋白的一或多個開放閱讀框位於編碼功能性非結構蛋白的開放閱讀框下游。在一個實施例中，編碼感興趣蛋白的第一開放閱讀框位於5'複製辨識序列，且在第一RNA的情況下視情況編碼自我複製型病毒的一或多個非結構蛋白的開放閱讀框下游。在一個實施例中，編碼感興趣蛋白的第一開放閱讀框位於5'複製辨識序列下游，且在第一RNA的情況下IRES的上游且視情況為編碼自我複製型病毒的一或多個非結構蛋白的開放閱讀框上游。在一些實施例中，一或多個其他開放閱讀框可以存在於第一開放閱讀框下游。第一開放閱讀框下游的一或多個其他開放閱讀框可被稱為「第二開放閱讀框」、「第三開放閱讀框」等，依照它們存在於第一開放閱讀框下游的順序(5'至3')。在一個實施例中，在第一RNA上，編碼一或多個感興趣蛋白的一或多個其他開放閱讀框位於編碼自我複製型病毒的一或多個非結構蛋白的開放閱讀框下游，且較佳地受亞基因體啟動子控制。較佳地，編碼感興趣蛋白的各個開放閱讀框受亞基因體啟動子控制。較佳地，各個開放閱讀框包含起始密碼子(鹼基三聯體)，通常為AUG (在RNA分子中)，對應於ATG (在相應的DNA分子中)。
如果複製子包含3'複製辨識序列，則偏好所有開放閱讀框位於3'複製辨識序列上游。
在一些實施例中，第一RNA及/或第二RNA的至少一個開放閱讀框受到亞基因體啟動子，較佳地α病毒亞基因體啟動子控制。α病毒亞基因體啟動子非常有效率，因此適於大量表現異源基因。較佳地，亞基因體啟動子是α病毒中亞基因體轉錄本的啟動子。這意味著亞基因體啟動子是α病毒天然的啟動子，且其較佳地控制編碼該α病毒中一或多個結構蛋白的開放閱讀框的轉錄。或者，亞基因體啟動子是α病毒的亞基因體啟動子變體；任何在宿主細胞中充當亞基因體RNA轉錄啟動子的變體都是合適的。如果第一RNA及/或第二RNA包含亞基因體啟動子，則偏好第一RNA及/或第二RNA包含保守序列元件3 (CSE 3)或其變體。
較佳地，受亞基因體啟動子控制的至少一個開放閱讀框位於亞基因體啟動子下游。較佳地，亞基因體啟動子控制包含開放閱讀框轉錄本的亞基因體RNA的產生。
在一些實施例中，第一開放閱讀框受亞基因體啟動子控制。在一個實施例中，當第一開放閱讀框受亞基因體啟動子控制時，由第一開放閱讀框編碼的基因可以從RNA以及其亞基因體轉錄本(後者在功能性α病毒複製酶存在的情況下)表現。各自受亞基因體啟動子控制的一或多個其他開放閱讀框可能存在於可受到亞基因體啟動子控制的第一開放閱讀框下游。由一或多個其他開放閱讀框(例如由第二開放閱讀框)編碼的蛋白質可能從一或多個亞基因體轉錄本轉譯，各個亞基因體轉錄本受亞基因體啟動子控制。例如，第一RNA可能包含控制編碼第三感興趣蛋白的轉錄本產生的亞基因體啟動子。
在其他實施例中，第一開放閱讀框不受亞基因體啟動子控制。在一個實施例中，當第一開放閱讀框不受亞基因體啟動子控制時，由第一開放閱讀框編碼的蛋白質可由RNA表現。一或多個其他開放閱讀框(各自受亞基因體啟動子控制)可能存在於第一開放閱讀框下游。由一或多個其他開放閱讀框編碼的蛋白質可能由亞基因體轉錄本表現。
在包含本文所述第一RNA分子和第二RNA分子的細胞中，第二和視情況存在的第一RNA可能被功能性複製酶擴增。另外，如果第一RNA及/或第二RNA包含受到亞基因體啟動子控制的一或多個開放閱讀框，則預期功能性複製酶(本文所述經修飾的聚合酶)會產生一或多個亞基因體轉錄本。
如果第一RNA及/或第二RNA包含超過一個編碼感興趣蛋白的開放閱讀框，則偏好各個開放閱讀框編碼不同的蛋白質。例如，由編碼感興趣蛋白的第二開放閱讀框編碼的蛋白質不同於由編碼感興趣蛋白的第一開放閱讀框編碼的蛋白質。 IRES
在一個實施例中，第一核酸分子(較佳地第一RNA分子)可能包含內部核醣體進入位點(IRES)和編碼自我複製型RNA病毒的一或多個非結構蛋白的開放閱讀框，其中IRES控制該一或多個非結構蛋白(例如nsp1234)的表現。較佳地，第一rRNA及/或第二rRNA含有允許藉由功能性複製酶進行複製的序列元件。在一個實施例中，自我複製型病毒是α病毒且允許藉由功能性複製酶進行複製的序列元件是衍生自α病毒。
α病毒複製酶具有加帽酶功能，並且通常基因體和亞基因體(+)股RNA會被加帽。5'-帽用於保護mRNA免於降解，並將核醣體次單元以及細胞因子引導至mRNA，以便在mRNA上形成核糖核蛋白複合體，然後可以從附近的起始密碼子開始轉譯。這複雜的過程在文獻中有廣泛描述(Jackson et al., 2010, Nat Rev Mol Biol; Vol 10:113-127)。儘管帽依賴性轉譯的機制非常複雜且有效率，但細胞具有完全或部分獨立於5'帽起始轉譯的方法(Thompson 2012; Trends in Microbiology 20:558-566)。因此，在導致帽依賴性轉譯全局下調的細胞壓力情況下，細胞仍然可優先表現選定的基因，通常是在IRES的輔助下。
病毒也進化出不同的方式來利用細胞機制來轉譯病毒基因。由於病毒感染通常會被細胞感知到，導致細胞抗病毒反應(干擾素反應；壓力反應)，因此許多病毒也利用帽獨立性轉譯，尤其是RNA病毒。帽獨立性轉譯確保了病毒RNA轉譯在細胞壓力反應時的優勢，使病毒有機會完成其生命週期並從受感染細胞被釋放。
內部核醣體進入位點(IRES)是形成適當二級結構的RNA序列，該二級結構會將預起始複合體吸引到轉譯起始密碼子(AUG或其他密碼子)附近。文獻中描述了具有共同特徵的四類IRES。原型IRES為脊髓灰白質炎病毒IRES (第I型)、腦心肌炎病毒(EMCV) IRES (第II型)、C型肝炎病毒(HCV) IRES (第III型)和雙順反子病毒基因間區域中發現的IRES (第IV型) (Thompson, 2012; Trends in Microbiology 20:558-566；Lozano et al., 2018; Open Biology 8:180155)。
第I型至第III型IRES的共同之處在於它們在AUG起始密碼子處起始轉譯，而第IV型IRES在非AUG密碼子(例如GCU)處起始。因此，第I型至第III型需要在eIF2/GTP的幫助下傳遞甲硫胺酸的起始子tRNA (eIF2/GTP/Met-tRNAiMet)。在壓力下活化eIF2激酶會磷酸化eIF2的α次單元，進而抑制AUG處起始的轉譯。因此，第IV型IRES引導的轉譯不會受到eIF2磷酸化所抑制。
術語「內部核醣體進入位點」，縮寫為「IRES」，是有關將核醣體招募到mRNA內部區域而以帽獨立的方式啟動轉譯的RNA元件。IRES通常位於RNA病毒的5'-UTR中。然而，雙順反子病毒科病毒的mRNA具有兩個開放閱讀框(ORF)，各開放閱讀框的轉譯均由兩個不同的IRES引導。也有人提出，一些哺乳動物細胞mRNA也具有IRES。這些細胞IRES元件被認為是位於真核mRNA中，編碼參與壓力存活和其他對存活至關重要的過程的基因。IRES元件的位置通常位於5'-UTR，但也可能出現在mRNA中的其他位置。
術語「內部核醣體進入位點」包括存在於小核醣核酸病毒科(諸如脊髓灰白質炎病毒(PV)與腦心肌炎病毒)與病原性病毒(包括人類免疫缺乏病毒、C型肝炎病毒(HCV)與口蹄疫病毒)中的IRES。儘管這些病毒IRES含有多樣的序列，但其中許多具有相似的二級結構，並透過相似機制起始轉譯。此外，IRES的活性通常需要其他因子(稱為IRES異側作用因子(ITAF))的幫助。基於轉譯起始因子(IF)和ITAF的結構和要求，病毒IRES被分為如本文所述的四種類型。這些IRES類型中的任何一者都是可用的，其中特別偏好第IV型IRES。
兩群病毒IRES (第I型和第II型)無法直接結合至40S小核醣體次單元。相反，它們透過不同的ITAF招募40S小核醣體次單元，並在帽依賴性轉譯中需要經典IF (即eIF2、eIF3、eIF4A、eIF4B和eIF4G)。第I型和第II型IRES的主要差異在於需要40S核醣體掃描，而第II型IRES不需要40S核醣體掃描。第I型IRES的實例包括在脊髓灰白質炎病毒(PV)和鼻病毒中發現的IRES。第Ⅱ型IRES的實例包括在腦心肌炎病毒(EMCV)、口蹄疫病毒(FMDV)和泰勒氏鼠類腦脊髓炎病毒(TMEV)中發現的IRES。
第III型IRES可以直接與具有特化RNA結構的40S小核醣體次單元交互作用，但其活性通常需要包括eIF2和eIF3在內的多種IF以及起始子Met-tRNAi協助。實例包括C型肝炎病毒(HCV)、典型豬瘟病毒(CSFV)和豬鐵士古病毒(PTV)中發現的IRES。
第IV型病毒IRES通常具有很強的活性，可以從非AUG起始密碼子處起始轉譯而無需額外ITAF，甚至不需要eIF2/Met-tRNAi/GTP三元複合體。這些IRES折疊成緻密的結構，直接與40S小核醣體次單元交互作用。實例包括在雙順反子病毒(諸如蟋蟀麻痺病毒(CrPV)、珀椿(plautia stali)腸道病毒(PSIV)和套拉症候群病毒(TSV))中發現的IRES。
術語「內部核醣體進入位點」還包括在細胞mRNA中發現的IRES，其中許多編碼壓力反應(例如在細胞凋亡、有絲分裂、缺氧和營養有限的條件下)所需的蛋白質。基於核醣體招募機制，細胞IRES可大致分為兩類：第I型IRES透過結合在順式元件上的ITAF與核醣體交互作用，例如RNA結合模體和N-6-甲基腺苷(m6A)修飾，而第II型 IRES包含一個短順式元件，其與18S rRNA配對以招募核醣體。 非編碼 RNA 序列
在一個實施例中，功能性核苷酸序列可以包含本身具有一些生物活性的非編碼序列，諸如miRNA或前-miRNA序列，或核酶序列，或反義序列，並且可用於治療或預防疾病或病症。
功能性核苷酸序列可以編碼/包含至少一個miRNA序列，當miRNA序列存在於細胞中時能夠從RNA分子被切下，並且能夠調節細胞中的基因表現。本文所述的RNA分子包含(視情況編碼)至少一個非編碼RNA序列，該非編碼RNA序列當存在於細胞中時能夠從第二可複製RNA分子被切下，並且能夠調節細胞中的基因表現。較佳地細胞為真核細胞，較佳地為哺乳動物細胞，較佳地為人類細胞。其中存在切除的第二RNA的細胞通常必須能夠從第二RNA分子切除miRNA序列，例如它必須具有所需的酶，諸如Drosha和Dicer。細胞可以內源地(即天然地)表現所需的因子(通常是酶)，或者可能已被修飾以表現所需的因子(通常是酶) (從第二RNA分子切除非編碼RNA序列，較佳地是miRNA序列所需)。這些因子(通常是酶)可能能夠從第二RNA分子切除含有miRNA序列的序列，並且可以視需要進一步加工該序列以提供功能性miRNA序列。
能夠從細胞內部的第二RNA分子被切除的miRNA通常在miRNA上游及/或下游側接有側翼序列。這些側翼序列充當或包含用於從第二RNA分子切除miRNA的辨識序列。因此，如上所述的因子或酶可能會靶向側翼序列中的辨識序列以便從第二RNA分子切除miRNA。
在一個實施例中，至少一個miRNA序列上游及/或下游的側翼序列是天然存在的側翼序列的側翼序列，例如側接天然存在的miRNA的序列(諸如來自鼠類miR-155)。在miRNA是天然存在的miRNA的情況下，側翼序列可以是在自然界中也側接miRNA序列的側翼序列，或者它們可以是在自然界中不側接miRNA的側翼序列，諸如側接其他miRNA序列的側翼序列。側翼序列可以來自與miRNA序列相同或不同的生物體。
在一個實施例中，至少一個miRNA序列上游及/或下游的側翼序列是人工側翼序列。
術語「能夠調節基因表現」表示miRNA影響某種基因產物(諸如基因編碼的蛋白質)的表現量，從而調節蛋白質的含量。調節可以是完全停止基因表現，也稱為默化基因或表現減弱(這意味著更少的基因被表現)，或增強表現。較佳地，透過靶向mRNA以阻止其轉譯來進行調節。
miRNA的目標沒有特別受到限制。較佳地，目標對於疾病或病症的發作或進展特別感興趣，且其調節有助於治療或預防該疾病或病症。該目標也可能與誘導多能性相關。
術語「靶向」是指miRNA結合到至少部分互補的序列(較佳地mRNA的序列)，並調節mRNA的表現。
miRNA序列的來源可以是天然的或人工的。天然miRNA序列較佳地源自於要引入RNA分子的相同生物體。例如，當預見要將本文所述的系統引入人類細胞時，miRNA較佳地是人類來源的。
人工前-miRNA序列還可以包含天然存在的成熟miRNA序列。在這個實施例中，例如天然存在的成熟miRNA的序列包含在人工前-miRNA中，其中側翼序列和環序列不是與此成熟miRNA天然締合的序列。
miRNA序列也可以被設計為與特定感興趣的mRNA (即目標mRNA)至少部分互補，例如能夠結合該特定感興趣的mRNA。因此，第二RNA分子可包含與(例如目標)感興趣的mRNA至少部分互補的miRNA序列，視情況進一步包含如本文所述的側翼序列。
術語「成熟miRNA」或「功能性miRNA」在本件申請案中可互換使用。它們是指約22個核苷酸的miRNA，其能夠透過與蛋白質一起結合至其目標(例如目標mRNA)來直接調節基因表現。
在一些實施例中，第二RNA分子上所包含的miRNA序列的長度可能是10-200個核苷酸，視情況長度為10-100、10-90、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、10-30、20-100、20-90、20-80、20-70、20-60、20-50、20-40或20-30個核苷酸，視情況長度為10-50個核苷酸，較佳地長度為10-30個核苷酸。
在其他實施例中，非編碼RBA是核酶或反義序列。核酶序列是本領域已知的；參見例如Deng et al., 2023, Nucleic Acids Research, 51:D1, D262-D268。 製備 RNA 的方法
本文所述的核酸分子(特別是RNA分子)可藉由活體外轉錄獲得。活體外轉錄的RNA (IVT-RNA)尤其令人感到興趣。IVT-RNA可透過從核酸分子(特別是DNA分子)轉錄獲得。本文所述的DNA分子適於這樣的目的，特別是如果包含可以被DNA依賴性RNA聚合酶辨識的啟動子的話。
可以在活體外合成本文所述的RNA。這允許向活體外轉錄反應添加帽類似物。通常聚(A)尾由DNA模板上的聚-(dT)序列編碼。或者，加帽和聚(A)尾添加可以在轉錄後以酶促的方式達到。
活體外轉錄方法是習於技藝者熟知的。例如，如WO 2011/015347 A1中所提到的，多種活體外轉錄套組是可商購的。 DNA
本文也提供包含編碼本文所述的第一及/或第二RNA分子的核酸序列的DNA。
較佳地，DNA是雙股的。
在一個較佳實施例中，DNA是質體。如本文所用，術語「質體」通常是有關染色體外遺傳物質的構建體，通常是環狀DNA雙股螺旋，其可以獨立於染色體DNA進行複製。
DNA可能包含可以被DNA依賴性RNA聚合酶辨識的啟動子。這允許所編碼的RNA (例如本文所述的RNA)在活體內或活體外轉錄。IVT載體可能以標準化的方式用作為活體外轉錄的模板。偏好的啟動子實例為SP6、T3或T7聚合酶的啟動子。
在一個實施例中，DNA是經分離的核酸分子。 包含核酸分子及其他組分的組合物
本文所述的核酸分子和系統可能呈組合物或兩種不同組合物的形式存在，並且其中組合物可能包含其他組分。以下實施例是有關其中例如僅存在核酸分子(較佳地RNA分子)中之一者的組合物。
在一個實施例中，組合物可進一步包含溶劑，諸如水性溶劑或任何能夠保有RNA完整性的溶劑。在一個較佳實施例中，組合物是包含RNA的水溶液。水溶液可能視情況包含溶質，例如鹽。
在一個實施例中，組合物是呈冷凍乾燥組合物或至少兩種冷凍乾燥組合物的形式。冷凍乾燥的組合物可透過冷凍乾燥各別水性組合物而獲得。
在一些實施例中，如本文所述的組合物可進一步包含能夠與核酸(例如RNA分子)形成顆粒的試劑。
本文所述的組合物可額外包含鹽、緩衝劑或其他如下文進一步描述的組分。
在一些實施例中，用於本文所述組合物中的鹽包含氯化鈉。在不希望受理論囿限的情況下，氯化鈉在與脂質混合之前用作預處理RNA的離子滲透壓劑。在一些實施例中，本文所述的組合物可能包含替代性有機或無機鹽。替代鹽包括但不限於氯化鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、乙酸鉀、碳酸氫鉀、硫酸鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、乙酸鈉、碳酸氫鈉、硫酸鈉、氯化鋰、氯化鎂、磷酸鎂、氯化鈣，和乙二胺四乙酸(EDTA)的鈉鹽。
一般而言，用於儲存RNA顆粒(諸如用於冷凍RNA顆粒)的組合物包含低濃度氯化鈉，或包含低離子強度。在一些實施例中，氯化鈉的濃度為0 mM至約50 mM、0 mM至約40 mM，或約10 mM至約50 mM。
