TW202526012A - 改良整合酶 - Google Patents

Abstract

本發明涉及用於產生標靶特異性大絲胺酸重組酶(LSR)之方法，該方法包含以下步驟：a)藉由將一或多個突變引入編碼LSR之序列中來產生LSR之多個第一變體;b)產生表現載體文庫，其中每個表現載體包含編碼LSR之第一變體之一的第一區域，及包含LSR之至少兩個第一標靶位點之第二區域，其中該兩個第一標靶位點彼此不同；c)將表現載體文庫導入宿主細胞；d)培養宿主細胞並表現第一變體LSR；e)從宿主細胞培養物中分離質體DNA；f)確定該兩個第一標靶位點間該表現載體之第二區域的部分是否已被變體LSR切除；g)藉由將一或多個突變引入編碼彼等第一LSR變體之序列中來產生多個第二LSR變體，該第一LSR變體切除兩個第一標靶位點間表現載體之第二區域的部分；h)視需要以至少一個第二標靶位點重複步驟b)至f)，其中該至少一個第二標靶位點在至少一個核苷酸上不同於第一標靶位點。本發明進一步提供了藉由此方法獲得之變體LSR、編碼變體LSR之核酸或核酸組、包含該核酸之載體；用於將供體DNA整合到標靶核酸中之系統；以及LSR、核酸或載體之用途。

Description

改良整合酶

本發明涉及產生標靶特異性大絲胺酸重組酶(也稱為整合酶)之方法。本發明還涉及藉由該方法獲得之大絲胺酸重組酶變體及包含該變體之系統、編碼該變體之核酸、表現該核酸之載體，以及該大絲胺酸重組酶用於將供體核酸序列整合到標靶核酸序列(較佳為到個體或細胞之基因體)中之用途。

基因體整合是將外源DNA引入生物體基因體之過程，是分子生物學及基因工程之基本技術。在醫學及生物技術領域，精確操縱基因體之能力對於治療、疾病研究及生物製藥生產之進步至關重要。

基因體編輯之一個重要面向是將遺傳負載(genetic payloads)定點整合(site-specific integration)到所欲之基因體基因座中。在精確之基因體位置整合大量遺傳負載具有許多優勢，例如標靶基因療法、精確之基因調控以及為各種研究及工業目的創建基因改造生物。標靶整合允許使用者將轉基因插入有利於穩定、長期表現之基因座。它有助於避免強烈之位置效應並減少對細胞功能之不良影響，以及控制每個整合事件之拷貝數。然而，實現大DNA片段之標靶位點特異性整合仍然是當前基因體編輯方法中之重大挑戰，目前需要時間及資源密集型之低效、多步驟過程(Anzalone等人，2022；Yarnall等人，2023；Zhu等人，2014)。

大絲胺酸重組酶(LSR)，也稱為整合酶，已成為促進精確有效基因體整合非常有價值之工具。它們是在溫和噬菌體基因體或移動元件中編碼之酵素家族，它們以高度可控及可預測之方式精確切割及重組DNA。在噬菌體整合中，LSR作用於特定位點，即噬菌體中之attP位點及宿主染色體中之attB位點，其中切割及鏈交換導致整合之原噬菌體(prophage)兩側是重組位點attL及attR。為了進行整合，LSR不需要任何額外之因素、輔助DNA序列或特定之基質拓撲(Smith，2015)。第一個在體外重組系統中研究的LSR是來自鏈黴菌噬菌體(Streptomyces phage) PhiC31 (Thorpe及Smith，1998)及分枝桿菌噬菌體(Mycobacteriophage) Bxb1 (Kim等人，2003)之整合酶。

整合酶通常由DNA切割及重新連接所需之相對保守催化N端結構域(1–140 aa)、「重組酶」結構域及鋅帶結構域(zinc ribbon domain)組成。催化結構域與「重組酶」結構域係藉由長αE螺旋連接，且「重組酶」結構域與鋅帶結構域係藉由短接頭連接。「重組酶」結構域及鋅帶結構域統稱為C端結構域，大小範圍為319至約550個胺基酸。鋅帶結構域含有一個長而可撓之捲曲螺旋基序，與額外之結合特異性及不切除輔因子之正向整合反應之不可逆性有關(Van Duyne及Rutherford綜述，2013；Smith，2015)。

LSR使用之附著位點包含其同源整合酶之結合位點；沒有宿主或與附著位點結合之輔助因子。attP及attB位點顯示出相對簡單之結構，通常小於50 bp，交叉位點位於中心，兩側是不完美之反向重複序列。重組後形成之位點稱為attL及attR，並含有來自attP及attB之一半位點。LSR之重組具有很強之方向性。只有attB及attP位點會發生重組；所得到之attL及attR位點在缺乏切除所需之噬菌體編碼因子之情況下係為無活性，並且沒有其他位點配對(例如attB及attB)會產生重組產物(Ghosh等人，2005；Rutherford等人，2013；Thorpe等人，2000；Smith，2015)。

LSR家族提出以下重組機制：整合酶以二聚體形式與其標靶附著位點結合，然後形成四聚體，將DNA位點聚集在一起形成突觸複合體(synaptic complex)。在該複合物中，所有四個亞基同時被活化，催化絲胺酸殘基同時斷裂所有四個DNA鏈。當兩個整合酶亞基相對於其他兩個次單元旋轉180°時，每個切割末端仍與整合酶單體共價結合，這個過程稱為次單元旋轉。如果attP及attB位點之中心二核苷酸相同，整合酶會將新對齊之DNA鏈連接在一起，從而完成該過程。如果中心二核苷酸不匹配，則它們不會進行連接，並且整合酶會繼續旋轉，直到恢復原始之attP及attB位點(Bai等人，2011；Rutherford等人，2013；Smith，2015)。

大量研究證明了大絲胺酸重組酶作為基因體工程工具之功效(Groth等人，2004；Keravala等人，2006；Low等人，2022；Olivares等人，2001；Russe等人，2006；Thomason等人，2001；Yamaguchi等人，2011；Xu等人，2008)。它們已廣泛用於多種生物體中之標靶基因插入，包括細菌、酵母、植物及哺乳動物細胞。這些酵素具有出色之能力，可以高效、準確地整合從數千鹼基到幾兆鹼基之大型遺傳負載。

然而，一個重要之障礙在於整合酶通常依賴預定之標靶位點，而這些位點並不天然存在於人類基因體或其他感興趣之基因體中。這種限制阻礙它們在複雜生物系統中之位點特異性整合之應用。

鑑於這項挑戰，研究人員採取了一種策略，將整合酶野生型標靶位點整合到基因體中，然後將其用作進一步基因體操作之登陸平台(Anzalone等人，2022；Yarnall等人，2023)。這種方法允許隨後在人工創建之標靶位點上整合所需之遺傳負載，並提高特異性。然而，這種方法依賴於具有多種酶之複雜機械，這使得整個構建體難以以目前之遞送方法引入細胞中。此外，所涉及之所有不同酶都可能導致額外之脫靶事件。

替代方法包括在可用之宏觀基因體(metagenome)資料集中搜尋具有所需標靶位點識別功能之酵素(Durrant等人，2023)，或尋找可以作用於偽位點(pseudo-sites)之更靈活的酵素。偽位點是人類基因體中與酵素之天然標靶位點具有一定相似性之標靶位點，因此可用於整合(Thyagarajan等人，2001)。然而，在宏觀基因體資料庫中搜尋整合酶也需要對每個標靶位點之新酶進行詳細表徵，如果找到合適之整合酶，這可能非常耗費資源及時間。同時，重新利用酵素來識別額外之假位點會導致高脫靶活性之風險增加，限制了可能之治療應用。

為了能夠在使用者定義之標靶序列上進行直接及位點特異性整合，有必要修改大絲胺酸重組酶並改變其標靶位點特異性。然而，人們對DNA識別所涉及的3D結構及定域之認知甚少，這對合理設計提出了挑戰。LSR之修飾進一步受到其天然標靶位點複雜性之阻礙，這些標靶位點通常是不對稱且非重複。由於特異性定義規則如此模糊，因此本領域需要開發一種新的無偏且開放之方法以能夠改變LSR之標靶位點偏好或進一步提高LSR之活性及/或效率。還需要大絲胺酸重組酶之新變體，其允許將所欲DNA序列引入個體基因體中之特定位點處。

本發明之基本目的係藉由提供一種用於產生標靶特異性大絲胺酸重組酶(LSR)之方法來解決，該方法包含以下步驟： a)藉由將一或多個突變引入編碼LSR之序列中來產生LSR之多個第一變體； b)產生表現載體文庫，其中每個表現載體包含第一區域及第二區域，該第一區域包含編碼LSR之第一變體之一的序列，該第二區域包含LSR之至少兩個第一標靶位點，其中該兩個第一標靶位點彼此不同； c)將表現載體文庫導入宿主細胞； d)培養宿主細胞並表現LSR之第一個變體； e)從宿主細胞培養物中分離質體DNA； f)確定該兩個第一標靶位點間該表現載體之第二區域的部分是否已被第一變體LSR切除； g)藉由將一或多個突變引入編碼彼等第一LSR變體之序列中來產生多個第二LSR變體，該第一LSR變體切除該至少兩個第一靶位點間該表現載體之第二區域的部分； h)視需要以至少一個第二標靶位點重複步驟b)至f)，其中該至少一個第二標靶位點在至少一個核苷酸上不同於第一靶位點。

根據一實施例，該方法進一步包含重複步驟g)及h)之步驟，較佳地其中步驟g)及h)重複至少兩次至至少30次。

根據另一實施例，步驟a)中作為多個第一變體LSR之基礎的LSR是天然存在之LSR。

根據一實施例，表現載體之第二個區域中之兩個標靶位點間隔至少50個核苷酸。

根據一實施例，確定步驟f)包含(i)對表現載體之第一及第二區域進行定序，或(ii)對包含兩個標靶位點之表現載體之序列進行限制消化，然後分析消化片段。

根據較佳之實施例，該方法進一步包含從表現載體文庫中去除變體LSR之無活性變體之步驟。

根據較佳之實施例，編碼LSR之序列中之一或多個突變係使用易錯PCR (error-prone PCR)藉由隨機誘變引入。

根據進一步之實施例，該載體上之第一區域尚包含獨特之分子標識。

根據一個實施例，該方法尚包含以下步驟中之一或多個： (i)將獨特之分子標識進行聚類， (ii)產生及完善(polishing)一致序列(consensus sequences)， (iii)確定每種變體LSR酶之DNA修飾事件的數量； (iv)確定每個LSR變體之活性率；及/或 (v)從請求項1之步驟a)或步驟g)至h)產生之變體LSR中選擇標靶特異性LSR，其切除兩個感興趣之變體標靶位點間表現載體上第二區域之DNA序列。

根據一個較佳實施例，該表現載體係為pEVO載體。

根據另一方面，本發明提供一種可藉由本發明之方法獲得或獲自本發明方法之變體大絲胺酸重組酶(LSR)，其中該變異LSR之胺基酸序列與在步驟a)中產生變異LSR之胺基酸序列以及與任何其他天然存在大絲胺酸重組酶之胺基酸序列有至少一個胺基酸不同。根據較佳之實施例，該變體包含與SEQ ID NO: 14、17至35、38至56、60至8391、8395、8398至8403、8406至8412、8415至8422、8425至8429及8430至13115之一具有至少85%同一性之胺基酸序列或由其組成。

根據一實施例，變體LSR係選自由A118、TP901、φRV1(也稱為PhiRv1)、Bxb1、φC31、R4、Wβ、Tnpx、Cp36、Dn29、Kp03、Nm60、Pa01、Si74所組成之群的LSR變體。

根據另一方面，本發明提供一種編碼根據本發明變異LSR之核酸或核酸組。

根據另一方面，本發明提供一種包含本發明核酸或核酸組之表現載體。

根據另一方面，本發明提供一種用於將供體DNA整合到標靶核酸中之系統，該系統包含多肽，該多肽包含根據本發明之變體LSR，或編碼其之核酸，以及待插入標靶核酸中之供體核酸。

根據另一方面，本發明提供一種醫藥組合物，其包含本發明之變體LSR、本發明之核酸或核酸組、或本發明之表現載體，以及視需要藥學上可接受之載劑。

根據另一個方面，本發明提供一種本發明之變體LSR、本發明之核酸或核酸組、本發明之表現載體、本發明之系統或本發明之醫藥組合物之用途，其係用於將感興趣之核酸序列整合到個體或細胞之基因體中，其中該細胞較佳不包括人種系之細胞。

根據另一方面，本發明提供用作藥物之本發明之變體LSR、本發明之核酸或核酸組、本發明之表現載體或本發明之醫藥組合物。

根據另一方面，本發明提供了供本發明使用之變體LSR、供本發明使用之核酸或核酸組、供本發明使用之表現載體、或供本發明使用之醫藥組合物，其係用於治療遺傳疾病或病症。該遺傳疾病或病症較佳係為單一遺傳疾病或病症(monogenetic disease or disorder)。根據所附申請專利範圍及下面之詳細描述，本發明之另外態樣及實施例將變得顯而易見。

序列表

本文提及之序列詳細揭示在所附序列表中。本發明之例示性且同時較佳之序列也在說明書之以下詳細部分之表2至5中列出。

在下面詳細描述本發明之前，應理解，本發明不限於本文所述之特定方法、方案及試劑，因為這些可以變化。也應理解，本文中使用之術語僅是為了描述特定實施態樣之目的，並且不旨在限制本發明之範圍，本發明之範圍僅由所附申請專利範圍限制。除非另有定義，本文使用之所有技術及科學術語具有與本領域普通技術人員通常理解之相同含義。

較佳地，本文使用之術語係定義於「A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)」，Leuenberger, H.G.W, Nagel, B.及Klbl, H.編輯(1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)。

貫穿本說明書及隨後之申請專利範圍，除非上下文另有要求，詞語「包含(comprise)」以及諸如「包含(comprises)」及「包含(comprising)」之變體將被理解為暗示包括所述之整數或步驟或整數組或步驟，但不排除任何其他整數或步驟或整數或步驟組。在以下段落中，更詳細地定義本發明之不同面向。如此定義之每個方面可以與任何其他一或多個方面組合，除非清楚地表明相反。指示為視需要、較佳或有利之任何特徵可以與指示為視需要、較佳或有利之任何其他特徵組合。

本說明書全文中引用了多個文件。本文引用之每個文件(包括所有專利、專利申請、科學出版物、製造商說明書、說明書等)，無論上文或下文，均藉由引用將其整體併入本文。本文中之任何內容均不應被解釋為承認本發明無權憑藉在先發明而早於此類公開。本文引用之一些文件之特徵是「藉由引用併入」。如果這些併入之參考文獻之定義或教導與本說明書中所引用之定義或教導之間存在衝突，則以本說明書之文本為準。