根據本發明，本文所述的組合物具有適合RNA顆粒穩定性且特別是適合RNA穩定性的pH。在不希望受理論囿限的情況下，緩衝系統的使用在組合物的製造、儲存和使用期間維持本文所述的顆粒組合物的pH。在本發明的一些實施例中，緩衝系統可能包含溶劑(特別是水，諸如去離子水，特別是注射用水)和緩衝物質。緩衝物質可能選自2-[4-(2-羥基乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)、2-胺基-2-(羥基甲基)丙烷-1,3-二醇(Tris)、乙酸鹽和組胺酸。偏好的緩衝物質是HEPES。
本文所述的組合物還可以包含低溫保護劑及/或表面活性劑作為穩定劑以避免產品品質顯著損失，特別是在儲存、冷凍、噴霧乾燥及/或冷凍乾燥期間RNA活性顯著損失，例如以減少或防止聚集、顆粒塌陷、RNA降解及/或其他類型的損傷。
在一個實施例中，低溫保護劑是醣類。如本文所用，術語「醣類」是指並涵蓋單醣、雙醣、三醣、寡醣和多醣。
在一個實施例中，低溫保護劑是單醣。如本文所用，術語「單醣」是指不能被水解成更簡單的醣類單元的單一醣類單元(例如，簡單的糖)。例示性單醣低溫保護劑包括葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、核糖與類似者。
在一個實施例中，低溫保護劑是雙醣。如本文所用，術語「雙醣」是指由透過糖苷鍵聯(例如透過1-4鍵聯或1-6鍵聯)鍵結在一起的2個單醣單元所形成的化合物或化學實體。雙醣可以被水解成兩個單醣。例示性雙醣低溫保護劑包括蔗糖、海藻糖、乳糖、麥芽糖與類似者。
術語「三糖」表示連接在一起形成一個分子的三個糖。三醣的實例包括棉子糖和松三糖。
在一個實施例中，低溫保護劑是寡醣。如本文所用，術語「寡醣」是指由3至約15個，例如3至約10個單醣單元形成的化合物或化學實體，該等單醣單元透過糖苷鍵聯(例如透過1-4鍵聯或1-6鍵聯)鍵結在一起形成直鏈、分支或環狀結構。例示性寡醣低溫保護劑包括環糊精、棉子糖、松三糖、麥芽三糖、水蘇糖、阿卡波糖與類似者。寡醣可以被氧化或還原。
在一個實施例中，低溫保護劑是環狀寡醣。如本文所用，術語「環狀寡醣」是指由3至約15個，諸如6、7、8、9或10個單醣單元形成的化合物或化學實體，該等單醣單元透過糖苷鍵聯(例如透過1-4鍵聯或1-6鍵聯)鍵結在一起形成環狀結構。例示性環狀寡醣低溫保護劑包括作為離散化合物的環狀寡醣，諸如α環糊精、β環糊精或γ環糊精。
其他例示性環狀寡醣低溫保護劑包括在較大分子結構中包含環糊精部分的化合物，諸如含有環狀寡醣部分的聚合物。環狀寡醣可以被氧化或還原，例如被氧化成二羰基形式。如本文所用，術語「環糊精部分」是指被併入較大分子結構(諸如聚合物)中或其一部分的環糊精(例如α、β或γ環糊精)基團。環糊精部分可以直接或透過視情況存在的連接子鍵結到一或多個其他部分。環糊精部分可以被氧化或還原，例如氧化成二羰基形式。
醣類低溫保護劑(例如環狀寡醣低溫保護劑)可以是衍生的醣類。例如，在一個實施例中，低溫保護劑是衍生的環狀寡醣，例如衍生的環糊精，例如2-羥基丙基-β-環糊精，例如部分醚化的環糊精(例如部分醚化的β環糊精)。
例示性低溫保護劑是多醣。如本文所用，術語「多醣」是指由至少16個單醣單元形成的化合物或化學實體，該等單醣單元透過糖苷鍵聯(例如透過1-4鍵聯或1-6鍵聯)鍵結在一起形成直鏈、分支或環狀結構，並且包括包含多醣作為其骨架結構一部分的聚合物。在骨架中，多醣可以是直鏈的或環狀的。例示性多醣低溫保護劑包括肝醣、澱粉酶、纖維素、葡聚醣、麥芽糊精與類似者。
在一些實施例中，組合物可包含蔗糖。在不希望受理論囿限的情況下，蔗糖發揮促進低溫保護的作用，從而防止RNA (尤其是rRNA)顆粒聚集並維持組合物的化學和物理穩定性。在一些實施例中，組合物可包含蔗糖的替代低溫保護劑。替代穩定劑包括但不限於海藻糖和葡萄糖。在一個具體實施例中，蔗糖的替代穩定劑是海藻糖或蔗糖和海藻糖的混合物。
偏好的低溫保護劑選自由蔗糖、海藻糖、葡萄糖及其組合組成之群，諸如蔗糖和海藻糖的組合。在一個較佳實施例中，低溫保護劑是蔗糖。
本發明的一些實施例考慮了在本文所述組合物中使用螯合劑。螯合劑是指能夠與金屬離子形成至少兩個配位共價鍵，從而產生穩定的水溶性錯合物的化合物。在不希望受理論囿限的情況下，螯合劑降低游離二價離子的濃度，否則在本發明中這可能會誘導RNA降解加速。合適螯合劑的實例包括但不限於乙二胺四乙酸(EDTA)、EDTA之鹽、去鐵胺B、去鐵胺、二乙基二硫胺基甲酸鈉(dithiocarb sodium)、青黴胺、噴替酸鈣、噴替酸的鈉鹽、二硫基丁二酸(succimer)、曲恩汀(trientine)、氮基三乙酸、反式-二胺基環己烷四乙酸(DCTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)，和雙(胺基乙基)乙二醇醚-N,N,N',N'-四乙酸。在一些實施例中，螯合劑是EDTA或EDTA的鹽。在一個例示性實施例中，螯合劑是二水合EDTA二鈉。在一些實施例中，EDTA的濃度為約0.05 mM至約5 mM、約0.1 mM至約2.5 mM，或約0.25 mM至約1 mM。
在一個替代實施例中，本文所述的組合物不含螯合劑。
如本文所用，諸如「穩定性」或「期望的儲存穩定性」的術語可能指產品(例如Tris/蔗糖成品)在未開封的解凍小瓶中於30℃下歷時至多24小時，以及在注射器中於2-8℃下歷時至多24小時與30℃下歷時至多12小時的物理化學穩定性。這些術語可能是指產品在-90至-60℃下儲存時的保存期限為6個月或更長。
在一些實施例中，組合物可能包含一或多種佐劑。可以將佐劑添加至疫苗中來刺激免疫系統的反應；佐劑本身通常不提供免疫性。例示性佐劑包括但不限於以下：無機化合物(例如明礬、氫氧化鋁、磷酸鋁、羥磷灰石)；礦物油(例如石蠟油)、細胞激素(例如IL-1、IL-2、IL-12)；免疫刺激性多核苷酸(例如RNA或DNA；例如含有CpG的寡核苷酸)；皂素(例如來自石鹼木屬、大豆、美遠志的植物皂素)；油乳液或脂質體；聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯配製物；聚磷腈(PCPP)；胞壁醯肽；咪唑并喹喏酮化合物；縮胺硫脲化合物；Flt3配體(WO 2010/066418 A1)；或習於技藝者熟知的任何其他佐劑。用於投予RNA的偏好佐劑是Flt3配體(WO 2010/066418 A1)。當Flt3配體與編碼某一個抗原的RNA一起投予時，可以觀察到抗原特異性CD8+ T細胞強烈增加。
組合物可以被緩衝(例如，用乙酸鹽緩衝劑、檸檬酸鹽緩衝劑、丁二酸鹽緩衝劑、Tris緩衝劑、磷酸鹽緩衝劑)。 含有 RNA 的顆粒
在一些實施例中，由於未受保護的RNA的不穩定性，以複合或囊封形式提供本文所述的RNA分子是有利的。本文提供了相應的組合物。具體地，在一些實施例中，組合物包含含有核酸的顆粒，較佳地含有RNA的顆粒。含核酸顆粒可能是例如呈蛋白質顆粒的形式或呈含脂質顆粒的形式。合適蛋白質或脂質被稱為顆粒形成劑。先前已描述過蛋白質顆粒和含脂質顆粒適於以顆粒形式遞送α病毒RNA (例如Strauss & Strauss, 1994, Microbiol. Rev. 58:491-562)。特別地，α病毒結構蛋白(例如由輔助病毒提供)適於以蛋白質顆粒形式遞送RNA的合適載體。該系統可能包含有包含第一RNA分子的第一組合物，以及包含第二RNA分子的第二組合物，與視情況選用的包含任何其他RNA分子(例如第三RNA分子)的一或多個其他組合物。該系統可能包含組合物，該組合物包含第一RNA分子和第二RNA分子，以及視情況選用的任何其他RNA分子(例如第三RNA分子)。該系統可能包含組合物，該組合物包含有包含第一RNA分子的顆粒和包含第二RNA分子的顆粒。該系統可能包含有包含顆粒的組合物，該等顆粒包含第一RNA分子和第二RNA分子的混合物。
在一個實施例中，組合物包含呈奈米顆粒形式的本文所述的核酸分子。奈米顆粒配製物可以透過各種方案並使用各種複合化合物來獲得。脂質、聚合物、寡聚物或兩親分子是奈米顆粒配製物的典型組分。
如本文所用，術語「奈米顆粒」是指具有使得顆粒適於全身性(特別是非經腸)投予的直徑的(尤其是核酸的)任何顆粒，通常直徑為1000奈米(nm)或更小。在一個實施例中，奈米顆粒的平均直徑在約50 nm至約1000 nm，較佳地約50 nm至約400 nm，較佳地約100 nm至約300 nm，諸如約150 nm至約200 nm範圍內。在一個實施例中，奈米顆粒的直徑在約200至約700 nm、約200至約600 nm，較佳地約250至約550 nm，特別是約300至約500 nm或約200至約400 nm範圍內。在一個實施例中，平均直徑在約50至150 nm，較佳地約60至120nm之間。在一個實施例中，平均直徑小於50 nm。
在一個實施例中，如藉由動態光散射測量的本文所述奈米顆粒的多分散性指數(PI)為0.5或更小，較佳地0.4或更小或甚至更佳地0.3或更小。「多分散性指數」(PI)是顆粒混合物中個別顆粒(諸如脂質體)的均勻或非均勻尺寸分布的測量值，並指示混合物中顆粒分布的寬度。PI可以例如如WO 2013/143555 A1中所述來測定。
如本文所用，術語「奈米顆粒配製物」或「奈米顆粒系統」或類似術語是指含有至少一種奈米顆粒的任何系統，特別是組合物。在一些實施例中，奈米顆粒系統是奈米顆粒的均勻集合。在一些實施例中，奈米顆粒系統是含脂質系統，諸如脂質體配製物或乳液。 含脂質組合物
在一個實施例中，組合物包含至少一種脂質。較佳地，至少一種脂質是陽離子脂質。該含脂質組合物包含本文所述的一或多種核酸分子。在一個實施例中，組合物包含囊封在囊泡中(例如脂質體中)的RNA。在一個實施例中，組合物包含呈乳液形式的RNA。在一個實施例中，組合物包含與陽離子化合物形成複合物的RNA，從而形成例如所謂的脂質複合物。RNA囊封在囊泡(例如脂質體)中不同於脂質/RNA複合物。例如，當RNA與預先形成的脂質體混合時，可獲得脂質/RNA複合物。
在一個實施例中，組合物包含囊封在囊泡中的RNA。此類配製物是本文的特定組合物。囊泡是捲成球形殼的脂質雙層，包圍一個小空間並將該空間與囊泡外部的空間分開。通常，囊泡內部的空間是水性空間(即包含水)。通常囊泡外部的空間是水性空間(即包含水)。脂質雙層由一或多種脂質(囊泡形成脂質)形成。包圍囊泡的膜是層狀相，類似於質膜。囊泡可能是多層囊泡、單層囊泡，或其混合物。當被囊封在囊泡中時，RNA通常與任何外部介質分離。因此，它以受保護的形式存在，在功能上與天然α病毒中的受保護形式相同。合適的囊泡是顆粒，特別是奈米顆粒，如本文所述。
例如，RNA可能被囊封在脂質體中。在本實施例中，組合物是或包含脂質體配製物。囊封在脂質體內通常可以保護RNA免受RNase消化。脂質體可能包括一些外部RNA(例如在其表面上)，但至少一半的RNA(理想情況下是全部)被囊封在脂質體的核心內。
脂質體是通常具有一個或多個形成囊泡的脂質(諸如磷脂)的雙層的顯微脂質囊泡，並且能夠囊封藥物(例如RNA)。可以採用不同種類的脂質體，包括但不限於多層囊泡(MLV)、小單層囊泡(SUV)、大單層囊泡(LUV)、空間穩定脂質體(SSL)、多囊泡(MV)和大多囊泡(LMV)與該領域中已知的其他雙層形式。脂質體的尺寸和層狀取決於製備方式。還有幾種其他形式的超分子組織，其中脂質可能存在於水性介質中，包括層狀相、六方相和反六方相、立方相、微胞、由單層組成的反微胞。這些相也可以透過與DNA或RNA組合來獲得，且與RNA和DNA的交互作用可能會顯著影響相狀態。此類相可能存在於奈米顆粒RNA配製物中。
脂質體可以使用習於技藝者已知的標準方法形成。相應方法包括反向蒸發法、乙醇注射法、脫水-復水法、超音波處理或其他適當的方法。脂質體形成後，可以調整脂質體的尺寸以獲得具有基本上均勻尺寸範圍的脂質體群體。
在一個較佳實施例中，RNA存在於包括至少一種陽離子脂質的脂質體中。相應脂質體可以由單一脂質或脂質混合物形成，前提是使用至少一種陽離子脂質。偏好的陽離子脂質具有能夠被質子化的氮原子；較佳地，此類陽離子脂質是具有三級胺基團的脂質。特別適合的具有三級胺基團的脂質是1,2-二亞麻油醯基氧基-N,N-二甲基-3-胺基丙烷(DLinDMA)。在一個實施例中，RNA存在於如WO 2012/006378 A1中所述的脂質體配製物中：具有囊封包含RNA的水性核心的脂質雙層的脂質體中，其中該脂質雙層包含pKa在5.0至7.6範圍內的脂質，其較佳地具有三級胺基團。偏好的具有三級胺基團的陽離子脂質包括DLinDMA (pKa 5.8)並且一般描述於WO 2012/031046 A2中。根據WO 2012/031046 A2，包含相應化合物的脂質體特別適於囊封RNA並因此適於脂質體遞送RNA。在一個實施例中，RNA存在於脂質體配製物中，其中脂質體包括至少一種陽離子脂質，其頭基包括至少一個能夠被質子化的氮原子(N)，其中脂質體與RNA的N：P比在1：1和20：1之間。「N：P比」是指陽離子脂質中的氮原子(N)與包含在含脂質顆粒(例如脂質體)中的RNA中的磷酸根原子(P)的莫耳比，如WO 2013/006825 A1所述。N：P比為1：1至20：1之間牽涉到脂質體的淨電荷以及RNA遞送至脊椎動物細胞的效率。
在一個實施例中，RNA存在於脂質體配製物中，該脂質體配製物包含至少一種脂質，該脂質包括聚乙二醇(PEG)部分，其中RNA被囊封在聚乙二醇化的脂質體內，使得PEG部分存在於脂質體的外部，如WO 2012/031043 A1和WO 2013/033563 A1中所述。
在一個實施例中，RNA不存在於包含至少一種包括聚乙二醇(PEG)部分的脂質的脂質體配製物中。
在一個實施例中，RNA存在於脂質體配製物中，其中脂質體的直徑在60-180 nm範圍內，如WO 2012/030901 A1中所述。
在一個實施例中，RNA存在於脂質體配製物中，其中含有RNA的脂質體具有接近零或負值的淨電荷，如WO 2013/143555 A1中所揭示的。
在其他實施例中，組合物包含呈乳液形式的RNA。先前已描述過乳液用於將核酸分子(諸如RNA分子)遞送至細胞。本文偏好的是水包油乳液。相應乳液顆粒包含油核和陽離子脂質。更偏好的是陽離子水包油乳液，其中本文所述的RNA與乳液顆粒複合。乳液顆粒包含油核和陽離子脂質。陽離子脂質可以與帶負電荷的RNA交互作用，從而將RNA錨定到乳液顆粒。在水包油乳液中，乳液顆粒分散在水連續相中。例如，乳液顆粒的平均直徑通常可約為80 nm至180 nm。在一個實施例中，組合物是陽離子水包油乳液，其中乳液顆粒包含油核和陽離子脂質，如WO 2012/006380 A2中所述。RNA可能以包含陽離子脂質的乳液形式存在，其中乳液的N：P比為至少4：1，如WO 2013/006834 A1中所述。RNA可能以陽離子脂質乳液形式存在，如WO 2013/006837 A1中所述。特別地，組合物可能包含與陽離子水包油乳液顆粒複合的RNA，其中油/脂質的比率為至少約8：1 (莫耳：莫耳)。
在其他實施例中，組合物包含呈脂質複合物形式的RNA。術語「脂質複合物」或「RNA脂質複合物」是指脂質和核酸(諸如RNA)的複合物。脂質複合物可以由陽離子(帶正電荷)脂質體和陰離子(帶負電荷)核酸形成。陽離子脂質體還可以包括中性「輔助」脂質。在最簡單的情況下，透過用某種混合方案將核酸與脂質體混合而自發性形成脂質體複合物，然而也可以應用各種其他方案。應理解，帶正電荷的脂質體和帶負電荷的核酸之間的靜電交互作用是脂質複合物形成的驅動力(WO 2013/143555 A1)。在一個實施例中，RNA脂質複合物顆粒的淨電荷接近零或負值。已知RNA和脂質體的電中性或帶負電荷的脂質複合物在全身性投予後會導致脾臟樹突狀細胞(DC)中大量表現RNA，並且與已報導的帶正電荷脂質體和脂質複合物的毒性升高無關(參見WO 2013/143555 A1)。因此，在一個實施例中，組合物包含呈奈米顆粒(較佳地脂質複合物奈米顆粒)形式的RNA，其中(i)奈米顆粒中的正電荷數量不超過奈米顆粒中的負電荷數量，及/或(ii)奈米顆粒具有中性或淨負電荷及/或(iii)奈米顆粒中正電荷與負電荷的電荷比為1.4：1或更少，及/或(iv)奈米顆粒的zeta電位為0或更少。如WO 2013/143555 A1中所述，zeta電位是膠體系統中動電位的一個科學術語。在此，奈米顆粒中的(a)zeta電位和(b)陽離子脂質與RNA的電荷比均可以如WO 2013/143555 A1中所揭示的那樣計算。總之，如WO 2013/143555 A1中所揭示的，偏好的組合物是具有明確粒度的奈米顆粒脂質複合物配製物的組合物，其中顆粒的淨電荷接近零或負值。
在其他實施例中，脂質複合物是根據WO 2019/077053 A1中所揭示的方法獲得。根據WO 2019/077053 A1，可以透過添加脂質體膠體與包含RNA的溶液來獲得脂質複合物。根據WO 2019/077053 A1，脂質體膠體可以透過包含以下之方法獲得：將乙醇中的脂質溶液注射到水相中以產生脂質體膠體，其中脂質溶液中至少一種脂質的濃度對應於至或高於至少一種脂質在乙醇中的平衡溶解度。尤其偏好生產脂質體膠體的方法包含將在乙醇中包含莫耳比為約2：1的DOTMA和DOPE的脂質溶液注射到以約150 rpm的攪拌速度攪拌的水中而產生脂質體膠體，其中脂質溶液中的DOTMA和DOPE的濃度為約330 mM。