下文將描述本發明之元件。這些元件均以特定實施例列出；然而，應理解，它們可以任何方式及以任何數量進行組合以創建另外之實施例。各種描述之範例及較佳實施例不應被解釋為將本發明限於明確描述之實施例。該描述應被理解為支援並涵蓋將明確描述之實施例與任意數量之公開之及/或較佳之元件相結合之實施例。此外，除非上下文另有指示，否則本申請中所有描述之元件之任何排列及組合應被認為由本申請之描述公開。 定義

下面，提供本說明書中經常使用術語之一些定義。這些術語在其使用之每種情況下，在說明書之其餘部分中將具有分別定義之含義及較佳之含義。

如本說明書及所附申請專利範圍中所使用，單數形式「一」、「一種」及「該」包括複數指示物，除非內容另外明確指出。

「序列同一性之百分比」係藉由在比較視窗上比較兩個最佳比對之序列來確定，其中比較視窗中的序列部分與參考序列(其不包含添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(即缺口)，以實現兩個序列的最佳比對。藉由確定兩個序列中出現相同核酸鹼基或胺基酸殘基之位置數以產生匹配位置數，將匹配位置數除以比較視窗中之位置總數來計算百分比，將結果乘以100即可得出序列同一性之百分比。

術語「相同」在本文中在二或更多個核酸或多肽序列之上下文中使用，係指二或更多個序列或子序列相同，即包含相同之核苷酸或胺基酸序列。如果序列具有特定百分比之相同核苷酸或胺基酸殘基，則序列彼此為「相同」。根據本發明，至少60%相同包括與指定序列有至少61%、至少62%、至少63%、至少64%、至少65%、至少66%、至少67%、至少68%、至少69%、至少70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%，至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.2%、至少99.5%或至少99.7%同一性，當比較及比對時，使用以下序列比較演算法之一或藉由手動比對及目視檢查測量之比較視窗或指定區域上之最大對應性。這些定義也涉及測試序列之互補。因此，在整個說明書中關於多肽及多核苷酸序列比較使用術語「至少XY%序列同一性」。此表述較佳是指與對應參考多肽或對應參考多核苷酸相比至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.2%、至少99.5%或至少99.7%之序列同一性。

在本發明之上下文中，包含與給定SEQ ID NO具有至少80%同一性之胺基酸序列之蛋白質較佳意指該蛋白質與給定SEQ ID NO或與該SEQ ID NO反向互補的核酸序列具有至少85%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%、至少99.2%、至少99.5%或至少99.7%之序列同一性。

同樣地，在本發明之上下文中，與給定SEQ ID NO或與其反向互補之核酸序列具有至少60%序列同一性之核酸序列較佳意指該核酸與給定SEQ ID NO或與該SEQ ID NO反向互補之核酸序列具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%、至少99.2%、至少99.5%或至少99.7%之序列同一性。

本文所使用之術語「序列比較」是指其中一個序列充當參考序列，將其與測試序列進行比較之過程。當使用序列比較演算法時，將測試序列及參考序列輸入電腦，如果需要，指定子序列座標，並指定序列演算法程式參數。通常使用預設程式參數，或可以指定替代參數。然後，序列比較演算法根據程式參數計算測試序列相對於參考序列之序列同一性百分比。如果比較兩個序列且未指定要計算序列同一性百分比之比較參考序列，在沒有具體說明下，則將參考要比較之兩個序列中較長的一個來計算序列同一性。如果指明了參考序列，如果沒有另外具體指明，則基於本發明SEQ ID NO之一所指示之參考序列的全長來確定序列同一性。

用於比較之序列比對方法是本領域眾所周知者。用於比較之序列之最佳比對可以例如藉由Smith及Waterman (Adv. Appl. Math. 2:482, 1970)之局部同源演算法、藉由Needleman及Wunsch 1970之同源比對演算法、藉由搜尋來進行對於Pearson及Lipman 1988之相似性方法，藉由這些演算法之電腦化實現(例如，Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA)，或藉由手動對準及目視檢查(參見例如Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement))。適合確定序列同一性及序列相似性百分比之演算法是BLAST及BLAST 2.0演算法，這些演算法分別在Altschul 等人(Nuc. Acids Res. 25:3389-402, 1977)及Altschul等人(J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990)之論文中進行了描述。用於執行BLAST分析之軟體可藉由National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公開取得。該演算法首先藉由識別查詢序列中長度為W之短單字來識別高分序列對(HSP)，當與資料庫序列中相同長度之單字對齊時，這些短單字匹配或滿足某個正值閾值分數T。T被稱為鄰域詞得分閾值(Altschul等人，同上)。這些最初之鄰域單字命中充當啟動搜尋之種子，以找到包含它們之更長的HSP。單字命中沿著每個序列在兩個方向上延伸，直到可以增加累積對齊分數。對於核苷酸序列，使用參數M(一對匹配殘基之獎勵分數；始終＞0)及N(不匹配殘基之懲罰分數；始終＜0)來計算累積分數。對於胺基酸序列，使用評分矩陣來計算累積分數。在以下情況下，單字匹配在每個方向上之擴展都會停止：累積對齊分數從其最大實現值下降了數量X；由於一或多個負評分殘基比對之累積，累積分數降至零或更低；或到達任一序列之末端。BLAST演算法參數W、T及X決定了比對之靈敏度及速度。BLASTN 程式(對於核苷酸序列)使用預設字長(W) 11、期望值(E) 10、M=5、N=-4以及兩條鏈之比較。對於胺基酸序列，BLASTP 程式預設使用字長3、期望值(E) 10，以及BLOSUM62評分矩陣(參見Henikoff及Henikoff，1989)比對(B) 50、期望值(E) 10、M=5、N=-4，以及兩條鏈之比較。BLAST演算法也對兩個序列之間之相似性進行統計分析(參見，例如，Karlin及Altschul，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-87, 1993)。BLAST演算法提供之一種相似性度量是最小和機率 (P(N))，它提供了兩個核苷酸或胺基酸序列間偶然發生匹配機率之指示。例如，如果測試核酸與參考核酸之比較中之最小總機率小於約0.2，通常小於約0.01，且更通常小於約0.001，則認為核酸與參考序列相似。

術語「核酸」及「核酸分子」在本文中同義使用並且被理解為本領域廣泛接受者，即去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸鹼基或兩者之單鏈或雙鏈寡聚體或多聚體。本文所使用之術語「核酸」不僅包括去氧核糖核酸(DNA)及核糖核酸(RNA)，也包括所有其他線性聚合物，其中鹼基腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)以相應序列(核酸序列)排列。本發明也包含對應之RNA序列(其中胸腺嘧啶被尿嘧啶取代)、互補序列及具有修飾之核酸主鏈或3'或5'-末端之序列。然而，較佳為DNA形式之核酸。

術語「大絲胺酸重組酶」，縮寫為LSR，且術語「整合酶」(包括術語「整合酶蛋白」)在本文中可互換使用，並且係指能夠藉由將核酸整合到個體或細胞之基因體中來操縱基因體結構之酶。更具體地，該術語指能夠催化整合反應之各種酶。LSR是本領域已知者並且例如在Van Duyne等人，2013中描述，其藉由引用併入本文。整合酶較佳以單體、二聚體或四聚體之形式存在，特別是以二聚體之形式存在。兩個整合酶二聚體通常會一起作用來催化整合酶反應。二聚體及四聚體可以分別包含兩個或四個相同的整合酶蛋白質單體(同二聚體或同四聚體)，或者兩個或更多個不同之單體(異二聚體或異四聚體)。

術語「工程化DNA重組酶」是指已被進一步修飾之任何天然存在DNA重組酶，較佳是整合酶蛋白，例如如本文所述之演化，特別是修飾其標靶位點特異性及/或其活性及/或效率。

術語「標靶位點」(有時也稱為「附著位點」或「att」)是指LSR識別之特定核苷酸序列，並且在該序列處發生DNA斷裂及鏈交換。位點之命名歷來與其位置有關：attP位點存在於噬菌體基因體中，attB位點存在於細菌基因體中(Smith，2015)。這些序列之長度通常在30到200個鹼基對之間，交叉位點大多位於中心，兩側是不完美反向重複序列。

本文所使用之術語「標靶序列」或「標靶核酸」是指包含一或多個標靶位點例如attB位點之核酸序列，並且在其上形成LSR二聚體用於催化切除或整合反應。為了發生整合反應，將供體序列整合到標靶序列中。

如本文所用，術語「供體序列」或「供體核酸」係指待整合至細胞或個體之基因體中、特別是整合至其標靶序列中之核酸序列。供體序列包含一或多個標靶位點，例如attP位點，在其上形成LSR二聚體。

為了發生重組事件，整合酶以二聚體形式結合到標靶核酸及供體核酸上之標靶(附著)位點，然後一起形成四聚體，將DNA位點聚集在突觸複合體中，如圖2C所示。重組後形成之位點稱為attL (位於整合之左側或上游)及attR (位於整合之右側或下游)，並包含來自attP及attB之一半位點。

本文所使用的術語「治療有效量」係指研究人員、獸醫、醫生或其他臨床醫生所尋求在組織系統、動物或人中引起生物或醫學反應之活性化合物或藥劑的量，其包括減輕正在治療疾病或病症之症狀。

本文所使用之術語「醫藥組合物」係指用於識別、預防或治療疾病或組織狀態之物質及/或物質之組合。該醫藥組合物係被調配為適合施用於患者以預防及/或治療疾病。此外，醫藥組合物係指活性劑與惰性或活性載劑之組合，使得此組合物適合於治療用途。這樣之載劑也被稱為藥學上可接受者。醫藥組合物可依其化學及物理性質調配為用於口服、腸胃外、局部、吸入、直腸、舌下、透皮、皮下或陰道施用途徑。醫藥組合物包含固體、半固體、液體、透皮治療系統(TTS)。固體組合物係選自由片劑、包衣片劑、粉末、顆粒、丸劑、膠囊、泡騰片或透皮治療系統所組成之群。也包含液體組合物，其係選自由溶液、糖漿、輸注液、萃取物、用於靜脈施用之溶液、用於輸注之溶液或本發明載劑系統之溶液所組成之群。可用於本發明之半固體組合物包含乳劑、混懸劑、乳膏劑、洗劑、凝膠劑、小球劑、含服錠劑及栓劑。

如本文所用，術語「藥學上可接受」涵蓋人類及獸醫用途：例如，術語「藥學上可接受」涵蓋獸醫學上可接受之化合物或人類醫學及保健中可接受之化合物。

本文所用之術語「個體」是指動物，較佳為哺乳動物，最佳為人類。

本文所使用之術語「多個」包括由大於一之整數所述任意數量之事件。術語「多於一個」可以代替術語「多個」。

術語「LSR變體」與「LSR之變體」在本文中可互換使用，並且表示在至少一個胺基酸方面不同於LSR非變體之LSR，例如胺基酸取代，刪除或添加。 實施例之描述

本發明屬於大絲胺酸重組酶(LSR)領域。LSR，也稱為整合酶，係為本領域已知且例如描述於Van Duyne等人，2013中，其藉由引用併入本文。與酪胺酸重組酶相反，大絲胺酸重組酶催化單向整合反應。圖1示意性地說明了這種整合反應。粗體圓圈代表噬菌體基因體，具有噬菌體附著位點attP。線代表細菌基因體，帶有細菌附著位點attB。整合反應在整合酶存在之情況下進行，導致噬菌體基因體整合到細菌染色體中，兩側是兩個雜交att位點，稱為attL及attR。

大絲胺酸重組酶之典型結構域組織如圖2A所示。催化結構域(CD)位於蛋白質之N端部分，大小約140個胺基酸。在圖2A中，aE表示將CD連接至重組酶結構域(RD)及鋅帶結構域(ZD)之長α螺旋。RD及ZD之總大小為約300至500個胺基酸。遊離狀態下之LSR結構如圖2B所示，顯示LSR為緊湊之球狀二聚體，藉由催化結構域間之相互作用結合在一起。LSR整合反應之典型機制如圖2C所示。當標靶序列上之附著位點attP及供體序列上之附著位點attB各自與整合酶二聚體結合時，反應開始，然後藉由兩個整合酶二聚體之間之分子間結合發生突觸。DNA序列在中間被重組酶結構域切割並旋轉180°。連接所得互補之黏性末端。旋轉後，LSR二聚體與兩個新生成之附著位點attL及attR分離。

本發明提供第一種可靠且標靶之方法，用於提高大絲胺酸重組酶對其標靶序列之活性及/或效率，或用於改變大絲胺酸重組酶對基本上任何所需標靶序列及供體序列之特異性。

本發明提供一種產生標靶特異性大絲胺酸重組酶(LSR)之方法，該方法包含以下步驟： a)藉由將一或多個突變引入編碼LSR之序列中來產生LSR之多個第一變體； b)產生表現載體文庫，其中每個表現載體包含第一區域及第二區域，該第一區域包含編碼LSR之第一變體之一的序列，該第二區域包含LSR之至少兩個第一標靶位點，其中該兩個第一標靶位點彼此不同； c)將表現載體文庫導入宿主細胞； d)培養宿主細胞並表現LSR之第一個變體； e)從宿主細胞培養物中分離質體DNA； f)確定該兩個第一標靶位點間該表現載體之第二區域的部分是否已被第一變體LSR切除； g)藉由將一或多個突變引入編碼彼等第一LSR變體之序列中來產生多個第二LSR變體，該第一LSR變體切除該至少兩個第一靶位點間該表現載體之第二區域的部分； h)視需要以至少一個第二標靶位點重複步驟b)至f)，其中該至少一個第二標靶位點在至少一個核苷酸上不同於第一靶位點。

根據一實施例，該方法進一步包含重複步驟g)及h)之步驟，較佳地其中步驟g)及h)重複至少兩次至至少30次。即，步驟g)及h)較佳重複兩次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、13x、14x、15x、16x、17x、18x、19x、20x、21x、22x、23x、24x、25x、26x、27x、28x、29x、30x或更多，其中x表示次數。

根據本發明，LSR之變體—無論是第一、第二、第三或任何後續變異—與該已知、初始或起始LSR在至少一個胺基酸上不同。即，引入編碼LSR之序列中之一或多種突變分別導致至少一或多種胺基酸取代、缺失或添加，較佳導致至少一或多種胺基酸取代。因此，根據特別較佳之實施例，胺基酸突變是胺基酸取代。較佳地，變體與已知、初始或起始LSR之不同之處在於至少兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個胺基酸，較佳至少15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350或400個胺基酸。對於演化之LSR，根據本發明之較佳實施例產生之第一變體與已知之LSR在至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個或更多個不同胺基酸，較佳至少15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100個胺基酸。當重複此方法步驟g)產生LSR變體之步驟時，新變體(也稱為第二變體)較佳地與最初生成或第一LSR變體在至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個或更多個不同胺基酸，較佳至少15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100個胺基酸。這同樣適用於每個隨後之LSR變體，其較佳地在至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個胺基酸、較佳地至少15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100個胺基酸與先前之LSR變體不同。應理解，術語「第一LSR變體」表示起始LSR變體，並且術語「第二LSR變體」表示下一個及所產生之任何另外之LSR變體。因此，術語「第二」不僅限於一個後續LSR變體，而是包括根據本方法之方法步驟(步驟g))之每次重複生成之任何後續變體，例如第三、第四、第五等變體。因此，該方法不限於僅僅一個循環或重複，而是可以包括產生所欲LSR變體所需之任意數量之循環或重複。這可以包括至少兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、13、14、15、16、17、18 、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或至少30個本方法之循環或重複，較佳依步驟g)及視需要之步驟h)。