在其他實施例中，脂質複合物是根據WO 2020/069632 A1的RNA脂質複合物顆粒，其包含RNA及至少一種陽離子脂質和至少一種額外脂質、濃度為約10 mM或更少的氯化鈉、濃度超過約10 w/v%但少於約15 w/v%的穩定劑，與緩衝劑。較佳地，脂質複合物是包含DOTMA和DOPE的莫耳比為約2：1的RNA脂質複合物顆粒，其中組合物中如WO 2020/069632 A1中所述正電荷與負電荷的比率為約1.3：2.0、濃度為約8.2 mM的氯化鈉、濃度為約13% (w/v)的蔗糖、濃度為約5 mM且pH為約6.7的HEPES，以及濃度為約2.5 mM的EDTA。
在一個實施例中，核酸(諸如本文所述的RNA)是呈脂質奈米顆粒(LNP)的形式。LNP可能包含任何能夠形成顆粒的脂質，一或多種核酸分子附著於該顆粒，或一或多種核酸分子被囊封其中。在本發明中，LNP(脂質奈米顆粒)可能被理解為水包油乳液，其中LNP核心材料較佳地呈液態，因此具有低於體溫的熔點。因而，LNP通常包含嵌入脂質製成的無序非層狀相中的mRNA和脂質的中心複合物。在生理條件下，用於LNP形成的脂質通常不會在水中形成層狀(雙層)相。LNP通常不包含或囊封水性核。LNP通常包含脂質(或油性)核心。
在一個實施例中，LNP包含一或多種陽離子或陽離子可電離脂質，以及一或多種穩定性脂質。穩定性脂質包括中性脂質及聚合物結合型脂質。
在一個實施例中，LNP不包含聚乙二醇化脂質。
在一個實施例中，LNP包含陽離子或陽離子可電離脂質、中性脂質、類固醇、聚合物結合型脂質；和RNA，其囊封在脂質奈米顆粒內或與脂質奈米顆粒締合。
在一個實施例中，LNP包含40至55 mol%、40至50 mol%、41至49 mol%、41至48 mol%、42至48 mol%、43至48 mol%、44至48 mol%、45至48 mol%、46至48 mol%、47至48 mol%，或47.2至47.8 mol%的陽離子或陽離子可電離脂質。在一個實施例中，LNP包含約47.0、47.1、47.2、47.3、47.4、47.5、47.6、47.7、47.8、47.9或48.0 mol%的陽離子或陽離子可電離脂質。
在一個實施例中，中性脂質以5至15 mol%、7至13 mol%，或9至11 mol%範圍的濃度存在。在一個實施例中，中性脂質以約9.5、10或10.5 mol%的濃度存在。
在一個實施例中，類固醇以30至50 mol%、35至45 mol%，或38至43 mol%範圍的濃度存在。在一個實施例中，類固醇以約40、41、42、43、44、45或46 mol%的濃度存在。
在一個實施例中，LNP包含1至10 mol%、1至5 mol%，或1至2.5 mol%的聚合物結合型脂質。
在一個實施例中，LNP包含40至50 mol%的陽離子脂質；5至15 mol%的中性脂質；35至45 mol%的類固醇；1至10 mol%的聚合物結合型脂質；和RNA，其囊封在脂質奈米顆粒內或與脂質奈米顆粒締合。
在一個實施例中，mol%是基於脂質奈米顆粒中存在的脂質總mol來決定。
在一個實施例中，中性脂質選自由DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE、DOPG、DPPG、POPE、DPPE、DMPE、DSPE和SM組成之群。在一個實施例中，中性脂質選自由DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE和SM組成之群。在一個實施例中，中性脂質是DSPC。
在一個實施例中，類固醇是膽固醇。
在一個實施例中，聚合物結合型脂質是聚乙二醇化脂質。在一個實施例中，聚乙二醇化脂質具有以下結構。 或其醫藥上可接受之鹽、互變異構體或立體異構體，其中： R 12和R 13各自獨立地為含有10至30個碳原子的直鏈或分支、飽和或不飽和烷基鏈，其中該烷基鏈視情況被一或多個酯鍵中斷；且w具有範圍為30至60的平均值。在一個實施例中，R 12和R 13各自獨立地為含有12至16個碳原子的直鏈飽和烷基鏈。在一個實施例中，w具有範圍為40至55的平均值。在一個實施例中，平均值w為約45。在一個實施例中，R 12和R 13各自獨立地為含有約14個碳原子的直鏈飽和烷基鏈，且w具有約45的平均值。
在一個實施例中，聚乙二醇化脂質是DMG-PEG 2000，例如具有以下結構：
在一些實施例中，聚合物結合型脂質不是聚乙二醇化脂質。
在一個實施例中，聚合物結合型脂質是結合至選自由以下組成之群的聚合物的脂質：聚乙二醇(PEG)；聚(胺基乙氧基乙氧基乙酸) (pAEEA)、聚肌胺酸(pSar)、聚(2-甲基胺基乙氧基乙氧基乙酸) (pmAEEA)；聚(噁唑啉) (POX)；聚(噁嗪) (POZ)、聚(乙烯基吡咯啶酮) (PVP)；聚( N-(2-羥基丙基)-甲基丙烯醯胺) (pHPMA)；以及聚(去氫丙胺酸) (pDha)。較佳地，聚合物結合型脂質是結合至pAEEA或pSar的脂質。在一些實施例中，聚合物結合型脂質不是結合至PEG的脂質。結合pSar的脂質描述於WO2020/069718中。結合pAEEA的脂質描述於US 63/370,046和US 63/482,893中，且在一個較佳的情況下聚合物pAEEA可包含以下結構： 其中n可包含1至100、5至50、5至25、較佳7至14。
在一些實施例中，LNP的陽離子或陽離子可電離脂質組分具有式(III)的結構： (III) 或其醫藥上可接受之鹽、互變異構體、前藥或立體異構體，其中： L 1或L 2中之一者為–O(C=O)-、-(C=O)O-、-C(=O)-、-O-、-S(O) x-、-S-S-、‑C(=O)S-、SC(=O)-、-NR aC(=O)-、-C(=O)NR a-、NR aC(=O)NR a‑、-OC(=O)NR a-或-NR aC(=O)O-，而L 1或L 2中之另一者為–O(C=O)-、-(C=O)O-、-C(=O)-、-O-、-S(O) x-、-S‑S-、-C(=O)S-、SC(=O)-、-NR aC(=O)-、-C(=O)NR a-、NR aC(=O)NR a‑、-OC(=O)NR a-或-NR aC(=O)O-，或直接鍵結； G 1和G 2各自獨立地為未經取代的C 1-C 12伸烷基或C 1-C 12伸烯基； G 3為C 1-C 24伸烷基、C 1-C 24伸烯基、C 3-C 8伸環烷基、C 3-C 8伸環烯基； R a為H或C 1-C 12烷基； R 1和R 2各自獨立地為C 6-C 24烷基或C 6-C 24烯基； R 3為H、OR 5、CN、‑C(=O)OR 4、‑OC(=O)R 4或-NR 5C(=O)R 4； R 4為C 1-C 12烷基； R 5為H或C 1-C 6烷基；及 x為0、1或2。
在式(III)的一些前述實施例中，脂質具有以下結構(IIIA)或(IIIB)中之一者： 或 (IIIA)                                    (IIIB) 其中： A是3至8員環烷基或伸環烷基環； R 6在每次出現時獨立地為H、OH或C 1-C 24烷基； n為1至15範圍內的整數。
在式(III)的一些前述實施例中，脂質具有結構(IIIA)，而在其他實施例中，脂質具有結構(IIIB)。
在式(III)的其他實施例中，脂質具有以下結構(IIIC)或(IIID)中之一者： 或 (IIIC)                                    (IIID) 其中y和z各自獨立地為1至12範圍內的整數。
在式(III)的任何前述實施例中，L 1或L 2中之一者是‑O(C＝O)。例如在一些實施例中，L 1和L 2中的各者是‑O(C=O)。在任何前述的一些不同實施例中，L 1和L 2各自獨立地為‑(C=O)O或O(C=O)-。例如在一些實施例中，L 1和L 2中的各者是‑(C=O)O。
在式(III)的一些不同實施例中，脂質具有以下結構(IIIE)或(IIIF)中之一者： 或 (IIIE)                                          (IIIF)。
在式(III)的一些前述實施例中，脂質具有以下結構(IIIG)、(IIIH)、(IIII)或(IIIJ)中之一者： ； ； (IIIG)                                          (IIIH) 或 (IIII)                                            (IIIJ)。
在式(III)的一些前述實施例中，n是2至12範圍內的整數，例如2至8或2至4。例如在一些實施例中，n是3、4、5或6。在一些實施例中，n是3。在一些實施例中，n是4。在一些實施例中，n是5。在一些實施例中，n是6。
在式(III)的一些其他前述實施例中，y和z各自獨立地為2至10範圍內的整數。例如在一些實施例中，y和z各自獨立地為4至9或4至6範圍內的整數。
在式(III)的一些前述實施例中，R 6是H。在前述其他實施例中，R 6是C 1-C 24烷基。在其他實施例中，R 6是OH。
在式(III)的一些實施例中，G 3是未經取代的。在其他實施例中，G 3經取代。在各種不同的實施例中，G 3是直鏈C 1-C 24伸烷基或直鏈C 1-C 24伸烯基。
在式(III)的一些其他前述實施例中，R 1或R 2或兩者是C 6-C 24烯基。例如在一些實施例中，R 1和R 2各自獨立地具有以下結構： 其中： R 7a和R 7b在每次出現時獨立地為H或C 1-C 12烷基；和 a是2至12的整數， 其中R 7a、R 7b和a各自選擇以使得R 1和R 2各自獨立地包含6至20個碳原子。例如在一些實施例中，a是5至9或8至12範圍內的整數。
在式(III)的一些前述實施例中，R 7a至少一次出現為H。例如在一些實施例中，R 7a在每次出現為H。在前述的其他不同實施例中，R 7b至少一次出現為C 1-C 8烷基。例如在一些實施例中，C 1-C 8烷基是甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、正己基或正辛基。
在式(III)的不同實施例中，R 1或R 2或兩者具有下列結構中之一者： ； ； ； ； ； ； ； ； ； 。
在式(III)的一些前述實施例中，R 3為OH、CN、‑C(＝O)OR 4、‑OC(＝O)R 4或-NHC(＝O)R 4。在一些實施例中，R 4為甲基或乙基。
在各種不同的實施例中，式(III)的陽離子脂質具有下表中所示結構中之一者。
式(III)的代表性化合物。
編號 結構
III-1
III-2
III-3
III-4
III-5
III-6
III-7
III-8
III-9
III-10
III-11
III-12
III-13
III-14
III-15
III-16
III-17
III-18
III-19
III-20
III-21
III-22
III-23
III-24
III-25
III-26
III-27
III-28
III-29
III-30
III-31
III-32
III-33
III-34
III-35
III-36
在一些實施例中，LNP包含式(III)的脂質、RNA、中性脂質、類固醇和聚乙二醇化脂質。在一些實施例中，式(III)的脂質是化合物III-3。在一些實施例中，中性脂質是DSPC。在一些實施例中，類固醇是膽固醇。在一些實施例中，聚乙二醇化脂質是ALC-0159。
在一些實施例中，陽離子脂質以約40至約50莫耳%的量存在於LNP中。在一個實施例中，中性脂質以約5至約15莫耳%的量存在於LNP中。在一個實施例中，類固醇以約35至約45莫耳%的量存在於LNP中。在一個實施例中，聚乙二醇化脂質以約1至約10莫耳%的量存在於LNP中。
在一些實施例中，LNP包含約40至約50莫耳%之量的化合物III-3、約5至約15莫耳%之量的DSPC、約35至約45莫耳%之量的膽固醇，和約1至約10莫耳%之量的ALC-0159。
在一些實施例中，LNP包含約47.5莫耳%之量的化合物III-3、約10莫耳%之量的DSPC、約40.7莫耳%之量的膽固醇和約1.8莫耳%之量的ALC-0159。
在各種不同的實施例中，陽離子或陽離子可電離脂質具有下表中所示結構中之一者。
編號 結構
A
B
C
D
E
F
在一些實施例中，LNP包含上表中所示的陽離子或陽離子可電離脂質(例如式(B)或式(D)的陽離子或陽離子可電離脂質，特別是式(D)的陽離子脂質)、RNA、中性脂質、類固醇和聚乙二醇化脂質。在一些實施例中，中性脂質是DSPC。在一些實施例中，類固醇是膽固醇。在一些實施例中，聚乙二醇化脂質是DMG-PEG 2000。
在一個實施例中，LNP包含陽離子或陽離子可電離脂質，陽離子可電離脂質是可電離脂質樣材料(類脂質)。在一個實施例中，陽離子或陽離子可電離脂質具有以下結構：
N/P值較佳為至少約4。在一些實施例中，N/P值範圍為4至20、4至12、4至10、4至8，或5至7。在一個實施例中，N/P值為約6。
本文所述的LNP可具有在一個實施例中範圍為約30 nm至約200 nm，或約60 nm至約120 nm的平均直徑。 RNA 靶向
本發明的一些態樣涉及靶向遞送本文揭示的RNA (例如編碼疫苗抗原及/或免疫刺激劑的RNA)。
在一個實施例中，本發明涉及靶向肺臟。如果投予的RNA是編碼疫苗抗原的RNA或與治療肺臟傳染病相關的miRNA，則尤其偏好靶向肺臟。例如，可以透過吸入投予RNA而將RNA遞送至肺臟，該RNA可能被配製為如本文所述的顆粒(例如脂質顆粒)。
在一個實施例中，本發明涉及靶向淋巴系統，特別是次級淋巴器官，更具體地脾臟。如果投予的RNA是編碼疫苗抗原的RNA，則尤其偏好靶向淋巴系統，特別是次級淋巴器官，更具體地脾臟。
在一個實施例中，目標細胞是脾臟細胞。在一個實施例中，目標細胞是抗原呈現細胞，諸如脾臟中的專職抗原呈現細胞。在一個實施例中，目標細胞是脾臟中的樹突狀細胞。
「淋巴系統」是循環系統的一部分，也是免疫系統的重要部分，包含攜帶淋巴的淋巴管網絡。淋巴系統由淋巴器官、淋巴管傳導網絡和循環淋巴組成。初級或中央淋巴器官從未成熟的前驅細胞生成淋巴球。胸腺和骨髓構成初級淋巴器官。次級或周邊淋巴器官(包括淋巴結和脾臟)維持成熟的幼稚淋巴細胞並啟動適應性免疫反應。
RNA可以透過所謂的脂質複合物配製物被遞送至脾臟，其中RNA與包含陽離子脂質和視情況選用的額外脂質或輔助脂質的脂質體結合以形成可注射的奈米顆粒配製物。脂質體可能透過將乙醇中的脂質溶液注射到水或合適的水相中來獲得。RNA脂質複合物顆粒可能透過將脂質體與RNA混合來製備。脾臟靶向性RNA脂質複合物顆粒描述於WO 2013/143683中，其以引用的方式併入本文。已發現具有淨負電荷的RNA脂質複合物顆粒可用於優先靶向脾臟組織或脾臟細胞(諸如抗原呈現細胞，特別是樹突狀細胞)。因此，投予RNA脂質複合物顆粒後，脾臟中發生RNA累積及/或RNA表現。因而本發明的RNA脂質複合物顆粒可用於在脾臟中表現RNA。在一個實施例中，投予RNA脂質複合物顆粒後，肺臟及/或肝臟中沒有或基本上沒有發生RNA累積及/或RNA表現。在一個實施例中，投予RNA脂質複合物顆粒後，抗原呈現細胞(諸如脾臟中的專職抗原呈現細胞)中發生RNA累積及/或RNA表現。是以，本發明的RNA脂質複合物顆粒可用於在此類抗原呈現細胞中表現RNA。在一個實施例中，抗原呈現細胞是樹突狀細胞及/或巨噬細胞。
本發明RNA脂質複合物顆粒的電荷是存在於至少一種陽離子脂質中的電荷與存在於RNA中的電荷之和。電荷比是存在於至少一種陽離子脂質中的正電荷與存在於RNA中的負電荷之比率。存在於至少一種陽離子脂質中的正電荷與存在於RNA中的負電荷的電荷比是透過以下等式計算：電荷比=[(陽離子脂質濃度(mol))*(陽離子脂質中正電荷的總數)]/[(RNA濃度(mol))*(RNA中負電荷的總數)]。
本文所述的脾臟靶向性RNA脂質複合物顆粒在生理pH下較佳地具有淨負電荷，諸如正電荷與負電荷的電荷比為約1.9：2至約1：2，或約1.6：2至約1：2，或約1.6：2至約1.1：2。在具體實施例中，在生理pH下RNA脂質複合物顆粒中的正電荷與負電荷的電荷比為約1.9：2.0、約1.8：2.0、約1.7：2.0、約1.6：2.0、約1.5：2.0、約1.4：2.0、約1.3：2.0、約1.2：2.0、約1.1：2.0，或約1：2.0。