胺基酸之差異可以是取代、缺失或添加。根據本文所述之變體LSR，特別較佳之胺基酸差異是胺基酸取代。因此，變體LSR較佳與已知LSR或先前變體LSR之不同之處在於，其含有至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多胺基酸，較佳在至少15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100個胺基酸修飾，較佳為取代。

LSR變體可以使用本領域已知之任何常規方法產生。根據較佳之實施例，藉由以易錯PCR擴增相應LSR基因以建立變體文庫來產生變體。根據本發明之特別較佳之實施例，將低真度DNA聚合酶(low-fidelity DNA polymerase)用於易錯PCR。

根據一個特別較佳之實施例，LSR變體係基於天然存在之LSR。根據一個這樣之實施例，天然存在之LSR選自由下列所組成之群，但不限於A118、TP901、φRV1、Bxb1、φC31、R4、Wβ、Tnpx、Cp36、Dn29、Kp03、Nm60、Pa01及Si74。因此，根據本發明，為了產生基於天然存在LSR之LSR變體，編碼該天然存在LSR之核酸序列，例如A118之編碼序列，藉由在其編碼序列中引入一或多個突變來進行本發明之方法，例如藉由易錯PCR。為了產生基於非天然存在LSR之LSR變體，編碼該非天然存在LSR之核酸序列藉由在其編碼序列中引入一或多個突變來進行本發明之方法，例如藉由本文所述之易錯PCR。因此，根據另一個特別較佳實施例，LSR變體係基於非天然存在之LSR，例如已經被修飾之天然存在LSR，或例如人工創建之LSR。

將編碼變體LSR之突變序列，例如易錯PCR反應之PCR產物，引入(例如選殖)到適當之表現載體。這可以藉由常規方法來完成，例如使用合適之限制酶消化編碼核酸並將編碼核酸連接到表現載體中。用於表現載體文庫之表現載體可以是本領域普通技術人員認為有用之任何表現載體。本發明上下文所使用之較佳表現載體是Buchholz及Stewart 2001中所描述之pEVO表現載體或其本文描述為pEVO4gg之修飾版本，如圖7所示。

表現載體包含至少兩個區域。在第一區域中，表現載體包含編碼LSR變體之核酸序列。根據較佳實施例，第一區域還包含用於將識別手段與每個變體LSR相關聯之獨特分子標識(UMI)。本文所使用之術語「獨特分子標識」或「UMI」表示分子條碼之類型。分子條碼是用於唯一標記樣本庫中之分子的短序列。UMI是本領域技術人員已知者，並且在Zurek等人，2020或Karst等人，2021中詳細描述，兩者均通過引用整體併入本文。根據本發明之較佳實施例，UMI是包含至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少20個、至少30個、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100個隨機核苷酸之寡核苷酸。根據特別較佳之實施例，UMI是包含至少50個隨機核苷酸之寡核苷酸。UMI可以較佳地形成UMI標籤之一部分，其可以進一步包含UMI之隨機核苷酸下游及/或上游之一或多個序列(例如，隨機核苷酸側翼)，該序列可以充當一或多個引子結合位點。UMI標籤還可包含一或多個且較佳至少兩個限制位點，較佳位於UMI之隨機核苷酸之下游及/或上游。根據較佳之實施例，UMI標籤包含第一引子結合位點、第一限制位點、UMI之隨機核苷酸、第二限制位點及第二引子結合位點。

除了表現載體之第一區域中編碼變體LSR之序列外，表現載體還包含含有至少兩個第一標靶位點之第二區域。表現載體上之第二區域與第一區域分開，因為兩個區域不重疊。

天然存在LSR標靶位點各不相同。因此，根據本發明之一實施例，標靶位點彼此不同，較佳地在至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或至少30個核苷酸上不同。如果將兩者進行比較，這種差異也可能包括標靶位點之長度。取決於LSR之預期演化方向，每個第二標靶位點與對應之第一標靶位點可在至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或至少30個核苷酸上不同。根據另一實施例，第二標靶位點中僅一個與對應之第一標靶位點在至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或至少30個核苷酸上不同，並且第二標靶位點中之另一個與對應之第一標靶位點並無不同。

第一標靶位點較佳為本發明方法之步驟a)中待突變之對應LSR的標靶位點。例如，在天然存在LSR作為本發明方法之起點並且因此作為步驟a)中突變模板之情況下，該至少兩個標靶位點可以是天然存在LSR之標靶位點。在這種情況下，與相應之天然存在LSR相比，變體LSR演化為對第一標靶位點具有增加之特異性及/或在第一標靶位點上增加之活性(也稱為增加之效率)。與起始/初始LSR相比，特異性及/或活性之這種增加較佳為至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、250%或至少300%。這同樣適用於基於先前變體LSR之後續變體LSR之產生。

表1列出了用於生成LSR變體之天然存在LSR (也稱為野生型LSR)及其對應之天然靶位點。 表 1：野生型LSR 其標靶位點。

LSR	胺基酸序列	第一標靶位點 (P)	第二標靶位點 (B)
TP901-1	SEQ ID NO: 5	SEQ ID NO: 6	SEQ ID NO: 7
PhiRv1	SEQ ID NO: 8	SEQ ID NO: 9	SEQ ID NO: 10
A118	SEQ ID NO: 11	SEQ ID NO: 12	SEQ ID NO: 13
Bxb1	SEQ ID NO: 8392	SEQ ID NO: 8393	SEQ ID NO: 8394

根據本發明之一個較佳實施例，為了產生在所欲標靶位點(也稱為感興趣之標靶位點)上有活性之LSR，該至少兩個第一標靶位點之一或兩者是LSR之對應標靶位點的變體，在本發明方法之步驟a)中從LSR產生變體。根據一實施例，該至少兩個第一標靶位點之一或兩者與LSR之對應標靶位點在至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或至少30個核苷酸上不同。或者，任何感興趣之核酸序列都可以用作本發明方法中之標靶位點。因此，本發明允許產生在所欲標靶位點上有活性之LSR，較佳在存在於生物體例如哺乳動物且更佳人類基因體中之標靶位點上。特別較佳之標靶位點是個體(較佳為人類)之基因體中位於安全港位點(SHS)之那些位點。SHS及其鑑定方法在相應領域中是已知者，並且例如在Aznauryan等人，2022中進行了描述。對於不需要精確靶向現有基因或基因座的應用(例如引入或修飾內源基因、等位基因或調控元件)，常見策略是將轉基因整合到少數染色體SHS之一中進行表現，假設不會破壞相鄰或更遠基因之表現。已知之SHS包括但不限於染色體19q上之AAVS1位點以及Pellenz等人，2019中描述之那些位點，該文獻藉由引用併入本文。選擇其他較佳之標靶位點，使得可以藉由插入對應之供體核酸來修飾內源基因、等位基因或調控元件。

根據本發明之較佳實施例，表現載體上第二區域中之至少兩個標靶位點彼此間隔至少約50、55、60、65、70、75、80、85、 90、95、100、110 、120、130、140、150、160、170、180、190或至少約200個核苷酸。根據特別較佳之具體態樣，表現載體上第二區域中之至少兩個標靶位點彼此間隔至少約50個核苷酸，更佳至少約100個核苷酸。

隨後將含有編碼變體LSR核苷酸序列及標靶位點之表現載體文庫引入適當之(宿主)細胞中。根據本發明之方法可以使用真核及原核(宿主)細胞進行。較佳之原核細胞是細菌細胞。特別較佳之原核細胞是大腸桿菌細胞。較佳之真核細胞是酵母細胞(較佳為釀酒酵母)、昆蟲細胞、非昆蟲無脊椎動物細胞、兩棲類細胞或哺乳動物細胞(較佳為體細胞或多能幹細胞，包括胚胎幹細胞及其他多能幹細胞，如誘導多能幹細胞，以及其他天然細胞或已建立之細胞系，包括NIH3T3、CHO、HeLa、HEK293、hiPS)。根據特別較佳之具體態樣，(宿主)細胞是XL-1 Blue大腸桿菌細胞，並且藉由細胞之電穿孔引入連接質體。技術人員熟知用於將連接質體引入宿主細胞以隨後表現所編碼蛋白質之替代合適方法。根據一個具體態樣，該細胞不是人類生殖細胞。

培養攜帶表現載體文庫之宿主細胞以允許表現所編碼之LSR變體。培養條件沒有特別限制並且將由技術人員基於所使用之宿主細胞來選擇。例如，在使用XL-1 Blue大腸桿菌細胞之情況下，較佳在37℃下之LB培養基中培養轉形之細菌。表現引入編碼LSR變體之條件也取決於所使用之宿主細胞及質體載體。在使用pEVO表現載體及XL-1 Blue大腸桿菌細胞之情況下，可以藉由向培養基中添加例如阿拉伯糖來誘導表現。

儘管已知LSR會將供體DNA整合到基因體中，但表現LSR變體(如果在對應標靶位點上有活性)會主動切除表現載體上至少兩個標靶位點間之部分(即核苷酸序列)，而不整合任何DNA。

培養及誘導表現後，使用本領域技術人員或普通技術人員已知之任何合適之方法分離這些培養物之質體DNA。然後可以分析分離質體DNA之LSR變體在標靶位點之活性。例如，可以對編碼至少兩個標靶位點之質體DNA之至少相應部分以及至少兩個標靶位點間之任何核苷酸進行定序。因此，根據一個具體態樣，確定表現載體之第二個區域在至少兩個標靶位點間之部分是否已被變體LSR切除之步驟涉及對表現載體之至少第二個區域進行定序。定序還可以包括編碼變體LSR之表現載體的第一區域。或者，可以使用一或多種限制酶來消化質體DNA。因此，根據一個具體態樣，確定表現載體上在至少兩個標靶位點間之第二區域的部分是否已被變體LSR切除之步驟包括對包含兩個標靶位點之表現載體的序列進行限制消化，接著分析消化片段。較佳地選擇限制酶以便切除編碼變體LSR之質體部分，在LSR不切除之情況下產生包括至少兩個標靶位點間之序列的更大片段(即LSR在標靶位點上無活性)，並且在至少兩個標靶位點間發生切除反應之情況下產生較小之片段(即LSR在標靶位點上有活性)。當確定變體LSR在標靶位點上是否有活性時，那些被證明不能切除至少兩個標靶位點間之部分的變體將從文庫中除去。因此，根據本發明之一個具體態樣，該方法也包含從表現載體文庫中除去失活LSR變體之步驟。在這種情況下，移除之變體將不包括在方法步驟g)及h)中。去除失活LSR變體之例示性方法類似於用於確定LSR變體在相應標靶位點上是否有活性之限制消化方法。限制酶消化載體第二區域中編碼標靶位點間之質體。在沒有切除反應之情況下，限制酶將在兩個標靶位點間切割載體，並且載體將線性化。如果LSR具有活性，則兩個標靶位點間之相應部分將被切除，並且不會發生可使質體線性化之限制消化。選擇PCR引子以允許擴增包含編碼變異LSR序列之第一區域及包含至少兩個第一標靶位點之第二區域，其中PCR引子彼此指向。如果發生切除反應，則任何限制位點被移除並且載體保持完整，從而保留PCR引子之正確方向並因此擴增包括質體上之第一區域及第二區域之產物。該PCR產物然後可以用於下一個演化循環，因為它充當引入進一步突變之基礎 ，例如藉由步驟a)該之易錯PCR來產生第二LSR變體。

根據本發明，藉由將一個或多個突變引入到編碼這些第一LSR變體之序列中，用那些第一活性LSR變體重複步驟a)以產生第二LSR變體。此步驟可以與步驟a)類似地進行，使用第一輪之變體LSR代替天然存在LSR作為突變之基礎。

同樣地，重複方法步驟b)至f)。為了產生在標靶位點上具有改良之效率/活性之LSR變體，標靶位點可以不改變地使用，即具有與前一輪或循環中相同之核苷酸序列。如果LSR變體應在與所使用之第一標靶位點不同之變體標靶位點之方向上演化，則可以視需要修改步驟b)中使用之至少一個標靶位點。此類變體第二靶位點與先前使用之第一標靶位點可在至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或至少30個核苷酸上不同。

可以重複本文所揭露之方法步驟，直到產生對天然存在標靶位點具有改良之效率/活性或對所欲標靶位點具有活性(即具有改變之特異性)之變體LSR。用於測定LSR之活性及/或特異性之方法沒有特別限制。根據一個特別較佳具體態樣，藉由對包含兩個標靶位點之表現載體的序列進行限制消化，然後分析消化片段來測定活性。在LSR未發生切除反應之情況下獲得較大之片段，而在至少兩個標靶位點間之LSR發生切除反應之情況下獲得較小之片段。將較小片段之量與較大片段之量進行比較可以計算百分比值，該百分比值反映LSR在對應標靶位點上之活性。更詳細地，較佳將編碼LSR或LSR變體之序列引入包含相應標靶位點及/或變體標靶位點之表現載體。然後將表現載體引入合適之細胞(例如細菌細胞)中，將其在允許所編碼之蛋白質表現之條件下培養(例如藉由向培養基中添加例如阿拉伯糖)。然後可以分離質體DNA並使用一或多種限制酶消化。較佳選擇限制酶以便切除編碼標靶位點及視需要變體LSR之質體部分，在LSR沒有切除反應之情況下產生包括至少兩個標靶位點間之序列的更大片段，並且在至少兩個標靶位點間切除之情況下產生較小之片段。例如，可以藉由凝膠電泳來觀察尺寸差異。然後可以分析所觀察到大片段及小片段之相對量，從而計算重組及非重組(切除及未切除)質體之百分比值。例如，條帶強度值可以除以重組條帶及非重組條帶之組合值，以確定重組DNA之比例，可以藉由乘以100將其轉換為百分比值。

另一種確定LSR在表現載體之標靶位點上是否有活性之方法是藉由分析分離質體中載體之核酸序列。這可以藉由對包含標靶位點及視需要編碼LSR變體之區域進行PCR擴增，及/或藉由對包含標靶位點及視需要編碼LSR變體之區域進行定序來完成。在活性LSR發生切除反應之情況下，序列會更短，缺少兩個標靶位點間之切除序列。

根據較佳之具體態樣，活性LSR表現出至少約10%之活性，較佳至少約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%或至少約50%於相對標靶位點上之活性。根據較佳之具體態樣，表現出小於約1%、小於約2%、小於約3%、小於約4%或小於約5%活性之LSR被認為對相應標靶無活性。