可以透過向個體投予呈配製物之編碼免疫刺激劑的RNA來向個體提供免疫刺激劑，以將RNA優先遞送至肝臟或肝臟組織。偏好將RNA遞送至此類目標器官或組織，特別是如果希望表現大量的免疫刺激劑及/或如果希望或需要免疫刺激劑的全身性存在，特別是大量存在。
RNA遞送組合物對肝臟具有固有的偏好。這涉及基於脂質的顆粒、陽離子和中性奈米顆粒，特別是脂質奈米顆粒(諸如脂質體、奈米微胞和生物結合物中的親脂性配體)。肝臟累積是由肝脈管系統或脂質代謝(脂質體和脂質或膽固醇結合物)的不連續性質引起的。
為了將RNA活體內遞送至肝臟，可以使用藥物遞送系統透過防止RNA降解來將其轉運至肝臟中。例如，由聚(乙二醇) (PEG)塗覆的表面和含有mRNA的核心組成的聚合複合物奈米微胞是可使用的系統，因為奈米微胞在生理條件下提供優異的RNA活體內穩定性。此外，由緻密的PEG柵欄組成的聚合複合物奈米微胞表面提供的隱形特性能有效逃脫出宿主的免疫防禦。
用於靶向肝臟的合適免疫刺激劑的實例是參與T細胞增生及/或維持的細胞激素。合適細胞激素的實例包括IL2或IL7、其片段和變體，以及這些細胞激素、片段和變體的融合蛋白，諸如PK延長型細胞激素。
在另一個實施例中，編碼免疫刺激劑的RNA可能呈配製物投予，用於將RNA優先遞送至淋巴系統，特別是次級淋巴器官，更具體地脾臟。偏好將免疫刺激劑遞送至此類目標組織，特別是如果在這個器官或組織中希望免疫刺激劑存在的話(例如用於誘導免疫反應，特別是在T細胞啟動期間或活化常駐免疫細胞需要諸如細胞激素之免疫刺激劑的情況下)，同時不希望免疫刺激劑的全身性存在，特別是大量存在(例如因為免疫刺激劑具有全身性毒性)。
合適免疫刺激劑的實例是參與T細胞啟動的細胞激素。合適細胞激素的實例包括IL12、IL15、IFN-α或IFN-β、其片段和變體，以及這些細胞激素、片段和變體的融合蛋白，例如PK延長型細胞激素。 基於聚合物的組合物
在一個實施例中，該組合物包含至少一種聚合物，較佳地聚亞烷基亞胺。
在一些實施例中，由RNA和聚合物(較佳地聚亞烷基亞胺)形成的顆粒是基於聚合物的聚合複合物。
鑑於其高度的化學靈活性，聚合物是基於奈米顆粒的遞送的常用材料。通常，陽離子聚合物用於將帶負電荷的核酸靜電壓縮成奈米顆粒。這些帶正電荷的基團通常由胺組成，其在pH範圍5.5至7.5之間改變其質子化狀態，被認為會導致離子不平衡，從而導致內體破裂。諸如聚-L-離胺酸、聚醯胺基胺、魚精蛋白和聚乙烯亞胺的聚合物以及諸如殼聚醣的天然存在的聚合物都已應用於核酸遞送並且適合作為本文的陽離子聚合物。此外，一些研究人員還合成了專門用於核酸遞送的聚合物。特別是聚(β-胺基酯)，由於其易於合成和生物降解性，在核酸遞送中得到廣泛的應用。此類合成聚合物也適合作為本文的陽離子聚合物。
如本文所用，「聚合物」具有其普通意義，即包含透過共價鍵連接的一或多個重複單元(單體)的分子結構。重複單元可以全部相同，或者在一些情況下聚合物內部可以有超過一種類型的重複單元。在一些情況下，聚合物是生物衍生的，即生物聚合物(諸如蛋白質)。在一些情況下，聚合物中還可以存在額外部分，例如靶向部分。
如果聚合物內存在超過一種類型的重複單元，則該聚合物被稱為「共聚物」。應理解，本文所採用的聚合物可以是共聚物。形成共聚物的重複單元可以按任何方式排列。例如，重複單元可以按無規順序、按交替順序，或以「嵌段」共聚物排列，「嵌段」共聚物即包含一或多個各自包含第一重複單元(例如第一嵌段)的區域以及一或多個各自包含第二重複單元(例如第二嵌段)等的區域。嵌段共聚物可以具有兩種(二嵌段共聚物)、三種(三嵌段共聚物)，或更多數量的不同嵌段。
在某些實施例中，聚合物是生物相容的。生物相容性聚合物是一種在適當濃度下通常不會導致顯著細胞死亡的聚合物。在某些實施例中，生物相容性聚合物是可生物降解的，即聚合物能夠在生理環境內(諸如在體內)以化學及/或生物方式降解。
在某些實施例中，聚合物可能是魚精蛋白或聚亞烷基亞胺。
術語「魚精蛋白」是指任何各種分子量相對較低的強鹼性蛋白，其富含精胺酸並且被發現在各種動物(如魚)的精子細胞中代替體細胞組蛋白與DNA締合。具體地，術語「魚精蛋白」是指在魚精子中發現的蛋白質，其為強鹼性、可溶於水、不因熱凝集，並且在水解時主要產生精胺酸。它們以經純化形式用於長效胰島素配製物中並用於中和肝素的抗凝血作用。
根據本發明，如本文所用的術語「魚精蛋白」表示包含從天然或生物來源獲得或衍生而來的任何魚精蛋白胺基酸序列，包括其片段和該胺基酸序列或其片段的多聚體形式，以及人工且專門為特定目的設計且不能從天然或生物來源中分離的(合成)多肽。
在一個實施例中，聚亞烷基亞胺包括聚乙烯亞胺及/或聚丙烯亞胺，較佳地聚乙烯亞胺。偏好的聚亞烷基亞胺是聚乙烯亞胺(PEI)。PEI的平均分子量較佳為0.75·10 2至10 7Da，較佳地1000至10 5Da，更佳地10000至40000 Da，更佳地15000至30000 Da，甚至更佳地20000至25000 Da。
根據本發明偏好的是直鏈聚亞烷基亞胺，例如直鏈聚乙烯亞胺(PEI)。
考慮用於本文的陽離子聚合物(包括聚陽離子聚合物)包括能夠靜電結合核酸的任何陽離子聚合物。在一個實施例中，考慮用於本文的陽離子聚合物包括核酸可與之締合的任何陽離子聚合物，例如藉由與核酸形成複合物或形成核酸封閉或囊封其中的囊泡。
本文所述的顆粒還可能包含陽離子聚合物以外的聚合物，即非陽離子聚合物及/或陰離子聚合物。陰離子聚合物與中性聚合物在本文中統稱為非陽離子聚合物。
在一個實施例中，組合物包含聚亞烷基亞胺，並且例如聚亞烷基亞胺中的氮原子(N)數目與RNA分子中的磷原子(P)數目的莫耳比(N：P比)可以是2.0至15.0，較佳地6.0至12.0及/或組合物的離子強度可以是50 mM或更少，較佳地其中單價陽離子的濃度可以是25 mM或更少，且二價陽離子的濃度可以是20 μM或更少。
在一個實施例中，形成的顆粒可以是聚合複合物。
在一個實施例中，聚亞烷基亞胺可包含以下通式(I)： ， 其中 R為H、醯基或包含以下通式(II)的基團： 其中R 1為H或包含以下通式(III)的基團： n、m和l獨立地選自2至10的整數；且 p、q和r是整數，其中p、q和r的總和使得聚合物的平均分子量為1.5·10 2至10 7Da，較佳地5000至10 5Da，更佳地10000至40000 Da，更佳地15000至30000 Da，甚至更佳地20000至25000 Da。在一個實施例中，n、m和l可以獨立地選自2、3、4和5，較佳地選自2和3及/或R 1可以是H。在一個實施例中，R可以是H或醯基基團。
在一個實施例中，聚亞烷基亞胺可以包括聚乙烯亞胺及/或聚丙烯亞胺，較佳地聚乙烯亞胺。在一個實施例中，聚亞烷基亞胺中至少92%的N原子可以是可質子化的。 醫藥組合物
除了本文所述的一或多種核酸分子以外，本文所述的組合物還可能包含醫藥上可接受的稀釋劑及/或醫藥上可接受的賦形劑及/或醫藥上可接受的載劑及/或醫藥上可接受的媒劑(「藥物組合物」)。醫藥上可接受的載劑、媒劑、賦形劑或稀釋劑的挑選沒有特別限制。可以使用本領域已知的任何適當醫藥上可接受的載劑、媒劑、賦形劑或稀釋劑。
在一個實施例中，醫藥組合物可進一步包含上述與組合物相關的任何其他組分。在一個實施例中，醫藥組合物可進一步包含溶劑，諸如水性溶劑或任何能夠保持RNA完整性的溶劑。在一個較佳實施例中，醫藥組合物是包含RNA的水溶液。水溶液可以視情況包含溶質，例如鹽。
在一個實施例中，醫藥組合物是呈冷凍乾燥組合物的形式。冷凍乾燥組合物可透過冷凍乾燥相應的水性組合物而獲得。
在一些實施例中，醫藥組合物用於製造供治療或預防疾病，較佳地供如本文所述的治療方法的藥劑。 套組
本文也提供了包含至少兩種核酸分子(較佳地本文所述的RNA分子)的套組。
在一個實施例中，套組的組分以不同的實體存在。例如，套組的一個組分可能以一個實體存在，而套組的另一個組分可能以不同的實體存在。例如，開放或密閉的容器是合適的實體。密閉容器是較佳的。所使用的容器較佳地應不含RNAse或基本上不含RNAse。
在一個實施例中，套組包含用於接種細胞及/或用於投予給人類或動物個體的RNA。
套件視情況包含標籤或其他形式的資訊元件，例如電子資料載具。標籤或資訊元件較佳地包含說明書，例如列印的書面說明書或視情況可列印的電子形式說明書。說明書可能涉及套組的至少一種合適的可能用途。 藥劑
考慮到投予給個體的能力，本文所述的各個核酸分子(較佳地RNA分子)、本文所述的組合物、本文所述的醫藥組合物或本文所述的套組可能被稱為「藥劑」、「醫學製劑」或類似物。提供第一核酸(RNA)分子、第二核酸(RNA)分子、組合物、套組或醫藥組合物作為藥劑。藥劑可用於治療個體。「治療」表示向個體投予如本文所述的化合物或組合物或其他實體。該術語包括藉由療法來治療人類或動物身體的方法。
上述藥劑通常不包含DNA，因而相比於先前技術(例如WO 2008/119827 A1)中所述基於DNA的藥劑(例如疫苗)具有額外的安全性特徵。
可以將藥劑投予給有需要的個體。藥劑可用於治療個體的預防方法以及治療方法中。
藥劑以有效量投予。「有效量」涉及單獨或與其他劑量一起足以達到反應或期望效應之量。在治療個體的某種疾病或某種病況的情況下，期望效應是抑制疾病進程。這包括減緩疾病的進程，特別是中斷疾病進程。治療疾病或病況時的期望效應也可能是延遲疾病發作或抑制疾病發作。
有效量將取決於待治療的病況、疾病的嚴重程度、患者的個別參數(包括年齡、生理狀況、體型和體重)、治療持續時間、伴隨治療的類型(如果有的話)、具體投藥模式和其他因素。 治療方法
在一個實施例中，用於在個體中治療或預防細菌、病毒、寄生蟲或真菌感染的方法，該方法包含向個體投予如本文所述的醫藥組合物。
在一個實施例中，用於在個體中治療或預防癌症的方法，該方法包含向個體投予如本文所述的醫藥組合物。
在一個實施例中，本文所述的治療方法是疫苗接種，特別是針對傳染病(諸如由細菌、病毒、真菌或寄生蟲引起的傳染病)或癌症。
本文也描述如本文所述用於以下的第一核酸分子(較佳地第一RNA分子)和第二核酸分子(較佳地第二RNA分子)：在個體中(i)治療或預防細菌、病毒、寄生蟲或真菌感染的方法、(ii)治療或預防癌症的方法，或(ii)疫苗接種，特別是針對傳染病(諸如由細菌、病毒、真菌或寄生蟲引起的傳染病)或癌症；該方法包含向該個體投予第一和第二分子核酸分子。例如，第一核酸分子是編碼本文所述之經修飾聚合酶的mRNA，而第二核酸分子是編碼可用於治療或預防疾病或病症的感興趣蛋白的可複製RNA (複製子)。本文也描述如本文所述的第一核酸分子，其用於如本文所述在個體中進行治療的方法，該方法包含向個體投予第一核酸分子，其中該個體也被投予或已被投予如本文所述的第二核酸分子。本文也描述如本文所述的第二核酸分子，其用於如本文所述在個體中進行治療的方法，該方法包含向個體投予第二核酸分子，其中該個體也被投予或已被投予如本文所述的第一核酸分子。
術語「免疫」或「疫苗接種」通常是指出於治療或防治原因而治療個體的一個過程。治療(特別是防治性治療)較佳地是或包括旨在誘導或增強個體(例如針對一或多種抗原)的免疫反應的治療。如果需要透過使用核酸(特別是本文所述的RNA分子)來誘導或增強免疫反應，則可以透過RNA觸發或增強免疫反應。在一個實施例中，提供了一種防治性治療，其較佳地是或包含對個體進行疫苗接種。其中第二RNA分子(複製子)編碼作為免疫活性化合物或抗原的醫藥活性肽或蛋白質的實施例對於疫苗接種特別有用。
RNA先前已被描述用於針對包括病原體的外來因子或癌症的疫苗接種(最近由Ulmer et al., 2012, Vaccine 30:4414-4418綜述)。與先前技術中的常見方法相反，本文所述的RNA分子特別適合有效治療或預防，特別是疫苗接種，因為複製子能夠被本文所述的經修飾功能性α病毒非結構蛋白複製。治療或預防(特別是疫苗接種)可以用於例如誘導針對弱免疫原性蛋白質的免疫反應。在基於RNA的疫苗的情況下，蛋白質抗原永遠不會暴露於血清抗體，而是在RNA轉譯後由經轉染細胞本身產生。因此，過敏反應不應該是個問題，從而允許患者重複免疫而沒有過敏反應的風險。
在涉及治療或預防(特別是疫苗接種)的方法中，將本文所述的藥劑投予給個體，特別是如果希望治療患有涉及抗原的疾病或處於涉及抗原的疾病的風險下的個體時。
在涉及治療或預防的方法中，由本文所述的第二RNA分子(及/或第一RNA分子)編碼的感興趣蛋白編碼例如有益於治療或預防細菌感染、病毒感染、真菌感染或癌症的肽，以及視情況免疫反應被引導為針對其的細菌抗原，或免疫反應被引導為針對其的病毒抗原，或免疫反應被引導為針對其的癌症抗原，或免疫反應被引導為針對其的單細胞生物體抗原。治療(特別是疫苗接種)的功效可以透過已知的標準方法來評估，諸如透過測量生物體的抗原特異性IgG抗體。在涉及過敏原特異性免疫治療的方法中，由本文所述的第二RNA分子編碼的感興趣蛋白編碼與過敏相關的抗原。過敏原特異性免疫療法(也稱為低敏化)被定義為向患有一或多種過敏的生物體投予較佳地劑量遞增的過敏原疫苗，以達到與隨後暴露於致病性過敏原相關的症狀得以緩解的一種狀態。過敏原特異性免疫療法的功效可以透過已知的標準方法來評估，諸如透過測量生物體的過敏原特異性IgG和IgE抗體。
本文所述的藥劑可以被投予給個體，例如用於個體的治療，包括個體的疫苗接種。
術語「個體」是有關脊椎動物，特別是哺乳動物。例如，哺乳動物是人類、非人類靈長類動物、豢養哺乳動物(諸如狗、貓、綿羊、牛、山羊、豬、馬等)、實驗動物(諸如小鼠、大鼠、兔、天竺鼠等)，以及圈養的動物(諸如動物園的動物)。術語「個體」也有關非哺乳動物脊椎動物，諸如鳥類(特別是豢養鳥類，諸如雞、鴨、鵝、火雞)和魚類(特別是養殖魚，例如鮭魚或鯰魚)。如本文所用，術語「動物」也包括人類。個體較佳為人類，視情況為人類患者。
在一些實施例中，偏好對豢養動物(諸如狗、貓、兔、天竺鼠、倉鼠、綿羊、牛、山羊、豬、馬、雞、鴨、鵝、火雞)或野生動物(例如狐)進行投予。例如，防治性疫苗接種可能適於對例如農業中的動物群體或野生動物群體進行疫苗接種。其他圈養動物群體(諸如寵物或動物園的動物)可能進行接種疫苗。
在一個實施例中，可以投予藥劑超過一次。可以投予多個劑量，使得可以按照不同的時間間隔投予單個劑量。例如，可以在已經投予前一劑後14至35天投予一劑。在一個實施例中，在前一劑後21天投予一劑。在一個實施例中，在前一劑後35天投予一劑。
在一個實施例中，當投予給個體時，用作為藥劑的組合物較佳地不包含來自對待治療個體所屬的種或屬具有感染性的病毒類型(例如α病毒)的序列。較佳地，在這種情況下，複製子不包含可感染相應種或屬的α病毒的任何核苷酸序列。這個實施例具有以下優點：即使投予RNA的個體(例如意外地)受到傳染性α病毒的影響，也不可能與傳染性(例如全功能或野生型)α病毒重組。作為說明性實例，有關豬隻的治療，所使用的組合物不包含可感染豬的α病毒的任何核苷酸序列。 投藥模式
醫藥組合物(特別是藥劑)可以按任何適當路徑被投予給個體。
例如，藥劑可以全身性投予，例如靜脈內(i.v.)、肌肉內(i.m.)、皮下(s.c.)、皮內(i.d.)或透過吸入。
在一個實施例中，將組合物(特別是藥劑)投予至肌肉組織(諸如骨骼肌)，或皮膚(例如皮下)。一般認為RNA轉移到皮膚或肌肉中會導致高且持續的局部表現，同時強烈誘導體液和細胞免疫反應(Johansson et al., 2012, PLoS. One. 7:e29732；Geall et al., 2012, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 109:14604-14609)。
向肌肉組織或皮膚投藥的替代方案包括但不限於：皮內、鼻內、眼內、腹膜內、靜脈內、間質、經頰、經皮或舌下投藥。皮內和肌肉內投藥是兩種偏好的路徑。
可以透過多種方式實現投藥。在一個實施例中，本文所述的組合物(特別是藥劑)是透過注射投藥。在一個較佳實施例中，注射是經由針頭進行的。無針注射可用作為替代方案。
透過圖式和實例詳細說明和描述本發明，這些圖式和實例僅用於說明目的，並不意味著限制。由於發明說明和實例，習於技藝者可以理解同樣包括在本發明中的其他實施例。 實例
自我擴增型RNA (saRNA)是一種有前途的核糖核酸疫苗載體候選物，由於最初轉移的RNA在細胞細胞質內擴增，因此能夠顯著降低劑量。saRNA是透過用感興趣的基因(轉基因)取代α病毒結構基因而從α病毒基因體改造而來。saRNA編碼α病毒複製酶，該複製酶帶有從活體外轉錄saRNA轉錄新RNA拷貝所需的所有酶促功能。
反式擴增型RNA (taRNA)是一種與saRNA相關的新型系統，它是基於複製酶辨識並有效率地反式複製模板RNA的能力。通常，此類模板RNA側接位於病毒特異性RNA的正股和負股中的啟動子並且被稱為反式複製子(TR)。TR可以透過刪除複製由saRNA改造而來。另外，進一步改良的奈米反式複製子(NTR)可能透過從5'複製辨識序列移除所有起始密碼子由TR改造而來，如先前在WO2017/162460A1中所述。本文中所用的特定NTR (TC83+3xMut)描述於WO 2023/066874 A1中。為了進行擴增，TR和NTR需要複製酶，可能由共遞送的編碼複製酶的mRNA表現，而該mRNA本身可能被複製也可能不被複製。在安全性、多功能性和製造方面，taRNA系統可能比saRNA更有優勢。
基於α病毒RNA基因體複製的機制，習於技藝者會假設複製酶變體將以與saRNA和taRNA相同的方式影響轉基因表現。然而，這裡出乎意料地證明，事實上saRNA媒介的轉基因表現量不能被用來預測taRNA上編碼的轉基因表現，反之亦然，因為複製酶蛋白序列的特定變化可能會導致順式或逆式的相反效果。本文描述的是意外發現到的複製酶變體，其在taRNA系統中特異性地增強表現。 實例 1. 所用複製酶的序列。
相對於複製酶的N端甲硫胺酸，所測試的委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)複製酶蛋白在三個胺基酸位置中有差異：747、1360和1589。初始親代複製酶與VEEV TRD基因體的複製酶(GenBank登錄號L01442.2)相同，並且在位置747處具有麩胺酸(E)，在位置1360處具有甘胺酸(G)，以及在位置1589處具有蘇胺酸(T)，縮寫為EGT-複製酶。縮寫為EGS的複製酶變體在位置1589處具有絲胺酸(S)，由Kinney et al. (Kinney RM, et al., Virology. 1989, 170(1):19-30、Kinney RM, et al., J Virol. 1993, 67(3):1269-77)描述。縮寫為QRT的複製酶變體在位置747處具有麩醯胺酸(Q)且在位置1360處具有精胺酸(R)，由Michel et al. (Michel G, et al., Virology. 2007, 362(2):475-87)描述。縮寫為QRS的另一種新生成的複製酶變體在位置747處具有麩醯胺酸(Q)，在位置1360處具有精胺酸(R)，以及在位置1589處具有絲胺酸(S)。 實例 2. 在 saRNA 和 taRNA 的背景下變體 EGT 和 EGS 的相反活性。
saRNA和taRNA被設計為編碼EGT或EGS複製酶變體以及螢光素酶作為報導基因。幼倉鼠腎纖維母細胞(BHK) (圖2)、小鼠肌母細胞株C2C12 (圖3)及初代人類包皮纖維母細胞(HFF) (圖4)以3種不同劑量的各種saRNA或taRNA轉染。為了監測轉染後6小時、24小時、48小時和72小時的轉基因表現，透過發光對螢光素酶的活性進行定量。這些實驗的結果如圖2-4中所示。在用所有測試劑量的所有測試細胞中，編碼EGT複製酶的saRNA提供了更高的轉基因表現。令人驚訝的是，當使用taRNA時觀察到相反的情況。在taRNA背景下，在測試的所有三種不同細胞類型中，EGS複製酶產生比EGT複製酶更高的螢光素酶水平。這些數據表明，複製酶位置1589處用絲胺酸交換蘇胺酸會損害saRNA的性能，但提高了taRNA的性能。 實例 3. 在 saRNA 和 taRNA 的背景下變體 EGT 和 QRT 的相反活性。
為了解決科學文獻中描述的另一種複製酶變體是否也可能對saRNA和taRNA具有相反活性的問題，對編碼EGT或QRT複製酶和螢光素酶作為報導基因的saRNA和taRNA進行了比較。轉染BHK細胞和HFF並評估螢光素酶活性。這些實驗的結果如圖5中所示。使用QRT複製酶替代EGT複製酶在兩種測試的細胞類型中均降低saRNA活性。當測試taRNA時，再次觀察到相反的效果。與EGT複製酶相比，QRT複製酶展現出高得多的反式活性，如反式複製子NTR (TC83+3xMut)上編碼的螢光素酶的表現所示(NTR (TC83+3xMut)描述於WO2023/066874A1)。這些數據提供了第二個實例，其中複製酶變體對taRNA有利，但對saRNA不利。 實例 4. QRT 變體更有效率地複製 NTR 。
進行進一步的實驗以排除實例3的觀察結果僅對作為複製酶受質的NTR (TC-83+3xMut)具有特異性的可能性，還排除QRT僅在纖維母細胞中於taRNA中優於EGT複製酶的可能性。因此，以編碼QRT或EGT複製酶的mRNA以及帶有螢光素酶作為報導基因的NTR轉染淋巴母細胞株K-562。在這個實驗中，使用兩種不同的NTR作為複製酶受質，NTR (TC-83+3xMut) (如先前在WO2023/066874A1中所述)和NTR (TRD) (如先前在WO2017/162460A1中所述)。這些數據如圖6A中所示。同樣，在兩個taRNA系統中，在淋巴母細胞株中，與EGT複製酶相比，24小時後用QRT複製酶處理的樣品中的螢光素酶活性更高。
在不受理論約束的情況下，螢光素酶活性較高的可能解釋是QRT複製酶的TR複製較高。為了確認QRT變體是否是更為活躍的RNA複製酶，在相同的taRNA系統中，透過定量RT-PCR分析NTR水平(參見圖6C)，同時透過發光測量螢光素酶活性(參見圖6B)。數據顯示，QRT複製酶作為taRNA系統的組分，比EGT複製酶更有效率地擴增NTR，這導致螢光素酶活性值更高。 實例 5. 開發更加活躍的複製酶。
EGS和QRT均能夠增進taRNA。接下來，研究QRT中位置1589處的蘇胺酸交換為絲胺酸所產生的新變體QRS是否會進一步增加taRNA背景下的轉基因表現。為了解決這個問題，用固定量的編碼親代EGT、EGS、QRT或QRS複製酶的mRNA以及0.2 ng或0.02 ng NTR (TRD)或NTR (TC-83+3xMut)與作為報導基因的螢光素酶轉染K-562細胞。結果如圖7中所示。數據證實實例2的觀察結果，目前在K-562細胞中，EGS在taRNA系統中比EGT更為活躍。數據也證實，在taRNA系統中，QRT的活性相比於EGS更高。然而，新的變體QRS是taRNA系統中最活躍的。這些數據證實，利用VEEV複製酶的新QRS變體，已經開發出taRNA載體系統的極其有效的組分。 實例 6. 在活體內使用不同複製酶變體的反式複製。
為了在不同複製酶(REPL)變體的情況下比較反式複製子(TR)編碼的免疫原性，以1：100的莫耳比使用LNP配製的編碼流感病毒血球凝集素(HA)的TR的和LNP配製的編碼複製酶變體(EGT-REPL、QRT-REPL、EGS-REPL或QRS-REPL)中之一者的核苷修飾mRNA免疫BALB/c小鼠。使用蛋白質特異性ELISA從血清樣品測定HA特異性IgG抗體。經由IFN-γ ELISpot評估HA特異性T細胞反應。截至第49天，與EGT-REPL相比，QRT-REPL和EGS-REPL產生的HA特異性IgG稍高，而QRS-REPL觀察到最高的IgG滴度(圖8A)。與EGT-REPL相比，所有複製酶變體的HA特異性T細胞反應均增加，其中QRS-REPL再次顯示最高反應(圖8B)。 實例 7. 目標減量 需要 STR-miR 的複製，且複製酶活性決定減量的程度
將VEEV複製酶插入非複製型mRNA (nrRNA-REPL)中，並建構基於VEEV的縮短反式複製子(STR) (圖10A)。使用在3'UTR中包含前-miRNA序列的STR研究有效miRNA遞送。產生了包含靶向螢火蟲螢光素酶的兩種amiRNA之一(STR-miR-luc1、STR-miR-luc2)的STR (圖10A)，並產生了穩定表現螢光素酶的BHK-21細胞(BHK-luc)。為了研究STR複製是否是目標基因減量所必需的，將BHK-luc以STR-miR-luc構建體以及編碼EGT-複製酶(TRD-REPL)、複製缺陷突變體(不活化-REPL)、或QRT-複製酶(QRT-REPL)的nrRNA共轉染。轉染後當天，觀察到細胞的emGFP表現量反映了所用的複製酶類型(圖10B)。具體來說，在複製酶不活化的情況下，加帽的STR-miR被轉譯為基礎GFP表現，該表現被EGT複製酶(TRD-REPL)放大超過50倍，並被QRT-REPL進一步增加了約10倍(圖10B)。關於螢光素酶表現，當共轉染STR-miR-luc和不活化-REPL時，並沒有發現明顯的默化(圖9A，左)。共轉染EGT-複製酶(TRD-REPL)使螢光素酶表現降低50-60% (圖9A，中)，而共轉染QRT-REPL最終導致80%默化(圖9A，右)。無論使用何種複製酶變體，細胞生存力均不受影響(圖9B)。因此，透過使用QRT複製酶增強反式複製來產生更多的STR-miR轉錄本會導致更強的目標減量。 實例 8. ( 奈米 ) 反式複製子與 QRS 複製酶的免疫原性
為了比較含有U或N1-甲基-假尿苷(m1Y)的奈米反式複製子(NTR)與編碼EGT複製酶(wt-REPL)或QRS複製酶(QRS-REPL)的核苷修飾mRNA的免疫原性，分別按1：1的莫耳比用經LNP配製的RNA對BALB/c小鼠進行免疫。分別使用蛋白質特異性ELISA和病毒中和測試從血清樣品測定HA特異性IgG和流感病毒中和抗體。經由IFN-γ ELISpot評估HA特異性T細胞反應。QRS-REPL產生與帶有m1Y的NTR的wt-REPL不相上下的HA特異性IgG (圖11A)和病毒中和抗體(圖11B)，但與wt-REPL相比會引發更高的CD8和CD4 T細胞反應(圖11C)。 實例 9. 在先天免疫抑制劑存在下， taRNA 與 QRS-REPL 的免疫原性
已經觀察到因為NTR的擴增，taRNA具有內在佐劑活性，這可能是由於模式辨識受體的刺激，例如在複製期間透過雙股RNA中間體的刺激。先前已證明(例如Beissert et al., (2017) Human Gene Therapy, 28(12): 1138-1146)，mRNA編碼的先天免疫抑制劑的共遞送可以增加saRNA的表現。為了評估NTR-HA與QRS-REPL在核苷修飾mRNA編碼的先天免疫抑制劑存在下的免疫原性，按1：100 (NTR：REPL)或1：100：100 (NTR：RELP：抑制劑)的莫耳比分別用LNP配製的RNA免疫BALB/c小鼠。本研究中所用的先天免疫抑制劑是NS1 (A型流感病毒) (SEQ ID NO：17)、NS (托斯卡納病毒) (SEQ ID NO：18)和E3 (牛痘病毒) (SEQ ID NO：19)。分別使用蛋白質特異性ELISA和病毒中和測試從血清樣品測定HA特異性IgG和流感病毒中和抗體。經由IFN γ ELISpot評估HA特異性T細胞反應。與NTR-HA + QRS-REPL但沒有抑制劑相比，先天免疫抑制劑NS1和NS的共遞送導致更高的HA特異性IgG (圖12A)、病毒中和抗體(圖12B)和HA特異性CD8 T細胞(圖12C)。E3的共遞送導致第49天的HA特異性IgG略有增強，且CD8和CD4 T細胞反應與沒有抑制劑的taRNA相當。 SEQ ID NO: 17 (NS1; Genbank ID: DQ508893.1) MDSNTVSSFQVDCFLWHVRKQVADQELGDAPFLDRLRRDQKSLKGRGSTLGLNIETATCVGKQIVERILKEESDEAFRMTMASALASRYLTDMTIEEMSRDWFMLMPKQKVAGPLCVRMDQAIMDKNIILKANFSVIFDRLETLTLLRAFTEEGAIVGEISPLPSLPGHTNEDVKNAIGVLIGGLEWNDNTVRVSETLQRFAWRSSNENGGPPLTPTQKRKMAGKIRSEV SEQ ID NO: 18 (NS; Genbank ID: AIQ84578.1) MQSRAVILKHRSGSGHKRSLPRFYIDCDLDTFDFEKGCSLIENEFPIYINNYEVVYKSKPTLSHFLIEKEFPAVLGPGMISAVRTRLYEPTMRELYQESIHQLKRNNKKYLLSALRWPTGIPTLEFIDYYFEELLFLSEFDPGSIQRYLKLLVKASGLYNSTIEEQLVEIHRRVLIEGKKHGLTAFDLPGNDILGDICVVQAARVTRLVAKTFSKMTRDTHLMIYFSISPVELVLNKLDKKEDKRAKAKGLMSMCAARSYDYFMRTDLGFRETALSTFWAKDWPTLQETILSDKRCLKEDMRVTKWLPSPPHYPPL SEQ ID NO: 19 (E3; Genbank ID: YP_232941.1) MSKIYIDERSNAEIVCEAIKTIGIEGATAAQLTRQLNMEKREVNKALYDLQRSAMVYSSDDIPPRWFMTTEADKPDADAMADVIIDDVSREKSMREDHKSFDDVIPAKKIIDWKGANPVTVINEYCQITRRDWSFRIESVGPSNSPTFYACVDIDGRVFDKADGKSKRDAKNNAAKLAVDKLLGYVIIRF 實例 10. 材料與方法：
實例中使用以下材料和方法。
載體和質體選殖：使用標準技術選殖質體以編碼(i)含有複製酶序列與報導基因匣GFP-secNLuc (綠色螢光蛋白和分泌型奈米螢光素酶)的saRNA、(ii)複製酶mRNA，或(iii)反式複製子(例如TR或NTR) mRNA。病毒複製酶序列是基於親代委內瑞拉馬腦炎病毒特立尼達驢病毒株(Trinidad donkey strain) (VEEV TRD；GenBank登錄號L01442)，此處稱為EGT-複製酶。也使用了變體複製酶序列：VEEV EGS-複製酶(GenBank登錄號J04332)和VEEV QRT-複製酶(GenBank登錄號L01442)。序列表中也提供了胺基酸序列。將由30和70個腺苷酸殘基(聚A30-70)組成的質體編碼的聚(A)匣(被10個核苷酸隨機序列分隔開) (WO2016/005004A1)被添加到緊鄰VEEV 3'CSE最後一個核苷酸的下游。EGS-複製酶和QRT-複製酶的質體被用於選殖QRS-複製酶。序列詳細內容如實例1中所示。反式複製子在5'端與3'端處含有複製必要的啟動子元件，且可能帶有(實例1中的TR)或不帶有(所有其他實例中的NTR)亞基因體啟動子的序列。在NTR載體中，報導基因起始密碼子上游的所有ATG核苷酸三聯體透過單核苷酸交換而被改變，避免了考慮到假定的有害RNA結構改變會造成過早轉譯(參見例如WO2017/162460)。NTR(TRD)和NTR(TC83)在位置4處的一個核苷酸有別，而NTR(TC83+3xmut)在5' UTR中具有三個額外改變(參見例如WO2023/066874)。核苷酸序列提供於序列表中。TR和NTR載體中使用了以下報導基因匣：GFP-secNluc、螢火蟲螢光素酶以及不穩定的螢火蟲螢光素酶和不穩定的GFP (luc2CP-d2eGFP)。胺基酸序列提供於序列表中。
購買兩個含有emGFP-前-miRNA表現匣的慢病毒載體(BLOCK-IT TMLentiviral Pol II miR RNAi Exptession System with emGFP Kit，目錄號K4925-00，Invitrogen)並用作為PCR模板而將miRNA匣選殖到STR載體中。靶向細菌 lacZ基因或預測為非靶向性的成熟miRNA序列側接鼠類miR-155序列的環序列(Lagos-Quintana, et al., (2002). Identification of tissue-specific microRNAs from mouse. Current biology CB 12, 735-739)，它指導從較長的Pol II轉錄本(pri-miRNA)切除工程化的miRNA。被製成插入miR-155骨架的所有其他人工miRNA序列均使用BLOCK-iT RNAi設計器(一種配套線上工具(https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/))設計。成熟miRNA序列如下：miR-luc1：AGCCCATATCGTTTCATAGCT (SEQ ID NO：15)；miR-luc2：ATACCTGGCAGATGGAACCTC (SEQ ID NO：16)。透過客製化基因合成(Genewiz)訂購電腦設計的前-miRNA匣，並選殖到STR質體的轉基因編碼序列和α病毒3'保守序列元件之間。
活體外轉錄、RNA純化：關於活體外轉錄，在聚A下游透過限制消化將質體線性化充當為T7 RNA聚合酶的模板。如前所述進行RNA合成與純化(Holtkamp et al., 2006, Blood, vol. 108, pp. 4009-4017；Kuhn et al., 2010, Gene Ther., vol. 17, pp. 961-971)。有需要時，UTP被N-1-甲基假-尿苷三磷酸(1mψ)交換。RNA以CC413 (Trilink Biotechnologies)、CCAU (Trilink Biotechnologies)、β-S-ARCA Cap (D2 CAP) (BioNTech RNA Pharmaceuticals)或ARCA Cap (BioNTech RNA Pharmaceuticals)進行加帽。藉由分光光度法評估經純化RNA的品質，並在5200 Fragment Analyzer (Advanced Analytical)上進行分析。