用於測定酶活性之其他方法是本領域眾所周知者。用於確定LSR活性之一種進一步較佳之方法包含用切除LSR基因之限制酶消化來自宿主細胞培養物之重組及非重組質體。由於兩個版本間之質體大小不同，所得包含質體主鏈之DNA片段也顯示出大小差異。例如，可以藉由瓊脂糖凝膠電泳來觀察尺寸差異。然後可以分析所觀察到大片段及小片段之相對量，從而計算重組及非重組質體之百分比值。例如，條帶強度值可以除以重組條帶及非重組條帶之組合值，以確定重組DNA之比例，可以藉由乘以100將其轉換為百分比值。

根據另一個具體態樣，本發明之方法還包含對表現載體之第一區域中存在之獨特分子標識(如果有之話)進行聚類(clustering)之步驟。根據另一個具體態樣，本發明之方法還包含產生及完善一致序列之步驟。各個定序結果之聚類及完善描述於Zurek等人，2020及Karst等人，2021中，兩者均藉由引用整體併入本文。為了聚類，藉由本領域已知之方法對編碼變異LSR及較佳UMI之表現載體之至少第一區域中之序列進行定序。然後根據序列同一性對收集之UMI序列進行聚類，同時保持它們與其讀取標識(讀取ID)(即UMI)之關聯。這可以藉由本領域已知之任何常規方法來完成，例如使用VSEARCH (Rognes等人，2016)。根據這些聚類及其關聯之讀取ID，序列讀取可以分為不同之文件，其中每個文件包括對應於一個UMI聚類之讀取。從每個分離讀取聚類中，含有LSR變體基因之序列部分與含有與篩選變體高度相似性之參考基因進行比對。通常，這樣之基因係藉由對篩選之LSR變體文庫進行定序或藉由選擇經修飾以產生篩選之變體文庫的LSR變體基因來確定。借助這種比對，可以使用用於一致序列生成及序列完善之軟體來根據所有序列讀取確定與該聚類相關之LSR變體最可能之基因序列。在這方面之完善是指對讀取進行額外之輪次處理，從而提高序列準確性。

根據進一步之具體態樣，本發明之方法還包含確定或每個變體LSR中之DNA修飾事件數量之步驟。此步驟鑑定與天然存在起始LSR或衍生出變體LSR之先前LSR相比，變體LSR中之哪些胺基酸已被修飾。

根據進一步之具體態樣，本發明之方法進一步包含確定由本發明方法產生之每個LSR變體之活性率的步驟。具體地，可以確定那些已發現切除表現載體上在至少兩個特別感興趣標靶位點間之第二區域上之DNA序列之LSR變體之活性率。

根據另一個具體態樣，本發明之方法還包含從步驟a)或步驟g)至i)中產生之變體LSR中選擇標靶特異性LSR之步驟，其切除表現載體上在至少兩個感興趣標靶位點間之第二區域上之DNA序列。

本發明也涉及藉由本發明方法所獲得之變體LSR(也稱為LSR變體)。這些變體LSR較佳在至少一個胺基酸上不同，在至少兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個胺基酸上不同，較佳在至少15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350或至少400個胺基酸上與任何天然存在LSR不同，特別是來自LSR A118、TP901、φRV1、φC31、R4、Wβ、Tnpx、Cp36、Dn29、Kp03、Nm60、Pa01及Si74。變異LSR進一步較佳在至少一個、至少兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多胺基酸上不同，較佳在至少15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350或至少400個胺基酸上與本發明方法步驟a)中所產生第一變體LSR不同。根據一個特別較佳之具體態樣，變體LSR與迄今為止已知之任何LSR (例如Durrant等人，2022中描述之那些)在於至至少一個、至少兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多胺基酸上不同，較佳至少15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350或至少400個胺基酸上不同。本發明方法所獲得之LSR變體與天然存在LSR (特別是A118、TP901、φRV1、φC31、R4、Wβ、Tnpx、Cp36、Dn29、Kp03、Nm60、Pa01及Si74)間之差異也可以用百分比同一性來表示。因此，根據一個具體態樣，藉由本發明方法獲得之LSR變體與天然存在LSR (特別是A118、TP901、φRV1、Bxb1、φC31、R4、Wβ、Tnpx、Cp36、Dn29、Kp03、Nm60、Pa01及Si74)間具有不超過80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88% 、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.2%、99.5%或99.7%之序列同一性。根據特別較佳之具體態樣，本發明方法所獲得之LSR變體與天然存在LSR (特別是A118、TP901、φRV1、Bxb1、φC31、R4、Wβ、Tnpx、Cp36、Dn29、Kp03、Nm60、Pa01及Si74)具有80%至90%，更佳為82%至88%，甚至更佳為84%至86%，及最佳為85%之序列同一性。此類LSR變體較佳是如本文所定義之活性LSR。

根據特別較佳之具體態樣，胺基酸序列之差異是由一或多個胺基酸取代所引起，即變體與野生型或前述變體之不同處在於它包含相應數量之胺基酸取代並因此與野生型或前述變體具有相同之胺基酸整體數量。

本發明特別較佳之LSR包含與SEQ ID NO:14、17至35、38至56、60至8391、8395、8398至8403、8406至8412、8415至8422、8425至8429及8430至13115中任一個具有至少85%序列同一性之胺基酸序列或由其組成。更特別較佳係為包含與SEQ ID NO:14、17至35、38至56、60至88及12437中任一個具有至少85%序列同一性之胺基酸序列或由其組成之LSR。根據較佳具體態樣，根據本發明之LSR包含與SEQ ID NO:14、17至35、38至56、60至8391、8395、8398至8403、8406至8412、8415至8422、8425至8429及8430至13115中任一個具有至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.2%、至少99.5%、至少99.7%或100%序列同一性之胺基酸序列或由其組成。根據特別較佳的具體態樣，LSR係由SEQ ID NO：14、17至35、38至56、60至8391、8395、8398至8403、8406至8412、8415至8422、8425至8429及8430至13115之一所示的胺基酸序列組成，更佳為SEQ ID NO: 14、17至35、38至56、60至88及12437之一所示的胺基酸序列。根據一個特別具體態樣，根據本發明之LSR包含與SEQ ID NO：14、17至35、38至56、60至8391、8395、8398至8403、8406至8412、8415至8422、8425至8429和8430至13115中任一個具有至少85%序列同一性的胺基酸序列或由其組成，其與本領域已知的任何大絲胺酸重組酶不相同。所有這些LSR較佳是如本文所定義之活性LSR。

本發明也提供本文所揭露或藉由本發明方法所獲得之LSR片段，特別是包含與SEQ ID NO：14、17至35、38至56、60至8391、8395、8398至8403、8406至8412、8415至8422、8425至8429和8430至13115中任一個具有至少85%序列同一性或由其組成的LSR片段。根據本發明，片段LSR可包含刪除一或多個胺基酸之N端及/或C端。根據較佳具體態樣，與非片段LSR相比，該刪除可包括一個、二個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個胺基酸。所有這些LSR較佳是如本文所定義之活性LSR。

下表列出一些產生之變體LSR及其對應標靶序列。因此，根據本發明之特別較佳具體態樣，根據本發明之LSR或LSR變體係選自表2至5中所揭露之LSR變體。 表2：TP901 LSR變體及其標靶位點。

LSR 變體	胺基酸序列	第一標靶位點 (P)	第二標靶位點 (B)
798 cl2	SEQ ID NO: 14	SEQ ID NO: 6	SEQ ID NO: 15
798 cl6	SEQ ID NO: 17	SEQ ID NO: 6	SEQ ID NO: 15
798 cl10	SEQ ID NO: 18	SEQ ID NO: 6	SEQ ID NO: 15
798 cl3	SEQ ID NO: 19	SEQ ID NO: 6	SEQ ID NO: 15
798 cl4	SEQ ID NO: 20	SEQ ID NO: 6	SEQ ID NO: 15
798 cl9	SEQ ID NO: 21	SEQ ID NO: 6	SEQ ID NO: 15
798 cl7	SEQ ID NO: 22	SEQ ID NO: 6	SEQ ID NO: 15
798 cl5	SEQ ID NO: 23	SEQ ID NO: 6	SEQ ID NO: 15
798 cl8	SEQ ID NO: 24	SEQ ID NO: 6	SEQ ID NO: 15
799 cl10	SEQ ID NO: 25	SEQ ID NO: 6	SEQ ID NO: 16
799 cl5	SEQ ID NO: 26	SEQ ID NO: 6	SEQ ID NO: 16
799 cl9	SEQ ID NO: 27	SEQ ID NO: 6	SEQ ID NO: 16
799 cl3	SEQ ID NO: 28	SEQ ID NO: 6	SEQ ID NO: 16
799 cl7	SEQ ID NO: 29	SEQ ID NO: 6	SEQ ID NO: 16
799 cl1	SEQ ID NO: 30	SEQ ID NO: 6	SEQ ID NO: 16
799 cl2	SEQ ID NO: 31	SEQ ID NO: 6	SEQ ID NO: 16
799 cl8	SEQ ID NO: 32	SEQ ID NO: 6	SEQ ID NO: 16
799 cl6	SEQ ID NO: 33	SEQ ID NO: 6	SEQ ID NO: 16
799 cl4	SEQ ID NO: 34	SEQ ID NO: 6	SEQ ID NO: 16

表 3：PhiRv1 LSR變體及其標靶位點。

LSR 變體	胺基酸序列	第一標靶位點 (P)	第二標靶位點 (B)
824 cl1	SEQ ID NO: 35	SEQ ID NO: 9	SEQ ID NO: 36
824 cl8	SEQ ID NO: 38	SEQ ID NO: 9	SEQ ID NO: 36
824 cl5	SEQ ID NO: 39	SEQ ID NO: 9	SEQ ID NO: 36
824 cl10	SEQ ID NO: 40	SEQ ID NO: 9	SEQ ID NO: 36
824 cl2	SEQ ID NO: 41	SEQ ID NO: 9	SEQ ID NO: 36
824 cl3	SEQ ID NO: 42	SEQ ID NO: 9	SEQ ID NO: 36
824 cl7	SEQ ID NO: 43	SEQ ID NO: 9	SEQ ID NO: 36
824 cl4	SEQ ID NO: 44	SEQ ID NO: 9	SEQ ID NO: 36
824 cl6	SEQ ID NO: 45	SEQ ID NO: 9	SEQ ID NO: 36
824 cl9	SEQ ID NO: 46	SEQ ID NO: 9	SEQ ID NO: 36
825 cl4	SEQ ID NO: 47	SEQ ID NO: 9	SEQ ID NO: 37
825 cl1	SEQ ID NO: 48	SEQ ID NO: 9	SEQ ID NO: 37
825 cl8	SEQ ID NO: 49	SEQ ID NO: 9	SEQ ID NO: 37
825 cl9	SEQ ID NO: 50	SEQ ID NO: 9	SEQ ID NO: 37
825 cl3	SEQ ID NO: 51	SEQ ID NO: 9	SEQ ID NO: 37
825 cl10	SEQ ID NO: 52	SEQ ID NO: 9	SEQ ID NO: 37
825 cl2	SEQ ID NO: 53	SEQ ID NO: 9	SEQ ID NO: 37
825 cl7	SEQ ID NO: 54	SEQ ID NO: 9	SEQ ID NO: 37
825 cl5	SEQ ID NO: 55	SEQ ID NO: 9	SEQ ID NO: 37

表 4：A118 LSR變體及其標靶位點。

LSR 變體	胺基酸序列	第一標靶位點 (P)	第二標靶位點 (B)
783 cl7	SEQ ID NO: 56	SEQ ID NO: 12	SEQ ID NO: 57
783 cl1	SEQ ID NO: 60	SEQ ID NO: 12	SEQ ID NO: 57
783 cl2	SEQ ID NO: 61	SEQ ID NO: 12	SEQ ID NO: 57
783 cl8	SEQ ID NO: 62	SEQ ID NO: 12	SEQ ID NO: 57
783 cl10	SEQ ID NO: 63	SEQ ID NO: 12	SEQ ID NO: 57
783 cl3	SEQ ID NO: 64	SEQ ID NO: 12	SEQ ID NO: 57
783 cl6	SEQ ID NO: 65	SEQ ID NO: 12	SEQ ID NO: 57
783 cl4	SEQ ID NO: 66	SEQ ID NO: 12	SEQ ID NO: 57
783 cl9	SEQ ID NO: 67	SEQ ID NO: 12	SEQ ID NO: 57
783 cl5	SEQ ID NO: 68	SEQ ID NO: 12	SEQ ID NO: 57
784 cl9	SEQ ID NO: 69	SEQ ID NO: 12	SEQ ID NO: 58
784 cl1	SEQ ID NO: 70	SEQ ID NO: 12	SEQ ID NO: 58
784 cl5	SEQ ID NO: 71	SEQ ID NO: 12	SEQ ID NO: 58
784 cl10	SEQ ID NO: 72	SEQ ID NO: 12	SEQ ID NO: 58
784 cl4	SEQ ID NO: 73	SEQ ID NO: 12	SEQ ID NO: 58
784 cl8	SEQ ID NO: 74	SEQ ID NO: 12	SEQ ID NO: 58
784 cl2	SEQ ID NO: 75	SEQ ID NO: 12	SEQ ID NO: 58
784 cl3	SEQ ID NO: 76	SEQ ID NO: 12	SEQ ID NO: 58
784 cl7	SEQ ID NO: 77	SEQ ID NO: 12	SEQ ID NO: 58
784 cl6	SEQ ID NO: 78	SEQ ID NO: 12	SEQ ID NO: 58
787 cl1	SEQ ID NO: 79	SEQ ID NO: 12	SEQ ID NO: 59
787 cl7	SEQ ID NO: 80	SEQ ID NO: 12	SEQ ID NO: 59
787 cl3	SEQ ID NO: 81	SEQ ID NO: 12	SEQ ID NO: 59
787 cl5	SEQ ID NO: 82	SEQ ID NO: 12	SEQ ID NO: 59
787 cl6	SEQ ID NO: 83	SEQ ID NO: 12	SEQ ID NO: 59
787 cl10	SEQ ID NO: 84	SEQ ID NO: 12	SEQ ID NO: 59
787 cl4	SEQ ID NO: 85	SEQ ID NO: 12	SEQ ID NO: 59
787 cl8	SEQ ID NO: 86	SEQ ID NO: 12	SEQ ID NO: 59
787 cl9	SEQ ID NO: 87	SEQ ID NO: 12	SEQ ID NO: 59
787 cl2	SEQ ID NO: 88	SEQ ID NO: 12	SEQ ID NO: 59