細胞培養：除非另有說明，否則所有生長培養基和其他補充劑均由HiMedia提供。胎牛血清(FCS)購自Sigma-Aldrich。從System Bioscience (HFF，新生兒)獲得的人類包皮纖維母細胞培養在含有15% FCS、1%非必需胺基酸、1 mM丙酮酸鈉的最低必需培養基(MEM)中。BHK21細胞(ATCC；CCL10)在補充10% FCS的MEM中生長。K-562細胞(ATCC，CCL243)在含有10% FCS的RPMI-1640培養基中培養。所有三種細胞株均儲存在37℃、平衡至5% CO2的潮濕氣氛中。C2C12細胞(ATCC1772)在37℃和7% CO2下培養於Dulbecco改良eagle培養基(DMEM)中，DMEM加入GlutaMAX™且補充10% FBS和1%丙酮酸鈉。
RNA轉移到細胞：關於電穿孔，使用方波電穿孔裝置(BTX ECM 830，Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA)在室溫下將RNA電穿孔到細胞中，使用以下設定：650 V/cm，3個8毫秒(ms)且間隔400 ms的脈衝)。在無RNAse的試管中製備1 µg複製酶和0.05 µg NTR的混合物，並保存在冰上直至轉染。關於電穿孔，將RNA重新懸浮於X-vivo無血清培養基中，最終體積為62.5 µl/mm光析管間隙大小。使用2 mm光析管。
遵循製造商的說明書使用Lipofectamine MessengerMAX (Life Technologies, Darmstadt, Germany)進行RNA脂轉染。脂轉染前一天，將HFF、C2C12和BHK21以96孔盤每孔5000個接種(實例2)，或者BHK和HFF以12孔盤每孔100000個接種(實例3)。K-562細胞以96孔盤每孔10000個接種。每1 µg RNA將RNA與50 µL OptiMEM混合，隨後與含有4 µl脂質的50 µL OptiMEM混合。RNA轉染量如圖圖例中所示。
報導基因活性分析：根據製造商的說明書，使用Nano-Glo Luciferase分析系統以Bright-Glo Luciferase Assay System與Nanoluc (均為Promega，Madison, WI, USA)測量螢火蟲螢光素酶表現。透過將每個樣品的值相對於未轉染RNA的細胞的值標準化來計算相對生存力。使用Spark®多模式微量讀盤儀(Tecan Group, Männedorf, Switzerland)測量生物發光。
qPCR：使用RNeasy Micro Kit (Qiagen)根據製造商的說明書，使用QiaCube (Qiagen)裝置進行RNA分離。
SuperScript™ IV逆轉錄酶套組(Thermo Fisher)用於cDNA合成，如製造商說明書中所述。將RNaseOUT替換為H20，並使用隨機引子(TaKaRa的RT Primer Mix，PrimerScriptKit)。將反應混合物在50℃下培育20分鐘。
關於qPCR，根據製造商的說明書使用Quanti Tect SYBR Green PCR Kit (Qiagen)。為了偵測螢火蟲螢光素酶RNA，使用RNA l2m2_pair3_for 5'CCCATCTTCGGCAACCAGAT3' (SEQ ID NO：11)與l2m2_pair3_rev 5'GTACATGAGCACGACCCGAA3' (SEQ ID NO：12)。以如5'TGACACTGGCAAAACAATGCA3' (SEQ ID NO：13)的HPRT1和如5'GGTCCTTTTCACCAGCAAGCT3' (SEQ ID NO：14)的HPRT1偵測管家基因HPRT。透過7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems)系統偵測螢光。關於評估RT-qPCR數據，採用7300系統v1.4.0軟體。目標基因螢光素酶的循環閾值(CT)值以管家基因標準化，以消除不同樣品中細胞數量不等引起的差異(ΔCT)。再計算與0.5小時後偵測值的差異(ΔΔCT=ΔCT轉染細胞-ΔCT轉染後0.5小時)。為了評估與轉染後0.5小時相比螢光素酶表現的誘導倍數，計算2的負ΔΔCT次方(2 -ΔΔCT)。 活體內實驗：
動物照護：所有實驗和方案均經地方當局(地方福利委員會)批准，根據FELASA建議進行，並符合德國動物福利法和指令2010/63/EU。
肌肉內注射：將編碼流感病毒血球凝集素的反式複製子(TR-HA)和編碼不同複製酶(REPL)的核苷修飾mRNA分別配製在LNP中，並在施用前以1：100 (0.4 ng TR-HA + 99.6 ng REPL)的莫耳比混合。透過吸入麻醉(異氟烷2.5%) (Abbott, Ludwigshafen, Germany)對小鼠進行麻醉。在初次免疫-加強免疫方案中，BALB/c小鼠(每組n=5隻)在第0天和第28天肌肉內注射20 µL配製的RNA。
血液採樣：從面靜脈採集用於IgG ELISA的血液樣品。在相關研究日，將所有動物的50 µL血液收集到塗覆肝素的血清管(BD Microtainer)中。此外，在第0天第一次免疫前從10%的動物採集血液。
流感HA特異性IgG ELISA：使用ELISA偵測血清樣品中的流感HA特異性IgG。根據製造商的說明書，使用Thermo Scientific的EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit (目錄號：28005)對桿狀病毒-昆蟲細胞(目錄號：11055-V08B，Sino Biological)產生的A型流感H1N1 (A/California/04/2009)重組蛋白進行生物素化，使其能夠以高親和力結合至經鏈黴親和素預塗覆的96孔盤(目錄號：734-1284；Nunc)。在蛋白質儲液生物素化後，馬上使用HABA/Avidin分析(Biotin Quantitation Kit Thermo Scientific)評估重組蛋白的成功生物素化。經鏈黴親和素預塗覆的盤已在4℃下與100 ng/100 µl (1 µg/ml)生物素化重組蛋白或已知濃度的小鼠IgG同型(小鼠IgG-BIOT；濃度：0.5 mg/ml；目錄號：0107-08；Southern Biotech) (以1：100至1：3200連續稀釋)一起培育過夜。此外，還納入陽性對照和陰性對照，它們同樣已塗覆有生物素化重組蛋白，但與流感HA的特異性抗體(抗人類A型流感(H1N1、H2N2)，單株(純系C179)，目錄號M145，TaKaRa Bio，1：1000)連同山羊抗小鼠-IgG-HRP (目錄號：15-035-071；Jackson ImmunoResearch；1：15,000稀釋)一起培育。洗滌並阻斷非特異性結合位點(阻斷緩衝液來自Sigma-Aldrich，目錄號：B6429)後，將經免疫小鼠的血清樣品與塗覆孔一起在搖床上於37℃下培育1小時。使用辣根過氧化酶(HRP)偶聯的二級抗體(山羊抗小鼠IgG (POX)；目錄號：115-035-071；Jackson ImmunoResearch；1：15,000)和使用TMB one受質(貨號：4380；Kem-En-Tec)在RT下進行酶促反應歷時8分鐘從血清樣品偵測結合抗體。使用硫酸(目錄號：1.007.161.000；Merck)中止反應並用H 2O全面洗滌。使用Epoch讀盤儀並在450-620 nm測量進行結果的定量。
ELISpot分析：在第49天分離脾細胞，使用Mabtech Mouse IFN-γ ELISpotPLUS套組進行ELISpot分析。將脾細胞接種到預塗覆的ELISpot盤上，並在37℃下加濕培養箱中用流感HA特異性肽池刺激過夜。使用不相關的肽(僅培養基或伴刀豆球蛋白A)進行對照測量。用生物素偶聯的抗IFNγ抗體，接著與5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸/硝基藍四唑鎓鹽(BCIP/NBT)受質進行培育，使得點可視化。使用CTL ImmunoSpot® Analyzer掃描盤並透過ImmunoCapture V6.3軟體進行分析。所有測試均以三重複進行，而點計數總結為每個三重複的中值。
實施例列表 1. 一種編碼經修飾RNA依賴性RNA聚合酶(複製酶)的核酸分子，其中與相應未經修飾聚合酶的反式複製活性相比，該聚合酶具有增加的反式複製活性。 2. 如實施例1之核酸，其中核酸分子未編碼任何病毒結構蛋白。 3. 如實施例1或實施例2之核酸，其中經修飾聚合酶具有與其順式複製活性相比增加的反式複製活性。 4. 如實施例1至3中任一項之核酸，其中與相應未經修飾聚合酶的順式複製活性相比，經修飾聚合酶具有減少的順式複製活性。 5. 如實施例1至4中任一項之核酸，其中聚合酶衍生自病毒。 6. 如實施例1至5中任一項之核酸，其中聚合酶衍生自正股自我複製型病毒。 7. 如實施例1至5中任一項之核酸，其中聚合酶衍生自α病毒。 8. 如實施例1至7中任一項之核酸，其中聚合酶衍生自選自由委內瑞拉馬腦炎病毒、東部馬腦炎病毒、西部馬腦炎病毒、屈公病毒、塞姆利基森林病毒、辛德比斯病毒、巴爾馬森林病毒、米德爾堡病毒和恩杜穆病毒組成之群的α病毒。 9. 如實施例1至8中任一項之核酸，其中聚合酶衍生自委內瑞拉馬腦炎病毒。 10. 如實施例1至9中任一項之核酸，其中經修飾聚合酶與相應未經修飾聚合酶具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%但非100%序列同一性。 11. 如實施例1至10中任一項之核酸，其中與相應未經修飾聚合酶相比，經修飾聚合酶包含至少一個胺基酸插入、取代及/或缺失。 12. 如實施例1至11中任一項之核酸，其中經修飾聚合酶在nsP2蛋白中及/或nsP3蛋白中包含至少一個胺基酸插入、取代及/或缺失。 13. 如實施例1至12中任一項之核酸，其中相應未經修飾聚合酶包含SEQ ID NO：1中所示的胺基酸序列。 14. 如實施例1至13中任一項之核酸，其中經修飾聚合酶在對應於SEQ ID NO：1的位置1589的胺基酸位置處包含取代。 15. 如實施例1至14中任一項之核酸，其中經修飾聚合酶在對應於SEQ ID NO：1的位置747的胺基酸位置處包含取代。 16. 如實施例1至15中任一項之核酸，其中經修飾聚合酶在對應於SEQ ID NO：1的位置1360的胺基酸位置處包含取代。 17. 如實施例1至16中任一項之核酸，其中經修飾聚合酶在對應於SEQ ID NO：1的位置1589的胺基酸位置處具有絲胺酸(S)。 18. 如實施例1至17中任一項之核酸，其中經修飾聚合酶在對應於SEQ ID NO：1的位置747的胺基酸位置處具有麩醯胺酸(Q)。 19. 如實施例1至18中任一項之核酸，其中經修飾聚合酶在對應於SEQ ID NO：1的位置1360的胺基酸位置處具有精胺酸(R)。 20. 如實施例1至19中任一項之核酸，其中經修飾聚合酶在對應於SEQ ID NO：1的位置747的胺基酸位置處具有麩醯胺酸(Q)，且在對應於SEQ ID NO：1的位置1360的胺基酸位置處具有精胺酸(R)。 21. 如實施例1至20中任一項之核酸，其中經修飾聚合酶在對應於SEQ ID NO：1的位置747的胺基酸位置處具有麩醯胺酸(Q)，在對應於SEQ ID NO：1的位置1360的胺基酸位置處具有精胺酸(R)，並在對應於SEQ ID NO：1的位置1589的胺基酸位置處具有絲胺酸(S)。 22. 如實施例1至21中任一項之核酸，其中核酸包含SEQ ID NO：2中所示胺基酸序列的編碼序列。 23. 如實施例1至22中任一項之核酸，其中核酸包含SEQ ID NO：3中所示胺基酸序列的編碼序列。 24. 如實施例1至23中任一項之核酸，其中核酸包含SEQ ID NO：4中所示胺基酸序列的編碼序列。 25. 如實施例1至24中任一項之核酸，其中經修飾聚合酶是VEEV衍生的經修飾聚合酶，其在對應於SEQ ID NO：1的位置747、1360和1589的各個胺基酸位置處包含取代突變。 26. 如實施例25之核酸，其中取代突變包含E747Q、G1360R和T1589S。 27. 如實施例1至26中任一項之核酸，其中相比於包含SEQ ID NO：2中所示胺基酸序列的經修飾聚合酶，經修飾聚合酶具有增加的反式複製活性。 28. 如實施例1至27中任一項之核酸，其中相比於包含SEQ ID NO：3中所示胺基酸序列的經修飾聚合酶，經修飾聚合酶具有增加的反式複製活性。 29. 如實施例1至28中任一項之核酸，其中相比於包含SEQ ID NO：4中所示胺基酸序列的經修飾聚合酶，經修飾聚合酶具有增加的反式複製活性。 30. 如實例1至29中任一項之核酸，其中核酸包含至少一個編碼感興趣胺基酸序列的額外開放閱讀框，較佳地其中感興趣胺基酸序列不是病毒結構蛋白。 31. 如實施例1至30中任一項之核酸，其中病毒結構蛋白是衍生自正股自我複製型病毒，較佳地α病毒的蛋白質。 32. 如實施例1至31中任一項之核酸，其中核酸為RNA。 33. 如實施例1至32中任一項之核酸，其中核酸為mRNA。 34. 如實施例1至33中任一項之核酸，其中核酸是包含至少一個經修飾核苷酸或核鹼基的RNA分子。 35. 如實施例34之核酸，其中至少一個經修飾核苷酸或核鹼基是經修飾的尿苷。 36. 如實施例35之核酸，其中RNA分子中至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的尿苷是假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)，或5-甲基-尿苷(m5U)，較佳地為N1-甲基-假尿苷(1mψ)。 37. 如實施例1至36中任一項之核酸，其中核酸是包含5'帽及/或聚(A)序列的RNA分子。 38. 如實施例37之核酸，其中5'帽是天然存在的5'帽或5'帽類似物。 39. 如實施例38之核酸，其中5'帽類似物是ARCA、β-S-ARCA、β-S-ARCA(D1)、β-S-ARCA(D2)、CleanCap、Cap0、Cap1或AU(Cap1)中之一者。 40. 如實施例1至39中任一項之核酸，其中核酸是包含至少一個經修飾的尿苷和具有序列NpppNU之5'帽的RNA分子，其中5'帽中的U是未經修飾的尿苷。 41. 如實施例40之核酸，其中5'帽具有序列NpppAU，其中A表示經修飾或未經修飾的腺苷核苷酸。 42. 如實施例1至41中任一項之核酸，其中核酸包含含有約80至約150個A殘基的聚(A)序列，或間斷的聚(A)序列。 43. 如實施例1至42中任一項之核酸，其中反式複製活性是複製能夠被經修飾聚合酶複製並且不編碼任何RNA依賴性RNA聚合酶的RNA分子的能力。 44. 一種系統，包含 兩個核酸分子， 其中第一核酸分子是如實施例1至43中任一項之核酸分子，且 其中第二核酸分子是包含功能性核苷酸序列且不包含編碼RNA依賴性RNA聚合酶之核苷酸序列的可複製RNA分子，該第二核酸分子能夠被第一核酸分子所編碼的經修飾聚合酶反式複製。 45. 如實施例44之系統，其中第一核酸分子和第二核酸分子各自是RNA分子。 46. 如實施例44或實施例45之系統，其中功能性核苷酸序列是編碼感興趣胺基酸序列的核苷酸序列。 47. 如實施例46之系統，其中該感興趣胺基酸序列選自由以下組成之群：免疫原性蛋白，較佳地衍生自細菌、病毒、真菌或寄生蟲的免疫原性蛋白或其片段；抗體或其片段；治療性蛋白；多能性因子或分化因子；牛痘病毒免疫逃脫蛋白，較佳地E3及/或B18；包含托斯卡納病毒NS蛋白或托斯卡納病毒NS蛋白的功能變體的病毒衍生因子；以及報導蛋白。 48. 如實施例47之系統，其中免疫原性蛋白或其片段是抗原或其表位，較佳地T細胞表位。 49. 如實施例44至48中任一項之系統，其中該第一核酸分子進一步包含功能性核苷酸序列。 50. 如實施例44至49中任一項之系統，其中第一核酸分子是mRNA。 51. 如實施例44至50中任一項之系統，其中功能性核苷酸序列側接5'非轉譯區(UTR)及/或3' UTR。 52. 如實施例44至51中任一項之系統，其中第二核酸分子是包含至少一個經修飾的核苷酸或核鹼基的RNA分子。 53. 如實施例52之系統，其中至少一個經修飾的核苷酸或核鹼基是經修飾的尿苷。 54. 如實施例53之系統，其中RNA分子中至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的尿苷是假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)，或5-甲基-尿苷(m5U)，較佳地N1-甲基-假尿苷(1mψ)。 55. 如實施例44至54中任一項之系統，其中第二核酸分子是包含5'帽、5'調節區、5'複製辨識序列、3'複製辨識序列及/或聚(A)序列的RNA分子。 56. 如實施例44至55中任一項之系統，其中第二核酸分子是包含5'帽的RNA分子，5'帽是天然存在的5'帽或5'帽類似物。 57. 如實施例56之系統，其中5'帽類似物為ARCA、β-S-ARCA、β-S-ARCA(D1)、β-S-ARCA(D2)、CleanCap、Cap0、Cap1或AU(Cap1)中之一者。 58. 如實施例44至57中任一項之系統，其中第二核酸分子是包含至少一個經修飾的尿苷的RNA分子，並且其中該分子包含具有序列NpppNU的5'帽，其中5'帽中的U是未經修飾的尿苷。 59. 如實施例58之系統，其中5'帽具有序列NpppAU，其中A表示經修飾或未經修飾的腺苷核苷酸。 60. 如實施例44至59中任一項之系統，其中第二核酸是包含5'帽的RNA分子，該5'帽包含有Cap1和包含分子的位置+1、+2、+3、+4與+5的帽近端序列，其中： (i) Cap1包含m7G(5')ppp(5')(2'OMeN1)pN2，其中N1是分子的位置+1，而N2是分子的位置+2，且其中N1和N2各自獨立地選自：A、C、G或U；且 (ii) 帽近端序列包括Cap1的N1和N2，以及： (a) 選自由以下組成之群的序列：A3A4X5；C3A4X5；A3C4A5和A3U4G5；或 (b) 包含X3Y4X5的序列； 其中X3或X5各自獨立地選自A、G、C或U；且其中Y4不是C。 61. 如實施例44至60中任一項之系統，其中第二RNA分子包含自我複製型RNA病毒之經修飾5'調節區，該經修飾調節區包含在5'調節區(SEQ ID NO：5)的位置67、244、245、246、248中的一或多者處的點突變。 62. 如實施例61之系統，其中自我複製型RNA病毒是α病毒。 63. 如實施例61或62之系統，其中5'調節區進一步包含在5'調節區(SEQ ID NO：5)的位置4處的點突變。 64. 如實施例61至63中任一項之系統，其中點突變是G4A、A67C、G244A、C245A、G246A或C248A。 65. 如實施例44至64中任一項之系統，其中第二核酸分子包含5'複製辨識序列，其特徵在於與天然5'複製辨識序列相比，移除了至少一個起始密碼子。 66. 如實施例65之系統，其中5'複製辨識序列包含與自我複製型病毒的非結構蛋白或其一部分的開放閱讀框同源的序列，其中與自我複製型病毒的非結構蛋白或其一部分的開放閱讀框同源的序列的特徵在於，與天然病毒序列相比，其包含移除至少一個起始密碼子。 67. 如實施例66之系統，其中與自我複製型病毒的非結構蛋白或其一部分的開放閱讀框同源的序列的特徵在於，其包含至少移除自我複製型病毒之非結構蛋白的開放閱讀框的天然起始密碼子。 68. 如實施例66或實施例67之系統，其中與自我複製型病毒的非結構蛋白或其一部分的開放閱讀框同源的序列的特徵在於，其包含移除自我複製型病毒之非結構蛋白的開放閱讀框的天然起始密碼子以外的至少一個起始密碼子。 69. 如實施例66至68中任一項之系統，其中與自我複製型病毒的非結構蛋白或其一部分的開放閱讀框同源的序列的特徵在於其不含起始密碼子。 70. 如實施例66至69中任一項之系統，其中第二核酸分子包含至少一個核苷酸改變，其補償因為移除至少一個起始密碼子而被引入至少一個莖環內的核苷酸配對破壞。 71. 如實施例44至70中任一項之系統，其中第二核酸分子包含3'複製辨識序列。 72. 如實施例44至71中任一項之系統，其中5'及/或3'複製辨識序列衍生自自我複製型病毒，較佳地相同的自我複製型病毒物種。 73. 如實施例44至72中任一項之系統，其中第二核酸分子包含有包含約80至約150個A殘基的聚(A)序列，或間斷的聚(A)序列。 74. 如實施例44至73中任一項之系統，其進一步包含第三或更多可複製RNA分子，其可被第一核酸分子編碼的RNA依賴性RNA聚合酶複製。 75. 如實施例74之系統，其中第三或更多可複製RNA分子包含與第二核酸中所含者不同的功能性核苷酸序列。 76. 一種組合物，其包含如實施例1至43中任一項之核酸分子或包含如實施例44至75中任一項之系統的第一和第二核酸分子；以及能夠與核酸分子形成顆粒的試劑。 77. 如實施例76之組合物，其中核酸分子是RNA分子。 78. 如實施例76或實施例77之組合物，其中試劑是或包含聚亞烷基亞胺或脂質。 79. 如實施例76至78中任一項之組合物，其中該試劑是或包含脂質，較佳地包含陽離子頭基。 80. 如實施例76至79中任一項之組合物，其中試劑是或包含pH反應性脂質。 81. 如實施例76至80中任一項之組合物，其中試劑是或包含聚乙二醇化脂質。 82. 如實施例76至81中任一項之組合物，其中試劑結合至聚肌胺酸，視情況其中試劑包含結合至聚肌胺酸的脂質。 83. 如實施例76至82中任一項之組合物，其中由至少一種RNA分子和試劑形成的顆粒是基於聚合物的聚合複合物(PLX)、脂質奈米顆粒(LNP)，脂質複合物(LPX)或脂質體。 84. 如實施例76至83中任一項之組合物，其中顆粒進一步包含至少一種磷脂醯絲胺酸。 85. 如實施例76至84中任一項之組合物，其中顆粒是奈米顆粒，其中： (i) 奈米顆粒中的正電荷數不超過奈米顆粒中的負電荷數，及/或 (ii) 奈米顆粒具有中性或淨負電荷，及/或 (iii) 奈米顆粒中正電荷與負電荷的電荷比為1.4：1或更小，及/或 (iv) 奈米顆粒的zeta電位為0或更小。 86. 如實施例85之組合物，其中奈米顆粒中正電荷與負電荷的電荷比在1.4：1至1：8之間，較佳地在1.2：1至1：4之間。 87. 如實施例85或實施例86之組合物，其中奈米顆粒包含至少一種脂質，較佳地包含至少一種陽離子脂質。 88. 如實施例87之組合物，其中正電荷由至少一種陽離子脂質所貢獻，而負電荷由核酸分子，較佳地RNA分子所貢獻。 89. 如實施例87或實施例88之組合物，其中奈米顆粒進一步包含至少一種輔助脂質。 90. 如實施例89之組合物，其中輔助脂質是中性脂質。 91. 如實施例87至90中任一項之組合物，其中該至少一種陽離子脂質包含1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基銨丙烷(DOTMA)、1,2-二油醯基氧基-3-二甲基胺基丙烷(DODMA)，及/或1,2-二油醯基-3-三甲基銨-丙烷(DOTAP))。 92. 如實施例89至91中任一項之組合物，其中該至少一種輔助脂質包含1,2-二-(9Z-十八烯醯基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、膽固醇(Chol)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DOPC)，及/或1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)。 93. 如實施例89至92中任一項之組合物，其中至少一種陽離子脂質與至少一種輔助脂質的莫耳比為10：0至3：7，較佳地9：1至3：7、4：1至1：2、4：1至2：3、7：3至1：1，或2：1至1：1，較佳地約1：1。 94. 如實施例85至93中任一項之組合物，其中奈米顆粒是包含莫耳比為10：0至1：9，較佳地8：2至3：7，且更佳地7：3至5：5的DODMA和DOPE的脂質複合物，且其中DODMA中的正電荷與RNA中的負電荷的電荷比為1.8：2至0.8：2，更佳地1.6：2至1：2，甚至更佳地1.4：2至1.1：2，且甚至更佳地約1.2：2。 95. 如實施例85至93中任一項之組合物，其中奈米顆粒是包含莫耳比為10：0至1：9，較佳地8：2至3：7，更佳地7：3至5：5的DODMA和膽固醇的脂質複合物，且其中DODMA中的正電荷與RNA中的負電荷的電荷比為1.8：2至0.8：2，更佳地1.6：2至1：2，甚至更佳地1.4：2至1.1：2，且甚至更佳地約1.2：2。 96. 如實施例85至93中任一項之組合物，其中奈米顆粒是包含莫耳比為10：0至1：9，較佳地8：2至3：7，更佳地7：3至5：5的DODMA和DSPC的脂質複合物，且其中DODMA中的正電荷與RNA中的負電荷的電荷比為1.8：2至0.8：2，更佳地1.6：2至1：2，甚至更佳地1.4：2至1.1：2，且甚至更佳地約1.2：2。 97. 如實施例85至93中任一項之組合物，其中奈米顆粒是包含莫耳比為40：48：10：2的DODMA：膽固醇：DOPE：PEGcerC16的脂質複合物。 98. 如實施例85至93中任一項之組合物，其中奈米顆粒是包含莫耳比為10：0至1：9，較佳地8：2至3：7，且更佳地7：3至5：5的DOTMA和DOPE的脂質複合物，且其中DOTMA中的正電荷與RNA中的負電荷的電荷比為1.8：2至0.8：2，更佳地1.6：2至1：2，甚至更佳地1.4：2至1.1：2，且甚至更佳地約1.2：2。 99. 如實施例85至93中任一項之組合物，其中奈米顆粒是包含莫耳比為10：0至1：9，較佳地8：2至3：7，且更佳地7：3至5：5的DOTMA和膽固醇的脂質複合物，且其中DOTMA中的正電荷與RNA中的負電荷的電荷比為1.8：2至0.8：2，更佳地1.6：2至1：2，甚至更佳地1.4：2至1.1：2，且甚至更佳地約1.2：2。 100. 如實施例85至93中任一項之組合物，其中奈米顆粒是包含莫耳比為10：0至1：9，較佳地8：2至3：7，且更佳地7：3至5：5的DOTAP和DOPE的脂質複合物，且其中DOTMA中的正電荷與RNA中的負電荷的電荷比為1.8：2至0.8：2，更佳地1.6：2至1：2，甚至更佳地1.4：2至1.1：2，且甚至更佳地約1.2：2。 101. 如實施例76至100中任一項之組合物，其中試劑包含脂質且形成的顆粒是與核酸分子(較佳地RNA分子)複合及/或囊封核酸分子的LNP。 102. 如實施例76至101中任一項之組合物，其中試劑包含脂質且形成的顆粒是囊封核酸分子(較佳地RNA分子)的囊泡，其較佳地為單層脂質體。 103. 如實施例76至78中任一項之組合物，其中試劑是或包含聚亞烷基亞胺。 104. 如實施例102之組合物，其中(a)聚亞烷基亞胺中的氮原子(N)數目與RNA分子中的磷原子(P)數目的莫耳比(N：P比)是2.0至15.0，較佳地6.0至12.0；(b)聚亞烷基亞胺中的氮原子(N)數目與RNA分子中的磷原子(P)數目的莫耳比(N：P比)是至少約48，視情況約48至300、約60至200，或約80至150。 105. 如實施例102或實施例103之組合物，其中組合物的離子強度是50 mM或更低，較佳地其中單價陽離子的濃度是25 mM或更低，且二價陽離子的濃度是20 μM或更低。 106. 如實施例103至105中任一項之組合物，其中形成的顆粒是聚合複合物。 107. 如實施例103至106中任一項之組合物，其中該聚亞烷基亞胺包含以下通式(I)： 其中 R為H、醯基或包含下列通式(II)的基團： ， 其中R 1為H或包含以下通式(III)的基團： n、m和l獨立地選自2至10的整數；且 p、q和r是整數，其中p、q和r的總和使得聚合物的平均分子量為1.5·10 2至10 7Da，較佳地5000至10 5Da，更佳地10000至40000 Da，更佳地15000至30000 Da，甚至更佳地20000至25000 Da。 108. .如實施例107之組合物，其中n、m和l獨立地選自2、3、4和5，較佳地選自2和3。 109. 如實施例107或實施例108之組合物，其中R 1是H。 110. 如實施例107至109中任一項之組合物，其中R是H或醯基。 111. 如實施例107至110中任一項之組合物，其中該聚亞烷基亞胺包含聚乙烯亞胺及/或聚丙烯亞胺，較佳地聚乙烯亞胺。 112. 如實施例110或實施例111之組合物，其中聚亞烷基亞胺中至少92%的N原子是可質子化的。 113. 如實施例76至112中任一項之組合物，其進一步包含一或多種基於肽的佐劑，其中基於肽的佐劑視情況包含免疫調節分子，諸如細胞激素、淋巴因子及/或共刺激分子。 114. 如實施例76至113中任一項之組合物，其進一步包含一或多種添加劑，其中添加劑視情況選自由緩衝物質、醣類、穩定劑、低溫保護劑、凍乾保護劑和螯合劑組成之群。 115. 如實施例114之組合物，其中該緩衝物質包含選自由4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、2-(N-嗎啉)乙磺酸(MES)、3-N-嗎啉-2-羥基丙磺酸(MOPSO)、乙酸、乙酸鹽緩衝劑與類似物、磷酸與磷酸鹽緩衝劑，以及檸檬酸與檸檬酸鹽緩衝劑組成之群中的至少一者。 116. 實施例114或實施例115之組合物，其中醣類包含選自由單醣、雙醣、三醣、寡糖和多醣組成之群中的至少一者，較佳地選自葡萄糖、海藻糖和蔗糖。 117. 如實施例114至116中任一項之組合物，其中低溫保護劑包含選自由二醇(諸如乙二醇、丙二醇)和甘油組成之群中的至少一者。 118. 如實施例114至117中任一項之組合物，其中螯合劑包含EDTA。 119. 如實施例76至118中任一項之組合物，其進一步包含醫藥上可接受的載劑。 120. 如實施例119之組合物，其被配製用於肌肉內、靜脈內、皮內及/或皮下投藥，諸如藉由注射。 121. 一種套組，其包含如實施例1至43中任一項之核酸、如實施例44至75中任一項之系統，或如實施例76至120中任一項之組合物，視情況與其使用說明書組合。 122. 如實施例121之套組，其中由如實施例44至75中任一項之系統或如實施例76至120中任一項之組合物包含的第一核酸和第二核酸位於不同容器中。 123. 如實施例1至43中任一項之核酸、如實施例44至75中任一項之系統、如實施例76至120中任一項之組合物，或如實施例121或實施例122之套組，其用於治療。 124. 如實施例1至43中任一項之核酸、如實施例44至75中任一項之系統、如實施例76至120中任一項之組合物，或如實施例121或實施例122之套組，其用於治療或預防疾病的方法中，較佳地其中個體是哺乳動物，更佳地哺乳動物是人類，該方法包含向個體分別投予核酸、系統、組合物或套組。 125. 如實施例124使用之核酸、系統、組合物或套組，其中投予核酸、系統、組合物或套組分別包含肌肉內、靜脈內、皮內或皮下投藥，諸如藉由肌肉內、靜脈內、皮內或皮下注射。 126. 如實施例125使用之核酸、系統、組合物或套組，其中注射使用針或使用無針注射裝置。 127. 如實施例124至126中任一項使用之核酸、系統、組合物或套組，其中投藥包含藉由肌肉內注射投藥，較佳地使用針頭。 128. 如實施例124至127中任一項所使用的核酸、系統、組合物或套組，其中核酸分子分別投予，較佳地藉由相同的投藥路徑。 129. 如實施例124至128中任一項使用之核酸、系統、組合物或套組，其中疾病為個體的細菌、病毒、寄生蟲或真菌感染、心血管疾病或癌症。 130. 一種用於在個體中治療或預防細菌、病毒、寄生蟲或真菌感染的方法，該方法包含向個體投予如實施例1至43中任一項之核酸、如實施例44至75中任一項之系統、如實施例76至120中任一項之組合物，或如實施例121至122中任一項之套組。 131. 一種用於在個體中治療或預防癌症的方法，該方法包含向個體投予如實施例1至43中任一項之核酸、如實施例44至75中任一項之系統、如實施例76至120中任一項之組合物，或如實施例121或實施例122的套組。 132. 一種包含兩個RNA分子的系統，其中 第一RNA分子是非可複製mRNA分子，其編碼經修飾RNA依賴性RNA聚合酶(複製酶)並且不編碼任何病毒結構蛋白，並且其中與相應未經修飾聚合酶的反式複製活性相比，該聚合酶具有增加的反式複製活性，且 第二RNA分子是可複製RNA分子，其包含功能性核苷酸序列且不包含編碼RNA依賴性RNA聚合酶的核苷酸序列，而且其能夠被第一RNA分子編碼的經修飾聚合酶反式複製。 133. 一種編碼RNA依賴性RNA聚合酶的核酸分子，其包含SEQ ID NO：4中所示的序列。 134. 一種治療或預防疾病的方法，其中該疾病是個體的細菌、病毒、寄生蟲或真菌感染或癌症，其包含同時或分別向個體投予兩種RNA分子，其中 第一RNA分子是非可複製mRNA分子，其編碼經修飾RNA依賴性RNA聚合酶(複製酶)並且不編碼任何病毒結構蛋白，並且其中與相應未經修飾聚合酶的反式複製活性相比，該聚合酶具有增加的反式複製活性，且 第二RNA分子是可複製RNA分子，其包含功能性核苷酸序列且不包含編碼RNA依賴性RNA聚合酶的核苷酸序列，而且其能夠被第一RNA分子編碼的經修飾聚合酶反式複製，其中功能性核苷酸序列編碼治療或預防疾病之基礎的胺基酸序列。 135. 一種經修飾RNA依賴性RNA聚合酶，其包含SEQ ID NO：4中所示的胺基酸序列。 136. 如實施例135之經修飾聚合酶，其是經純化的。 137. 一種細胞，其包含前述實施例中任一項之第一核酸和第二核酸，或包含如實施例135之經修飾聚合酶。 138. 如實施例137之細胞，其是經分離的