表 5：Bxb1 LSR變體及其標靶位點。

LSR 變體	胺基酸序列	第一標靶位點 (P)	第二標靶位點 (B)
SH1 cl10rep	SEQ ID NO: 8395	SEQ ID NO: 8396	SEQ ID NO: 8397
SH1 cl4rep	SEQ ID NO: 8398	SEQ ID NO: 8396	SEQ ID NO: 8397
SH1 cl8	SEQ ID NO: 8399	SEQ ID NO: 8396	SEQ ID NO: 8397
SH1 cl3	SEQ ID NO: 8400	SEQ ID NO: 8396	SEQ ID NO: 8397
SH1 cl2	SEQ ID NO: 8401	SEQ ID NO: 8396	SEQ ID NO: 8397
SH1 cl9	SEQ ID NO: 8402	SEQ ID NO: 8396	SEQ ID NO: 8397
SH2 cl6	SEQ ID NO: 8403	SEQ ID NO: 8404	SEQ ID NO: 8405
SH2 cl7	SEQ ID NO: 8406	SEQ ID NO: 8404	SEQ ID NO: 8405
SH2 cl5	SEQ ID NO: 8407	SEQ ID NO: 8404	SEQ ID NO: 8405
SH2 cl8	SEQ ID NO: 8408	SEQ ID NO: 8404	SEQ ID NO: 8405
SH2 cl4	SEQ ID NO: 8409	SEQ ID NO: 8404	SEQ ID NO: 8405
SH2 cl3	SEQ ID NO: 8410	SEQ ID NO: 8404	SEQ ID NO: 8405
SH2 cl1	SEQ ID NO: 8411	SEQ ID NO: 8404	SEQ ID NO: 8405
SH3 cl4	SEQ ID NO: 8412	SEQ ID NO: 8413	SEQ ID NO: 8414
SH3 cl5	SEQ ID NO: 8415	SEQ ID NO: 8413	SEQ ID NO: 8414
SH3 cl7	SEQ ID NO: 8416	SEQ ID NO: 8413	SEQ ID NO: 8414
SH3 cl6	SEQ ID NO: 8417	SEQ ID NO: 8413	SEQ ID NO: 8414
SH3 cl2	SEQ ID NO: 8418	SEQ ID NO: 8413	SEQ ID NO: 8414
SH3 cl9	SEQ ID NO: 8419	SEQ ID NO: 8413	SEQ ID NO: 8414
SH3 cl3	SEQ ID NO: 8420	SEQ ID NO: 8413	SEQ ID NO: 8414
SH3 cl8	SEQ ID NO: 8421	SEQ ID NO: 8413	SEQ ID NO: 8414
SH4 cl4	SEQ ID NO: 8422	SEQ ID NO: 8423	SEQ ID NO: 8424
SH4 cl3	SEQ ID NO: 8425	SEQ ID NO: 8423	SEQ ID NO: 8424
SH4 cl10	SEQ ID NO: 8426	SEQ ID NO: 8423	SEQ ID NO: 8424
SH4 cl8	SEQ ID NO: 8427	SEQ ID NO: 8423	SEQ ID NO: 8424
SH4 cl1	SEQ ID NO: 8428	SEQ ID NO: 8423	SEQ ID NO: 8424
SH4 cl7	SEQ ID NO: 8429	SEQ ID NO: 8423	SEQ ID NO: 8424

本發明之其他LSR變體包含如SEQ ID NO：89至8391及8430至13115之一所示之胺基酸序列或由其組成，或與其至少85%相同之序列。

特別較佳之Bxb1 LSR變體包含相對於Bxb1 LSR野生型(SEQ ID NO：8392)之一或多個及較佳所有選自由以下所組成之群的突變： (a) Q70R、V74A、T84A、I87T、I87V、K138R、N141S、T166A、E171V、V175A、H189R、D193N、N194D、K214R、Q221R、E229K、I240T、E242G、E242V、T254I、D257G、E273G、L275Q、V283A、A315S、P322S、D355G、D355N、N381S、E418G、E434G、T453A、L488S、S490G； (b) V74A、T84A、I87T、I87V、N141S、T166A、V175A、K214R、Q221R、E229K、I240T、E242V、T254I、L275Q、A315S、D355G、D355N、E434G； (c) T84A、I87T、N141S、T166A、V175A、Q221R、E229K； (d) D14E、E24A、Q27R、V74A、I87T、I87V、Q92R、H95L、H95R、N141I、N141S、A145T、A145V、H146R、T166A、V175A、H189R、H203Y、Q221R、Q226R、E229K、K236R、I240T、E242G、E242K、E242V、T254I、D257G、E273G、L275Q、V283A、K284R、A315T、A315V、F331S、K333E、A341V、A343T、A347V、E351K、D355G、D355N、K365R、A374S、V385M、E418G、G422S、E431G、E434G、F439L、G440R、T453A、V460I、V466A、D478E、Q480R、E483G、Q484R、L488S、S490G、V491A、V492A、H496R、T497A、M499T、S500P； (e) V74A、I87T、I87V、H95R、N141I、N141S、A145V、H146R、T166A、H203Y、Q221R、Q226R、E229K、K236R、I240T、E242G、E242V、T254I、D257G、E273G、L275Q、V283A、A315V、K333E、A341V、A343T、D355G、D355N、E434G、F439L、G440R、D478E、Q484R、L488S、V492A、H496R； (f) I87T、H95R、N141I、A145V、Q221R、Q226R、E229K、I240T、E242V、T254I、L275Q、V283A、A315V、K333E、A341V、D355N、E434G、V492A； (g) D45N、V74A、T84A、I87T、I87V、K138R、T166A、V175A、H189R、N194D、P197S、L200W、Q221R、E229K、I240T、E242V、T254I、E273G、E281V、V283A、A341V、D355G、D355N、A360T、N381S、E424G、S428P、E431G、E434G、T453A、V466A、D478G、Q480R、L488S、S490G； (h) V74A、T84A、I87T、I87V、T166A、V175A、Q221R、E229K、I240T、E273G、A341V、D355N、E424G、E434G； (i) I87T、I87V、Q221R、E229K、A341V、E424G； (j) D14E、E24A、Q27R、D45N、Q70R、V74A、T84A、I87T、I87V、Q92R、H95L、H95R、K138R、N141S、N141I、A145T、A145V、H146R、T166A、E171V、V175A、H189R、D193N、N194D、P197S、L200W、H203Y、K214R、Q221R、Q226R、E229K、K236R、I240T、E242G、E242V、E242K、T254I、D257G、E273G、L275Q、E281V、V283A、K284R、A315S、A315T、A315V、P322S、F331S、K333E、A341V、A343T、A347V、E351K、D355G、D355N、A360T、K365R、A374S、N381S、V385M、E418G、G422S、E424G、S428P、E431G、E434G、F439L、G440R、T453A、V460I、V466A、D478E、D478G、Q480R、E483G、Q484R、L488S、S490G、V491A、V492A、H496R、T497A、M499T、S500P； (k) V74A、T84A、I87T、I87V、H95R、N141S、N141I、A145V、H146R、T166A、V175A、H203Y、K214R、Q221R、Q226R、E229K、K236R、I240T、E242V、E242G、T254I、D257G、E273G、L275Q、V283A、A315S、A315V、K333E、A341V、A343T、D355G、D355N、E424G、E434G、F439L、G440R、D478E、Q484R、L488S、V492A、H496R；或 (l) T84A、I87T、I87V、H95R、N141S、N141I、A145V、T166A、V175A、Q221R、Q226R、E229K、I240T、E242V、T254I、L275Q、V283A、A315V、K333E、A341V、D355N、E424G、E434G、V492A。

根據本發明之一個具體態樣，LSR係作為單體存在。根據本發明之較佳具體態樣，LSR包含至少兩個LSR單體，即呈二聚體形式(二聚體)。這樣之二聚體可以包含兩個相同類型之單體(即兩個相同之整合酶單體，同二聚體)或不同類型之兩個單體(即兩個不同的整合酶單體，異二聚體)。根據本發明進一步較佳之具體態樣，LSR包含至少四個蛋白質單體，即呈四聚體形式(四聚體)。這種四聚體可以包含四個相同類型之單體(即四個相同之整合酶單體，同四聚體)，或不同類型之單體，例如兩個、三個或四個不同的整合酶單體(異四聚體)。根據特別較佳之具體態樣，變體LSR係以二聚體存在並且包含兩個相同之LSR單體。

本發明進一步涉及編碼根據本發明變體LSR之核酸或核酸組。為了活化此類核酸或核酸組之表現，編碼LSR之核酸較佳進一步包含調節核酸序列，較佳啟動子區域。因此，編碼整合酶蛋白之核酸的表現可以藉由活化調節核酸序列來啟動或調節。因此，誘導供體核酸DNA整合至細胞或個體基因體中之一種方法是將本發明之核酸序列或核酸序列組引入相應之個體或細胞中，並活化調節核酸酸序列(較佳啟動子區域)以表現編碼整合酶蛋白之基因。較佳地，調節核酸序列(較佳啟動子區域)較佳地與編碼整合酶蛋白之序列一起引入相應之細胞中，或者調節核酸序列在開始時就已經存在於該細胞中。在第二種情況下，僅將編碼整合酶蛋白之核酸引入細胞中(並置於調節核酸序列的控制之下)。

本文所使用之術語「調節核酸序列」是指DNA之基因調節區。除了啟動子區域之外，該術語還涵蓋距離基因更遠之操縱子區域以及影響基因表現之核酸序列，例如順式元件(cis-elements)、增強子(enhancers)或沉默子(silencers)。本文所使用之術語「啟動子區域」是指DNA上允許基因之受調節表現之核苷酸序列。啟動子區域允許編碼相應蛋白質之核酸受調節表現。啟動子區域位於基因之5'端，因此位於RNA編碼區之前。細菌及真核啟動子均適用於本發明。

根據本發明之一個具體態樣，標靶位點係已包括在個體或細胞中，或它們較佳地被藉由本領域普通技術人員熟知之重組技術引入個體之基因體或細胞中。

根據一個較佳具體態樣，待整合之核酸(即供體核酸)已經存在於個體中，特別是相應細胞中。或者，可以藉由技術人員已知之常規方法，例如藉由重組技術(例如轉染或轉導)將待整合之核酸引入個體或細胞中。

本發明還包括一或多種核酸或核酸序列或多核苷酸，其中LSR之編碼序列在同一閱讀框內與有助於蛋白質從宿主細胞表現及分泌之多核苷酸序列融合。例如，充當控制多肽從細胞轉運之分泌序列的前導序列可以與編碼整合酶蛋白之序列融合。具有這樣前導序列之多肽或蛋白質被稱為前蛋白質(pre-protein)或前原蛋白質(pre-proprotein)，並且該多肽或蛋白質具有可以被宿主細胞切割以形成蛋白質成熟形式之前導序列。這些多核苷酸可以具有5'延伸區域，以便其編碼原蛋白，其係為成熟蛋白加上N末端之額外胺基酸殘基。具有這種原序列(pro-sequence)之表現產物稱為原蛋白質，它是成熟蛋白之無活性形式；然而，一旦原序列被切割，活性成熟蛋白就會保留下來。附加序列也可以連接至蛋白質並且成為成熟蛋白質之一部分。因此，例如，本發明之多核苷酸可以編碼多肽、或具有原序列之蛋白質、或同時具有原序列及前序列(例如前導序列)之蛋白質。

本發明之核酸也可以具有與標記序列框內融合之編碼序列，其允許純化本發明之整合酶蛋白。標記序列可以是親和標籤或表位標籤，例如多組胺酸標籤、鏈黴親和素標籤(streptavidin tag)、Xpress標籤、FLAG標籤、纖維素或幾丁質結合標籤、麩胱甘肽-S轉移酶標籤(GST)、血球凝集素(HA)標籤、c-myc標籤或V5標籤。

如果本發明之核酸是mRNA，特別是用作藥物，則可以藉由在最大化mRNA轉譯及穩定性、防止其免疫刺激活性方面所取得之顯著進展來促進mRNA治療劑之遞送以及體內遞送技術之發展。5'帽及3'聚(A)尾是成熟真核生物mRNA有效轉譯及延長半衰期之主要貢獻者。將帽類似物(諸如ARCA(抗反向帽類似物))及120-150 bp之聚(A)尾摻入體外轉錄(IVT) mRNA中，可顯著改善編碼蛋白之表現及mRNA穩定性。新型帽子類似物，例如1,2-二硫代二磷酸修飾之帽子，具有抗RNA脫帽複合(decapping complex)之能力，可以進一步提高RNA轉譯之效率。用同義頻繁出現密碼子(即所謂之密碼子優化)替換mRNA蛋白質編碼序列中之稀有密碼子，也有助於提高蛋白質合成之效率，並限制稀有密碼子造成之mRNA不穩定，從而防止轉錄物加速降解。同樣，工程化3'及5'非轉譯區(UTR)(其包含負責招募RNA結合蛋白(RBP)及miRNA之序列)可以提高蛋白質產物之水平。有趣的是，UTR可以被有意修飾以編碼調控元件(例如K轉角基序(K-turn motifs)及miRNA結合位點)，從而提供一種以細胞特異性方式控制RNA表現之方法。一些RNA鹼基修飾(例如N1-甲基-假尿苷)不僅有助於掩蓋mRNA免疫刺活化性，而且還被證明可以藉由增強轉譯起始來增加mRNA轉譯。除了觀察到之對蛋白質轉譯之影響外，鹼基修飾及密碼子優化還會影響mRNA之二級結構，進而影響其轉譯。本發明也考慮了本發明核酸分子之相應修飾。

RNA或多個RNA較佳編碼本發明之整合酶或其任何亞單元。用於遞送及表現核酸之具體方法及具體RNA揭示於例如EP2590676及EP3115064中，其藉由引用併入本文。RNA可以存在於顆粒中並且較佳地是自我複製者。在體內投予顆粒後，RNA從顆粒中釋放出來並在細胞內轉譯以提供DNA重組酶或其任何單體亞單元。

當自我複製之RNA分子(複製子)被遞送到脊椎動物細胞時，即使沒有任何蛋白質，也可以藉由自身轉錄(藉由其自身產生之反義副本)產生多個子RNA。這些子RNA以及共線亞基因體轉錄物(collinear sub-genomic transcripts)可以自行轉譯以提供編碼多肽之原位表現，或者可以轉錄以提供與遞送之RNA具有相同意義之進一步轉錄物，其被轉譯以提供多肽之原位表現。此轉錄序列之總體結果是引入之複製子RNA數量之巨大擴增，因此編碼之多肽成為細胞之主要多肽產物。

較佳之自我複製RNA分子編碼(i)可以從自我複製RNA分子轉錄RNA之RNA依賴性RNA聚合酶，及(ii)本發明之整合酶蛋白。聚合酶可以是α病毒複製酶，例如包含α病毒蛋白nsP1、nsP2、nsP3及nsP4中之一或多種。較佳地，本發明之自我複製RNA分子不編碼α病毒屬結構蛋白。因此，較佳之自我複製RNA可以導致在細胞中產生其自身之基因體RNA拷貝，但不會導致產生含有RNA之病毒粒子。可用於本發明之自我複製RNA分子可以有兩個開放閱讀框。第一個(5')開放閱讀框編碼複製酶，且第二個(3')開放閱讀框編碼本發明之多肽。在一些實施例，RNA可以具有額外(例如下游)之開放閱讀框，例如用於進一步編碼附加多肽。

此類RNA特別適用於基因療法之一般用途，並且特別適用於治療遺傳性病症或疾病。

本發明進一步提供一種包含根據本發明核酸之表現載體。表現載體較佳是如Buchholz及Stewart，2001中所描述之pEVO載體，更佳係本文描述為pEVO4gg之變體pEVO載體。根據特別較佳之具體態樣，載體包含編碼與SEQ ID NO:14、17至35、38至56、60至8391、8395、8398至8403、8406至8412、8415至8422、8425至8429及8430至13115中任一個具有至少85%同一性之蛋白質的核酸序列。

本發明進一步提供一種包含根據本發明載體或核酸或核酸組之細胞或宿主細胞。技術人員容易鑑定合適之宿主細胞，其可以是真核或原核。較佳的原核細胞是細菌細胞。特別較佳的原核細胞是大腸桿菌細胞。較佳的真核細胞是酵母細胞(較佳釀酒酵母)、昆蟲細胞、非昆蟲無脊椎動物細胞、兩棲類細胞或哺乳動物細胞(較佳為體細胞或多能幹細胞，包括胚胎幹細胞及其他多能幹細胞，如誘導多能幹細胞，以及其他天然細胞或已建立之細胞系，包括NIH3T3、CHO、HeLa、HEK293、hiPS)。根據特別較佳之具體態樣，宿主細胞是XL-1 Blue大腸桿菌細胞。

本發明進一步提供一種用於將供體核酸整合到標靶核酸例如個體或細胞之基因體中的系統。該系統包含含有根據本發明大絲胺酸重組酶(LSR)之多肽或編碼其之核酸，以及待插入標靶核酸中之供體核酸。供體核酸較佳包含LSR之至少一個標靶位點。

根據本發明之系統適用於與其他重組酶系統組合使用，並且因此可以成為同時或依序需要多種重組酶之遺傳實驗特別有價值之工具。

本發明也提供一種醫藥組合物，其包含根據本發明之大絲胺酸重組酶，並且特別是與SEQ ID NO：14、17至35、38至56、60至8391、8395、8398至8403、8406至8412、8415至8422、8425至8429及8430至13115中任一個具有至少85%同一性之蛋白質，根據本發明之一或多種核酸，或根據本發明之載體，及視需要藥學上可接受之載劑。醫藥組合物可以是適合於所選投予模式之任何形式。

在一個具體態樣中，本發明之醫藥組合物係以腸胃外投予。

本文所使用之短語「腸胃外投予」及「腸胃外施用」是指除了腸內及局部投予之外的投予方式，通常藉由注射，並且包括表皮、靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、囊內、眼眶內、心內、皮內、腹膜內、肌腱內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊椎內、顱內、胸內、硬膜外及胸骨內注射及輸注。

本發明醫藥組合物中之治療活性劑包括但不限於根據本發明之大絲胺酸重組酶，並且特別包括與SEQ ID NO：14、17至35、38至56、60至8391、8395、8398至8403、8406至8412、8415至8422、8425至8429及8430至13115中任一個具有至少85%同一性之蛋白質，根據本發明之一或多種核酸，或根據本發明之載體。根據較佳之具體態樣，醫藥組合物中之活性劑是根據本發明之大絲胺酸重組酶，並且特別是與SEQ ID NO: 14、17至35、38至56、60至8391、8395、8398至8403、8406至8412、8415至8422、8425至8429及8430至13115中任一個具有至少85%同一性之蛋白質。包含治療活性劑之醫藥組合物可以作為單獨的醫藥組合物，或與其他活性劑組合，以單位投予形式，作為與習知醫藥支撐物的混合物，施用於動物和人類。

在進一步之具體態樣中，醫藥組合物含有一或多種載劑(也稱為賦形劑(vehicles))，其對於能夠注射之製劑而言是藥學上可接受者。這些特別可以是等滲透、無菌之鹽溶液(磷酸單鈉或雙鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣或氯化鎂等或這些鹽之混合物)，或乾燥、特別是冷凍乾燥之組合物，依狀況添加無菌水或生理食鹽水，則可以配製注射溶液。

適合注射使用之藥物劑型包括無菌水溶液或分散液；製劑包括芝麻油、花生油或丙二醇水溶液；以及用於即時製備無菌注射溶液或分散液之無菌粉末。在所有情況下，形式必須是無菌且必須是流體。它在製造及儲存條件下必須穩定，並且必須防止微生物(例如細菌及真菌)之污染作用。

根據另一方面，本發明提供一種根據本發明大絲胺酸重組酶之用途，特別是與SEQ ID NO: 14、17至35、38至56、60至8391、8395、8398至8403、8406至8412、8415至8422、8425至8429及8430至13115中任一個具有至少85%同一性之蛋白質之用途，其係用於將供體核酸整合至標靶核酸中，如將核酸整合至個體或細胞基因體中。根據特別較佳之具體態樣，供體核酸編碼感興趣之多肽或蛋白質並整合到標靶核酸中，使得當標靶核酸轉錄及轉譯時表現感興趣之多肽或蛋白質。供體核酸較佳包含LSR之至少一個標靶位點。

根據另一方面，本發明提供一種本發明核酸或核酸組用於將供體核酸整合到標靶核酸例如個體或細胞基因體中之用途。根據特別較佳之具體態樣，供體核酸編碼感興趣之多肽或蛋白質並整合到標靶核酸中，使得當標靶核酸轉錄及轉譯時表現感興趣之多肽或蛋白質。供體核酸較佳包含LSR之至少一個標靶位點。

根據另一方面，本發明提供一種本發明表現載體或醫藥組合物用於將供體核酸整合到標靶核酸例如個體或細胞基因體中之用途。根據特別較佳之具體態樣，供體核酸編碼感興趣之多肽或蛋白質並整合到標靶核酸中，使得當標靶核酸轉錄及轉譯時表現感興趣之多肽或蛋白質。供體核酸較佳包含LSR之至少一個標靶位點。

根據另一方面，本發明提供一種本發明系統用於將供體核酸整合到標靶核酸例如個體或細胞基因體中之用途。根據特別較佳之具體態樣，供體核酸編碼感興趣之多肽或蛋白質並整合到標靶核酸中，使得當標靶核酸轉錄及轉譯時表現感興趣之多肽或蛋白質。供體核酸較佳包含LSR之至少一個標靶位點。

本發明也提供一種根據本發明大絲胺酸重組酶，特別是與SEQ ID NO: 14、17至35、38至56、60至8391、8395、8398至8403、8406至8412、8415至8422、8425至8429及8430至13115中任一個具有至少85%同一性之蛋白質，本發明之核酸或核酸組，本發明之表現載體，本發明之醫藥組合物，或本發明之系統用作醫藥之用途。

本發明也提供一種根據本發明大絲胺酸重組酶，特別是與SEQ ID NO: 14、17至35、38至56、60至8391、8395、8398至8403、8406至8412、8415至8422、8425至8429及8430至13115中任一個具有至少85%同一性之蛋白質，本發明之核酸或核酸組，本發明之表現載體，本發明之醫藥組合物，或本發明之系統於治療遺傳疾病或病症上之用途。遺傳疾病或病症不受特別限制，並且包括可藉由將核酸序列或多個核酸序列整合到相應患者之基因體中來治療之任何遺傳疾病或病症，該基因體編碼一或多種有助於治療之蛋白質或多肽。較佳之遺傳疾病或病症是單一遺傳疾病或病症。

根據一個具體態樣，本發明意義內之(宿主)細胞較佳是天然存在細胞或細胞系(視需要經轉化或遺傳修飾)，其包含如上所述，至少有一種重組的根據本發明之載體或根據本發明之核酸。因此，本發明包括瞬時轉染子(transient transfectants) (例如藉由mRNA注射)或包含至少一種根據本發明之表現載體作為質體或人工染色體之宿主細胞，以及其中根據本發明之表現載體穩定地整合到該宿主細胞之基因體中之宿主細胞。

進一步提供了包含本文所述治療活性劑之套組。在一個具體態樣中，套組提供製備成一或多種單位劑量形式之治療活性劑，以準備投予個體，例如在預裝注射器中或在安瓿中。在另一個具體態樣中，治療活性劑係以冷凍乾燥形式提供。

使用本發明，可以將供體核酸(較佳DNA)整合到標靶核酸(較佳DNA)中，該標靶核酸可以存在於宿主生物體(例如哺乳動物)中。因此，本發明也包括包含經整合核酸之宿主生物體。根據一個具體態樣，宿主生物體不是人類。也提供了宿主生物體，其包含如上所述根據本發明之載體或根據本發明之核酸，其分別穩定地整合到宿主生物體之基因體或宿主生物體之個體細胞中。本發明之較佳宿主生物體是植物、無脊椎動物及脊椎動物，特別是牛科動物( Bovidae)、黑腹果蠅( Drosophila melanogaster)、秀麗隱桿線蟲( Caenorhabditis elegans)、非洲爪蟾( Xenopus laevis)、青鱂(medaka)、斑馬魚(zebrafish)或小家鼠( Mus musculus)，或這些生物體之胚胎。

本發明也涉及用於將供體DNA整合到標靶核酸例如個體或細胞之基因體中之方法。此方法包括步驟(i)提供根據本發明之LSR變體，並且特別是包含與SEQ ID NO: 14、17至35、38至56、60至8391、8395、8398至8403、8406至8412、8415至8422、8425至8429及8430至13115中任一個具有至少85%同一性或由其組成之蛋白質，本發明之核酸或核酸組，本發明之表現載體、本發明之醫藥組合物或本發明之系統，及供體DNA，其視需要允許大絲胺酸重組酶表現，及(ii)允許LSR將供體核酸整合到靶標核酸中。

本發明也涉及藉由將供體DNA整合到個體之標靶核酸中來治療個體之遺傳疾病或病症之方法。此方法包括以下步驟：(i)提供根據本發明之LSR變體，並且特別是包含與SEQ ID NO: 14、17至35、38至56、60至8391、8395、8398至8403、8406至8412、8415至8422、8425至8429及8430至13115中任一個具有至少85%同一性或由其組成之蛋白質，本發明之核酸或核酸組，本發明之表現載體、本發明之醫藥組合物或本發明之系統，及供體DNA，其視需要允許大絲胺酸重組酶表現，及(ii)允許LSR將供體核酸整合到靶標核酸中。

本發明還涉及以下項目。

項目1：一種產生標靶特異性大絲胺酸重組酶(LSR)之方法，該方法包含以下步驟： a)藉由將一或多個突變引入編碼LSR之序列中來產生LSR之多個第一變體； b)產生表現載體文庫，其中每個表現載體包含第一區域及第二區域，該第一區域包含編碼LSR之第一變體之一的序列，該第二區域包含LSR之至少兩個第一標靶位點，其中該兩個第一標靶位點彼此不同； c)將表現載體文庫導入宿主細胞； d)培養宿主細胞並表現LSR之第一變體； e)從宿主細胞培養物中分離質體DNA； f)確定該兩個第一標靶位點間該表現載體之第二區域的部分是否已被第一變體LSR切除； g)用那些第一LSR變體重複步驟a)，藉由將一或多個突變引入編碼第一變體LSR之序列中來切除兩個第一標靶位點間之表現載體上之第二區域之DNA序列，以產生LSR之第二變體； h)視需要以至少一個第二標靶位點重複步驟b)至f)，其中該至少一個第二標靶位點在至少一個核苷酸上不同於第一靶位點。

項目2：根據項目1之方法，其進一步包含重複步驟g)及h)之步驟，較佳地其中步驟g)及h)重複至少兩次至至少30次。

項目3：根據項目1或2之方法，其中步驟a)中作為LSR之多個第一變體之基礎的LSR是天然存在之LSR。

項目4：根據項目1至3中任一項之方法，其中表現載體之第二個區域中之兩個標靶位點間隔至少50個核苷酸。

項目5：根據項目1至4中任一項之方法，其中該確定步驟f)包含(i)對該表現載體之第一及第二區域進行定序，或(ii)對包含兩個標靶位點之表現載體之序列進行限制消化，然後分析消化片段。

項目6：根據項目1至5中任一項之方法，其進一步包含從表現載體文庫中去除變體LSR之無活性變體之步驟。

項目7：根據項目1至6中任一項之方法，其中編碼LSR之序列中之一或多個突變係使用易錯PCR藉由隨機誘變引入。

項目8：根據項目1至7中任一項之方法，其中該載體上之第一區域進一步包含獨特之分子標識。

項目9：根據項目8之方法，其尚包含以下步驟中之一或多個： (i)將獨特之分子標識進行聚類， (ii)產生及完善一致序列(consensus sequences)， (iii)確定每種LSR變體之DNA修飾事件的數量； (iv)確定每個LSR變體之活性率；及/或 (v)從請求項1之步驟a)或步驟g)至i)產生之變體LSR中選擇標靶特異性LSR，其切除兩個感興趣之變體標靶位點間表現載體上第二區域之DNA序列。

項目10：根據前述項目中任一項之方法，其中該表現載體係為pEVO載體。

項目11：一種可藉由項目1至10中任一項之方法獲得之變體大絲胺酸重組酶(LSR)，其中該變異LSR之胺基酸序列與在步驟a)中產生變異LSR之胺基酸序列以及與任何其他天然存在大絲胺酸重組酶之胺基酸序列有至少一個胺基酸不同，較佳地其中該變體包含與SEQ ID NO: 14、17至35、38至56、60至8391、8395、8398至8403、8406至8412、8415至8422、8425至8429及8430至13115之一具有至少85%同一性之胺基酸序列或由其組成。

項目12：根據項目11之變體LSR，其中該變體LSR是選自由A118、TP901、φRV1、Bxb1、φC31、R4、Wβ、Tnpx、Cp36、Dn29、Kp03、Nm60、Pa01、Si74所組成之群的LSR變體。

項目13：一種編碼根據項目11或12之變異LSR之核酸或核酸組。

項目14：一種表現載體，其包含根據項目13之核酸或核酸組。

項目15：一種用於將供體DNA整合到標靶核酸中之系統，該系統包含 包含根據項目11或12之變體LSR之多肽，或編碼其之核酸，及 待插入標靶核酸中之供體核酸。

項目16：一種醫藥組合物，其包含項目11之變體LSR、根據項目13之核酸或核酸組、或根據項目14之表現載體，以及視需要藥學上可接受之載劑。

項目17:一種根據項目11或12之變體LSR、項目13之核酸或核酸組、項目14之表現載體、項目15之系統、或項目16之醫藥組合物之用途，其係用於將感興趣之核酸序列整合到個體或細胞之基因體中，其中該細胞不包括人種系之細胞。