圖1. 例示性複製酶變體的概述。(A)示意圖顯示VEEV複製酶的非結構多蛋白前體(nsP) 1-4。指出了本文所用複製酶中被取代的位置。(B)與親代VEEV TRD病毒株的複製酶(EGT-複製酶)相比，總結本發明複製酶(EGS-複製酶、QRT-複製酶、QRS-複製酶)中的胺基酸序列改變的表。EGT-複製酶是衍生自VEEV特立尼達驢(TRD)病毒株，並且在位置747處具有麩胺酸(E)、在位置1360處具有甘胺酸(G)以及在位置1589處具有蘇胺酸(T)。EGS-複製酶的T1589取代變成絲胺酸(S)1589；QRT複製酶的E747取代變成麩醯胺酸(Q)747且G1360取代變成精胺酸(R)1360；QRS複製酶的取代為E747Q、G1360R和T1589S。(C)帶有所示取代之EGT-複製酶、EGS-複製酶、QRT-複製酶和QRS-複製酶的nsP1、nsP2和nsP3序列(直到第一個終止密碼子)的序列比對。在比對中，「.」表示相同殘基。 圖2. 在BHK21細胞中，saRNA和taRNA系統中EGT-複製酶和EGS-複製酶的相反活性。將編碼指定複製酶和分泌型奈米螢光素酶的saRNA (上圖)，或由編碼指定複製酶的mRNA和編碼分泌型奈米螢光素酶的反式複製子(TR)組成的taRNA (下圖)以三種不同劑量(100、20和4 ng)脂轉染至BHK21細胞中。在指定時間點測量72小時(h)內的螢光素酶活性。a.u.=任意單位。 圖3. 在C2C12細胞中，saRNA和taRNA系統中EGT-複製酶和EGS-複製酶的相反活性。將編碼所示複製酶和分泌型奈米螢光素酶的saRNA (上圖)，或由編碼所示複製酶的mRNA和編碼分泌型奈米螢光素酶的TR組成的taRNA (下圖)以三種不同劑量(100、20和4 ng)脂轉染至C2C12細胞中。在指定時間點測量72小時(h)內的螢光素酶活性。a.u.=任意單位。 圖4. 在HFF細胞中，saRNA和taRNA系統中EGT-複製酶和EGS-複製酶的相反活性。將編碼所示複製酶和分泌型奈米螢光素酶的saRNA (上圖)，或由編碼所示複製酶的mRNA和編碼分泌型奈米螢光素酶的TR組成的taRNA (下圖)以三種不同劑量(100、20和4 ng)脂轉染至HFF細胞中。在指定時間點測量72小時(h)內的螢光素酶活性。a.u.=任意單位。 圖5. 在saRNA和taRNA系統的背景中，EGT-複製酶和QRT-複製酶的相反活性。BHK細胞(上圖)或HFF細胞(下圖)以(i)左圖：編碼所示複製酶和報導基因GFP-SecNLuc (1 µg)的saRNA，或(ii)右圖：由編碼指定複製酶的mRNA (250 ng)和編碼GFP與SecNLuc的NTR (TC-83 + 3xMut) (2 ng)的taRNA，連同編碼NS1的mRNA (500 ng)脂轉染。轉染後24小時測量螢光素酶活性。 圖6. QRT-複製酶比EGT-複製酶更有效率地複製奈米反式複製子(NTR)。以由編碼指定複製酶的1 µg mRNA和(i)上圖：編碼螢火蟲螢光素酶的0.05 µg NTR (TRD)，或(ii)下圖：編碼螢火蟲螢光素酶的0.05 µg NTR (TC-83 + 3xMut)組成的taRNA對K-562細胞進行電穿孔。(A)轉染後24小時藉由發光偵測來評估螢光素酶表現。(B)在8小時時程實驗中，於轉染後的指定時間點藉由發光偵測來評估螢光素酶水平。(C)在6小時時程實驗中，於轉染後的指定時間點藉由qPCR分析來評估螢光素酶水平。 圖7. 新穎QRS複製酶比EGS複製酶或QRT複製酶更有效。K-562細胞以80 ng指定複製酶的mRNA與編碼螢火蟲螢光素酶的NTR組合進行脂轉染。轉染後24小時測量螢光素酶活性。(A)使用0.2 ng的NTR (TC-83 + 3xMut)，(B)使用0.2 ng的NTR (TRD)，(C)使用0.02 ng的NTR (TC-83 + 3xMut)，(D)使用0.02 ng的NTR (TRD)。 圖8. 複製酶變體在活體內的效用。在施用前，將編碼流感病毒血球凝集素的反式複製子(TR-HA)和編碼不同複製酶(REPL)的核苷修飾mRNA分別配製在LNP內，並以1：100的莫耳比(0.4 ng TR-HA + 99.6 ng REPL)混合。BALB/c小鼠(每組n=5隻)在第0天和第28天肌肉內注射配製的RNA。複製缺陷型REPL (未經修飾的mRNA)與TR-HA充當陰性對照。在免疫前(第0天)，與初次免疫後第14天和第28天，以及加強免疫後(第49天)收集血清樣品。(A) HA特異性IgG作為B細胞反應的標記。將生物素化重組HA蛋白塗覆到經鏈黴親和素塗覆的盤上，與稀釋血清(1：2700稀釋；初次免疫後第49天分離)和HRP偶聯二級抗體一起培育。測量在460 nm和620 nm處的吸附並計算ΔOD。各個ΔOD值以點表示；組平均值以水平條表示。(B) (C)使用初次免疫後第49天分離的脾細胞進行ELISpot分析。用MHC I特異性HA-肽池(B)或非特異性肽(C) (作為陰性對照)刺激脾細胞。測量IFN-γ分泌以評估T細胞反應。單個點計數以點顯示；組平均值以空心條(±SEM)表示。 圖9. 目標減量需要STR-miR的複製，且複製酶活性決定減量的程度。穩定表現螢火蟲螢光素酶的BHK-21細胞(BHK-luc)以1.1 pM所示縮短的反式複製子(STR)-miR進行電穿孔，並與0.4 pM的不活化複製酶(不活化-REPL)、VEEV-TRD的EGT複製酶(TRD-REPL)或QRT-複製酶(QRT-REPL)共遞送。對照細胞是在沒有RNA的情況下進行電穿孔(模擬)。(A)目標基因表現。在指定時間點測量螢光素酶表現，並相對於模擬電穿孔BHK-Luc細胞的螢光素酶表現(n=3的平均值(SD))進行標準化。以雙向ANOVA檢定統計顯著性；與模擬對應，*， P＜0.1；**， P＜0.01；***， P＜0.001；****， P＜0.0001，且ns，不顯著。(B)細胞生存力和增生。在轉染後的指定時間點測定BHK-luc細胞的生存力(n=3的平均值(SD))。luc，螢光素酶；RLU，相對光單位；VEEV，委內瑞拉馬腦炎病毒；TRD，特立尼達驢病毒系。 圖10. 在用QRT-複製酶共轉染的細胞中增強STR-miR媒介的emGFP表現。穩定表現螢火蟲螢光素酶的BHK-21細胞(BHK-luc)以1.1 pM所示STR-miR進行電穿孔，並與0.4 pM的不活化複製酶(不活化-REPL)、EGT複製酶(TRD-REPL)或QRT-複製酶(QRT-REPL)或無RNA (模擬)共遞送。轉染後24小時，以流動式細胞測量術測定emGFP陽性細胞的比率和emGFP平均螢光(MFI)。將emGFP陽性細胞的比率乘以emGFP陽性細胞的MFI來估算總GFP表現。 圖11. 帶有QRS-REPL的(奈米)反式複製子的免疫原性。編碼流感病毒血球凝集素(HA)之含有尿苷(U)或N1-甲基-假尿苷(m1Y)的奈米反式複製子(NTR)，以及編碼EGT複製酶(wt-REPL)或QRS複製酶(QRS-REPL)的不同核苷修飾mRNA分別配製在LNP中，並以1：1的莫耳比混合(22 ng NTR-HA + 78 ng REPL)。BALB/c小鼠(每組n=5隻)在第0天和第28天肌肉內注射配製的RNA。在免疫前(第0天)，與初次免疫後第14天和第28天，以及加強免疫後(第49天)收集血清樣品。(A)隨著時間推移的每組血清轉換率。將生物素化的重組HA蛋白塗覆到經鏈黴親和素塗覆的盤上，與稀釋血清和HRP偶聯的二級抗體一起培育。測量在460 nm和620 nm處的吸附並計算ΔOD。各個ΔOD值以符號表示；組平均值以水平條(±SEM)表示。(B)隨著時間推移的病毒中和抗體滴度。將連續稀釋的血清與傳染性流感病毒一起培育，轉移至MDCK細胞並培育3天。經由凝血分析確定病毒中和作用。顯示單個效價(符號)，組平均值以水平條(±SEM)表示。(C)使用初次免疫後第49天分離的脾細胞進行ELISpot分析。以MHC I和MHC II特異性HA肽池刺激脾細胞，使用非特異性肽池作為陰性對照(數據未顯示)。測量IFN-γ分泌來評估T細胞反應。單個點計數以符號顯示；組平均值以水平條(±SEM)表示。數量太多無法計數的點計數設定為1000。 圖12. 在先天免疫抑制劑存在下，帶有QRS-REPL的taRNA的免疫原性。編碼流感病毒血凝素(HA)的奈米反式複製子(NTR，含有N1-甲基-假尿苷)、編碼QRS-REPL的核苷修飾mRNA和編碼先天免疫抑制劑NS1、NS或E3的核苷修飾mRNA分別配製在LNP並以1：100的莫耳比混合(或1：100：100與抑制劑，0.2 ng NTR + 74 ng QRS-REPL + 11 ng NS1或13 ng NS或10 ng E3)。BALB/c小鼠(每組n=5隻)在第0天和第28天肌肉內注射配製的RNA。在免疫前(第0天)，與初次免疫後第14天和第28天，以及加強免疫後(第49天)收集血清樣品。(A)隨著時間推移的每組血清轉換率。將生物素化的重組蛋白塗覆到經鏈黴親和素塗覆的盤上，與稀釋血清和HRP偶聯的二級抗體一起培育。測量在460 nm和620 nm處的吸附並計算ΔOD。各個ΔOD值以符號表示；組平均值以水平條(±SEM)表示。(B)在第49天的病毒中和抗體滴度。將連續稀釋的血清與傳染性流感病毒一起培育，轉移至MDCK細胞並培育3天。經由凝血分析確定病毒中和作用。顯示單個效價(符號)，組平均值以水平條(±SEM)表示。(C)使用初次免疫後第49天分離的脾細胞進行ELISpot分析。以MHC I和MHC II特異性HA-肽池刺激脾細胞，使用非特異性肽池作為陰性對照(數據未顯示)。測量IFN-γ分泌來評估T細胞反應。單個點計數以符號顯示；組平均值以水平條(±SEM)表示。使用不活化複製酶 (REPL mut)作為對照。
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Claims (27)

  1. 一種編碼經修飾RNA依賴性RNA聚合酶(複製酶)的核酸分子，其中與相應未經修飾聚合酶的反式複製活性相比，該聚合酶具有增加的反式複製活性，其中相應未經聚合酶包含SEQ ID NO：1中所示的胺基酸序列，且其中經修飾聚合酶在對應於SEQ ID NO：1的位置747、1589和1360的胺基酸位置處包含取代。
  2. 如請求項1之核酸，其中該核酸分子未編碼任何病毒結構蛋白。
  3. 如請求項1或請求項2之核酸，其中該經修飾聚合酶具有： (a) 與其順式複製活性相比增加的反式複製活性；及/或 (b) 與相應未經修飾聚合酶的順式複製活性相比，具有減少的順式複製活性。
  4. 如請求項1至3中任一項之核酸，其中該聚合酶衍生自α病毒，視情況其中α病毒是選自由委內瑞拉馬腦炎病毒、東部馬腦炎病毒、西部馬腦炎病毒、屈公病毒、塞姆利基森林病毒、辛德比斯病毒、巴爾馬森林病毒、米德爾堡病毒和恩杜穆病毒組成之群。
  5. 如請求項1至4中任一項之核酸，其中該經修飾聚合酶與相應未經修飾聚合酶具有至少90%但非100%序列同一性。
  6. 如請求項1至5中任一項之核酸，其中經修飾聚合酶： (a) 在SEQ ID NO：1的位置1589處具有絲胺酸(S)； (b) 在SEQ ID NO：1的位置747處具有麩醯胺酸(Q)； (c) 在SEQ ID NO：1的位置1360處具有精胺酸(R)； (d) 在SEQ ID NO：1的位置747處具有麩醯胺酸(Q)，且在SEQ ID NO：1的位置1360處具有精胺酸(R)；及/或 (e) 在SEQ ID NO：1的位置747處具有麩醯胺酸(Q)、在SEQ ID NO：1的位置1360處具有精胺酸(R)，且在SEQ ID NO：1的位置1589處具有絲胺酸(S)。
  7. 如請求項1至6中任一項之核酸，其中該核酸包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中所示胺基酸序列的編碼序列。
  8. 如請求項1至7中任一項之核酸，其中該經修飾聚合酶是VEEV衍生的經修飾聚合酶，其在對應於SEQ ID NO：1的位置747、1360和1589的各個胺基酸位置處包含取代突變；視情況其中取代突變包含E747Q、G1360R和T1589S。
  9. 如請求項1至8中任一項之核酸，其中相比於包含SEQ ID NO：2及/或SEQ ID NO：3中所示胺基酸序列的經修飾聚合酶，該經修飾聚合酶具有增加的反式複製活性。
  10. 如請求項1至9中任一項之核酸，其中該核酸為RNA，視情況為mRNA。
  11. 如請求項1至10中任一項之核酸，其中反式複製活性是複製能夠被經修飾聚合酶複製並且不編碼任何RNA依賴性RNA聚合酶的RNA分子的能力。
  12. 一種系統，包含 兩個核酸分子， 其中第一核酸分子是如請求項1至11中任一項之核酸分子，且 其中第二核酸分子是包含功能性核苷酸序列且不包含編碼RNA依賴性RNA聚合酶之核苷酸序列的可複製RNA分子，該第二核酸分子能夠被第一核酸分子所編碼的經修飾聚合酶反式複製。
  13. 如請求項12之系統，其中第一核酸分子和第二核酸分子各自是RNA分子。
  14. 如請求項12或請求項13之系統，其中功能性核苷酸序列是編碼感興趣胺基酸序列的核苷酸序列； 視情況其中該感興趣胺基酸序列選自由以下組成之群：免疫原性蛋白，較佳地衍生自細菌、病毒、真菌或寄生蟲的免疫原性蛋白或其片段；抗體或其片段；治療性蛋白；多能性因子或分化因子；以及報導蛋白；視情況其中免疫原性蛋白或其片段是抗原或其表位，較佳地T細胞表位。
  15. 如請求項12至14中任一項之系統，其中第一核酸分子是mRNA。
  16. 如請求項12至15中任一項之系統，其中功能性核苷酸序列側接5'非轉譯區(UTR)及/或3' UTR。
  17. 如請求項12至16中任一項之系統，其中第二核酸分子： (a) 是包含5'帽、5'調節區、5'複製辨識序列、3'複製辨識序列及/或聚(A)序列的RNA分子； (b) 包含5'複製辨識序列，其特徵在於與天然5'複製辨識序列相比，移除了至少一個起始密碼子；及/或 (c) 包含3'複製辨識序列。
  18. 如請求項12至17中任一項之系統，其中5'及/或3'複製辨識序列衍生自自我複製型病毒，較佳地相同的自我複製型病毒物種。
  19. 如請求項12至18中任一項之系統，其進一步包含第三或更多可複製RNA分子，其可被第一核酸分子編碼的RNA依賴性RNA聚合酶複製；視情況其中第三或更多可複製RNA分子包含與第二核酸中所含者不同的功能性核苷酸序列。
  20. 如請求項12至19中任一項之系統，其進一步包含編碼免疫逃脫蛋白的核酸分子，視情況其中免疫逃脫蛋白是選自由以下組成之群：牛痘病毒免疫逃脫蛋白，較佳地E3或B18；包含托斯卡納病毒NS蛋白或托斯卡納病毒NS蛋白的功能變體的病毒衍生因子；以及流感NS1蛋白，較佳地禽流感(AIV) NS1蛋白。
  21. 如請求項20之系統，其中第三核酸分子是mRNA。
  22. 如請求項20或21之系統，其中第三核酸分子編碼包含選自SEQ ID NO：17 (NS1蛋白)或SEQ ID NO：18 (NS蛋白)之序列的免疫逃脫蛋白。
  23. 一種組合物，其包含如請求項1至11中任一項之核酸分子或包含如請求項12至22中任一項之系統；以及能夠與核酸分子形成顆粒的試劑。
  24. 如請求項23之組合物，其中核酸分子是RNA分子。
  25. 如請求項23或請求項24之組合物，其中試劑是或包含陽離子或陽離子可電離脂質或陽離子聚合物，諸如聚亞烷基亞胺。
  26. 如請求項23至25中任一項之組合物，其中由至少一種RNA分子和試劑形成的顆粒是脂質奈米顆粒(LNP)、脂質複合物(LPX)，脂質體或基於聚合物的聚合複合物(PLX)。
  27. 如請求項1至11中任一項之核酸、如請求項12至22中任一項之系統，或如請求項23至26中任一項之組合物，其用於治療或預防疾病的方法中，該方法包含分別向個體投予該核酸、系統或組合物；視情況其中疾病為細菌、病毒、寄生蟲或真菌感染、心血管疾病，或癌症。
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