項目18：根據項目11或12之變體LSR、項目13之核酸或核酸組、項目14之表現載體或項目16之醫藥組合物，其係用作藥物。

項目19:根據項目18之變體LSR、核酸或核酸組、表現載體或醫藥組合物之用途，其係用於治療遺傳疾病或病症，較佳地其中該遺傳疾病或病症係為單一遺傳疾病或病症。

項目20:一種用於將供體DNA整合到標靶核酸例如個體或細胞之基因體中之方法，其包含步驟(i)提供根據本發明之LSR變體，並且特別是包含與SEQ ID NO: 14、17至35、38至56、60至8391、8395、8398至8403、8406至8412、8415至8422、8425至8429及8430至13115中任一個具有至少85%同一性或由其組成之蛋白質，本發明之核酸或核酸組，本發明之表現載體、本發明之醫藥組合物或本發明之系統，及供體DNA，其視需要允許大絲胺酸重組酶表現，及(ii)允許LSR將供體核酸整合到靶標核酸中。

項目21:一種藉由將供體DNA整合到個體之標靶核酸中來治療個體之遺傳疾病或病症之方法，該方法包含步驟(i)提供根據本發明之LSR變體，並且特別是包含與SEQ ID NO: 14、17至35、38至56、60至8391、8395、8398至8403、8406至8412、8415至8422、8425至8429及8430至13115中任一個具有至少85%同一性或由其組成之蛋白質，本發明之核酸或核酸組，本發明之表現載體，本發明之醫藥組合物或本發明之系統，及供體DNA，其視需要允許大絲胺酸重組酶表現，及(ii)允許LSR將供體核酸整合到靶標核酸中。 實例 實例1：整合酶基因之選殖

分析已發表之文獻及GenBank中可用之序列後，選擇了四種大絲胺酸重組酶(A118、PhiRv1、TP901-1及Bxb1)，並如本文詳述進行演化。絲胺酸家族之大位點特異性重組酶之胺基酸序列從GenBank取得並反向轉譯為DNA。由於重組酶之來源來自各種細菌或細菌病毒，因此針對重組酶在大腸桿菌中之表現對DNA序列進行了優化，而不改變編碼之胺基酸序列。基因用限制酶位點合成用於選殖。如下製備20 µl消化反應液：500 ng質體DNA、2 µl CutSmart緩衝液、1 µl XbaI、1 µl BsrGI-HF及水。將反應物在37°C下培養至少1小時，並根據製造商之說明使用ISOLATE II PCR及Gel Kit (Bioline)純化插入物。隨後將純化插入物用於與含有標靶位點之pEVO4gg載體連接。pEVO4gg載體是在pEVO4載體之基礎上藉由將寡核苷酸與BbsI標靶位點整合而製成(Hoersten等人，未發表)。pEVO4gg載體之圖譜如圖7所示。 實例2：標靶位點選殖

為了產生具有標靶位點之質體(參見表2至5)，使用包含標靶位點之寡核苷酸來擴增DNA片段，該片段藉由Golden Gate選殖到pEVO4gg主鏈中。該方法使用IIS型限制內切酶及T4 DNA連接酶作為該過程之關鍵組成部分，為將多個DNA片段同時組裝成統一之構建體提供了一種熟練且定向之方法。IIS型酶(如BbsI)會在其識別位點之外切割DNA，並且由於最終產物缺乏識別位點，因此正確連接之產物無法再次被限制酶切割，這意味著該反應基本上是不可逆(Engler等人，2008)。具體而言，按如下方式製備50 µl PCR反應液：36 µl水、10 µl 5x Herculase II Reaction Buffer、0.5 µl 100 mM dNTP Mix、正向及反向引子各1.25 µl (10 µM)、0.5 µl Herculase II Fusion DNA Polymerase、1 µl任何帶有標靶位點之pEVO4或pEVO4gg載體(20 ng/µl)。反應依照以下程序進行：95°C 3分鐘；30個循環：95℃ 15秒，55℃ 20秒，72℃ 30秒；72°C 3分鐘；儲存於8°C。PCR產物直接用於Golden Gate反應。 表6：切除演化測定中所使用之引子。

引子	引子序列
F	TTTGAAGACCCCACC (SEQ ID NO:1) -target_site_1-AGCTTGCATGCCTGCAGATCGAG (SEQ ID NO:2)
R	TTTGAAGACCTAAAC (SEQ ID NO:3) -rev_comp_target_site_2-TCGAACTGTACCGGTTGTTAGTGA (SEQ ID NO:4)

20 µl Golden Gate反應液之製備如下：2 µl Fast Digest Buffer、2 µl 10 mM ATP、75 ng pEVO4gg載體、1 µl帶標靶位點之PCR 產物(以1:10稀釋)、1 µl T4 DNA Ligase、1 µl BpiI-HF及水。反應依照以下程序進行：37℃ 10分鐘，37℃ 5分鐘及16℃ 5分鐘、37℃ 15分鐘及65℃ 10分鐘之10個循環。

然後使用Golden Gate反應進行細菌轉形。將整個轉形混合物鋪在含有15μg/ml氯黴素之瓊脂平板上，並將培養物在37°C培養箱中生長14-16小時。 實例3：切除演化測定

使用易錯PCR擴增整合酶基因以建立文庫。使用低保真DNA聚合酶(low-fidelity DNA polymerase) (MyTaq、Bioline)進行PCR，並使用XbaI及BsrGI消化PCR產物以進行進一步選殖。使用Isolate II PCR及Gel Kit (Bioline)從瓊脂糖凝膠中分離消化之片段，並將其連接到具有標靶位點之類似消化pEVO4gg載體中。使用T4 DNA Ligase (NEB)在30 ng插入片段及60 ng載體間進行連接。

經連接質體以MF-Millipore濾膜(Merck)在蒸餾水中脫鹽20分鐘，並以電穿孔轉形至XL-1 Blue大腸桿菌細胞。轉形細菌在SOC培養基中37℃下培養1小時。將2 µl此培養物塗在含有15 mg/ml氯黴素之瓊脂糖平板上，並在37°C下培養過夜。確定平板上之菌落數，以計算每µl SOC培養物中存在轉形細菌之數量。將剩餘之轉形溶液加入100 ml LB培養基中，使文庫在37°C下生長過夜。液體培養物含有特定量之阿拉伯糖以誘導整合酶之表現。演化中使用之阿拉伯糖水平及由此誘導之酶表現為200 μg/ml、100 μg/ml、50 μg/ml、25 μg/ml、10 μg/ml、5 μg/ml及1 μg/ml。將粉末配製成阿拉伯糖溶液至儲備濃度為100 mg/ml，再以LB培養基稀釋至所需濃度。

使用GeneJet Plasmid Miniprep Kit (Thermo Fisher Scientific)依序萃取這些培養物之質體DNA，並用於表徵切除及繼續演化循環。為了繼續演化循環，用NdeI及AvrII消化質體DNA之小量，標靶是載體上標靶位點間之質體部分。在沒有切除反應之情況下，載體被線性化，並且用於PCR擴增之引子將沿相反方向進行。如果發生切除反應，限制位點將被移除，載體保持完整，從而保留PCR引子之正確方向。

對酵素消化DNA進行易錯PCR開始了另一輪定向演化。僅複製編輯過之質體，因為引子之放置方式使得只有編輯過之DNA片段才是PCR之有效模板。PCR產物隨後被選殖到未編輯之pEVO4gg載體中，從而開始新的演化週期。為了增加選擇壓力，阿拉伯糖水平及酶表現之誘導從200 μg/ml降低至1 μg/ml。

在整合酶TP901、PhiRv1及A118上執行之演化過程分別顯示於圖3A至3C；表2至4總結變體LSR之相應序列以及變體演化之標靶位點。在圖3A至3C中，野生型標靶位點之序列呈現在稱為WT之頂部圖。用於演化之新標靶位點顯示在該框下方。新標靶位點序列中之灰色方塊標示了新標靶位點之變化。更改之總數在每個新標靶序列之末端給出。下圖中之瓊脂糖凝膠圖片顯示重組測試之結果以及相對活性百分比(Rec%)。為了測定活性，以限制酶消化重組及非重組質體，切除重組酶基因。由於兩個版本間之質體大小不同，所得包含質體主鏈DNA片段之大小也不同。大小差異在瓊脂糖凝膠電泳中可見。由於演化文庫中之酵素具有不同之效率，因此結果是重組及非重組質體之混合物。當瓊脂糖凝膠圖片包含兩種片段時，每個條帶之強度對應於相應片段之量，從而可以量化重組率。左邊之瓊脂糖圖片代表演化過程之開始，右邊之瓊脂糖圖代表演化過程之結束。凝膠圖右側之象形圖指示每個條帶對應於哪個片段：兩個三角形代表非重組片段，一個三角形代表重組片段。演化週期之總數顯示在兩張瓊脂糖凝膠圖片中間之圓形箭頭中。阿拉伯糖誘導水準(μg/ml)記錄在凝膠圖片下；M表示分子量標記。

所得整合酶變體如圖4 (TP901變體)、圖5 (PhiRv1變體)及圖6 (A118變體)所示。對於每個文庫，在如圖所示之阿拉伯糖誘導下分析了10個殖株(TP901變體為1 μg/ml (圖4)，其他變體為0、1及10 μg/ml (圖5至7))。使用正向及反向引子藉由Sanger定序對每個殖株進行定序。使用兩個讀取來創建一個基因序列，進行轉譯並用於與野生型酶相比之胺基酸序列比對。每個殖株與野生型酵素之序列比對顯示在每個圖表中。沒有顯示完整之序列比對，但圖式僅突出顯示變體及野生型序列間不同之那些位置。點代表沒有變化，*是終止密碼子，#是插入。每個錯配之位置顯示在每個序列比對下方之底線。僅顯示與野生型參考有差異之位置。野生型酵素之序列用作參考。 實例4：測試消化

為了檢測整合酶變體是否催化切除反應，如圖3至7所示進行限制消化。利用XbaI及BsrGI限制酶將整合酶選殖到具有對應標靶位點的pEVO載體。整合酶之表現由L-阿拉伯糖誘導型啟動子系統(araBAD)控制。演化質體上對應標靶位點之重組導致從質體中切除750 bp片段。由此產生之大小差異是由重組酶活性介導，並且可以通過限制消化然後進行凝膠電泳來檢測。剩餘主鏈之大小與未修飾載體(5147 bp)或包含切除載體(4397 bp)相關，與每個載體之相對豐度成比例。 實例5：切除演化測定

Lansing等人2020描述了基於瞬時螢光之報導者測定，以及Lansing等人2022用於確定演化整合酶變體之重組特性。

Expi293F細胞維持在補充10%胎牛血清及1%青黴素-鏈黴素(10,000 U/ml，Thermo Fisher)之Dulbecco改良Eagle培養基(Invitrogen GmbH)中。細胞每3至4天繼代一次，並維持在37°C及5% CO ₂。根據製造商之說明使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)轉染細胞。48小時後，收穫細胞並在MACS Quant分析儀(Miltenyi Biotec)中分析。

檢驗進行如下：將每孔75,000個細胞接種到24孔板中。細胞以編碼一種整合酶變體及藍色螢光蛋白(BFP)之EF1a-tagBFP-P2A-Int質體(圖15)以及編碼側翼為測試標靶位點之紅色螢光蛋白mCherry之pCAGGS-attB-mCherry-attP-EGFP報導者質體(圖14)之組合共轉染。​​這些位點重組後，下游EGFP基因就會表現。過程之示意圖如圖16所示。轉染48小時後，使用MACSQuant VYB流式細胞儀(Miltenyi Biotec)以FACS對重組酶活性進行定量。使用FlowJo ™ 10 (BD)進行數據分析。使用前向散射及側向散射對細胞群進行分組，以對總細胞群進行分組。將表現BFP之細胞按照前向散射及BFP進行分組，以定義已獲得具有整合酶變體之EF1a-tagBFP-P2A-Int質體之群體。BFP群體中之細胞根據GFP及mCherry表現進行分組。藉由確定藍色螢光群體中顯示綠色螢光細胞之百分比來量化重組。

在哺乳動物細胞培養物中測試了兩組Bxb1變體之重組效率。首先，評估了每個安全港側(SHS)文庫中具有最高重組效率之2至3個變體，這些變體來自測試之單殖株(圖9至14)。結果如圖17所示。使用野生型Bxb1整合酶進行比較，結果顯示所有4個測試標靶位點的重組率為0%。

隨後，對每個文庫在Nanopore篩選中具有最高性能之十個殖株進行了測試。所有這些序列之比對如圖13所示。測量的重組效率如圖18所示。

這些實驗顯示，演化之殖株可以在哺乳動物細胞中重組其新標靶位點，效率達到89%，而野生型Bxb1在新標靶位點上完全無活性。

實驗中使用之pCAGGS-attB-mCherry-attP-EGFP報導者質體(圖 14)是從Karpinski等人(2016)所描述之pCAGGS-loxP-mCherry-loxP-EGFP質體生成者。使用懸垂引子藉由PCR引入標靶位點，並使用NheI及HindIII限制消化殖株將其插入報導者質體中。 表7：用於PCR之引子：

引子	引子序列
F	AAAAGCTAGC (SEQ ID NO: 13116) - target_site-CGCCACCATGGTGAGCAA (SEQ ID NO: 13117)
R	AAAAAAGCTTAGATCT (SEQ ID NO:13118) -rev_comp -CCTGCATCGACCTAGACTAGCTAGAA (SEQ ID NO:13119)

如Lansing等人(2020)及Lansing等人(2022)所述，瞬時哺乳動物表現載體EF1a-tagBFP-P2A-Int (圖15)係由EF1a-Rec-P2A-EGFP載體產生。使用XbaI及BsrGI藉由限制消化將整合酶插入表現質體中。 實例6：SH2整合實驗

本實驗顯示使用演化之LSR成功地將供體核酸序列整合到SH2基因座中。

pTwist-CMV質體(Twist Bioscience)用於表現SH2殖株20整合酶(SEQ ID NO：12437)，在重組酶之C端具有Nucleoplasmin NLS。SH2-cl20-NP以 HindIII及NheI限制位點選殖到pTwist-CMV表現載體。供體質體pTwist-Kan-DNR3-P52源自pTwist-Kan高拷貝殖株載體(Twist Bioscience)，其含有SH2-P52標靶位點(5'-GTGGTTTGTCTGGTCAACCACCGCGGTCTCAGTGGTGTACGGTAACCCA-3'；SEQ ID NO: 13126)及turboGFP，後接短CMV啟動子下的SV40 Poly(A)序列(無增強子和嵌合內含子序列)。將片段attP52-CMV-turboGFP-SV40poly(A)選殖到pTwist-Kan高拷貝殖株載體(Twist Bioscience)中。

Expi293F細胞(Thermo Fisher Scientific)在含有10% FBS (Gibco)及1%青黴素-鏈黴素(10,000 U/ml，Thermo Fisher Scientific)的DMEM (Gibco)中於37°C及5% CO ₂下培養。使用胰蛋白酶-EDTA (Gibco)來解離細胞以進行分裂。

對於整合分析，將每孔30,000個Expi293F細胞接種到96孔板中。第二天，使用Lipofectamine 2000轉染試劑(Thermo Fisher Scientific)轉染25 ng pTwist-CMV-SH2cl20-NP表現質體及200 ng pDNR3-attP52供體質體。使用MACSQuant X (Miltenyi Biotec)轉染72小時後對細胞進行分析。對單細胞及轉染群體(GFP ⁺細胞)進行門控。重組酵素及供體質體轉染樣本之轉染效率為49.6%。

轉染72小時後，收穫細胞並按照製造商之說明使用Fast萃取 DNA溶液(VWR)萃取gDNA。

1 µl萃取之gDNA (未處理之細胞用作對照組)在25 µl PCR反應中與MyTaq聚合酶(Bioline)連接PCR。連接PCR允許藉由擴增基因體基因座與整合DNA序列間之DNA片段來檢查基因體中SH2-B標靶位點中供體之正確整合。使用對SH2-B標靶位點之基因體序列上游(5')或下游(3')序列特異之引子、以及對重組酶整合之序列(供體質體)特異之另一引子進行PCR。用於左連接(5')PCR之引子：GCAATGAGGTCCAGATCCT (SEQ ID NO：13120，結合在基因體序列中，引子結合位點在人類基因體中緊鄰SH2-B標靶位點之座標：chr13：74,941,518-74,941,537)及TGGCGGTCATATTGGACATGA (SEQ ID NO：13121，結合在供體質體中之標靶位點下游)；預期產物大小：435 bp。用於右連接(3')PCR之引子：TCGGGCTTCCCATACAATCG (SEQ ID NO：13122，結合在標靶位點上游之供體質體中)及CTTGGCGCCTCCAGAAACATTG (SEQ ID NO：13123，結合在基因體序列中，引子結合之座標人類基因體中SH2-B標靶位點旁之位點：chr13:74,941,098-74,941,118)；預期產物大小：618 bp。循環程序：95°C - 5分鐘、(95°C - 15秒、56°C - 15秒、72°C - 15秒)x 35、72°C - 3分鐘。

將5 µl PCR產物在22孔1% Agarose E-Gel (Thermo Fisher Scientific)上移行20分鐘。使用E-Gel 1Kb Plus Express DNA Ladder分析PCR產物大小。凝膠照片(圖19)係使用E-Gel Power Snap Plus Electrophoresis System (Thermo Fisher Scientific)拍攝。在凝膠圖片上，樣本泳道中存在兩條PCR條帶，其中使用SH2 cl20重組酶及pTwist-Kan-DNR3-P52供體轉染細胞之gDNA作為模板。條帶大小與左連接(5')處之預期大小435 bp及右連接(3')處618 bp之預期大小相匹配，表明供體質體已成功整合到SH2基因體基因座中。在使用未處理細胞(wt細胞)之gDNA作為模板的樣本中沒有擴增出PCR產物，顯示PCR測定之特異性(參見圖19中之對照泳道2；對照泳道3未顯示PCR反應混合物中H ₂O陰性對照之擴增子)。

將 1 µl PCR產物送至Microsynth AG進行Sanger定序，其中引子GCAATGAGGTCCCAGATCCT (SEQ ID NO: 13124)用於左連接PCR，引子 TCGGGCTTCCCATACAATCG (SEQ ID NO: 13125)用於右連接PCR。定序結果證實供體核酸序列成功整合至SH2基因座。 引用之非專利文獻 Anzalone AV, Gao XD, Podracky CJ, Nelson AT, Koblan LW, Raguram A, Levy JM, Mercer JAM, Liu DR. Programmable deletion, replacement, integration and inversion of large DNA sequences with twin prime editing. Nat Biotechnol. 2022 May;40(5):731-740. Aznauryan E, Yermanos A, Kinzina E, Devaux A, Kapetanovic E, Milanova D, Church GM, Reddy ST. Discovery and validation of human genomic safe harbour sites for gene and cell therapies. Cell Reports Methods 2022 January:2(1):100154. Bai H, Sun M, Ghosh P, Hatfull GF, Grindley ND, Marko JF. Single-molecule analysis reveals the molecular bearing mechanism of DNA strand exchange by a serine recombinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 May 3;108(18):7419-24. doi: 10.1073/pnas.1018436108. Epub 2011 Apr 18. PMID: 21502527; PMCID: PMC3088605. Buchholz F., Hauber J. (2011). 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本發明藉由以下附圖及實例進一步說明，但不限於此。

圖1說明自然界中之整合反應。粗體圓圈代表噬菌體基因體，具有噬菌體附著位點attP。該線代表細菌基因體，帶有細菌附著位點attB。在整合酶存在之情況下，進行整合反應，導致噬菌體基因體整合到細菌染色體中，兩側是兩個雜交att位點，稱為attL及attR。

圖2A說明大絲胺酸重組酶之結構域組織。圖2B示出處於自由未結合狀態之LSR結構。圖2C說明位點特異性重組之機制。

圖3說明不同整合酶之演變過程。圖3A顯示TP901整合酶之過程，圖3B顯示PhiRv1整合酶之過程，圖3C顯示A118整合酶之過程。

圖4顯示對來自TP901整合酶演化文庫之單殖株的分析。圖4A是向pRT798標靶位點演化之文庫，及圖4B是向標靶位點pRT799演化之文庫。上圖：瓊脂糖凝膠圖片顯示1 μg/ml阿拉伯糖誘導之單殖株重組測試結果。凝膠圖右側之象形圖指示每個條帶對應於哪個片段。底部之數字顯示重組效率。兩個三角形代表未重組之片段，一個三角形代表重組之片段。M = 分子量標記。下圖：每個殖株與野生型酵素(頂線)之序列比對。點代表沒有變化，*是終止密碼子，#是插入。每個不匹配之位置都顯示在底行中。

圖5顯示對來自PhiRv1整合酶演化文庫之單殖株的分析。圖5A是向pRT824標靶位點演化之文庫，及圖5B是向標靶位點pRT825演化之文庫。上圖：瓊脂糖凝膠圖片顯示以0、1及10 μg/ml阿拉伯糖誘導之單殖株重組測試結果。凝膠圖右側之象形圖指示每個條帶對應於哪個片段。兩個三角形代表未重組之片段，一個三角形代表重組之片段。下圖：每個殖株與野生型酵素(頂線)之序列比對。點代表沒有變化，*是終止密碼子。每個不匹配之位置都顯示在底行中。

圖6顯示對來自A118整合酶演化文庫之單殖株的分析。圖6A是向pRT783標靶位點演化之文庫，圖6B是向標靶位點pRT784演化之文庫，及圖6C是向標靶位點pRT787演化之文庫。上圖：瓊脂糖凝膠圖片顯示以0、1及10 μg/ml阿拉伯糖誘導之單殖株重組測試結果。凝膠圖右側之象形圖指示每個條帶對應於哪個片段。兩個三角形代表未重組之片段，一個三角形代表重組之片段。下圖：每個殖株與野生型酵素(頂線)之序列比對。點代表沒有變化，*是終止密碼子。每個不匹配之位置都顯示在底行中。

圖7顯示pEVO4gg載體之質體圖譜。

圖8說明Bxb1整合酶向不同標靶位點之演化過程。圖8A示出針對SH1標靶位點之過程，圖8B示出針對SH2標靶位點之過程，圖8C示出針對SH3標靶位點之處理，且圖8D示出針對SH4標靶位點之過程。

圖9顯示來自向SH2標靶位點演化之文庫的單殖株之分析。圖9A：瓊脂糖凝膠圖片顯示用0、1及10 μg/ml阿拉伯糖誘導之單殖株重組測試結果。底部之數字顯示重組效率。凝膠圖右側之象形圖指示每個條帶對應於哪個片段。兩個三角形代表未重組之片段，一個三角形代表重組之片段。M = 分子量標記。圖9B：每個殖株與野生型酵素(頂線)之序列比對。僅顯示與野生型參考有差異之位置。點代表沒有變化，*是終止密碼子。每個不匹配之位置都顯示在底行中。

圖10顯示來自向SH4標靶位點演化之文庫的單一殖株之分析。圖10A：瓊脂糖凝膠圖片，顯示0、1及10 μg/ml阿拉伯糖誘導之單殖株重組測試結果。底部之數字顯示重組效率。凝膠圖右側之象形圖指示每個條帶對應於哪個片段。兩個三角形代表未重組之片段，一個三角形代表重組之片段。M = 分子量標記。圖10B：每個殖株與野生型酵素(頂線)之序列比對。僅顯示與野生型參考有差異之位置。點代表沒有變化，*是終止密碼子。每個不匹配之位置都顯示在底行中。

圖11顯示來自向SH3標靶位點演化之文庫的單一殖株之分析。圖11A：瓊脂糖凝膠圖片，顯示0、1及10 μg/ml阿拉伯糖誘導之單殖株重組測試結果。底部之數字顯示重組效率。凝膠圖右側之象形圖指示每個條帶對應於哪個片段。兩個三角形代表未重組之片段，一個三角形代表重組之片段。M = 分子量標記。圖11B：每個殖株與野生型酵素(頂線)之序列比對。僅顯示與野生型參考有差異之位置。點代表沒有變化，*是終止密碼子。每個不匹配之位置都顯示在底行中。

圖12顯示來自向SH1標靶位點演化之文庫的單一殖株之分析。圖12A：瓊脂糖凝膠圖片，顯示0、1及10 μg/ml阿拉伯糖誘導之單殖株重組測試結果。底部之數字顯示重組效率。凝膠圖右側之象形圖指示每個條帶對應於哪個片段。兩個三角形代表未重組之片段，一個三角形代表重組之片段。M = 分子量標記。圖12B：每個殖株與野生型酵素(頂線)之序列比對。僅顯示與野生型參考有差異之位置。點代表沒有變化，*是終止密碼子。每個不匹配之位置都顯示在底行中。

圖13為評估哺乳動物細胞培養物而選擇之來自奈米孔篩選之殖株的序列比對。野生型Bxb1酵素(頂線)用作參考。僅顯示與野生型參考有差異之位置。點代表沒有變化，*是終止密碼子。每個不匹配之位置都顯示在底行中。

圖14顯示pCAGGS-attB-mCherry-attP-EGFP報導者載體之通用質體圖譜。

圖15顯示具有整合酶之EF1a-tagBFP-P2A-Int表現載體之通用質體圖譜。

圖16顯示用於量化哺乳動物細胞中演化整合酶變體之重組效率的基於質體之測定方案。pCAGGS-attB-mCherry-attP-EGFP報導者質體編碼紅色螢光蛋白mCherry，兩側是測試標靶位點，接著為終止轉錄之終止子序列，以及EGFP基因(原始質體不表現該基因)。標靶位點重組後，帶有終止子序列之mCherry盒被切除，導致下游EGFP基因之表現。

圖17顯示藉由使用報導者測定法測量之單一殖株的重組效率。此圖顯示用指定重組酶轉染細胞48小時後藉由流式細胞儀分析重組效率之量化(n = 2，生物重複顯示為點)。誤差線代表平均值之標準差(SD)。

圖18顯示了從Nanopore篩選指定並用報導者測定法測量之單一殖株的重組效率。上圖顯示SH4標靶位點上之重組，下圖顯示SH3標靶位點上之重組。N = 2，生物重複顯示為點，誤差線代表平均值之標準差(SD)。

圖19顯示了PCR產物之凝膠分析，證明使用演化LSR將供體核酸序列成功整合至SH2基因座。

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Claims (15)

1. 一種產生標靶特異性大絲胺酸重組酶(LSR)之方法，該方法包含以下步驟： a)藉由將一或多個突變引入編碼LSR之序列中來產生LSR之多個第一變體； b)產生表現載體文庫，其中每個表現載體包含第一區域及第二區域，該第一區域包含編碼多個LSR中第一變體之一的序列，該第二區域包含LSR之至少兩個第一標靶位點，其中該兩個第一標靶位點彼此不同； c)將表現載體文庫導入宿主細胞； d)培養宿主細胞並表現LSR之第一變體； e)從宿主細胞培養物中分離質體DNA； f)確定該兩個第一標靶位點間該表現載體之第二區域的部分是否已被第一變體LSR切除； g)藉由將一或多個突變引入編碼彼等第一LSR變體之序列中來產生多個第二LSR變體，該第一LSR變體切除該至少兩個第一靶位點間該表現載體之第二區域的部分； h)視需要以至少一個第二標靶位點重複步驟b)至f)，其中該至少一個第二標靶位點在至少一個核苷酸上不同於第一靶位點。
2. 根據請求項1之方法，其進一步包含重複步驟g)及h)之步驟，較佳地其中步驟g)及h)重複至少兩次至至少30次。
3. 根據請求項1或2之方法，其中步驟a)中作為LSR之多個第一變體之基礎的LSR是天然存在之LSR。
4. 根據請求項1至3中任一項之方法，其中表現載體之第二個區域中之兩個標靶位點間隔至少50個核苷酸。
5. 根據請求項1至4中任一項之方法，其中該確定步驟f)包含：i)對該表現載體之第一及第二區域進行定序；或ii)對包含兩個標靶位點之表現載體之序列進行限制消化，然後分析消化片段。
6. 根據請求項1至5中任一項之方法，其進一步包含從表現載體文庫中去除變體LSR之無活性變體之步驟。
7. 一種可藉由根據請求項1至6中任一項之方法獲得之變體大絲胺酸重組酶(LSR)，其中該變異LSR之胺基酸序列與在步驟a)中產生變異LSR之胺基酸序列、以及與任何其他天然存在絲胺酸重組酶之胺基酸序列有至少一個胺基酸不同，較佳地其中該變體包含與SEQ ID NO: 14、17至35、38至56、60至8391、8395、8398至8403、8406至8412、8415至8422、8425至8429及8430至13115之一具有至少85%同一性之胺基酸序列或由其組成。
8. 根據請求項7之變體LSR，其中該變體LSR是選自由A118、TP901、φRV1、Bxb1、φC31、R4、Wβ、Tnpx、Cp36、Dn29、Kp03、Nm60、Pa01、Si74所組成之群的LSR變體。
9. 一種編碼根據請求項7或8之變體LSR之核酸或核酸組。
10. 一種表現載體，其包含根據請求項9之核酸或核酸組。
11. 一種用於將供體DNA整合到標靶核酸中之系統，該系統包含 包含根據請求項7或8之變體LSR之多肽，或編碼其之核酸，及 待插入標靶核酸中之供體核酸。
12. 一種醫藥組合物，其包含請求項7或8之變體LSR、根據請求項9之核酸或核酸組、或根據請求項10之表現載體，以及視需要藥學上可接受之載劑。
13. 一種請求項7或8之變體LSR、請求項9之核酸或核酸組、請求項10之表現載體、請求項11之系統或請求項12之醫藥組合物之用途，其係用於將感興趣之核酸序列整合到個體或細胞之基因體中，其中該細胞不包括人種系之細胞。
14. 根據請求項7或8之變體LSR、請求項9之核酸或核酸組、請求項10之表現載體或請求項12之醫藥組合物，其係用作藥物。
15. 根據請求項14之變體LSR、核酸或核酸組、表現載體或醫藥組合物之用途，其係用於治療遺傳疾病或病症，較佳地其中該遺傳疾病或病症係為單一遺傳疾病或病症。